JP2022536389A - 小カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体と微生物の光不活性化におけるそれらの応用 - Google Patents

Abstract

本発明は、小カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体、特に式（Ｉ）のポルフィリン、クロリンもしくはバクテリオクロリン、またはそれらの医薬的に許容される塩に関するものである。本発明はまた、式（Ｉ）の上述のカチオン性オルト－５，１０－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体またはそれらの医薬的に許容される塩の、微生物の光線力学的不活性化における使用に関する。ここで言及される誘導体は、適切な光の存在下で同じものを処理することができる。本発明はまた、ヒトまたは動物の、細菌および／または真菌、および／または酵母菌、および／またはウイルス感染症の治療のための、カチオン性オルト－５，１０－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体、特に式（Ｉ）のプロフィリン、クロリンもしくはバクテリオクロリン、またはそれらの医薬的に許容される塩の１つまたは複数を含む医薬組成物を論述する。【化１】TIFF2022536389000021.tif59126

Description

本願は、新規の小カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体、つまり、式（Ｉ）のポルフィリン、クロリンまたはバクテリオクロリン、およびそれらの調合過程、ならびに微生物の光線力学的不活性化（ＰＤＩ）におけるそれらの使用に関するものである。

病原性細菌における抗生物質への耐性の出現は、公衆衛生上の重大な問題となっている。抗菌薬耐性に起因する死亡者数は、２０５０年までに全世界で年間１，０００万人に達すると予想されており、医療システムに多大な負担をかけている。克服すべき大きな課題は、多剤耐性のグラム陰性菌とバイオフィルム内の細菌による耐性である。グラム陽性菌の細胞質膜は、ペプチドグリカンやリポタイコ酸などの比較的多孔質な層に囲まれており、分子量３万～６万Ｄａの高分子を拡散することができる。しかし、グラム陰性菌は、細胞質内膜と、ペプチドグリカンを含むペリプラズムで隔てられた外膜からなる細胞包囲体を持っている。この外膜は、細胞と環境の間に物理的・機能的なバリアーを形成しており、ポリンチャネルを介して拡散できる分子量７００Ｄａ以下の比較的親水性の化合物に限定して取り込まれる（１）。バイオフィルムが細菌を敵対的な環境から守るため、バイオフィルムが関与する細菌感染症の根絶は非常に困難である。バイオフィルムの耐性には、ドラッグポンプなどの従来の耐性機構に加えて、殺生物剤の拡散性の低下、バイオフィルム外層による抗菌剤の不活性化、バイオフィルムの一部の領域での細菌の休眠、高度に保護された表現型への分化など、さまざまなメカニズムが関与している。

微生物の光線力学的不活性化（ＰＤＩ）は、光増感分子を投与して微生物に蓄積させ、しばらくしてから光増感剤が吸収した光を照射することで臨床的に認められている治療法である（２）。光が吸収されると、光増感剤は電子的に励起された状態になり、基質分子と電子伝達反応を起こしてスーパーオキシドアニオンやヒドロキシルラジカルを生成したり（Ｉ型反応）、基底状態の分子状酸素に電子エネルギーを伝達して一重項酸素を生成したりする（ＩＩ型反応）。これらの光生成された活性酸素種（ＲＯＳ）は、最終的に微生物を死滅させる生物学的なメカニズムを引き起こし、ＰＤＩは効果的な消毒、防腐、抗生物質の処置となる。

ここで、「微生物」とは、細菌、真菌、酵母、ウイルス、原生動物（例えば、マラリアの原因となるマラリア原虫、シャーガス病の原因となるクルス菌、アメーバ病の原因となるアメーバ・ヒストリチカ）などの種を対象としている。ここで、「バイオフィルム」とは、固体表面に付着した微生物が自ら合成したマトリックスの中に存在する集合体を意味する。ここで、「多剤耐性」という用語は、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性（すなわちＭＲＳＡ）を含む１つの主要な抗菌剤に耐性のある微生物を示すが、これはそのような微生物が複数のケースの抗菌剤に対して交差耐性または共耐性を示すことが多いためである。

メソテトラ（Ｎ－メチル－４－ピリジル）ポルフィリン・メソテトラ（４－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアニリニウム）ポルフィリンなどのメソ置換カチオン性ポルフィリンがグラム陰性菌を不活化することが示され（３）、カチオン性亜鉛ピリジニウムフタロシアニンでも同様のことが示された（４）。これらの先駆的な研究により、グラム陽性菌を効果的にＰＤＩするには、顕著なカチオン電荷を持つ光増感剤が必要であることがわかり、さまざまなポリカチオン光増感剤コンジュゲートが調製され、試験された（５）。その結果、カチオン性のテトラピリジルポルフィリン（１）、クロリンｅ６のポリカチオン性リジン結合体（５）、４級化アンモニウム基を持つバクテリオクロリン（６）などが開発され、マイクロモル濃度で数十ジュール／平方センチメートル（Ｊ／ｃｍ^２）の光を照射すると、細菌の生存率を４～６ｌｏｇ単位で低下させることができた。グラム陰性菌のＰＤＩには、疎水性のテトラピロール系光増感剤にできるだけ多くのカチオン電荷が必要であることが、この分野では認められていた（７）。

マイクロモルの光増感剤濃度と１０Ｊ／ｃｍ^２程度の光量を用いて細菌懸濁液のＰＤＩを５～６桁向上させることができたが（７）、このような光増感剤の臨床応用はほとんど成功していない。最近の微生物のＰＤＩに関する特許状況を見ると、革新的な方法や装置が開示されているが、分子光増感剤の臨床的選択肢は非常に限られており、バイオフィルムの場合には存在しない（８）。

抗菌剤の効果を高めるための試みとして、ＰＤＩ用光増感剤と低分子種や抗菌ペプチドとの組み合わせがある。微生物の光不活性化を増強する低分子種としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。（ｉ）病原体排出システムの低分子阻害剤（９）、（ｉｉ）微生物の外膜のリポポリサッカライドに安定化作用を及ぼすネイティブな２価のカチオンであるＣａ^＋２やＭｇ^２＋を競合的に置換し、この膜を破壊する低分子ポリカチオン種（１０）、（ｉｉｉ）アジドや無機塩など、光増感剤の三重項状態への電子移動を受けて、微生物のＰＩを増強する反応性ラジカルを生成する種（１１）などである。正の電荷と適切な疎水性部分を持つ抗菌ペプチドは、孔形成および非孔形成メカニズムによって細菌の外膜を損傷する可能性があり、光増感剤の効力を高めるために光増感剤と一緒に投与されている（１２）。

単細胞懸濁液を用いたＰＤＩが臨床現場に導入されない理由として、人間を悩ませる感染症の多くは、実際には単細胞ではなくバイオフィルムで増殖する細菌が原因であることが考えられる。ＰＤＩは、治療が困難な局所的な感染症に対する治療法として期待されているため、この点は特に重要である。光増感剤は、感染部位に局所投与または腔内投与が可能であることが大前提であり、その後、適切な時間が経過した後に、光ファイバ、拡散チップ、ファイババンドル、埋め込み型光源、または外科的露出部位への直接照射により、感染部位に最適な波長の光を適切に照射することができる（２）。口腔カンジダ症、歯周病、火傷や手術などの創傷感染症、ヘルペス、ニキビ、爪水虫、乳頭腫、手術後の膿瘍の除去、副鼻腔炎、尿路感染症、角膜感染症などの臨床応用が考えられる。

バイオフィルムが存在する局所的な感染症のＰＤＩに成功するためには、光増感剤の設計において、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の課題とバイオフィルムの課題の両方を考慮する必要がある。本発明は、プランクトンとバイオフィルムの両方の形態の微生物のＰＤＩに非常に効率的な光増感剤を初めて開示するものである。ＰＤＩのための光増感剤の以前の使用では、非常に多くの正電荷が親水性を増加させ、細菌の細胞壁やバイオフィルムへの分割を減少させることは理解されていなかった。さらに、ＰＤＩのための光増感剤の初期の使用では、細菌細胞の取り込みとバイオフィルムへの浸透の光増感剤のサイズへの依存性を調査していない。例えば、式（Ｉ）の光増感剤は、２つの正電荷を持ちながら、４７０Ｄａという低い分子量を持つことができる。式（Ｉ）の光増感剤は、高いモル吸光係数を有する小さなカチオン性分子種を有するという技術的問題を解決し、グラム陰性菌を含む微生物に取り込まれ、バイオフィルム内で急速に拡散し、１リットル当たり１ｍｇ（１ｍｇ／Ｌ）よりも低い光増感剤用量で微生物の光活性化を可能にすることができる。

本発明の本質的な特徴は、正電荷の分布が、細菌の細胞質や外膜との静電的相互作用を最大化するように特に設計されている光増感剤を開示することである。マクロサイクルの上側および／または下側の、光増感剤分子種の周囲の媒体により多くさらされている原子に正電荷を分布させることで、光増感剤の総正電荷を低くするのに有効な静電的相互作用が可能になることは、これまで気づかれていなかった。これにより、バクテリアへの浸透やバイオフィルムへの拡散に必要なサイズの小ささと、少数の正電荷の存在を兼ね備えた小さなカチオン性ポルフィリン誘導体を使用することができる。本発明は、ポルフィリン誘導体のメソ位に結合したヘテロアリール基の１つのオルト位に、少なくとも１つの窒素原子を配置することで実現されており、前記窒素原子は４級化されている。前記窒素原子がヘテロアリール環のオルト位にあり、かつメチル基と結合していることにより、マクロサイクルとの立体的な相互作用が生じ、ヘテロアリール基が回転してマクロサイクルに対してほぼ直交する方向をとるようになる。直交するヘテロアリール基のオルト位に配置された窒素原子は、メチル基をマクロサイクル環の上または下に誘導し、正電荷の媒体への露出を最大化する。これを図１に示す。

ヘテロアリール基の２つのオルト位にある窒素原子によって誘導される正電荷の方向性を考慮すると、イミダゾイル基は好ましいヘテロアリール基である。また、サイズが小さいことも好ましい。

本発明の別の好ましい実施形態は、式（ＩＩ）のポルフィリン誘導体をＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、ＡｇまたはＩｎなどの金属イオンと複合化することである。これらの金属イオンは、ポルフィリン誘導体と反磁性の閉殻複合体を形成する。このような金属ポルフィリン誘導体は、自由塩基ポルフィリン誘導体のＨＯＭＯおよびＬＵＭＯと非常によく似た最高被占分子軌道（ＨＯＭＯ）および最低非占分子軌道（ＬＵＭＯ）を持つのが特徴である（１３）。このような状況では、金属ポルフィリンの光化学は、金属イオンの内部の重原子効果によってほとんど制御されており、一重項と三重項の多様性の間の系間交差が加速される。重原子効果は、金属の原子番号が大きくなるほど大きくなる。Ｚｎのような金属では、重原子効果は、最低励起一重項状態から最低三重項状態への系間交差を増加させ、光増感剤の三重項状態量子収率をほぼ１倍にするには十分であるが、光増感剤の三重項状態から基底状態への系間交差を増加させ、三重項状態の寿命をマイクロ秒の範囲以下にするには不十分である。ほぼ単位の三重項状態量子収率と長い三重項寿命が、光増感剤分子と酸素分子との間の効率的な相互作用の前提条件であり、活性酸素の生成効率がその相互作用に依存することを考慮して、本発明は、バイオフィルムモードで増殖する微生物を含む微生物のＰＤＩのための最も好ましい光増感剤を開示しており（式（ＩＩ））、

マクロサイクルの中心に金属イオンが存在しても、その体積への影響は無視できる。それゆえ、式（ＩＩ）の分子種は、具体的には、式（ＩＩａ）のポルフィリンとすることができる。

式（ＩＩａ）を、図１では別の視点から示している。同一に、式（ＩＩ）の分子種は、式（ＩＩｂ）のバクテリオクロリンであることができる。

または、式（ＩＩｃ）のクロリン

式（Ｉ）の小さなカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体が、微生物やバイオフィルムに対しては非常に高い光毒性を示すが、真核細胞に対しては光毒性を示さないことは、当業者には予想できなかった。実際、最も近い先行技術は、式（ＩＩＩ）の亜鉛（ＩＩ）フェニルポルフィネートであり、これはｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトの細胞に対して非常に高い光毒性を示すことが示されている：１．２μＭの濃度でヒトＨｅＬａ細胞の５０％が死滅する（１４）。このようにヒトの細胞に対して高い光毒性を示すことから、このような化合物を人体の感染症治療に使用することはできない。近い先行技術の最後の例は、式（ＩＶ）のメソ（ジ－シス［４－Ｎ－メチル－ピリジル］シス－ジフェニル－ポルフィリン）であり、これはハエに対して光毒性を示すが、細胞毒性物質の光生成という点では他のメソ置換ポルフィリンと区別がつかないことが示された（１５）。モノカチオンのイミダゾイル置換メソポルフィリンやジカチオンのＮ－メチルピリジル置換メソポルフィリンを用いたこれらの研究では、ジカチオンのイミダゾリルポルフィリンがヒト細胞に対しては光毒性を示さないが、微生物に対しては非常に高い光毒性を示すことは予想できなかった。このような光毒性の予想外の違いを理解する鍵は、図１に示した電荷の分布にある。マクロサイクルの平面の上下にある正電荷の大きな密度は、細菌の外膜に対する特異性を与えるこれらの分子種の特異的な特性である。さらに、サイズが小さいため、バイオフィルム中での拡散に有利である。

微生物を光力学的に不活性化する際に、光増感剤として式（Ｉ）の小さなカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体を使用すると、最先端の光増感剤に比べて様々な利点がある。実際、この光増感剤のファミリーは
－ 強烈な光の吸収
－ 高い安定性と高い光安定性
－ 活性酸素を高収率で発生させる能力
－ ヒトの細胞に対して非常に低い毒性や光毒性を持つ
－ 微生物の外膜と相互作用する高い特異性
－ 生体適合性のある医薬品ビヒクルへの溶解性
－ バイオフィルム内で不活性化されずに拡散する能力
－ 多剤耐性グラム陰性菌を含む微生物に対して高い光毒性を有する。
これらの特性は、式（Ｉ）のポルフィリン誘導体の２つの構造的・電子的特徴、すなわち、分子サイズが小さいことと、マクロサイクルの周囲に過剰な正電荷が分布していることに関連していると考えられる。

本発明はまた、そのような光増感剤を合成するプロセスを開示し、例として、プランクトンやバイオフィルム形態の細菌を不活性化するためにこれらの光増感剤を使用することを示している。

Ｐｅｒｅｉｒａ ＭＭ，Ａｒｎａｕｔ Ｍｏｒｅｉｒａ ＬＧ，Ｆｏｒｍｏｓｉｎｈｏ ＳＪ，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ ＣＪＰ，発明者；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｉｍｂｒａ，ａｓｓｉｇｎｅｅ．Ｎｏｕｖｅａｕｘ ｄｅｒｉｖｅｓ ｄｅ ｐｏｒｐｈｉｒｉｎｅ，ｎｏｔａｍｍｅｎｔ ｃｈｌｏｒｉｎｅｓ ｅｔ／ｏｕ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｅ，ｅｔ ｌｅｕｒｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｅｎ ｔｈｅｒａｐｉｅ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｑｕｅ，２００５，ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２２１２。 Ａｒｎａｕｔ Ｍｏｒｅｉｒａ Ｌ，Ｐｅｒｅｉｒａ ＭＭ，Ｆｏｒｍｏｓｉｎｈｏ ＳＪ，Ｓｉｍｏｅｓ Ｓ，Ｓｔｏｃｈｅｌ Ｇ，Ｕｒｂａｎｓｋａ Ｋ，発明者；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｉｍｂｒａ，ａｓｓｉｇｎｅｅ．Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｓｅｓ，２００９，ＰＣＴ／ＰＴ２００９／００００５７。

Ｊｏｒｉ Ｇ，Ｆａｂｒｉｓ Ｃ，Ｓｏｎｃｉｎ Ｍ，Ｆｅｒｒｏ Ｓ，Ｃｏｐｐｅｌｌｏｔｔｉ Ｏ，Ｄｅｉ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ Ｍｅｄ．２００６；３８：４６８－８１。 Ｈａｍｂｌｉｎ ＭＲ，Ｈａｓａｎ Ｔ．Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ：ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ？Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２００４；３：４３６－５０。 Ｍｅｒｃｈａｔ Ｍ，Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ Ｇ，Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ Ｐ，Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ Ａ，Ｊｏｒｉ Ｇ．Ｍｅｓｏ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ ｏｆ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｔｅｒｉａ．Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｂ：Ｂｉｏｌ．１９９６；３２：１５３－７。 Ｍｉｎｎｏｃｋ Ａ，Ｖｅｒｎｏｎ ＤＩ，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ Ｊ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｊ，Ｐａｒｉｓｈ ＪＨ，Ｂｒｏｗｎ ＳＢ．バクテリアの光不活性化。カチオン性の水溶性亜鉛フタロシアニンを用いてグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方を光不活性化する。Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｂ：Ｂｉｏｌ．１９９６；３２：１５９－６４。 Ｈａｍｂｌｉｎ ＭＲ，Ｏ．Ｄｏｎｎｅｌｌ ＤＡ，Ｍｕｒｔｈｙ Ｎ，Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ Ｋ，Ｍｉｃｈａｕｄ Ｎ，Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ Ｇｒａｍ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２；４９：９４１－５１。 Ｈｕａｎｇ Ｌ，Ｋｒａｙｅｒ Ｍ，Ｒｏｕｂｉｌ ＪＧＳ，Ｈｕａｎｇ Ｙ－Ｙ，Ｈｏｌｔｅｎ Ｄ，Ｌｉｎｄｓｅｙ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｎｏ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｐｈｏｔｏｉｎａｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｔ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｂ：Ｂｉｏｌ．２０１４；１４１：１１９－２７。 Ｈｕａｎｇ Ｌ，Ｋｒａｙｅｒ Ｍ，Ｒｏｕｂｉｌ ＪＧＳ，Ｈｕａｎｇ Ｙ－Ｙ，Ｈｏｌｔｅｎ Ｄ，Ｌｉｎｄｓｅｙ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔａｂｌｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｎｏ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｐｈｏｔｏｉｎａｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｔ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｂ：Ｂｉｏｌ．２０１４；１４１：１１９－２７。 Ａｈｍｅｄ Ｉ，Ｆａｎｇ Ｙ，Ｌｕ Ｍ，Ｙａｎ Ｑ，Ｍｏｈａｍｅｄ ＡＥ－Ｈ，Ｈａｍｂｌｉｎ ＭＲ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｅｎｔ ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ ｌｉｇｈｔ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉ－ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ Ａｎｔｉｉｎｆｅｃｔ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８；１３：７０－８８。 Ｔｅｇｏｓ ＧＰ，Ｈａｙｎｅｓ Ｍ，Ｓｔｒｏｕｓｅ ＪＪ，Ｋｈａｎ ＭＭ，Ｂｏｌｏｇａ ＣＧ，Ｏｐｒｅａ ＴＩ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｔａｃｔｉｃｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２０１１；１７：１２９１－３０２。 Ｈａｎｃｏｃｋ ＲＥＷ，Ｆａｒｍｅｒ ＳＷ，Ｌｉ Ｚ，Ｐｏｏｌｅ Ｋ．アミノグリコシドとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの外膜、精製リポポリサッカライド、ＯｍｐＦポリンとの相互作用。Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９１；３５：１３０９－１４。 Ｈａｍｂｌｉｎ ＭＲ，Ａｂｒａｈａｍｓｅ Ｈ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｃｏｎｕｎｄｒｕｍｓ？Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１８；２３：３１９０。 Ｘｉａｏ Ｆ，Ｃａｏ Ｂ，Ｗａｎｇ Ｃ，Ｇｕｏ Ｘ，Ｌｉ Ｍ，Ｘｉｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｈｉｇｈｙ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１９；１３：１５１１－２５。 Ａｒｎａｕｔ ＬＧ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ ｆｏｒ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｄｖ Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ．２０１１；６３：１８７－２３３。 Ｍｒｏｚ Ｐ，Ｂｈａｕｍｉｋ Ｊ，Ｄｏｇｕｔａｎ ＤＫ，Ａｌｙ Ｚ，Ｋａｍａｌ Ｚ，Ｋｈａｌｉｄ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｓ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒｇｅ，ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｔａｌ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００９；２８２：６３－７６。 Ａｍｏｒ ＴＢ，Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏ Ｌ，Ｊｏｒｉ Ｇ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｓ ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ．２．メソ置換されたポルフィリンの光毒性活性。Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９８；６８：３１４－８。

本発明の目的は、サイズの小さい新規のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体、すなわち式（Ｉ）のポルフィリン、クロリンまたはバクテリオクロリンを提供することである。

Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選択される金属イオンである。

Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有する。

ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択される環の原子であり、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素またはＲから選択される。

ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はそれぞれ独立してＹＲ′′から選択され、ここでＹはそれぞれ独立して炭素、硫黄または窒素から選択される環の原子であり、Ｒ′′はＹに結合しており、Ｒ′およびＲ′′はそれぞれ独立して水素からまたはＲから選択される。

または、本発明は、病原性微生物の光力学的不活性化に使用するためのその薬剤的に許容される塩である。

したがって、式（Ｉ）の化合物は、式のポルフィリンであってもよい。

Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選択される金属イオンである。

Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有する。

ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択される環の原子であり、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素またはＲから選択される。

ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、ＹＲ′′からそれぞれ独立して選択され、ここで、Ｙは、炭素、硫黄または窒素からそれぞれ独立して選択された環の原子であり、Ｒ′′は、Ｙに結合しており、Ｒ′およびＲ′′は、水素からまたはＲからそれぞれ独立して選択される；または、それらの薬学的に許容される塩である。

本発明の具体的な好ましい化合物としては、式（Ｉａ）の小型カチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンが挙げられる。ＭはＺｎ^２＋であり、Ｚ_１は窒素であり、Ｚ_２とＺ_３は炭素である。Ｒはメチルであり、Ｒ′′はメチルまたは水素であり、Ｒ′が構造中に存在しないことを意味するｎ＝０であり、Ｚ_２はＺ_３に直接結合している。

また、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｂ）のバクテリオクロリンであってもよい。

Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選択される金属イオンである。

Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有する。

ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択される環の原子であり、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素またはＲから選択される。

ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、ＹＲ′′からそれぞれ独立して選択され、ここで、Ｙは、炭素、硫黄または窒素からそれぞれ独立して選択された環の原子であり、Ｒ′′は、Ｙに結合しており、Ｒ′およびＲ′′は、水素からまたはＲからそれぞれ独立して選択される；または、それらの薬学的に許容される塩である。

本発明の具体的な好ましい化合物としては、式（Ｉｂ）の小型カチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールバクテリオクロリンが挙げられる。ＭはＺｎ^２＋であり、Ｚ_１は窒素であり、Ｚ_２およびＺ_３は炭素であり、Ｒはメチルであり、Ｒ′は水素であり、Ｒ′′はメチルまたは水素であり、Ｒ′が構造中に存在しないことを意味するｎ＝０である。

また、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉｃ）のクロリンであってもよい。

Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選択される金属イオンである。

Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有する。

ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択される環の原子であり、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素またはＲから選択される。

ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、ＹＲ′′からそれぞれ独立して選択され、ここで、Ｙは、炭素、硫黄または窒素からそれぞれ独立して選択された環の原子であり、Ｒ′′は、Ｙに結合しており、Ｒ′およびＲ′′は、水素からまたはＲからそれぞれ独立して選択される；または、それらの薬学的に許容される塩である。

本発明のもう一つの目的は、手頃な価格の原料から大量に式（Ｉ）の化合物を調製する方法を提供することである。

さらに、細菌、真菌、酵母、ウイルス、原生動物などの微生物を光力学的に不活性化するための薬剤を提供することも目的としている。

また、本発明は、式（Ｉ）に準拠した誘導体の少なくとも１つ、またはその薬学的に許容される塩、薬学的に許容される担体、および微生物の光不活性化を増強しうる低分子種および／または抗菌ペプチドとの組み合わせを含む薬学的組成物に関するものである。

本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投与量および投与の時間経過は、特定の患者、組成物、および投与方法において、患者に毒性（または許容できない毒性）を示すことなく、所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変化させることができる。

使用時には、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物を、薬学的に有効な量で、薬学的担体に入れて、局所的もしくは腔内適用、または体内、静脈内、筋肉内、皮下注射、もしくは経口投与により、それを必要としている対象者に投与する。本発明の化合物は、単独で投与してもよいし、第２の異なる治療用またはアジュバント用の化合物と併用してもよい。「併用する」とは、一緒に、実質的に同時に、または順次にという意味である。本発明の化合物は、約１時間、１日、または１週間などの短期間の治療のために投与してもよい。別の実施形態では、本発明の化合物は、より長い期間にわたって投与してもよい。

微生物の光線力学的不活性化に必要な薬剤、光、酸素の「薬学的有効量」を決めるには、さまざまな重要な要素がある。光力学的不活性化は、光増感剤、光増感剤が吸収する波長の光、分子状酸素の組み合わせに依存している。この組み合わせにより活性酸素が発生し、治療の結果を決定するのは活性酸素の「薬学的に有効な量」である。従って、この結果は、光増感剤の投与量、照射される光の量、生物学的標的の酸素化に依存する。また、光増感剤を投与してから標的に光が照射されるまでの時間で定義される薬剤－光照射間隔も、「薬学的有効量」を決定する上で重要な要素となる。なぜなら、光増感剤が標的に到達するまでの時間、およびその排泄や代謝が時間に依存するからである。例えば、薬剤から光までの時間が数秒と非常に短い場合、光照射時に光増感剤が標的に到達し、発生する活性酸素の量を減少させるには不十分であると考えられる。逆に、薬剤から光を照射するまでの時間が数週間と非常に長い場合は、光増感剤が生物学的標的からクリアランスされ、発生する活性酸素の量が減少すると考えられる。光のフルエンスレート（単位時間に単位面積当たりどれだけの光子が照射されるか）も、治療の結果を左右する重要な要素である。なぜなら、フルエンスレートが非常に高い（光子の数が多すぎて速い）と、治療対象の酸素が減少してしまい、治療が非効率的または効果的にならない可能性があるからである。

別の実施形態では、本発明は、本明細書で画定された化合物（例えば、式（Ｉ）の分子種）の有効量が、約１ｎｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である投与量範囲を有する組成物を提供するものである。特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の有効量は、１００ｎｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。さらなる実施形態では、本明細書で審議された化合物の有効量は５００ｎｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの範囲であり、光照射量は０．１から３００Ｊ／ｃｍ^２の範囲である。さらなる実施形態では、本明細書に記載されている化合物の有効量は約５００ｎｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇであり、光量は１から１００Ｊ／ｃｍ^２であり、薬剤から光への間隔は光増感剤の投与と同時から光増感剤の投与後１週間までの間で選択される。

本発明の別の目的は、本明細書に記載された医薬組成物と、その投与のための指示書とを含むキットである。キットは、任意の適切な容器（すなわち、バイアル、ボトル、シリンジ、アンプル、チューブ）に医薬組成物を提供してもよく、任意に光源を含み、光線力学的療法／不活性化のための指示（例えば、光照射の指示、薬物対光の推奨）などを含む。

その他の目的や技術的特徴は、例示としてのみ与えられる以下の説明に現れるが、それに限定されるものではない。

ＰＤＩに採用されている現行の光増感剤では、バイオフィルムに浸透し、宿主に毒性を与えることなく１ｍｇ／ｋｇ以下の濃度で微生物を光不活性化することができないという欠点があることに鑑み、本発明では、小型で強い光吸収性、高い光安定性、活性酸素光生成の高い量子収率、正電荷の適切な分布、生体適合性を兼ね備えた新しいポルフィリン誘導体を開示する。これらの誘導体の技術的な特徴の一つは、サイズが小さく、その結果、ポリンチャネルを通ってバイオフィルム中に迅速に拡散することができることである。また、光を強く吸収し、高い量子収率で活性酸素を発生させることで知られるポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリンのマクロサイクルを維持していることも技術的な利点である。さらに、ポルフィリン誘導体の光安定性を向上させ、微生物に対して選択性を持たせるのに十分な正電荷を付与する置換基が存在することも利点である。式（Ｉ）のポルフィリン誘導体のさらなる技術的特徴は、蛍光性が高く、すなわち蛍光量子収率が０．１よりも高いことであり、これにより対象物を非侵襲的に可視化することができる。この可視化は、ターゲットの可視化を可能にし、例えば光増感剤がターゲットに蓄積したときに治療を開始する最適なタイミングを選択することができるため、望ましい特性である。本発明の新規ポルフィリン誘導体の最も好ましい特性は、マクロサイクルの周囲に正電荷が分布していることである。これにより、過剰な正電荷が環境にさらされ、光増感剤が微生物の外膜と相互作用することになる。この予想外の特性は、微生物に対する光毒性を高め、ヒトの細胞に対する毒性を抑える決定要因となり、微生物の不活性化を目的とした光毒性の高い低分子光増感剤につながる。

本明細書の開示内容を限定する意図はなく、本出願では、理解を容易にするために、図示された実施形態の添付図面を提示している。
式（ＩＩａ）のＣｈｅｍ ３Ｄ最小化構造（黒で示された原子は正電荷を過剰に持つ）。 式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）の分子種の構造。 式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）の分子種の構造。 式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の分子種の構造。 式（Ｉａ）の前駆体および化合物の合成のための一般的な合成アプローチ。 式（ＩＩａ）の前駆体および化合物の合成のための一般的な合成アプローチ。 水を溶媒とした式（ＩＩａ）の化合物の正規化吸収スペクトル。 様々な光増感剤濃度０μＭ（ブランク）；０．１μＭ（斜線）および１μＭ（十字または横線）で６０分インキュベーションし、４１５ｎｍで１．３６Ｊ／ｃｍ^２の光量を与えた場合のプランクトン細菌のＰＤＩ。 光増感剤の濃度を０μＭ（ブランク）、０．１μＭ（斜線）、１μＭ（十字）とし、６０分培養し、４１５ｎｍで１．３６Ｊ／ｃｍ^２の光を照射した場合のプランクトン細菌のＰＤＩ。 式（ＩＩａ）の分子種とインキュベートしたバイオフィルムの共焦点顕微鏡写真で、バイオフィルム内の式（ＩＩａ）の分子種の蛍光が赤で示され、プランクトン細菌の内因性蛍光が緑で示されている。 構造（ＩＩａ）の分子種を５．２ｎＭ使用した場合の白色光（４０ｍＷ／ｃｍ^２）下でのＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムのＰＤＩ。 線維芽細胞（Ａ）およびケラチノサイト（Ｂ）に対する式（ＩＩａ）の分子種の５Ｊ／ｃｍ^２の光照射下での暗色細胞毒性（斜線）および光毒性（白棒）。

図面を参照して、本明細書では、任意の実施形態をより詳細に説明するが、これらは本願の範囲を限定することを意図したものではない。

Ａ．材料と方法
すべての溶媒は、標準的な手順に従って乾燥させた。市販の試薬はすべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ社から購入し、さらに精製せずに使用した。^１Ｈと^１３Ｃの核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、^１Ｈと^１３Ｃの内部標準としてテトラメチルシラン（δ＝０．００ｐｐｍ）を用いて、４００ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光器（それぞれ４００ＭＨｚと１０１ＭＨｚ）で記録した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルは、ポルトガルのオエイラスにあるＩＴＱＢ／ｉＢＥＴの質量分析ユニット（ＵｎｉＭＳ）で得られたものである。

光学吸収：合成の制御に用いた紫外可視光吸収（ＵＶ－ｖｉｓ）スペクトルは、分光学グレードの溶媒を用いて日立Ｕ－２００１または島津２１００分光光度計で記録した。紫外－可視－近赤外光吸収は、モル吸光係数の測定にはＡｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ５０００紫外－可視－近赤外分光光度計を、ルーチン測定には島津ＵＶ－２１００分光光度計を用いて記録した。吸収スペクトルは３００ｎｍから８００ｎｍまでの波長で記録された。モル吸光係数は、Ｂｅｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔの法則を用いて決定した。各化合物について、１０^－７～１０^－６Ｍの濃度で最低６種類の溶液を調製し、０．１～１の間の吸光度を得た。

蛍光発光：蛍光発光スペクトルは、Ｈｏｒｉｂａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ－４で記録した。スペクトルは、光路長１ｃｍの標準的なキュベットを用いて、５５０ｎｍから８００ｎｍまで収集した。蛍光量子収率（Φ_Ｆ）は、試料の蛍光積算面積と既知の比較化合物の蛍光積算面積Φ_Ｆを比較して求めたもので、励起波長における試料と比較化合物の吸収、および標準液と比較化合物に使用した溶媒の屈折率で補正した。標準溶液には、トルエンに溶解したテトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）（Φ_Ｆ＝０．１１）を用いた。励起波長における溶液の吸光度は０．０１であった。

一重項酸素量子収率：実験は室温で行った。溶液はＮｄ－ＹＡＧレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ－Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｑｕａｎｔａ－Ｒａｙ ＧＲＣ－１３０）を用いて３５５ｎｍで励起し、６００ライングレーディングのモノクロメーターで波長を選択した後、液体窒素チャンバー内で１９３Ｋに冷却した浜松Ｒ５５０９－４２光電子増倍管で１２７０ｎｍで一重項酸素の燐光を捕集した。散乱や蛍光を避けるため、発光部にはニューポート社のフィルターモデル１０ＬＷＦ－１０００－Ｂを使用した。フェナレノンを一重項酸素発生剤のリファレンスとして使用し、ΦΔ^Ｒｅｆ＝０．９８とした。任意のレーザー強度で測定した試料と参照溶液の一重項酸素発光の減衰を時間ゼロに外挿すると、レーザー強度の関数としての発光強度の関係が得られ、これは一重項酸素量子収率の関係と同じであることがわかった。一重項酸素量子収率は、フェナレノンの一重項酸素量子収率を考慮して、励起波長で試料と参照液が同じ吸収をするときの、試料と参照液の両方のレーザーパルスのエネルギーとの間の線形依存性を比較して得られたものである。

ｎ－オクタノール：ＰＢＳ分配比：シェイクフラスコ法を改良し、ｎ－オクタノールとリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を等量ずつ混合した中の光増感剤の平衡濃度を、同じ光増感剤の典型的な蛍光バンドと、ジメチルスルホキシドで同じ倍率で希釈した後の蛍光の比率を用いて決定した。

光分解実験：光分解の実験は、感光剤を９％ジメチルスルホキシドを含む水に溶解して行った。３ｍＬの量をキュベットに入れ、光がすべて溶液に当たるように照射した。ポルフィリンは、発光波長４１５ｎｍ、有効出力０．２７ｍＷのＬＥＤライトで照射した。光分解量子収率（Φ_ｐｄ）は、光増感剤分子の消失速度ｖ_ｄと光子の吸収速度ｖ_Ｐとの比として定義される。

バクテリアに対する光毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。以下の細菌を用いてアッセイを行った。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２９２１３）を用いた。さらに、コインブラ大学病院（Ｃｅｎｔｒｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌａｒ ｄａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ ｄｅ Ｃｏｉｍｂｒａ）で採取された臨床抗生物質耐性株、すなわち火傷を負った患者の皮膚から採取されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ （ＭＲＳＡ） ｓｔｒａｉｎ Ｓａ１ＣＨＵＣ（すべてのβ－ラクタム系抗生物質に耐性）を用いた試験を実施した。また、火傷の傷口の滲出液から分離されたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ１４１ＨＵＣは、すべてのβ－ラクタム系抗生物質（ペニシリン系、セファロスポリン系、モノバクタム系、カルバペネム系）、キノロン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質のゲンタマイシンとネチルマイシンに高い耐性を示した。プランクトンの細胞は、ミューラー・ヒントン（ＭＨ）寒天（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７^ｏ℃で一晩培養した。細胞密度は、滅菌水で０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄ基準に調整し、約１．５×１０^８ＣＦＵ／ｍＬに相当するようにした。ＰＤＩ実験では、９６ウェルプレートを用いて、様々な濃度の光増感剤と暗所で１時間、室温で細菌の細胞懸濁液をインキュベートした。その後、青色光ＬＥＤ（４２０ｎｍ、４ｍＪ／ｓ）でプレートを照射した。光増感剤を用いて暗所でインキュベートした細胞は、ＰＤＩ群と同じ時間（１時間）アルミホイルで覆った。照明（または暗所でのインキュベーション）後、サンプルを振盪し、ＰＢＳで希釈して混合した。各ウェルからアリコートを取り、ＣＦＵ測定のためにＭＨ寒天に二重にストリークし、３７^ｏ℃／１８～２４時間暗所で培養した。２４時間後、コロニーをカウントし、ＣＦＵを測定した。実験は３重に行った。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で行った。

バイオフィルムに対する光毒性は、バイオフィルムを一晩成長させた後に評価した。アッセイはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２５のバイオフィルムを用いて行った。最初に、細菌の培養物をＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）（Ｋａｓｖｉ（登録商標）、Ｂｒａｚｉｌ）で１：９に希釈した。この微生物を遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分）し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。希釈した細菌懸濁液のアリコートを２４ウェルの平底滅菌ポリスチレンマイクロプレートに接種し、３７℃で２４時間培養した。ＰＤＩ実験では、バイオフィルムのあるプレートを５．２ｎＭの光増感剤と一緒に３０分間、室温で暗所でインキュベートした。コントロールとして使用したウェルはＰＢＳのみでインキュベートした。その後、Ｂｉｏｔａｂｌｅ（登録商標）と名付けられた特別に設計された光源を用いてプレートを照射した。Ｂｉｏｔａｂｌｅ（登録商標）は２４個のＬＥＤランプで構成されており、４００～６５０ｎｍの波長範囲で３０ｍＷ／ｃｍ^２の均一な光を照射することができる。コントロールとして使用したウェルはＰＢＳのみでインキュベートした。光増感剤を用いて暗所でインキュベートした細胞は、ＰＤＩ細胞と同じ時間（１時間）アルミホイルで覆った。照射（または暗黒コントロール）後、光増感剤をウェルから注意深く除去し、バイオフィルムをＰＢＳで１回洗浄した。バイオフィルムを丁寧に削り、超音波処理した後、ボルテックスしてサンプルをホモジナイズした。処理済みおよび未処理のサンプルを連続的に希釈し、ＭＨペトリ皿にプレートし、コロニー形成を可能にするために３７^ｏ℃の暗所で２４時間インキュベートした。この後、コロニーを数え、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した。

ヒト細胞株に対する毒性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）アッセイを用いて、適切な処理後の細胞の生存率を評価した。細胞を付着させた後、ＰＢＳに溶解した光増感剤溶液を０～１０μＭの濃度で細胞培養液に加え、３７℃の暗所で１時間培養した。Ｂｉｏｔａｂｌｅ（登録商標）で照明した後、または対照実験では同等の時間後に、ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶解したＭＴＴを各ウェルに添加し（最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）、マイクロプレートをさらに３～４時間インキュベートした。その後、培地を廃棄し、１００μｌのメタノールを加えて十分に混合し、濃青色のフォルマザンの結晶を溶解させた。フォルマザンの定量は、自動マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｇｏ Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、５７０ｎｍでの吸光度測定により行った。各実験は３回繰り返した。データは６サンプルの平均吸光度値と平均値の標準誤差で表した。

共焦点顕微鏡画像は、Ｚｅｉｓｓ社製の蛍光共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７８０倒立型）を用いて、レーザー励起（ＬＡＳＥＲ Ｄｉｏｄｅ ４０５ｎｍ）で取得した。この顕微鏡には、スペクトルイメージング（４００～７００ｎｍ）用の高感度ＧａＡｓＰ検出器が搭載されている。

Ｂ．化合物の調製方法の説明
ポルフィリン前駆体の一般的な調製方法を以下に示す（図５）。

非対称の５，１５－二置換ポルフィリン前駆体は、市販のジピロメタン（ハーベケム社）と所望のヘテロ芳香族アルデヒドを適当な溶媒に溶解したものを等モル量混合して調製した。溶媒は不活性ガスで脱気し、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタンから選択しました。次に、有機物であるトリフルオロ酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリクロロ酢酸、または無機物であるアルミノシリケート（Ａｌ－ＮａＹ）、スルホン酸粘土から選ばれた酸を触媒として加えた。反応容器を外光から遮断し、不活性ガスの下、０℃から５０℃で１５分から６時間撹拌した。ポルフィリノーゲンへの環化反応を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認した。次に、ポルフィリノーゲンを酸化して、対応するポルフィリンを生成した。適切な量の酸化剤を、Ｏ_２、Ｏ_２／光、ニトロベンゼン／有機酸（炭素数２～１３の酸）、または高電位キノン、すなわち２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（ＤＤＱ）または２，３，５，６－テトラシアノ－１，４－ベンゾキノンから選択し、２５℃～１００℃の温度で５分～１０時間かけて酸化した。溶媒除去後、粗製品を適当な溶媒（ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン）に溶解し、適当な塩基の飽和溶液で洗浄した。塩基は、無機物であり、炭酸塩、リン酸塩から選択されるか、有機物であるか、あるいは、アミン類、好ましくはトリメチルアミンから選択されることができる。その後、適切な溶媒混合物（溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、エチルエーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノールから選択することができる）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。

５，１５－二置換ポルフィリンの非対称金属錯体前駆体は、５，１５－二置換ポルフィリンと選択された金属塩を反応させることによって調製された。５，１５－脱置換ポルフィリンを、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン；ジメチルホルムアミドから選択される適切な溶媒に溶解し、過剰（１～５０当量）の選択された金属塩を添加する。金属塩は、二塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、三塩化アルミニウム；酢酸亜鉛、塩化亜鉛；酢酸パラジウム、二塩化パラジウム、酢酸銀、塩化銀；三塩化インジウム、酢酸インジウムまたはトリクロロシランから選択した。その後、－２５℃から２００℃の間の温度で加熱して反応させた。ＵＶ－ｖｉｓおよび薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で複合体形成をモニターした。完了後、溶媒を除去し、固体をジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、テトラヒドロフラン、エチルエーテルまたは酢酸エチルから選択される適切な溶媒に溶解し、不純物を水で抽出する（３～７回）。有機層を、無水硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、無水硫酸カルシウム；無水酸化カルシウムから選ばれる無機乾燥剤を用いて乾燥させた。デカンテーション後、有機溶媒を蒸発させ、純粋な金属錯体を単離した。

カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリンの合成
カチオン性のオルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン（式Ｉａ；Ｍ＝２Ｈ）は、選択されたハロゲン化された置換または非置換のアルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール（Ｒ≦１２原子）を用いたオルト窒素原子（式Ｉａ、Ｒ）のアルキル化を介して達成された。選択された前駆体５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンを、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン；ジメチルホルムアミドから選択された溶媒に溶解し、選択されたハロゲン化された置換もしくは無置換のアルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリールの過剰量（２～１００当量）を加えた。反応は２０℃～１００℃の温度で１～９６時間維持した。反応の進行をＴＬＣで追跡した。５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン（式Ｉａ；Ｍ＝２Ｈ）を、選択した溶媒で沈殿させた。溶媒は無極性溶媒、すなわちジエチルエーテル、ジクロロメタン、ヘキサン、ペンタン、クロロホルムから選択した。固体をろ過し、選択した溶媒（メタノール、エタノール、プロパノン、酢酸エチル）から再結晶し、純粋なカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン（式Ｉ；Ｍ＝２Ｈ）を単離した。

カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリンの金属錯体の合成
カチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体（式Ｉ；Ｍ＝Ｍｇ、Ａｌ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎ）の金属錯体は、選択されたハロゲン化アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール（Ｒ≦１２原子）を用いたオルト窒素原子（式Ｉａ，Ｒ）のアルキル化を経て合成された。選択された５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン前駆体の金属錯体を、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン；ジメチルホルムアミドから選択された溶媒に溶解し、選択されたハロゲン化アルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリールを過剰（２～１００当量）に添加した。反応は、２０℃から１００℃の間の温度で１～９６時間維持した。反応の進行をＴＬＣで追跡した。生成物である５，１５－ビス（１，３－ジメチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリナート（式Ｉ；Ｍ＝Ｍｇ、Ａｌ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎ）を、選択した溶媒で沈殿させた。溶媒は、無極性溶媒、すなわちジエチルエーテル、ジクロロメタン、ヘキサン、ペンタン、クロロホルムから選択された。固形物をろ過し、選択した溶媒（メタノール、エタノール、プロパノン、酢酸エチル）から再結晶し、純粋なカチオン性オルト－５，１０－ジヘテロアリールポルフィリン（式Ｉ；Ｍ＝Ｍｇ、Ａｌ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎ）を単離した。

カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールバクテリオクロリン（式Ｉｂ）の合成
カチオン性のオルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体を前駆体として用い、対応する還元型バクテリオクロリンを得た。還元は、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２２１２（１６）に開示されている方法を改変して、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ピコリンから選択される溶媒中で、水素源としてヒドラジド、好ましくはｐ－トルエンスルホニルヒドラジド（ｐ－ＴＳＨ）、無機塩基またはヒンダード有機塩基を用いるジイミド還元法に基づいて行った。また、ＰＣＴ／ＰＴ２００９／００００５７（１７）に開示されている方法を改変して、溶媒の不存在下、塩基の不存在下でも還元を行うことができる。冷却（室温）後、固体を水に溶解し、適切な分子量カットオフの膜を備えたＡｍｉｃｏｎデバイスを用いて過剰なヒドラジドを除去した。水を凍結乾燥し、得られた固体を選択した溶媒（メタノール、エタノール、プロパノン、酢酸エチル）から再結晶し、純粋なカチオン性のオルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールバクテリオクロリンを単離した。

カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールクロリン（式Ｉｃ）の合成
カチオン性のオルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンを用いて、対応する還元型クロリンを得た。還元は、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２２１２（１６）に開示されている方法を改変して、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、ジメチルホルムアミド、ピリジンおよびピコリンから選択される溶媒中で、水素源としてヒドラジド、好ましくはｐ－トルエンスルホニルヒドラジド（ｐ－ＴＳＨ）、無機塩基またはヒンダード有機塩基を用いるジイミド還元法に基づいて行った。また、ＰＣＴ／ＰＴ２００９／００００５７（１７）に開示されている方法を改変して、溶媒の不存在下、塩基の不存在下でも還元を行うことができる。冷却（室温）後、固体を水に溶解し、過剰なヒドラジドを、適切な分子量カットオフを持つ膜を備えたＡｍｉｃｏｎデバイスを用いて除去した。クロリンと少量のバクテリオクロリンとの混合物が得られた。クロリンと少量のバクテリオクロリンの混合物を、ジオキサン、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、ジメチルホルムアミドから選ばれる適当な溶媒に溶解し、対応するクロリンに酸化した。酸化は、空気の存在下で２０℃～１００℃で加熱するか、ＦｅＣｌ_３－６Ｈ_２Ｏ（０．５～１０当量）を加えた後、過酸化水素（水に３％、０．１～１０ｍＬ）を加えることで行った。最後の溶液を撹拌下、室温で３０分から６時間保持した。完了後、溶媒を除去し、固体を水に溶かし、適切な分子量カットオフの膜を備えたＡｍｉｃｏｎデバイスを用いて過剰なヒドラジドを除去した。水を凍結乾燥し、得られた固体を選択した溶媒（メタノール、エタノール、プロパノン、酢酸エチル）から再結晶し、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールクロリン（式Ｉｃ）を単離した。

Ｃ．化合物の特性
化合物の吸収率およびその他の光物理学的・光生物学的特性は、「材料と方法」に記載された方法で測定した。赤外の最大吸収波長は、調べた濃度範囲では変化しなかった。これは、選択した溶媒中で検討した濃度において、ほとんどがモノマーとして存在する分子間の凝集が無視できることを示している。表１は、式（Ｉ）の典型的なカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体、より具体的には、９％ジメチルスルホキシドを含む水中の式（ＩＩａ）のポルフィリン誘導体の最も強い吸収帯のモル吸光係数（ε_Ｍａｘ）を示している。また、同表には、蛍光量子収率（Φ_Ｆ）、一重項酸素発生量（Φ_Δ）、ｎ－オクタノール：水の分配係数の対数（ｌｏｇ Ｐ_ＯＷ）も示した。同じ誘導体のヒト線維芽細胞およびヒトケラチノサイトの細胞株に対する光毒性も表１に示した。材料と方法」に記載した多剤耐性菌やバイオフィルム中の細菌を含む細菌に対する光毒性を表２に示す。

表１：式（ＩＩａ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体の光物理学的および光化学的特性と、５Ｊ／ｃｍ^２の光量に対するヒト線維芽細胞およびヒトケラチノサイト細胞株に対する光毒性。

表２：式（ＩＩａ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体の光生物学的特性プランクトン細菌では波長４１５ｎｍで１．３６Ｊ／ｃｍ^２、細菌バイオフィルムでは波長４００～６５０ｎｍで５Ｊ／ｃｍ^２の条件で測定。

最長波長の６２２ｎｍの吸収帯の強度は、１５，０００秒の照射後に△Ａ＝０．００１以下に減少しており、有効吸収量は約４Ｊとなる。

式（Ｉ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリン誘導体の典型的な光物理学的、光化学的、光生物学的特性は、微生物のＰＤＩに採用されている現在の光増感剤の前述の欠点を改善する。特に、式（Ｉ）の分子種は、小さなサイズ、正電荷の適切な分布、生体適合性のあるビヒクルへの溶解性、強い光吸収、便利なモニタリングのための適度な蛍光、および非常に大きな一重項酸素量子収率を有することができる。
光安定性、光治療窓での強い吸収、活性酸素の高い収率、正電荷密度の適切な分布の結合は、式（Ｉ）のポルフィリン誘導体に、ヒトの細胞に対しては非常に低い光毒性を示すが、細菌に対しては非常に高い光毒性を示すという、もう一つの有利な技術特性を提供する。表１は、式（Ｉ）の光増感剤の一例を示したもので、１０μＭの濃度でヒト線維芽細胞およびヒトケラチノサイト細胞株に５Ｊ／ｃｍ^２の光を照射してインキュベートした場合、光毒性は非常に低く、８０％以上のヒト細胞がこの条件で生存している。しかし、１μＭの濃度でグラム陰性のＳ．Ａｕｒｅｕｓやグラム陰性のＥ．Ｃｏｌｉとインキュベートし、１．３６Ｊ／ｃｍ^２または４１５ｎｍの光を照射すると、細菌のＣＦＵ数が７桁も減少する。さらに重要なことは、前記光増感剤を、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株や、カルバペネム系、キノロン系、ゲンタマイシン、ネチルマイシンなどのすべてのβ－ラクタム系に高い耐性を持つアシネトバクター・バウマニスタリンのＰＤＩに使用した場合も同様である。黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対する光毒性はさらに顕著で、約５ｎＭ濃度の前記光増感剤をインキュベートした後、５Ｊ／ｃｍ^２の白色光を照射すると、バイオフィルム内の細菌が７桁も減少した。

式（Ｉ）のポルフィリン誘導体は、標的に向かって速やかに拡散する能力があり、ヒトの細胞に対する光毒性が低く、微生物に対する光毒性が高いことから、これらのポルフィリン誘導体は、本発明に記載の１つまたは複数のポルフィリン誘導体を主な活性剤とするヒトまたは動物用の抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗酵母薬、抗寄生虫薬に特に適している。特にＰＤＩで使用されるこのタイプの薬剤は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含むこともできる。さらに、この製剤は、病原体の排出システムの低分子阻害剤、および／または微生物の外膜を破壊する低分子ポリカチオン種、および／または抗菌ペプチド、および／または光増感剤の三重項状態への電子移動を受けて反応性ラジカルを生成し、微生物の光線力学的不活性化を増強する種を含んでいてもよい。

照射された光増感剤分子から発生した活性酸素種は、化学的・生物学的プロセスのカスケードを引き起こし、最終的に細菌、ウイルス、真菌、酵母、原生動物を死滅させる。

また、本発明の化合物は、合理的な量子収率で、光治療のウィンドウ内で蛍光を発することができる。表１は、Φ_Ｆ＝０．１０の光増感剤の例を示している。この典型的な蛍光は、標的組織における化合物の存在を検出するために使用することができ、本発明の化合物を微生物に由来する感染症の視覚化に使用する可能性を提供する。

実施例
次に、以下の非限定的な実施例において、本発明をより詳細に説明する。

実施例１．５，１５－ビス（１，３－ジメチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリン酸亜鉛（ＩＩ）ジヨダイドの調製方法

ＣＨ_２Ｃｌ_２（３００ｍｌ）中の市販のジピロメタン（４３８ｍｇ，３ｍｍｏｌ）および１－メチルイミダゾール－２－カルボキシアルデヒド（３３０ｍｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液を、触媒量のＴＦＡ（１５３μＬ，２ｍｍｏｌ）を添加する前に、アルゴンの連続流で１０分間脱気した。反応容器を外光から遮断し、アルゴン雰囲気下、Ｔ＝２５℃で３時間撹拌した。次に、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（ＤＤＱ）（２．０４ｇ，６ｍｍｏｌ）を反応混合物に一度に加え、温度３０～５０℃で１時間攪拌を続けた。溶媒を除去した後、粗製品をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で洗浄した。その後、ジクロロメタン／メタノール（１０：１）を溶離液として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行った。溶媒蒸発後、５，１５－ビス（１－メチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリンを単離し、真空下で乾燥後、収率１９％（０．１３４ｇ）で得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ａｔｒｏｐｏｉｓｏｍｅｒｓ １０．３５（ｓ，２Ｈ），９．４３（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，４Ｈ），９．０３（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，４Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｓ，２Ｈ），３．５２（ｓ，６Ｈ），－３．３１（ｓ，２Ｈ）．ＵＶ－ｖｉｓ（ＣＨ_２Ｃｌ_２）：λ_ｍａｘ／ｎｍ（ｌｏｇε）：４０６（４．８３），５００（３．７５），５３５（３．５４），５７３（３．３７），６２７（３．１２）．ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＣＨ_２Ｃｌ_２），ｍ／ｚ：４７１．２０４０５；ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｃ_２８Ｈ_２３Ｎ_８ ^＋］：４７１．２０４０２。

次に、前駆体である５，１５－ビス（１－メチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリン（８６ｍｇ；０．１８３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのクロロホルムに溶解した。これとは別に、酢酸亜鉛（４０１ｍｇ；１．８３ｍｍｏｌ）をメタノール３ｍＬに溶解し、温度２５℃で攪拌しながら先ほどの溶液に加えた。ＵＶ－ｖｉｓおよび薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で錯体形成をモニターした。反応が完了したら、溶媒を除去し、固体をジクロロメタンに溶解し、過剰の金属塩を水で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を除去した。固体を真空下で乾燥させ、７０ｍｇ（収率８１％）の５，１５－ビス（１－メチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリン酸亜鉛（ＩＩ）を得た。ＵＶ－ｖｉｓ（ＤＭＳＯ）：λ_ｍａｘ／ｎｍ（ｌｏｇε）：４１５（４．２９），５４５（３．１４），５８１（２．９４）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ａｔｒｏｐｏｉｓｏｍｅｒｓ １０．３８（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，２Ｈ），９．６６（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，４Ｈ），９．０４（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，２Ｈ），８．９４（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，２Ｈ），８．０２（ｓ，２Ｈ），７．６２（ｓ，２Ｈ）。

最後に、５，１５－ビス（１－メチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリン酸亜鉛（ＩＩ）（２０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）のイミダゾイル基の４級化は、３０℃で１２～２４時間、溶媒として優先的にＤＭＦ（０．１５ｍＬ）を用いて大過剰のヨードメタン（１００ ｅｑ）で窒素イミダゾイル原子をメチル化することで達成した。反応の進行をＴＬＣで追跡した。生成物である５，１５－ビス（１，３－ジメチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリン酸亜鉛（ＩＩ）ジヨダイド（式ＩＩａ）をジエチルエーテルで沈殿させ、溶媒として優先的にメタノールまたはエタノールを用いてろ過・再結晶を行ったところ、ほぼ定量的な収率で５，１５－ビス（１，３－ジメチルイミダゾール－２－イル）ポルフィリン酸亜鉛（ＩＩ）ジヨダイド（式ＩＩａ）が得られました。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－Ｄ_６）：δ１０．７３（ｓ，２Ｈ），９．８１（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，４Ｈ）），９．０７（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，４Ｈ）），８．５０（ｓ，４Ｈ），３．７０（ｓ，１２Ｈ），ＵＶ－ｖｉｓ（Ｈ_２Ｏ）：λ_ｍａｘ／ｎｍ（ｌｏｇε））：４０６（４．３７），５４０（３．０９），５７３（３．３４）．ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ－Ｉ］＋（ＭｅＯＨ），ｍ／ｚ：６８９．０６１３４；ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ ［Ｃ_３０Ｈ_２６ＩＮ_８Ｚｎ^＋］：６８９．０６１１１。

図７は、式（ＩＩａ）の化合物の吸収スペクトルを示している。

実施例２．グラム陽性のＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ ＡＴＣＣ ２９２１３、グラム陰性のＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ ＣＯＬＩ ＡＴＣＣ ２５９２２、およびグラム陰性のＰＳＥＵＤＯＭＯＮＡＳ ＡＥＲＵＧＩＮＯＳＡ ＡＴＣＣ ２７８５３に対する光毒性
本実施例では、式（ＩＩａ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンのグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ光毒性の評価について説明する。光毒性の測定は、「材料と方法」の項の記述に従って行った。式（ＩＩａ）のポルフィリンは水に可溶であり、その使用には特別な処方を必要としなかった。非処理の対照に対して試験化合物の用量－光毒性反応がある。図８は、４１５ｎｍで１．３６Ｊ／ｃｍ^２の光照射を行った場合のＣＦＵ減少量を光増感剤濃度の関数として示したものである。ナノモル濃度の試験化合物を６０分インキュベートした場合、低光量でＣＦＵが劇的に減少した。

実施例３．多剤耐性グラム陽性菌株ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳおよび多剤耐性グラム陰性菌株ＡＣＩＮＥＴＯＢＡＣＴＥＲに対する光毒性
本実施例では、式（ＩＩａ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンの多剤耐性グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ光毒性の評価について述べる。アッセイは、コインブラ大学病院（Ｃｅｎｔｒｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌａｒ ｄａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ ｄｅ Ｃｏｉｍｂｒａ）の臨床耐性株、すなわち火傷患者の皮膚から採取したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ （ＭＲＳＡ） ｓｔｒａｉｎ Ｓａ１ＣＨＵＣ（すべてのβ－ｌａｃｔａｍｉｃ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓに耐性）と、火傷の傷口の滲出液から分離したＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ１４１ＨＵＣ（カルバペネム系抗菌薬、キノロン系抗菌薬、ゲンタマイシン、ネチルマイシンを含むすべてのβ－ｌａｃｔａｍｉｃｓに高い耐性）を用いて行った。光毒性の測定は、「材料と方法」の項の記述に従って行った。式（ＩＩａ）のポルフィリンは水に可溶であり、その使用には特別な製剤を必要としなかった。試験化合物の投与量－光毒性反応は、非処理の対照と比較して見られる。図９は、４１５ｎｍで１．３６Ｊ／ｃｍ^２の光照射を行った場合の、光増感剤濃度の関数としてのＣＦＵ減少量を示している。試験化合物の濃度が１ μＭの場合、６０分間のインキュベーションの後、低光量の光を照射すると、ＣＦＵが劇的に減少することがわかる。

実施例４．黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対する光毒性
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２５のバイオフィルムを２４ウェル平底滅菌ポリスチレンマイクロプレート上で培養した。２４時間後、共焦点顕微鏡でプレートを観察したところ、平均厚さ２０μｍのバイオフィルムの形成が裏付けられた。次に、式（ＩＩａ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンの１μＭ溶液を加え、前記光増感剤の１時間のインキュベーション時間にわたってバイオフィルムからの蛍光強度を追跡した。図１０は、バイオフィルムと３０分間インキュベートした後の、式（ＩＩａ）の分子種の蛍光を示している。
光毒性試験では、２４ウェル平底滅菌ポリスチレンマイクロプレート上で培養したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２５バイオフィルムを、５．２ｎＭの式（ＩＩａ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンとともに、室温で暗所にて３０分間インキュベートした。コントロールとして使用したウェルはＰＢＳのみでインキュベートした。インキュベーション期間終了後、プレートにＢｉｏｔａｂｌｅ（登録商標）を照射した。暗所で光増感剤とインキュベートした細胞は、ＰＤＩ細胞と同じ時間、アルミホイルで覆った。照射（または暗黒コントロール）後、バイオフィルムをウェルから注意深く取り除き、ＰＢＳで１回洗浄した。バイオフィルムを丁寧に削り、超音波処理した後、ボルテックスしてサンプルをホモジナイズした。処理したサンプルと未処理のサンプルを連続的に希釈し、ＭＨペトリ皿にプレーティングし、コロニー形成を可能にするために３７^ｏ℃の暗所で２４時間インキュベートした。この後、コロニーを数え、ＣＦＵを測定した。この体験は９回行った。図１１は、式（ＩＩａ）の光増感剤を５．２ｎＭの濃度で用いた場合のバイオフィルムの不活性化を示している。

実施例７．繊維芽細胞（ＨＤＦＮ－ＧＩＢＣＯ）およびケラチノサイト（ＨＡＣＡＴ）細胞株に対する毒性
本実施例では、式（ＩＩａ）のカチオン性オルト－５，１５－ジヘテロアリールポルフィリンのＨＤＦｎ新生児ヒト真皮線維芽細胞およびＨａＣａＴ不死化ヒトケラチノサイト細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性を評価した。両タイプの細胞は、１０％牛胎児血清（Ｃｕｌｔｉｌａｂ－Ｃａｍｐｉｎａｓ，ＳＰ，Ｂｒａｚｉｌ）を添加したＤＭＥＭ（ＢｉｏＴｅｃｈ社）で培養した。実験前に細胞をトリプシンで除去し、ＰＢＳで洗浄した後、３７ｏ℃および５％ＣＯ２の加湿環境下で維持した。細胞は暗所でＰＢＳ中の式（ＩＩａ）の光増感剤と１０μＭまでの濃度で３０分間インキュベートした後、Ｂｉｏｔａｂｌｅ（登録商標）を用いて４００～７００ｎｍの波長範囲で５Ｊ／ｃｍ^２の光を照射した。光照射後、細胞を新しい培地で洗浄し、プレートをインキュベーターに戻して２４時間培養した。細胞の生存率は、照射２４時間後に実施したＭＴＴアッセイで測定した。対照実験の細胞は、照射時間の間、暗所に留まった。図１２は、暗所で１０μＭ濃度の被験薬とインキュベートした線維芽細胞およびケラチノサイトが、細胞生存率の統計的に有意な低下を示さなかったことを示している。また、試験した薬物の最高用量である１０μＭでは、線維芽細胞の生存率が２０％低下しただけであった。これらの例は、式（ＩＩａ）の光増感剤がバクテリアやバイオフィルムに対して非常に高い光毒性を示す薬剤および光の投与量では、ヒトの細胞に対しては毒性や光毒性を示さないことを示している。

Claims (16)

1. カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体、すなわち、式Ｉのポルフィリン、クロリンまたはバクテリオクロリンであり、
   

   

   Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選択される金属イオンであり、
   Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有するものとし、
   ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素から、またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択された環内の原子であり、また、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素から、またはＲから選択され、
   ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はそれぞれ独立してＹＲ′′から選択され、ここにてＹはそれぞれ独立して炭素、硫黄または窒素から選択された環の原子であり、また、Ｒ′′はＹに結合しており、Ｒ′′およびＲ′′はそれぞれ独立して水素から、またはＲから選択されており、
   または、微生物の光力学的不活性化のためのそれらの医薬的に許容される塩である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
2. 請求項１に記載の使用のためのカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、特に式（Ｉａ）のポルフィリン類において、
   

   

   Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選ばれた金属イオンであり、
   Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有するものとし、
   ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素から、またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択された環内の原子であり、また、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素から、またはＲから選択され、
   ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はそれぞれ独立してＹＲ′′から選択され、ここにてＹはそれぞれ独立して炭素、硫黄または窒素から選択された環の原子であり、また、Ｒ′′はＹに結合しており、Ｒ′およびＲ′′はそれぞれ独立して水素から、またはＲから選択されており、
   または、それらの医薬的に許容される塩である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
3. 請求項２に記載の使用のためのカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、式（Ｉａ）において、
   Ｍは、Ｚｎであり、
   Ｚ_１は、ＹＲ′′であり、ここで、Ｙは、Ｚ_２と炭素に結合した環内の窒素であり、Ｒ′′は、Ｙに結合したメチルであり、
   Ｚ_２およびＺ_３は、炭素であり、
   Ｒはメチルであり、
   また、ｎ＝０であり、つまり、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体は式（ＩＩａ）を有し、
   

   

   または、それらの医薬的に許容される塩である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
4. 請求項１に記載のカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、特に式（Ｉｂ）のバクテリオクロリン類において、
   

   

   Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選択される金属イオンであり、
   Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有するものとし、
   ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素から、またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択された環内の原子であり、また、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素から、またはＲから選択され、
   ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はそれぞれ独立してＹＲ′′から選択され、ここにてＹはそれぞれ独立して炭素、硫黄または窒素から選択された環の原子であり、また、Ｒ′′はＹに結合しており、Ｒ′およびＲ′′はそれぞれ独立して水素から、またはＲから選択されており、
   または、それらの医薬的に許容される塩である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
5. 請求項４に記載のカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールバクテリオクロリン類が、式（Ｉｂ）において、
   ＭはＺｎであり、
   Ｚ_１は、ＹＲ′′であり、ここで、Ｙは、Ｚ_２への環結合および炭素への環結合における窒素であり、Ｒ′′は、Ｙに結合したメチルであり、
   Ｚ_２およびＺ_３は炭素であり、
   Ｒはメチルであり、
   また、ｎ＝０であり、
   または、それらの医薬的に許容される塩である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
6. 請求項１に記載のカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、特に式（Ｉｃ）のクロリン類において、
   

   

   Ｍは、Ｈ_２またはＭｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｉｎから選択される金属イオンであり、
   Ｒは、未置換または置換されたアルキル、未置換または置換されたヘテロアルキル、未置換または置換されたアリール、未置換または置換されたヘテロアリールから選択され、ただし、Ｒは１２個未満の原子を有するものとし、
   ｎ＝０の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３は、それぞれ独立して、酸素から、またはＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙは、それぞれ独立して、炭素、硫黄または窒素から選択された環内の原子であり、また、Ｒ′′は、Ｙに結合し、それぞれ独立して、水素から、またはＲから選択され、
   ｎ＝１の場合、Ｚ_１、Ｚ_２およびＺ_３はそれぞれ独立してＹＲ′′から選択され、ここで、Ｙはそれぞれ独立して炭素、硫黄または窒素から選択された環の原子であり、また、Ｒ′′はＹに結合しており、Ｒ′およびＲ′′はそれぞれ独立して水素から、またはＲから選択されており、
   または、それらの医薬的に許容される塩である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
7. 請求項６に記載のカチオン性オルト－５，１０－ジ－ヘテロアリールクロリン類が、式（Ｉｃ）において、
   Ｍは、Ｚｎであり、
   Ｚ_１は、ＹＲ′′であり、ここで、Ｙは、Ｚ_２への環結合および炭素への環結合における窒素であり、Ｒ′′は、Ｙに結合したメチルであり、
   Ｚ_２およびＺ_３は、炭素であり、
   Ｒはメチルであり、
   また、ｎ＝０であり、
   または、それらの医薬的に許容される塩である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
8. 請求項１に記載の使用のためのカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、微生物が細菌である、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
9. 請求項１に記載の使用のためのカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、微生物がバイオフィルムである、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
10. 請求項１～７に記載のカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、細菌、真菌、酵母菌、ウイルスまたは原虫を含む微生物によって引き起こされる感染症の治療に使用される、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
11. 請求項１～７に記載のカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体であって、消毒薬および／または防腐薬として、および／または微生物に起因する感染症の予防に使用される、カチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体。
12. 請求項１～７に記載の誘導体の少なくとも１つと、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
13. 病原体排出システムの小分子阻害剤、および／または微生物の外膜を破壊する小ポリカチオン分子種、および／または抗菌ペプチド、および／または光増感剤の三重項状態への電子移動を受けて反応性ラジカルを生成し、微生物の光力学的不活性化を増強する種を追加的に含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 細菌、および／またはウイルス、および／または真菌の感染症の治療に使用される、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
15. 局所療法に使用される、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
16. 以下の処置：
    ・ 請求項１～７に記載の少なくとも１つのカチオン性オルト－５，１５－ジ－ヘテロアリールポルフィリン誘導体を選択する処置と、
    ・ 請求項１２または１３に記載の医薬組成物を調製する処置と、
    ・ 前記医薬組成物を微生物の排除を意図した対象に適用する処置と、
    ・ 前記ポルフィリン誘導体が前記対象の微生物に蓄積する時間を確保する処置と、
    ・ 前記対象の微生物に適切な波長の光を照射して前記ポルフィリン誘導体を活性化し、前記微生物を破壊する処置と、
    を含む、実際の患者の環境における微生物の排除方法。

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