JP2022527383A - 脂肪組織から微小血管を単離するためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するための方法及びシステムが記載される。システム及び方法は、第１の消化及び第１の遠心分離操作からの上層を濃縮又は精製された酵素で消化し、第２のファット－酵素溶液を生成するための第２の消化、第２の遠心分離操作、並びに第１及び第２の遠心分離操作によって生成されたペレットからの微小血管の単離を含む。システム及び方法は、消化後洗浄において第２のファット－酵素溶液を酵素阻害剤で洗浄することを含んでもよい。

Description

本開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＮＧ ＭＩＣＲＯＶＥＳＳＥＬＳ ＦＲＯＭ ＡＤＩＰＯＳＥ ＴＩＳＳＵＥ」と題する２０１９年４月１０日出願の米国仮出願第６２／８３１，７６５号の利益を主張する。

本開示は、脂肪組織から微小血管を単離するための方法、より詳細には濃縮又は精製された酵素を利用して脂肪組織から微小血管を単離するための方法に関する。

微小血管を含む細胞を組織から単離する実用化された方法は、組織解離酵素の粗調製物を利用して、組織を個々の細胞構成成分に分割する。組織を解離させて微小血管を単離するための、代替的な高品質の効率的且つ有効な方法に対する必要性が存在する。

Ｈｏｙｉｎｇ ＪＢ、Ｂｏｓｗｅｌｌ ＣＡ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＫ、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｇｅｌｓ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏ． Ａｎｉｍ １９９６年７月、３２（７）：４０６～１９頁

本開示の主題によると、方法及びシステムは、濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離させて、微小血管を単離することができる。システム及び方法は、二重消化特徴及び／又は消化後洗浄特徴を含んでもよい。

実施例によると、濃縮された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するためのシステムは、１つ又は複数のプロセッサ、１つ又は複数のプロセッサに通信可能に連結された非一時的メモリ、及び非一時的メモリに保存された機械可読命令を含んでもよい。濃縮された酵素は、濃縮又は精製された酵素を含んでもよい。機械可読命令は、１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、システムに１つ又は複数のプロトコールとして少なくとも以下：第１の消化において、細切された脂肪を濃縮された酵素で消化し、第１のファット－酵素溶液(fat-enzyme solution：脂肪－酵素溶液ともいう)を生成すること、第１の遠心分離操作において第１の消化からの第１のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第１のペレット及び１つ又は複数の第１のペレットの上に位置するファット上層(a top fat layer：脂肪上層又はトップ脂肪層ともいう）を生成すること、第２の消化においてファット上層を濃縮された酵素で消化し、第２のファット－酵素溶液を生成すること、第２の遠心分離操作において第２の消化からの第２のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第２のペレットを生成する、並びに１つ又は複数の第１のペレット及び１つ又は複数の第２のペレットの１つ又は複数の部分を１つ又は複数のふるいに通し、複数の単離された微小血管を生成することを実施させてもよい。

別の実施例によると、濃縮された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するための方法は、第１の消化において、細切された脂肪を濃縮された酵素で消化し、第１のファット－酵素溶液を生成すること、第１の遠心分離操作において第１の消化からの第１のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第１のペレット及び１つ又は複数の第１のペレットの上に位置するファット上層を生成すること、及び第２の消化においてファット上層を濃縮された酵素で消化し、第２のファット－酵素溶液を生成することを含んでもよい。方法は、第２の遠心分離操作において第２の消化からの第２のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第２のペレットを生成すること、並びに１つ又は複数の第１のペレット及び１つ又は複数の第２のペレットの１つ又は複数の部分を１つ又は複数のふるいに通し、複数の単離された微小血管を生成することをさらに含んでもよい。

また別の実施例によると、濃縮された酵素を使用して組織を解離する、微小血管を単離するための方法は、第１の消化において、細切された脂肪を濃縮された酵素で消化し、第１のファット－酵素溶液を生成すること、第１のファット－酵素溶液の消化のための触媒として追加の酵素を使用すること、第１の遠心分離操作において第１の消化からの第１のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第１のペレット及び１つ又は複数の第１のペレットの上に位置するファット上層を生成すること、及び第２の消化においてファット上層を濃縮された酵素で消化し、第２のファット－酵素溶液を生成することを含んでもよい。方法は、消化後洗浄において第２のファット－酵素溶液を酵素阻害剤で洗浄すること、第２の遠心分離操作において第２の消化からの第２のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第２のペレットを生成すること、並びに１つ又は複数の第１のペレット及び１つ又は複数の第２のペレットの１つ又は複数の部分を１つ又は複数のふるいに通し、複数の単離された微小血管を生成することをさらに含んでもよい。消化後洗浄の酵素阻害剤は、１種若しくは複数のペプチド阻害剤、１種若しくは複数の小分子阻害剤、１種若しくは複数の天然のマトリックス材料阻害剤、又はそれらの組合せを含んでもよい。

本開示の実施例によって提供されるこれら及び追加の特徴は、図面と併せて以下の詳細な説明を考慮することでより詳細に理解される。

本開示の特定の実施例の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号によって示される以下の図面と併せて読むと最良に理解することができる。

図示及び本明細書に記載される１つ又は複数の実施例に従って、濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離する、微小血管を単離するための方法のフロー・チャートを示す図である。 図示及び本明細書に記載される１つ又は複数の実施例に従って、濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するための別の方法のフロー・チャートを示す図である。 図示及び本明細書に記載される１つ又は複数の実施例に従って、図１～２のフロー・チャートの方法を自動化するためのコンピュータ・ベースのプロセスを実施するためのシステムを示す概略図である。

本明細書に記載される実施例によると、濃縮又は精製された酵素を使用して脂肪組織又は他の組織などの組織を解離させるための、インタクトの機能的な微小血管を単離するシステム及び方法が記載される。そのような酵素は、本明細書で濃縮と記載される場合があるが、精製された酵素が、濃縮又は精製を伴わない粗酵素単体と比較して濃縮された酵素の１種であることが企図され、且つ本開示の範囲内である。システム及び方法は、以下でより詳細に記載される通り、細切された脂肪の二重消化の使用を含んでもよい。さらに又は代替的に、システム及び方法は、以下でより詳細にさらに記載される通り、消化後洗浄の使用を含んでもよい。

Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ ＪｅｒｓｅｙのＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬから市販されうる粗酵素が関与する動作では、細切された脂肪を粗酵素による単一の消化に供し、遠心分離し、下に位置するペレット及び処分可能な上層を得ることができる。処分可能な上層を廃棄し、下に位置するペレットの１つ又は複数の部分をふるいに通し、組織を解離させて、微小血管を単離してもよい。粗酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するための単一の消化を含む方法の例は、Ｈｏｙｉｎｇ ＪＢ、Ｂｏｓｗｅｌｌ ＣＡ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＫ、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｇｅｌｓ、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏ． Ａｎｉｍ １９９６年７月、３２（７）：４０６～１９頁に記載される。

本明細書に記載されるシステム及び方法は、濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離する微小血管を単離するための方法における二重消化特徴を対象とし、二重消化特徴は、第２の消化及び第１の消化から得られた上層の使用を対象とする。実施例では、濃縮又は精製された酵素は、濃縮又は精製されたコラゲナーゼを含む。実施例では、濃縮又は精製された酵素は、クロマトグラフィーによって濃縮又は精製されたコラゲナーゼを含む。実施例では、濃縮又は精製された酵素は、組織から細胞を単離するために有用なクロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）からの低プロテアーゼ濃縮コラゲナーゼ生成物を含む。特定の実施例では、濃縮又は精製された酵素は、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｇｏｌｄ又はＤＥＧｏｌｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ又はＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＨＡ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩｎｄｉａｎａのＶＩＴＡＣＹＴＥから市販されうる）を含む。実施例では、クロストリジウムのコラゲナーゼに加えて又はその代替として、濃縮又は精製された酵素は、ビブリオなどの他の細菌源及び／又は哺乳動物
のコラゲナーゼを含んでもよい。

濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離する、微小血管を単離するための方法１００のフロー・チャートである図１をまず参照する。ブロック１０２で、細切された脂肪を濃縮又は精製された酵素による第１の消化に供し、第１のファット－酵素溶液を得る。実施例では、脂肪は、手動の混合又は脂肪吸引カニューレなどによって細切され、濃縮又は精製された酵素によって消化される。脂肪組織を細切するための細断（例えば、細切）技術の実施例は、当業者に理解される他の機械的技術の使用を含んでもよい。そのような細断技術は、細断するためのファットを、脂肪吸引（例えば、リポアスピレーション）又は腹壁形成術などの１種又は複数の手順から受け取るように協働してもよい。脂肪吸引に関して、外科用カニューレを使用してファットを吸引脂肪組織として収集し、これをその後細断してもよい。腹壁形成術に関して、ファットの塊を除去及び単離し、さらに細断してもよい。

第１のファット－酵素溶液は、消化のための触媒として濃縮又は精製された酵素を補助する夾雑物としての別の酵素の使用をさらに含んでもよい。別の酵素は、ヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合を加水分解することができ、より詳細にはＤＮＡ骨格におけるホスホジエステル連結の加水分解切断を触媒し、ＤＮＡを分解するヌクレアーゼ酵素であるデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）であってもよいが、これらに限定されない。消化のために、濃縮又は精製された酵素の体積に一致する体積のファットを含む消化フラスコが使用されてもよく、且つテフロン（登録商標）又は鋼コーティングされうる撹拌棒が使用されてもよい。実施例では、消化フラスコは、水浴中３７℃で８～１０分間振盪されてもよく、振盪されなくてもよい。

ブロック１０４では、第１の遠心分離操作においてブロック１０２の第１のファット－酵素溶液を遠心分離し、第１の遠心分離操作からの１つ又は複数のペレット及び１つ又は複数のペレットの上に位置するファット上層を得る。第１の遠心分離操作は、ファットと微小血管を含む単離物との分離を可能にする。

ブロック１０６では、第１の遠心分離操作から得られた上層を濃縮又は精製された酵素による第２の消化に供し、第２のファット－酵素溶液を得る。実施例では、上層は、ファット上層から微小血管を完全に離すための、新鮮な濃縮又は精製された酵素による第２の消化で消化されるファット上層である。

ブロック１０８では、第２の遠心分離操作において第２のファット－酵素溶液を遠心分離し、第２の遠心分離操作からの１つ又は複数のペレットを得る。実施例では、リピド／上側層（a lipid/upper layer、リピド（lipid）は脂質ともいう）（例えば、上側リピド層（an upper lipid layer））及び第２のファット－酵素溶液の上清が吸引除去され、チューブの底に１つ又は複数のペレットが残る。

ブロック１１０では、第１の遠心分離操作及び第２の遠心分離操作からの、得られたペレットとしての１つ又は複数のペレットの部分を１つ又は複数のふるい（screen:スクリーンともいう）に通し、単離された微小血管とする。実施例では、得られたペレットをゼラチン溶液で洗浄し、２つのふるいに通して微小血管を収集する。実施例では、図２に関して以下に詳細に記載されるように、微小血管酵素を凍結保存及び／又は酵素阻害剤による消化後洗浄によって阻害及び／又はクエンチし、微小血管のコラーゲン分解を防止する又は最小化する。凍結保存により、微小血管をある期間、例えば１ヶ月間まで保存することができる。

「実例１」
例示的な手順では、２０ミリリットル（ｍｌ）の細切された脂肪組織が使用される。ブロック１０２において、哺乳動物細胞を取り扱い培養するための平衡塩類溶液としての０．１％ＤＰＢＳ中３０ｍｇのＤＮａｓｅとともに濃縮又は精製された酵素としての３０ｍｇ Ｇｏｌｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅを含む３０ｍｌの第１のファット－酵素溶液を調製する。次に、１５ｍｇの濃縮又は精製された酵素が使用されるように、１０ｍｌの第１のファット－酵素溶液を第１のフラスコ中の１０ｍｌのファット（例えば、細切された脂肪）に添加する（例えば、１．０ｘ酵素ミックス）。第２のフラスコでは、７．５ｍｇの濃縮又は精製された酵素が使用されるように、７．５ｍｌの第１のファット－酵素溶液を別の１０ｍｌのファットに添加する（例えば、０．５ｘ酵素ミックス）。ブロック１０２で、両方のフラスコを水浴中３７℃で１分間振盪し、７分間振盪せずに８分間消化する。両方のフラスコが依然として組織の塊を保持する。

次のブロック１０４のステップでは、第１の遠心分離操作において両方のフラスコの材料を遠心分離する。１．０ｘ酵素ミックスは、０．５ｘ酵素ミックスより大きなペレットを生じる。ファット組織は、各遠心分離されたミックスの上層に残存する。ブロック１０６で、上層を新しいフラスコに移し、７．５ｍｌの第１のファット－酵素溶液の残存する酵素を添加して再消化する。この再消化は第２の消化特徴として働き、８分の振盪を含み、上部のほとんどが脂肪細胞である高品質の組織をもたらす。ブロック１０４後、１．０ｘ酵素ミックスはペレット中に微小血管を含まない細胞クラスターを生じ、０．５ｘ酵素ミックスは、ペレット中に微小血管を含まないより大きな細胞クラスターを生じる。ブロック１０６後、第２の消化後、並びにブロック１０８の遠心分離及びブロック１１０の微小血管単離後に相当な数の微小血管がもたらされ、その多くは長い。４５の計数を０．０２ｍｌで除して４０ｍｌを乗じた場合、９０，００００の微小血管が得られると推測される。得られた微小血管をペレット化し、冷凍培地の１ｍｌアリコート中で発泡容器の場合は－２０℃で２～３時間、その後－８０℃で、又は－１℃／分で冷却しながら直接－８０℃で冷凍する（例えば、凍結保存）。別の実施例では、ブロック１０２で１．０ｘ酵素ミックスを１６分間消化してもよい。

図２は、濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するための別の方法２００のフロー・チャートを示す。方法２００は、図１の方法１００と同様であり、ステップ２０８で第２の遠心分離前に行われる消化後洗浄の使用を含む追加的な選択肢を伴う。したがって、図２のブロック２０２、２０４、２０６及び２１０は、上述のブロック１０２、１０４、１０６及び１１０と同様である。新しいブロック２０８に関して、消化後洗浄は、０．０１％ブタゼラチンの使用を含む消化直後の特徴であってもよい。実施例では、消化後洗浄は、酵素阻害剤の使用を含んでもよい。酵素阻害剤は、これらに限定されないが、ペプチド阻害剤、小分子阻害剤、天然のマトリックス材料阻害剤、又はそれらの組合せなどのクラスの阻害剤を含んでもよい。天然のマトリックス材料阻害剤として、コラーゲンゲル、フィブリン、エラスチン、ゼラチン又はそれらの組合せを挙げることができるが、これらに限定されない。

「実例２」
実例２の方法は滅菌された用品によって開始し、最良のバイオセーフティ・レベル２（ＢＳＬ－２）の実験室業務及び無菌技術に従う。用品は以下を含んでもよい：
・１００ｍｍのペトリ皿の底に嵌まるように丸く切断された２０μｍ（約φ６０ｍｍ）のナイロン・メッシュ・フィルター。
・１００ｍｍのペトリ皿の底より大きくなるように１０ｃｍ正方形に切断された５００μｍ（約φ１００ｍｍ）のナイロン・メッシュ・フィルター。
・ワイヤ・ステンレス鋼メッシュふるい
・フラスコ１つにつき１つの小さな撹拌棒を備えた１２５ｍｌのポリカーボネート製エルレンマイヤーフラスコ
・１００ｍｍ×２０ｍｍのペトリ皿
・５０ｍｌの遠心分離用コニカル・チューブ
・Ｓｔｅｒｉ－ｆｌｉｐフィルター（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ カタログ＃ＳＣＧＰ００５２５）
・２００μｌの開口部が広いマイクロピペット・チップ
・１０００μｌのピペット・チップ
・セロロジカル・ピペット－２５、１０＆５ｍｌ
・ベンチトップ遠心分離機
・振盪用水浴
・ブロッキング緩衝液としてのカチオン不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．１％ウシ血清アルブミンタンパク質（ＢＳＡ）（ＢＳＡ－ＰＢＳ；ＢＳＡ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ カタログ＃ＢＰ１６０５－１００）
・Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｇｏｌｄ（ＶＩＴＡＣＹＴＥ カタログ＃０１１－１０６０）
・ウシ膵臓由来のＤＮａｓｅ－デオキシリボヌクレアーゼ１（Ｓｉｇｍａ ＤＮ２５）
・ＰＢＳ中２％ゼラチン溶液、オートクレーブ処理
・冷凍培地（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ カタログ＃１２６４８０１０）
・ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ カタログ＃１４１７５１０３）

図２を参照した実例２の手順は以下の通りである：

２０μｍのナイロンふるいを、後に使用するために２０ｍｌのＢＳＡ－ＰＢＳを含有するペトリ皿に入れる。ブロック２０２で、３５ｍｌ以下のファットを５０ｍｌのコニカル・チューブに移す。一度に４本までのファットのコニカル・チューブが使用できる。各チューブの体積をＨＢＳＳで５０ｍｌにする。チューブを反転させて洗浄し、４００ｇで４分間遠心分離し、ファットをコニカル・チューブの上部でファット上層として得る。ファット上層を新たな５０ｍｌコニカル・チューブに移し（新しいチューブ１本につき３５ｍｌまで）、体積をＨＢＳＳで５０ｍｌにし、新たなチューブを４００ｇで４分間遠心分離する。小さな回転棒を含有する１２５ｍＬ三角フラスコ１つにつき３０ｍｌ以下のファットを入れる。Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＧｏｌｄとＤＮａｓｅの溶液を測定して調製することにより第１のファット－酵素溶液を調製する。ＢＳＡ－ＰＢＳ中各酵素１ｍｇ／ｍｌを含有する第１のファット－酵素溶液を作製する（すなわち、１５ｍｌ ＢＳＡ－ＰＢＳ中１５ｍｇコラゲナーゼ及び１５ｍｇ ＤＮａｓｅ）。消化されるファットの体積に等しい体積に０．５Ｘｍｌの過剰量を加えたものを調製する。０．２μｍのＳｔｅｒｉＦｌｉｐフィルターを使用して第１のファット－酵素溶液を滅菌する。

次に、フラスコ中のファット１ｍｌにつき１ｍｌの酵素溶液を添加する（すなわち、洗浄されたファット１５ｍｌに１５ｍｌの酵素を添加する）。フラスコのキャップを締めてパラフィルムを巻く。ブロック２０２の第１の消化で、フラスコを３７℃の水浴に移して１分間振盪し、その後振盪せずにさらに７分間水浴中でインキュベーションを続ける。

ブロック２０４の第１の遠心分離操作で、第１のファット－酵素溶液を５０ｍｌコニカル・チューブに移し（チューブ１つにつき３５ｍｌ以下）、各チューブの体積をＢＳＡ－ＰＢＳで５０ｍｌにする。次に、２５０μｌの滅菌２％ゼラチンを各コニカル・チューブに添加し（０．０１％ゼラチンの最終濃度になるように）、第１の遠心分離操作を４００ｇで４分間行う。遠心分離後、コニカル・チューブに血液細胞、間質細胞の凝集塊及び微小血管を含有するペレットが得られる。

ブロック２０６で、コニカル・チューブ中のファットを上部に収集し（ファットがファット上層として消化されずに現れる）、撹拌棒を備える同じ５０ｍｌ三角フラスコに移す。第１の消化と同様、第２のファット－酵素溶液として同じ体積の新鮮な酵素ミックスを添加する（すなわち、１５ｍｌのファットから開始した場合１５ｍｌ）。フラスコのキャップをパラフィルムで巻き、第２の消化においてフラスコを３７℃の水浴中８分間振盪しながらインキュベートする。ファットが第２の消化で消化されている間、５０ｍｌコニカル・チューブを取り出し、各ペレットの上部の残液をペレットの上におよそ５ｍｌ残るように吸引してもよい。ペレットを再懸濁してペトリ皿に移してもよい。

ブロック２０８で、得られたファット－酵素溶液を５０ｍｌコニカル・チューブに移し、ＢＳＡ－ＰＢＳを５０ｍｌまで満たしてもよい。さらに、２５０μｌの２％ゼラチンを各コニカル・チューブに添加し（０．０１％ゼラチンの最終濃度になるように）、第２の遠心分離操作で４００ｇで４分間遠心分離してもよい。得られるペレットは、単離された微小血管及び消化できないマトリックス要素を含有する。リピド／上側層及び上清を、チューブの底に位置するペレット上におよそ５ｍｌ残るように吸引除去してもよい。

ブロック２１０で、各ペレットを再懸濁して２５～３０ｍｌのＢＳＡ－ＰＢＳを添加する。ペレットを、第１の消化からの微小血管（例えば、ペレット）を含むペトリ皿に添加する。滅菌鉗子を用いて金属ふるいを新しいペトリ皿の上に置き、５００μｍのナイロン・メッシュ・フィルターを金属ふるいの上に置く。微小血管懸濁液を皿から５００μｍふるい上にゆっくりピペッティングし、懸濁液から未消化の組織片を除去する。完了後、ペトリ皿を１０ｍｌ ＢＳＡ－ＰＢＳですすぎ、５００μｍふるい上にピペッティングする。ふるいにＢＳＡ－ＰＢＳをさらに２０ｍｌピペッティングすることによってふるいをすすぎ、ふるいに接着した微小血管又は組織の塊をふるいを通して洗浄する。５００μｍふるいを廃棄し、ワイヤ支持体を新しい１０ｃｍ皿に移す。この段階で、微小血管はふるいを通過して皿に存在する。

滅菌鉗子を用いて２０μｍのナイロン・メッシュ・フィルターをワイヤメッシュふるいの上に置き、下に位置する新しい皿を中心として配置する。ここで５００μｍふるい分けに使用されたペトリ皿内にある濾過された微小血管懸濁液を、例えば同心円状に２０μｍふるいを通してピペッティングする。懸濁液がふるいを通して非常にゆっくり移動し始め、その結果ふるいに溜まりが形成し移動に時間がかかる場合、このステップを停止し次のステップに進む。この緩慢な移動及び溜まりは高収率の微小血管を意味し、したがってステップを継続すると、すべての単一細胞を洗い落とすことができない場合がある。代わりに、第２の２０μｍふるいを再び入れ、ＢＳＡ－ＰＢＳに短時間浸し、必要な数の追加のふるいを使用してピペッティングのステップを続ける。元の皿を１０ｍｌのＢＳＡ－ＰＢＳですすぎ、残存する微小血管を除去して、ふるいにピペッティングする。

ふるいの縁からこぼれないよう注意しながら２０ｍｌのＢＳＡ－ＰＢＳを同心円状に穏やかにピペッティングすることによってふるいを再びすすぎ、残存する単一細胞を洗い落とす。この段階で、微小血管はふるいの上に捕捉され、単一細胞はふるいを通過している。

滅菌鉗子を用いて２０μｍのナイロン・メッシュ・フィルターをワイヤメッシュからスライドさせて外し、最初にふるいを浸すのに使用された２０ｍＬ ＢＳＡ－ＰＢＳを含有するペトリ皿に微小血管側を上にして入れる。２０μｍメッシュを１０分間浸す。ペトリ皿を前後に穏やかに振盪し、微小血管をナイロン・メッシュ・フィルターから取り除く。ふるい周辺の微小血管懸濁液の一部をピペットで吸い上げ、ピペットでふるいに吐き出すことによってナイロンふるいの上部を洗浄する。この懸濁液を５０ｍｌチューブに移す。１０ｍｌの新たなＢＳＡ－ＰＢＳを一度にふるいにピペッティングすることによって洗浄を複数回繰り返し、すすぎ液を５０ｍｌチューブに移す。ふるいウェルの縁もすすぐべきである。ふるいを顕微鏡で確認し、すべての微小血管が除去されたことを確実にすべきであり、これらの除去ステップは、必要であれば、すべての微小血管がふるいから除去されるまで繰り返される。得られた単離された微小血管は、この段階で５０ｍｌコニカル・チューブにあるべきである。

ここで、得られた単離された微小血管を計数してもよい。計数手順は、まず５０ｍｌコニカル・チューブの上部がしっかり締まっていることを決定することを含んでもよい。次に、断片懸濁液を含有するチューブを２～３回穏やかに反転させ、微小血管を溶液中に均一に分布した状態に保つ。２０μＬの懸濁液試料２つをチューブの反転直後に取り出し、ガラスのスライドにストリークする。ガラススライドは滅菌されていないため、ピペット・チップを各試料間で交換する。さらに、スライドにストリークする前にピペット・チップ上に大きな液滴がないことを決定すべきである。顕微鏡を用いて各ストリークで微小血管を計数する。剥がれた（もはや細胞が付着していない）微小血管は計数されるべきでない。大きな血管の各分枝は、別個の血管として計数されるべきである。小さい毛細血管については、３つに１つの毛細血管のみが計数されるべきである。

次に、微小血管の総数を以下の式１によって計算してもよい：
全微小血管＝（２つの２０μｌ試料からの平均断片数）^＊［（５０ｍｌチューブ中の懸濁液の体積）／０．０２）］
（式１）

断片懸濁液を４００ｇで４分間遠心分離してもよく、これは微小血管の計数中に行われてもよい。微小血管ペレットの上におよそ１００μＬの溶液が残るように上清をデカント又は吸引してもよい。１００μＬの溶液を穏やかにピペッティングし、微小血管断片をほぐしてもよい。

さらに、得られた単離された微小血管は冷凍されてもよい。クライオチューブを、すべてのチューブにそれらの内容物（ヒト微小血管（ＭＶ）、間質血管細胞群（ＳＶＦ）など）、ロット番号、バイアル中の微小血管の数及び調製者のイニシャルがラベル付けされるように調製してもよい。冷凍媒体を室温に戻し、微小血管を冷凍媒体中１ｍｌあたりの所望の量で懸濁する。冷凍媒体が入手可能でない場合、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＤＵＬＢＥＣＣＯ ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＥＡＧＬＥ ＭＥＤＩＵＭ（ＤＭＥＭ）細胞培養培地が使用されてもよい。チューブの蓋が締まっていることを確認しながら、各クライオチューブに１ｍｌまでの微小血管－冷凍媒体懸濁液を移し、クライオチューブ毎に微小血管を再懸濁する。クライオチューブを冷凍容器（例えば、ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣから市販のＭＲ．ＦＲＯＳＴＹ）に入れ、すぐに－８０℃の冷凍庫に移す。冷凍容器が入手可能でない場合、輸送用発泡容器が代わりに使用されてもよい。輸送用発泡容器が使用される場合、クライオチューブを－２０℃に２～４時間入れ、その後－８０℃の冷凍庫又は使用説明書に従って他の冷凍デバイスに入れてもよい。２４時間後、保持性のためにバイアルを保管用液体Ｎ_２に移す。

他の実例
本明細書に記載される濃縮又は精製された酵素の方法は、濃縮又は精製された酵素を使用して組織を解離させる、ヒト（又は他の）微小血管を単離するための新規の単離、培養及び分取の基準の開発を提供する。他の実施例は本開示の範囲内である。例として、且つ限定としてではなく、本明細書に記載される濃縮又は精製された酵素を使用する８分間の単一の消化を含む実施例では、収率は二重消化を使用する場合ほど高くない。さらに、８分間の間で変化する濃縮又は精製された酵素の濃度を含む実施例では、収率は二重消化を使用する場合ほど高くなく、相当な量のファットが消化されずに残る。８分間ずつの２回の二重消化を利用する実施例では、第２の消化後に高収率が得られ、微小血管の品質が良好である。そのような二重消化を複数回繰り返すことにより、３種の異なるファット源などの異なるファット源間で一貫した収率及び良好な品質が得られる。

図１の本明細書に記載される二重消化方法を使用する場合、且つ冷凍の前に、おそらく微小血管単離物上の残留するコラゲナーゼのキャリーオーバーに起因して、微小血管の崩壊とともにコラーゲンが急速に分解する可能性がある。しかし、４週間以上冷凍された微小血管は、コラーゲンの分解を生じなかった。残留コラゲナーゼを阻害又は不活性化し、生産時間を短縮して微小血管を４週間より前に使用するために、ブロック２０６の第２の消化の直後且つ第２の遠心分離操作の前のブロック２０８の溶解後洗浄は、培養期間を通してコラーゲンの完全性を維持し、微小血管の高収率をもたらし、さらにコラーゲンの分解を防止する。

他の洗浄プロトコールも種々の他の実例で試験される。ふるい分け後のシステイン（非競合阻害剤）洗浄の添加は、微小血管の崩壊とともに１日目にコラーゲンの急速な分解を依然としてもたらす。酵素の様々な濃度の試験は、より低い濃度で微小血管の低収率をもたらすが、１日目に微小血管の崩壊とともにコラーゲンの急速な分解を依然としてもたらす。余分な酵素をすすぎ落とすための酵素消化後の追加のＰＢＳ洗浄は、１日目に微小血管の崩壊とともにコラーゲンの急速な分解を依然としてもたらす。残存する酵素と競合結合することを試みるための、希釈されたコラーゲンによるふるい分け後の洗浄は、洗浄中のコラーゲンの重合及びコラーゲンプラグの全体的な構造を破壊する微小血管とのコラーゲン塊の懸濁をもたらす。ふるい分け後の５分間の０．０１％ゼラチン洗浄は、コラーゲンの分解を緩徐化するが停止させず、微小血管増殖の品質を低下させる。消化後にすべてのふるい分け／洗浄に添加される０．０１％ゼラチンは、ふるい分けされる微小血管のゼラチン依存性の凝集のために収率を低下させるが、コラーゲンは分解しなかった。ふるい分け後の２０分間の０．０１％ゼラチンによる洗浄は、培養期間を通してコラーゲンの完全性を維持する。１回限りの０．１％ゼラチンによる酵素消化後の洗浄は、高収率、良好な微小血管の品質をもたらし、コラーゲンは分解しない。

ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有培地を利用する実施例では、微小血管増殖はロット依存性であり、高価で時間のかかるロット試験を伴う場合がある。血清不含培地（ＳＦＭ）の使用は、ロット非依存性で動物製品を含まず、そのためヒトの試験に有用な規定された費用対効果の高いプロセスを可能にする。ＳａｔｏＳＦＭ及び１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの使用は、微小血管増殖をもたらさない。Ｓａｔｏ ＳＦＭ及び１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦに加え、各成分に対してレシピで訂正された投与計算の使用は、緩やかな微小血管増殖をもたらす。Ｓａｔｏ ＳＦＭ及び５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの使用は、試験されたロットの一部で良好な微小血管増殖、及びその他では緩やかな微小血管増殖をもたらし、これはゼラチンのインキュベーションの繰り返しに起因する可能性がある。ヒト血漿構成成分ベースの培地の使用は、Ｓａｔｏ ＳＦＭ及び５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの使用と同様の良好な微小血管増殖をもたらすが、作製するのが複雑且つ時間がかかる培地である。

試験された実施例では、６０，０００微小血管／ｍＬで１０Ｋの微小血管アリコートで試験を実施し、この１０Ｋの微小血管アリコートは顧客サイズである。しかし、ヒトの微小血管は試験されたラットの微小血管より小さく、ロバストな微小血管増殖には高密度が望ましいのに対し、同じ数の微小血管／ｍＬで密度が低くなる。アリコート当たりの微小血管の数が高いほど、解凍時のより容易な均一な懸濁及びより正確な計数が可能になり、また２０Ｋの微小血管のアリコートの最低サイズは、より容易な使用及び一貫した取扱いを可能にする場合がある。８０Ｋの微小血管／ｍＬの最低密度が使用されてもよい。

試験された実施例では、一部のファットのバッチは、培養中に破裂して微小血管死をもたらしうる筋肉細胞（例えば、筋細胞）を含有する。Ｐｅｒｃｏｌｌ遠心分離によって異なるサイズの細胞を分離することができるが、筋細胞と同様の密度の微小血管は分離しない。筋細胞はプラスチックに粘着する可能性があるため、単離物の上４分の３のみがふるい分けされる場合があり、筋細胞がプラスチックによって捕捉されることで筋細胞の計数が顕著に低下し、微小血管増殖が良好になり、さらに微小血管の収率はわずかに低くなる。実施例では、組織培養接着性プラスチックを利用し、筋細胞の接着をさらに促してもよい。

図３は、図１～２のフロー・チャートの方法１００、２００を自動化するためのコンピュータ・ベースの制御スキームを実施するシステム３００を示す。システム３００は、例えばユーザ・ワークステーション（例えば、コンピューティング・デバイス３２４）でアクセス可能なグラフィカル・ユーザ・インターフェース（ＧＵＩ：ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｕｓｅｒ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）２０２の使用とともに実施されてもよい。コンピューティング・デバイス３２４は、スマートフォン、タブレット又は同様の携帯型手持ちスマート・デバイスでありうるスマート・モバイル・デバイスであってもよい。コンピューティング・デバイス３２４は、プロセッサ、プロセッサに通信可能に連結されたメモリ、及びメモリに保存された機械可読命令を含む。機械可読命令は、方法１００、２００の１つ又は複数のステップが自動化されうるように、プロセッサによって実行された場合にシステム３００を図１～２の方法１００、２００のブロックの１つ又は複数に従わせてもよい。したがって、機械可読命令は、プロセッサによって実行された場合に、システム３００を本明細書に記載される１つ又は複数のプロセスに示される１つ又は複数の制御スキームに従わせてもよい。

システム３００は、通信路３０２、１つ又は複数のプロセッサ３０４、メモリ・コンポーネント３０６、ソフトウェア・ツール・コンポーネント３１２、本明細書に記載される１つ又は複数のプロトコールを含みうるストレージ又はデータベース３１４、人工知能コンポーネント３１６、ネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８、サーバ３２０、ネットワーク３２２及び少なくとも１つのコンピューティング・デバイス３２４を含む。システム３００の種々のコンポーネント及びそれらの対話が以下で詳述される。

一部の実施例では、システム３００は、ワイド・エリア・ネットワーク（ＷＡＮ：ｗｉｄｅ ａｒｅａ ｎｅｔｗｏｒｋ）或いはイントラネット若しくはインターネット、又はクラウド・コンピューティング・ベースのネットワーク構成を含みうる他の有線若しくは無線通信ネットワークなどのネットワーク３２２を使用して実施される。ワークステーションのコンピューティング・デバイス３２４は、スマート・モバイル・デバイス２００などのデジタル・システム並びにネットワークへの接続及びそのナビゲーションを可能にする他のデバイスを含んでもよい。種々の地理的に多様なコンポーネント間の通信を可能にする他のシステム３００の変形が可能である。図３に示されるラインは、種々のコンポーネント間の物理的な接続ではなく通信を示す。

上述のように、システム３００は通信路３０２を含む。通信路３０２は、例えば導電線、導電トレース、光導波路などの信号を伝達できる任意の媒体、又は信号を伝達できる媒体の組合せから形成されてもよい。通信路３０２は、システム３００の種々のコンポーネントを通信可能に連結する。本明細書で使用される場合、「通信可能に連結される」という用語は、例えば導電媒体を介した電気信号、空気を介した電磁信号、光導波路を介した光信号など、連結されたコンポーネントが互いとデータ信号を交換できることを意味する。

上述のように、システム３００はプロセッサ３０４を含む。プロセッサ３０４は、機械可読命令を実行できる任意のデバイスであってもよい。したがって、プロセッサ３０４は、制御装置、集積回路、マイクロチップ、コンピュータ又は任意の他のコンピューティング・デバイスであってもよい。プロセッサ３０４は、通信路３０２によってシステム３００の他のコンポーネントに通信可能に連結される。したがって、通信路３０２は、任意の数のプロセッサを互いと通信可能に連結し、且つ通信路３０２に連結されたモジュールが分散コンピューティング環境で動作することを可能にしてもよい。特に、モジュールのそれぞれは、データを送信する及び／又は受信することができるノードとして動作可能である。プロセッサ３０４は、システム・モジュールから受信された入力信号を処理する及び／又はそのような信号から情報を抽出してもよい。

上述のように、システム３００は、通信路３０２に連結され、且つプロセッサ３０４に通信可能に連結されたメモリ・コンポーネント３０６を含む。メモリ・コンポーネント３０６は、非一時的コンピュータ可読媒体又は非一時的コンピュータ可読メモリであってもよく、不揮発性コンピュータ可読媒体として構成されてもよい。メモリ・コンポーネント３０６は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュ・メモリ、ハード・ドライブ、又は機械可読命令がプロセッサ３０４によってアクセス及び実行可能であるように機械可読命令を保存することができる任意のデバイスを含んでもよい。機械可読命令は、機械可読命令にコンパイル又はアセンブルされ、メモリ・コンポーネント３０６に保存されてもよい任意のプログラミング言語、例えばプロセッサによって直接実行されうる機械言語又はアセンブリ言語、オブジェクト指向プログラミング（ＯＯＰ：ｏｂｊｅｃｔ－ｏｒｉｅｎｔｅｄ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）、スクリプト言語、マイクロコードなどで記述されるロジック又はアルゴリズムを含んでもよい。代替的に、機械可読命令は、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ：ｆｉｅｌｄ－ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｇａｔｅ ａｒｒａｙ）構成又は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ）のいずれか又はそれらの等価物によって実施されるロジックなど、ハードウェア記述言語（ＨＤＬ：ｈａｒｄｗａｒｅ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌａｎｇｕａｇｅ）で記述されてもよい。したがって本明細書に記載される方法は、予めプログラムされたハードウェア要素として、又はハードウェア・コンポーネントとソフトウェア・コンポーネントの組合せとして任意の従来のコンピュータ・プログラミング言語で実施されてもよい。実施例では、システム３００は、プロセッサ３０４によって実行された場合に、本明細書に記載される１つ又は複数の機能をプロセッサに実施させる命令を保存するメモリ・コンポーネント３０６に通信可能に連結されたプロセッサ３０４を含んでもよい。

さらに図３を参照すると、上述のように、システム３００はコンピューティング・デバイス３２４の画面上に、視覚的出力、例えば情報、グラフィカル・レポート、メッセージ又はそれらの組合せなどを提供するためのＧＵＩなどのディスプレイを含む。コンピューティング・デバイス３２４は、プラットフォームにわたる１つ又は複数のコンピューティング・デバイスを含んでもよく、又はスマートフォン、タブレット、ラップトップ及び／又はその他を含むスマート・モバイル・デバイス２００などのプラットフォームにわたるデバイスに通信可能に連結されてもよい。コンピューティング・デバイス３２４の画面上のディスプレイは通信路３０２に連結され、且つプロセッサ３０４に通信可能に連結される。したがって、通信路３０２は、ディスプレイをシステム３００の他のモジュールに通信可能に連結する。ディスプレイは、光出力を伝達することができる任意の媒体、例えば陰極線管、発光ダイオード、液晶ディスプレイ、プラズマ・ディスプレイなどを含んでもよい。さらに、ディスプレイ又はコンピューティング・デバイス３２４は、プロセッサ３０４及びメモリ・コンポーネント３０６のうちの少なくとも１つを含んでもよいことが留意される。システム３００は、図３で単一の統合システムとして図示されるが、他の実施例ではシステムは独立のシステムであってもよい。

システム３００は、本明細書に記載される１つ又は複数のプロトコール又は方法のステップを自動化するためのソフトウェア・ツール・コンポーネント３１２、及びニューラル・ネットワークをトレーニングし、より正確で一貫したより高収率の微小血管増殖及び単離をもたらすために、本明細書に記載されるように適用される自動化されたプロトコール又は方法を自動的に改善及び変更するための機械学習を実現できる機械学習能力を付与する人工知能コンポーネント３１６を含む。実施例では、機械可読命令は、１つ又は複数のプロセッサ３０４によって実行された場合に、システム３００に少なくとも以下を実施させる：人工知能コンポーネント３１６を適用し、本明細書に記載されるシステム３００の１つ又は複数のプロトコールを自動化するようにシステム３００によって使用されるニューラル・ネットワーク・モデルをトレーニングする、及び人工知能コンポーネント３１６によりニューラル・ネットワーク・モデルに機械学習を適用し、システム３００の１つ又は複数のプロトコールに関連する履歴データに基づいて経時的に１つ又は複数のプロトコールを変更し、システム３００による経時的なより高収率の微小血管増殖並びに正確さ及び一貫性が増大した単離をもたらす。ソフトウェア・ツール・コンポーネント３１２及び人工知能コンポーネント３１６は通信路３０２に連結され、プロセッサ３０４に通信可能に連結される。プロセッサ３０４は、システム・モジュールから受信した入力信号を処理する及び／又はそのような信号から情報を抽出してもよい。

本明細書に記載されるようにシステム３００に保存及び操作されるデータは、人工知能コンポーネント３１６によって利用され、人工知能コンポーネント３１６は、クラウドなどのクラウド・コンピューティング・ベースのネットワーク構成を利用し、機械学習及び人工知能を適用することができる。この機械学習の適用により、システム３００によって適用されてもよいモデルを作成することができ、実行がより効率的且つ知的になる。例として且つ限定ではなく、人工知能コンポーネント３１６は、人工知能エンジン、ベイズ推定エンジン及び意思決定エンジンからなる群から選択されるコンポーネントを含んでもよく、且つディープ・ニューラル・ネットワーク学習エンジンをさらに含む適応学習エンジンを有してもよい。

システム３００は、システム３００をネットワーク３２２などのコンピュータ・ネットワークと通信可能に連結するためのネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８を含む。ネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８は、通信路３０２がネットワーク・インターフェース・ハードウェア２１８をシステム３００の他のモジュールに通信可能に連結するように、通信路３０２に連結される。ネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８は、無線ネットワークを介してデータを伝達及び／又は受信できる任意のデバイスであってもよい。したがって、ネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８は、任意の無線通信基準に従ってデータを送信及び／又は受信するための通信トランシーバを含んでもよい。例えば、ネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８は、有線及び／又は無線コンピュータ・ネットワーク、例えばワイヤレス・フィデリティ（Ｗｉ－Ｆｉ：ｗｉｒｅｌｅｓｓ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）、ＷｉＭａｘ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、ＩｒＤＡ、Ｗｉｒｅｌｅｓｓ ＵＳＢ、Ｚ－Ｗａｖｅ、ＺｉｇＢｅｅなどを通して通信するチップセット（例えば、アンテナ、プロセッサ、機械可読命令など）を含んでもよい。

さらに図３を参照すると、コンピューティング・デバイス３２４上で作動する種々のアプリケーションからのデータが、ネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８を介してコンピューティング・デバイス３２４からシステム３００に提供されてもよい。コンピューティング・デバイス３２４は、ネットワーク・インターフェース・ハードウェア３１８及びネットワーク３２２と通信可能に連結するためのハードウェア（例えば、チップセット、プロセッサ、メモリなど）を有する任意のデバイスであってもよい。特に、コンピューティング・デバイス３２４は、上述の無線コンピュータ・ネットワークのうちの１つ又は複数を通して通信するためのアンテナを有する入力デバイスを含んでもよい。

ネットワーク３２２は、任意の有線及び／又は無線ネットワーク、例えばワイド・エリア・ネットワーク、メトロポリタン・エリア・ネットワーク、インターネット、イントラネット、クラウド３２３、衛星ネットワークなどを含んでもよい。したがって、ネットワーク３２２は、コンピューティング・デバイス３２４によって１つ又は複数のサーバ（例えば、サーバ３２０）にアクセスするための無線アクセス・ポイントとして利用されてもよい。サーバ３２０及びクラウド・サーバなどの任意の追加のサーバは、一般的にネットワーク３２２を介してリソースを送達するためのプロセッサ、メモリ及びチップセットを含む。リソースは、例えばネットワーク３２２を介したサーバ３２０からシステム３００への処理、保存、ソフトウェア及び情報の提供を含んでもよい。さらに、サーバ３２０及び任意の追加のサーバは、例えばネットワークの有線部分、ネットワークの無線部分又はそれらの組合せを介してネットワーク３２２を通して互いとリソースを共有してもよいことが留意される。

本明細書に記載される濃縮又は精製された酵素及び二重消化特徴を利用するシステム及び方法は、上述の粗酵素を利用する以前の方法と比較して高度に規定された単離された微小血管組成物、ロット間の一貫性及び費用対効果をもたらす。

本開示を記載及び定義する目的で、パラメータ又は別の変数の「関数」である変数への本明細書における言及は、変数がもっぱら列挙されたパラメータ又は変数の関数であると示すことを意図しないことが留意される。むしろ、列挙されたパラメータの「関数」である変数への本明細書における言及は、変数が単一のパラメータ又は複数のパラメータの関数でありうるように非制限的であることを意図する。

「少なくとも１つの」成分、要素などの本明細書における記述は、冠詞「ａ」又は「ａｎ」の代替的な使用が単一の成分、要素などに限定されるべきであるという推測をもたらすために使用されるべきではないことも留意される。

特定の性質を具現化するため、又は特定の様態で機能するために特定の方法で「構成される」又は「プログラムされる」本開示のコンポーネントの本明細書における記述は、意図される用途の記述とは対照的に、構造的記述であることが留意される。より詳細には、コンポーネントが「構成される」又は「プログラムされる」様態への本明細書における言及は、コンポーネントの既存の物理的状態を表し、したがってコンポーネントの構造的特性の明確な記述として解釈されるべきである。

「好ましくは」、「一般的に」及び「典型的に」などの用語は、本明細書で利用される場合、特許請求される開示の範囲を限定する、又は特定の特徴が特許請求される開示の構造若しくは機能にとって重大である、必須である、若しくはさらには重要であると示唆するように利用されないことが留意される。むしろ、これらの用語は、本開示の実施例の特定の態様を特定する、又は本開示の特定の実施例で利用されてもされなくてもよい代替的な、若しくは追加の特徴を強調することを意図するにすぎない。

本開示を記載及び定義する目的で、「実質的に」及び「およそ」という用語は、任意の定量的比較、値、測定又は他の表示に起因する可能性がある不確実性の固有の程度を表すために本明細書で利用されることが留意される。「実質的に」及び「およそ」という用語はまた、定量的表示が、問題の主題の基本的機能に変化を生じることなく述べられた基準から異なりうる程度を表すために本明細書で利用される。

本開示の主題を詳細に、且つその特定の実施例を参照して記載したが、本明細書に開示される種々の詳細は、特定の要素が本明細書に付随する図面のそれぞれに示される場合であっても、これらの詳細が本明細書に記載される種々の実施例の本質的な成分である要素に関連することを示唆すると解釈されるべきではないことが留意される。さらに、これらに限定されないが、添付の特許請求の範囲に定義される実施例を含む本開示の範囲から逸脱することなく修正及び変形が可能であることが明白である。より詳細には、本開示の一部の態様は、好ましい又は特に有利であるとして本明細書で特定されるが、本開示は必ずしもこれらの態様に限定されないことが企図される。

以下の特許請求の範囲の１つ又は複数は、移行句として「であって」（ｗｈｅｒｅｉｎ）という用語を利用することが留意される。本開示を定義する目的で、この用語は構造の一連の特性の記述を導入するために使用される非制限的な移行句として特許請求の範囲に導入され、且つより一般的に使用される非制限的なプレアンブルの用語「含む」と同様に解釈されるべきであることが留意される。

Claims (20)

1. 濃縮された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するためのシステムであって、
   １つ又は複数のプロセッサ、
   前記１つ又は複数のプロセッサに通信可能に連結された非一時的メモリ、及び
   前記非一時的メモリに保存された機械可読命令であり、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに１つ又は複数のプロトコールとして少なくとも以下：
   第１の消化において、細切された脂肪を濃縮された酵素で消化し、第１のファット－酵素溶液を生成すること、
   第１の遠心分離操作で前記第１の消化からの前記第１のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第１のペレット及び前記１つ又は複数の第１のペレットの上に位置するファット上層を生成すること、
   第２の消化において、前記ファット上層を前記濃縮された酵素で消化し、第２のファット－酵素溶液を生成すること、
   第２の遠心分離操作において前記第２の消化からの前記第２のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第２のペレットを生成すること、並びに
   前記１つ又は複数の第１のペレット及び前記１つ又は複数の第２のペレットの１つ又は複数の部分を１つ又は複数のふるいに通し、複数の単離された微小血管を生成すること
   を実施させる機械可読命令
   を含むシステム。
2. 前記濃縮された酵素が、組織から細胞を単離するためのクロストリジウム・ヒストリチカムからの低プロテアーゼ濃縮コラゲナーゼ生成物を含む濃縮又は精製された酵素を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
   前記第２の遠心分離操作の前に、消化後洗浄において前記第２のファット－酵素溶液を酵素阻害剤で洗浄する
   をさらに実施させる、請求項１に記載のシステム。
4. 前記消化後洗浄の前記酵素阻害剤が、１種若しくは複数のペプチド阻害剤、１種若しくは複数の小分子阻害剤、１種若しくは複数の天然のマトリックス材料阻害剤、又はそれらの組合せを含む、請求項３に記載のシステム。
5. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
   前記１つ又は複数の部分をゼラチン溶液で洗浄する、及び
   前記１つ又は複数の部分を２つのふるいに通し、前記複数の単離された微小血管を生成する
   をさらに実施させる、請求項１に記載のシステム。
6. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
   前記複数の単離された微小血管を凍結保存する
   をさらに実施させる、請求項５に記載のシステム。
7. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
   前記第１のファット－酵素溶液の消化のための触媒として追加の酵素を使用する
   をさらに実施させる、請求項１に記載のシステム。
8. 前記追加の酵素がデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を含む、請求項７に記載のシステム。
9. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
   上側リピド層及び前記第２の遠心分離操作からの前記第２のファット－酵素溶液の上清を吸引除去し、前記第２のファット－酵素溶液を含有するチューブの底に前記１つ又は複数の第２のペレットを残す
   をさらに実施させる、請求項１に記載のシステム。
10. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
    手動の混合、脂肪吸引カニューレ又はそれらの組合せの使用によって脂肪を細切し、前記細切された脂肪を生成する
    をさらに実施させる、請求項１に記載のシステム。
11. 前記脂肪が、脂肪吸引、腹壁形成術又はそれらの組合せを含む１種又は複数の手順から受け取られる、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
    人工知能コンポーネントを適用し、前記システムの前記１つ又は複数のプロトコールを自動化するように前記システムによって使用されるニューラル・ネットワーク・モデルをトレーニングする
    をさらに実施させる、請求項１に記載のシステム。
13. 前記機械可読命令が、前記１つ又は複数のプロセッサによって実行された場合に、前記システムに少なくとも以下：
    前記人工知能コンポーネントにより、前記システムの前記１つ又は複数のプロトコールに関連する履歴データに基づいて経時的に前記１つ又は複数のプロトコールを変更し、前記システムによる経時的なより高収率の微小血管増殖並びに正確さ及び一貫性が増大した単離をもたらすための機械学習をニューラル・ネットワーク・モデルに適用する
    をさらに実施させる、請求項１２に記載のシステム。
14. 濃縮された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するための方法であって、
    第１の消化において、細切された脂肪を濃縮された酵素で消化し、第１のファット－酵素溶液を生成すること、
    第１の遠心分離操作において前記第１の消化からの前記第１のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第１のペレット及び前記１つ又は複数の第１のペレットの上に位置するファット上層を生成すること、
    第２の消化において、前記ファット上層を前記濃縮された酵素で消化し、第２のファット－酵素溶液を生成すること、
    第２の遠心分離操作において前記第２の消化からの前記第２のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第２のペレットを生成すること、並びに
    前記１つ又は複数の第１のペレット及び前記１つ又は複数の第２のペレットの１つ又は複数の部分を１つ又は複数のふるいに通し、複数の単離された微小血管を生成すること
    を含む方法。
15. 前記第２の遠心分離操作の前に、消化後洗浄において前記第２のファット－酵素溶液を酵素阻害剤で洗浄すること
    をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記消化後洗浄の前記酵素阻害剤が、１種若しくは複数のペプチド阻害剤、１種若しくは複数の小分子阻害剤、１種若しくは複数の天然のマトリックス材料阻害剤、又はそれらの組合せを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記消化後洗浄の前記酵素阻害剤が０．０１％ブタゼラチンを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１のファット－酵素溶液の消化のための触媒として追加の酵素を使用すること
    をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
19. 濃縮された酵素を使用して組織を解離させる微小血管を単離するための方法であって、
    第１の消化において、細切された脂肪を濃縮された酵素で消化し、第１のファット－酵素溶液を生成すること、
    前記第１のファット－酵素溶液の消化のための触媒として追加の酵素を使用すること、
    第１の遠心分離操作において前記第１の消化からの前記第１のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第１のペレット及び前記１つ又は複数の第１のペレットの上に位置するファット上層を生成すること、
    第２の消化において前記ファット上層を前記濃縮された酵素で消化し、第２のファット－酵素溶液を生成すること、
    消化後洗浄において前記第２のファット－酵素溶液を酵素阻害剤で洗浄することであって、ここて、前記消化後洗浄の前記酵素阻害剤が、１種若しくは複数のペプチド阻害剤、１種若しくは複数の小分子阻害剤、１種若しくは複数の天然のマトリックス材料阻害剤、又はそれらの組合せを含み、
    第２の遠心分離操作において前記第２の消化からの前記第２のファット－酵素溶液を遠心分離し、１つ又は複数の第２のペレットを生成すること、並びに
    前記１つ又は複数の第１のペレット及び前記１つ又は複数の第２のペレットの１つ又は複数の部分を１つ又は複数のふるいに通し、複数の単離された微小血管を生成すること
    を含む方法。
20. 前記消化後洗浄の前記酵素阻害剤が０．０１％ブタゼラチンを含む、請求項１９に記載の方法。

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