JP2022521729A - 微小液滴操作装置 - Google Patents

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Abstract

微小液滴を操作する装置は、経路に沿って流れる担体流体中に分散された微小液滴を受け取り、操作するように適合された微小流体チップを含み、前記チップは担体流体の流量が異なるまたはゼロの領域を含むことを特徴とする。異なる流れの領域間で複数の種類の乳剤と乳剤の成分を輸送するエレクトロウエッティング手段も開示されている。【選択図】図１

Description

本発明は、微小液滴と担体流体の乳剤を操作するのに適した微小流体チップに関する。当該微小流体チップでは、前記乳剤の成分は、選択的に加えられる保持力と共に、前記乳剤を異なる流れの領域に曝すことにより、独立して操作され得る。
液滴や磁気ビーズを操作するための装置は、当技術分野で以前から説明されている。例えば、特許文献１～３を参照のこと。液滴の場合、この結果は、典型的には、例えば、混じり合わない担体流体の存在下で、液滴を、カートリッジまたは微小流体管の2つの対向する壁によって画定される微小流体空間を通過させることによって達成され得る。カートリッジまたは微小流体管の 一方または両方の壁には、誘電層で覆われた微小電極が埋め込まれており、それぞれの電極はA/Cバイアス回路に接続されている。A/Cバイアス回路は、層の電場特性を変更するために、間隔を空けて急速にオン/オフすることができる。これにより、微小電極の近傍に局所的な指向性毛管力が発生し、これを利用して液滴を1つ以上の所定の経路に誘導することができる。このようなデバイスは、以下、本発明に関連して「本物の」エレクトロウェッティング電極と呼ばれるものを採用しており、当業界ではEWOD（Electrowetting on Dielectric）デバイスという頭文字で知られている。
エレクトロウェッティング力が光学的に媒介されるこのアプローチの変形は、当技術分野ではオプトエレクトロウェッティングとして知られており、以下では対応する頭字語OEWODとして知られており、例えば、特許文献１～４および非特許文献１に開示されている。特に、4つの特許出願のうち最初のものは、第1および第2の壁によって画定される微小流体キャビティを含み、第1の壁が複合設計であり、基板、光導電層および絶縁（誘電）層で構成される、様々な微小流体デバイスを開示している。本実施形態では、光導電層と絶縁層の間に、互いに電気的に絶縁され、光活性層に結合された導電性セルのアレイが配置されており、その機能は、絶縁層上に対応するエレクトロウェッティング電極の位置を生成することである。これらの位置では、上述のようにエレクトロウェッティング場によって液滴の表面張力特性を変更することができる。これらの光導電層は、光が当たることで一時的に導電性セルをオンされ得る。この方法は、スイッチングがより簡単かつ迅速に行えるという利点があるものの、電極の配置によってある程度制限される。さらに、液滴を移動させる速度や、実際の液滴の経路を変化させる範囲にも限界がある。
この後者の方法の両面実施形態は、非特許文献２に開示されている。一例では、電気的にバイアス印加されたアモルファスシリコン上の光パターンを用いて誘電層上に堆積されたテフロンAFの表面を横切る光エレクトロウェッティングを用いて、サイズ範囲100～500mの比較的大きな液滴を操作することができるデバイスが記載されている。しかし、例示されたデバイスでは、誘電層は薄く（100nm）、光活性層のある壁にしか配置されていない。
最近では、本願出願人らが出願中のEP17177204.9に、光電子放射を利用して微小液滴を操作するデバイスが記載されている。このOEWODデバイスでは、微小液滴は、例えば、微小流体空間を挟む一対の平行なプレートなどの含有壁によって定義された微小流体空間を介して転流される。封入壁の少なくとも一方には、内部に埋設された半導体層の領域に選択的に光を照射することで発生する「仮想」エレクトロウェッティング電極が設置されている。別の光源からの光で層を選択的に照明することで、仮想エレクトロウェッティング電極位置の仮想経路を一時的に生成し、それに沿って微小液滴を移動させることができる。対応出願EP17180391.9には、この装置を核酸シーケンサーの動作部分として使用することが記載されている。
本願出願人らは現在、いくつかの例では、異なる流れの領域間で微小液滴を移動させることが非常に望ましいことを発見した。これにより、例えば、特定の微小液滴を異なる領域に分離して捕捉することができる。例えば、そこで起こる化学反応や酵素反応を培養する目的で一時的に保存することができるし、別の例では、担体や流体、または第2の乳剤を微小流体チップに流入させる間、特定の位置に保持することができる。この後者の例は、細胞培養に有用であり、細胞を含む微小液滴が所定の位置に保持される一方で、溶解した栄養分や気体を含む連続相流が微小液滴上に流される。さらに、本発明の別の応用例として、体外受精のワークフロー中に雄と雌の配偶子を操作して検査することが挙げられる。
米国特許出願公開第20030224528公報 米国特許出願公開第20150298125公報 米国特許出願公開第20160158748公報 米国特許出願公開第20160160259公報 PCT／EP2019／062791
Applied Physics Letters 93 221110、2008年 Pei著、カリフォルニア大学バークレー校の論文UCB/EECS-2015-119 Spiegelaere他(2012). Methods Mol. Biol., vol 853, pp 29-37; Goossens et al. (2012). Anal. Biochem., vol 423(1), pp 93-101
本発明によれば、微小液滴を操作する装置であって、経路に沿って流れる担体流体中に分散された微小液滴を受け取り、操作するように適合された微小流体チップを含み、チップは担体流体の流量が異なるまたはゼロの領域を含むことを特徴とする装置が提供される。
発明の一実施形態では、前記微小流体チップは、例えばエレクトロウェッティング力の適用などの保持力によって前記微小液滴を静止位置に保持する1つ以上の場所を含む。別の実施形態では、採用される前記エレクトロウェッティング力は、光学的に媒介され（OEWOD）、上述または後述のタイプの仮想電極を用いる。さらに別の実施形態では、前記チップは、様々な領域の間で前記微小液滴を移送する手段をさらに含む。好ましくは、前記移送手段は、前記微小液滴または選択された微小液滴が沿って移動し得る現実又は仮想のエレクトロウェッティング位置の経路を含む。
液滴が、流体の流れが少ない領域に存在することによって、若しくは（光）エレクトロウェッティング力などの外力によって保持されることによって、又は前述の2つの効果の組み合わせによって静止している場合、前記液滴をその保持場所から変位させることなく、外部のポンプ力を用いて連続相の流れを制御することが可能である。この操作は、標的液滴の周囲で前記連続相を交換することができるという利点を有する。前記標的液滴に内包された生体細胞の代謝活動によって枯渇する溶存気体や栄養分を前記連続相が含む生体細胞培養システムでは、前記微小流体の外部から新たな物質を流入させることで、前記の枯渇した連続相を補充することが有利である。同様に、前記連続相と前記微小液滴の間で溶解物質を移動させることで、前記液滴のpHを変更することができる。緩衝性細胞培養液のような試薬－通常は前記培養媒体のpHが前記培養媒体の周囲を取り囲む気相の二酸化炭素濃度によって調整される－の場合、外部で所望の気相と平衡となった担体相を制御して導入することで、前記液滴中の培養媒体と気相の間に輸送経路を形成することができる。
このような前記チップ内の低流量領域に保持された液滴が担体相を流すことによって再供給される機構は、前記担体相が二酸化炭素や酸素などの溶質に対して非常に高い飽和容量を有するが、水性物質に対して相対的に低い飽和容量を有する場合に特に有利である。これにより、油相への水滴の溶解速度は低くなるが、前記連続相から前記微小液滴への溶存気体の補充は効率的に行われるようになる。このようにして、酸素や二酸化炭素などの必要な気体へのアクセスを制限することなく、また細胞を含む前記微小液滴の体積を減少させることなく、前記微小液滴内で細胞の集団を生存・増殖状態に保つことが可能となる。
前記微小液滴の内部の分析物が前記連続相中に溶解する場合、前記微小液滴を移動させることなく前記連続相を流して前記分析物の試料を抽出することができる。同様に、前記連続相の流れを利用して前記微小液滴に外部試薬を導入することも可能である。
例示的な実施形態では、前記連続相の流れは、流体ポンプをオフにしてバルブを閉じることによって停止させる。前記液滴内で培養された細胞は化合物を分泌し、その化合物は前記液滴から前記連続相へと自然に拡散する。場合によっては、光学的なエレクトロウェッティング力を使って液滴を攪拌することで前記拡散が促進される。前記液滴から分泌された物質を蓄積した前記連続相の試料は、前記ポンプを再作動させ、関連するバルブを開くことで前記装置から回収され得る。このプロセスは逆に操作することもできる。それにより前記連続相に溶解した物質は前記液滴に供給され得る。これはバッチ式の流れの形式をとることができる。それにより前記連続相の一部は、流体ポンプの作動によって導入されて前記液滴の周囲の空間に放置されて培養する。また、前記連続相の流れが前記液滴を通過するような一定の流れにすることもできる。前記連続相から前記液滴とその中に含まれる細胞への物質の取り込みは、受動的拡散、浸透、オストワルド熟成のいずれかによって行われる。
前記連続相の流れを起こすだけでなく、前記低流量領域とエレクトロウェッティング力を利用して前の液滴の一部を静止させた状態で、前記チップの外側から微小液滴の２次乳剤の流れを起こすことも可能である。その後、前記２次乳剤からの前記液滴を、１次乳剤と同様の方法で前記低流量領域に捕獲することができる。このプロセスは3次乳剤で繰り返すことができる。このようにして、一連の異なる乳剤を単一の入口だけで微小流体チップに順次搬入することができる。
上述したように、いくつかの実施形態では、本発明は、体外受精のワークフローにおいて、雄および雌の配偶子の操作並びに検査に適用することができる。
例えば、本発明の装置を用いて、ヒトまたは動物の精子細胞などの雄性配偶子細胞の検査、選択、およびアッセイの手順を実施することが可能である。 1つの例では、精子細胞の試料が希釈した精液から調製されて液滴に封入される。この液滴がチップに装着され、明視野顕微鏡で検査される。配偶子を含まないこれらの液滴は廃棄され、精子細胞を含む液滴は検査のために保持される。分析対象となる配偶子の試料が選択されると、前記配偶子の動画と静止画が撮影される。この動画にパターン認識アルゴリズムを適用することで、配偶子の運動性、体の形態、核の形態などの特徴を把握することができる。この特徴づけの結果は、特定の液滴にマッピングされてよい。その後前記特定の液滴は回収されてさらなる処理を行われる。この処理は、レポーター試薬の添加など、チップ上でのアッセイステップを含むことができ、また、体外受精プロセスや遺伝子解析に使用するためにチップ外で回収することもできる。
別の例では、ヒトや動物の卵子などの雌性配偶子を封入することで、卵子の受精を行うことができる。雄の配偶子と同様に、雌の配偶子を液滴に封入して、前記チップに搭載することができる。当該装置上では前記細胞は、形態の欠陥を検査したり、レポーター試薬を用いてアッセイされ得る。検査またはアッセイの後、前記雌性配偶子細胞は、液滴の動きによって加えられる機械的なせん断によって生殖上皮細胞を除去したり、さらなる試薬を加えたりするなど、任意の処理工程を受けてよい。
さらに別の例では、雄性および雌性の配偶子を単一の微小流体装置に搭載することにより、2つの配偶子を含む液滴を一緒に合体させることが可能である。一の例では、多数の雄性配偶子の液滴を1つの卵子と合体させ、従来の配偶子間の相互作用により、チップ上で受精が起こって胚盤胞が生成される。別の例では、選択された単一の男性配偶子と、選択され処理された単一の女性配偶子がチップ上で結合されて相互作用する。
別の応用例では、両性の配偶子が微小流体チップから回収され、ICSIまたはIVFなどの当技術分野で知られる従来の処理技術を用いて結合される。
いくつかの実施形態では、上述の方法または当技術分野で知られている従来の方法で形成された胚盤胞も、液滴に封入されてチップ上で培養され得る。オンチップ培養によって、後述するイメージングシステムや検出システムを用いて、形成中の胚盤胞を検査することができる。また、液滴の結合操作を用いることで、緩衝液、塩類、栄養分、タンパク質、細胞外マトリックスなどの材料の追加による前記胚盤胞の環境の制御が可能となる。胚盤胞の形成中に、レーザーマイクロダイセクションなどの技術を用いて前記胚盤胞から細胞の試料を取り出し、さらなる分析のためにそれらを回収することが望ましい場合が多い。いくつかの実施形態では、前記胚盤胞は液滴操作領域に搬送される。この操作領域は、柱（ピラー、ポスト）、エレクトロウェッティングプレート間の物理的な制限、または特許文献５に記載されているようなエレクトロウェッティングプレート間のギャップのくさび状の変化など、微小流体チップ上の物理的な特徴を含んでいてもよく、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。胚盤胞が操作領域に搬入されると、前記胚盤胞は実質的に不動の状態で保持される。その後前記胚盤胞の一部を除去するため、非特許文献３に記載されているようにレーザーマイクロダイセクションを行うことができる。一旦前記液滴の一部が切除されると、本明細書に記載の液滴分割操作を用いて、前記試料部分を前記胚盤胞から分離することができる。分割と再結合の操作を繰り返し、分割後の2つの液滴間での物質の分布を機械の目で検査することにより、前記胚盤胞と前記試料部分が正しく分離されたことを確認することができる。分離後、前記胚盤胞の前記試料部分は、ポリメラーゼ連鎖反応やDNA配列決定を含む遺伝子検査によるさらなる処理のために回収され得る。
前記微小流体チップ自体に関しては、様々な領域と、任意で一連の微小流体経路で連結される－例えば基板上または基板の壁の間に配置された1つ以上の微小流体チャネル、管、または経路によって結ばれる－光学検出系を備えていることが好ましい。一実施形態では、これらの経路は、現実または仮想のエレクトロウェッティング電極の位置を含み、この電極に沿って前記微小液滴は空気圧および／またはエレクトロウェッティング力によって駆動され得る。さらに、様々な領域および光学検出系は、より多くのそのような電極位置をさらに含んでもよい。別の実施形態では、これらの経路は面内狭窄部または面外狭窄部を含んでもよい。前記面内狭窄部または面外狭窄部は、前記担体相が前記面内狭窄部または面外狭窄部を妨げられずに流れることができるが、前記液滴は前記面内狭窄部または面外狭窄部を通過できないような寸法を有する
本チップの好ましい実施形態では、前記エレクトロウェッティング電極は、1つ以上のOEWOD構造によって前記微小流体経路および／または領域に仮想的に設置される。一実施形態では、これらのOEWOD構造は、
－ 第1基板、70～250nmの厚さを有する前記第１基板上の第1導体層、前記第１導体層上に形成された、300～1500nmの範囲の厚さを有する、400～1000nmの波長範囲の電磁放射線によって活性化される光活性層、及び前記光活性層上に形成された、30～160nmの厚さを有する第1誘電層を有する第1複合壁と、
－ 第2基板、前記第2基板上に形成された70～250nmの厚さを有する第2導体層と、任意で前記第2導体層上に形成された30～160nmの厚さの第2誘電層を有して、前記第1誘電層及び第2誘電層の露出した表面は、前記微小液滴を含むように適合された微小流体空間を画定するように少なくとも10m離れて配置されている、第2複合壁と、－ 前記第1導体層および前記第2導体層を接続する前記第1複合壁および前記第2複合壁に電圧を供給するA/C源と、
－ 前記光活性層に衝突して、前記第1誘電層の表面上の対応する仮想エレクトロウェッティング電極の位置を誘発するように適合された、前記光活性層のバンドギャップよりも高いエネルギーを有する少なくとも1つの電磁放射源と、
－ 前記光活性層への電磁放射の衝突点を操作して前記仮想エレクトロウェッティング電極位置の配置を変化させることにより、前記微小液滴が沿って移動し得る少なくとも1つの光学的に媒介されたエレクトロウェッティング経路を形成する手段と、を備える。
ある実施形態では、構造体の前記第1壁および第2壁は透明で、その間に前記微小流体空間が挟まれている。別の実施形態では、前記第1基板および前記第1導体層は透明であり、前記電磁放射源（例えば、複数のレーザービームまたはLEDダイオード）からの光が前記光活性層に入射することができる。別の実施形態では、前記第2基板、前記第2導体層、および前記第2誘電層が透明であるため、同様の目的を得ることができる。さらに別の実施形態では、これらの層のすべてが透明である。
好適には、前記第1基板および前記第2基板は、例えば、ガラス、金属、シリコン、またはエンジニアリングプラスチックなどの機械的強度を有する材料で作られる。ある実施形態では、前記第1基板および前記第2基板はある程度の柔軟性を有していてもよい。さらに別の実施形態では、前記第1基板および前記第2基板は、100～1000mの範囲の厚さを有する。
前記第1導体層および前記第2導体層は、前記第1基板および前記第2基板の一方の表面に配置され、典型的には、70～250nm、好ましくは70～150nmの範囲の厚さを有する。これらの層の少なくとも1つは、インジウムスズ酸化物（ITO）などの透明導電材料、銀などの導電性金属の非常に薄いフィルム、またはPEDOTなどの導電性ポリマーで作られている。これらの層は、連続したシートとして形成されていても、ワイヤーのような一連の個別構造として形成されていてもよい。また、前記導電体層をメッシュ状にして、メッシュの隙間から電磁波を照射することもできる。
前記光活性層は、電磁波による刺激に反応して局所的に電荷を発生させることができる半導体材料で構成されているのが好ましい。例えば、300～1500nmの厚さを持つアンドープの水素化アモルファスシリコン層が挙げられる。ある実施形態では、前記光活性層は、可視光を用いて活性化される。
前記第1壁の場合での前記光活性層、及び、任意で前記第2壁の場合での導電層は、典型的には30～160nmの厚さの範囲の誘電層で被覆されている。この層の誘電特性は、好ましくは、107V／m超の高い誘電強度および3超の誘電率を含み、好ましくは、絶縁破壊を回避することと一致する可能な限り薄い。一実施形態では、前記誘電層は、アルミナ、シリカ、ハフニア、または薄い非導電性ポリマーフィルムから選択される。
構造体の別の実施形態では、少なくとも前記第1誘電層、または前記第2誘電層、好ましくは両方が、様々な仮想エレクトロウェッティング電極の位置で所望の微小液滴／担体液／表面の接触角を確立するのを支援し、さらに前記微小液滴の内容物が前記表面に付着し、前記チップ内を移動する際に減少するのを防ぐために、防汚層でコーティングされる。前記第2壁が第2誘電層を含まない場合、第2防汚層は第2導体層上に直接塗布されてもよい。最適な性能を得るためには、前記防汚層は、250℃で空気-液体-表面の3点界面として測定したときに70～1100°の範囲にあるべき微小液滴／担体液／表面の接触角を確立するのを支援しなければならない。一実施形態では、これらの層（複数可）は150nm未満の厚さを有し、場合によっては単分子層を形成する。別の実施形態では、これらの層は、トリクロロ（1H，1H，2H，2H-パーフルオロオクチル）シランなどのフルオロカーボン-シランの多層を有する。好ましくは、最適な性能を確保するために、いずれかまたは両方の防汚層が疎水性である。特定の実施形態では、層間に化学的に適合した界面を形成するために、前記防汚層と前記誘電層との間にシリカの間質層が介在しており、そのような層の厚さは通常10nm未満である。
前記第1誘電層および前記第2誘電層、つまり前記第1壁および前記第2壁は、少なくとも10mの幅を持つ微小流体空間を画定し、その中に前記微小液滴が収容される。好ましくは、この空間の幅は10～180mである。好ましくは、前記微小液滴が収容される前、前記微小液滴は、前記微小液滴空間の幅よりも10％以上、好ましくは20％以上大きい固有の直径を有している。これにより、前記チップ内に入った前記微小液滴は圧縮され、エレクトロウェッティング性能が向上している。
ある実施形態では、前記第1誘電層および前記第2誘電層は、フルオロシランのような防汚コーティングでコーティングされている。別の実施形態では、前記第1誘電層および前記第2誘電層は、（3-アミノプロピル）トリメトキシシラン、堆積タンパク質、コラーゲン、ラミニンまたはフィブロネクチンの層などの生体適合性コーティングでコーティングされている。
別の実施形態では、前記微小流体空間は、前記第1壁および第2壁を所定の量だけ離すための1つ以上のスペーサーを含む。前記スペーサーには、フォトパターニングによって生成された中間レジスト層から作られたビーズや柱、尾根などがあり得る。様々な形状のスペーサーを使用して、細いチャネル、テーパーのついたチャネル、またはピラーのラインで画定される部分的に囲まれたチャネルを形成することができる。慎重に設計することで、これらのスペーサーを使用して、前記微小液滴の変形を助け、その後、前記微小液滴の分割を行い、変形した前記微小液滴に対して操作を行うことができる。また、装置の充填、プライミング、空にする際に、同じスペーサーを使用して前記微小流体空間内の流体の流れを誘導することができる。
前記第1壁と前記第2壁は、前記導体層に取り付けられたA/C電源を使用してバイアスをかけ、その間に10～150ボルトの範囲の電圧電位差を与える。
これらの好ましいOEWOD構造は、400～1000nmの範囲の波長と光励起層のバンドギャップよりも高いエネルギーを有する電磁放射線源を用いて活性化される。好適には、前記光活性層は、使用される放射線の入射強度が0.01～0.2Wcm-2の範囲にあるときに、前記仮想エレクトロウェッティング電極の位置で活性化される。前記電磁波源は、ある実施形態では高度に減衰され、別の実施形態では画素化されて、前記光活性層上に対応する光励起領域が生成される。これにより、画素化された前記仮想エレクトロウェッティング電極の位置が前記第1誘電層上に誘導される。
電磁波の発生源が画素化される場合、LEDなどのランプの光で照らされたデジタル・微小ミラー・デバイス（DMD）などの反射スクリーンを用いて、直接または間接的に供給されるのが好ましい。これにより、前記第1誘電層上に仮想エレクトロウェッティング電極の位置の複雑なパターンを迅速に生成・破壊することが可能となり、エレクトロウェッティング力を厳密に制御することで、前記微小液滴を本質的に任意の仮想経路に沿って正確に誘導することができる。これは、前記チップが複数の経路に沿って何千もの微小液滴を同時に操作する必要がある場合に、特に有利な方法である。このようなエレクトロウェッティングの経路は、前記第1誘電層上の仮想的なエレクトロウェッティング電極の位置の連続体から構成されていると考えることができる。ビデオ微小スコープからの画像出力を用いて、微小装置上にパターン化された物理的な微小流体チャネルと、同じデバイス上に投影された仮想エレクトロウェッティング電極位置のパターンの両方を同時に検査することで、この検査の後に、前記仮想エレクトロウェッティングパターンの位置を流体チャネルの位置に正しく合わせることができ、微小流体と光学プロジェクタアセンブリとの間の機械的な調整に頼ることなく、様々な流体チャネルとフロー領域を介して液滴を正確に輸送することができる。
前記光活性層上での電磁放射源の衝突点は、従来の円形および環状を含む任意の便利な形状とすることができる。一実施形態では、これらの点の形態は、対応する画素化の形態によって決定され、別の実施形態では、前記微小流体の空間に入った後の前記微小液滴の形態に全体的または部分的に対応する。好ましい実施形態の1つでは、衝突点、つまり前記エレクトロウェッティング電極の位置は、三日月形であり、前記微小液滴の意図された進行方向を向いてよい。好適には、前記エレクトロウェッティング電極の位置自体が、前記第1の壁に付着した前記微小液滴の表面よりも小さく、前記液滴と前記表面の誘電体との間に形成される接触線にわたって最大の電界強度勾配を与える。前記OEWOD構造の1つの実施形態では、前記第2の壁もまた光活性層も含み、同一または異なる電磁放射源によって前記第2の誘電層上に仮想エレクトロウェッティング電極の位置を誘起することができる。前記第2の誘電層を追加することで、必要に応じて、所与の微小液滴の濡れた端部を構造の上面から下面に移行させることができ、各微小液滴に大きなエレクトロウェッティング力を加えることができる。
上述したように、本装置は、前記チップ内部またはその下流での光学現象を調査するように配置された光学検出系をさらに含んでもよい。一実施形態では、前記光学検出系は前記チップと一体化しており、微小液滴の流れがゼロの領域内に配置されている。前記光学検出系は、一実施形態では、明視野顕微鏡、暗視野顕微鏡、化学発光検出手段、Forster共鳴エネルギー移動検出手段、および蛍光検出手段から選択される。好ましい一実施形態では、前記光学検出系は、微小液滴の蛍光を刺激して検出する手段であり、さらに、任意の関連する放射線透過性検出窓を有する検出領域と、前記微小液滴を照射する電磁放射線（例えば、可視光、赤外光またはUV光）源と、1つ以上の光検出器と、任意で、前記光検出器（複数可）からの信号を受信してアッセイ結果またはヌクレオチド配列情報を、例えば、視覚的な表示またはカウントの形でユーザに提供するマイクロプロセッサとを備える。一実施形態では、前記光学検出系は、前記微小液滴に関連する特徴的な検出特性－好ましくは、内部に含まれて探索中の分析物との相互作用若しくは反応によって直接的又は間接的に活性化されるレポーター分子（バイオマーカーまたは分子ビーコンなど）からの蛍光信号を検出するように設計されている。
本発明の装置は、（1）フルオロカーボンやシリコーンオイルなどの非混和性の担体流体中の水性微小液滴の乳剤を含む媒体を生成する手段、（2）この媒体を、例えば空気圧ポンプ又は機械式インジェクターなどを用いて入口から前記チップ内で貫流させる手段、(3)上述の型の分析物や別の生体分子が例えば患者の試料や細胞培養インキュベーターなどから前記入口の上流で生成される試料調製領域、のうち1つ以上をさらに含んでよい。
上述したように、場合によっては、二酸化炭素や酸素などの溶質に対する飽和容量が非常に大きく、水性物質に対する飽和容量が比較的小さい担体相を流すことによって、微小液滴に含まれる細胞を再供給することが有利である。
したがって、前記媒体を生成する手段（1）は、例えば、制御された雰囲気の容器内で前記担体相のバイアルを培養し、それを撹拌して前記液相と前記気相の接触を確保することにより、前記担体相を処理するための媒体調製成分を含んでいてもよい。この担体相を気体不透過性の密閉容器（ガラスシリンジなど）に移し、上述のように前記微小流体のネットワークを介して送液することで、前記微小液滴内の前記細胞の呼吸によって溶存気体が減少した担体相を補充することができる。
別の例では、前記担体相の流れを気体透過性の管または膜に通し、それを平衡容器内の所望の気体濃度を持つ制御された雰囲気にさらすことで、再供給は実現される。制御された雰囲気から前記膜を介して前記担体相に気体が拡散することで、前記担体相の気体濃度が要求された値になる。前記平衡容器から先の流路では、透過性の管が、ガラス、溶融シリカ、ポリエーテルエーテルケトン、または複合構造の管など、気体不透過性の管に置き換えられている。このようなネットワークにより、別々の容器で担体相をバッチ式に調製する必要なく処理済み担体相を継続的に供給することができる。前記平衡容器内の気体濃度は、前記平衡容器内に配置された気体ブリードインバルブと気体センサーとの間に設けられた閉ループフィードバックシステムによって制御され得る。前記気体ブリードバルブは、前記センサーによって測定された濃度が臨界値を下回るときに気体を前記容器へ入れる。あるいはそのかわりに連続的な気体の流れは、流量調整コントローラを介して平衡容器を貫流してよく、流量は気体の減少速度を上回るように選択される。次に、本発明を以下のように説明する。
本発明による装置を示している。
本発明による装置は、図1に示すように、まず、フルオロカーボンオイルを炭酸気体飽和容器2に導入する微小流体管1を備える。容器2は、気体の内容物が5％の二酸化炭素に維持されるように、気体の入口および出口4に接続された空隙3を備える。気体の組成は、任意で二酸化炭素プローブ5によって監視される。次に、フルオロカーボンオイルは、気体透過性管6を介して空洞内に貫流される。それによりオイルは炭酸化させる。炭酸化したオイルは、微小流体管7を経由してセレクタバルブ8に送られる。8には、水性微小液滴の乳剤9が供給され、そのうちの少なくとも一部は、本装置のユーザーが操作や検出しようとしている細胞が含まれている。8には、さらに微小流体管10が接続されており、8の設定に応じて、乳剤、フルオロカーボンオイル、またはそれらの混合物を含むことができる。
10は、OEWOD仮想電極（図示せず）の経路が設けられた流路12と、保持領域13を含む微小液滴操作部11に接続されている。使用時には、流路12を通って出力13に流れる微小液滴は、入口14で指向性のあるエレクトロウェッティング力を加えることにより、流路12から13に選択的に変位され得る。13の中で、微小液滴は、フルオロカーボンオイルが微小液滴を横切る間、エレクトロウェッティングを受ける場所（図示せず）に保持され得る。この状態で、微小液滴内の細胞は保持点で効率的に培養され得る。プロセスの最後に、微小液滴は13から12に戻され、15に流れて、さらなる処理や分析のために回収される。

Claims (15)

  1. 微小液滴を操作する装置であって、
    経路に沿って流れる担体流体中に分散された微小液滴を受け取り、操作するように適合された微小流体チップを含み、
    前記チップは担体流体の流量が異なるまたはゼロの領域を含む、
    ことを特徴とする装置。
  2. 請求項１に記載の装置であって、少なくとも１つの領域は、前記微小液滴が前記担体流体の流れの中で静止位置に保持される保持領域である、装置。
  3. 請求項２に記載の装置であって、前記保持位置は、光学的に媒介された保持力が加えられ得るバリア、井戸、又は位置を含むことを特徴とする、装置。
  4. 請求項２又は３に記載の装置であって、微小液滴を前記保持領域へ移送及び前記保持領域から移送する手段をさらに備えることを特徴とする、装置。
  5. 請求項２～４のいずれかに記載の装置であって、前記担体流体の流れが内部で溶解した気体、栄養分、生体分子、又は他の化学試薬を含むことを特徴とする、装置。
  6. 請求項５に記載の装置であって、前記担体流体の流れの中で溶解する材料は、前記微小液滴内部で封入される生体細胞に細胞の拡散を促進する局所的環境を与える、装置。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載の装置であって、前記チップは、
    － 第1基板、70～250nmの厚さを有する前記第１基板上の第1導体層、前記第１導体層上に形成された、300～1500nmの範囲の厚さを有する、400～1000nmの波長範囲の電磁放射線によって活性化される光活性層、及び前記光活性層上に形成された、30～160nmの厚さを有する第1誘電層を有する第1複合壁と、
    － 第2基板、前記第2基板上に形成された70～250nmの厚さを有する第2導体層と、任意で前記第2導体層上に形成された30～160nmの厚さの第2誘電層を有して、前記第1誘電層及び第2誘電層の露出した表面は、前記微小液滴を含むように適合された微小流体空間を画定するように少なくとも10m離れて配置されている、第2複合壁と、
    － 前記第1導体層および前記第2導体層を接続する前記第1複合壁および前記第2複合壁に電圧を供給するA/C源と、
    － 前記光活性層に衝突して、前記第1誘電層の表面上の対応する仮想エレクトロウェッティング電極の位置を誘発するように適合された、前記光活性層のバンドギャップよりも高いエネルギーを有する少なくとも1つの電磁放射源と、
    － 前記光活性層への電磁放射の衝突点を操作して前記仮想エレクトロウェッティング電極位置の配置を変化させることにより、前記微小液滴が沿って移動し得る少なくとも1つの光学的に媒介されたエレクトロウェッティング経路を形成する手段と、を備える少なくとも１つのOEWOD構造で本質的に構成される、
    ことを特徴とする装置。
  8. 請求項７に記載の装置であって、前記第1複合壁と前記第２複合壁はそれぞれ、前記第1誘電層と前記第２誘電層上に第１防汚層と第２防汚層をさらに含むことを特徴とする、装置。
  9. 請求項７に記載の装置であって、前記第１誘電層上の第１防汚層及び／又は前記第２誘電層上の第２防汚層は疎水性である、装置。
  10. 請求項７～９のいずれかに記載の装置であって、前記微小流体空間は、前記第１誘電層と前記第２誘電層に付着するスペーサによってさらに確定される、装置。
  11. 請求項７～１０のいずれかに記載の装置であって、前記エレクトロウェッティング経路は、各々が使用中にいくつかの地点でＯＥＷＯＤに曝され得る仮想エレクトロウエッティング位置の連続体を含む、
  12. 請求項７～１１のいずれかに記載の装置であって、前記微小流体空間は、少なくとも１つの次元において１０～８０μｍである、装置。
  13. 請求項７～１２のいずれかに記載の装置であって、
    前記電磁放射線源は画素化された光のアレイを含み、
    前記光は、前記アレイから反射され、又は、前記アレイを透過する、
    装置、
  14. 前記チップ内部又はその下流に位置する前記微小液滴からの信号を検出する光学検出系をさらに備えることを特徴とする、請求項７～１３のいずれかに記載の装置であって、
  15. 請求項７～１４のいずれかに記載の装置であって、前記微小流体チップの入り口から前記微小流体チップを流れる水性微小液滴の乳剤を含む媒体又は非混和担体流の流れを有機する手段をさらに備えることを特徴とする、装置。
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