JP2022534845A

JP2022534845A - ヒドロゲル薬物送達組成物

Info

Publication number: JP2022534845A
Application number: JP2021561875A
Authority: JP
Inventors: ワン，ドン; アルモシャリ，ヨシフ; レン，ロングォ
Original assignee: ボードオブリージェンツオブザユニバーシティオブネブラスカ; ボヘバイオテクノロジー（チェンドゥ）カンパニーリミテッド
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2022-08-04
Also published as: IL287330A; WO2020211859A1; AU2020257376A1; EP3982929A1; EP3982929A4; CA3146153A1; CN115666520A; US20220218571A1

Abstract

開示されるのは、治療剤とポロキサマーとを含むヒドロゲル薬物送達組成物であって、ポロキサマーは、骨または歯の表面に付着することができるように修飾されており、ポロキサマーは、ピロホスフェート、ビスホスホネート、酸性ペプチドまたはテトラサイクリンおよびその誘導体により修飾されている、ヒドロゲル薬物送達組成物である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／８３５５４２号に対する優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、薬物送達システムの分野、特にヒドロゲル薬物送達組成物に関する。

口腔疾患は、ヒトにおいて非常に一般的な疾患である。ほとんどの場合、口腔疾患の処置は、局所投薬しか必要とせず、全身投薬を必要としない。一部の患者では、全身投薬は、重篤な副作用を引き起こすことがある。さらに、全身投薬は、体内で薬物耐性を容易に招き、薬物の有効性を低下させる可能性がある。加えて、口腔環境は複雑であり、多くの要因が口腔の健康に影響を与える。例えば、抗生物質の長期使用は、口腔の正常菌叢を破壊することになる。研究者らは、標的を定めて口腔内で薬物を効果的に放出することができる送達システムを探してきた。

歯周疾患は、歯肉、歯根膜および歯槽骨を含む歯の周囲組織に影響を与えてポケット形成、動揺、骨喪失を生じ、最終的に歯を喪失する一般的かつ慢性的な炎症状態である。病原性細菌集団に加えて、宿主免疫応答（これは、細菌の侵襲から宿主組織を保護することを目的とする）は、歯周損傷のメディエータとしても作用する^［１］。現在の処置戦略は、機械的治療法および抗菌剤の投与により細菌負荷を軽減することを目的とする^{［２、３］}。加えて、炎症を寛解し、疾患進行を防止するために宿主調節剤が利用されてきた^{［４、５］}。歯槽骨喪失（これは、歯周疾患の主な破壊的かつ非可逆的な特徴である）を食い止めるそれらの有効性は限定される。したがって、骨侵食を防止し、失われた歯槽骨を再生することになる新規な治療法を開発するという満たされていない臨床的必要性が存在する。

グリコーゲン合成酵素キナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）は、炎症および骨恒常性を含むいくつかの生理的過程において決定的な役割を有するマルチタスクのセリン／トレオニンキナーゼである。これは、負の制御因子として宿主の炎症反応^{［６～８］}および骨恒常性^［９］において決定的な役割を果たすことが示されており、ＧＳＫ３βの阻害薬が炎症性および骨代謝性疾患に治療効果をもたらし得ることを示唆する^［１０］。特に、ＧＳＫ３β阻害薬（ＳＢ２１６７６３）が歯周疾患において研究されてきており、データにより、歯周疾患に関連する歯槽骨喪失の防止におけるその治療上の利益が確認された^［１１］。過去１０年間に、いくつかの選択的ＧＳＫ－３β阻害薬が合成され、様々な相の臨床試験において試験されてきた^{［１２、１３］}。特に、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（ＢＩＯ）（５ｎＭの酵素ＩＣ５０を有する強力なＧＳＫ３β阻害薬）は、抗炎症性^{［７、８］}ならびに強い骨および歯同化作用^{［１４～２０］}を示した。しかし、複数の生理的過程におけるＧＳＫ３の関与に起因して、全身投与は、重篤な有害副作用（例えば、下痢、低血糖、腫瘍発生）を引き起こすことがある^{［２１～２３］}。したがって、その生物学的作用を主として所期の作用部位において限定および制限することが必要である。歯周ポケット内へのＢＩＯの局所送達は、歯周組織を直接標的にし、全身毒性を最小限に抑えると共に高い局所濃度を達成することを可能にする。しかし、乏しい水性溶解度および歯周ポケットからのＢＩＯの迅速な排除が、その効果的な局所送達にとって大きな課題となる。

スタチン（これらは、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル（ＨＭＧ）－ＣｏＡ還元酵素阻害薬として開発された）は、数十年間、心血管疾患を処置するために広く使用されてきた。Ｍｕｎｄｙらは、２種のスタチン、シンバスタチン（ＳＩＭ）およびロバスタチンが、骨誘導因子骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）の誘導によるとされた強い骨同化作用を有することを報告した。後に、スタチンは、その抗炎症作用でも知られる^［５６］。それ以来、この知見の検証を試みて、大きな努力が投じられてきた。しかし、結果は、肝臓における初回通過代謝（これは、経口的に投与されたとき骨に達する量を限定し、骨格骨を強化するまたは歯周炎を処置するそれらの臨床応用を妨げてきた）に部分的に起因して、議論の余地が残されている。シンバスタチンの局所適用は、その乏しい水溶性により妨げられる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００６４１）。

歯周ポケットに注入された熱応答性ヒドロゲル製剤は、歯周炎に関連する骨欠損を防止するためのＢＩＯまたはＳＩＭの局所送達にとって有望な選択肢であろう。医薬用途向けに米国ＦＤＡにより承認された頻繁に使用される製剤賦形剤であるポロキサマー４０７（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７）は、２つのポリエチレンオキシドブロックが両側に隣接するポリプロピレンオキシドの中央ブロックからなるトリブロック両親媒性コポリマー（ＰＥＯ１０１ＰＰＯ５６ＰＥＯ１０１）である^{［２４～２７］}。これは、制御された薬物および細胞送達において広範に使用されてきた^［２８］。水性溶液（２０～３５％ｗ／ｖ）におけるその特有の熱応答性ゲル化特性は、水性溶液を歯周薬物送達および他の同様の用途に魅力的な担体材料にする^{［２９、３０］}。両親媒性Ｆ１２７ポリマーは、ミセルを形成することにより室温における疎水性薬物の溶解度を向上させる。生理的温度に曝されると、ポリマー溶液はヒドロゲルを生成し、その崩壊したミセル構造内にカプセル化された薬物を保持して徐放速度論を実現する。Ｆ１２７は、非毒性かつ生体適合性であることも既知である^［３０］。しかし、絶え間ない溝液の流れ、Ｆ１２７ヒドロゲルの乏しい骨付着および機械的特性は、歯周ポケット内のペイロード薬物のバイオアベイラビリティを著しく制限するであろう。

したがって、硬組織へのヒドロゲルの結合を改善することおよび局所部位における効果的な薬物放出のための新規なヒドロゲル薬物送達システムを開発することが必要とされている。

１つの態様において、本開示は、治療剤とポロキサマーとを含む薬物送達組成物であって、ポロキサマーは、骨または歯の表面に付着することができるように修飾されている、薬物送達組成物を提供する。

ポロキサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が両側に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖から構成された非イオン性トリブロックコポリマーである。好ましくは、ポロキサマーは、ピロホスフェート、ビスホスホネート、ドーパミン、酸性ペプチドまたはテトラサイクリンおよびその誘導体により修飾されている。

より好ましくは、ポロキサマーは、ピロホスホリル化ポロキサマーまたはポロキサマーとピロホスホリル化ポロキサマーとの混合物である。

本開示の実施形態において、
ポロキサマーは、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ３１、Ｌ３５、Ｆ３８、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ６２、Ｌ６３、Ｌ６４、Ｐ６５、Ｆ６８、Ｌ７２、Ｐ７５、Ｆ７７、Ｌ８１、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｌ９２、Ｆ９８、Ｌ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０８、Ｌ１２１、Ｌ１２２、Ｌ１２３、Ｆ１２７、１０Ｒ５、１０Ｒ８、１２Ｒ３、１７Ｒ１、１７Ｒ２、１７Ｒ４、１７Ｒ８、２２Ｒ４、２５Ｒ１、２５Ｒ２、２５Ｒ４、２５Ｒ５、２５Ｒ８、３１Ｒ１、３１Ｒ２、３１Ｒおよびそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、ポロキサマーはポロキサマー４０７（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７）であり、
治療剤は、抗炎症化合物、骨同化化合物、骨再吸収抑制化合物、抗がん化合物、スタチンおよび抗菌化合物を含み、好ましくは、治療剤は、ＧＳＫ３－ベータ阻害薬またはスタチンである。

本発明において使用されてよいＧＳＫ３－ベータ阻害薬を表１に挙げる。

本開示の１つの実施形態において、ＧＳＫ３－ベータ阻害薬は、インジルビンおよびその誘導体、リチウム、ベリリウム、亜鉛ならびにそれらの混合物など、表１に挙げられた化合物から選択され、好ましくは、ＧＳＫ３－ベータ阻害薬は、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム、リチウムまたは亜鉛である。

本発明において使用されてよいスタチンには、アトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ）、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ、ＬｅｓｃｏｌＸＬ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ、Ａｌｔｏｐｒｅｖ）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ）、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ）およびピタバスタチン（Ｌｉｖａｌｏ）が含まれる。

好ましくは、組成物は、ヒドロゲルの形態であり、ヒドロゲルは熱感受性である。

別の態様において、本開示は、薬物送達組成物を製造する方法であって、
ポロキサマーをトシル化反応に供してトシル化ポロキサマーを合成する工程と、
トシル化ポロキサマーをピロホスホリル化に供してピロホスホリル化ポロキサマーを得る工程と、
治療剤をピロホスホリル化ポロキサマーに溶解してヒドロゲル含有薬物送達組成物を得る工程と
を含む、方法を提供する。

別の態様において、本開示は、薬物送達組成物を、それを必要とする対象に局所部位においてｉｎｓｉｔｕで投与する工程を含む、口腔疾患を治療する方法を提供する。

好ましくは、局所部位は歯であり、口腔疾患は、歯科疾患、より好ましくは歯周炎である。組成物は、治療剤を放出して少なくとも２日にわたり口腔疾患を処置することができ、組成物は、局所部位に対してのみ付着性である。

ピロホスホリル化ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（Ｆ１２７－ＰＰｉ）の合成を示す図である。ＰＦ１２７ヒドロゲルのｉｎｖｉｔｒｏ特徴付けを示す図である。（ａ）Ｆ１２７－ＰＰｉおよびＦ１２７の異なる比率を使用して調製された２５％ｗ／ｖＰＦ１２７ヒドロゲルのヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結合の評価。Ｆ１２７ヒドロゲル（比率０）と比較すると^＊＊Ｐ＜０．０１および^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；比率２５と比較すると^＃Ｐ＜０．０５および^＃＃Ｐ＜０．０１（テューキーの多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡ）。（ｂ）４℃でのＰＦ１２７溶液対Ｆ１２７溶液中のＢＩＯの溶解度。^＊＊Ｐ＜０．０１および^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（テューキーの多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡ）。（ｃ）３７℃でのＰＦ１２７ヒドロゲルからの累積ＢＩＯ放出。（ｄ）残留重量（％）により測定された、３７℃でインキュベートされたＰＦ１２７ヒドロゲルの浸食時間。値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）で示されている。（ａ）２４時間および（ｂ）４８時間曝露後にＣＣＫ－８アッセイにより測定された、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の増殖に対する異なる処置の効果を示す図である。データは平均±ＳＤで示されている。対照群と比較すると^＊Ｐ＜０．０５。ＢＩＯ群と比較すると^＃Ｐ＜０．０５。対照群と比較すると^＊＊Ｐ＜０．０１。ＢＩＯ群と比較すると^＃＃Ｐ＜０．０１。ヒドロゲルの物理的特性を示す図である。（ａおよびｄ）ＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲルおよびＰＦ１２７ヒドロゲルのゲル化温度（Ｔ_ｇｅｌ）値を決定した貯蔵および損失弾性率（Ｇ’およびＧ’’）。異なる剪断速度における（ｂ）ＰＦ１２７ヒドロゲルおよび（ｃ）ＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲルの粘度。異なる剪断速度における（ｅ）Ｆ１２７ヒドロゲルおよび（ｆ）Ｆ１２７－ＢＩＯヒドロゲルの粘度。実験的歯周炎ラットモデルにおけるＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲルの治療有効性のｉｎｖｉｖｏ評価を示す図である。（ａ）上顎大臼歯セメントエナメル境（ＣＥＪ）－歯槽骨頂（ＡＢＣ）に対する異なる処置の効果を示すマイクロＣＴ矢状断像。白色の鉛直線はＡＢＣ－ＣＥＪ距離を示す。スケールバー＝１ｍｍ。（ｂ）ＣＥＪとＡＢＣの間の直線距離の測定。（ｃ～ｄ）異なる処置後の歯槽骨の質の定量分析。骨量（ＢＶ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）。値は平均±ＳＤで示されている。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１および^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（テューキーの多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡ）。３週間の異なる処置後の乳頭結合組織ならびに第一大臼歯（Ｍ１）と第二大臼歯（Ｍ２）の間の歯槽骨の組織学的解析を示す図である。（ａ）ＨおよびＥ染色組織の異なる処置群からの代表的な画像。（ｂ）炎症細胞および（ｃ）破骨細胞の半定量的評価。値は平均±ＳＤで示されている。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１および^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｃｏｎ＋群と比較すると^＃Ｐ＜０．０５、^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃＃＃Ｐ＜０．００１および^＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。（一元配置ＡＮＯＶＡ）。スケールバー＝１００倍および４００倍についてそれぞれ２００μｍおよび５０μｍ。黒色の矢印は歯槽骨を示し、アスタリスクは第一大臼歯（Ｍ１）を示す。処置部におけるβ－カテニンの免疫組織化学（ＩＨＣ）解析を示す図である。（ａ）歯槽骨頂（ＡＢＣ）上かつ第一大臼歯（Ｍ１）と第二大臼歯（Ｍ２）の間の結合組織のβ－カテニンのＩＨＣ染色の異なる処置群からの代表的な画像。（ｂ）第一大臼歯（Ｍ１）と第二大臼歯（Ｍ２）の隣接面間のβ－カテニン陽性細胞の半定量的評価。値は平均±ＳＤで示されている。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１および^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｃｏｎ＋群と比較すると^＃＃＃Ｐ＜０．００１。（一元配置ＡＮＯＶＡ）。スケールバー＝２００μｍ。黒色の矢印は歯槽骨を示し、アスタリスクは、第一大臼歯（Ｍ１）および第二大臼歯（Ｍ２）を示す。ＳＩＭ負荷ＰＦ１２７／Ｆ１２７ヒドロゲルの相転移の画像である。実験的歯周炎ラットモデルにおけるＳＩＭ負荷ＰＦ１２７ヒドロゲルの治療有効性のｉｎｖｉｖｏ評価を示す図である。（ａ）上顎大臼歯セメントエナメル境（ＣＥＪ）－歯槽骨頂（ＡＢＣ）に対する異なる処置の効果を示すマイクロＣＴ矢状断像。白色の鉛直線はＡＢＣ－ＣＥＪ距離を示す。スケールバー＝１ｍｍ。（ｂ）ＣＥＪとＡＢＣの間の直線距離の測定。（ｃ～ｄ）異なる処置後の歯槽骨の質の定量分析。骨量（ＢＶ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）。値は平均±ＳＤで示されている。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（テューキーの多重比較による一元配置ＡＮＯＶＡ）。

実施形態を参照して本開示の実施形態を以下で詳細に説明する。しかし、以下の実施形態は単に本開示を例示するものであり、本開示の範囲を限定するものではないことを当業者なら理解するであろう。特定の条件が指定されない実施形態について、それらは従来の条件または製造者により推奨された条件にしたがって行った。製造者が示されない使用試薬または使用機器について、それらはすべて市販の従来の製品であった。

［実施例１］
材料および試薬
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７およびピロホスフェートをＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯのＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ、ＵＳＡ）から購入した。ＢＩＯを文献^［３１］にしたがって合成した。高密度セラミックヒドロキシアパタイトディスク（０．５インチ径および０．０８インチ厚）をＣｌａｒｋｓｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（ＳｏｕｔｈＷｉｌｌｉａｍｓｐｏｒｔ、ＰＡＵＳＡ）から入手した。マウス骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｌ１細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標））をＧｅｍｉｎｉＢｅｎｃｈＭａｒｋ（ＷｅｓｔＳａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）から入手した。最小必須培地（アルファ－ＭＥＭ）およびトリプシン－ＥＤＴＡをＧＩＢＣＯ（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８（ＣＣＫ－８）をＤｏｊｉｎｄｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤＵＳＡ）から購入した。すべての他の溶媒および試薬（指定されない場合）をＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ（ＭｏｒｒｉｓＰｌａｉｎｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）またはＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）のいずれかから入手した。

ピロホスホリル化ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（Ｆ１２７－ＰＰｉ）の合成
トシル化ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７の合成
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（１．０ｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）および４－トルエンスルホニルクロリド（１５１ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタンに溶解した。次いで、ピリジン（６２μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を２１℃で２４時間撹拌した。ジクロロメタン（８０ｍＬ）を加えた後、得られた溶液をＨＣｌ（１Ｍ、２０ｍＬ）およびブライン（８０ｍＬ×２）で洗浄した。洗浄後、有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥した。溶液を濾過し、濃縮し、残留物をＬＨ－２０カラムで精製して、９２２ｍｇの最終生成物（収率：９０％）を生成した。¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ ppm 7.78 (d, J = 3.0 Hz, 4H), 7.33 (d, J = 3.0 Hz 4H), 4.14 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.77 (t, J = 4.5 Hz, 8H), 3.59-3.55 (m, 872 H), 3.50-3.44 (m, 142 H), 3.38 (m, 65H), 2.44 (s, 6H), 1.12 (t, J = 5.0 Hz, 195H); ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz) δ ppm 144.7, 133.0, 129.8, 127.9 , 75.5, 75.4, 75.1, 73.4, 73.0, 72.9, 72.7, 69.2, 68.7, 21.6, 17.5, 17.3.
ピロホスホリル化ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７の合成
トシル化ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（１．０ｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）および二リン酸水素トリス（テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム）［（ｎ－Ｂｕ_４Ｎ）_３（ＨＯ）Ｐ_２Ｏ_６］（０．３１ｍｍｏｌ、２８０ｍｇ）を乾燥アセトニトリルに溶解した。出発材料が完全に消失するまで（約３時間、ＴＬＣにより監視）、溶液を２１℃で撹拌した。溶媒の除去後、残留物を水（２０ｍＬ）に溶解し、ＮａＣｌ溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）に対して一晩透析（ＭＷＣＯ＝１２～１４ｋＤａ）して、テトラブチルアンモニウムをナトリウムに交換した。次いで、得られた溶液を蒸留水に対して透析して、過剰なＮａＣｌを除去した。次いで、得られた溶液を凍結乾燥して、８５９ｍｇの最終的なピロホスホリル化ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（Ｆ１２７－ＰＰｉ）生成物（収率：８５％）を得た。合成経路は図１に示されている。
¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ ppm 4.16 (t, J = 5.0 Hz, 4H), 3.78 (t, J = 4.5 Hz, 8H), 3.59-3.54 (m, 872H), 3.50-3.44 (m, 142 H), 3.39-3.36 (m, 65H), 1.13 (t, J = 5.0 Hz, 195H); ¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz)δ ppm 75.5, 75.4, 75.1, 73.4, 73.0, 72.9, 72.8, 72.7, 70.6, 17.5, 17.3; ³¹P NMR (202.5MHz, CDCl₃): δ(ppm) = -7.70 (d, J = 20.2Hz), -7.91 (d, J = 20.2Hz).
ＰＰｉ含量を決定するために、Ｆ１２７－ＰＰｉを１ＭＨＣｌ中１００℃で２時間加水分解して、ホスフェートを遊離させた。クロロホルム抽出によるＦ１２７の除去後、０．５％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウムおよび２％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む等体積の１ＭＨＣｌ溶液を加えた。サンプルを３７℃で２時間インキュベートし、次いで、８２０ｎｍにおけるその吸光度をＵＶ分光計を使用して測定した^［４９］。Ｆ１２７の８０パーセントの末端ヒドロキシル基がピロホスホリル化されたことが見出された。

ＢＩＯ負荷熱応答性ヒドロゲルの調製
Ｆ１２７－ＰＰｉおよびＦ１２７を異なる比率（０：１００、２５：７５、５０：５０、７５：２５、１００：０％ｗ／ｗ）で混合することにより、所定のポリマー濃度（２０、２５および３０％ｗ／ｖ）を有するＰＦ１２７ヒドロゲル製剤を調製した。簡潔には、所望の量のＦ１２７－ＰＰｉおよびＦ１２７を透明な溶液（ＰＦ１２７）が得られるまで氷水浴（約４℃、ゲル化を防止するため）中で撹拌しながらＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、次いで、４℃で一晩保管した。次いで、ＢＩＯを４℃で連続撹拌することによりポリマー溶液に溶解し、得られた溶液を０．８μｍフィルタシリンジに通して濾過した。

モデル骨（ヒドロキシアパタイト、すなわちＨＡ）への結合能
ヒドロキシアパタイト、すなわちＨＡ（これは、骨および歯の主な無機成分を構成する）への製剤化ヒドロゲルの結合能を評価するために、ＨＡディスクを使用してｉｎｖｉｔｒｏ結合研究を行った。簡潔には、Ｆ１２７－ＰＰｉおよびＦ１２７の異なる比率（０：１００、２５：７５、５０：５０、７５：２５および１００：０％ｗ／ｗ）を使用して、１００μＭのＢＩＯを含むポリマー溶液（２５％ｗ／ｖ）を調製して、結合親和性を最適化した。３７℃のプラスチックウェル内に置かれたＨＡディスク上にヒドロゲル（１ｍＬ）を生成し、ヒドロゲルを１５分間安定化させた。その後、その上にヒドロゲルが生成されたＨＡディスクを反転させ、反転させたヒドロゲルを水浴（３７℃）内に保持することにより温度を３７℃に維持した。ＨＡディスクへのヒドロゲルの結合時間を測定した。結合実験を三つ組で実施した。この研究に基づいて、１種の製剤をすべてのその後の実験のために選択した。

ＰＦ１２７溶液およびＦ１２７溶液中のＢＩＯの溶解度の評価
ＰＦ１２７溶液およびＦ１２７溶液中のＢＩＯの水性溶解度をこの実験において評価した。以前報告された通り、ＢＩＯをＰＦ１２７含有培地およびＦ１２７含有培地に所定の時間加えた後、ＢＩＯの溶解度値を溶解平衡状態で測定した^［３２］。具体的には、過剰量のＢＩＯを微量遠心管内の異なる濃度のＰＦ１２７溶液またはＦ１２７溶液に加えた。懸濁液をロータで４℃で４８時間混合して溶解平衡を達成した。４℃で、懸濁液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、未溶解の薬物を微量遠心管の底に沈降させた。次いで、上清を０．８μｍシリンジフィルタに通して濾過して、飽和ＢＩＯ溶液を得た。ＵＶＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ２分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、２６０ｎｍにおいてＢＩＯ濃度を測定した。

ヒドロゲルからのＢＩＯのｉｎｖｉｔｒｏ放出
ＰＦ１２７ヒドロゲル（２０、２５および３０％ｗ／ｖ）からの物理的に捕捉されたＢＩＯの放出速度を、以前報告された通り、膜なし実験により研究した^{［３３～３５］}。簡潔には、０．５ｍｇのＢＩＯを含む１ｍＬのポリマー溶液のサンプルをスクリューキャップチューブに移し、ゲルが生成するまで３７℃の水浴中でインキュベートした。ゲル化後、３７℃であらかじめ平衡化させた、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）をヒドロゲルの表面上に静かに注ぎ、３７℃の水浴中で絶えず穏やかに振盪しながらインキュベートした。ＢＩＯの放出を測定するために、放出培地（２ｍＬ）を一定の時間間隔で採取し、あらかじめ平衡化させた等体積の新鮮な放出緩衝液で置き換えた。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅのＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ２（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによりＢＩＯの濃度を決定した。放出研究を三つ組で実施した。

ｉｎｖｉｔｒｏヒドロゲル浸食
他者により報告された通り、残留重量（％）実験を実施することにより、ＰＦ１２７ヒドロゲル製剤（２０、２５および３０％ｗ／ｖ）の浸食時間を決定した^{［３３～３５］}。簡潔には、１ｍＬのポリマー溶液のサンプルをスクリューキャップチューブに移し、ゲルが生成するまで３７℃の水浴中でインキュベートした。ゲル化後、ヒドロゲルサンプルの元の重量を（Ｗ_０）として測定した。続いて、３７℃であらかじめ平衡化させた２ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）をヒドロゲルの表面上に静かに注ぎ、３７℃の水浴中で絶えず穏やかに振盪しながらインキュベートした。緩衝液を完全に吸い取った後、残留ヒドロゲルの重量（Ｗ_ｔ）を一定の時間間隔で測定した。浸食研究を三つ組で実施した。残留重量（％）を以下の通り計算した：

ＰＦ１２７ヒドロゲルの生体適合性
細胞生存率に対する選択されたＰＦ１２７ヒドロゲル製剤（２５％ｗ／ｖの混合Ｆ１２７－ＰＰｉおよびＦ１２７、５０：５０％ｗ／ｗ）およびＦ１２７ヒドロゲル（２５％ｗ／ｖ）（ＢＩＯありまたはなし）の影響をＣＣＫ－８アッセイを使用して評価した。すべてのＢＩＯ含有製剤中のＢＩＯ濃度は１００ｎＭである。簡潔には、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含む細胞培養培地（アルファ－ＭＥＭ）中でマウス前骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｌ１細胞株を培養した。５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中３７℃の標準条件下で、細胞を９０％コンフルエンスまでインキュベートした。ヒドロゲルをＩＳＯ規格１０９９３－１２にしたがってアルファ－ＭＥＭ中３７℃で２４時間抽出した^{［３４、３５］}。ヒドロゲルの表面積と培地の体積の間の比率は１．２５ｃｍ^２／ｍＬであった。無希釈の抽出物をアッセイのために使用した。細胞を９６ウェルプレート（１×１０^４細胞／ウェル）内で増殖させ、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を培地のみ、ＰＦ１２７抽出物、ＰＦ１２７－ＢＩＯ抽出物、Ｆ１２７抽出物、Ｆ１２７－ＢＩＯ抽出物または遊離ＢＩＯのいずれかで処置し、プレートを３７℃で２４時間および４８時間インキュベートした。各フォローアップ時点で、ＣＣＫ－８試薬（１０μＬ）を各ウェルに加え、さらに３７℃で４時間インキュベートした。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅのＳｐｅｃｔｒａｍａｘＭ２マイクロプレートリーダー（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して吸光度を４５０ｎｍにおいて測定した。

ゲル化および粘度研究
サンプルの貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ’’）を温度掃引モードで測定することによりゲル化温度を決定した^{［３６、３７］}。２０～４０％の間の範囲のｗ／ｖ濃度を有する溶液を上記の通り調製した。レオメーター（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＡＲ１５００ｅｘ）のペルチェプレートと３℃の６０ｍｍ径、１°コーンジオメトリ（ｃｏｎｅｇｅｏｍｅｔｒｙ）の間に各サンプルを均一に負荷した。振動振幅機能を使用することにより各サンプルの線形粘弾性領域を４５℃であらかじめ決定し、以下の条件を選んだ：歪み０．１％および角周波数１ｒａｄ／ｓ。次いで、レオメーターの振動温度掃引機能（加熱ステップ：１℃、ソーク（ｓｏａｋ）時間：各温度上昇につき２分）を使用することにより、３℃～４５℃の温度範囲について、各サンプルのＧ’およびＧ’’を測定した。Ｇ’およびＧ’’が等しくなるときの温度として各サンプルのゲル化温度を決定した。

レオメーターおよび２５ｍｍ径平行プレートを使用してフロースイープ（ｆｌｏｗｓｗｅｅｐ）^［３０］（３７℃、剪断速度１～１００ｓ^－１）により一定温度でゲル相の粘度も調査した。サンプルをレオメーターのペルチェプレート上に分配し、３７℃まで加熱し、３７℃で１５分間維持して熱的安定に到達させた後、等温試験を行った。

実験的歯周炎のラットモデルに基づくＢＩＯ含有ヒドロゲルの治療有効性
１０カ月齢の雌ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット（退役種親（ｒｅｔｉｒｅｄｂｒｅｅｄｅｒ）、Ｅｎｖｉｇｏ）を実験前に１週間順化させた。動物（ｎ＝４８）を以下の群にランダムに割り当てた（表２）：健常対照、生理食塩水で処置された実験的歯周炎（ＥＰ）、２５％ｗ／ｖの混合Ｆ１２７－ＰＰｉおよびＦ１２７ヒドロゲル（５０：５０％ｗ／ｗ、１００μＭのＢＩＯを含む）（ＰＦ１２７－ＢＩＯ）で処置されたＥＰ、２５％ｗ／ｖのＦ１２７ヒドロゲル（１００μＭのＢＩＯを含む）（Ｆ１２７－ＢＩＯ）で処置されたＥＰ、２５％ｗ／ｖのＰＦ１２７ヒドロゲルで処置されたＥＰ、および遊離ＢＩＯ（１００μＭ）で処置されたＥＰ。絹糸結紮を使用して、実験的歯周炎を以前記載された通り誘発させた^{［３２、３８］}。簡潔には、１００％Ｏ_２中１％～４％イソフルランを含むイソフルランチャンバ内でラットをまず麻酔した。体重を量った後、０．５％～２％イソフルランおよび１００％Ｏ_２が供給されたノーズコーンを着けてラットを置き、全手順の間麻酔を維持した。実験的歯周炎を誘発させるために、上顎第二大臼歯（Ｍ２）周囲に歯肉縁下で４－０絹糸結紮を軽く締めた。結紮留置後、上顎第一大臼歯（Ｍ１）と第二大臼歯（Ｍ２）の間に異なる処置（１０μＬ）を毎週１回、３週間局所送達した。１週間後、結紮を除去した。すべての動物を第４週に安楽死させた。３種すべての大臼歯を含む口蓋全体を切離し、マイクロＣＴおよび組織学的解析の前に１０％ホルマリン中で固定した。すべての動物関連実験は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｅｂｒａｓｋａＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ（ＵＮＭＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。

歯周骨のマイクロコンピュータトモグラフィ（μ－ＣＴ）解析
高分解能Ｘ線マイクロトモグラフィシステム（Ｓｋｙｓｃａｎ１１７２、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｋｏｎｔｉｃｈ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、すべての口蓋サンプル（３種すべての大臼歯を含む）を歯槽骨の質に関して評価した（以前の研究^{［３２、３８］}を参照）。Ｘ線源を以下の通り設定した：７０ｋＶおよび１４１μＡ、分解能１２．９μｍ、露光時間１８８０ｍｓおよびアルミニウムフィルタ０．５ｍｍ厚。３Ｄ画像を作成するために、ＮＲｅｃｏｎソフトウェアを使用して走査生データを再構成した。ＣＴ－Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して矢状断面を作成した。骨侵食を評価するために、ＳｋｙｓｃａｎＤａｔａｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用してセメントエナメル境（ＣＥＪ）から歯槽骨頂（ＡＢＣ）までの距離を決定した。より長いＣＥＪからＡＢＣまでの距離は、より多い骨喪失を示唆する。骨量（ＢＶ）および骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）などの組織形態計測学的パラメータの解析のために、Ｍ１とＭ２の間の多角形関心領域（ＲＯＩ）を同定した。Ｍ１の遠心口蓋からＭ２の近心口蓋まで（長さ）、Ｍ１およびＭ２のＣＥＪ下１３０スライス（高さ）ならびにＭ１およびＭ２の口蓋側から頬側まで（幅）のＲＯＩを決定した。

以前記載された通り^［３９］、この試験ラットの大腿骨も採取および走査して、ＢＩＯの潜在的な全身作用を評価した。Ｘ線源を以下の通り設定した：電圧は７０ｋＶ、電流は１４１μＡ、露光時間は７００ｍｓ、分解能は８．６μｍ、アルミニウムフィルタは０．５ｍｍ厚であった。ＳｋｙｓｃａｎＮＲｅｃｏｎおよびＳｋｙｓｃａｎＤａｔａＶｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して３Ｄ画像を作成した。骨の質を解析するために、遠位大腿骨における海綿骨の一貫した多角形ＲＯＩを選択し、成長板に近接した２０スライスから１００スライスまでのＲＯＩを決定した。ＣＴ－Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して平均骨量（ＢＶ）、骨量／組織量（ＢＶ／ＴＶ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）および骨塩密度（ＢＭＤ）を含む骨組織形態計測学的パラメータを決定した。

組織学的解析
μ－ＣＴ走査完了時、１４％ＥＤＴＡ溶液を使用して口蓋を２週間脱灰した。脱灰後、組織をパラフィンに包埋して、４μｍ厚の矢状断面を得た。スライドを顕微鏡観察のためにヘマトキシリンおよびエオシン（ＨおよびＥ）染色した。Ｍ１とＭ２の間の炎症細胞および歯槽頂内の破骨細胞の存在を探索するために、実験群の割当てを知らない病理学者（ＳＭＬ）が、ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５３顕微鏡を使用して半定量的にスライドを評価した。半定量的スコアリングシステム^{［３２、４０、４１］}を使用して炎症細胞を評価した（ここで、０は陰性、１は３０％未満の患部組織、２はいくらかの炎症細胞（３０～６０％）、３は多くの炎症細胞（＞６０％）である）。同様に、半定量的スコアリングシステム^{［３２，４２］}を使用して歯槽頂上の破骨細胞を評価した（ここで、０は陰性、１は、歯槽骨表面の５％未満を覆う少数の破骨細胞、２はいくらかの破骨細胞（５～２５％）、３は多くの破骨細胞（２５～５０％）である）。一次抗体（ウサギモノクローナル抗β－カテニン抗体、Ａｂｃａｍ、ａｂ３２５７２；１：４００希釈）を使用してβ－カテニンの免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を実施した。脱パラフィンおよび再水和の後、切片を抗原回復のためにクエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝６．０、０．１Ｍ）中でインキュベートし、洗浄し、次いで、過酸化水素中でインキュベートした。次いで、切片をブロックし、一次抗体とインキュベートし、続いて二次抗体とインキュベートした。ＤＡＢ色素原を使用して抗体複合体を視覚化した。ヘマトキシリンを対比染色のために使用した。０～３のスケールを使用して病理学者（ＳＭＬ）により染色強度を独立して評価した（ここで、０は陰性、１は弱い染色、２は中程度の染色、３は強い染色である）^{［１９、４３］}。スライドの積層を評価し、次いで、ＳＭＬのスコアと比較した別の試験者（ＹＡ）により、ＳＭＬのスコアリングを検定した。

統計解析
すべての生成データを平均±ＳＤ（標準偏差）で表した。Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して統計解析を行った。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、３つを超える群間で連続アウトカムを分析した。テューキーのペアワイズ事後試験を多重比較のために実施した。０．０５未満のＰ値は統計的に有意とみなした。

結果
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）へのヒドロゲル結合
ＨＡへのＰＦ１２７ヒドロゲル（２５％ｗ／ｖ）のｉｎｖｉｔｒｏ結合を解析して、ｉｎｖｉｖｏでの骨に対するその親和性を予測した。図２ａに示す通り、Ｆ１２７－ＰＰｉ含量がヒドロゲル中で増加するにつれて結合時間は増加した。Ｆ１２７－ＰＰｉの異なる比率の中で、５０、７５および１００（ｗ／ｗ％）は、ＨＡディスクへの最長の結合時間（２４．６、２５．６および２８．２分）をそれぞれ示した。それらの結合時間は、Ｆ１２７ヒドロゲルと比較すると統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１）。比率２５（ｗ／ｗ％）も、Ｆ１２７ヒドロゲルよりも有意に長い（Ｐ＜０．０１）かなりの結合時間（１８．２分）を示した。Ｆ１２７ヒドロゲルは、すべての製剤の中で最低の結合時間（８．５分）を有していた。この観察に基づいて、比率５０：５０％ｗ／ｗのＦ１２７－ＰＰｉおよびＦ１２７の製剤が、比較的低いＰＰｉ含量で強い結合親和性を示したので、これをその後の実験において使用した。

ＰＦ１２７対Ｆ１２７中のＢＩＯの溶解度
異なる濃度のＰＦ１２７含有溶液およびＦ１２７含有溶液中のＢＩＯの溶解度を溶液ｐＨ＝７で４℃で解析および比較した。図２ｂに示す通り、ＢＩＯの溶解度は、ポリマー濃度に比例的に依存するように見受けられる。２０％ＰＦ１２７中のＢＩＯの溶解度は、２０％Ｆ１２７中の０．１ｍｇ／ｍＬと比較して、０．５ｍｇ／ｍＬと決定された。さらに、ポリマー濃度を２５％まで増加させると、ＰＦ１２７中のＢＩＯの溶解度は２ｍｇ／ｍＬまで大幅に改善されたが、この値はＦ１２７溶液中では０．３ｍｇ／ｍＬまで改善されただけであった。濃度が３０％までさらに増加すると、ＰＦ１２７中の溶解度は３ｍｇ／ｍＬまで増加し続けたが、Ｆ１２７中では０．６ｍｇ／ｍＬまで改善した。明らかに、ＰＦ１２７は、ＢＩＯの水性溶解度を著しく改善することができる。

ＰＦ１２７ヒドロゲルからのＢＩＯのｉｎｖｉｔｒｏ放出
ＰＦ１２７ヒドロゲル（２０、２５および３０％ｗ／ｖ）からのＢＩＯの放出速度論を３７℃で研究した。図２ｃに示す通り、ヒドロゲルからのＢＩＯの放出速度論は、ポリマーの濃度に依存することが見出された：ポリマー濃度が高いほど、放出速度は遅くなる。２０％ｗ／ｖヒドロゲルからのＢＩＯの全放出（約９９％）は２４時間で起こり、最初の３時間のバースト放出（約５０％）を伴った。２５％ｗ／ｖヒドロゲルからのＢＩＯ放出は、最初の１２時間のバースト放出とその後に続く次の４８時間の徐放を伴って示された。３０％ｗ／ｖヒドロゲルの場合、ＢＩＯの放出は、４８時間を超えて持続した。

ｉｎｖｉｔｒｏヒドロゲル浸食
一定のインキュベーション時間間隔で残留重量（％）を測定することによってＰＦ１２７ヒドロゲル浸食挙動を特徴付けた。結果は、放出研究と相関し、ヒドロゲルの濃度の関数であることが示される。図２ｄに示す通り、２０％ｗ／ｖ濃度を有するヒドロゲルは２４時間以内に完全に浸食され、約５０％が最初の３時間で浸食された。２５％ｗ／ｖヒドロゲルは４８時間で完全に浸食されたが、約６０％の重量減少が最初の６時間で観察され（バースト浸食）、その後、持続的浸食が続いた。３０％ｗ／ｖ濃度を有するヒドロゲルは、持続的浸食で４８時間で完全に浸食された。

ＰＦ１２７ベースのヒドロゲルの生体適合性
生体適合性であることが既知であるＦ１２７と比較してＰＦ１２７ヒドロゲルの安全性を評価するために、マウス骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｌ１細胞をＰＦ１２７、ＰＦ１２７－ＢＩＯ、Ｆ１２７およびＦ１２７－ＢＩＯ培養培地抽出物、または遊離ＢＩＯ（１００ｎＭ）で２４時間および４８時間処置し、ＣＣＫ－８アッセイを使用して細胞生存率を定義した（図３）。ＰＦ１２７２５％ｗ／ｖで処置されたＭＣ３Ｔ３－Ｌ１細胞の生存率百分率は、培地処置対照と比較すると、２４時間後に８４．５％までわずかに減少し、４８時間後に７９．５％までさらに低下した。Ｆ１２７抽出物で処置されたＭＣ３Ｔ３－Ｌ１細胞の生存率は、２４時間後および４８時間後にそれぞれ８７．５％および８３．５％であった。ＢＩＯをヒドロゲルに加えたとき、細胞生存率は大幅に変化しなかった。しかし、細胞を１００ｎＭの遊離ＢＩＯで処置したとき、生存率は、培地処置対照と比較して１０２％および１０４．５％と決定された。

ＰＦ１２７ヒドロゲルのゲル化および粘度解析
貯蔵および損失弾性率（Ｇ’およびＧ’’）の温度掃引測定に基づいてゲル化温度（Ｔ_ｇｅｌ）を決定した（図４）。サンプルは、Ｇ’がＧ’’よりもはるかに小さいので、低温（Ｔ＜Ｔ_ｇｅｌ）で流体のような挙動を示した。サンプルを加熱するにつれて、Ｇ’およびＧ’’のいずれもＴ_ｇｅｌ付近で急激に増加し、Ｇ’は高温（Ｔ＞Ｔ_ｇｅｌ）でＧ’’よりも大きくなった。これは、サンプルがゲル化を経て、固体のような挙動を示したことを示す。したがって、Ｇ’曲線とＧ’’曲線の交差点によりＴ_ｇｅｌを決定した。表３に得られたＴ_ｇｅｌ値をまとめる。

ＢＩＯありとなしのＰＦ１２７ヒドロゲルおよびＦ１２７ヒドロゲルに対して粘度測定も３７℃で実施して、それらの粘性に対するピロホスホリル化および薬物含量の効果を調査した（図４）。すべてのヒドロゲルが典型的なシアシニング挙動（非ニュートン性）を示し、粘度は剪断速度に応じて低下した。低粘度を示した、非常に弱いヒドロゲルを生成する２０％ｗ／ｖＰＦ１２７を除いて、同じ濃度内でＰＦ１２７ヒドロゲルとＦ１２７ヒドロゲルの間に粘度の注目すべき差は観察されなかった。ＢＩＯ添加は、ヒドロゲルの粘性に対して著しい影響を与えないようであった。

歯周骨のマイクロコンピュータトモグラフィ（μ－ＣＴ）解析
図５ａに示す通り、ＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲルが他の処置と比較して歯槽骨喪失を防止したことは明らかである。直線測定（ＣＥＪからＡＢＣ）は、ＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲル処置群が、すべての他の処置群の中で最短距離を有することを示した。Ｆ１２７－ＢＩＯ処置群は、生理食塩水処置群と比較したときのみ統計的に有意な差を示したが、遊離ＢＩＯ－処置群は、生理食塩水処置群と比較して統計的に有意な差を示さなかった（図５ｂ）。骨量（ＢＶ、図５ｃ）および骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ、図５ｄ）も定量化して、骨の質をさらに検証した。ＰＦ１２７－ＢＩＯ処置群のＢＶの値は、すべての他の処置群と比較して有意により高かった。対照的に、Ｆ１２７－ＢＩＯ処置群は、生理食塩水処置群と比較したときのみ統計的に有意な差を示した。ＰＦ１２７－ＢＩＯ処置群およびＦ１２７－ＢＩＯ処置群のＴｂ．Ｔｈの値は、生理食塩水群と比較して有意により高かった。遊離ＢＩＯ処置群と生理食塩水群の間の統計的に有意な差は、上記のμ－ＣＴパラメータにおいて観察されなかった。異なる処置後の歯周骨の質を示す３Ｄ動画は補足情報に見出すことができる。大腿骨解析データは、すべての処置群の中で有意差を何ら示さなかった。

組織学的評価
炎症細胞、破骨細胞およびβ－カテニンに対する異なる処置の影響を調査するために、染色組織切片の画像（図５ａ、図６ａ）を半定量的に評価した。炎症細胞の組織学スコアを図６ｂに示した。予想される通り、健常Ｃｏｎ＋群は、炎症細胞および破骨細胞の両方について０のスコアを有し、これは、ＰＦ１２７－ＢＩＯ群を除くすべての処置群よりも有意に低い。健常Ｃｏｎ＋群とＰＦ１２７－ＢＩＯ群の間に統計的に有意な差はない。ＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲル処置群は、すべての他の群と比較したとき最低の炎症細胞スコアを有する（生理食塩水Ｃｏｎ－群と比較してＰ＜０．０００１、Ｆ１２７－ＢＩＯ処置群および遊離ＢＩＯ処置群と比較してＰ＜０．０１）が、Ｆ１２７－ＢＩＯ処置群および遊離ＢＩＯ処置群は、生理食塩水Ｃｏｎ－群と比較したときのみ統計的に有意な差（Ｐ＜０．０１）を示した。ＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲル処置群は、健常Ｃｏｎ＋群を除くすべての処置群と比較して最低の破骨細胞スコアを有し、生理食塩水Ｃｏｎ－群の破骨細胞スコアよりも有意に（Ｐ＜０．００１）低かった（図６ｃ）。Ｆ１２７－ＢＩＯ処置群および遊離ＢＩＯ処置群のスコアは、生理食塩水Ｃｏｎ－群よりも有意に低かった。ＰＦ１２７－ＢＩＯヒドロゲル処置群のβ－カテニン陽性細胞スコアは、すべての処置群の中で最も高かった（図７ｂ、生理食塩水Ｃｏｎ－群と比較してＰ＜０．０００１、Ｆ１２７－ＢＩＯ処置群および遊離ＢＩＯ処置群と比較してＰ＜０．０５、健常Ｃｏｎ＋群と比較するとＰ＜０．００１）。Ｆ１２７－ＢＩＯ処置群および遊離ＢＩＯ－処置群のスコアは、生理食塩水Ｃｏｎ－、ＰＦ１２７および健常Ｃｏｎ＋群と有意に異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。

［実施例２］
この実施例において、シンバスタチン（ＳＩＭ）を治療剤として使用した。ＰＦ１２７の調製は実施例１に記載した。

ＳＩＭ負荷ＰＦ１２７／Ｆ１２７ヒドロゲルの調製
膜水和法：過剰量のＳＩＭをＰＦ１２７／Ｆ１２７のメタノール溶液に溶解した。メタノールを蒸発させて膜を形成し、次いで、翌日、水和を氷水で３０分間行って、ゲルの生成を防止した。遠心分離後に遊離薬物を除去した。

溶媒蒸発法：ＰＦ１２７／Ｆ１２７およびＳＩＭをアセトンに溶解し、次いで、撹拌しながら氷水に滴加した。アセトンを一晩蒸発させた。遠心分離後に遊離薬物を除去した。

直接溶解法：氷ＰＦ１２７／Ｆ１２７溶液をまず調製し、過剰量のＳＩＭを加え、４８時間混合した。遠心分離後に遊離薬物を除去した。

結果を表４に示す。この結果に基づいて、直接溶解法をＳＩＭ負荷ＰＦ１２７／Ｆ１２７ヒドロゲルの調製において使用した。

ＳＩＭ負荷ＰＦ１２７／Ｆ１２７ヒドロゲルの相転移が図８に示されている。結果は、Ｆ１２７のピロホスホリル化がその熱応答性挙動に影響を与えないことを示唆する。

歯周炎における治療有効性に関する動物研究
実験プロセスは実施例１に記載されている。群分けおよび処置を表４に示す。

図９に示す通り、ＳＩＭ負荷ＰＦ１２７製剤が、生理食塩水対照と比較したときＣＥＪ－ＡＢＣ距離を有意に短縮することができる唯一の製剤である。加えて、この処置は、歯周骨量（ＢＶ）および骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）を有意に増加させることもできる。

参考文献

Claims

治療剤とポロキサマーとを含む薬物送達組成物であって、前記ポロキサマーは、骨または歯の表面に付着することができるように修飾されている、薬物送達組成物。
前記ポロキサマーが、ピロホスフェート、ビスホスホネート、ドーパミン、酸性ペプチドまたはテトラサイクリンおよびその誘導体により修飾されている、請求項１に記載の薬物送達組成物。
前記ポロキサマーが、ピロホスホリル化ポロキサマーまたはポロキサマーとピロホスホリル化ポロキサマーとの混合物である、請求項２に記載の薬物送達組成物。
前記ポロキサマーが、ＰｌｕｒｏｎｉｃＬ３１、Ｌ３５、Ｆ３８、Ｌ４２、Ｌ４３、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ６２、Ｌ６３、Ｌ６４、Ｐ６５、Ｆ６８、Ｌ７２、Ｐ７５、Ｆ７７、Ｌ８１、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｌ９２、Ｆ９８、Ｌ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０８、Ｌ１２１、Ｌ１２２、Ｌ１２３、Ｆ１２７、１０Ｒ５、１０Ｒ８、１２Ｒ３、１７Ｒ１、１７Ｒ２、１７Ｒ４、１７Ｒ８、２２Ｒ４、２５Ｒ１、２５Ｒ２、２５Ｒ４、２５Ｒ５、２５Ｒ８、３１Ｒ１、３１Ｒ２、３１Ｒおよびそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、前記ポロキサマーがポロキサマー４０７（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
前記治療剤が、抗炎症化合物、骨同化化合物、骨再吸収抑制化合物、抗がん化合物、スタチンおよび抗菌化合物を含み、好ましくは、前記治療剤が、ＧＳＫ３－ベータ阻害薬またはスタチンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
前記ＧＳＫ３－ベータ阻害薬が、インジルビンおよびその誘導体、リチウム、亜鉛、ベリリウムならびにそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、前記ＧＳＫ３－ベータ阻害薬が、６－ブロモインジルビン－３’－オキシム、リチウムまたは亜鉛である、請求項５に記載の薬物送達組成物。
前記スタチンが、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチンおよびそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、前記スタチンがシンバスタチンである、請求項５に記載の薬物送達組成物。
前記組成物が、熱応答性ヒドロゲルの形態である、請求項１から７のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
前記組成物が、前記歯の表面に付着することができかつ歯周ポケット内に少なくとも２日間残留する、請求項１から８のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
請求項３に記載の薬物送達組成物を製造する方法であって、
前記ポロキサマーをトシル化反応に供してトシル化ポロキサマーを合成する工程と、
前記トシル化ポロキサマーをピロホスホリル化に供してピロホスホリル化ポロキサマーを得る工程と、
前記治療剤を前記ピロホスホリル化ポロキサマーに溶解してｉｎｖｉｖｏ注入時にヒドロゲルを生成してもよい注入可能な溶液組成物を得る工程と
を含む、方法。
前記ポロキサマーがポロキサマー４０７（ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７）であり、前記治療剤が、ＧＳＫ３－ベータ阻害薬またはスタチンである、請求項１０に記載の方法。
前記組成物が、ｉｎｖｉｖｏ注入時にヒドロゲルを生成することができる注入剤の形態である、請求項１０に記載の方法。
請求項１から９のいずれか一項に記載の薬物送達組成物を、それを必要とする対象に局所部位においてｉｎｓｉｔｕで投与する工程を含む、口腔疾患を治療する方法。
前記局所部位が歯周ポケットであり、前記口腔疾患が、歯科疾患、好ましくは歯周炎である、請求項１３に記載の方法。
前記組成物が、前記治療剤を放出して少なくとも２日にわたり前記口腔疾患を処置することができ、前記組成物が、前記局所部位にのみ残留する、請求項１３または１４に記載の方法。
口腔疾患の前記処置における使用のための、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬物送達組成物。
前記口腔疾患が、歯科疾患、好ましくは歯周炎である、請求項１６に記載の使用のための薬物送達組成物。