JP2022514353A - 炎症の治療方法 - Google Patents

Abstract

PRC2（polycomb repressive complex 2）メチルトランスフェラーゼEzh2（enhancer of zeste homolog 2）の阻害剤を用いて、アレルギー性炎症、リンパ球によって引き起こされる炎症、および炎症性状態（アレルギー性喘息およびアレルギー性肺炎症など）を含む炎症を治療するための方法が提供される。

Description

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分野
本開示は、一般的には、炎症、特にアレルギー性炎症の分野に関し、より具体的には、アレルギー性炎症、リンパ球によって引き起こされる炎症、および非アレルギー性喘息を治療するためのEzh2阻害剤の使用に関する。

背景
免疫システムは、ホメオスタシスを維持し、かつ病原体の攻撃から保護するように機能している。しかし、通常は無害な抗原に対する過敏反応が、喘息やアレルギー性鼻炎などのアレルギー疾患、またはループス（lupus）や1型糖尿病などの自己炎症性疾患を引き起こすことがある。残念ながら、これらの障害は有病率が増加しており、現在の治療法は症状の改善を目的としたものがほとんどで、疾患病理の原因となるリンパ球の働きを止めることを目的としたものではない。したがって、炎症カスケードを混乱させ、かつ潜在的に疾患を治癒することを目的として、そのような状況下で免疫反応を再構築するための新しい戦略が切実に求められている。

アレルギー反応の発現における免疫細胞機能の主な担い手は、CD4⁺ Tヘルパー（Th）細胞である。アレルギー性喘息の動物モデルでは、気道炎症の誘発と好酸球の動員にとってCD4⁺ T細胞の存在が絶対に必要である（Gonzalo et al., (1996) J Clin Invest 98, 2332-2345（非特許文献1））。アレルゲン特異的Th細胞は、流入領域リンパ節の樹状細胞によって活性化され、肺組織に浸潤し、サイトカインを分泌して炎症反応を統治し、悪化させる（Lambrecht, B.N., and Hammad, H. (2011). Annu Rev Immunol（非特許文献2））。いくつかのThサブセットが知られているが、このアレルギー反応を促進する主役はTh2サブセットであると考えられ、それらは、自然免疫細胞の動員、活性化をもたらすIL-4、IL-5、IL-13およびケモカインシグナルなどの重要なサイトカインを産生する。

Th表現型の相対的な安定性と可塑性を制御する因子は、免疫反応にとって極めて重要である（Allan, R.S., and Nutt, S.L. (2014). Immunol Rev 261, 50-61（非特許文献3））；Thの分化を導くシグナルと転写因子は明確に定義されているが、細胞分裂による遺伝性は主にエピジェネティックなメカニズムによって制御されているようである。コミットされた（committed）Th1およびTh2細胞では、いくつかのヒストンH3およびH4修飾のレベルと、サイトカイン遺伝子の活性またはサイレンシングとの間に相関関係が観察されている（Avni, O., et al. (2002). Nat Immunol 3, 643-651（非特許文献4））。重要なこととして、Th2細胞での安定したTh1遺伝子のサイレンシングには、Th1遺伝子のヒストンH3のリシン9（H3K9）でのメチル化とアセチル化のバランスを維持するために、Suv39h1酵素の発現が必要であることがわかっている（Allan, R.S., et al. (2012). Nature 487, 249-253（非特許文献5））。さらに、Th2アレルギー性喘息のマウスモデルでは、Suv39h1の欠損により、Th1応答への偏り（skewing）と肺病変の減少がもたらされた（Allan et al., (2012) 前記）。したがって、クロマチンへのエピジェネティックな修飾に関与する酵素を標的とすることは、アレルギー反応を引き起こすリンパ球の機能をかき乱す可能性がある。しかし、他のエピジェネティックな修飾因子または経路もアレルギー反応に関与しているかどうかは不明である。

現在の治療法は、免疫介在性障害を回復させるのではなく、症状を緩和することに主眼が置かれているため、当技術分野では免疫介在性障害の発症に介入する戦略が必要とされている。

Gonzalo et al., (1996) J Clin Invest 98, 2332-2345 Lambrecht, B.N., and Hammad, H. (2011). Annu Rev Immunol Allan, R.S., and Nutt, S.L. (2014). Immunol Rev 261, 50-61 Avni, O., et al. (2002). Nat Immunol 3, 643-651 Allan, R.S., et al. (2012). Nature 487, 249-253

開示の概要
本開示は、T細胞が炎症、特にアレルギー性炎症およびリンパ球によって引き起こされる炎症、の発症を統治するのに極めて重要であるエピジェネティック経路について本発明者らが実施した調査研究に基づいている。クロマチンへのエピジェネティック修飾に関与する酵素を標的とすることは、免疫反応を引き起こすリンパ球の機能をかき乱す可能性がある代替戦略を表している。本発明者らは、T細胞の活性化後にアップレギュレートされるエピジェネティックな遺伝子サイレンシングに関与する成分を特定し、これらの分子のインビボ不活性化を特にT細胞系統において実施した。とりわけ、本発明者らは、PRC2メチルトランスフェラーゼEzh2（enhancer of zeste homolog 2：zesteホモログ2のエンハンサー）の小分子阻害が炎症を軽減し、それゆえ炎症性障害、特にアレルギー性疾患およびリンパ球によって引き起こされる障害、を抑制するための新規標的になることを見出した。

一局面では、本開示は、対象における炎症を予防するか、炎症の1つもしくは複数の症状を軽減するか、または炎症を治療するための方法であって、PRC2（polycomb repressive complex 2：ポリコーム抑制複合体2）メチルトランスフェラーゼEzh2（enhancer of zeste homolog 2）の阻害剤を該対象に投与することを含む方法を提供する。一例として、前記方法は、アレルギー性炎症を予防、軽減、または治療する。

アレルギー性炎症とは、アレルゲンによって開始される任意の障害を指すことができる。アレルギー性炎症の非限定的な例としては、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、蕁麻疹（発疹）、ならびに食物アレルギー、薬物アレルギー、アナフィラキシー、眼のアレルギー性障害などがある。一例では、前記方法は、初期または後期のアレルギー性喘息の予防、軽減または治療に使用され得る。一例として、眼のアレルギー性障害はアレルギー性結膜炎である。

別の例では、前記方法は、リンパ球によって引き起こされる炎症を予防、軽減、または治療する。リンパ球によって引き起こされる炎症の非限定的な例としては、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患、1型糖尿病などがある。自己免疫疾患の好適な例は、COPD、全身性エリテマトーデス、1型糖尿病である。自己免疫疾患の例には、以下が含まれる：ループス（例えば、全身性エリテマトーデス）、セリアック病、急性散在性脳脊髄炎、急性運動性軸索型ニューロパチー、アジソン病、有痛脂肪症（ダーカム病）、成人スティル病（adult onset still's disease）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、自己免疫性膵炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、バロー同心円性硬化症（Balo concentric sclerosis）、ベーチェット病、ビッカースタッフ脳炎、水疱性類天疱瘡、セリアック病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、クローン病、皮膚筋炎、1型糖尿病、子宮内膜症、線維筋痛症、胃炎、巨細胞性動脈炎、グレーブス病、グレーブス眼症、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、若年性関節炎、扁平苔癬、ライム病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、視神経脊髄炎、小児急性発症神経精神症候群、心筋梗塞後症候群、乾癬、むずむず脚症候群（restless leg syndrome）、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑。

別の例では、前記方法は、非アレルギー性（例えば、内因性）喘息を予防、軽減、または治療する。

特定の例では、本開示の方法は、アレルギー性炎症の1つまたは複数の症状、例えばアレルギー性炎症、を軽減する。そのような症状には、かゆみ、鼻水、くしゃみ、涙目、気管支収縮、発疹、気道炎症、アナフィラキシー、および皮膚炎から選択される症状の1つまたは複数が含まれる。

特定の例では、本開示の方法は、リンパ球によって引き起こされる炎症の1つまたは複数の症状を軽減する。そのような症状には、気道閉塞、肺気腫、慢性気管支炎のうちの1つまたは複数が含まれる。さらに、リンパ球によって引き起こされる炎症は、炎症性サイトカイン（例えば、IL-1β、IL-8、IL-17、TNF、GM-CSF、IFY-γ）および/またはTh細胞（例えば、Th1細胞、Th17細胞）の増加と関連している可能性があり、これらは測定可能である。

Ezh2の阻害剤は、免疫グロブリン（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、siRNA、アンチセンス分子、ペプチド、または薬物（例えば、小分子阻害剤）からなる群より選択することができる。一例では、Ezh2阻害剤は、薬学的に許容される担体中に提供される。

Ezh2の小分子阻害剤は当技術分野で知られており、市販されている。本方法での使用に適し得るEzh2阻害剤の例としては、GSK126、GSK343およびGSK503、EPZ005687、EPZ-6438、EI1、CPI-1205が挙げられる。文献に記載された非市販のEzh2阻害剤も、DzNep、UNC199、SAH-EZH2、およびそれらの任意の組み合わせを含めて、本方法に適している可能性がある。しかし、Ezh2阻害剤は、上記の化合物に限定されないことを理解されたい。

一例として、前記阻害剤はEzh2に対して選択的である。他の例では、該阻害剤はEzh1とEzh2の両方の二重阻害剤である。そのような阻害剤の例はUNC1999である（Konze KD et al. ACS Chem Biol. (2013); 8(6):1324-34）。

一例では、Ezh2阻害剤は治療上有効な量で対象に投与される。対象に投与される用量は、医師によって決定され得る。いくつかの例では、Ezh2の用量は、約0.1μg～10,000mg、より典型的には約1μg/日～8000mg、最も典型的には約10μg～100μgの範囲であり得る。対象の体重の観点から述べると、典型的な投与量は、約0.1μg～20mg/kg/日、より典型的には約1～10mg/kg/日、最も典型的には約1～5mg/kg/日の範囲である。

Ezh2阻害剤は、毎日、毎週、2週間に1回、毎月、または必要に応じて対象に投与することができる。ある例では、Ezh2阻害剤は、喘息またはアレルギーの事象を予想して対象に投与される。ある例では、Ezh2阻害剤は、喘息またはアレルギーの事象の実質的に前に投与される。本明細書中で使用する「実質的に前」とは、喘息またはアレルギーの事象の少なくとも6ヶ月前、少なくとも5ヶ月前、少なくとも4ヶ月前、少なくとも3ヶ月前、少なくとも2ヶ月前、少なくとも1ヶ月前、少なくとも3週間前、少なくとも2週間前、少なくとも1週間前、少なくとも5日前、または少なくとも2日前を意味する。

いくつかの例では、Ezh2阻害剤は、喘息またはアレルギーの事象の直前に（例えば、喘息またはアレルギーの事象の48時間以内、24時間以内、12時間以内、6時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、1時間以内、30分以内、または10分以内に）、喘息またはアレルギーの事象と実質的に同時に（例えば、対象がアレルゲンと接触しているか、喘息またはアレルギーの症状を経験している間に）、あるいは喘息またはアレルギーの事象の後に投与される。

Ezh2阻害剤は、任意の適切な経路で投与することができる。いくつかの例では、それは吸入、摂取によって、局所経路（例えば、点鼻薬）で、または全身経路によって投与される。全身経路は経口および非経口を含む。吸入による投薬は、主に喘息患者の炎症部位である肺に直接送達できるため、いくつかの例では好まれる。いくつかのタイプの定量吸入器が吸入による投与のために定期的に使用される。これらのタイプのデバイスには、定量吸入器（MDI）、呼吸作動式MDI、ドライパウダー吸入器（DPI）、MDIと組み合わせたスペーサー/保持チャンバー、およびネブライザーが含まれる。本明細書で使用する場合、点鼻薬もしくは吸入による鼻腔または肺への送達は、局所投与と見なされる。肺への送達（例えば、吸入による）は最終的に薬剤の全身送達をもたらす可能性があるが、二次的な全身作用に先立って、薬剤の大部分が最初に肺組織または鼻腔に提示されるという意味で、その投与は依然として「局所」と見なされる。好ましい例では、Ezh2阻害剤は経口投与される。

治療に使用する場合、Ezh2阻害剤の有効量は、該阻害剤を所望の表面に、例えば粘膜、全身に送達する任意の様式で、対象に投与され得る。

Ezh2阻害剤は、単剤として、またはPRC2タンパク質複合体中のタンパク質の阻害剤と組み合わせて、投与することができる。例としては、Suz12、EED、RbAP48、およびAEBP2のうちの1つまたは複数を標的とする阻害剤が含まれる。

いくつかの例では、Ezh2阻害剤は、喘息および/またはアレルギーの治療薬と組み合わせて投与することができる。非限定的な例には、抗ヒスタミン薬、テオフィリン、サルブタモール、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、クロモグリク酸ナトリウム、ステロイド薬、抗炎症剤、IgEアンタゴニスト、および抗IgE抗体が含まれる。そのような化合物は、Ezh2阻害剤と同時に、または逐次的に投与され得る。

好ましくは、対象はヒトである。いくつかの例では、対象は本明細書に記載されるような炎症性障害を発症するリスクのあるものである。いくつかの例では、対象は本明細書に記載されるような炎症性障害を有するものである。ある例では、対象は喘息を有する。ある例では、対象は自己免疫疾患を有する。

「喘息を有する対象」とは、炎症、気道の狭窄、および吸入された薬剤に対する気道の反応性の増加によって特徴づけられる呼吸器系の障害を有する対象のことである。喘息の発症要因としては、アレルゲン、低温、運動、ウイルス感染、SO₂などがあるが、これらに限定されない。

一例として、対象は確立された炎症を有する。

一例として、対象は癌を有しない。

対象は、ezh2遺伝子について野生型またはezh2遺伝子について変異型であり得る。一例では、変異型はEZH2ポリペプチドのY641変異型である。別の例では、変異型は、Y641F、Y641H、Y641N、およびY641Sからなる群より選択される変異を有する。

別の局面では、本開示は、対象における炎症の予防、炎症の1つもしくは複数の症状の軽減、または炎症の治療に使用するための、本明細書に記載されるEzh2阻害剤を提供する。特定の例では、炎症はアレルギー性炎症である。

別の局面では、本開示は、対象における炎症の予防、炎症の1つもしくは複数の症状の軽減、または炎症の治療に使用するためのEzh2阻害剤を提供する。特定の例では、炎症はアレルギー性炎症である。

別の例では、本開示は、炎症を予防するか、炎症の1つもしくは複数の症状を軽減するか、または炎症を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載されるEzh2阻害剤の使用を提供する。特定の例では、炎症はアレルギー性炎症である。

図1. ヒトEzh2のタンパク質配列。 図2. PRC2およびSuv39h-HP1経路の構成成分は、T細胞の活性化後に特異的にアップレギュレートされる。 a）公開されているヒトCD4⁺ T細胞マイクロアレイデータからの、ヒストン修飾に関連する34の抑制的クロマチン成分をコードする遺伝子の発現変化の定量化（ナイーブと、抗CD3および抗CD28による24時間活性化との比較）（Martinez-Llordella et al., 2013）。有意にアップレギュレートされた遺伝子は赤で示され、有意にダウンレギュレートされた遺伝子は青で示され、有意に変更されなかった遺伝子は黒で示される。その他の遺伝子は灰色で示される。 b）C57BL/6マウスのナイーブCD4⁺ T細胞と、24時間活性化（抗CD3および抗CD28）CD4⁺ T細胞とを比較した代表的なウェスタンブロット（生物学的レプリケートを示す）と共に、定量化（4つのサンプルからの平均±SEM）を（c）に示す。統計的有意性は、studentのt検定で判定した。 d）H3K27me3関連PRC2およびH3K9me3関連Suv39h-HP1遺伝子サイレンシングに関与する分子を示す概略図。 図3. Cd4駆動型creリコンビナーゼは、loxPで両側を挟まれた標的遺伝子産物の効率的な欠失を引き起こす。 a）脾臓のB細胞およびCD4+ T細胞の蛍光活性化セルソーティング。 図3. Cd4駆動型creリコンビナーゼは、loxPで両側を挟まれた標的遺伝子産物の効率的な欠失を引き起こす。 b）T細胞コンパートメントにおけるそれぞれCbx5（HP1α）、Cbx1（HP1β）およびTrim28（TIF1β）の効率的な欠失を示す、2つの代表的なCbx5^fl/flCd4^Cre、Cbx1^fl/flCd4^CreおよびTrim28^fl/flCd4^Creマウスからのウェスタンブロット解析。 図4. Suv39h-HP1ファミリーメンバーは、アレルギー性炎症の発症に必要ではない。 a）OVA誘発アレルギー性炎症後のPAS+ 細胞と組織炎症の頻度を示す、Cbx5^fl/flCd4^Cre、Cbx1^fl/flCd4^CreおよびTrim28^fl/flCd4^Creマウス、ならびに対照のfloxedマウスの気道の組織学的解析。比較のために、未曝露の野生型切片を示す。スケールバーは100μmを表す。 b）aに示した組織学的解析の定量化。個々のデータ点ならびに平均およびSDを示す。統計的有意性は、Kruskal-Wallis検定とDunnのpost-hoc（事後検定）により、各floxed対照グループと未曝露Bl/6対照（^*P＜0.05）および対応するCd4Creマウスとを比較して判定した。グループのサイズは、n＝5のBl/6、n＝9のCbx5fl/flおよびCbx5fl/flCd4Cre、n＝6のCbx1fl/fl、Cbx1fl/flCd4Cre、Trim28fl/flおよびTrim28fl/flCd4Creである。 c）OVA誘発アレルギー性炎症後の示された遺伝子型の気管支肺胞洗浄サンプルの代表的なフローサイトメトリー解析。 図4. Suv39h-HP1ファミリーメンバーは、アレルギー性炎症の発症に必要ではない。 d）cに示したフローサイトメトリーからの個々の細胞集団の定量化。好酸球（CD11b+, Siglec-F+, CD11c-）、好中球（CD11bHi, GR1Hi）、CD4+ T細胞（TCRβ+, CD4+, CD8-）、CD8+ T細胞（TCRβ+, CD4-, CD8+）。個々のデータ点ならびに平均およびSDを示す。統計的有意性はbのとおりに判定した。グループのサイズは、n＝4のBl/6、n＝6の他の全てのグループ。 e）マウスのBAL液中のサイトカインレベルのBio-Plex（登録商標）解析（グループのサイズはbのとおり）。OVAによって2倍を超えて誘導されたサイトカインのみを示す。平均およびSEMを示す。統計解析はKruskal-Wallis検定とDunnのpost-hocによる。 図5. 気管支肺胞洗浄サンプルにおける肺炎症レベルに対するT細胞のHP1α、HP1βまたはTIF1βの欠失のベースライン効果。フローサイトメトリーで特定された個々の細胞集団の定量化は、1グループあたりn＝3の平均およびSDとして示す。生細胞（Sytox Blue-）を、次のような個々のサブセットにさらにゲートした：好酸球（CD11b+, Siglec-F+, CD11c-）；肺胞マクロファージ（CD11b+, Siglec-F+, CD11c+）；好中球（CD11bHi, GR1Hi）；B細胞（CD11b-, TCRβ-, CD19+）；CD4 T細胞（TCRβ+, CD4+, CD8-）；CD8 T細胞（TCRβ+, CD4-, CD8+）。 a）HP1α欠失とfloxed対照。 b）HP1β欠失とfloxed対照。c）TIF1β欠失とfloxed対照。 図6. Ezh2は、T細胞がアレルギー性炎症を引き起こすのに不可欠である。 a）オボアルブミン（OVA）誘発アレルギー性炎症の実験プロトコル。 b）OVA誘発アレルギー性炎症後のEzh2^fl/flCd4^Creマウスと野生型C57Bl/6（Bl/6）マウスからの気管支肺胞洗浄（BAL）サンプルの代表的な前方散乱対側方散乱のフローサイトメトリープロット。データは、n＝2（WT/Alum）、n＝8（Ezh2^fl/flCd4^Cre/Alum）、n＝12（WT/Ova）、n＝11（Ezh2^fl/flCd4^Cre/Ova）の代表を示す。 c）OVA感作およびチャレンジを受けたEzh2^fl/fl対照動物とEzh2^fl/flCd4^Cre動物からのBALサンプル中の個々の白血球集団を特定するゲーティング戦略；それらを（d）で定量化する。n＝4のBl/6、n＝6のEzh2^fl/fl/OVA、n＝6のEzh2^fl/flCd4^Cre/OVAの平均およびSEM。OVA感作を受けたEzh2^fl/flグループとEzh2^fl/flCd4^CreグループをMann-WhitneyのU検定で比較した。比較のために、未チャレンジBl/6を示す。 e）OVA誘発アレルギー性炎症後のEzh2^fl/flCD4^CreマウスとBl/6マウスの気道の代表的な組織学的解析。スケールバーは100μmを表す。 f）PAS⁺ 細胞と炎症スコアの定量化。OVAは初回感作を指し、全てのマウスはネブライザーによるOVAチャレンジに曝露された。n＝12（Bl/6/Ova）、n＝4（Ezh2^fl/fl/Ova）、n＝13（Ezh2^fl/flCd4^Cre/Ova）、n＝7（Ezh2^fl/flCd4^Cre/Alum）の平均およびSEMを示す。統計的有意性は、Kruskal-WallisのH検定とDunnのpost-hoc検定で判定した。 g）Ezh2^fl/flマウス（n＝7）およびEzh2^fl/flCd4^Creマウス（n＝7）におけるOVA誘発アレルギー性炎症後の気道抵抗（Rn）。メタコリン（MCh）に対するベースラインの気管支収縮を示すために未チャレンジBl/6マウス（n＝6）を含めた。平均およびSEMを示し、データを2-way ANOVAとBonferroniのpost-hoc検定で解析した。^*P＜0.05、特定の比較を中央のパネルと右側のパネルに示した。 図6-1の説明を参照のこと。 図7. 個々の白血球集団をゲートした後の気管支肺胞洗浄（BAL）サンプルの代表的な前方散乱対側方散乱のフローサイトメトリープロット。ゲーティング戦略は図5cに見ることができる。好中球は、CD11bHiGR1HiによってゲートされたSSCMid集団である；好酸球は、CD11b+CD11c-SiglecF+によってゲートされたSSCHi集団である；肺胞マクロファージは、CD11b+CD11c+SiglecF+によってゲートされたFSCHiSSCHi集団である；Tリンパ球は、CD11b-GR1-TCRβ+によってゲートされたFSCLoSSCLo集団である。 図8. T細胞コンパートメントにおけるEzh2の欠失は、HDM誘発アレルギー性炎症の発症を防ぐ。 a）ハウスダストダニ（house dust mite：HDM）誘発アレルギー性炎症の実験プロトコル。 b）ハウスダストダニ（HDM）誘発アレルギー性炎症後のEzh2^fl/flCd4^Creマウスと対照Ezh2^fl/flマウスにおける気管支肺胞洗浄（BAL）液のフローサイトメトリー解析（1グループあたりn＝7～8の代表、3回の独立した実験からプールされた）。 c）総BAL細胞（bから）および個々の白血球集団の定量化。n＝8（Ezh2^fl/fl/PBSグループとEzh2^fl/flCd4^Cre/HDMグループ）、n＝7（Ezh2^fl/fl/HDMグループとEzh2^fl/flCd4^Cre/PBSグループ)の平均およびSEMを示す。統計解析は2-way ANOVAとTukeyの多重比較検定による。 図8. T細胞コンパートメントにおけるEzh2の欠失は、HDM誘発アレルギー性炎症の発症を防ぐ。 d）HDM誘発アレルギー性炎症後のEzh2^fl/flCd4^Creマウスと野生型マウスの気道の代表的な組織学的解析。スケールバーは100μmを表す。 e）dに示した組織学的解析の定量化。平均およびSEMを示す。グループのサイズはcのとおり。統計解析は2-way ANOVAとTukeyの多重比較検定による。 図9. PRC2コア成分の発現は、アレルギー性炎症の発症に極めて重要である。 a）OVAチャレンジ後のEed^fl/flCd4^Creマウス、Suz12^fl/flCd4^CreマウスおよびC57Bl/6（Bl/6）野生型マウスの気道の組織学的解析。代表的なサンプルを左のパネルに示す。PAS+ 細胞の頻度と炎症スコアを平均およびSEMとして右に示す。グループのサイズは、n＝12のEed^fl/flCd4^Creとn＝11の同週齢Bl/6対照、n＝5のSuz12^fl/flCd4^Creとn＝5の同週齢Bl/6対照である。統計的有意性はMann-WhitneyのU検定で判定した。 b）OVA誘発喘息後のSuz12fl/flCd4Creマウスと野生型Bl/6マウスの気管支肺胞洗浄液（BAL）浸潤の代表的なフローサイトメトリー解析。顆粒球、リンパ球および肺胞マクロファージに相当する集団を示す。顆粒球ゲートにおける好酸球（CD11b+, SiglecF+）の頻度を右に示した。 図9. PRC2コア成分の発現は、アレルギー性炎症の発症に極めて重要である。 c）bからのデータをグループ化した。各グループn＝3の平均およびSEMを示す。統計解析は2-way ANOVAとTukeyのpost-hocによる。 d）OVA誘発喘息後のEed^fl/flCd4^Creマウス（n＝10）、Suz12^fl/flCd4^Creマウス（n＝3）および野生型Bl/6マウス（n＝5）のBAL液中のサイトカインレベルのBio-Plex（登録商標）解析。OVAによって2倍を超えて誘導されたサイトカインのみを示し（平均およびSEM）、統計的有意性をtwo-way ANOVAで判定した。 図10. Ezh2は抗原特異的メモリーの生成に必要である。 a）OVAチャレンジ後のEzh2^fl/flCd4^Creマウスと対照Ezh2^fl/flマウスの気管支肺胞洗浄（BAL）液中のサイトカインレベルのBio-Plex（登録商標）解析。対照のAlum感作マウスのレベルに対する平均倍率変化を、SDを伴って示す。統計解析は、Holm-Sidak法n＝2（Ezh2^fl/fl）、n＝8（Ezh2^fl/flCd4^Cre）を用いて、多重比較に対して補正される多重の対応のない（unpaired）t検定による。OVAによって2倍を超えて誘導されたサイトカインのみを示す。 b）OVAチャレンジ後のBAL液中のIFNγレベル。X軸のラベルは初回感作を示す。対照に対する平均倍率変化およびSDを示す。統計解析は2-way ANOVAによる。グループのサイズはaのとおり。 c）OVAチャレンジ後のマウスの血清中に検出されたOVA特異的IgEおよび総IgE。X軸のラベルは初回感作を示す。個々のデータ点ならびに平均およびSDを示す；各グループn＝3であるが、未免疫Bl/6はn＝1で、参照用に示される。統計解析はKruskal-WallisのH検定とDunnのpost-hocによる。 図10. Ezh2は抗原特異的メモリーの生成に必要である。 d）OVA感作プロトコルの3日後（初回感作の10日後）の脾臓の抗原を経験した（CD44⁺）CD4⁺ T細胞の細胞内サイトカイン染色。細胞をPMA/イオノマイシン刺激で5時間刺激し、最後の2時間はGolgistopタンパク質輸送阻害剤の存在下で行った。 e）dの定量化。平均およびSEMを示す。統計解析はMann-WhitneyのU検定で行い、各グループにつきn＝6とした。 f）dのようなOVA感作プロトコル後に機械的にホモジナイズした脾臓および末梢リンパ節からプールされた細胞のOVAクラスIIテトラマー染色。 図10. Ezh2は抗原特異的メモリーの生成に必要である。 g）fの定量化。n＝3（Bl/6）、n＝6（Ezh2^fl/fl）、n＝5（Ezh2^fl/flCd4^Cre）の平均およびSEMを示す。統計解析はKruskal-WallisのH検定とDunnのpost-hocによる。 図11. Ezh2はCD4⁺ T細胞のクローン増殖に必要である。 a）インビトロでの抗CD3、抗CD28活性化後のEzh2^fl/flCd4^Creおよび野生型からのセルトレースバイオレット（cell-trace violet）標識ナイーブCD4⁺ T細胞の増殖。活性化マーカーCD25のアップレギュレーションを下のパネルに示す。 b）aからのEzh2^fl/flCd4^Creおよび野生型の培養物から回収された細胞数。n＝3の平均およびSEMを示す。統計解析は2-way ANOVAとBonferroniのpost-hocによる。 c）aのように活性化した細胞のアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム染色。生細胞（左下の象限）、初期アポトーシス細胞（左上の象限）、後期アポトーシス/壊死細胞（右上の象限）。 d）cの定量化。グループのサイズと統計解析はbのとおり。^*P＜0.05、^**P＜0.01、^***P＜0.001；その時点で、または示されたように、Bl/6対照と比較した。 図11-1の説明を参照のこと。 図11-1の説明を参照のこと。 図12. Ezh2の小分子阻害はアレルギー性炎症の発症を抑制する。 a）インビトロで3日後の活性化C57BL/6マウスCD4⁺ T細胞の生存に及ぼすEzh2阻害剤GSK126の影響。データは、GSK126の各濃度での3～5回の測定から得られたビヒクル対照の細胞数の平均％±SEMとして示す。 b）オボアルブミン（OVA）誘発アレルギー性炎症におけるGSK126の強制経口投与の実験プロトコル。 c）C57BL/6マウス（1グループあたりn＝4）のアレルギー性炎症のOVAモデルにおけるGSK126投与後の気管支肺胞洗浄液浸潤のフローサイトメトリー解析の定量化。平均およびSEMを示す。統計解析はKruskal-WallisのH検定とDunnのpost-hocによる。 d）bのようなOVAモデルにおいてGSK126またはビヒクル対照で処置したマウスの気道の代表的な組織学的解析（グループあたりn＝8の代表、2回の独立した実験からプールした）。スケールバーは100μmを表す。 図12. Ezh2の小分子阻害はアレルギー性炎症の発症を抑制する。 e）PAS⁺ 細胞の頻度と炎症スコアを示す組織学的解析の定量化。グループあたりn＝8の平均およびSEMを示す。統計的有意性はStudentのt検定で判定した。 f）OVAチャレンジおよびGSK126投与後のマウスの血清中に検出されたOVA特異的IgEおよび総IgE。n＝5（ビヒクル）、n＝4（各GSK用量）の平均およびSEMを示す。統計解析はKruskal-WallisのH検定とDunnのpost-hocによる。 g）ビヒクルまたはGSK126で処置したC57BL/6マウスのOVA誘発アレルギー性炎症後の気道抵抗（Rn）。ビヒクルおよびGSK126（150mg/kg）処置グループの完全なメタコリン用量-反応を左パネルに、10mg/mLメタコリンに対する全グループの気道抵抗を右パネルに示す。n＝6（生理食塩水/ビヒクル）、n＝6（OVA/ビヒクル）、n＝5（OVA/75mg/kg GSK126）、n＝5（OVA/150mg/kg GSK126）の平均およびSEMを示し、データを2-way ANOVAとBonferroni post-hoc検定で解析した。^**P＜0.01、特定の比較を右側のパネルに示した。 図13. Ezh2阻害剤GSK126の4日間の経口投与後、脾臓細胞の数と比率は変化しない。OVA誘発喘息モデルにおいて、GSK126（75mg/kgおよび150mg/kg）またはビヒクル対照を投与した後のC57BL/6マウスの脾臓細胞の比率のフローサイトメトリー解析（実験プロトコルは図5bのとおり）。a）代表的なプロット。b）総脾細胞および個々の白血球集団の定量化。平均およびSEM、ならびに個々のデータ点を示す。各グループn＝4。データは、1-way ANOVAとDunnetのpost-hoc検定で統計的に検証した。 図14. GSK126の単回投与は、気道におけるCD4+ T細胞の数を選択的に減少させる。 a）確立された炎症においてEzh2阻害剤GSK126（150mg/kg）の1回投与を使用する実験プロトコル。 b）確立された炎症におけるGSK126またはビヒクルの単回投与後の気管支肺胞洗浄液（BAL）の細胞数。最初に、CD4+およびCD8+ T細胞をCD11b-GR1-TCRβ+でゲートした。好中球をCD11bHiGR1Hiでゲートした。好酸球をCD11b+CD11c-SiglecF+でゲートした。平均およびSEMを示す。比較のために、n＝2のAlum感作ビヒクル処置対照を示す。OVA感作グループをStudentのt検定で統計的に比較した。グループのサイズは、n＝4のビヒクルおよびn＝5のGSK126であった。 図15. Ezh2の阻害は、確立されたアレルギー性炎症を治療し得る。 a）確立された炎症においてEzh2阻害剤GSK126を使用する実験プロトコル。 b）GSK126（150mg/kgを強制経口投与）およびビヒクルで処置したC57Bl/6マウスからの気管支肺胞洗浄液（BAL）サンプルの代表的なフローサイトメトリープロット。データは、n＝5のOVA/ビヒクル（Veh）およびOVA/GSKグループの代表を示し、n＝2の未チャレンジ対照（Con）を参照目的で示す。 c）bの定量化。平均およびSEMを示す。グループのサイズはbのとおり。統計解析は、ビヒクルグループとGSK126グループを比較するMann-WhitneyのU検定による。 図15. Ezh2の阻害は、確立されたアレルギー性炎症を治療し得る。 d）bのようなグループにおけるBAL好酸球とBAL CD4⁺ T細胞との相関関係。個々のデータ点を示す。 e）確立された炎症におけるGSK126またはビヒクル処置後のマウスの気道の代表的な組織学的解析。スケールバーは100μmを表す。 f）PAS⁺ 細胞および炎症スコアの定量化。平均およびSEMを示す。グループのサイズはbのとおり。統計解析は、1-way ANOVAとHolm-Sidakのpost-hocによる。 図16. H＆Eで染色した肺切片における白血球浸潤を定量化するための組織学的スコアリングチャート。

開示の詳細な説明
全般
本明細書全体を通して、特に明記しない限り、または文脈が特に要求しない限り、単一のステップ、組成物、ステップのグループ、または組成物のグループへの言及は、そのステップ、組成物、ステップのグループ、または組成物のグループの1つおよび複数（すなわち1つ以上）を包含すると解釈されるものとする。

当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変化および修飾を受けやすいことを理解するであろう。本開示は、そのような全ての変化および修飾を含むことを理解されたい。また、本開示には、本明細書で言及または示されたステップ、特徴、組成物、および化合物の全てが、個別にまたは集合的に含まれ、さらに前記ステップまたは特徴のありとあらゆる組み合わせまたは任意の2つ以上が含まれる。

本開示は、例示のみを目的とする、本明細書に記載の特定の例によって範囲が限定されるべきではない。機能的に同等の産物、組成物および方法は、明らかに本開示の範囲内にある。

本明細書中の本開示の任意の例は、特に明記しない限り、本開示の任意の他の例に準用すると解釈されるものとする。

特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、生化学の当業者）が一般的に理解しているものと同じ意味を持つものとする。

特に断りのない限り、本開示で利用される組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学の技術は、当業者によく知られている標準的な手順である。そのような技術は、Perbal (1984)、Sambrook et al., (1989)、Brown (1991)、Glover and Hames (1995 and 1996)、Ausubel et al., (1988, 現在までの全ての更新を含む)、Harlow and Lane, (1988)、Coligan et al., (現在までの全ての更新を含む)、Zola (1987)などの文献に記載されて説明されている。

本明細書全体を通して、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変化形は、記載された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップのグループの包含を意味し、他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップのグループの除外を意味しないことが理解されよう。

本明細書中で使用する用語「由来する（derived from）」は、特定の完全体（integer）が、特定の起源から必ずしも直接ではないものの、その起源から得られる可能性があることを示すと解釈されるものとする。

本発明は、当分野の技術の範囲内で、従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を採用している。例えば、Sambrook et al “Molecular Cloning” A Laboratory Manual (1989)を参照されたい。

用語「からなる」または「本質的にからなる」は、より大きな産物に共有結合されていない、一定数の残基のペプチド配列を指す。

当業者は、本明細書に記載の本発明が、具体的に記載されたもの以外の変化および修飾を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、そのような全ての変化および修飾を含むことを理解されたい。また、本発明には、本明細書で言及または示されたステップ、特徴、組成物、および化合物の全てが、個別にまたは集合的に含まれ、さらに前記ステップまたは特徴のありとあらゆる組み合わせまたは任意の2つ以上が含まれる。

本開示は、例示のみを目的とする、本明細書に記載された具体的な態様によって範囲が限定されるべきではない。機能的に同等の産物、組成物および方法は、明らかに、本明細書に記載される本開示の範囲内にある。

本明細書中の任意の例は、特に明記しない限り、任意の他の例に準用すると解釈されるものとする。

選択した定義
本明細書で使用する場合、単数形「1つ（a）」、「1つ（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書では、用語「1つ（a）」（または「1つ（an）」）、ならびに用語「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、交換可能に使用することができる。

さらに、本明細書で使用する「および/または」は、2つの特定の特徴または構成要素のそれぞれを、他方と一緒にまたは他方なしに、具体的に開示しているものとして解釈されるべきである。したがって、本明細書で「Aおよび/またはB」などの語句で使用される用語「および/または」は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」（単独）、および「B」（単独）を含むことを意図している。同様に、「A、B、および/またはC」などの語句で使用される用語「および/または」は、次の具体例のそれぞれを包含することを意図している：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（単独）；B（単独）；およびC（単独）。

「約」という用語は、本明細書では、およそ、大体、あたり、またはほぼ（in the regions of）を意味するために使用される。用語「約」が数値範囲と共に使用される場合、それは、示された数値の上と下の境界を広げることによってその範囲を変更する。一般的に、用語「約」は、本明細書では、記載された値の上と下の数値を10％の変動で、上または下に（より高くまたはより低く）変更するために使用される。

本明細書で使用する用語「アレルギー性炎症」とは、花粉、ハウスダストダニ、カビ、動物の皮膚/毛などのアレルゲンへの曝露によって引き起こされる障害を指すことを意図している。

本明細書で使用する用語「喘息」とは、自然にまたは治療によって（一部の患者では完全ではないが）改善しうる気道閉塞、気道の炎症、および各種刺激に対する気道の反応性の増加を特徴とする肺疾患を指す。喘息は、アレルギー性喘息と非アレルギー性（内因性）喘息に大別される。本明細書で使用する「アレルギー性喘息」とは、患者が敏感に反応する抗原の吸入に対する喘息反応を指す。非アレルギー性喘息は、Th2-low喘息および内因性喘息としても知られており、遅発性喘息を含むことができる。内因性喘息は、ストレス、不安、冷たいおよび/または乾燥した空気、タバコの煙、ウイルス、大気汚染、化学物質、香料、激しい運動（運動誘発性喘息）および薬物（例えば、アスピリン、非ステロイド性炎症薬（NSAID））の1つまたは複数によって引き起こされる可能性がある。

本明細書で使用する用語「アレルギー性鼻炎」（一般に花粉症（hay-fever）として知られている）とは、対象者の鼻および/または目が花粉、ハウスダストダニ、カビ、動物の毛/皮膚などの環境アレルゲンと接触することにより引き起こされる。一般的に、症状としては、鼻水、鼻づまり、鼻のかゆみ、くしゃみ、かゆい涙目などがある。

本明細書で使用する用語「アトピー性皮膚炎」（一般に湿疹として知られている）とは、皮膚の斑点が赤くなり、うろこ状で、かゆみを伴う遺伝性の慢性炎症性疾患を指す。時には病変が現れ、それが感染することもある。環境中の刺激物との接触などの要因がアトピー性皮膚炎の引き金となることが多い。

用語「自己免疫疾患」とは、人の免疫系が自分自身の細胞、組織、および/または臓器に対して不適切な反応を引き起こす疾患を指す。その結果、炎症および損傷が発生する。用語「自己免疫疾患」は、局所または全身性の疾患を包含することを意図している。

本明細書で使用する用語「COPD」とは、適切な呼吸ができなくなる多数の肺疾患の総称をいう。COPDの最も一般的な2つのタイプは、肺気腫と慢性気管支炎である。COPDは、息切れ、慢性的な咳および痰（sputum）（粘液または痰（phlegm））が発生する。

本明細書で使用する用語「ループス」（lupus）とは、任意の臓器に影響を及ぼす可能性のある慢性自己免疫疾患を指す。用語「ループス」には、全身性エリテマトーデス（SLE）、円板状ループス、亜急性皮膚ループス、および薬剤誘発性ループスが含まれる。

用語「セリアック病」とは、グルテンに対する異常な反応によって引き起こされる自己免疫疾患を指し、小腸にダメージを与えて、食物の吸収に影響を及ぼす。

Ezh2またはEZH2への言及は、文脈が特に指示しない限り、そのタンパク質を指すために交換可能に使用される。イタリック体で書かれたEzh2またはezh2は、文脈が特に指示しない限り、その遺伝子を指すことを意図している。

本明細書で使用する用語「薬学的組成物」とは、治療上または生物学的に活性な薬剤を少なくとも1つ含み、かつ患者への投与に適している組成物を意味する。こうした製剤はいずれも、当技術分野で周知の、一般に認められた方法によって調製することができる。例えば、Gennaro, A.R.編, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (2000)を参照されたい。

語句「薬学的に許容される」とは、本明細書では、合理的なベネフィット/リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、および/または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに、健全な医学的判断の範囲内で、適している化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すために使用される。

「対象」とは、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。本明細書で使用する用語「対象」には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、クマ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含み、適切な場合には、用語「患者」と交換可能に使用することができる。好ましくは、対象は霊長類である。特に、対象はヒトである。

用語「治療有効量」とは、所望の生物学的効果を実現するのに十分なEzh2阻害剤の量を意味すると解釈されるものとする。例えば、Ezh2阻害剤の有効量は、アレルギー性炎症の1つまたは複数の症状を、（例えば、アレルゲンに反応してIgEが発生するのを予防または軽減することによって）その障害の臨床的特徴として観察され一般に認められるレベルより低いレベルに低減または抑制するのに必要な量である。この用語は、本発明を特定の量に限定するものと解釈されるべきではない。

本明細書で使用する用語「治療（または処置）する（treat、treating）」、「治療（または処置）（treatment）」、およびそれらの文法的変化形は、個々の患者に、その患者において生理学的な応答または転帰を得ることが望まれるプロトコル、レジメン、プロセス、または救済策を施すことを意味する。治療を受けた全ての患者が、特定の治療プロトコル、レジメン、プロセス、または救済策に応答するとは限らないため、治療は、ありとあらゆる患者または患者集団において、望ましい生理学的応答または転帰が達成されることを必要としない。そのため、ある患者または患者集団は、治療に応答しなかったり、不十分に応答することがある。

本明細書で使用する用語「予防する（または防ぐ）（prevent）」、「予防した（または防いだ）（prevented）」または「予防する（または防ぐ）（preventing）」とは、アレルギー性または喘息性障害の治療に関して使用する場合、アレルゲンまたはイニシエーターに対する対象の抵抗性を高めるか、または、言い換えれば、対象がアレルゲンまたはイニシエーターに対してアレルギー反応または喘息反応を起こす可能性を減少させる予防的治療、ならびにアレルギー/喘息と戦うための、例えば、アレルギー/喘息を完全に抑制もしくは排除するか、または悪化するのを防止するための、アレルギー性または喘息性障害が始まった後の治療を指す。

アレルギー性炎症
「アレルギー」という言葉は、特定の物質（アレルゲン）に曝露されたときに、反応性の兆候および症状、つまり「過敏性反応」を発症する一部の個人の異常な性質に注意を促すために、1906年に造り出された言葉である。アレルゲンは2つの主要なカテゴリーに分類される。第1のタイプは、IgEの産生を誘発する（それによって対象を「感作」する）可能性がある非感染性の環境物質を包含し、後でその物質に再曝露されると、アレルギー反応が起こる。アレルゲンの一般的な発生源には、草木の花粉、動物のふけ（皮膚や毛皮からの脱落）、ハウスダストダニの糞便粒子、特定の食品（特に落花生、木の実、魚、甲殻類、牛乳、卵）、ラテックス、一部の医薬品、および昆虫の毒が含まれる。場合によっては、外来抗原に対するアレルゲン特異的IgEが交差反応性の宿主抗原を認識することもあるが、その臨床的意義は不明である。第2のタイプは、局所的な炎症を伴う適応免疫反応を誘発し得るが、IgEとは無関係に発生すると考えられる非感染性の環境物質である（例えば、ツタウルシまたはニッケルに対するアレルギー性接触皮膚炎）。

アレルギー性障害は、先進国でますます増加しており、アレルギー性鼻炎（花粉症としても知られている）、アトピー性皮膚炎（湿疹としても知られている）、アレルギー性（またはアトピー性）喘息、いくつかの食物アレルギーが含まれる（Holgate ST. (1999) Nature 404:B2-B4）。一部の人々は、アレルゲンへの曝露から数秒または数分以内に、アナフィラキシーと呼ばれる、命を脅かす可能性のある全身アレルギー反応を起こす（Sampson HA et al. (2005) J Allergy Clin Immunol. 115:584-591）。

アレルギー性炎症とは、感作された対象が特定のアレルゲンに曝された後に生じる炎症を指す。単一のアレルゲンは急性反応を引き起こし、これは即時相反応またはI型即時型過敏反応として知られている。多くの対象では、この後に遅発相反応が続く。アレルゲンへの持続的または反復的な曝露により、慢性アレルギー性炎症が発症し、これには組織の変化が伴う。

近年、アレルギー性障害に関連する病理学、それゆえ疾病負荷（burden of disease）、の多くは、アレルゲンに持続的または反復的に曝露された部位での慢性的なアレルギー性炎症の長期的結果を反映していることが明らかになってきた。この認識は、アレルギー疾患における追加の治療標的を特定し、原因となるアレルゲンに対する免疫寛容を誘導するための改善された戦略を画策し、さらにはアレルギー性障害の初期発症を防ぐために免疫応答を操作するための、新たな取り組みへとつながった。

アレルギー性炎症はしばしば3つの時間相（temporal phase）に分類される。即時相反応はアレルゲンチャレンジの数秒から数分以内に誘発され、遅発相反応は数時間以内に発生する。対照的に、慢性アレルギー性炎症は、アレルゲンに繰り返し曝された部位で発生する持続性の炎症である。

即時相反応（またはI型即時型過敏反応）は、アレルゲン曝露から数分以内に発生し、主に患部のマスト細胞によるメディエーターの分泌を反映している。反応は、局所性（例えば、アレルギー性鼻炎における急性鼻結膜炎、急性の喘息発作、蕁麻疹（発疹）、および食物アレルギーにおける胃腸反応）または全身性（アナフィラキシー）であり得る。感作された個体では、これらのマスト細胞は、表面の高親和性IgE受容体（FcεRI）に結合したアレルゲン特異的IgEをすでに持っている。二価または多価アレルゲンによる隣接IgE分子の架橋が起こると、FcεRIの凝集が複雑な細胞内シグナル伝達プロセスの引き金を引き、その結果、3つのクラスの生物学的に活性な産物が分泌される：細胞質顆粒に貯蔵されたもの、脂質由来のメディエーター、ならびに新たに合成されたサイトカイン、ケモカイン、成長因子、および他の産物。これらの事象は、血管拡張、浮腫を伴う血管透過性の増加、影響を受けた器官の急性機能変化（気管支収縮、気道粘液分泌、蕁麻疹、嘔吐、下痢など）を引き起こす。放出されたメディエーターの一部は、白血球の局所的な動員と活性化を促進し、遅発相反応の発生に寄与する。

遅発相反応は、一般にアレルゲン曝露から2～6時間後に発生し、6～9時間後にピークに達する反応を指す。それは、通常、臨床的に明らかな即時相反応によって先行され、1～2日で完全に消失する。皮膚の遅発相反応は、浮腫、痛み、温感、および紅斑（赤み）を伴う。肺では、これらの反応は気道狭窄と粘液過分泌により特徴づけられる。それらは、TH2細胞、好酸球、好塩基球、その他の白血球の局所的な動員と活性化、および常在細胞（例えば、マスト細胞）による持続的なメディエーター産生を反映している。遅発相反応を開始するメディエーターは、IgEとアレルゲンによって活性化された常在マスト細胞に由来するか、またはアレルゲン由来ペプチドを認識するT細胞に由来すると考えられる（そのようなT細胞は、アレルゲンチャレンジの部位に常在していても、該部位に動員されたものであってもよい）。ある種のマスト細胞由来産物は、血管内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、神経細胞などの構造細胞の生物学にも影響を与える可能性がある。遅発相反応に寄与する他の産物は、アレルゲン由来ペプチドを認識するT細胞に由来し得る；そのようなT細胞は、アレルゲンチャレンジの部位に常在していても、該部位で即時相反応に動員されたものであってもよい。

慢性のアレルギー性炎症は、特定のアレルゲンに長期間または反復して曝露されることで誘発される持続的な炎症を指し、典型的には、罹患部位での多数の自然免疫細胞と適応免疫細胞（白血球の形態）の存在によってだけでなく、細胞外マトリックスの大きな変化および罹患組織の構造細胞の数、表現型、機能の変化によっても特徴づけられる。

初めはアトピー性皮膚炎などの単一のアレルギー性障害があった多くの患者は、ゆくゆくはアレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息などの他の疾患を発症していく（これはアレルギーマーチまたはアトピーマーチと呼ばれている）。このプロセスは、一部には、アレルギー性炎症が上皮バリアの機能を低下させるという悪循環（vicious circle）によって引き起こされる可能性がある。これにより、元のアレルゲンと追加のアレルゲンへの免疫系の曝露が増加し、既存のアレルゲン特異的IgEが新たなアレルゲンに対する感作に寄与する。このスキームでは、表面にFceRIおよび/または低親和性IgE受容体CD23を発現する抗原提示細胞（APC）（FceRIを担持するランゲルハンス細胞および他の樹状細胞、ならびにCD23担持B細胞を含む）が、それらの表面に結合したアレルゲン特異的IgEによってアレルゲンを捕捉する。これらのIgEに結合した抗原を処理することにより、APCは、感作がすでに存在しているアレルゲンの他のエピトープに対する、または同じAPCによって並行して処理されている他のアレルゲンに対するTH2細胞応答の発生を促進することができる。この提案されたメカニズムは、エピトープ・スプレッディング（epitope spreading）（単一のアレルゲンの複数のエピトープに特異的なIgEの産生と、新たなアレルゲンに特異的なIgEの産生）をもたらす可能性がある。

EZH2（zeste homolog 2）およびその阻害剤
ヒストンの翻訳後修飾は、遺伝子発現と細胞分化の調節に重要な役割を果たしている（Strahl BD, Allis CD. (2000) Nature. 403:41-45）。EZH2（enhancer of zeste homolog 2）は、多面的に作用する分子である；その主な保存された機能は、PRC2（polycomb repressive complex 2）の必須構成成分として、エピジェネティックな遺伝子抑制にある。

ヒトEzh2タンパク質の配列は、UniProtリファレンスQ15910に見い出すことができる。その配列は、本明細書の図1（SEQ ID NO:1）にも再現されている。また、Ezh2阻害剤という用語は、そのアイソフォームを含むことを意図している。

EZH2は、補因子S-(S'-アデノシル)-l-メチオニン（SAM）からのメチル基の転移を介して、ヌクレオソーム基質のヒストン3リシン27（H3K27）のε-NH2基のメチル化を触媒し、H3K27のトリメチル化（H3K27me3）と標的遺伝子の転写サイレンシングをもたらす。蓄積された証拠からは、EZH2が癌細胞における異常なトランスクリプトームに深く関与していることが示唆される。実際、EZH2とその酵素作用の産物であるH3K27me3は、様々なヒト悪性腫瘍の予後不良と関連している。EZH2の増幅および機能変化は、大多数の癌で頻繁に観察される。

ポリコーム（polycomb）機能に拮抗するEZH2またはSWI/SNF複合体の変化は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、非ホジキンリンパ腫（NHL）、T細胞ALLなどの複数の癌サブタイプで報告されている（McCabe et al. (2012) Nature 492:108）。EZH2の再発性の機能獲得（gain-of-function）変化は、胚中心B細胞様のびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（GCB-DLBCL）の最大30％、濾胞性リンパ腫（FL）の27％に発生する。

興味深いことに、2013年の研究は、Ezh2欠損T細胞がインビトロ活性化T細胞の養子移入後に喘息の病理を増強することを示したため、アレルギー性喘息の発症にEzh2が関与しているとした（Tumes et al. (2013) Immunity 39:819-832）。本明細書に提示された研究は、これらの知見とは明らかに対照的である。Tumesらは、OVA感作マウスに養子移入する前に、OVA特異的T細胞受容体トランスジェニックEzh2欠損CD4+ T細胞のTh2インビトロ分極化を使用した。対照的に、本明細書で本発明者らは、インビボでのT細胞応答の生成に対するEzh2の重要性を直接検証した。

最近、EZH2の小分子阻害剤が開発されて、目下、臨床試験で評価されつつある。最近になって、EZH2の酵素活性を抑制する小分子化合物がいくつか開発された。ほとんどの化合物はまだ前臨床開発中であるが、3つの薬剤（タゼメトスタット（tazemetostat）、GSK2816126、およびCPI-1205）が第I/II相臨床試験に移行しており（Gulati N et al. (2018) Leukemia and Lymphoma 59(7):1574-1585に要約される）、これらの薬剤を用いたリンパ腫の多くの活発な臨床試験が目下進行中である。

EPZ-6438（E7438/タゼメトスタット）
タゼメトスタット（Epizyme社製）は、EZH2の経口投与可能な小分子阻害剤である（Knutson SK et al. (2013) Proc Natl Acad Sci U S A. May 7;110(19):7922-7）。タゼメトスタットは、PRC2に対する化学多様性ライブラリーのハイスループットスクリーニングによって2012年に同定された分子であるEPZ 005687（Knutson SK et al. (2012) Nt Chem Biol 8(11):890-6）から最適化された。EPZ 005687は、EZH2に対して高い親和性と選択性を示すが、最適な薬物動態特性を持たないため、その臨床的有用性が制限されている。タゼメトスタットは効力が増強され、経口バイオアベイラビリティーを含む薬物動態が改善されている（Knutson SK et al. (2013) 前記）。タゼメトスタットは、EZH2の機能に必要な補因子S-アデノシル-L-メチオニン（SAM）との競合阻害により、EZH2を阻害する。タゼメトスタットは、野生型と変異型の両方のEZH2を阻害し、その50％阻害濃度（IC50）は2～38nMである。また、タゼメトスタットは、EZH2に対する選択性が高く、EZH1と比べて効力が35倍増加し、他の14種のヒストンメチルトランスフェラーゼと比べて効力が4,500倍超増加している（Knutson et al. (2013) 前記）。

タゼメトスタットの前臨床活性は、NHL、多発性骨髄腫（MM）、およびPRC2機能への依存性がある選ばれた固形腫瘍で評価されている（Knutson SK, et al. (2014) Mol Cancer Ther. 2014;13:842-854）。

さらに、タゼメトスタットは固形腫瘍で研究されており、SWI/SNFサブユニットSMARCB1の両アレル不活化変異を有する小児悪性ラブドイド腫瘍およびSMARCB1欠損滑膜肉腫において、顕著な前臨床活性を示した。

タゼメトスタットの有望な前臨床試験は、この化合物の臨床開発につながり、現在、NHLおよび遺伝的に定義された固形腫瘍を対象とした一連の第I相および第II相試験で研究されている。タゼメトスタットの大規模な第I/II相試験（NCT01897571）からの予備的な結果が最近報告された（Morschhauser F, et al. (2017) Hematol Oncol. 2017;35:24-25）。NHL患者でタゼメトスタットを評価する他の進行中の研究には、治療歴のないDLBCL患者を対象としたR-CHOP（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン）と組み合わせたタゼメトスタットの第Ib/II相試験、再発/難治性DLBCLまたはFL患者を対象としたPD-1阻害剤アテゾリマブと組み合わせたタゼメトスタットの第I相試験、およびリンパ腫または遺伝的に定義された固形腫瘍を有する小児患者を対象とした第II相試験が含まれる。

米国食品医薬品局は、タゼメトスタットに、EZH2変異型DLBCLおよびEZH2変異の状態にかかわりなくFLに対してファストトラック（Fast Track）指定を許可し、また、悪性ラブドイド腫瘍に対して希少疾病用医薬品（Orphan Drug）指定を許可した。

GSK2816126（GSK126）
GSK126（GlaxoSmithKline社）は、EZH2を標的とした化合物のハイスループット生化学スクリーニングで同定された化合物を化学的に最適化することで生成された、EZH2の小分子阻害剤である（McCabe MT et al. (2012) Nature Dec 6;492(7427):108-12）。EPZ-6438と同様に、GSK126は、S-アデノシルメチオニン（SAM）との競合阻害を通じて、WTと変異型の両方のEZH2を阻害する。GSK126の予測されるドッキング部位は、EZH2のSAM結合ポケットである。GSK126は、WTおよび変異型EZH2を同様の効力（Ki app^1/4 0.5～3nM）で阻害し、EZH1と比較して（効力が150倍増加）または他の20種のメチルトランスフェラーゼと比較して（効力が1000倍超増加）高度に選択的である（McCabe MT et al. 前記）。

GSK126は、最近、多施設共同第I相臨床試験（NCT 02082977）で評価された。

GSK社はまた、さらなるEZH2阻害剤であるGSK343（Verma S et al. (2012) ACS Med Chem Lett 13; 3(12):1091-1096）およびGSK503（Bequelin W et al. (2013) 13; 23(5):677-92）を開発した。

CPI-1205
Constellation Pharmaceuticals社は、ピリジン系化合物であるGSK126およびタゼメトスタットとは構造的に異なる一連のインドール系EZH2阻害剤を報告している（Gehling VS, et al. (2015) Bioorg Med Chem Lett. 2015;25:3644-3649）。CPI-1205は、経口投与可能な小分子のインドール系EZH2阻害剤である。それは、化学プローブCPI-169のN-トリフルオロエチルピペリジン類似体である（Gehling et al. 前記）。CPI-169は、インビボで抗腫瘍活性とPDターゲットエンゲージメント（target engagement）を示したが、経口バイオアベイラビリティーは限られていた。CPI-1205は、EZH2の触媒ポケットに結合し、SAM結合部位と一部重なっている。それは、EZH1（EZH1 IC50 52±11nm）よりもEZH2に中程度の選択性を示し、他の30種のヒストンまたはDNAメチルトランスフェラーゼに対して試験した場合にも選択性を示した（Vaswani RG, et al. J Med Chem. 2016;59:9928-9941）。

CPI-1205は、再発または難治性B細胞リンパ腫の患者を対象とした第I相臨床試験（NCT 02395601）で目下評価中である。この試験は2015年3月に開始され、2018年10月までに約41名の患者を獲得すると予想される。主な目的は、CPI-1205の用量制限毒性を表すことである。PK、PD、および反応評価も検討されるであろう。

EI1
Novartis社は、Ezh2/PRC2のメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するEzh2のS-アデノシルメチオニン（SAM）競合阻害剤であるEI1を開発した。EI1で処理された細胞は、PRC2標的遺伝子のH3K27メチル化と活性化のゲノムワイドな喪失を示す。さらに、Y641変異を有するびまん性大細胞型B細胞リンパ腫細胞でのEI1によるEzh2の阻害は、増殖の低下、細胞周期の停止、およびアポトーシスを招いた（Wei Qi et al. (2012) PNAS 109(52):21360-21365）。

前臨床開発におけるEZH2阻害剤
EZH2が発癌に果たす役割についての理解が深まり、臨床試験から有望なデータが得られていることから、さらなるEZH2阻害剤が合成されて、前臨床試験での評価が続いている（Stazi G, et al. (2014-2016). Expert Opin Therapeu Patents. 2017;27:797-813）。最も強力なEZH2阻害剤の多くはピリドン部分を有するが、いくつかのグループは代替EZH2阻害剤の特許を取得しており、2-ピリドン部分への異なる置換基の付加または交換がこの薬物の有効性と効力に及ぼす影響を試験している。変異型EZH2阻害剤について記載しているそのような特許の例には、以下が含まれる（WO 2012/034132、WO 2018/133795、US2013/0040906、US2011/0251216、US2009/0012031、US2018/0271892、US 2018/0243315、US2017/0065600、US2015/0141362、US9,949,999、US9,889180、US9,889,138、およびUS9,688,665）。

有効性を最適化するための別の戦略は、EZH2とEZH1の両方を同時に標的とする薬剤を開発することであった。例えば、二重EZH1/EZH2阻害剤であるUNC 1999は、インビトロおよびインビボでMLL遺伝子再構成白血病の増殖を抑制することが実証されている。さらに、最近記載された二重EZH1/EZH2阻害剤であるOR-S1およびOR-S2は、EZH2の機能獲得変異を有するDLBCL細胞に対して、インビトロとインビボの両方で、選択的EZH2阻害剤よりも高い抗腫瘍活性を示した（Honma D et al. (2017) Cancer Sci. 108:2069-2078）。全部で50を超える小分子EZH2阻害剤が現在、前臨床開発のさまざまな段階にある。

EZH2の他の阻害剤としては、DZNep（Fiskus W et al.(2009) 24;114(13):2733-43）、UNC199（Konze KD et al. (2013) ACS Chem Biol 8(6):1324-34）、SAH-EZH2（Kim W et al. (2013) 9(10):643-50）などが文献に記載されている。

EZH2阻害剤は、Cayman Chemical社、Sigma（Merck）社、SelleckChem社、AdooQ Bioscience社、APExBio社など、多くの異なる商業的供給業者から入手可能である。

（表１）市販のEzH2阻害剤

アレルギー性炎症の予防および/または治療
いくつかの例では、Ezh2阻害剤は、アレルギー（例えば、喘息）を発症するリスクのある対象（対象のアレルゲンへの曝露および喘息の素因が疑われることが知られている）のアレルギー性炎症の予防に使用される。本明細書に記載される「リスクのある対象」とは、アレルゲンに曝露されるリスクもしくはアレルギー性炎症疾患（例えば、喘息）を発症するリスクがある対象、および/または以前に喘息発作に苦しんだことがあるか、喘息発作の素因がある対象のことである。例えば、リスクのある対象は、特定の種類のアレルゲンが見つかったまたは蔓延している地域への旅行を計画している対象であってもよいし、アレルゲンが特定された地域に住んでいる対象であってもよい。対象が特定の抗原へのアレルギー反応を発生し、かつ対象がその抗原に曝される可能性がある場合、すなわち花粉の季節には、その対象は抗原に曝されるリスクがある。アレルギー性炎症（例えば、喘息）を発症するリスクのある対象には、アレルギーがあると確認されているが、本開示の方法の治療中には活動性疾患を発症しない対象、ならびに遺伝的または環境的要因によりこれらの疾患を発症するリスクがあると考えられる対象が含まれる。

他の例では、Ezh2阻害剤は、アレルギーがある対象においてアレルギー性炎症を治療するのに使用される。「アレルギーがある対象」とは、アレルゲンに反応してアレルギー反応を起こす対象のことである。「アレルギー」とは、ある物質（アレルゲン）に対する獲得過敏性（acquired hypersensitivity）を指す。ヒトと動物におけるアレルギー反応は広く研究されており、関与する基本的な免疫機構はよく知られている。ヒトのアレルギー状態または疾患には、湿疹、アレルギー性鼻炎またはコリーザ、花粉症、結膜炎、気管支喘息またはアレルギー性喘息、蕁麻疹（発疹）および食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アナフィラキシー；薬物アレルギー；血管浮腫；およびアレルギー性結膜炎が含まれるが、これらに限定されない。

アレルギー反応を引き起こす分子の総称はアレルゲンである。アレルゲンには数多くの種類がある。アレルギー反応は、IgEタイプの組織を感作する免疫グロブリンが外来のアレルゲンと反応するときに起こる。IgE抗体がマスト細胞および/または好塩基球に結合し、これらの特殊な細胞が、アレルゲンによって刺激されると、アレルギー反応の化学的メディエーター（血管作用性アミン）を放出する。ヒスタミン、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝物、およびセロトニンは、ヒト対象におけるアレルギー反応のメディエーターとして最もよく知られている。ヒスタミンと他の血管作用性アミンは通常、マスト細胞および好塩基性白血球に蓄えられている。マスト細胞は組織全体に分散しており、好塩基球は血管系内を循環している。これらの細胞は、IgEの結合を伴う一連の特殊なイベントが発生してヒスタミンの放出を誘発しない限り、ヒスタミンを製造して細胞内に蓄えている。

遅延型過敏症は、IV型アレルギー反応としても知られており、アレルギー対象に抗原が侵入してから炎症反応または免疫反応が現れるまでに、少なくとも12時間の遅延時間があることを特徴とするアレルギー反応である。アレルギー状態にある個体のTリンパ球（感作Tリンパ球）は抗原と反応して、炎症メディエーターとして機能するリンホカイン（マクロファージ遊走阻止因子（MIF）、マクロファージ活性化因子（MAF）、マイトジェン因子（MF）、皮膚反応性因子（SRF）、走化性因子、血管新生促進因子など）を放出するようにTリンパ球をトリガーする；これらのリンホカインの生物学的活性は、局所的に現れるリンパ球または他の炎症性免疫細胞の直接的および間接的な作用と共に、IV型アレルギー反応を引き起こす。遅延型アレルギー反応としては、ツベルクリン型反応、同種移植拒絶反応、細胞依存型防御反応、接触性皮膚炎過敏症反応などがあり、これらはステロイド薬によって最も強く抑制されることが知られている。その結果、ステロイド薬は遅延型アレルギー反応によって引き起こされる疾患に対して有効である。しかし、現在使用されている濃度のステロイド薬を長期間使用すると、ステロイド依存性として知られる重篤な副作用につながる可能性がある。本開示の方法は、投与される用量をより低くかつより少なくすることによって、これらの問題のいくつかを解決するものである。

即時型過敏症（またはアナフィラキシー反応）は、極めて急速に、つまり患者が原因となるアレルゲンに曝されてから数秒または数分以内に、発症するアレルギー反応の一形態であり、Bリンパ球により産生されたIgE抗体によって媒介される。非アレルギー患者では、臨床的に関連するIgE抗体が存在しない；しかし、アレルギー疾患で苦しんでいる人では、IgE抗体が、皮膚、リンパ系器官に、目と鼻と口の膜に、気道と腸に豊富に存在するマスト細胞を感作することによって、即時型過敏症を媒介している。

マスト細胞はIgEの表面受容体を持っており、アレルギー患者のIgE抗体はそれらに結合するようになる。上で簡単に述べたように、結合したIgEがその後、適切なアレルゲンと接触すると、マスト細胞は脱顆粒を起こし、ヒスタミンなどの生物活性メディエーターと呼ばれる各種の物質を周囲の組織に放出するようになる。即時型過敏症に典型的な臨床症状（すなわち、気道または腸の平滑筋の収縮、小血管の拡張と水および血漿タンパク質へのそれらの透過性の増加、多量の粘り気のある粘液の分泌、皮膚では発赤、腫れ、およびかゆみまたは痛みをもたらす神経終末の刺激）の原因となるのは、これらの物質の生物学的活性である。

多くのアレルギーは、無害なアレルゲンに対するIgE抗体の生成によって引き起こされる。免疫刺激性核酸の投与によって誘導されるサイトカインは、主に「Th1」と呼ばれるクラスのものである（例えば、IL-12、IFN-γ）。ヘルパーCD4+ T細胞（そしてまたCD8+ T細胞）によるサイトカインの産生は、しばしば、マウスとヒトの両システムでは、Th1およびTh2の2つの表現型のいずれかに分類される（Romagnani, (1991) Immunol Today 12: 256-257, Mosmann, (1989) Annu Rev Immunol, 7: 145-173）。Th1細胞は、インターロイキン2（IL-2）、腫瘍壊死因子（TNFα）、およびインターフェロンガンマ（IFNγ）を産生し、主に遅延型過敏症などの細胞性免疫に関与している。Th2細胞は、インターロイキン類、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、およびIL-13を産生し、主にIgEおよびIgG4抗体のアイソタイプスイッチなどの体液性免疫応答への最適な支援を提供することに関与している（Mosmann, (1989), Annu Rev Immunol, 7: 145-173）。

Th1応答に関連する抗体のタイプは、中和能力とオプソニン化能力が高いため、一般的により防御的である。Th2応答には主に抗体が関与しており、これらは感染に対してより低い防御効果を有する；一部のTh2アイソタイプ（例えば、IgE）はアレルギーに関連している。

強く分極されたTh1およびTh2応答は、防御において異なる役割を果たすだけでなく、異なる免疫病理学的反応を促進することができる。Th1型応答は、実験的自己免疫性ブドウ膜網膜炎(Dubey et al, 1991, Eur Cytokine Network 2: 147-152）、実験的自己免疫性脳炎(EAE)（Beraud et al, 1991, Cell Immunol 133: 379-389）、およびインスリン依存性糖尿病（Hahn et al, 1987, Eur. J. Immunol. 18: 2037-2042）などの臓器特異的自己免疫に、接触皮膚炎に（Kapsenberg et al, Immunol Today 12: 392-395）、およびいくつかの慢性炎症性障害に関与している。対照的に、Th2型応答は、アレルギー性喘息（Walker et al, 1992, Am Rev Resp Dis 148: 109-115）およびアトピー性皮膚炎（van der Heijden et al, 1991, J Invest Derm 97: 389-394）などの（一般的な環境アレルゲンに対する）アレルギー性アトピー性障害の引き金となり、蠕虫（Finkelman et al, 1991, Immunoparasitol Today 12: A62-66）およびリーシュマニア・メジャー（Leishmania major）（Caceres-Dittmar et al, 1993, Clin Exp Immunol 91: 500-505）などの組織内原生動物による感染を悪化させると考えられ、高IgE症候群（Del Prete et al, 1989, J Clin Invest 84: 1830-1835）およびオーメン（Omenn）症候群（Schandene et al, 1993, Eur J Immunol 23: 56-60）などの特定の原発性免疫不全症で優先的に誘発され、そしてHIV複製を抑制する能力の低下と関連している（Barker et al, 1995, Proc Soc Nat Acad Sci USA 92: 11135-11139）。

このように、一般に、アレルギー疾患はTh2型の免疫応答により仲介されている。

本明細書で使用する「アレルゲン」とは、IgEの産生を特徴とする免疫反応を惹起することができる分子のことである。このように、本開示の文脈において、アレルゲンという用語は、IgE抗体によって仲介され得るアレルギー反応を引き起こすことができる特定のタイプの抗原を意味する。

本開示のアレルギー性炎症の引き金となり得るアレルゲンは、そのようなアレルゲンの断片またはアレルゲンとして作用するハプテンを含めて、広範なクラスをカバーし得る。アレルゲンには、限定するものではないが、以下が含まれる：環境エアロアレルゲン；植物の花粉、例えばブタクサ（Ragweed）/花粉症（hayfever）；雑草花粉アレルゲン；イネ科花粉アレルゲン；セイバンモロコシ（Johnson grass）；樹木花粉アレルゲン；ライグラス（Ryegrass）；ハウスダストダニアレルゲン；貯蔵庫ダニアレルゲン；スギ花粉/花粉症；カビ胞子アレルゲン；動物アレルゲン（ネコ、イヌ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、マウス）；食物アレルゲン（例えば、甲殻類、落花生などのナッツ類、柑橘類）；昆虫アレルゲン（上記のダニ以外）；毒液(ハチ目（Hymenoptera）、イエロージャケット、ミツバチ、カリバチ、スズメバチ、ヒアリ)；ゴキブリ、ノミ、蚊などからの他の環境昆虫アレルゲン；連鎖球菌抗原などの細菌；回虫抗原などの寄生虫；ウイルス抗原；真菌胞子；薬物アレルゲン；抗生物質；ペニシリンおよび関連化合物；他の抗生物質；ホルモン（インスリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）などの全タンパク質（Whole Protein）；不完全な抗原またはハプテンとして作用し得る全ての薬物およびそれらの代謝物；ハプテンとして作用し、免疫系を刺激することができる工業化学物質および代謝物（例えば、酸無水物（無水トリメリット酸など）およびイソシアネート（トルエンジイソシアネートなど））；小麦粉（すなわち、パン職人の喘息）、トウゴマの実、コーヒー豆、上記の工業化学物質などの職業性アレルゲン；ノミのアレルゲン；および非ヒト動物のヒトタンパク質。

アレルゲンには、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、多糖コンジュゲート、多糖類と他の分子のペプチド模倣体および非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、および炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。しかし、タンパク質およびポリペプチドは一般に炭水化物または脂肪よりも抗原性が高いため、多くのアレルゲンは本質的にタンパク質またはポリペプチドである。

特定の天然、動物および植物アレルゲンの例には、限定するものではないが、以下の属に特異的なタンパク質が含まれる：イヌ属（カニス・ファミリアリス（Canis familiaris））；ヒョウヒダニ属（例えば、コナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae））；ネコ属（イエネコ（Felis domesticus））；アンブローシア属（ブタクサ（Ambrosia artemiisfolia））；ドクムギ属（例えば、ホソムギ（Lolium perenne）またはネズミムギ（Lolium multiflorum））；クリプトメリア属（スギ（Cryptomeria japonica））；アルテルナリア属（アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata））；アルダー属（Alder）；アルナス属（ヨーロッパハンノキ（Alnus gultinoasa））；カバノキ属（シラカバ（Betula verrucosa））；コナラ属（ホワイトオーク（Quercus alba））；オリーブ属（オリーブ（Olea europa））；ヨモギ属（オオヨモギ（Artemisia vulgaris））；オオバコ属（例えば、ヘラオオバコ（Plantago lanceolata））；ヒカゲミズ属（例えば、ヨーロッパヒカゲミズ（Parietaria officinalis）またはカベイラクサ（Parietaria judaica））；チャバネゴキブリ属（例えば、チャバネゴキブリ（Blattella germanica））；アピス属（例えば、セイヨウミツバチ（Apis multiflorum））；イトスギ属（例えば、ホソイトスギ（Cupressus sempervirens）、アリゾナイトスギ（Cupressus arizonica）、モントレーイトスギ（Cupressus macrocarpa））；ビャクシン属（例えば、ジュニペルス・サビノイデス（Juniperus sabinoides）、エンピツビャクシン（Juniperus virginiana）、セイヨウネズ（Juniperus communis）およびアッシュジュニパー（Juniperus ashei））；クロベ属（例えば、コノテガシワ（Thuya orientalis））；ヒノキ属（例えば、ヒノキ（Chamaecyparis obtusa））；ゴキブリ属（例えば、ワモンゴキブリ（Periplaneta americana））；コムギダマシ属（例えば、シバムギ（Agropyron repens））；ライムギ属（例えば、ライムギ（Secale cereale））；コムギ属（例えば、パンコムギ（Triticum aestivum））；カモガヤ属（例えば、カモガヤ（Dactylis glomerata））；ウシノケグサ属（例えば、オニウシノケグサ（Festuca elatior））；イチゴツナギ属（例えば、ナガハグサ（Poa pratensis）またはコイチゴツナギ（Poa compressa））；カラスムギ属（例えば、エンバク（Avena sativa））；シラゲガヤ属（例えば、シラゲガヤ（Holcus lanatus））；ハルガヤ属（例えば、ハルガヤ（Anthoxanthum odoratum））；オオカニツリ属（例えば、オオカニツリ（Arrhenatherum elatius））；ヌカボ属（例えば、コヌカグサ（Agrostis alba））；アワガエリ属（例えば、オオアワガエリ（Phleum pratense））；クサヨシ属（例えば、クサヨシ（Phalaris arundinacea））；スズメノヒエ属（例えば、アメリカスズメノヒエ（Paspalum notatum））；モロコシ属（例えば、セイバンモロコシ（Sorghum halepensis））；およびスズメノチャヒキ属（例えば、スズメノチャヒキ（Bromus inermis））。

別の例では、本開示は、低応答性（hypo-responsive）の対象におけるアレルギー性炎症を予防、軽減、または治療する方法を提供する。本明細書で使用する低応答性の対象とは、喘息またはアレルギーの治療または予防を目的とした治療に以前に応答しなかった対象、またはそのような治療に応答しないリスクがある対象のことである。低応答性である対象には、喘息/アレルギーの薬剤に抵抗性（refractory）である対象が含まれる。本明細書で使用する用語「抵抗性」とは、治療に対して抵抗する、または降伏しないことを意味する。そのような対象は、これまで喘息/アレルギーの薬剤に応答したことがない対象（すなわち、不応答者である対象）であるか、あるいは、一度は喘息/アレルギーの薬剤に応答したが、それ以降は該薬剤に抵抗性になった対象であり得る。いくつかの態様では、対象は薬剤のサブセットに抵抗性のある対象である。薬剤のサブセットとは、少なくとも1つの薬剤のことである。いくつかの態様では、サブセットとは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10種の薬剤を指す。一例では、低応答性の対象は、アレルギー性炎症（例えば、喘息）の治療または予防を目的とした治療に以前に応答したかどうかに関わらず、高齢の対象である。別の例では、低応答性の対象は、新生児の対象である。

対象へのEzh2阻害剤の投与は、任意の適切な手段、例えば、静脈内、経口、経皮、全身、および/または筋肉内経路で行うことができる。いくつかの例では、Ezh2阻害剤は吸入によって投与される。いくつかの例では、Ezh2阻害剤は、β-アドレナリン作動薬、テオフィリン化合物、コルチコステロイド、抗コリン作動薬、抗ヒスタミン薬、カルシウムチャネル遮断薬、クロモリンナトリウム（cromolyn sodium）、またはそれらの組み合わせであり得る薬物と共投与することができる。

いくつかの例では、Ezh2阻害剤は、アレルギーの薬剤と共投与される。アレルギーの薬剤には、抗ヒスタミン薬、ステロイド薬、およびプロスタグランジン誘導剤が含まれるが、これらに限定されない。抗ヒスタミン薬は、マスト細胞または好塩基球によって放出されたヒスタミンに対抗する化合物である。これらの化合物は当技術分野でよく知られており、アレルギーの治療によく使われている。抗ヒスタミン薬としては、ロラチジン、セチリジン、ブクリジン、セチリジン類縁体、フェキソフェナジン、テルフェナジン、デスロラタジン、ノルアステミゾール、エピナスチン、エバスチン、アステミゾール、レボカバスチン、アゼラスチン、トラニラスト、テルフェナジン、ミゾラスチン、ベタタスチン、CS 560、HSR 609などが挙げられるが、これらに限定されない。プロスタグランジン誘導剤は、プロスタグランジン活性を誘導する化合物である。プロスタグランジンは、平滑筋の弛緩を調節することによって機能する。プロスタグランジン誘導剤としては、S-5751が挙げられるが、これに限定されない。

いくつかの例では、Ezh2阻害剤は、ステロイド薬、免疫調節剤、または非ステロイド性グルココルチコイド受容体アゴニストと組み合わせて投与することができる。ステロイド薬としては、ベクロメタゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、コルチコステロイド、ブデソニドなどが挙げられるが、これらに限定されない。コルチコステロイドは、症状の発生を防ぎ、イニシエーターに起因する炎症を抑制し、制御し、改善するために長期的に使用される。コルチコステロイドには、吸入によって投与できるものと、全身投与できるものがある。吸入用のコルチコステロイドは、遅延反応型アレルゲンをブロックし、かつ気道の過敏性を軽減することで抗炎症機能を示す。また、これらの薬物は、サイトカインの産生、接着タンパク質の活性化、炎症細胞の移動と活性化を抑制する。

コルチコステロイドには、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾンプロピオン酸エステル、トリアムシノロンアセトニドなどがあるが、これらに限定されない。デキサメタゾンは抗炎症作用のあるコルチコステロイドであるが、それは高度に吸収され、かつ有効量で長期の抑制的副作用があるため、吸入の形での喘息/アレルギーの治療に常用されることはない。全身性コルチコステロイドには、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンなどがあるが、これらに限定されない。コルチコステロイドは、進行を防ぎ、炎症を改善し、回復を早めるために、一般に中等度から重度の増悪に使用される。これらの抗炎症化合物には、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾンが含まれるが、これらに限定されない。

免疫調節剤には、抗炎症薬、ロイコトリエン拮抗薬、IL-4ムテイン、可溶性IL-4受容体、免疫抑制剤（寛容型ペプチドワクチンなど）、抗IL-4抗体、IL-4アンタゴニスト、抗IL-4Rα抗体、抗IL-5抗体、抗IL-5受容体抗体、可溶性IL-13受容体-Fc融合タンパク質、抗IL-9抗体、CCR3アンタゴニスト、CCR5アンタゴニスト、VLA-4阻害剤、およびIgEのダウンレギュレーターが含まれるが、これらに限定されない。

ロイコトリエン修飾薬は、軽度の持続性喘息の症状を長期的にコントロールして、予防するために使用されることが多い。ロイコトリエン修飾薬は、LTD-4およびLTE-4受容体について選択的に競合することで、ロイコトリエン受容体拮抗薬として機能する。これらの化合物としては、ザフィルルカスト（zafirlukast）錠、ジロイトン（zileuton）錠などが挙げられるが、これらに限定されない。

その他の免疫調節剤には、免疫調節作用をもつことが示されている神経ペプチドが含まれる。機能研究からは、例えば、サブスタンスPが特定の受容体媒介メカニズムによってリンパ球機能に影響を与えることが示された。サブスタンスPはまた、粘膜のマスト細胞からのアラキドン酸由来メディエーターの生成を刺激することで、明確な即時型過敏反応を調節することも示された。J. McGillies, et al., Substance P and Immunoregulation, Fed. Proc. 46:196-9 (1987)。

別の化合物のクラスは、IgEのダウンレギュレーターである。これらの化合物には、IgE受容体に結合することによって抗原特異的IgEの結合を妨げる能力を持つペプチドまたは他の分子が含まれる。IgEのダウンレギュレーターの別のタイプは、ヒトIgE分子のIgE受容体結合領域に対するモノクローナル抗体である。したがって、IgEのダウンレギュレーターの1つのタイプは、抗IgE抗体または抗体フラグメントである。

長期管理薬（long-term control medication）としては、コルチコステロイド（グルココルチコイドとも呼ばれる）、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、クロモリンナトリウム、ネドクロミル、長時間作用型β2刺激薬、メチルキサンチン、ムスカリン受容体拮抗薬、ロイコトリエン修飾薬などの化合物が含まれる。即効薬（quick relief medication）は、アレルギーまたは喘息の反応に起因する症状を迅速に緩和するのに有効である。即効薬には、短時間作用型β2刺激薬、抗コリン作動薬、全身性コルチコステロイドが含まれる。

クロモリンナトリウムとネドクロミルは、主に運動に起因する喘息症状またはアレルゲンに起因するアレルギー症状を予防するための長期管理薬として使用される。これらの化合物は、クロライドチャネルの機能を妨害することにより、アレルゲンに対する初期および後期の反応をブロックすると考えられる。それらはまた、マスト細胞膜を安定化させ、好酸球および上皮細胞からのメディエーターの活性化と放出を抑制する。最大のベネフィットを得るためには、一般に4～6週間の投与期間が必要である。

抗コリン作動薬は、一般的に急性気管支痙攣の緩和に使用される。これらの化合物は、ムスカリン性コリン作動性受容体の競合的阻害によって機能すると考えられる。抗コリン作動薬としては、臭化イプラトロピウムが挙げられるが、これに限定されない。これらの化合物は、コリン作動薬により媒介される気管支痙攣のみを改善し、抗原に対するいかなる反応も変更しない。

リンパ球誘発炎症の予防および/または治療
特定の例では、Ezh2阻害剤は、リンパ球誘発炎症を発症するリスクのある対象の予防、またはリンパ球誘発炎症を有する対象の治療に使用される。リンパ球誘発炎症は、免疫系、特にTヘルパー1細胞およびTh17細胞などのT系統の細胞によって媒介される炎症状態を指す。炎症におけるこれらの細胞の役割は広く発表されている（例えば、Crane IJ et al. (2005) Crit. Rev. Immunol. 25(2):75-102参照）。Th1型炎症反応に関連するケモカインには、IFN-γ、CXCL10、CXCL9、CXCL11、CCL3、CCL4、およびCCL5が含まれ、これらは炎症部位での高い病原潜在性に寄与している。炎症組織でケモカインが産生される主な経路は、炎症性サイトカインを介した経路であり、Th1反応経由ではIL-1、TNF-αおよびIFN-γが含まれる。

当技術分野における一般的な認識は、多発性硬化症（MS）、1型インスリン依存性糖尿病、橋本甲状腺炎、関節リウマチなどのヒト自己免疫疾患がTh1介在性疾患であるというものである。本明細書に記載の方法は、以下を含むがそれらに限定されない、Th1が介在する自己免疫疾患の治療に適している：ループス（例えば、全身性エリテマトーデス）、セリアック病、急性散在性脳脊髄炎、急性運動性軸索型ニューロパチー、アジソン病、有痛脂肪症（ダーカム病）、成人スティル病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、自己免疫性膵炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、ビッカースタッフ脳炎、水疱性類天疱瘡、セリアック病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡、クローン病、皮膚筋炎、1型糖尿病、子宮内膜症、線維筋痛症、胃炎、巨細胞性動脈炎、グレーブス病、グレーブス眼症、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、若年性関節炎、扁平苔癬、ライム病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、視神経脊髄炎、小児急性発症神経精神症候群、心筋梗塞後症候群、乾癬、むずむず脚症候群（restless leg syndrome）、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス、強皮症、シェーグレン症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、血管炎、および白斑。

非アレルギー性喘息の予防および治療
本開示の方法は、非アレルギー性喘息の予防、軽減および/または治療をも包含する。非アレルギー性または内因性喘息では、アレルゲンは気道の炎症過程を促進する上で明らかな役割を担っていない。症状は、副鼻腔炎または気管支炎に関連する細菌感染症またはウイルス感染症によって誘発され得る。症状はまた、天候の変化、運動、室内の汚染物質、屋外の汚染物質、強い臭気、化学物質など、他の非アレルギー性要因によっても誘発されることがある。

当業者は、本開示の広範な一般的範囲から逸脱することなく、上記の態様に対して多くの変更および/または修正を行うことができることを理解するであろう。それゆえに、本態様はあらゆる点で例示的なものであって、制限的なものではないと見なされるべきである。本開示は、以下の非限定的な実施例を含む。

方法
マウス
Ezh2^fl/fl (Su et al, (2003) Nat Immunol 4, 124-131)、Eed^fl/fl (Xie et al. (2014) Cell Stem Cell 14, 68-80)、Suz12^fl/fl (Lee et al. (2015) Blood 126, 167-175)、Cbx5^fl/fl (Allan et al. (2012) Nature 487, 249-253)、およびTrim28^fl/fl (Cammas et al. (2000) Development 127, 2955-2963)マウスは、これまでに記載されたものである。

Cbx1^fl/flマウスは、Florence Cammas博士（IGBMC, Strasbourg）からの親切な贈り物であった。floxed株をCd4creマウスと交配させた（Lee et al. (2001) Immunity 15, 763-774）。全てのマウス系統をC57BL/6（Ly5.2）バックグラウンドで維持し、6週齢から12週齢の間で、週齢と性別を一致させて使用した。動物実験は、Walter and Eliza Hall Institute（WEHI）の動物倫理委員会のガイドラインに沿って実施した。

アレルギー性肺炎症のオボアルブミンモデル
マウスを、0日目と7日目に、滅菌PBS中に20μgの低エンドトキシンオボアルブミン（Worthington社）と2.25mgの水酸化アルミニウム（Sigma社）を含む200μLのAlum/OVAを腹腔内注射して免疫した。次いで、マウスを最低2週間休ませた後、PBS中の2％（w/v）オボアルブミン（Sigma社）を15分間ネブライザーで噴霧し、4日間毎日チャレンジした。最後のチャレンジの翌日（または本文に記載される時点）に、マウスを犠牲にし、気管支肺胞洗浄（250μL×2、滅菌PBSを使用）を行い、そこから細胞浸潤をフローサイトメトリーで解析し、無細胞BAL液をBio-Plex Pro（商標）サイトカインアッセイ（Biorad社）で分析した。その後、1mLの10％ホルマリンを気管から肺に挿入し、その場に少なくとも30分間配置したままにして、肺組織を固定した。次に、左葉の中央部を切除し、液体ホルマリンにさらに24時間浸した後、パラフィン包埋、切片化、過ヨウ素酸シッフ（PAS）ならびにヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）による染色を行った。染色したスライドをAperio Digital Pathology Slide Scannerで画像化し、PAS陽性の上皮細胞をカウントし、H＆E染色した切片の白血球浸潤をスコアリングチャート（図16）に従って評価することにより定量化した。各染色の少なくとも5つの20倍拡大視野からのスコアを、各マウスについて平均化した。

呼吸力学（respiratory mechanics）
肺機能は、FX1モジュールを備えたFlexiVentシステム（Scireq社, モントリオール, カナダ）を用いて、強制振動法により評価した。マウスをケタミン（150mg/kg）とキシラジン（15mg/kg）で麻酔した後、結紮して気管切開を行うことによりカニューレを挿入した。ベースラインの呼吸力学を記録し、続いて生理食塩水、その後漸増量のメタコリン（MCh）（0.1～30mg/mL）をエアロゾル化して噴霧した。呼吸インピーダンス（Z_rs）を測定し、定位相モデル（Constant Phase Model）へのフィッティングを通じて気道成分と実質成分に分割し、そこからニュートン抵抗（R_n；気道抵抗に相当）を算出した。

アレルギー性喘息のハウスダストダニモデル
マウスを、全ハウスダストダニ（HDM; ヤケヒョウヒダニ（D. Pteronyssinus），Greer Laboratories社）からのタンパク質抽出物の鼻腔内投与により0～2日目（10μg/マウス)、その後14～17日目（1μg/マウス）にチャレンジし、18日目に犠牲にした。評価項目は、上記のオボアルブミンモデルと同じであった。

GSK126インビボ投与
GSK126（Xcessbio biosciences社）を、ネブライザーによるオボアルブミンへの曝露の各日（Ovaチャレンジの4時間後）に75mg/kgおよび150mg/kgの用量で強制経口投与した。GSK126は、インビボ強制経口投与のために20％のCaptisol（登録商標）希釈剤中に溶解した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
総IgEとOVA特異的IgEを酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）で測定した。簡単に述べると、96ウェルプレートを、PBS中のラット抗マウスIgE（総IgEの測定のため；Southern Biotechクローン＃23G2、カタログ番号1130-01）またはOVAタンパク質（OVA特異的IgEのため）のいずれかで一晩コーティングした。サンプルを希釈し（パイロットアッセイに基づいて総IgEは1：50～1：200、OVA特異的IgEは1：50～1：100）、2つ組でインキュベートした後、GAM Fc特異的ポリクローナル抗IgE-HRPとインキュベートし、TMB基質（Thermo Scientific ＃34028）を用いて比色検出を行い、450nmの吸光度を測定した。吸光度値は、同じプレートに含まれるマウスIgE抗DNP（クローンSPE-7）の標準曲線（0.1ng/mL～1μg/mL）を参照して、総IgEレベルに変換した。OVA特異的IgEの吸光度は、測定前に選択された参照OVA免疫化WTマウスに対して相対的に表した。全てのELISAは、治療と遺伝子型を盲検化して実施された。

T細胞培養
ナイーブCD4⁺ T細胞は、マウス脾臓由来の単細胞懸濁液からMACS分離キット（Miltenyi Biotech社）を用いて分離した。細胞をCellTrace（商標）Violet（CTV, Thermo Fisher社）で標識した後、抗CD3（10μg/mL）および抗CD28（5μg/mL）でプレコーティングした96ウェルプレートにおいて、10％熱不活化ウシ胎児血清、2mM GlutaMAX（商標）および0.05mM β-メルカプトエタノールを添加したRPMI-1640培地中で活性化した。示されている場合は、細胞活性化の開始時にEzh2阻害剤GSK126で細胞を処理した。

イムノブロッティング
イムノブロッティングのために、RIPAバッファー（Millipore社）中で細胞を溶解して全細胞抽出物を調製した。ブラッドフォード（Bradford）アッセイを実施して、各溶解物中の総タンパク質含有量を定量化し、同等のタンパク質含有量のサンプルを、4－12％勾配のSDS-PAGE（Life Technologies社）で変性条件下に分解して、ニトロセルロース膜（Biorad社）に転写した。膜を以下の抗体でプローブした：ヤギ抗アクチン-HRP（sc-1616, Santa Cruz社)、ウサギ抗Ezh2（＃12408, Cell Signaling社)、ウサギ抗Suz12（Cell Signaling社)、マウス抗HP1α（＃05-689, Millipore社)、マウス抗HP1β（＃MAB3448, Millipore社)、ウサギ抗LaminB1（＃ab16048, Abcam社)、マウス抗TIF1β（＃MAB3662, Millipore社)。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーによる解析とソーティングには、以下のマウス抗原に対する蛍光色素コンジュゲート抗体の染色パネルを使用した。
1. 洗浄（lavage）および脾臓イムノフェノタイピングパネル：BD Pharmingen社製のCD19 (1D3)-BUV395およびSiglecF (E50-2440)-PE；eBioscience社製のCD11c(N418)-FITC、CD8α(53-6.7)-PerCPe710、Ly6c (HK1.4)-e450、GR1(RB6-8C5)-PECy7およびTCRβ(H57-597)-APCe780；CD4(GK1.5)-AlexaFluor647およびCD11b(M1/70)-AlexaFluor700は社内で作製した。
2. 細胞内サイトカインの解析：Biolegend社製のIL-4(11B11)-BV421、CD4(GK1.5)-PECy7、CD44(IM7)-APCCy7；BD Pharmingen社製のIFNγ(XMG1.2)-APC、TCRβ(H57-597)-PE；B220(RA3-6B2)-FITCは社内で作製した。
3. OVAテトラマーパネル：Biolegend社製のCD4(GK1.5)-PECy7およびCD19(6D5)-PerCPCy5.5またはB220(RA3-6B2)-Pacific Blue；BD Pharmingen社製のCD44(IM7)-FITC；eBioscience社製のTCRβ(H57-597)-APCe780；CD11b(M1/70)-AlexaFluor700は社内で作製した。
4. T細胞活性化パネル：eBioscience社製のCD25(PC61.5)-PerCPCy5.5；Miltenyi Biotech社製のCD69(H1.2F3)-APC。
5. CD4+ T細胞およびB細胞ソーティングパネル：eBioscience社製のTCRβ(H57-597)-APC；CD4(GK1.5)-PE、CD8α(53-6.7)-FITC、CD19(1D3)-Pacific Blueは社内で作製した。

表面染色を4℃で30分間行い、ヨウ化プロピジウムまたはSytoxBlue排除を生細胞インジケーターとして用いた。

細胞内サイトカイン染色は、FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set（Affymetrix eBioscience ＃00-5523）を用いて、メーカーの指示に従って行った。PMA（20ng/mL）およびイオノマイシン（500ng/mL）による5時間の刺激を用いてサイトカインの産生を促し、最後の2時間にBD GolgiStop（商標）Protein Transport Inhibitor（BD Pharmingen ＃554724）を添加して細胞内蓄積を可能にした。

OVA特異的CD4⁺ T細胞のテトラマーベースの濃縮は、James Moon博士（Massachusetts General Hospital, 米国）から惜しみなく提供されたPEコンジュゲートOVA-2CおよびOVA-3Cペプチド：MHCクラスIIテトラマーを用いて、（Moon et al, 2011）に記載されるように行った。アネキシンV-FITC（BD Pharmingen ＃556419）染色は、ヨウ化プロピジウムの添加および解析の前に、1×結合バッファー（PBS中の10mM HEPES, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl₂）中で行った。全ての実験で、BD FACS Canto II、BD FORTESSA X-20を用いて染色された細胞を解析し、SPHERO（商標）Rainbowキャリブレーションビーズを用いて絶対細胞数を算出した。示されている場合は、BD FACSARIA IIIを用いて細胞をソーティングした。

バイオインフォマティクス解析
もともとはMartinez-Llordellaら（(2013) J Exp Med 210, 1603-1619）によって作成された、ヒトのナイーブCD4⁺ T細胞活性化マイクロアレイデータセットは、Gene Expression Omnibus（GEO）、アクセッションGSE39594を通じて公開されている。これらのデータは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayプラットフォームを用いて作成された。これらのデータは、非刺激および抗CD3＋抗CD28という異なる条件下で24時間培養したCD4⁺ T細胞のデータで構成される。各グループは3つの反復試験サンプルを含み、サンプル数は合計6となる。全てのCELファイルをダウンロードし、プローブの発現を計算し、robust multi-array average expression（RMA）を用いて正規化した（Irizarry et al. (2003) Biostatistics 4, 249-264）。プローブは、それらの発現が少なくとも3つのサンプルにおいて6未満であった場合には、データから除外した。また、entrez gene IDを持たないプローブも除去した。これらのデータの解析は、limma（Ritchie et al (2015) Nucleic acids research 43, e47）ソフトウェアパッケージを用いて行った。発現の差異（differential expression）は、線形モデルおよび傾向のある事前分散（trended prior-variance）を伴う経験ベイズ調整t統計量（empirical bayes moderated t-statistics）を用いて、倍率変化閾値1.2に対してグループ間で評価した（McCarthy and Smyth (2009) Bioinformatics 25, 765-771）。Benjamini-Hochberg法を用いてp値を調整し、FDRを5％未満にコントロールした。平均差プロットは、limmaのplotMD関数を使って作成した。

実施例1 CD4 ⁺ T細胞の活性化の間にアップレギュレートされるヘテロクロマチン成分の同定
本発明者らは、アレルギー性免疫反応において重要な調節的役割を果たし、それゆえに潜在的な治療標的になり得るクロマチン関連タンパク質が、T細胞の活性化後にアップレギュレートされるかどうかを検討した。そのような分子を特定するために、一般に公開されているマイクロアレイデータでヒストン修飾に関連する34の異なる抑制性クロマチン成分をコードする遺伝子の発現を、非刺激ヒトCD4⁺ T細胞と24時間刺激したものとを比較して調べた（Martinez-Llordella et al. (2013) J Exp Med 210, 1603-1619）。

PRC2-H3K27me3（EZH2、EED、RBBP7）およびSuv39h-HP1-H3K9me3（SUV39H1、SUV39H2、CBX1、CBX3、CBX5およびTRIM28）経路に関連する分子は、T細胞の活性化に応答して有意にアップレギュレートされた（調整p＜0.05）；一方、PRC1メンバー（BMI1、RING1、CBX2、4、7および8）、大部分のHDAC（HDAC2を除く）、その他のリシンメチルトランスフェラーゼ、例えば、DOT1L、EZH1、EHMT1、2およびSETDB1など、の他の成分は、有意に変更されず、むしろダウンレギュレートされた（図1a）。したがって、図1dに示した2つの主要なエピジェネティックなサイレンシング経路の成分は、T細胞の活性化後にアップレギュレートされた。

次に、これらのクロマチン修飾遺伝子の活性化誘導調節をタンパク質レベルで検討した。野生型マウスCD4⁺ T細胞を活性化し、イムノブロッティングを行って、信頼できる抗体が入手できる各タンパク質のレベルを評価した。マイクロアレイ解析と一致して、24時間活性化された細胞では、PRC2成分であるEzh2およびSuz12のタンパク質レベルの大幅な増加が観察された（図2bおよび2c)。本発明者らはまた、HP1α（Cbx5）およびHP1β（Cbx1）のタンパク質レベルの増加をも観察したが、HP1結合因子である転写仲介因子（transcription intermediary factor）1β（Trim28によりコードされるTIF1β）の発現は、この時点で変化しなかった（図2bおよび2c）。

LaminB1を核内ローディング対照として使用したところ、活性化されたサンプルではLaminB1が低いことがわかった（図2b）；このことから、これらのエピジェネティックなサイレンシング経路のタンパク質成分の核内アップレギュレーションは過小評価されたことが示唆される。このデータに基づいて、本発明者らは次に、アレルギー性喘息におけるSuv39h-H3K9me3経路のPRC2およびコリプレッサーの重要性を、T細胞でそれらを特異的に不活性化することによって探ることにした。

実施例2 Suv39h-H3K9me3-HP1経路の補助成分はアレルギー性炎症の発症には必要ない
T細胞の活性化後にSuv39h1-H3K9me3-HP1経路の多くの分子がアップレギュレートされたことから（図2）、アレルギー反応におけるHP1α、HP1βおよびTIF1βの役割を調べた。以前に、本発明者らは、HP1α（Cbx5）はTh2細胞の安定性に関与しているが、HP1γ（Cbx3）は関与しておらず（Allan et al (2012) Nature 487, 249-253）、HP1γは有力な候補ではないとしていた。そのため、loxP配列によって挟まれたCbx5（HP1α）、Cbx1（HP1β）、またはTrim28（TIF1β）のエクソンを有するマウスを、Cd4プロモーターの制御下でcreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交配させた。これらの各系統のT細胞において特異的に遺伝子産物が失われていることを確認するために、脾臓のB細胞（B220⁺）とCD4⁺ T細胞（TCRβ⁺, CD4⁺）をソーティングし（図3a）、ウエスタンブロッティングによりHP1α、HP1βおよびTIF1βタンパク質の発現を調べた（図3b）。さらなる解析から、これらのマウスは全てが正常なT細胞の発達を示すことが明らかにされた（データは示されない）。これらのマウスがアレルギー反応を起こす能力を試験するために、肺環境の細胞組成およびサイトカイン組成の包括的な分析の前に、古典的なオボアルブミン（OVA）チャレンジモデルに供した。このモデルでは、マウスを最初に水酸化アルミニウム（Alum）アジュバントの存在下でOVAに感作させてから、エアロゾル化OVAでチャレンジした。これらの分子を欠失しているにもかかわらず、驚いたことに、これらのマウスは正常な細胞浸潤を示し、同腹仔マウスと同等のアレルギー病理を発症した（図4a～4d）。バックグラウンド効果からの交絡する影響を排除するために、ナイーブなCbx5^fl/flCd4^Cre、Cbx1^fl/flCd4^Cre、およびTrim28^fl/flCd4^Creマウスとそれらのfloxedマウスの気管支肺胞洗浄（BAL）を行ったところ、欠損マウスまたはfloxedマウスの肺内の個々の白血球集団に差異は見られず、予想通り、肺胞マクロファージが最大の細胞集団を形成していた（図5）。OVAを曝露したマウスからの無細胞洗浄液のBioplexサイトカイン解析では、サイトカインレベル（図4e）、特にCbx5^fl/flCd4^CreマウスでのIL-4およびIL-5レベルに、いくつかの変化が見られたが、これは、炎症性浸潤の減少または肺病理の減少にはつながらなかった（図4a～4d）。したがって、HP1α、HP1β、およびTIF1β分子は、T細胞がアレルギー性炎症を引き起こすのに重要ではない。

実施例3 T細胞はPRC2成分に依存してアレルギー性炎症を引き起こす
次に、本発明者らは、Ezh2がT細胞の活性化後に最もアップレギュレートされた遺伝子およびタンパク質であったので、アレルギー反応におけるEzh2の役割を調べた。Ezh2のエクソン（Su et al. (2003) Nat Immunol 4:124-131）がloxP配列によって挟まれたマウスと、Cd4プロモーターの制御下でcreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスを交配させた（Lee et al. (2001) Immunity 15:763-774）。これにより、T細胞系統においてEzh2が効率的に欠失された；このマウスは正常なT細胞の発生・発達を示すが、CD8メモリー表現型とNKT細胞の増殖に変化がある（Vasanthakumar et al. (2017) EMBP Rep 18:619-631）。対照として、遺伝子欠損によって引き起こされる既存のまたは自然発生的な免疫反応を試験するために、一部のマウスをOVAチャレンジの前にAlumのみに曝露した（図6a）。まず、BALの浸潤状況をフローサイトメトリーで調べた。Ezh2^fl/flCd4^Creマウスは、OVAチャレンジ後の気道への好酸球、好中球およびT細胞の浸潤から完全に保護された（図6b～6d）。（図6c）でゲートされた好中球、好酸球、肺胞マクロファージおよびT細胞集団のFSC対SSCプロファイルを（図7）に示す。これらの集団のそれぞれは、（図6b）に示したFSC対SSCプロットで確認できる主要な細胞集団に対応する。これらのEzh2^fl/flCd4^Creマウスから回収された細胞は、主に、常在する非炎症性の細胞集団である肺胞マクロファージ（FSC^hi, SSC^hi, CD11b⁺, CD11c⁺, SiglecF⁺）であり、その数はグループ間で一貫していた。

次に、Ezh2^fl/flCd4^Creマウスと対照マウスにおいて、OVAチャレンジ後の組織病理を調べた。OVA感作Ezh2^fl/flCd4^Creマウスは、PAS^＋粘液産生細胞および肺組織炎症レベルのOVA誘発増加から完全に保護され（図6eおよび6f）、Alumのみで感作された対照マウスと統計的に区別できなかった（図6eおよび6f）；これにより、T細胞でEzh2を欠失させると、肺のアレルギー疾患に特徴的な、肺の炎症と粘液の過剰分泌を完全に防ぐことができることが実証された。次に、この肺炎症からの保護が肺機能の改善につながるかどうかを検討した。吸入用の気管支収縮薬（メタコリン0.1～30mg/mL）と組み合わせた強制振動法を用いて、Ezh2^fl/fl対照マウスで見られたOVA誘発過敏反応は、Ezh2^fl/flCd4^Creマウスには存在せず、その気道抵抗（Rn）はチャレンジを受けなかったBl/6野生型マウスと区別できないことがわかった（図6g）。

また、本発明者らは、より生理学的に適切なアレルゲンであるハウスダストダニ（HDM）抽出物を用いたアレルギー性炎症の代替モデルを使用した（図8a）。OVAモデルを用いた以前の知見と一致して、Ezh2^fl/flCd4^CreマウスはHDM誘発アレルギー性炎症の発症から完全に保護された（図8b-3-e)。Ezh2^fl/fl対照マウスにおけるBAL白血球のHDM誘発増加は、Ezh2^fl/flCd4^Creマウスでは顕著に減少し、Ezh2^fl/flCd4^Cre洗浄液から回収された細胞数はPBS曝露した対照マウスと区別がつかなかった（図8c）。細胞浸潤は主に好酸球とT細胞であり、このモデルではロバストな好中球の蓄積はなかった（図8c）。肺の組織病理は、Ezh2^fl/fl対照と比較して、HDMによるチャレンジを受けたEzh2^fl/flCd4^Creマウスでは粘液産生細胞の減少および肺の炎症レベルの低下を明らかにし（図8dおよび8e）、OVAモデルを用いた以前の結果と一致した。全体として、これらの結果は、T細胞におけるEzh2の存在が、気道でのアレルギー反応にとって絶対的に必要であることを示唆している。

Ezh2が、PRC2複合体の酵素成分として、その正規の役割を通じて、アレルギー性炎症を媒介していたことを確認するために、本発明者らは、特にT細胞において、PRC2の非冗長性のコア成分であるSuz12およびEedを個別に不活性化した。重要なことは、T細胞活性化ヒトマイクロアレイデータセットにおいて、EEDがEZH2に次いで高度にアップレギュレートされた抑制成分であり（図2a）、マウスT細胞ではSuz12がタンパク質レベルで高度にアップレギュレートされたことである（図2c）。T細胞コンパートメントにおいてSuz12（Lee et al. (2015) Blood 126:167-175）またはEed（Xie et al. (2014) 14:68-80）のいずれかを欠損させたマウス（Suz12^fl/flCd4^Cre，Eed^fl/flCd4^Cre）を用いて、本発明者らは、OVAチャレンジマウスの肺におけるアレルギー性組織病理の発生（図9a）、好酸球増多（図9b、9c）、およびサイトカイン産生（図9d）には、これらの分子が絶対的に必要であることを確認した。したがって、PRC2経路はT細胞アレルギーの発生に極めて重要である。

実施例4 Ezh2は抗原特異的メモリーの生成に必要である
次に、T細胞におけるPRC2成分の欠失がアレルギー性炎症を防ぐメカニズムについて検討した。最初に、OVAチャレンジ後の無細胞BAL液中のサイトカインレベルを調べたところ、Ezh2^fl/flCd4^Creマウスからの洗浄液では、Th2サイトカインであるIL-4、IL-5、ならびに炎症性サイトカインであるIL-6およびKC（CXCL8のマウスホモログ）を含めて、ほぼ全てのOVA誘導サイトカインがベースラインレベルにまで減少したことがわかった（図10a）。重要なことは、Ezh2の欠損により、BAL液においてTh1サイトカインへの偏りが起きず、IFNγレベルが全グループを通して一貫していたことである（図10b）。

次に、これらのマウスからの血清中のOVA特異的IgEと総IgEの力価をOVAチャレンジ後に定量化した。Ezh2^fl/flCd4^Creマウスは、血清総IgEが正常レベルであるにもかかわらず（図10c）、アッセイのバックグラウンドを上回る検出可能なOVA特異的IgEを欠いていることがわかった（図10c）。OVAチャレンジ後のBl/6対照マウスからの血清には、予想通り、検出可能なレベルのOVA特異的IgEが見られた（図10c）。

T細胞にEzh2を欠くマウスにおけるTh2発生を調べるために、OVAへの初回感作から10日後にEzh2^fl/flCd4^CreマウスとEzh2^fl/fl対照マウスから脾細胞を分離した。PMA/イオノマイシンで5時間刺激し、最後の2時間はGolgistopタンパク質輸送阻害剤の存在下で行ってサイトカインの産生を刺激し、その後フローサイトメトリーで細胞内IFNγおよびIL-4サイトカインの蓄積を評価した。抗原を経験したCD4⁺ T細胞コンパートメント（CD44⁺）において、IFNγおよびIL-4サイトカイン産生細胞の頻度は、Ezh2^fl/flCd4^CreマウスとEzh2^fl/fl対照マウスの間で差がないことがわかり（図10d、e）、Ezh2の非存在下でもTh2細胞が発生し得ることを示唆している。

初回OVA感作から10日後に、Ezh2^fl/flCd4^Creマウスと対照のfloxedマウスの脾臓と末梢リンパ節におけるOVA特異的CD4⁺ T細胞の頻度を調べたところ、Ezh2^fl/flマウスと比較して、Ezh2^fl/flCd4^CreマウスではOVA特異的CD4⁺ T細胞の数の劇的な減少が明らかになった（図10fおよびg）。実際、Ezh2^fl/flCd4^Creマウスからのテトラマー⁺ CD4⁺ T細胞の頻度は、非感作Bl/6対照のバックグラウンドレベルと統計的に区別できなかった（図10fおよびg）。これらのデータは、OVA特異的IgEの欠如とともに、Ezh2が抗原特異的メモリーを生成するために必要であることを示唆している。

本発明者らは、Ezh2の非存在下で抗原特異的CD4⁺ T細胞を生成できないのは、T細胞の増殖の欠陥によるものであるという仮説を立てた。驚くべきことに、Ezh2^fl/flCd4^CreマウスおよびBl/6対照マウスからのCD4⁺ T細胞をセルトレースバイオレット（CTV）色素で標識し、抗CD3抗体と抗CD28抗体を用いてインビトロで活性化すると、Ezh2^fl/flCd4^CreマウスとBl/6対照マウスの両方で同程度の漸進的な色素希釈が見られただけでなく、活性化マーカーCD25の同様のアップレギュレーションも見られた（図11a）；このことは、損なわれていない活性化応答および正常な細胞分裂を示唆している。しかし、細胞数を経時的に測定したところ、Ezh2^fl/flCd4^Creマウスからの細胞のクローン増殖には重大な欠陥が認められた（図11b）。細胞活性化の後にアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム染色を用いて細胞死のプロセスを定量化すると、野生型細胞と比較して、アポトーシスを起こしているEzh2^fl/flCd4^Cre細胞の割合の大幅な増加が示された（図11cおよびd）。したがって、PRC2機能を欠く細胞におけるこの時期尚早な細胞死はロバストなT細胞増殖を妨げ、それによって炎症性CD4⁺ T細胞応答を抑えている。

実施例5 Ezh2の阻害はインビボでT細胞増殖とアレルギー反応を抑制する
PRC2成分を欠損しているマウスがアレルギー性炎症を発症しないことが示されたので、Ezh2の小分子阻害剤GSK126を用いて、アレルギー疾患に対するその治療可能性について試験した。GSK126は、Ezh2メチルトランスフェラーゼ活性の選択的なS-アデノシル-L-メチオニン競合的小分子阻害剤であり、マウスモデルで腫瘍の成長を抑制することが示されている（McCabe et al. (2012) Nature 492:108-122）。Ezh2機能を欠くT細胞の活性化がアポトーシスの誘導と免疫応答の低下をもたらしたことを考慮して、Ezh2の小分子阻害は同様にT細胞の増殖を防ぐであろうという仮説を立てた。これを検証するために、活性化野生型CD4⁺ T細胞を、抗CD3抗体と抗CD28抗体を用いてインビトロで活性化し、GSK126に3日間曝露した。ビヒクル対照と比較して、培養物中に回収された細胞の数に対する用量依存効果が観察された（図12a）。

OVAエアロゾルチャレンジの各日に、OVA曝露の4時間後にGSK126を強制経口投与することにより、Ezh2活性をインビボで阻害した（図12b）。ビヒクルで処置した対照マウスのOVAチャレンジは、気腔への主に好酸球の蓄積をもたらし、好中球とT細胞の数はより少なかった（図12c）。150mg/kgのGSK126を投与すると、総BAL白血球数だけでなく、これらの個々の集団のそれぞれも劇的に減少した（図12c)。150mg/kgのGSK126で処置したマウスの気道では、PAS⁺ 粘液産生上皮細胞および肺組織の炎症レベルが同様に減少した（図12d、e）。75mg/kg用量のGSK126は、ビヒクル処置マウスと比較して、BAL細胞（図12c）、PAS染色（データは示してない）、または肺組織の炎症（データは示してない）に影響を及ぼさなかった。この薬物の投与は、脾臓のリンパ球と顆粒球の数に変化がなかったので、免疫細胞の全体的な減少につながらなかった（図13）。GSK126で処置したマウスの血清中のOVA特異的IgEおよび総IgEの濃度にも変化がなかった（図12f）；このことは、アレルギー患者には体液性および細胞性メモリーが存在するにもかかわらず、Ezh2の阻害が実行可能な治療戦略であることを示唆している。重要なことは、150mg/kg用量のGSK126が、OVA誘発気道過敏性に対する完全な防護をも提供したことである（図12g）。

実施例6 Ezh2の阻害は確立された炎症を抑制する
確立された炎症におけるEzh2阻害の治療可能性をさらに試験するために、シングルヒット実験を行った；この実験では、全身感作と、その後に毎日ネブライザーで噴霧されるOVAへの4日間曝露が続く標準的なOVAモデルでアレルギー性炎症を確立した。5日目に、以前に行ったようにアレルギー性炎症を評価するのではなく、GSK126（150mg/kg）を強制経口投与で単回投与し、3日後に気管支肺胞の炎症を評価した（図14a）。炎症が確立した後のこの単回投与は、BAL CD4⁺ T細胞数の減少をもたらし、顆粒球数を変更しなかった；このことは、肺の微小環境で活発に分裂しているアレルギー促進性のT細胞に対する選択的効果を示唆している（図14b）。

次に、1～4日目にOVAチャレンジを行って炎症を確立した後、治療計画を3回の投与（5日目、8日目および10日目）に拡張し、11日目に気道の炎症を評価した（図15a）。この治療計画でのEzh2の阻害は、気道炎症の減少をもたらし（図15b）、総BAL細胞、CD4⁺ T細胞、好酸球およびB細胞が全て、GSK126処置後に有意に減少した（図15b、c)。興味深いことに、回収されたBAL好酸球の数は、BAL CD4⁺ T細胞の数と高度に相関していた（図15d）；Pearson R²＝0.9261, P＜0.0001）。肺の組織病理学的検査により、治療的GSK126処置後にPAS⁺ 粘液産生細胞の減少が明らかになった（図15e、f）。しかし、肺の炎症レベルはこの時点（最終OVAチャレンジの7日後）までに低下しており、全てのグループは統計的に区別ができなかった（図15e、f）。全体として、このデータは、遺伝子不活性化実験を実証しており、Ezh2の酵素活性を阻害することは、確立された炎症においてさえも、アレルギー反応を抑制するための新規戦略となり得ることを示している。

備考
クロマチンにエピジェネティックな修飾を施すことに関与している酵素を標的とすることは、近年、数種類の阻害薬のデザインによって可能となってきている（Kelly et al., (2010) Nat Biotechnol. 28:1069-1078; Tough et al., (2016) Nat Rev Drug Discv 15:835-853）。エピジェネティックな機構の一部を標的とすることは広範囲の悪影響を及ぼすのではないかという懸念は、個々のエピジェネティック酵素を標的とする選択的小分子阻害剤が、EZH2を標的とする多くの阻害剤を含めて、癌患者で良好な忍容性を示す、ことを実証する臨床研究によって軽減されている（Gulati et al., (2018) Leuk Lymphoma 59:1574-1585; Tough et al., 2016 前記）。実際、本発明者らは、使用したGSK126の用量で、どのような全身的作用も観察しなかった。今回のデータは、Ezh2阻害が、最終分化した比較的転写的にサイレントな顆粒球集団ではなく、急速に分裂している細胞、例えばアレルギー反応を開始するCD4⁺ T細胞に選択的に作用することを裏付けている。これは、適応応答（adaptive response）がEzh2阻害を介して多少鈍化する可能性がある一方で、先天性応答（innate response）はそのまま残ることを示唆している。さらに、Ezh2阻害レベルのバランスを慎重に調整することは、抗原負荷が高い場合に十分なT細胞応答を維持しながら、望ましくないアレルギー/自己免疫の活性化を防護できそうである。したがって、Ezh2阻害は、肺の炎症を引き起こすリンパ球を標的とした実行可能な治療戦略に相当すると考えられる。

GSK126の治療計画を用いたデータは、Ezh2阻害が実際にアレルギー性喘息などの疾患の実行可能な治療戦略であるというさらなる証拠を提供する。Ezh2の遺伝的欠失は、抗原特異的CD4⁺ T細胞と抗原特異的IgEの発生を阻止し、それによって、オボアルブミンまたはハウスダストダニチャレンジに続く免疫反応を起こさないようにするが、GSK126による処置は、抗原特異的メモリーが十分に確立された場合でさえ、気道炎症と過敏反応性を軽減することができた。Ezh2阻害の治療有効性は、確立された炎症が進行している状況下でこの薬物を投与した場合に見られた。興味深いことに、気道好酸球増多とCD4⁺ T細胞数との間に観察された相関関係は、ヒト喘息の病態で見られるものを反映しており(Walker et al., (1991b) J Immunol. 146:1829-1835）、そして重要なことに、喘息の重症度とも相関している（Walker et al., (1991a）J Allergy Clin Immunol 88:935-942）。これらの結果は、ただの予防的治療薬としてでなく、コントロールできない疾患の治療薬としてのEzh2阻害剤の有用性を期待する理論的根拠を提供する。

ヒト試験におけるEzh2阻害剤の忍容性を考えると、全身経路で投与された場合でさえも、癌治療から炎症治療への移行はスムーズかつ迅速であることが期待される。特に、アレルギー性炎症の治療に使用される投与計画は、癌のそれよりもはるかに制限されており、理想的には臓器制限される（すなわち、アレルギー性喘息の場合は肺に制限される）ことが期待される。

別の例では、本開示は、炎症を予防するか、炎症の1つもしくは複数の症状を軽減するか、または炎症を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載されるEzh2阻害剤の使用を提供する。特定の例では、炎症はアレルギー性炎症である。
[本発明1001]
対象における炎症を予防するか、炎症の1つもしくは複数の症状を軽減するか、または炎症を治療するための方法であって、PRC2（polycomb repressive complex 2）メチルトランスフェラーゼEzh2（enhancer of zeste homolog 2）の阻害剤を該対象に投与することを含む、方法。
[本発明1002]
炎症がアレルギー性炎症である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
炎症がリンパ球によって引き起こされる炎症である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
炎症がTh細胞によって引き起こされる、本発明1003の方法。
[本発明1005]
リンパ球によって引き起こされる炎症が慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患または糖尿病である、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
炎症が非アレルギー性喘息である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
アレルギー性炎症がアレルゲンによって開始される任意の障害である、本発明1002の方法。
[本発明1008]
アレルギー性炎症が、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、蕁麻疹（発疹）、食物アレルギー、薬物アレルギー、アナフィラキシー、および眼のアレルギー性障害からなる群より選択される、本発明1002の方法。
[本発明1009]
かゆみ、鼻水、くしゃみ、涙目、気管支収縮、発疹、気道炎症、アナフィラキシー、および皮膚炎からなる群より選択されるアレルギー性炎症の1つまたは複数の症状の影響を軽減する、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1010]
Ezh2阻害剤が、免疫グロブリン（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、siRNA、アンチセンス分子、ペプチドまたは薬物（例えば、小分子阻害剤）からなる群より選択される、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
Ezh2阻害剤が喘息および/またはアレルギーの治療薬と組み合わせて投与される、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記対象が炎症性障害を発症するリスクのあるものである、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記対象がアレルギー性炎症性障害を有する、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記対象が喘息を有する、本発明1002～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記対象がezh2遺伝子について野生型である、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記対象がezh2遺伝子について変異型である、本発明1001～1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
対象における炎症の予防、炎症の1つもしくは複数の症状の軽減、または炎症の治療に使用するためのEzh2阻害剤。
[本発明1018]
炎症を予防するか、炎症の1つもしくは複数の症状を軽減するか、または炎症を治療するための医薬の製造におけるEzh2阻害剤の使用。

Claims (18)

1. 対象における炎症を予防するか、炎症の1つもしくは複数の症状を軽減するか、または炎症を治療するための方法であって、PRC2（polycomb repressive complex 2）メチルトランスフェラーゼEzh2（enhancer of zeste homolog 2）の阻害剤を該対象に投与することを含む、方法。
2. 炎症がアレルギー性炎症である、請求項1に記載の方法。
3. 炎症がリンパ球によって引き起こされる炎症である、請求項1に記載の方法。
4. 炎症がTh細胞によって引き起こされる、請求項3に記載の方法。
5. リンパ球によって引き起こされる炎症が慢性閉塞性肺疾患（COPD）、自己免疫疾患または糖尿病である、請求項3または4に記載の方法。
6. 炎症が非アレルギー性喘息である、請求項1に記載の方法。
7. アレルギー性炎症がアレルゲンによって開始される任意の障害である、請求項2に記載の方法。
8. アレルギー性炎症が、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、蕁麻疹（発疹）、食物アレルギー、薬物アレルギー、アナフィラキシー、および眼のアレルギー性障害からなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
9. かゆみ、鼻水、くしゃみ、涙目、気管支収縮、発疹、気道炎症、アナフィラキシー、および皮膚炎からなる群より選択されるアレルギー性炎症の1つまたは複数の症状の影響を軽減する、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
10. Ezh2阻害剤が、免疫グロブリン（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）、オリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、siRNA、アンチセンス分子、ペプチドまたは薬物（例えば、小分子阻害剤）からなる群より選択される、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
11. Ezh2阻害剤が喘息および/またはアレルギーの治療薬と組み合わせて投与される、請求項1～10のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記対象が炎症性障害を発症するリスクのあるものである、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記対象がアレルギー性炎症性障害を有する、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記対象が喘息を有する、請求項2～13のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記対象がezh2遺伝子について野生型である、請求項1～14のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記対象がezh2遺伝子について変異型である、請求項1～14のいずれか一項に記載の方法。
17. 対象における炎症の予防、炎症の1つもしくは複数の症状の軽減、または炎症の治療に使用するためのEzh2阻害剤。
18. 炎症を予防するか、炎症の1つもしくは複数の症状を軽減するか、または炎症を治療するための医薬の製造におけるEzh2阻害剤の使用。

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