JP2022520206A - 微小血管狭心症 - Google Patents

Abstract

本発明は、微小血管狭心症（ＭＶＡ）を診断および治療する手段を提供する。冠動脈内ガイドワイヤの診断的用途が提供される。ジボテンタンによるＭＶＡ患者の治療が開示される。提供される診断的用途によってＭＶＡ患者を特定し、治療のために選択することができる。

Description

本発明は、非閉塞性冠動脈疾患を伴う狭心症の診断および治療、特に微小血管狭心症（ＭＶＡ）の診断および治療に有用な方法および組成物に関する。

心血管疾患（ＣＶＤ）は、世界中の死亡率の主要な原因である^１。狭心症は、多くの場合心臓の筋肉への不十分な血液供給（虚血）によって生じる胸部不快感／胸痛と説明されるＣＶＤの一般的な症状である。英国では、年間２０，０００件を超える実質的な関連する病的状態および医療資源利用を伴う狭心症の新規症例が発生している^２。病歴のみから診断を行うこともできるが、一部の医療専門家は、太い視認可能な冠動脈における閉塞性病変（閉塞）の検出が必須と考えている。しかし、これは一般的な誤解である。狭心症は、閉塞性冠動脈疾患（ＣＡＤ）と同義ではない。

虚血は、閉塞性冠動脈疾患を有さない患者で一般的である（ＩＮＯＣＡ、「非有意狭窄冠動脈由来の虚血性心疾患（ｉｓｃｈａｅｍｉａ ａｎｄ ｎｏ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ＣＡＤ）」を表す）^３。ＩＮＯＣＡ対象における微小血管狭心症の確定的診断の基準は、冠微小血管機能障害のエビデンスだけでなく、虚血のエビデンスも含むように改訂されている^４。ＩＮＯＣＡは、より太い冠動脈および／または微小血管を含むそれらの分枝の血管攣縮（ｖａｓｏｓｐａｓｍ）に起因する場合がある。ＩＮＯＣＡはまた、冠循環（大および／または小血管）の血管拡張能が需要を満たすのに不十分である、需要供給の不一致に起因する場合がある。最後にＩＮＯＣＡは、例えば小血管の粗鬆化および／または血管リモデリングに続発する血流への血管抵抗の増加に起因する場合がある。

冠微小血管機能障害は、閉塞性冠動脈病変の存在とは無関係に予後不良の前兆となる（図１）^５，６。これは、アテローム性動脈硬化、血管リモデリングおよび粗鬆化を含む、微小循環での血管疾患プロセスから生じる場合がある。体系的に研究を行ったところ、ＣＭＤは、血管造影が陰性である狭心症患者のおよそ４分の３に影響を及ぼす^７。重要なことに、これらの対象は多くの場合、死および心血管イベントのリスクが高いにもかかわらず見落とされる、または確診されないままである^８～１０。

本発明者らは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）の診断に対する「狭窄中心」のアプローチは、狭心症および冠動脈機能の障害のより広範な病態生理を見過ごしていると説明した（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ， ＥＨＪ， ２０１７）。この論文は、「冠疾患エンドタイプ」と称することができる４つの顕著に異なる疾患状態：（１）ＦＦＲ（血流予備量比）とＣＦＲ（冠血流予備能）の両方が低下し、ＩＭＲ（微小血管抵抗指数）が増加する、限局性心外膜狭窄を含むびまん性心外膜および微小血管疾患；（２）ＦＦＲ（血流予備量比）とＩＭＲ（微小血管抵抗指数）の両方が低下し、ＣＦＲ（冠血流予備能）が増加する限局性心外膜狭窄（ｆｏｃａｌ ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ ｓｔｅｎｏｓｉｓ）（微小血管機能の保持を伴う）；（３）ＦＦＲ（血流予備量比）が正常であり（ＦＦＲ＞０．８０）、ＣＦＲ（冠血流予備能）が低下し、ＩＭＲ（微小血管抵抗指数）が大幅に増加する、微小血管狭心症の原因である孤立性微小血管疾患；および（４）ＦＦＲ（血流予備量比）が低下し（ＦＦＲ≦０．８０）、ＩＭＲ（微小血管抵抗指数）が増加し、ＣＦＲ（冠血流予備能）が低下するびまん性心外膜および微小血管疾患、について記載している。

胸部不快感／胸痛および冠動脈疾患を全般的に評価するための、灌流ＭＲＩおよび心臓磁気共鳴（ＣＭＲ）などの特定の非侵襲的方法が公知である。第１選択の非侵襲的方法は、「最近発症した胸痛」の評価および診断に関する英国国立医療技術評価機構（ＮＩＣＥ）臨床指針通知（２０１０年３月２４日初版発行）に提示されており、これは不安定狭心症、ＳＴ部分上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）および非ＳＴ部分上昇型心筋梗塞（ＮＳＴＥＭＩ）を含む広範な状態を包含する「急性冠症候群」であることが疑われる、または確認された患者における１２誘導心電図（ＥＣＧ）を推薦している。臨床評価またはＥＣＧによって安定狭心症が示された患者では、ＮＩＣＥ指針通知はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）冠動脈血管造影を推薦している。２０１８年５月、Ｈｓｕらは、心筋血流（ＭＢＦ）を造影ＣＭＲ灌流画像法および定量的冠動脈血管造影法（ＱＣＡ）から定量する方法を公開した^１１。しかしＨｓｕらは、これらの方法が患者における微小血管疾患を反映しない可能性があることを認めている。

動脈造影法（血管造影）によって閉塞性ＣＡＤを特定することができ、閉塞性ＣＡＤ患者を治療するためにステントおよびバイパス手術などの治療が利用可能であるが、微小血管狭心症の診断に特異的な広範に利用可能な確定的試験は存在しない。胸痛を患う患者が冠動脈血管造影法による試験で陰性である場合、医師は疼痛が非心臓性の原因に起因するか、または患者が微小血管狭心症などのＩＮＯＣＡ型を有するかを容易に決定することができない。したがって、診断は最適未満であり、治療される患者の５０％は治療後に再来院し、かつ心血管関連死および／または心筋梗塞のリスクが２倍増加する。ほとんどの微小血管狭心症の治療は、疼痛を緩和するまたは急性症状を改善させるが、基礎疾患に長期的に対処しない。

ＥＴＲアンタゴニストおよび血管機能
エンドセリン（ＥＴ－１）は、内皮細胞によって放出されるペプチドホルモンであり、強力な血管収縮因子であり、エンドセリンＡ受容体（ＥＴ_ＡＲ）およびエンドセリンＢ受容体（ＥＴ_ＢＲ）に結合する。複数のエンドセリン受容体アンタゴニストが、血管機能に対するそれらの効果について研究されている。Ｐａｐａｄｏｇｅｏｒｇｏｓ ｅｔ ａｌ（２００９年）は、選択的ＥＴ_ＡＲアンタゴニストであるＢＱ１２３およびＥＴ_ＡＲ／ＥＴ_ＢＲ二重アンタゴニストであるボセンタンの、２型糖尿病患者の冠微小血管機能に対する効果について研究している。ＢＱ１２３は選択的ＥＴ_ＡＲアンタゴニストである一方、ボセンタンはＥＴ_ＡＲとＥＴ_ＢＲの両方を遮断する。Ｔｓｃｈｕｄｉ ｅｔ ａｌ（１９９４年）は、バイパス手術を受けるヒト患者から摘出されたヒトの乳房抵抗動脈（ｍａｍｍａｒｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｒｔｅｒｉｅｓ）のＥＴ－１誘導性収縮の遮断において、選択的ＥＴ_ＡＲアンタゴニストであるＦＲ１３９３１７が、ＥＴ_ＡＲ／ＥＴ_ＢＲ二重アンタゴニストであるボセンタンより有効性が低かったことを示している。Ｎｅｗｂｙら（１９９８年）は、ＢＱ１２３が「シンドロームＸ」患者および対照対象において同程度の血管拡張を引き起こすことを示している。Ｊｏｈｎｓｏｎら（２０１３年）は、ＥＴ_ＡＲアンタゴニストであるダルセンタンが、心筋灌流の均一性が低い対象において血流の均一性を増加させることを示している。Ｒｅｒｉａｎｉら（２０１０年）は、ＥＴ_ＡＲアンタゴニストであるアトラセンタンによる６ヶ月間の処置が、冠微小血管内皮機能障害を有する患者において冠微小血管内皮機能を向上させることを示している。

ジボテンタンは、高度に特異的なＥＴ_ＡＲアンタゴニストである（Ｍａｇｕｉｒｅ ＆ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ， ２０１４）。Ｂｅｌｔｒａｍｅ ｅｔ ａｌは、冠動脈スローフロー現象（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｌｏｗ ｆｌｏｗ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）（ＣＳＦＰ）を有する対象におけるジボテンタンの抗狭心症効果を調査している（ＡＮＺＣＴＲ ２０１８）。欧州心臓病学会（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）によると、ＣＳＦＰは、閉塞性冠動脈疾患の非存在下での造影剤の緩徐な通過（ＴＩＭＩフレーム数＞２５）を特徴とする血管造影現象として定義される。したがってＣＳＦＰは、侵襲的に検証されていないが冠微小血管機能障害の１種のサブタイプとみなされる、血管造影に由来する代用物である。急性冠症候群（心筋梗塞）は、微小血管狭心症を有さない患者で認められることが多いＣＳＦＰの一般的な症状である（例えば、冠動脈拡張症、心臓弁膜症または心不全）^１２。全体的に、ほとんどの微小血管狭心症患者はＣＳＦＰを有さず^１２、ＣＳＦＰを有する多くの患者は微小血管狭心症を有さない。ＣＳＦＰ患者に対するジボテンタンの有効性は未だ知られていない。

ＩＮＯＣＡを有する患者におけるエンドセリン調節不全
ＥＴ－１は、微小血管狭心症の病態生理に関与する。Ｋａｓｋｉらは、この群の患者が、冠血管抵抗の増加を伴い、結果として冠血流と逆の関係にある血漿ＥＴ－１の増加を有したことを観察している^１３。他の研究者により、この群におけるＥＴ－１の循環の増加が記述されている^１４。ＥＴ－１は、エンドセリン－Ａ受容体（ＥＴ_ＡＲ）およびエンドセリン－Ｂ受容体（ＥＴ_ＢＲ）を介して血管緊張へのその効果を媒介する^１５。ＥＴ_ＡＲの活性化は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）への直接作用を介して血管収縮を媒介する。ＥＴ_ＢＲの効果はより多様であるが、健常な内皮では、ＥＴ_ＢＲの活性化はＥＴ_ＡＲ媒介性血管収縮を妨げる。内皮機能不全を伴う疾患状態（微小血管狭心症）では、ＥＴ_ＢＲのモジュレーションの臨床効果は明確でない。

ＩＮＯＣＡを有する患者における選択的ＥＴ_ＡＲアンタゴニストの使用を支持するエビデンス
４７名の患者における経口ＥＴ_ＡＲアンタゴニスト（ＥＴ_Ａ－ＲＡ）のアトラセンタン（１日１０ｍｇＰＯ）の６ヶ月間投与の無作為化プラセボ対照試験において、Ｒｅｒｉａｎｉらは、長期的なＥＴ_Ａ－ＲＡ治療により、ＩＣ－ＡＣｈによって明らかにされるように冠微小血管内皮機能が向上したことを観察した^１６。エビデンスは、シタキセンタン（高度に選択的なＥＴ_ＡＲアンタゴニスト）の無作為化二重盲検試験からも導かれている^１７。シタキセンタンで処置された、駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）を有する患者は、選択性が低いエンドセリン受容体アンタゴニスト（ＥＲＡ）で見られる有害な心血管イベント（例えば体液貯留）を伴うことなく、プラセボと比較して運動時間の増加を示した。シタキセンタンは肝毒性のために開発が中止されたが、この試験によってＣＭＤを有する患者に対する選択的ＥＴ_ＡＲアンタゴニストの戦略が支持される。

ジボテンタン（Ｎ－（３－メトキシ－５－メチルピラジン－２－イル）－２－［４－（１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）フェニル］ピリジン－３－スルホンアミド）は、転移性前立腺がんの治療のためにＡｓｔｒａ－Ｚｅｎｅｃａによって開発された化合物であるが、第ＩＩＩ相試験での無益性のために中止された。ジボテンタンは、ＥＴ_ＢＲよりＥＴ_ＡＲに高度に選択的な（およそ１０^７倍）エンドセリン受容体アンタゴニストである^１８。

本発明者らは、デュアルセンサー診断用ガイドワイヤおよびアセチルコリンの冠動脈内注入を使用する介入的診断手順（ＩＤＰ）を使用する、微小血管狭心症を検出する侵襲的方法を開発した。この方法は、以前に微小血管狭心症の信頼性のある徴候をもたらすことができなかった非侵襲的方法を改良し、検証するためにも使用される。本発明者らは、心臓の小血管疾患が全身性の問題の一部となると考え、微小血管狭心症を有すると確認された患者の小血管において、微小血管狭心症疾患状態のＩＮＯＣＡの状況でのジボテンタンの有効性を初めて実証した。

したがって第１の態様では、本発明は、ＩＮＯＣＡを有する患者において狭心症を治療する方法であって、患者にジボテンタンを投与することを含む方法における使用のためのジボテンタンを提供する。関連する態様では、本発明は、ＩＮＯＣＡを有する患者における狭心症を治療する方法であって、患者にジボテンタンを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＩＮＯＣＡは微小血管狭心症である。

一部の実施形態では、患者は、本明細書に記載される診断用ガイドワイヤを使用して患者の心臓の微小血管抵抗指数（ＩＭＲ）、冠血流予備能（ＣＦＲ）、抵抗予備能比（ＲＲＲ）および／またはアセチルコリン（ＡＣｈ）血管反応性を測定することにより治療のために選択されている。これらの測定は、薬理学的プローブの使用と組み合わせて行われてもよい。薬理学的プローブは、太い末梢静脈を介した静脈内注入によって投与され得るアデノシンであってもよい。診断用ガイドワイヤは、好ましくは圧力温度感知ガイドワイヤである。ガイドワイヤは、主要心外膜冠動脈の遠位３分の１、例えば左前下降枝（ＬＡＤ）に配置されてもよい。他の場合では、左回旋枝または右冠動脈（ＲＣＡ）が使用されてもよい。ＣＦＲ測定は、最大充血時の平均遠位冠動脈圧の平均大動脈圧に対する比によって計算できる心筋血流予備量比（ＦＦＲ）の計算を含んでもよい。患者は、ＩＭＲが２５より高いと測定された場合および／またはＣＦＲが２．０未満と測定された場合に治療のために選択され得る。一部の実施形態では、患者は、２．５を超える充血微小血管抵抗（ｈｙｐｅｒａｅｍｉｃ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（ＨＭＲ）の測定後に治療のために選択され得る。ＨＭＲは、Ｄｏｐｐｌｅｒワイヤを使用して測定されてもよい。これらの方法を使用して、患者の心臓における冠微小血管機能障害の存在を定量および／または診断することができ、例えばＩＮＯＣＡおよび／またはＭＶＡを特定することができる。

一部の実施形態では、患者は陽電子放出断層撮影（ＰＥＴスキャン）および／または負荷灌流ＭＲＩを使用した２．０未満のＣＦＲ測定後に治療のために選択され得る。これは、心筋灌流予備能比の評価または心筋血流の絶対的な画素単位の評価を伴ってもよい。これらの方法を使用して、患者の心臓における冠微小血管機能障害の存在を定量および／または診断する、例えばＩＮＯＣＡおよび／またはＭＶＡを特定することができる。

一部の実施形態では、患者は、患者のゲノムの遺伝子座ｒｓ９３４９３７９の一塩基多型の有無の検出後に治療のために選択され得る。患者は、ｒｓ９３４９３７９遺伝子座がＧ対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である場合に治療のために選択され得る。

一部の実施形態では、患者は、診断用ガイドワイヤ、Ｄｏｐｐｌｅｒワイヤ、ＰＥＴスキャン、灌流ＭＲＩおよびまたは本明細書に記載されるＳＮＰに関連する方法の２つ以上の組合せ後に治療のために選択され得る。

治療の有効性は検査によって確認することができる。一部の実施形態では、標準化されたトレッドミル試験において測定される患者の平均運動継続時間は治療後に増加する。一部の実施形態では、狭心症の重症度は、狭心症が、ＣＣＳ狭心症分類スケールの、より下位のクラスに入るとみなされるように低減する。

典型的に、本明細書に開示される薬物療法（ｍｅｄｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）およびジボテンタンの医療使用は、１回投与より多いジボテンタンの投与を含み、ジボテンタンは異なる時点で投与される。好ましい実施形態では、方法は、ジボテンタンを患者に毎日１０ｍｇ（１日１０ｍｇ）の投薬量で投与することを含む。他の実施形態では、投薬量は倍増されてもよく（１日２０ｍｇ）、半減されてもよい（１日５ｍｇ）。さらなる実施形態では、さらに低い投薬量が使用されてもよい（１日５ｍｇ未満、例えば１日２ｍｇまたは１日１ｍｇ）。さらなる実施形態では、さらに高い投薬量が使用されてもよい（１日２０ｍｇより多い、例えば１日２５ｍｇまたは１日５０ｍｇ）。一部の実施形態では、ジボテンタンは、本明細書に開示される単回用量値のいずれかによりそのエンドポイントで規定される用量の範囲から選択される用量で投与することができる。一部の実施形態では、ジボテンタンは、本明細書に開示される用量値から選択される用量で１日おきに投与することができる。他の実施形態では、ジボテンタンは、本明細書に開示される用量値から選択される用量で毎週投与することができる。

他の態様では、本発明は、対象の冠動脈に近位圧力センサーおよび遠位圧力センサーを有するガイドワイヤを挿入すること、近位圧力センサーが冠動脈内に位置し、遠位圧力センサーが冠微小血管内に位置するようにガイドワイヤを位置決定することによって、対象の微小血管狭心症を診断する方法であって、前記方法は、血流予備量比（ＦＦＲ）および冠血流予備能（ＣＦＲ）を測定すること、ならびに微小血管抵抗指数（ＩＭＲ）を計算することを含み、対象がＩＭＲ＞２５である場合に微小血管狭心症と診断される方法を提供する。関連する態様では、本発明は、対象において微小血管狭心症を診断する方法における使用のためのガイドワイヤであって、前記方法は、対象の冠動脈に２つの圧力センサーを有するガイドワイヤを挿入すること、近位圧力センサーが冠動脈内に位置し、遠位圧力センサーが冠微小血管内に位置するようにガイドワイヤを位置決定することを含み、前記方法は、血流予備量比（ＦＦＲ）および冠血流予備能（ＣＦＲ）を測定すること、ならびに微小血管抵抗指数（ＩＭＲ）を計算することを含み、対象がＩＭＲ＞２５である場合に微小血管狭心症と診断されるガイドワイヤを提供する。ガイドワイヤはディスポーザブルである、すなわち「使い捨て（ｓｉｎｇｌｅ－ｕｓｅ）」である。

診断用ガイドワイヤは、好ましくは圧力温度感知ガイドワイヤである。ガイドワイヤは、主要心外膜冠動脈の遠位３分の１、例えば左前下降枝（ＬＡＤ）に配置されてもよい。他の場合では、左回旋枝または右冠動脈（ＲＣＡ）が使用されてもよい。ＣＦＲ測定は、最大充血時の平均遠位冠動脈圧の平均大動脈圧に対する比によって計算できる心筋血流予備量比（ＦＦＲ）の計算を含んでもよい。

一部の実施形態では、ガイドワイヤに付随するマイクロカテーテルまたはガイドカテーテルのいずれかによってアセチルコリン（ＡＣｈ）を冠動脈内腔に注入し、冠微小血管における攣縮（ｓｐａｓｍ）を誘発する。この微小血管攣縮（冠微小血管機能障害のサブタイプ）の診断は、虚血性胸部症状の再現、ＥＣＧでのＳＴ部分偏位が存在するが、心外膜冠動脈の内腔収縮が＜９０％である（ＣＯＶＡＤＩＳ研究グループの定義に従って）場合になされてもよい。ＡＣｈは、約１０^－６Ｍの注入から１００ｍｃｇのＩＣボーラスまでの範囲にわたる漸増濃度で投与されてもよい。一部の実施形態では、ＡＣｈは約０．２μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、その後約２０μｇ／ｍＬの濃度で投与される。

一部の実施形態では、太い末梢静脈を介してアデノシンを静脈内注入で投与し、ガイドワイヤの挿入前に定常状態の最大充血を誘導する。一部の実施形態では、アデノシンは１００～２００μｇ・ｋｇ^－１・分^－１、例えば１４０μｇ・ｋｇ^－１・分^－１の速度で注入される。一部の実施形態では、診断方法は、三硝酸グリセリン（ＧＴＮ）を注入すること、その後冠動脈の内皮非依存性機能を測定することの工程をさらに含む。

一部の実施形態では、診断方法は、患者に陽電子放出断層撮影（ＰＥＴスキャン）および／または負荷灌流ＭＲＩを実施し、その後本明細書に記載されるようにＰＥＴおよび／またはＭＲＩデータから２．０未満のＣＦＲを測定することを含んでもよい。これは、心筋灌流予備能比の評価または心筋血流の絶対的な画素単位の評価を伴ってもよい。

一部の実施形態では、診断方法は、患者のゲノムの遺伝子座ｒｓ９３４９３７９の一塩基多型の有無の検出を含んでもよい。患者は、ｒｓ９３４９３７９遺伝子座がＧ対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である場合に（例えば、本明細書に記載される他の方法を使用して得られるデータなどの他の診断データに加えて）ＩＮＯＣＡと診断され得る。

心筋（左）の状況で示される冠動脈（右手側）の概略図である。 コンピュータ断層撮影冠動脈血管造影法（ＣＴＣＡ）スキャンに続く、胸痛を呈する患者の割合の結果を示す流れ図である。 冠動脈および微小血管内のｉｎ ｓｉｔｕでの本発明のデュアルセンサー診断用ガイドワイヤの概略図である（ＣＦＲ、冠血流予備能；ＦＦＲ、血流予備量比；ＩＭＲ、微小血管抵抗指数）。 ＭＶＡ患者および対照対象におけるアセチルコリン（ＡＣｈ；パネルＡ）およびニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ；パネルＢ）に応答した微小血管の拡張を示す。ＡＣｈおよびＳＮＰにより、ＭＶＡ患者と対照対象の両方からのトロンボキサンアゴニストであるＵ４６６１９で事前収縮された動脈で濃度依存的な弛緩が引き起こされた。ＭＶＡを有する対象では、対照に比べＡＣｈに対する弛緩の高度に顕著な低減が認められるが、ＳＮＰに対する弛緩の差は認められない。これらの所見により、ＭＶＡ対象には末梢内皮機能不全が存在することが示唆される。 ＭＶＡ患者および対照対象におけるＥＴ－１（パネルＡ）およびＵ４６６１９（パネルＢ）に応答した微小血管の収縮を示す。すべての動脈がＥＴ－１とＵ４６６１９の両方に濃度依存的に応答し、応答はカリウム誘導性応答（ＫＰＳＳ）のパーセンテージとして提示される。ＥＴ－１に対する最大収縮応答は、ＭＶＡ患者で対照対象より顕著に大きく、Ｕ４６６１９に対する最大収縮応答は、患者において対照対象に比べて顕著に大きい。増加は、統計的に高度に有意である（ｐ＜０．００１）。 微小血管狭心症および血管攣縮性狭心症における全身性微小血管機能障害であり、対照対象の微小血管と比較して、ＩＮＯＣＡ患者の微小血管のＥＴ－１媒介性血管収縮に対する感応性の増加が示される。 エンドセリン受容体（ＥＴ_ＡＲ＆ＥＴ_ＢＲ）をモジュレートするｅｘ ｖｉｖｏ薬理学的研究を使用したＥＴ－１応答の決定因子である。ｘ軸に示される濃度でＥＴ－１によって血管収縮を誘導した。微小血管は、示される種々のアンタゴニストで前処理された。Ａ－ジボテンタン（選択的ＥＴ_ＡＲアンタゴニスト）は、ＥＴ－１媒介性血管収縮を強力に阻害する（曲線は右にシフトする）。Ｂ－ペプチドＢＱ１２３もＥＴ－１応答を阻害するが、ＢＱ１２３はバイオアベイラブルな化合物ではなく、ジボテンタンと比較して選択性が低い。ＣはＥＴ_ＢＲ拮抗作用を示しており、高用量のＢＱ７８８はＥＴ－１応答において最小限のシフトしかもたらさない。合わせて、このデータはＥＴ_ＡＲがＭＶＡにおけるＥＴ－１媒介性血管応答の主要エフェクターであることを支持する。 Ａ－遺伝的に決定されたＥＴ－１遺伝子発現の増加（Ｇ対立遺伝子）を有する患者は、微小血管狭心症（ＣＭＤ）を有する可能性が２倍を超えて高い（オッズ比２．２、９５％ＣＩ １．１～４．６）。Ｂ－冠血流予備能（ＣＦＲ－ＩＮＯＣＡを有する患者における微小血管機能不全のマーカー）は、２つの高リスクＧ対立遺伝子（ｒｓ９３４９３７９）を有する対象でより低く、エンドセリン遺伝子発現の増加の冠微小循環に対する有害作用と一致する（一元配置ＡＮＯＶＡの線形傾向Ｐ＝０．０１２）。ＡＡ群対ＧＧ群の事前分析では、ＧＧ群でより低いＣＦＲが示され、より不良なＣＭＤと一致する（平均差０．７、９５％ＣＩ ０．２～１．３、Ｐ＝０．０１１）。 遺伝的に決定されたＥＴ－１遺伝子発現の増加（Ｇ対立遺伝子）を有する患者は、非侵襲的（マルチモダリティ評価）においてより不良な虚血を有する。Ａ－心臓負荷磁気共鳴画像法（Ｎ＝１０７）。ＣＭＲにおいてＧ対立遺伝子と誘導性灌流欠損の存在との間に線形関係が存在した（傾向のχ^２検定 Ｐ＝０．０４１）。Ｂ－運動トレッドミル検査（ｎ＝８４）。負荷検査において遺伝子型群とより不良な虚血との間に負の線形関係が存在した（デュークトレッドミルスコア ＡＮＯＶＡ Ｐ傾向＝０．０４５）。 ジボテンタンが、ＢＱ１２３のものと同等の７．５４のｐＫ_ＢでＥＴ－１に対する収縮応答に拮抗することを示す（Ｎ＝８）（パネルＡ）。パネルＢは、ジボテンタンがＥＴ－１に対する確立された収縮応答の濃度依存的阻害をもたらすことを示す（Ｐ＜０．００１）。 エンドセリンＡ受容体のモジュレーション（ＢＱ１２３によるＥＴ_ＡＲ）の存在下および非存在下でのｅｘ ｖｉｖｏ薬理学的研究である。遺伝的に決定されたＥＴ－１活性（典型的に最低のエンドセリン遺伝子発現を有するＡＡ遺伝子型から典型的に最大のエンドセリン遺伝子発現を有するＧＧ遺伝子型まで）による３つの顕著に異なる患者の群。ｘ軸に示される濃度でＥＴ－１によって血管収縮を誘導した。各群について同様のアンタゴニスト効力が示され（右方向の曲線シフト）、第一に、ＥＴ_ＡＲがＥＴ－１血管収縮応答の主要エフェクターであることが示唆される。第二にかつより重要なことに、エンドセリン－１遺伝子発現の上昇およびＧ対立遺伝子患者の既知のＥＴ－１活性の増加にもかかわらず、ＥＴ_ＡＲ経路は下方調節されないことを示す。この所見は、微小血管狭心症を有する対象におけるジボテンタンによるＥＴ_ＡＲ経路のモジュレーションを考慮すると、特に重要である。 研究概要：微小血管狭心症におけるエンドセリン－１遺伝子エンハンサー。安定狭心症を有する３９１名の患者を、冠動脈解剖所見の事前知識無しに前もって登録した。１８５名（４７％）が閉塞性冠動脈疾患を有さず、したがって侵襲的冠血管反応性検査およびさらなるサブ研究に適格であった。１８５名のうち１５１名（８２％）が冠微小血管機能障害の補助的侵襲的試験を受けることが可能であった。試験された１０９名（７２％）の対象が冠微小血管機能障害のエビデンスを有した。１４０名の対象がｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子の遺伝子分析を受け、対立遺伝子頻度は４６％であった（１２９／２８０個の対立遺伝子）。有害なＧ対立遺伝子の頻度は、参照ゲノムバンクの対照対象より高かった（４６％対３９％、Ｐ＝０．０１３）。ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子を有する患者は、血清エンドセリン－１がより高く、冠微小血管機能障害のオッズが２倍を超えて高かった（オッズ比２．３３、９５％信頼区間１．１０～４．９６、Ｐ＝０．０２７）。さらに、対象は心筋灌流の機能不全（Ｐ＝０．０４）および運動耐容能の機能不全（デューク運動トレッドミルスコアで－３．０単位、Ｐ＝０．０４５）を有する可能性がより高かった。エンドセリン－１に対する末梢小動脈反応性およびＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストの親和性は、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子群で保持された（Ｐ＝０．２０９）。重要なことに、臨床的に関連する濃度で試験されたジボテンタンは、確立されたエンドセリン－１血管収縮を完全に逆転させ、これは血管攣縮に関連する状態における有効性の徴候となる。これにより、この群の患者におけるＥＴ_Ａ受容体拮抗作用が治療利益を有する可能性があることが示唆される。 冠微小血管機能およびエンドセリン－１に対するｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子の有害作用。（Ａ）Ｇ対立遺伝子を有する患者は、基礎微小血管機能障害を有する可能性が２倍を超えて高かった（Ｇ対立遺伝子あたりのオッズ比２．３３、９５％信頼区間１．１０～４．９６、Ｐ＝０．０２７）。他のリスク因子についての調整後でも、Ｇ対立遺伝子は微小血管疾患を予測するものであった（オッズ比２．３１、９５％信頼区間１．０～４．９１）。この所見は、エンドセリン遺伝子発現の生涯の増加の冠微小循環に対する有害な影響を支持する。（Ｂ）ベースライン群の差について調整する多変数回帰モデルでは、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子を有する患者は、より高い血漿エンドセリン－１を示した（最小二乗平均１．５９ｐｇ／ｍＬ対１．２８ｐｇ／ｍＬ、９５％信頼区間１．１０～０．５３、Ｐ＝０．００５）。 遺伝子型：Ｇ対立遺伝子と侵襲的冠微小血管機能障害の表現型関連性。（Ａ～Ｃ）侵襲的冠動脈検査の間に検出された微小血管機能障害の有病率は遺伝子型状態と関連した（ＡＡ６０％、ＡＧ７５％、ＧＧ８３％、Ｐ＝０．０２１）。異常な冠血流予備能および微小循環抵抗の存在は、Ｇ対立遺伝子が増えるごとに線形に関連した。Ｐ値は、線形傾向のピアソンのｖ２検定を表す（カテゴリーデータ）。（Ｄ）冠血流予備能は、２つの高リスクＧ対立遺伝子（ｒｓ９３４９３７９）を有する対象でより低く、冠微小循環に対するエンドセリン遺伝子発現の増加の有害作用と一致する（群間のクラスカル・ウォリス、破線、Ｐ＝０．０４６）。部分群の事前分析（ＡＡ群対ＧＧ群－実線）では、ＧＧ群でより低いＣＦＲが示された（Ｐ＝０．０１３）。データはＣＦＲの中央値であり、エラーバーは中央値の９５％信頼区間を表す。Ｐ＝０．０２１、Ｐ＝０．０３０、Ｐ＝０．０２９およびＰ＝０．０５６。 遺伝子型：Ｇ対立遺伝子と侵襲的冠微小血管機能障害の表現型関連性。（Ａ～Ｃ）侵襲的冠動脈検査の間に検出された微小血管機能障害の有病率は遺伝子型状態と関連した（ＡＡ６０％、ＡＧ７５％、ＧＧ８３％、Ｐ＝０．０２１）。異常な冠血流予備能および微小循環抵抗の存在は、Ｇ対立遺伝子が増えるごとに線形に関連した。Ｐ値は、線形傾向のピアソンのｖ^２検定を表す（カテゴリーデータ）。（Ｄ）冠血流予備能は、２つの高リスクＧ対立遺伝子（ｒｓ９３４９３７９）を有する対象でより低く、冠微小循環に対するエンドセリン遺伝子発現の増加の有害作用と一致する（群間のクラスカル・ウォリス、破線、Ｐ＝０．０４６）。部分群の事前分析（ＡＡ群対ＧＧ群－実線）では、ＧＧ群でより低いＣＦＲが示された（Ｐ＝０．０１３）。データはＣＦＲの中央値であり、エラーバーは中央値の９５％信頼区間を表す。Ｐ＝０．０２１、Ｐ＝０．０３０、Ｐ＝０．０２９およびＰ＝０．０５６。 エンドセリン－１のｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子型別血管生物学。（Ａ）ＥＴ_ＡアンタゴニストＢＱ１２３の存在下および非存在下での、３つの群におけるエンドセリン－１に対する累積濃度応答曲線（ｎ＝４４）。各群についての同様のアンタゴニスト効力（右方向の曲線シフト）は、第一にＥＴ_Ａ受容体がエンドセリン－１血管収縮応答の主要エフェクターであること、第二にエンドセリン－１遺伝子発現の上昇およびＧ対立遺伝子の一塩基多型を有する患者における既知のエンドセリン－１活性の増加にもかかわらず、ＥＴ_Ａ受容体経路は下方調節されないことを示唆する。（Ｂ）新規の治療用経口ＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストであるジボテンタンのアンタゴニスト効力［Ｎ＝８、平均７．５４（９５％信頼区間７．２７～７．８２）］は、ペプチドアンタゴニストＢＱ１２３［Ｎ＝２７、平均７．５３（９５％信頼区間７．３７～７．６９）］と同様である。ｐＫ_Ｂが高いほどアンタゴニスト効力が高いことを表す。（Ｃ）ジボテンタン：確立されたエンドセリン－１血管収縮の逆転。概念実証である、強力な確立されたエンドセリン－１媒介性末梢細動脈血管収縮の用量依存的な逆転。重要なことに、１０ｍｇ／日の臨床的に関連する用量によって達成された血漿濃度でもある試験された最高濃度は、確立されたエンドセリン－１収縮応答を迅速かつ完全に逆転させ、これは血管攣縮の状況における有効性の徴候となる。いずれも重要因子である時間および用量を含む、通常の二元配置分散分析を使用した比較（多重検定について調整後Ｐ＜０．００１）。 ＧＧ（高リスクエンドセリン－１遺伝子エンハンサー）。侵襲的および非侵襲的精密試験からの代表画像を含む安定狭心症を有する患者からの例示的な事例を、臨床像およびエンドセリン－１エンハンサー遺伝子型との関連で示す。最大ＳＴは、運動トレッドミル試験の間の最大の平面状または下行傾斜型ＳＴ部分下降を表す。両方の対象の侵襲的冠動脈血管造影法はほぼ同一であり、最小限のみの内腔不整を示す。白色矢印は、重度の冠微小血管機能障害を有する患者における、アデノシン負荷磁気共鳴画像法の間の心内膜下の誘導性虚血心筋を表す。ｅｘ ｖｉｖｏでの血管生物学的（下パネル）は、ワイヤミオグラフィーの間の典型的なエンドセリン－１媒介性血管収縮を示す。血管張力の増加は、各用量滴定における曲線の上昇と一致する。ＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストであるＢＱ１２３でのインキュベーション後に、対になった同一の血管の実験を実施する。この曲線は青色で印され、エンドセリン－１応答の曲線は右にシフトし、これはＥＴ_Ａ受容体が血管収縮を媒介することを示唆する。エンドセリン－１遺伝子エンハンサーにもかかわらず、ＧＧ対象は、同様のアンタゴニスト効力レベルでＥＴ_Ａ受容体の下方調節を有するように思われない。これにより、この群の患者におけるＥＴ_Ａ受容体拮抗作用が治療利益を有する可能性があることが支持される。ＣＦＲ、冠血流予備能；ＥＴ_Ａ、エンドセリンＡ受容体；ＦＦＲ、血流予備量比；ＩＭＲ、微小循環抵抗指数。

ここで、本発明の態様および実施形態を添付の図面を参照して考察する。当業者には、さらなる態様および実施形態が明らかである。本文書で言及されたすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

定義
治療される「対象」は、任意の動物またはヒトであってもよい。対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。対象は男性であっても女性であってもよい。対象は患者であってもよい。治療的使用は、ヒトまたは動物（獣医学的使用）におけるものであってもよい。

本発明の態様による医薬および医薬組成物は、これらに限定されないが、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腫瘍内、経口および鼻腔を含む多数の経路による投与用に製剤化されてもよい。好ましくは、医薬または医薬組成物は、経口投与用に調製される。医薬および組成物は、流体または固体形態で製剤化されてもよい。流体製剤は、ヒトまたは動物の身体の選択された領域への注射による投与用に製剤化されてもよい。投与は、好ましくは「治療有効量」であり、これは個体に対して利益を示すのに十分である。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間経過は、治療される疾患の性質および重症度に依存する。治療の処方、例えば投薬量などの決定は、一般医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的に治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および医師に既知の他の因子を考慮する。上述の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２０００， ｐｕｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに見出すことができる。

医薬組成物は、安全かつ有効とみなされる材料から構成される、薬学的に許容される「担体」を使用して調製されてもよい。「薬学的に許容される」は、「一般的に安全とみなされる」、例えば生理学的に耐容可能であり、ヒトに投与された場合に典型的にアレルギー性または胃の不調などの同様の不都合な反応をもたらさない分子実体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）および組成物を指す。一部の実施形態では、この用語は、ＦＤＡによる市販前審査および承認に供される連邦食品・医薬品・化粧品法の２０４（ｓ）および４０９条に基づくＧＲＡＳリストまたは同様のリストとして米国連邦政府または州政府の規制機関によって、米国薬局方または別の一般的に認識される薬局方によって、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために承認された分子実体および組成物を指す。

用語「担体」は、希釈剤、結合剤、滑沢剤および崩壊剤を指す。当業者は、そのような薬学的担体およびそのような担体を使用して医薬組成物を配合する方法を熟知している。

本明細書で提供される医薬組成物は、１種または複数の添加剤、例えば溶媒、溶解性増強剤、懸濁剤、緩衝剤、等張剤、酸化防止剤または抗菌保存剤を含んでもよい。使用される場合、組成物の添加剤は、組成物に使用される活性物質、すなわちジボテンタンの安定性、バイオアベイラビリティ、安全性および／または有効性に悪影響を及ぼさない。したがって、当業者は、剤形の成分のいずれかの間に不適合性が生じない組成物が提供されることを認識する。添加剤は、緩衝剤、可溶化剤、等張化剤、キレート剤、酸化防止剤、抗菌剤および保存剤からなる群から選択されてもよい。

活性化合物であるジボテンタンの対応する塩、例えばジボテンタンの薬学的に許容される塩を調製する、精製するおよび／または取り扱うことが好都合であるまたは望ましい場合がある。そのようなジボテンタンの塩は、それらが特許請求の範囲によって定義される方法における使用のためである限り、本発明の一部として包含される。薬学的に許容される塩の例は、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９７７， “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ． ６６， ｐｐ． １－１９で議論される。

本発明者らは、ガイドワイヤに基づく冠血管機能の直接測定、それに続く薬理学的血管反応性検査を組み合わせた介入診断手順を使用する。特に手順は、冠血管機能（血流予備量比［ＦＦＲ］、冠血流予備能［ＣＦＲ］および微小血管抵抗指数［ＩＭＲ］）のガイドワイヤに基づく測定、それに続くアセチルコリン（ＡＣｈ）および三硝酸グリセリン（ＧＴＮ）による薬理学的血管反応性検査を含み、以前に記載されている^７、１９。

簡潔には、アデノシンを静脈内注入（１４０μｇ・ｋｇ^－１・分^－１）で太い末梢静脈を介して投与し、定常状態の最大充血を誘導した。圧力温度感知ガイドワイヤを主要心外膜冠動脈の遠位３分の１（典型的に左前下降枝（ＬＡＤ））に配置した。心筋ＦＦＲを、最大充血時の平均遠位冠動脈圧の平均大動脈圧に対する比によって計算した。ＦＦＲ≦０．８０を異常および血流制限のある冠動脈疾患の徴候とみなした^２０。ＣＦＲは、安静時平均通過時間を充血時平均通過時間で除したものとして、熱希釈を使用して計算した^２１。ＣＦＲ＜２．０を、血管拡張予備能の機能不全を表す異常と定義した。ＩＭＲは、平均充血時通過時間と充血時の平均遠位冠動脈圧の積として計算した^２２。ＩＭＲ＞２５を、異常および微小血管抵抗の増加の徴候と定義した。これらの侵襲的パラメータは、専用のソフトウェア（Ｃｏｒｏｖｅｎｔｉｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してリアルタイムで同時に導出した。

狭心症の重症度の分類
狭心症の重症度は、検診（ｍｅｄｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）によって測定されてもよい。カナダ心臓血管学会狭心症分類（ＣＣＳ狭心症分類スケールと称されることもある）などの一般的な分類システムが使用されてもよい。狭心症のＣＣＳ狭心症分類スケールは、以下の通り提示される：
０度－無症候性狭心症。これは「症状を伴わない軽度の心筋虚血」と説明される。
１度－激しい労作のみによる狭心症。これは「激しい、急なまたは持続的な日常活動（歩行または階段を登る）の間の狭心症の存在」と説明される。
２度－中等度の労作による狭心症。これは「急に、食後に、寒冷下で、風の中で、情緒ストレス下で、起床後最初の数時間の間に行われる場合の日常活動だけでなく、坂道の歩行、通常の歩調で通常の条件下で１階分より多くの日常の階段を登る場合のわずかな制限」と説明される。
３度－軽度の労作による狭心症。これは「１もしくは２ブロックの歩行または通常の歩調および条件下で日常的な階段１階分を登ることに困難を有する」と説明される。
４度－安静時狭心症。これは「狭心症を引き起こすのに労作を必要としない」と説明される。

前述の記載または以下の特許請求の範囲または添付の図面で開示され、それらの特定の形態で、もしくは開示される機能を実行するための手段によって表される特色、または開示される結果を得るための方法もしくはプロセスは、適切な場合、その多様な形態で本発明を実現するために、別個にまたはそのような特色の任意の組合せで利用されてもよい。

本発明は上述の例示的な実施形態と併せて記載されたが、本開示を考慮すると、多くの等価の修正および変形が当業者に明らかである。したがって、上記に記載された本発明の例示的な実施形態は例示とみなされ、限定的ではない。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、記載された実施形態に種々の変更を加えることができる。

誤解を避けるために、本明細書に提供される理論的説明は、読者の理解を向上させる目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれによっても束縛されることを望まない。

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構造化のためのみのものであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。

後に続く特許請求の範囲を含む本明細書を通して、文脈によって別段要求されない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、言及された整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を包含するが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を排除しないことを示唆すると理解される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に指示しない限り複数の指示対象を含むことが留意されるべきである。範囲は、「約」１つの特定の値からおよび／または「約」別の特定の値までとして本明細書で表される場合がある。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約」を使用して概算値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。数値との関連での用語「約」は任意選択であり、例えば＋／－１０％を意味する。

実施例１：ＭＶＡを診断するための本発明の新規のガイドワイヤの使用

ｉｎ ｖｉｖｏでの冠血管機能の測定（図３に図示）
本発明者らは、ガイドワイヤに基づく冠血管機能の直接測定、それに続く薬理学的血管反応性検査を組み合わせる介入診断手順を使用する。特に手順は、冠血管機能（血流予備量比［ＦＦＲ］、冠血流予備能［ＣＦＲ］および微小血管抵抗指数［ＩＭＲ］）のガイドワイヤに基づく測定、それに続くアセチルコリン（ＡＣｈ）および三硝酸グリセリン（ＧＴＮ）による薬理学的血管反応性検査を含み、他の臨床設定において以前に記載されている^７、１９。

簡潔には、アデノシンを静脈内注入（１４０μｇ・ｋｇ^－１・分^－１）で太い末梢静脈を介して投与し、定常状態の最大充血を誘導する。圧力温度感知ガイドワイヤを主要心外膜冠動脈の遠位３分の１（典型的に左前下降枝（ＬＡＤ））に配置する。心筋ＦＦＲを、最大充血時の平均遠位冠動脈圧の平均大動脈圧に対する比によって計算する。ＦＦＲ≦０．８０を異常および血流制限のある冠動脈疾患の徴候とみなす^２０。ＣＦＲは、安静時平均通過時間を充血時平均通過時間で除したものとして、熱希釈を使用して計算する^２１。ＣＦＲ＜２．０を、血管拡張予備能の機能不全を表す異常と定義する。ＩＭＲは、平均充血時通過時間と充血時の平均遠位冠動脈圧の積として計算する^２２。ＩＭＲ＞２５を、異常および微小血管抵抗の増加の徴候と定義する。これらの侵襲的パラメータは、専用のソフトウェア（Ｃｏｒｏｖｅｎｔｉｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してリアルタイムで同時に導出する。

冠血管反応性検査
標的血管はＬＡＤ冠動脈である。技術的要因、例えば血管蛇行によってこの動脈の評価が除外される場合、左回旋枝または右冠動脈（ＲＣＡ）が選択される。本発明者らは、ガイドカテーテルを介した０．１８２、１．８２および１８．２μｇ／ｍＬ（それぞれ１０^－６、１０^－５および１０^－４ｍｏｌ／Ｌ）の濃度のＡＣｈの冠動脈内注入を、機械的注入ポンプを介して１ｍＬ／分で２分間にわたって使用し、内皮依存性冠血管運動機能を評価する^２３。その後、ＡＣｈの１００μｇのボーラス（１０^－４ｍｏｌ／Ｌを２０秒かけて５．５ｍＬ、ＲＣＡでは５０μｇに低減される）を使用し、心外膜冠動脈攣縮の誘発検査をすぐに実施する。非内皮依存性血管拡張を評価するために、手動の冠動脈内ボーラス注射によって３００μｇのＧＴＮを投与する。

実施例２：ＭＶＡ患者における血管収縮に対するＥＴ－１の役割のエビデンス（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ； ＥＨＪ ２０１８）^２４。

目的：冠微小血管機能障害および／または血管攣縮は、閉塞性冠動脈疾患を有さない患者における虚血の潜在的な原因である。本発明者らは、これらの患者が末梢小動脈における機能異常も有するという仮説を試験した。

方法および結果：患者を前もって登録し、実施例１で上述された内皮および内皮非依存性機能のプローブ（アセチルコリンおよびアデノシン）を組み込んだ冠動脈機能試験に基づき、微小血管狭心症（ＭＶＡ）、血管攣縮狭心症（ＶＳＡ）を有するとして、または正常対照として類別した。８１名の対象（６２歳、女性６９％、ＭＶＡ５９名、ＶＳＡ１１名および対照１１名）に臀部の皮下脂肪生検を実施した。抵抗動脈を切開することにより、ワイヤミオグラフィーを使用する研究を可能にした。

ＡＣｈに対する最大弛緩は、対照に比べてＭＶＡで中央値が低減した［７７．６対９８．７％、差の９５％信頼区間（ＣＩ）２．３～３８％、Ｐ＝０．００４７］。内皮非依存性弛緩［ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）］は、すべての群の間で同様であった。エンドセリン－１（ＥＴ－１）に対する最大収縮性応答は、ＭＶＡ（中央値１２１％）において対照に比べて高かった（１００％、９５％ＣＩ ４．７～４５％、Ｐ＝０．０１５）。トロンボキサンアゴニストＵ４６６１９に対する応答も、ＭＶＡ（中央値１４３％）で対照に比べて高かった（１０９％、９５％ＣＩ １３～５７％、Ｐ＝０．００３）。ＶＳＡを有する患者は、ＡＣｈに対する最大弛緩の低減（中央値７９．０％対９８％、Ｐ＝０．０３）およびＥＴ－１を含む収縮アゴニストに対する応答の増加（１２５％対１００％、Ｐ＝０．０２）を含む、末梢血管反応性の同様の異常なパターンを示した。すべての群において、抵抗動脈は、Ｕ４６６１９と比較してＥＴ－１の収縮効果に対しておよそ５０倍高く感受性であった。

結論：全身性微小血管異常は、ＭＶＡおよびＶＳＡを有する患者において一般的である。これらの機序にＥＴ－１が関与する可能性があり、血管収縮の上昇および内皮機能障害によって特徴付けられた。

結果を表１に示す：

これらの結果により、対照と比較してＭＶＡを有する患者の末梢細動脈において、内皮機能障害および血管収縮の増強が確認され、ＥＴ－１経路が潜在的な治療標的であることが示唆される。（図６－中央の図－ＥＴ－１は微小血管狭心症において収縮を増加させ、内皮機能を低減させた）。

実施例３：微小血管狭心症患者の末梢動脈に対するジボテンタンの効果

仮説：ＭＶＡを有する患者では、ジボテンタンは、選択的ＥＴＡ受容体アンタゴニスト（ＥＲＡ）であるＢＱ１２３および選択的ＥＴＢＲアンタゴニストであるＢＱ７８８より強力なＥＴ－１血管応答の阻害剤である。

目的：本発明者らは、ＭＶＡを有する患者および対応対照から単離された末梢抵抗動脈を使用し、超選択的ＥＴＡＲアンタゴニストであるジボテンタンが、ＭＶＡを有する患者においてｅｘ ｖｉｖｏでＢＱ１２３より強力なＥＴ－１血管応答の阻害剤であるか調査した。ＢＱ－１２３は経口的に有効でないことに留意されたい。ＢＱ－１２３は、ＥＲＡ機能を研究するための薬理学的ツールとして使用される。

結果：１０－６ＭのＢＱ７８８およびＢＱ１２３（対象ｎ＝３１）または１０－６Ｍのジボテンタン（ｎ＝８）でのプレインキュベーション後、単離直後の対になった細動脈で累積濃度応答曲線（ＣＣＲＣ）を実行した。ＥＴＡＲアンタゴニストであるジボテンタンの存在下でのＥＴ－１誘導性血管収縮の効力は、ＭＶＡを有する患者で顕著に低減する（図４）。ＢＱ７８８によるＥＴＢ受容体拮抗作用は、ＥＴ－１収縮応答に対してわずかな効果を及ぼした一方、ＥＴＡＲアンタゴニスト（ＢＱ１２３）との共インキュベーションにより、ジボテンタンのものと同等の効果が観察された（図７）。効力をシルドプロット（アンタゴニストのその受容体に対する親和性のｐＡ２分析）を使用して考慮すると、同様のｐＡ２値（ジボテンタン７．５９１（９５％ＣＩ ７．３１２～７．８７１）対ＢＱ１２３ ７．５２７（９５％ＣＩ ７．３６７～７．６８７））によって明らかであるように、ジボテンタン（ｎ＝８）はＢＱ１２３（ｎ＝６）と同様の効力を有する。ＢＱ１２３は、経口投与された場合は有効でない。ＢＱ７８８（１μＭｌ）によるＥＴ－１のＣＣＲＣにおける小さな右方向のシフトは、この化合物のＥＴＡ受容体に対する低い親和性を反映する可能性がある（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＆ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １９９６；１１９（４）：６３１）。ＢＱ７８８のシフトは、収縮応答がＥＴＢ受容体を介して媒介された場合に予想される８のｐＡ２ではなく、５．９８～６．８５の間のｐＡ２と一致する。

結論：本発明者らは、対照対象と比較したＭＶＡを有する患者で末梢小動脈の機能の変化を示した。末梢血管異常は、内皮機能不全および血管収縮刺激、特にＥＴ－１に対する応答の増加によって特徴付けられる。ＥＴ－１に対する応答の増強は、ＭＶＡを有する患者で上方調節されるまたはより活性であり得るＥＴ_ＡＲによって媒介される。超選択的ＥＴＡＲアンタゴニスト（ジボテンタン）は、これらの患者におけるこの有害なＥＴＡＲ媒介性ＥＴ－１血管応答の最も強力な経口活性選択的阻害剤である。ＢＱ７８８によるＥＴＢ拮抗作用はわずかな効果を及ぼし、また重要なことに、ＢＱ１２３は経口活性でない。

概要：本発明者らの結果は、ＥＴＡＲが、対応対照対象における観察と比較して微小血管狭心症を有する患者で上方調節される、またはＥＴ－１血管収縮を媒介するのにより有効であることを示唆する。

実施例４：ＥＴ－１ ＳＮＰ遺伝子型／表現型相互作用

Ｇｕｐｔａらによる公表（Ｃｅｌｌ， Ｊｕｌｙ ２０１７）により、一般的な非コードＳＮＰであるｒｓ９３４９３７９（ＰＨＡＣＴＲ１遺伝子）は、ヒトの血管細胞におけるＥＴ－１遺伝子発現の下流エンハンサーであると特定された^２５。染色体６ｐ２４の一般的な遺伝子変異体（ｒｓ９３４９３７９）は、５つの血管疾患（冠動脈疾患、高血圧、線維筋性異形成、片頭痛および動脈解離）と関連し、ゲノムワイド関連研究においてエンドセリン遺伝子発現の遠位調節因子であることが示されている。特に、イントロン性一塩基多型（ＳＮＰ）のマイナー対立遺伝子であるｒｓ９３４９３７９－Ｇは、冠動脈疾患のリスクの増加、エンドセリン遺伝子発現およびＥＴ－１血清レベルの増加と関連する。したがって、ＥＴ－１の調節不全はこれらの血管障害に関与するが、ＣＭＤの病態形成におけるこのＳＮＰの役割は調べられていない。心臓のＥＴ－１媒介性微小血管疾患に対して遺伝的基盤が存在する場合、この所見がＥＴＡのモジュレーションを含む治療開発の状況を前進させる機構的支援となる。

本明細書に提示される本発明者らの所見を考慮して、以下の研究課題が問われた：
１．安定胸痛を有する患者の前向きコホートにおいて遺伝子型（ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子）と表現型（ＭＶＡ）との間に関連は存在するか？
２．遺伝子型は、微小血管狭心症対象の心筋虚血および運動能力の非侵襲的パラメータと関連するか？
３．血管生物学：遺伝的に上昇したＥＴ－１活性（ＳＮＰマイナーＧ対立遺伝子）を有する対象におけるＥＴ－１に対する末梢血管のＥＴＡ受容体応答はどのようなものであるか

Ａ１－遺伝子多型（ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子）を有する患者は、ＣＭＤを有する可能性の２倍を超える増加を示した（ＯＲ２．３３、９５％ＣＩ １．１０～４．９５；Ｐ＝０．０２４；図８Ａ）。多変量分析により、Ｇ対立遺伝子は依然としてＣＭＤと関連することが示された（Ｇ対立遺伝子あたりのＯＲ１．８３；１．０３～３．２７；Ｐ＝０．０４）。さらに、冠血流予備能（ＣＦＲ－微小血管機能の尺度）はＧ対立遺伝子が増えるごとに線形に減少した（ＡＡ３．２；ＡＧ２．９；ＧＧ２．４；Ｐ傾向＝０．０１２）。最大リスク群（ＧＧ）は、ＡＡ群より顕著に低いＣＦＲを有した（平均差０．７、９５％ＣＩ ０．２～１．３；Ｐ＝０．０１１；図８Ｂ）。

Ａ２－ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子は、負荷灌流ＭＲＩにおいて誘導性虚血と線形に関連した（ＧＧ５６％、ＡＧ４３％、ＡＡ３１％；Ｐ＝０．０４２、図９９Ａ）。９０名の対象が、侵襲的冠動脈血管造影法に先立ち標準医療の診断精密試験の間に運動トレッドミル検査を完了した。平均運動継続時間は３６７（±１５６）秒であり、群間で同様であった。平均デュークトレッドミルスコア（ＤＴＳ）は－１．０（±５．３）単位であった。遺伝子型とＤＴＳの両方が入手可能な８４名の患者の部分群を考慮すると、Ｇ対立遺伝子が増えるごとにＤＴＳの低下が見られた（Ｐ＝０．０４５）。マイナーＧ対立遺伝子についてホモ接合性の対象のＡＡ群と比較した事前分析では、－３．０単位の平均差が明らかになった（９５％ＣＩ －５．８～－０．１；Ｐ＝０．０４５；図９Ｂ）。

Ａ３－本発明者らは、外植直後の皮下組織から単離されたヒトの細動脈で、ＥＴ－１媒介性血管収縮の基礎病態生理を遺伝子型によって評価し、ＳＮＰを有する患者におけるエンドセリン遺伝子発現の上昇およびＥＴ－１活性の既知の増加にもかかわらず、ＥＴ_Ａ血管収縮応答は下方調節されないことを結論づけた。選択的ＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストペプチドであるＢＱ１２３は、すべての動脈においてＥＴ－１に対するＣＣＲＣの平行な右方向のシフトをもたらした。シルド回帰を使用して導出されたｐＫ_Ｂ値は、ＡＡ、ＡＧおよびＧＧ群間ですべて同様であり（それぞれｐＫ_Ｂ値７．０７［±０．２３］、７．７９［±０．３５］および７．４１［±０．２６］；Ｐ＝０．２０９）、心外膜冠動脈を含む他のヒトの血管で、この化合物について文献で報告された機能的親和性値と同等であった^２６。ジボテンタンも、ＢＱ１２３のものと同等の７．５４のｐＫ_ＢでＥＴ－１への収縮応答に拮抗した（Ｎ＝８）（図１０Ａ）。さらに重要なことに、これらの研究により、ジボテンタンがＥＴ－１に対する確立された収縮応答の濃度依存的阻害をもたらしたことが確認された（Ｐ＜０．００１；図１０Ｂ）。

集団の観点から、世界的なおよび欧州でのｒｓ９３４９３７９のマイナー対立遺伝子頻度はそれぞれ３８％および４０％であり（１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ）、一方でＣＭＤを有する選択された患者の本発明者らの試料は、マイナー対立遺伝子の濃縮を示し、Ｇ対立遺伝子の頻度は４６％である。

概要：この一連の研究は、長期的なエンドセリン遺伝子の発現の増加および結果として生じる組織のＥＴ－１活性の上昇が冠微小循環に対する病理学的効果と関連し、ひいては微小血管狭心症を有する患者において定量的ＣＭＲによって明らかにされる負荷検査の間の心筋血流の機能不全および運動能力の機能不全をもたらすという仮説を支持する。この仮説は、この調査で利用されたマルチモダリティ研究からの結果によって一貫して支持された。最後に、血管生物学サブ研究は、微小血管狭心症を有する対象における、標的化薬剤としてのＥＴＡ受容体アンタゴニストであるジボテンタンの選択的モジュレーションの役割を支持する。

実施例５：エンドセリン－１の遺伝的調節不全は冠微小血管機能障害に関与する

目的：エンドセリン－１（ＥＴ－１）は、一般的なイントロン性遺伝子エンハンサー［（ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子）、６番染色体（ＰＨＡＣＴＲ１／ＥＤＮ１）］を通して血管疾患に関連付けられる強力な血管収縮ペプチドである。本発明者らは、虚血の症状および／または兆候を有するが、閉塞性冠動脈疾患（ＣＡＤ）を有さない患者での冠微小血管機能障害（ＣＭＤ）の病態形成におけるＥＴ－１およびこの遺伝子変異体の役割についてマルチモダリティ調査を実施した。

方法および結果：狭心症を有する３９１名の患者を登録した。このうち閉塞性ＣＡＤを有する２０６名（５３％）を除外し、適格な１８５名（４７％）が残った。侵襲的検査を受けた１５１名の対象のうち、１０９名（７２％）がＣＭＤの客観的エビデンスを有した（ＣＯＶＡＤＩＳ基準）。ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子頻度は、最新の参照ゲノムバンクの対照対象より高かった［対立遺伝子頻度４６％（１２９／２８０個の対立遺伝子）対３９％（５５５１／１４３８０）；Ｐ＝０．０１３］。Ｇ対立遺伝子は、より高い血漿血清ＥＴ－１と関連した［最小二乗平均１．５９ｐｇ／ｍＬ対１．２８ｐｇ／３０ｍＬ；９５％信頼区間（ＣＩ）０．１０～０．５３；Ｐ＝０．００５］。ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子を有する患者は、２倍を超えるＣＭＤのオッズを有した［オッズ比（ＯＲ）２．３３、９５％ＣＩ １．１０～４．９６；Ｐ＝０．０２７］。非侵襲的マルチモダリティ検査では、１．５Ｔでの負荷心臓磁気共鳴画像法（Ｎ＝１０７；ＧＧ５６％、ＡＧ４３％、ＡＡ３１％、Ｐ＝０．０４２）および運動検査（Ｎ＝８７；デューク運動トレッドミルスコアで－３．０単位；－５．８～－０．１；Ｐ＝０．０４５）で、Ｇ対立遺伝子は心筋灌流における関連付けられる機能不全と関連することが確認された。ジボテンタンを含むエンドセリンＡ受容体（ＥＴ_Ａ）アンタゴニストを用いてワイヤミオグラフィーを使用し、エンドセリン－１に関連する血管機構をｅｘ ｖｉｖｏで評価した。ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子を有する対象は、保持されたＥＴ－１に対する末梢小血管反応性とＥＴ_Ａアンタゴニストの高い親和性を示した。ジボテンタンは、Ｇ対立遺伝子状況とは無関係にＥＴ－１誘導性血管収縮を逆転させた。

結論：本発明者らは、ＣＭＤに対する新規の遺伝的リスク遺伝子座を特定する。これらの所見はＥＴ－１の調節不全を暗示し、また遺伝学を使用して微小血管狭心症を有する患者における経口ＥＴ_Ａアンタゴニスト療法を標的化する精密医療の可能性を支持する。

序論
冠微小循環は、５０年より長くにわたり狭心症の病態形成に関与してきたが、疾患機序の理解は不完全なままである^１Ａ。冠微小血管機能障害（ＣＭＤ）は、狭心症における有害事象および他の心血管障害の多血症に関連する^{２Ａ～５Ａ}。閉塞性心外膜冠動脈疾患（ＣＡＤ）を有さない狭心症患者の３分の２に影響を及ぼすという罹患率を特定した近年の研究^{７Ａ～１０Ａ}は、微小血管機能障害のための標準化された診断基準^６Ａに基づくものである。これらの患者は、最大４人に１人がフォローアップの５年後に主要有害心イベントを経験するという診断的および治療的課題を呈する^{１１Ａ、１２Ａ}。非有意狭窄冠動脈由来の虚血性心疾患（ＩＮＯＣＡ）は、ほとんどの場合心臓リスクの上昇が冠流量予備能（ＣＦＲ）の機能不全によって引き起こされる（かつ閉塞性冠疾患によって引き起こされない）^１１Ａ女性において特に重要である^１３Ａ。

エンドセリン－１（ＥＴ－１）は、ヒトの冠動脈の高度に強力な内在性血管収縮因子であり^１４Ａ、微小血管機能障害の病態形成に関与してきた^{１５Ａ、１６Ａ}。Ｇタンパク質共役エンドセリンＡ（ＥＴ_Ａ）受容体の血管平滑筋細胞に対するエンドセリン－１媒介性活性化は、内皮機能障害、炎症および血管増殖効果を誘導する。

血清ＥＴ－１の循環濃度は、ＣＭＤを有する患者における冠血流応答に逆関連する^{１４Ａ、１６Ａ}。近年、染色体６ｐ２４の一般的な（３９％）遺伝子座（ＰＨＡＣＴＲ１／ＥＤＮ１）は、エンドセリン遺伝子発現の遠位調節因子であることが示された^１７Ａ。対立遺伝子であるｒｓ９３４９３７９－Ｇは、アテローム性動脈硬化性心外膜ＣＡＤおよび心筋梗塞のリスクの増加と関連する^１８Ａ。この機能的一塩基多型（ＳＮＰ：ｒｓ９３４９３７９－Ｇ）は、エンドセリン遺伝子発現の増加と関連し、生涯にわたって少なくとも２０％高い血漿中ＥＴ－１前駆体レベルの曝露をもたらす^１７Ａ。エンドセリン－１調節不全は冠血管疾患に関与するが、ＣＭＤの病態形成におけるｒｓ９３４９３７９の役割は調べられていない。本発明者らは、侵襲的冠動脈機能検査を受ける狭心症患者で、存在する場合ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子とＣＭＤの関連を調査した。本発明者らの第２の目的は、Ｇ対立遺伝子が心筋虚血の非侵襲的パラメータと関連するか調査することであった。本発明者らの最後の目的は、患者から単離された末梢抵抗小血管における等尺性張力の記録を使用し、遺伝子型によって血管機構を調べることであった。本発明者らは、対象におけるＥＴ_Ａ受容体媒介性血管収縮をｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子状況によって評価した。これらには、第三相腫瘍学的試験の中立的な結果に続いて別の目的で使用するために利用可能な、ＥＴ_Ａ受容体選択的アンタゴニストであるジボテンタンが含まれた。

方法
研究集団：安定狭心症を有する患者を前もって登録した。ｓｃｏｔｌａｎｄ西部の約２５０万人の集団に対応する２つの病院に照会された選択的な成人をスクリーニングした。患者は、疑いのあるＣＡＤを調査するために、臨床的に必要であれば侵襲的冠動脈血管造影法を受けるよう予定された。参加者は、閉塞性ＣＡＤを有さない狭心症患者での層別化医療の無作為化対照戦略試験である冠微小血管狭心症（ＣｏｒＭｉｃＡ）研究（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ：ＮＣＴ０３ １９３２９４）に登録された^１９Ａ。血管造影日にＲｏｓｅ－Ａｎｇｉｎａ問診票を施行し、確定的なまたは可能性のある狭心症を有する患者のみが参加に適格であった^２０Ａ。除外基準は、侵襲的血管造影法での非冠動脈性の徴候、例えば弁疾患、重度の腎機能障害（糸球体濾過量＜３０ｍＬ／分）、インフォームドコンセントが得られないこと、および侵襲的冠動脈血管造影法の間に決定された閉塞性冠疾患［直径≧５０％の狭窄および／または血流予備量比（ＦＦＲ）≦０．８０］を含んだ。すべての冠血管拡張薬を手順の少なくとも２４時間前に休止した。プールされた対照の遺伝子型頻度は、最新の医療ゲノム参照コホートから確認した^２１Ａ。

定義：冠微小血管機能障害
本発明者らは、侵襲的冠動脈機能検査および冠動脈機能異常に関する国際共同研究組織（ＣＯＶＡＤＩＳ）診断基準を使用してＣＭＤを定義した^２０Ａ。これらの生理学的基準には、アデノシンへの異常な応答［微小血管抵抗指数（ＩＭＲ）の上昇（≧２５）および／または異常なＣＦＲ（＜２．０）］が含まれた。さらにＣＭＤには、アセチルコリン（ＡＣｈ）誘発の間の微小血管攣縮［狭心症症状の再現、虚血性の心電図の変化（≧１ｍｍのＳＴ部分偏位）かつＡＣｈ検査の間＜９０％の心外膜冠動脈攣縮］を有する対象が含まれた^２２Ａ。冠微小血管機能障害は、心外膜血管攣縮と頻繁に関連するため、アデノシン評価の間の異常な血管反応性（異常なＩＭＲおよび／またはＣＦＲ）ならびにＡＣｈ誘発の間の共存する心外膜血管攣縮を有する患者はＣＭＤ群内に含まれた。

血流予備量比を測定し、血流制限のあるＣＡＤを心筋虚血の代替的な説明であるとして除外した（ＩＮＯＣＡ対象は標的動脈においてＦＦＲ＞０．８０を示した）。

ｉｎ ｖｉｖｏで冠血管機能の測定
本発明者らは、ガイドワイヤに基づく冠血管機能の直接測定、それに続く薬理学的血管反応性検査を組み合わせた介入診断手順（ＩＤＰ）を使用した。特にＩＤＰは、冠血管機能［ＦＦＲ、ＣＦＲおよびＩＭＲ］のガイドワイヤに基づく測定、それに続くＡＣｈおよび三硝酸グリセリン（ＧＴＮ）による薬理学的血管反応性検査を含み、以前に記載されている^{１９Ａ、２３Ａ}。

簡潔には、アデノシンを静脈内注入（１４０μｇ ｋｇ^－１ 分^－１）で太い末梢静脈を介して投与し、標的時間を１８０秒として少なくとも９０秒間、定常状態の最大充血を誘導した。圧力温度感知ガイドワイヤを主要心外膜冠動脈の遠位３分の１（典型的に左前下降枝）に配置した。心筋ＦＦＲを、最大充血時の平均遠位冠動脈圧の平均大動脈圧に対する比によって計算した。ＦＦＲ≦０．８０を異常および血流制限のあるＣＡＤの徴候とみなした^２４Ａ。冠血流予備能は、安静時平均通過時間を充血時平均通過時間で除したものとして、熱希釈を使用して計算した^２５Ａ。ＣＦＲ＜２．０を、血管拡張予備能の機能不全を表す異常と定義した^２６Ａ。ＩＭＲは、平均充血時通過時間と充血時の平均遠位冠動脈圧の積として計算した^２７Ａ。ＩＭＲ≧２５を異常および微小循環抵抗の増加の徴候と定義した^２８Ａ。

これらの侵襲的パラメータは、専用のソフトウェア（Ｃｏｒｏｖｅｎｔｉｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してリアルタイムで同時に導出した。本発明者らは、ガイドカテーテルを介した０．１８２、１．８２および１８．２μｇ／ｍＬ（それぞれ１０^－６、１０^－５および１０^－４ｍｏｌ／Ｌ）の濃度のＡＣｈの冠動脈内注入を、機械的注入ポンプを介して１ｍＬ／分で２分間にわたって使用して内皮依存性冠血管運動機能を評価した^２９Ａ。ＡＣｈのボーラス（ＡＣｈの１００μｇのボーラス；１０^－４ｍｏｌ／Ｌを２０秒かけて５．５ｍＬ）の間にＣＭＤ（例えば、異常なＣＦＲおよび／またはＩＭＲ）を有したが、共存する心外膜血管攣縮を有さなかった患者をＣＭＤ群とみなした^３０Ａ。非内皮依存性血管拡張を評価するために、手動の冠動脈内ボーラス注射によって３００μｇのＧＴＮを投与した。詳細な方法は、付録のオンラインの補足資料に報告される。

血液および組織分析
冠動脈機能検査（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｅｕｒｏｐｅ、Ａｂｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）日に得た血液を使用して血清ＥＴ－１を決定した。血液は、一晩の絶食後に横臥位にある参加者から得た。

侵襲的冠動脈機能評価の４週間以内に、臀部の皮下脂肪生検を受けることを志願した患者に末梢血管機能のｅｘ ｖｉｖｏでの薬理学的評価を実施した。生検は、リドカイン（２％）による局所麻酔を使用して滅菌条件下で得た。光学顕微鏡を使用し、末梢抵抗小血管（＜４００μｍ）を新鮮な生検から慎重に切除した。約２ｍｍ長の血管を４０μｍのステンレス鋼ワイヤに取り付け、生理食塩溶液が充填された多チャネルミオグラフチャンバ（ＤＭＴ、デンマーク）で等尺性ミオグラフィーを行った。ワイヤミオグラフィー技術を直接使用して等尺性張力の記録を続けて行い、ＢＱ１２３またはジボテンタンのいずれかのＥＴ_Ａ受容体アンタゴニスト（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ＵＫ；Ｏｐｅｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）の存在下または非存在下の、ＥＴ－１に対する対になった累積濃度応答曲線（ＣＣＲＣ）によって末梢抵抗小動脈を研究した。この血管生物学サブ研究は、この学術誌で以前に公開されたＩＮＯＣＡ対象における本発明者らの研究の延長であった^３１Ａ。詳細な方法は、付録のオンラインの補足資料に記載される。

ＥＴ－１に対する末梢血管感受性（ｐＥＣ_５０）およびＥＴ－１に対する最大血管収縮（Ｅ_ｍａｘ）を決定した。アンタゴニスト研究では、個体からの対になった血管でＢＱ１２３の親和性（Ｋ_Ｂ）を最初に決定し、シルド回帰を使用して計算した。異なる遺伝子型を有する患者が臨床的に使用されるＥＴ_Ａアンタゴニストに同様に十分に応答する可能性があるかどうかを示すものとして、ｐＫ_Ｂ（－ｌｏｇ_１０Ｋ_Ｂ）値を各遺伝子型間で比較した。最終的な一連の実験は、高度に選択的なＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストであるジボテンタンの存在下および非存在下でのＥＴ－１のＣＣＲＣを使用してｐＫＢ値を決定し、ジボテンタンが確立されたＥＴ－１媒介性血管収縮を逆転させることができるかどうかを評価する、対になった血管による実験を含んだ。

心臓磁気共鳴画像法および虚血検査のプロトコール
指標冠動脈血管造影の６週間以内に、静脈内アデノシン（１４０μｇ／ｋｇ／分）を用いた薬理学的負荷検査を使用する、１．５Ｔでの定量的灌流心臓磁気共鳴（ＣＭＲ）画像法を受けるように患者を前もって募った。標準化されたＣＭＲプロトコール（Ｓｉｅｍｅｎｓ ＭＡＧＮＥＴＯＭ Ａｖａｎｔｏ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＣＭＲ研究を実施した。ＣＭＲスキャンは、診断所見および遺伝子型に対して盲検化された欧州心血管画像学会（ＥＡＣＶＩ）のレベルＩＩＩ認定を有する２名の熟練の観察者（Ｄ．Ｃ．、Ｃ．Ｂ．）によって判断された。負荷時および安静時灌流の原画像を、誘導性または固定灌流欠損について定性的に評価した。灌流は、正常、異常または不確定のいずれかに分類された。灌流欠損が存在する場合、心外膜、微小血管または不確定パターンを有すると報告された。灌流欠損は、次いでアメリカ心臓協会の１６セグメントモデル^３２Ａによるセグメントベースで報告され、灌流欠損の貫壁性（＜５０％または＞５０％）および定性的に異常な灌流が明確にされたセグメントの数によって分類された。標準化された基準に基づき、ｄａｒｋ ｒｉｍアーチファクトを判定した^３３Ａ。

次に、初回循環灌流画像を後処理し、定量的な灌流の画素マップを導出し、絶対的な心筋血流および心筋灌流予備能（ＭＰＲ）を導出した（オンラインの補足資料にさらに詳しい）^３４Ａ。

ブルースプロトコールを使用したトレッドミル運動負荷心電図を、侵襲的冠動脈血管造影法に先立ちこの手順のために臨床的背景に基づいて事前選択された患者の部分群から分析した。本発明者らは、心血管予後の有用性が確立された、立証された測定基準であるデュークトレッドミルスコア（ＤＴＳ）を使用した^３５Ａ。運動トレッドミル試験の分析は、（ｉ）運動継続時間ならびに（ｉｉ）遺伝子型および侵襲的生理学に対して盲検化された心臓病学研究者（ＥＹ）によるＤＴＳ^３６Ａを含んだ。ＤＴＳは、トレッドミル運動検査の間の狭心症の発生、試験の間のＳＴ部分下降および最大運動継続時間（または達成されたタスクの代謝等量）に基づく。詳細には、ＤＴＳは分単位の最大運動時間－（５ 運動中または後のｍｍ単位での最大の正味ＳＴ部分偏位）－（４ トレッドミル狭心症指数（０＝狭心症なし、１＝非制限狭心症、２＝運動を制限する狭心症）に等しい。

すべての対象に、ＣＭＲ検診前２４時間カフェインを含む飲料または食品を控え、４８時間血管作動薬を控えるよう求めた。すべてのスキャン取得物を空間的に共位置合わせした。すべてのＣＭＲ分析は、レベル３のＥＡＣＶＩ １１０認定を有する盲検化された分析者によって実施された。

統計分析
本発明者らの研究の主要仮説は、イントロン性ＥＴ－１遺伝子エンハンサーであるｒｓ９３４９３７９－Ｇの存在によって反映されるＥＴ－１遺伝子発現の調節が、ＣＭＤの侵襲的試験と関連するというものであった。本発明者らは、オッズ比（ＯＲ）およびその９５％信頼区間（ＣＩ）を計算することにより、侵襲的冠血管反応性検査で遺伝子型（ＳＮＰ ｒｓ９３４９３７９Ｇ－Ａ対立遺伝子状況）とＣＭＤの関連を試験した。以前の心臓イベントを含む全体的な心臓リスク（ＡＳＳＩＧＮスコア）について調整する多変数ロジスティック回帰を使用し、遺伝子型がＣＭＤ（冠動脈内ＡＣｈおよび／または全身アデノシンに対する異常な応答によって定義される）と独立に関連するかを決定した^３７Ａ。

カテゴリーデータはパーセンテージとして提示され、連続パラメータは平均と標準偏差値または中央値と四分位範囲として示される。二次分析では、対象を３つの遺伝子型群に分けた。クラスカル・ウォリス検定を使用し、ノンパラメトリック変数の分布が群間で同じであるか試験した。Ａ対Ｇ遺伝子型の部分群分析を事前に決定し、２つの最も差がある群間の差を評価した。従属変数として血清ＥＴ－１を用い、共変量として年齢、性別、ボディマス指数、遺伝子型および心血管リスクならびに可能性のある交絡因子について調整された共分散分析を使用して導出された血清ＥＴ－１レベルの最小二乗（ＬＳ）平均を群間で比較した。連続パラメータの線形傾向を表すＰを用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびカテゴリー変数の線形・線形検定を表すＰを用いたχ２検定により、微小血管疾患の侵襲的および非侵襲的測定基準の線形関連を実施した。Ｐｒｉｓｍ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＳＰＳＳ２５．０（ＳＰＳＳ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、２０ ＵＳＡ）を用いて統計分析を実施した。

結果
Ｓｃｏｔｌａｎｄ西部の約２５０万人の集団に対応する２つの病院で、２０１６年１１月２５日から２０１７年１２月１１日の間に狭心症を有する３９１名の患者を前もって登録した（ＣｏｒＭｉｃＡ：ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０３１９３２９４）^１９Ａ。侵襲的冠動脈血管造影法により、２０６名（５３．７％）の参加者で閉塞性疾患が明らかになり、さらなる研究から除外された。閉塞性冠疾患を有さない１５１名の参加者が研究を継続した（図１２、表２）。侵襲的冠血管反応性検査を受けた１５１名の対象のうち、１０９名（７２％）にＣＭＤのエビデンスが見出された（表３）。研究および調査の概要が表１２に例示される。ベースラインの静脈血液試料を使用し、１４０名の対象（９３％）で遺伝子分析を完了した。この分析での患者の平均年齢は６１．１±１０．１歳である。女性が多数であり［１０３名（７４％）］、２５％（±２０）の心血管イベントの推定１０年リスク（ＡＳＳＩＧＮ）が確認された。

ｒｓ９３４９３７９の遺伝子型分布は、ＡＡ（Ｎ＝５０、３６％）、ＡＧ（Ｎ＝５１、３６％）およびＧＧ（Ｎ＝３９、２８％）であった。このＳＮＰは、遺伝子型の生物学的確認を反映するハーディー・ワインベルグ平衡（Ｐ＝０．００１５）に適合しなかった。１４０名の対象が（ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子）についての遺伝子分析を受け、対立遺伝子頻度は４６％であった（１２９／２８０個の対立遺伝子）。対立遺伝子頻度は、ゲノムバンクの対照対象［ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子頻度３９％（５５５１／１４３８０）；ｘ^２＝６．１５、Ｐ＝０．０１３］のものと比較して、本発明者らの狭心症コホートで増加した^２１Ａ。ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子は、２倍を超えるＣＭＤのオッズと関連した（ＯＲ２．３３、９５％ＣＩ １．１０～４．９６；Ｐ＝０．０２７；図１３Ａ）。Ｇ対立遺伝子を有する対象は、循環血清ＥＴ－１濃度が高かった（ＬＳ平均１．５９ｐｇ／ｍＬ対１．２８ｐｇ／ｍＬ；差０．３１ｐｇ／ｍＬ；０．１０～０．５２；Ｐ＝０．００５；図１３Ｂ）。侵襲的インテロゲーションでは、Ｇ対立遺伝子が増えるごとにＣＭＤと線形に関連した（図１４Ａ；Ｐ＝０．０２１）。多変数分析では、Ｇ対立遺伝子は依然としてＣＭＤと関連した（Ｇ対立遺伝子あたりのＯＲ２．３１；１．０８～４．９１；Ｐ＝０．０３０）。

微小血管機能障害の診断的サブタイプを考慮すると、大部分がアデノシンによるインテロゲーションの間にＣＭＤを有し（７３％で異常なＣＦＲおよび／またはＩＭＲ）、遺伝子型決定された集団の２７％のみが孤立性微小血管攣縮（ＡＣｈのみに対する孤立性ＣＭＤ）を有した。冠血管拡張予備能の機能不全によって反映されるように、遺伝子型とＣＭＤとの間に統計的に有意な関係が存在した（異常なＣＦＲ：ＡＡ２０％、ＡＧ３５％およびＧＧ４１％；図１４Ｂ；Ｐ＝０．０３０）。各遺伝子型の異常な微小血管抵抗の有病率に関して同様の関係が認められた（異常なＩＭＲ：ＡＡ２４％、ＡＧ３３％およびＧＧ４６％；図１４Ｃ；Ｐ＝０．０２９）。冠血流予備能は、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子が増えるごとに線形に減少した［ＡＡ３．０（２．１～３．７）；ＡＧ２．７（１．８～３．５）；ＧＧ２．１（１．７～３．２）；全体Ｐ＝０．０４６；図１４Ｄ；表３］。最大リスク群（ＧＧ）は、ＡＡ群より顕著に低いＣＦＲを有した（中央値の差０．８４、９５％ＣＩ ０．１～１．１）。異常な侵襲的ＡＣｈ応答の有病率は、群間で有意に異ならなかった（Ｇ対立遺伝子有り３６％対Ｇ対立遺伝子なし３０％、Ｐ＝０．４６３）。ＡＣｈに対する孤立性ＣＭＤ（微小血管攣縮）を有する患者は、有さない患者と同様のＥＴ－１レベルを有した（１．３３ｎｇ／ｍＬ対１．２８ｎｇ／ｍＬ；Ｐ＝０．７６９）。最大の血清ＥＴ－１レベルは、ＣＦＲとＩＭＲの両方で一致した異常を有する対象で見られ、ＣＭＤの指標が１つのみの対象と比較して線形の段階的な低減を伴い、異常を有さない対象で最低であった［平均１．６７ｎｇ／ｍＬ（両方）対１．３９ｎｇ／ｍＬ（１つ）対１．３１ｎｇ／ｍＬ（なし）；Ｐ傾向＝０．０４１］。

冠動脈アテローム性動脈硬化の程度（または負荷量）を反映するＧｅｎｓｉｎｉ血管造影スコアは、ＡＡ群［中央値のスコア０．０（０．０～２．０）；Ｐ＝０．０３７；表３］と比較してｒｓ９３４９３７９－ＧＧ群［中央値のスコア１．０（０．０～６．０）］で高かった。このＩＮＯＣＡ患者集団で予想され得るように、心外膜ＣＡＤの生理学的負荷量は群間で同様であった［心筋ＦＦＲ、ＡＡ０．８８（±０．０５）；ＡＧ０．８８（０．０６）；ＧＧ０．８８（±０．０５）；Ｐ＝０．９７７］。
１０７名の対象が、侵襲的血管造影の６週間以内にアデノシン負荷灌流心臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を受けた。４６名（４３％）の患者がＣＭＤに起因する心筋灌流の心内膜下の円周方向の異常のエビデンスを有した（表３）。ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子は、負荷灌流ＭＲＩによって明らかにされた異常な心筋灌流と関連した（ＡＡ３１％、ＡＧ４３％、ＧＧ５６％；Ｐ＝０．０４２、図１５Ａ）。遺伝子型とＣＭＤの関連は、ＭＲＩによって明らかにされた円周方向の心内膜下灌流欠損またはＣＭＤの侵襲的エビデンスのいずれかを有する対象を考慮すると、さらにロバストであった（ＡＡ６５％、ＡＧ８５％、ＧＧ９１％；Ｐ＜０．００１；図１５Ｂ）。絶対的な全体および心内膜下灌流予備能（ＭＰＲ）は、Ｇ対立遺伝子ごとに数値が低下した。しかし、差は統計的に有意ではなかった（表３；図１５ＣおよびＤ）。

次に、運動トレッドミル検査、冠血管機能の侵襲的測定および遺伝子型の間の関係を評価した。９０名の対象が、侵襲的冠動脈血管造影法に先立ち標準医療の診断精密試験の間に運動トレッドミル検査を前もって完了し、これらの対象のうち８４名が研究に含まれ、残りの患者は遺伝子型データの欠如のために除外された。平均運動継続時間は３６７秒（±１５６秒）であり、群間で同様であった（表３）。平均ＤＴＳは－１．０（±５．３）単位であった。ＣＭＤの存在はＤＴＳの低下と関連した（ＣＭＤ－２．３対ＣＭＤなし＋３．５；差－５．８単位、９５％ＣＩ －８．２～－３．３；Ｐ＜０．００１；図１５Ｅ）。

全体的に、ＣＭＤの存在とＤＴＳの間に中等度の逆相関が存在した（スピアマンのｒｈｏ＝－０．４２；Ｐ＜０．００１）。遺伝子型とＤＴＳの両方が入手可能であった８４名の患者のコホートを考慮すると、ＥＴ－１遺伝子の増強による虚血の増加と一貫して、Ｇ対立遺伝子が増えるごとにＤＴＳが低下した。ＡＡ群と比較した高リスク対象（マイナーＧ対立遺伝子についてホモ接合性）の事前分析により、ＤＴＳの－３．０単位の平均差が明らかになった（９５％ＣＩ －５．８～－０．１；Ｐ＝０．０４５）（図１５Ｆ）。

連続ＤＴＳと遺伝子型の間に、統計的に有意でないわずかな相関が存在した（スピアマンのｒｈｏ－０．２１；Ｐ＝０．０５５）。運動中の狭心症指標は、Ｇ対立遺伝子状況と線形に関連した（非制限または制限狭心症 ＡＡ５９％対ＡＧ６８％対ＧＧ８７％；Ｐ傾向＝０．０３６）。運動時間は、Ｇ対立遺伝子を有する対象の間で有意に低下しなかった（３６５対３９２秒；Ｐ＝０．４２３）。

６８名の遺伝子型決定された対象が血管生物学サブ研究への参加に同意し、冠動脈血管造影法の４週間以内の臀部皮下生検について書面によるインフォームドコンセントを提供した。生検を行うことを志願した対象は、サブ研究への参加を辞退した対象と年齢および心臓リスクが同様であった［生検参加者の平均年齢６２±９歳対６１±１１歳（Ｐ＝０．１３４）、ＡＳＳＩＧＮスコア２３％±１８対２８％±２３（Ｐ＝０．１９８）］。これらの患者のうち４４名（６５％）が、ＢＱ１２３またはジボテンタン（ＺＤ４０５４、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）のいずれかのＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストの存在下および非存在下での、ＥＴ－１に対する対になったＣＣＲＣに供するのに十分な数の小動脈を有する生検を有した。

遺伝子型による群分け（ＡＡ、ｎ＝１６；ＡＧ、ｎ＝１４；ＧＧ、ｎ＝１４）およびＡＣｈに対する血管拡張応答（ＡＣｈ Ｅ_ｍａｘ）は同様であった（表４）。同様に、血管は同様のＥＴ－１に対する効力（ｐＥＣ_５０ ＡＡ９．３４、ＡＧ９．４５およびＧＧ９．３２；Ｐ＝０．５３３）およびＥＴ－１に対する最大血管収縮（Ｅ_ｍａｘ ＡＡ１２２．３％、ＡＧ１１５．５％、ＧＧ１２９．７％；Ｐ＝０．５３３；図１６Ａ；表４）を有した。特に、選択的ＥＴＡ受容体アンタゴニストであるＢＱ１２３は、ＣＣＲＣの平行の右方向のシフトをもたらし、ＡＡ、ＡＧおよびＧＧ群間で同等のｐＫ_Ｂ値を有した［それぞれ７．０７（±０．２３）、７．７９（±０．３５）および７．４１（±０．２６）のｐＫ_Ｂ値；Ｐ＝０．２０９；図１６Ｂ］。高度に選択的な経口活性ＥＴＡ受容体アンタゴニストであるジボテンタンは、ＥＴ－１に対する収縮応答を減弱させ、ｐＫ_Ｂは７．５４（９５％ＣＩ ７．２７～７．８２）でＢＱ１２３のもの、ｐＫ_Ｂ７．５３と同等であった（９５％ＣＩ ７．３７～７．６９）。

重要なことに、これらの研究により、ジボテンタンがＥＴ－１に対する確立された収縮応答の濃度依存的阻害をもたらし、かつ依然としてＧ対立遺伝子を有する対象で効果的であったことが確認された（Ｐ＜０．００１；図１６Ｃ）。図１７は、従来の心血管リスク因子を少ししか有さないが、高リスクのＥＴ－１エンハンサー遺伝子型（ＧＧ）を有する女性対象からの代表的な調査を示す。

考察：本発明者らは、ＣＭＤの新規の遺伝的リスク遺伝子座を特定する。本発明者らの研究は、動脈血管運動との遺伝子型の関連に関するＷＩＳＥ調査員からの報告を拡張する^１３Ａ。本発明者らの結果は、ＥＴ－１／ＥＴ_Ａ受容体系の調節不全が冠微小循環における異常の基盤となり、心筋虚血をもたらすという仮説を支持する。第１に、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子状況は、狭心症を有するが閉塞性冠疾患を有さない患者における血清ＥＴ－１の増加ならびにＣＭＤの存在および程度に関連する。第２に、遺伝子多型は、運動負荷心電図および負荷灌流ＣＭＲを含む、顕著に異なる非侵襲的モダリティーを使用する虚血検査に関連する。第３に、本発明者らは、ｅｘ ｖｉｖｏでヒトの末梢抵抗小血管において、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子を有する患者におけるエンドセリン遺伝子発現の増加およびＥＴ－１活性の存在下で、ＥＴ_Ａ血管収縮応答が下方調節されないことを実証する。最後に、本発明者らは、経口活性の高度に選択的なＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストであるジボテンタンの、確立されたＥＴ－１媒介性血管収縮の逆転における役割を支持する概念実証となる機構的データを提供する。ジボテンタンがこの患者集団における新規の疾患修飾療法としてリポジショニングに利用可能であるため、これらの所見は潜在的な臨床的関連性を有する。本発明者らの研究結果は、ＳＮＰ ｒｓ９３４９３７９の遺伝子検査を含む「微小血管狭心症におけるジボテンタンによる精密医療（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｚｉｂｏｔｅｎｔａｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｎｇｉｎａ）（ＰＲＩＺＥ）」試験および関連付けられる療法（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０４０９７３１４）の根拠を支持する。

エンドセリン調節不全：ＣＭＤの実験モデルでの前臨床研究は、心臓でのＥＴ－１産生の増加が内皮調節不全、ｒｈｏキナーゼおよびスーパーオキシドなどの反応性酸化種の血管発現の増強、ならびにＥＴ－１媒介性血管収縮の増強をもたらすことを暗示する^３８Ａ。狭心症を有するが閉塞性ＣＡＤを有さない患者において、微小血管調節不全は、末梢内皮調節不全および末梢小血管血管収縮の増強を特徴とする全身性の現象である^{３１Ａ、３９Ａ}。さらに、冠微小血管機能の機能不全および心筋虚血の傾向は、主要有害心臓イベントの長期的なリスクを増加させる可能性がある^{４０Ａ、４１Ａ}。

将来の第ＩＩ相研究を要する臨床解釈の潜在性が高いジボテンタンを使用したため、本発明者らの研究は顕著であり、微小血管狭心症におけるＥＴ－１の本発明者らの以前の血管研究をさらに強化する^３１。加えて、対象はＣＭＤの有無ではなく、ＥＴ－１のｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子状況によって分析された。ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子状況によって反映されるように、ＥＴ－１の増加した循環濃度への長期的な曝露は、微小血管狭心症を有する患者でＥＴ_Ａ媒介性ＥＴ－１血管収縮に対する下方調節をもたらさなかったことが観察された。逆ＳＮＰ（ｒｓ９３４９３７９－Ａ）は、典型的にアテローム性動脈硬化を有さない患者で生じる特発性冠動脈解離（ＳＣＡＤ）に関連することが近年見出されている^２１Ａ。この所見は、特に微小血管機能はＳＣＡＤにおいて典型的に正常であることを考慮すると、本発明者らの研究と一致する^４２Ａ。

本発明者らは、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子が血清ＥＴ－１レベルの上昇と関連したことを示し、これはＳＮＰが健康な対象においてＥＴ－１およびその前駆体（ビッグＥＴ－１）レベルの上昇と関連するという以前の研究と一致する。興味深いことに、本発明者らのＩＮＯＣＡ集団におけるＥＴ－１血漿濃度は、肺動脈高血圧を含む他の状態におけるＥＴ－１血漿濃度と同等であるが^４３Ａ、他のＩＮＯＣＡコホートにおける濃度より低い^４４Ａ。本発明者らは、内皮細胞から下部の血管平滑筋へのＥＴ－１の反管腔側分泌は、ＥＴ－１の循環濃度が血管組織におけるＥＴ－１活性の不完全な尺度であることを意味すると認識している^４５Ａ。循環ＥＴ－１の長期的な上昇により、その内在性Ｇタンパク質共役受容体の適応的下方調節がもたらされる可能性がある。この現象は、除去機能を有するＥＴ_Ｂ受容体がノックアウトされたマウスにおけるＥＴ_Ａ受容体で説明されている^４６Ａ。血圧を含む心血管リスク因子は、本発明者らの集団ではｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子と関連しなかったが、さらに大規模な集団では逆関連が観察されている^１７Ａ。これは、アテローム発生およびＣＡＤとのその関連を考慮すると、特に興味深い。健康な集団における過剰なＥＴ－１効果は、ＥＴ_Ｂ誘導性一酸化窒素およびプロスタサイクリン産生、結果として生じる血管拡張、利尿およびナトリウム利尿を介して血圧低下を媒介すると考えられている^４７Ａ。本発明者らの研究は、高血圧の治療によって交絡される可能性もあるベースラインの血圧の有意差を決定するには力不足であった。

微小血管狭心症は、満たされていない治療必要性を有する長期的な消耗性状態である。本発明者らの血管薬理学所見は、ＥＴ－１の循環濃度への曝露の生涯にわたる増強をもたらす可能性がある、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子状況に基づくエンドセリン遺伝子発現が増強する遺伝的傾向にもかかわらず、ＥＴ－１応答に対する正味の効果またはＥＴ_Ａアンタゴニストへの感受性は、ｒｓ９３４９３７９対立遺伝子状況別の群間で同様であったことを示す。ＥＴ_Ａ受容体は、罹患患者で下方調節されない可能性があり、ジボテンタンなどの選択的ＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストによる治療による健康上の利益に対する潜在性が向上する。重要なことに、ＢＱ１２３はすべての群において収縮応答を完全に遮断した。本発明者らの血管薬理学研究は、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子状況、ＥＴ－１血管作用性応答とＥＴ_Ａ受容体遮断との間の関係に特に焦点を置いた。微小血管狭心症を有する患者は、経口ＥＴ_Ａ受容体遮断薬療法に対して同様の組織応答を示す可能性があり、この重要な可能性はさらに評価に値する（ＮＣＴ０４０９７３１４）。

微小血管狭心症を有する患者における機構的無作為化対照試験において、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＧｏｕｌｄ^４８Ａは、ＥＴ_Ａ受容体の拮抗作用によって安静時心筋灌流の均一性が増加した（向上した）ことを報告している。この研究は、心臓の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用して均一性指標（ＰＥＴに由来する均一性の視覚的な見解）を定量した^４９Ａ。Ｋａｓｋｉ ｅｔ ａｌ．^５０Ａは、微小血管狭心症を有する患者がＥＴ－１の増加した循環濃度に曝露され、これがひいては冠血管抵抗の増加および冠血流の機能不全に関連したことを示している。近年、Ｔｈｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．^５１Ａは、３２名のＩＮＯＣＡ患者において血漿ＥＴ－１が侵襲的ＣＭＤと関連することを示したが、この関係はＣＦＲの機能不全ではなく微小血管抵抗の上昇によって引き起こされるものであった。

限界：本発明者らは、機能的ＳＮＰがＣＭＤに関連付けられるという説得力のある機構的エビデンスを説明する。本発明者らは、ＣＭＤ分類のための受け入れられているガイドラインに従ったが、いずれの分類システムにも注意事項が存在することが認識され、それらを認めることもこの研究に重要である。第１に、本発明者らはＩＤＰ試験についてバイナリカットオフを採用した。不確定（グレーゾーンまたはボーダーライン）試験結果によって一部の患者が誤判別された可能性がある。さらに、ＣＭＤを有する患者は異質性であり、異なる種類の微小血管機能障害、例えば血流予備能の機能不全、微小血管抵抗の増加、異常なＡＣｈ応答を有する患者が統合された。それにもかかわらず、罹患患者の血管表現型は、全身アデノシンの間の異常な冠微小血管応答、冠動脈内ＡＣｈに対する異常な血管運動応答またはその両方のための総合指針に基づく冠血管機能障害のものであった^６Ａ。このアプローチの裏付けとして、本発明者らはＣＭＤと運動トレッドミルによる非侵襲的虚血検査との間に高度な線形関係を観察した（図１５Ｆ）。さらに、多くの同様の心血管障害、例えば駆出率が保持された心不全を考慮した場合、異質性は例外ではなく標準である^５２Ａ。ＣＭＤの種類、すなわち構造的微小血管疾患（すなわちＩＭＲの上昇）および血管拡張予備能の機能障害（ＣＦＲの低下）別の本発明者らの層別化感受性分析（表３）により、本発明者らの橋渡し研究の設計がさらに支援される。第２に、すべての患者がトレッドミル運動検査を受けたわけではない。

試験は、中央検査室（ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ではなく標準医療および臨床試験の一部として示され、分析のための報告が入手可能であった。それにもかかわらず、試験はブルース（Ｂｒｕｃｅ）のプロトコールに従って実施され、結果はｒｓ９３４９３７９対立遺伝子状況に対して盲検化された標準化された方法で決定された。トレッドミル運動検査は虚血の不完全な尺度であるため、ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子と心外膜ＣＡＤの既知の関連は交絡因子であることが妥当と思われる。ＧｏｕｌｄおよびＪｏｈｎｓｏｎ^５３Ａは近年、入口部分枝血管のフラッシュ閉塞が、狭窄を伴わない視覚的に「正常の」血管造影にもかかわらず生じる虚血をどのように説明できるかについて強調している。一方で、ＤＴＳにはＣＭＤ患者における有用性が実証された発達した関連文献が存在する^{５４Ａ、５５Ａ}。標本サイズが比較的小規模であり、ベースラインの差が測定されない可能性があることから、第１種の過誤の可能性が増大する。第３に本発明者らは、経橈骨動脈アクセス、冠動脈造影法および侵襲的冠血管反応性検査に関する手順の安全性を促進するために、短時間作用ＧＴＮ（１００～２００μｇ）の用量を動脈内投与した。理論的に、ＧＴＮはＡＣｈに対する血管応答に影響を及ぼし得る；しかし、ＧＴＮの半減期はおよそ２分である。したがって、１０分後にはＧＴＮ用量の３％しかバイオアベイラブルでなく、微小血管の血管攣縮についての交絡および偽陰性試験の潜在性は低いと考えられる。

反対に、陽性のＡＣｈ試験は真の安静時血流の評価と交絡し、偽のＣＦＲ低下を導く可能性があるため、本発明者らはアデノシン評価後のＡＣｈ検査を支持する。最後に、本発明者らはＳｃｏｔｌａｎｄからの本発明者らのコホート内の対立遺伝子有病率を、プールされた他施設の最新医療ゲノム参照対照群と比較した。本発明者らの研究は、本発明者らの対象と同じ地域および民族背景からの対照比較群によって強化された可能性がある。さらに、ＳＮＰは集団全体でハーディー・ワインベルグ平衡を満たさなかったが、ＣＭＤを有さないこの研究からの対照群は平衡と一致した（ｘ^２２．９９、Ｐ＝０．０８４）。ＣＭＤ群では、目的のｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子とのその関連のためにＨＷが満たされなかったとするのが妥当である。この研究は単一の遺伝子座の断面分析であり、臨床的に興味深い関連のある所見を提供するが、他の重要な遺伝的リスク決定因子を見落とす場合がある。

臨床解釈：特に小規模な標本サイズおよび異質性の患者集団を考慮すると、これらの観察は仮説生成型である。所見は他のＣＭＤコホートにおける外部検証を必要とし、一方で異なる領域からの集団での将来の研究が有用な背景をもたらす可能性がある。全体的に本発明者らの研究は、心臓の微小血管疾患を有する患者におけるＥＴ_Ｂのモジュレーションとは顕著に異なる選択的なＥＴ_Ａ遮断に対する論拠を支持する。経口ＥＴ_Ａ選択的遮断薬は、微小血管の血管攣縮の傾向を減弱させ、冠血流を増加させ、さらにＮＯ媒介性放出によって冠動脈の内皮機能を向上させることによって治療潜在性を示す^５６Ａ。ジボテンタンは、すべての経口活性ＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストの中で最もＥＴ_Ａ選択的であるとして有望な１つの化合物であり、そのため微小血管狭心症に使用するのに特に適する。患者における選択的ＥＴ_Ａ受容体アンタゴニスト療法を使用する、遺伝子型に基づく標的化アプローチがＰＲＩＺＥ試験で評価されている（ＮＣＴ０４０９７３１４）。

結論：本発明者らは、ＣＭＤの遺伝的リスク遺伝子座を特定した。一般的な遺伝子多型（ＳＮＰ ｒｓ９３４９３７９－Ｇ対立遺伝子）は、狭心症を有するが閉塞性ＣＡＤを有さない対象におけるＥＴ－１の増加、および虚血の侵襲的ＣＭＤと非侵襲的試験の両方と関連した。機構的ｅｘ ｖｉｖｏ研究により、この機能的対立遺伝子を有する対象がＥＴ_Ａ受容体遮断に対する保持された応答を示すことが確認された。経口活性ＥＴ_Ａ受容体アンタゴニストであるジボテンタンは、確立されたＥＴ－１媒介性血管収縮を逆転させた。この研究は狭心症患者に希望をもたらすが、ＣＭＤがＥＴ_Ａアンタゴニスト療法の潜在的な新規の疾患サブタイプであるかどうかを決定するには将来の試験が必要である。

参考文献
本発明および本発明が属する最新技術をより詳細に記載し開示するために、多数の刊行物が上記で列挙される。これらの参考文献の完全な列挙を以下に提供する。これらの参考文献のそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる。

番号付き参考文献（実施例５を除く）

実施例５の番号付き参考文献

標準分子生物学技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ．Ｗ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ３ ｅｄ． ２００１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

Claims (16)

1. ＩＮＯＣＡを有する患者において狭心症を治療する方法であって、患者にジボテンタンを投与することを含む方法における使用のためのジボテンタン。
2. ＩＮＯＣＡが微小血管狭心症である、請求項１に記載の使用のためのジボテンタン。
3. 患者が、薬理学的プローブと組み合わせた診断用ガイドワイヤを使用して患者の心臓の微小血管抵抗指数（ＩＭＲ）、冠血流予備能（ＣＦＲ）、抵抗予備能比（ＲＲＲ）またはアセチルコリン（ＡＣｈ）血管反応性を測定することにより治療のために選択されている、請求項１または請求項２に記載の使用のためのジボテンタン。
4. 患者が、患者の心臓における冠微小血管機能障害の存在を定量／診断するための負荷灌流ＭＲＩを使用して治療のために選択されている、請求項１または請求項２に記載の使用のためのジボテンタン。
5. 患者が、患者のゲノムのｒｓ９３４９３７９遺伝子座の検出を含む方法によって治療のために選択されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのジボテンタン。
6. ｒｓ９３４９３７９遺伝子座がＧ対立遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である、請求項５に記載の使用のためのジボテンタン。
7. 標準化されたトレッドミル試験において測定される患者の平均運動継続時間が治療後に増加する、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのジボテンタン。
8. 狭心症の重症度が、狭心症がＣＣＳ狭心症分類スケールのより下位のクラスに入るとみなされるように低減する、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのジボテンタン。
9. 対象の冠動脈に近位圧力センサーおよび遠位圧力センサーを有するガイドワイヤを挿入すること、近位圧力センサーが冠動脈内に位置し、遠位圧力センサーが冠微小血管内に位置するようにガイドワイヤを位置決定することによって、対象の微小血管狭心症を診断する方法であって、前記方法は、血流予備量比（ＦＦＲ）および冠血流予備能（ＣＦＲ）を測定すること、微小血管抵抗指数（ＩＭＲ）および／または抵抗予備能比（ＲＲＲ）を計算することを含み、対象がＩＭＲ＞２５および／またはＣＦＲ＜２．０および／またはＲＲＲ＜２．０である場合に微小血管狭心症と診断される、方法。
10. ガイドワイヤに付随するマイクロカテーテルまたはガイドカテーテルのいずれかによってアセチルコリン（ＡＣｈ）を冠動脈内腔に注入し、冠微小血管における攣縮を誘発する、請求項１０に記載の微小血管狭心症を診断する方法。
11. ＡＣｈが、約１０－６Ｍの注入から１００ｍｃｇのＩＣボーラスまでの範囲にわたる漸増濃度で投与される、請求項１０に記載の微小血管狭心症を診断する方法。
12. 太い末梢静脈を介してアデノシンを静脈内注入で投与し、ガイドワイヤの挿入前に定常状態の最大充血を誘導する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の微小血管狭心症を診断する方法。
13. 対象において微小血管狭心症を診断する方法における使用のためのガイドワイヤであって、前記方法は、対象の冠動脈に診断用ガイドワイヤを挿入すること、近位圧力センサーが冠動脈内に位置し、遠位圧力センサーが冠微小血管内に位置するようにガイドワイヤを位置決定することを含み、前記方法は、血流予備量比（ＦＦＲ）および冠血流予備能（ＣＦＲ）を測定すること、微小血管抵抗指数（ＩＭＲ）および／または抵抗予備能比（ＲＲＲ）を計算することを含み、対象がＩＭＲ＞２５および／またはＣＦＲ＜２．０および／またはＲＲＲ＜２．０である場合に微小血管狭心症と診断される、ガイドワイヤ。
14. ガイドワイヤまたはガイドワイヤに付随するガイドカテーテルのいずれかによってアセチルコリン（ＡＣｈ）を冠動脈内腔に注入し、冠微小血管における攣縮を誘発する、請求項１３に記載の使用のためのガイドワイヤ。
15. ＡＣｈが、約１０^－６Ｍの注入から１００ｍｃｇのＩＣボーラスまでの範囲にわたる漸増濃度で投与される、請求項１４に記載の使用のためのガイドワイヤ。
16. 太い末梢静脈を介してアデノシンを静脈内注入で投与し、ガイドワイヤの挿入前に定常状態の最大充血を誘導する、請求項１４に記載の使用のためのガイドワイヤ。
    

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