JP2022513489A - 葉酸代謝拮抗薬担持ナノ粒子および医薬におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、金属および／または半導体を含むコア、およびコアに共有結合した複数のリガンドを含むナノ粒子を提供し、前記リガンドは、（ｉ）炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および（ｉｉ）式Ｄ－Ｌ１－Ｚ－Ｌ２のリガンドであって、式中、Ｄは葉酸拮抗剤または葉酸を含み、Ｌ１はＣ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ２－Ｃ１２アルキル鎖を含む第１のリンカー部分を含み、Ｌ２はＣ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ２－Ｃ１２アルキル鎖を含む第２のリンカー部分を含み、Ｌ１およびＬ２は同じであるまたは異なってよく、ＺはＬ１およびＬ２を連結するカルボニル含有基であり、Ｌ２は前記コアに結合される、リガンド、を含む。このようなナノ粒子を含む医薬組成物、その医用使用およびナノ粒子を製造するための方法も提供される。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１８年１２月１４日出願のＧＢ１８２０４７０．１からの優先権を主張する。この出願の内容および要素は、本出願において参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、特に医薬としての使用のための、特定の組織型または部位への活性薬剤の送達のための担体としてのナノ粒子に関し、かつ癌を含む、炎症性、自己免疫性および増殖性障害の治療方法を含む。局所ゲル製剤を含む、医薬組成物、およびそれらの使用方法も開示される。

本発明は、組成物および製剤、ならびに哺乳動物および特にヒトの治療のためを含む、このような組成物および製剤の製造方法ならびに投与方法に関する。

葉酸代謝拮抗薬は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の阻害により、葉酸（ビタミンＢ９）の作用と拮抗する代謝拮抗薬の一種である。葉酸代謝拮抗薬は、細胞分裂、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成および修復ならびにタンパク質合成を阻害する。種々の葉酸代謝拮抗薬が、癌（例えば、血液系腫瘍および骨肉腫のためのメトトレキサート、非小細胞肺癌および中皮腫のためのペメトレキセド）および炎症性疾患（例えば、乾癬および関節リウマチのためのメトトレキサート）の治療に使用されてきた。ある種の葉酸代謝拮抗薬は、微生物ＤＨＦＲを選択的に標的にし、抗菌剤または抗マラリア薬として使用される（例えば、トリメトプリムピリメタミン）。

葉酸の細胞取り込みは、葉酸受容体アルファおよび葉酸受容体ベータなどの葉酸受容体により媒介される。葉酸受容体アルファは、卵巣腫瘍、乳腺腫瘍、腎腫瘍、結腸直腸腫瘍および脳腫瘍を含むいくつかの上皮由来腫瘍で過剰発現される。葉酸受容体を結合する抗体などの薬剤が、標的療法および癌の診断のために開発されている（例えば、卵巣癌のためのファーレツズマブ）。

治療薬のナノ粒子ベース送達は、標的化、浸透（例えば、皮膚浸透）または送達される薬剤の他の特性を改善するために採用され得る。ナノ粒子はまた、画像処理および診断にも使用される。例えば、Ｚｗｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｎｏ Ｒｅｖ，Ｖｏｌ．３，１０．３４０２、は、癌ナノ治療薬のアクティブターゲティングのための葉酸受容体の使用について概説している。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，４（２），ｐｐ．１４２－１５３は、腫瘍分子共存診断のための蛍光酵素模倣物として機能する葉酸－受容体－標的化金ナノクラスターについて記載している。金ナノクラスターは、無水ジメチルスルホキシド中でＥＤＣ／ＮＨＳカップリングを用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）被覆金ナノクラスターを葉酸と反応させることにより形成された（Ｈｕらの図１を参照）。

メトトレキサートおよびペメトレキセドなどの葉酸代謝拮抗薬の金ナノ粒子への複合化も、報告されている。米国出願公開第２０１５／０２３１０７７号は、ＭＴＸを含むアミン含有分子で不動態化された金ナノ粒子について記載している。Ｓｔｏｌａｒｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ．１０９，ｐｐ．１３－２０は、ペメトレキセド複合化金ナノ粒子について記載しており、この論文では、ペメトレキセドがカルボン酸基により金表面と相互作用することが提案された。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００７，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐｐ．７１３－７２２は、ＭＴＸの１３ｎｍのコロイド状金ナノ粒子への吸着（スキーム１参照）およびその後のＭＴＸ－ＡｕＮＰの種々の癌細胞に対する細胞傷害性効果の評価について記載している。Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，Ｖｏｌ．７８，ｐｐ．１７５－１８０は、ワンポット合成によるメトトレキサート複合化金ナノ粒子の製造、およびその後の癌細胞に対するＭＴＸ－ＡｕＮＰのインビトロ試験について記載している。Ｂｅｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２０１６，Ｖｏｌ．１４１，ｐｐ．１４１－１４７は、ナトリウム ３－メルカプト－１－プロパンスルホネートで官能化された水溶性金ナノ粒子（Ａｕ－３ＭＰＳ）上へのＭＴＸの非共有結合担持について記載しており、Ａｕ－３ＭＰＳ＠ＭＴＸが乾癬患者の局所療法として好適である可能性があることを提案している。Ａｕ－３ＭＰＳに対するＭＴＸの担持効率は、７０～８０％の範囲であると評価され、急速に放出される（１時間以内に８０％）。Ｆｒａｔｏｄｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１９，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．２７６－２８６は、皮膚炎症マウスモデルにおける局所Ａｕ－３ＭＰＳ＠ＭＴＸの効果について記載している。

これらの進展にもかかわらず、例えば、癌、炎症性および自己免疫疾患の治療のための葉酸受容体の標的化および／または葉酸代謝拮抗薬の送達のための、さらなるナノ粒子送達系に対する未充足のニーズが残されている。特に、改善された担持（例えば、より高い密度の葉酸代謝拮抗薬または葉酸ペイロードおよび／またはより高い担持効率）を示すナノ粒子およびその医薬組成物は、未充足のニーズとして残されている。本発明はこれらのニーズに対する解決策を提供し、関連する追加の利点を提供しようとするものである。

概して、本発明は、医薬で使用される葉酸代謝拮抗薬保持ナノ粒子およびその組成物に関する。本発明者らは、驚くべきことに、ナノ粒子への化合物の複合化の前にそれによりリンカーがその基に結合される、葉酸および葉酸代謝拮抗薬クラスに共通の構造基（カルボン酸基）の修飾が、ナノ粒子上の化合物の担持を顕著に高めることを見出した。さらに本明細書で記載されるように、末端アミンを有するエチレングリコール鎖を有する、修飾型メトトレキサートは、コア当り最大１０個またはそれを超えるメトトレキサート含有リガンドの平均担持を示し、一方でメトトレキサート分子上のカルボン酸基を介するナノ粒子上のアミン末端リンカーへの非修飾メトトレキサートの結合は、コア当り５個以下のメトトレキサート含有リガンドの平均担持を示した。担持の改善に加えて、メトトレキサートの修飾は、より均質なナノ粒子の集団をもたらし、これはおそらく、ナノ粒子へのメトトレキサートのより制御された結合部位の結果であろう。さらに、メトトレキサートなどの、葉酸代謝拮抗薬へのリンカー修飾（例えば、－（ＥＧ）_３－ＮＨ_２修飾）を使用して、構築物の溶解度を調節し、および／またはコロナリガンドの局所的順序を変え得る。また、本明細書の複合化ナノ粒子は、リガンド単独およびナノ粒子単独の活性に比べて、相乗的活性を示すことも考えられる。

従って、第１の態様では、本発明はナノ粒子を提供し、ナノ粒子は、
金属および／または半導体を含むコア、および
コアに共有結合した複数のリガンド、
を含み、上記リガンドは、
（ｉ）炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および
（ｉｉ）式Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２のリガンドであって、式中、Ｄは葉酸拮抗剤または葉酸を含み、Ｌ_１はＣ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２またはＣ２－Ｃ１２アルキル鎖を含む第１のリンカー部分を含み、Ｌ_２はＣ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２またはＣ２－Ｃ１２アルキル鎖を含む第２のリンカー部分を含み、Ｌ_１およびＬ_２は同じであるまたは異なってよく、Ｚは、Ｌ_１およびＬ_２を連結する最大１０個の原子の二価のリンカー基であり、Ｚは少なくとも２個のヘテロ原子を含み、Ｌ_２は上記コアに結合される、リガンド
を含む。

いくつかの実施形態では、Ｄは次の構造：

を含み、式中、
Ｘは、３～８員（例えば、５または６員）炭素環、ヘテロ環、炭素芳香環またはヘテロ芳香環であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有するリンカー基であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有する１個または複数の基で任意に置換され、
Ｑは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルから選択される１個または複数の基で任意に置換される融合二環式ヘテロ環またはヘテロ芳香環である。特に、Ｑは、置換プテリジンであり得る。

いくつかの実施形態では、Ｄは、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラリトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒａｘｅｄ）およびプララトレキサートからなる群より選択される葉酸拮抗剤を含む。

いくつかの実施形態では、Ｄは、次の構造：

から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｚは、３～１０員炭素芳香環、３～１０員炭素環、３～１０員複素環、３～１０員ヘテロ芳香環、イミド、アミジン、グアニジン、１，２，３－トリアゾール、スルホキシド、スルホン、チオエステル、チオアミド、チオウレア、アミド、エステル、カルバメート、カーボネートエステルまたはウレアを含む。いくつかの実施形態では、Ｚは、カルボニル含有基である。いくつかの実施形態では、Ｚは、１～６個の原子を含む。好ましくは、Ｚは、アミドを含む。

いくつかの実施形態では、Ｌ_１は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ－を含み、Ｌ_２は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ－を含み、ｐおよびｑのそれぞれは、２～１０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の範囲の数であり、ｐおよびｑは、同じであるまたは異なってよい。特に、ｐは、３であり得、および／またはｑは、８であり得る。

いくつかの実施形態では、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

である。

いくつかの実施形態では、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

である。

いくつかの実施形態では、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

である。

いくつかの実施形態では、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

である。

いくつかの実施形態では、Ｌ_２は、末端硫黄原子を介してコアに結合される。
特に、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

であり得る。

いくつかの実施形態では、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

であり得、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。

いくつかの実施形態では、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

であり得、ｎは、１～１５の整数である。

いくつかの実施形態では、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：

であり得、ｎは、１～１５の整数である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［希釈リガンド］_ｓ［Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２－Ｓ］_ｔ＠Ａｕであり得、ｓおよびｔは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは、２０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。
通常、ナノ粒子は、それらに結合されるＤを有しない未反応リンカーリガンドを有する。従って、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［希釈リガンド］_ｓ［Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２－Ｓ］_ｔ［ＣＯＯＨ－Ｌ_２－Ｓ］_ｕ＠Ａｕであり得、ｓ、ｔおよびｕは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは、２０超、例えば、３０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。いくつかの事例では、ｕは、１０超、例えば、２０超であり得る。

いくつかの実施形態では、希釈リガンドは、単糖または二糖である炭水化物を含む。例えば、希釈リガンドは、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、マルトース、ラクトース、ガラクトサミンおよび／またはＮ－アセチルグルコサミンを含み得る。
特に、希釈リガンドは、２’－チオエチル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドまたは２’－チオエチル－β－Ｄ－グルコピラノシドを含み得る。

いくつかの実施形態では、コアは、次記からなる群より選択される金属を含む：Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｚｎまたはこれらの任意の組み合わせ。特に、コアは、金を含み得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［α－ガラクトース－Ｃ２－Ｓ］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２－Ｓ］_ｔ＠Ａｕであり得、ｓおよびｔは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは、２０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式：
［α－ガラクトース－Ｃ２－Ｓ］_ｓ［ＭＴＸ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２－Ｓ］_ｔ［ＣＯＯＨ－Ｌ_２－Ｓ］_ｕ＠Ａｕであり得、ｓおよびｔは独立に、２以上の数である。いくつかの事例では、ｓは、２０超、例えば、３０超であり得る。いくつかの事例では、ｔは、３超、例えば、５超、あるいは１０超であり得る。いくつかの事例では、ｕは、１０超、例えば、２０超であり得る。

いくつかの実施形態では、コアの直径は、１ｎｍ～５ｎｍ、例えば、２～４ｎｍの範囲である。

いくつかの実施形態では、リガンドを含むナノ粒子の直径は、３ｎｍ～５０ｎｍの範囲である。直径は、ナノ粒子コアまたはナノ粒子の最長の直径とされる。測定は、例えば、電子顕微鏡または動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて行われ得る。

いくつかの実施形態では、コア当りのリガンド総数は、２０～２００個の範囲である。

いくつかの実施形態では、コア当りの上記式Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２のリガンドの数は、少なくとも１０個、任意選択で、少なくとも１５個である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、次の構造：

を有し、
式中、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である。好ましくは、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも１０、１５、または２０個である。好ましくは、コア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５、１０または１５個である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、次の構造：

を有し、式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である。好ましくは、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも１０、１５、または２０個である。好ましくは、コア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５、１０または１５個である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、次の構造：

を有し、式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である。好ましくは、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも１０、１５、または２０個である。好ましくは、コア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５、１０または１５個である。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、次の構造：

を有し、式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である。好ましくは、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも１０、１５、または２０個である。好ましくは、コア当りのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも５、１０または１５個である。

いくつかの実施形態では、複数のリガンドは、治療に活性な薬剤および／または検出可能部分をさらに含む。Ｄが葉酸受容体結合物質（例えば、葉酸受容体に結合する葉酸または葉酸代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート）を含む場合、これは特に有用であり得る。理由は、Ｄは、ナノ粒子が葉酸受容体発現細胞または組織に標的化されるようにし、かつこのような細胞または組織（例えば、腫瘍細胞または腫瘍組織）によるナノ粒子の取込を促進し得るためである。治療に活性な薬剤は、抗癌剤を含み得る。このように、ナノ粒子は、例えば、葉酸受容体過剰発現腫瘍の、葉酸受容体標的療法のために用いられ得る。同様に、ナノ粒子が検出可能部分（例えば、蛍光標識）であるリガンドを有する場合、ナノ粒子は、葉酸受容体を発現する癌の画像処理、診断および／または治療監視においてなどの、葉酸受容体を過剰発現する細胞または組織の検出に使用され得る。

いくつかの実施形態では、抗癌剤は、マイタンシノイド（例えば、マイタンシノイドＤＭ１またはマイタンシノイドＤＭ４）、ドキソルビシン、イリノテカン、白金（ＩＩ）、白金（ＩＶ）、テモゾロミド、カルムスチン、カンプトテシン、ドセタキセル、ソラフェニブ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびパノビノスタットからなる群から選択され得る。

第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の複数のナノ粒子および少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ゲル、任意選択でヒドロゲル、の形態であり得る。
いくつかの実施形態では、上記ゲルは、カーボポール（登録商標）９８０、カーボポール（登録商標）９７４およびカーボポール（登録商標）ＥＴＤ２０２０からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、上記ゲル中の前記葉酸拮抗剤の濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約２ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子コアは、金であり、上記ゲル中の金の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約４ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与用である。
いくつかの実施形態では、組成物は、全身投与用（例えば、静脈内または皮下注射用）である。

第３の態様では、本発明は、医薬での使用のための、本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物を提供する。

第４の態様では、本発明は、哺乳動物対象における増殖性障害、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療での使用のための、本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物を提供する。増殖性障害は、癌、例えば、葉酸受容体発現癌であり得る。特に、癌は、卵巣癌、乳癌、胸膜癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌または脳癌であり得る。

第５の態様では、本発明は、それを必要としている対象に本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物対象における増殖性障害、炎症性疾患または自己免疫疾患を治療する方法を提供する。増殖性障害は、癌、例えば、葉酸受容体発現癌であり得る。特に、癌は、卵巣癌、乳癌、胸膜癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌または脳癌であり得る。

第６の態様では、本発明は、本発明の第５の態様の方法での使用のための薬物の調製における、本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物の使用を提供する。

第７の態様では、本発明は、次記を含む製品を提供する：
本発明の第１の態様のナノ粒子または本発明の第２の態様の医薬組成物、
ナノ粒子または医薬組成物を入れるための容器、および
添付文書または標識。
いくつかの実施形態では、添付文書および／または標識は、哺乳動物対象における増殖性障害、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療におけるナノ粒子または医薬組成物の使用に関連する説明書、投与量および／または投与情報を提供する。増殖性障害は、癌、例えば、葉酸受容体発現癌であり得る。特に、癌は、卵巣癌、乳癌、胸膜癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌または脳癌であり得る。

第８の態様では、本発明は、式Ｄ－Ｌ_１－Ｒ_１の化合物を提供し、式中、Ｄは、葉酸拮抗剤または葉酸を含み、Ｌ_１は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ－を含み、ｐは、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の範囲の整数であり、Ｒ_１は、アミン基を含む。

いくつかの実施形態では、化合物は、構造式：

を有し、式中、
Ｘは、３～８員（例えば、５または６員）炭素環、ヘテロ環、炭素芳香環またはヘテロ芳香環であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有するリンカー基であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有する１個または複数の基で任意に置換され、
Ｑは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルから選択される１個または複数の基で任意に置換される融合二環式ヘテロ環またはヘテロ芳香環である。

いくつかの実施形態では、化合物は、構造式：

を有する。

第９の態様では、本発明は、式（ｈ）の化合物の製造のための工程を提供し、工程は次のステップ：

（ｉ）式（ａ）のアルコールのハロゲン化により、ハロゲン化合物（ａ１）を得て、これを、式（ｂ）のアミンによる置換反応に使用して式（ｃ）の化合物を得るステップ、
（ｉｉ）式（ｃ）と（ｄ）の化合物を用いてアミドカップリングを実施し、式（ｅ）のアミドを得るステップ、
（ｉｉｉ）式（ｅ）と（ｆ）の化合物を用いてアミドカップリングを実施し、式（ｇ）のアミドを得るステップ、
（ｉｖ）式（ｇ）の化合物のアミンおよびカルボン酸保護基を除去して、式（ｈ）の化合物を得るステップ、
を含み、Ｒ１は、カルボン酸保護基であり、Ｒ２は、アミン保護基である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、酸に不安定な保護基である。最も好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル保護基である。いくつかの実施形態では、ｎは、３である。いくつかの実施形態では、ハロゲン化は、塩素化、臭素化またはヨウ化である。好ましくは、ハロゲン化は、トリフェニルホスフィンジブロミドによる臭素化である。

第１０の態様では、本発明は、式（ｈ）の化合物の製造のための工程を提供し、工程は次のステップ：

（ｉ）式（ａ）のアミンを第１の保護基で保護して、式（ｂ）の化合物を得るステップ、
（ｉｉ）式（ｂ）の化合物を用いてアミドカップリングを実施して、式（ｃ）のアミドを得るステップ、
（ｉｉｉ）式（ｃ）のアミドから第２のアミン保護基を除去して、式（ｄ）の化合物を得るステップ、
（ｉｖ）式（ｄ）の化合物を用いてアミドカップリングを実施して、式（ｅ）のアミドを得るステップ、
（ｖｉ）Ｑを含む試薬を式（ｆ）の化合物とカップリングさせて、式（ｆ）の化合物を得るステップ、
（ｖｉｉ）式（ｆ）の化合物のエステルを加水分解して、式（ｇ）の化合物を得るステップ、および
（ｖｉｉｉ）式（ｇ）の化合物から第１の保護基を除去して、式（ｈ）の化合物を得るステップ、
を含み、式中、
Ｒは、１～６個の炭素原子を含む炭化水素基であり、
Ｘは、３～８員炭素環、ヘテロ環、炭素芳香環またはヘテロ芳香環であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有するリンカー基であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有する１個または複数の基で任意に置換され、
Ｑは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルから選択される１個または複数の基で任意に置換される融合二環式ヘテロ環またはヘテロ芳香環である。

いくつかの実施形態では、工程は、４－［（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタン酸の製造のためのものであり、工程は、

を含む。

第１１の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のナノ粒子の製造のための工程を提供し、工程は：
（ａ）式Ｄ－Ｌ_１－ＮＨ_２の化合物を用意することであって、式中、Ｄは、葉酸拮抗剤または葉酸を含み、Ｌ_１は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ－を含み、ｐは、１～１０の範囲の整数である、用意すること、
（ｂ）ナノ粒子を用意することであって、
金属および／または半導体を含むコア、および
コアに共有結合した複数のリガンド、
を含み、前記リガンドは、
（ｉ）炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および
（ｉｉ）式ＣＯＯＨ－Ｌ_２－Ｓのリガンドであって、Ｌ_２は－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ－であり、ｑは１～１０の範囲の整数であり、前記リガンドの末端イオウ原子が前記コアに共有結合しているリガンド
を含む、用意すること、および
（ｃ）式Ｄ－Ｌ_１－ＮＨ_２の化合物の末端アミン基と式ＣＯＯＨ－Ｌ_２－Ｓのナノ粒子リガンドのカルボン酸基の間でアミド結合の形成を可能にする条件下で、式Ｄ－Ｌ_１－ＮＨ_２の化合物をナノ粒子と反応させること
を含む。

いくつかの実施形態では、Ｄは、次の構造：

を含み、式中、
Ｘは、３～８員（例えば、５または６員）炭素環、ヘテロ環、炭素芳香環またはヘテロ芳香環であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有するリンカー基であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有する１個または複数の基で任意に置換され、
Ｑは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルから選択される１個または複数の基で任意に置換される融合二環式ヘテロ環またはヘテロ芳香環である。
特に、Ｄは、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラリトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒａｘｅｄ）およびプララトレキサートからなる群より選択される葉酸拮抗剤、または葉酸を含み得る。

いくつかの実施形態では、Ｄは、次の構造：

から選択される。

いくつかの実施形態では、工程は、次記を含む：

第１２の態様では、本発明は、請求項１に記載のナノ粒子を形成するための工程を提供し、工程は、
Ｌ_２リガンドを有するペイロード不含ナノ粒子および炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および
遊離Ｄ－Ｌ_１リガンド、
を混合するステップを含み、
式中、Ｄ、Ｌ_１、ＺおよびＬ_２は、請求項１で定義の通りであり、Ｌ_２リガンドとＤ－Ｌ_１リガンドの１つは、末端アルキン基を有し、もう一方は、末端アジド基を有し、
その結果、Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２リガンドを有し、Ｚが、１，２，３－トリアゾールである、ナノ粒子が形成される。

いくつかの実施形態では、混合ステップは、

であり、式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも２０個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも１０個である。

いくつかの実施形態では、混合ステップは、

であり、式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、コア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である。

第１３の態様では、本発明は、第１の態様によるナノ粒子を形成するための工程を提供し、工程は、式Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２のリガンドをペイロード不含ナノ粒子と混合するステップを含み、
ペイロード不含ナノ粒子は、炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を有する複数の希釈リガンドに共有結合される金属および／または半導体を含むコアを有し、
その結果、いくつかの希釈リガンドが、リガンドにより置換される。
式Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２のリガンドは、ｉｎ ｓｉｔｕで還元されるＤ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２－ＳＨ（遊離チオール）またはＤ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２－Ｓ－Ｓ－Ｌ_２－Ｚ－Ｌ_１－Ｄ（ジスルフィド）のいずれかである可能性がある。

いくつかの実施形態では、希釈リガンドは、イオウ原子を介してペイロード不含ナノ粒子に共有結合される。

本発明のいずれかの態様では、対象は、ヒト、伴侶動物（例えば、イヌまたはネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタまたは非ヒト霊長類）、飼育動物または家畜（例えば、ブタ、雌ウシ、ウマまたはヒツジ）であり得る。好ましくは、対象は、増殖性障害（例えば、癌）、炎症性疾患または自己免疫疾患を有すると診断されたヒトである。

以降では、限定するものではなく、例示として、添付の図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。しかしながら、本開示を考慮すれば、本発明の種々のさらなる態様および実施形態は当業者には自明であろう。

記述された態様および好ましい特徴の組み合わせは、このような組み合わせが明確に許容されないまたは明示的になされるべきでないことが述べられる場合を除き、本発明は、これらの組み合わせを包含する。本発明のこれらおよびさらなる態様および実施形態は、以下で、および添付の実施例および図に関連してさらに詳細に説明される。

本明細書ではＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰとしても記載される、アルファガラクトースＣ２－ＳＨリガンドおよびＭＴＸ－ＰＥＧ_３ＮＨＣ（Ｏ）ＰＥＧ_８－ＳＨリガンドを含むコロナを有する金コアナノ粒子の一般的な化学構造を示す。 ４－［（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタン酸の化学構造を確証する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。ピークが特定され、化学構造は挿入図として示される。

本発明の態様および実施形態は、以降で、添付の図面に関連して考察される。さらなる態様および実施形態は、当業者には明白である。本明細書で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の記述において、次の用語が用いられ、以下に示されるように定義されることが意図される。

前述の記述により、または次の特許請求の範囲で、または添付図面において開示され、開示された機能を実施するための特定の形態でまたは手段の観点から表現された、または開示の結果を得るための方法または工程の特徴は、別々に、またはこのような特徴の組み合わせで、本発明をその多様な形態で実現するために使用され得る。

本発明は、上記の例示的実施形態と共に記載されてきたが、多くの等価な修正および変形物は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。したがって、本発明の上述の例示的実施形態は、例示であり、限定するものではないと見なされる。記載された実施形態に対する種々の変更は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。

疑義を生じないために、読者の理解の改善を目的として、本明細書で提供される何らかの理論的説明が提供される。本願発明者らは、これらの理論的説明のいずれかに束縛されることを望むものではない。

本明細書で使用されるセクション見出しはいずれも、単に構成上の目的のためであり、記載主題を限定するものと解釈されるべきではない。

後に続く特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、示した整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群の包含を意味し、任意の他の整数もしくはステップまたは整数群もしくはステップ群の除外を意味しないと理解される。

明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数形の指示対象を包含することに留意されなければならない。範囲は、「約（ａｂｏｕｔ）」１つの特定の値から、および／または「約（ａｂｏｕｔ）」別の特定の値までとして本明細書で表され得る。このような範囲が表記される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」を用いて近似値として表記される場合、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されよう。数値に関する用語の「約（ａｂｏｕｔ）」は、任意であり、例えば、±１０％を意味する。

ナノ粒子
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、ナノメートルスケールを有する粒子を指し、何ら特定の形状の制限を意味することを意図しない。特に、「ナノ粒子」は、ナノスフェア、ナノチューブ、ナノボックス、ナノクラスター、ナノロッド、などを包含する。特定の実施形態では、本明細書で意図されるナノ粒子および／またはナノ粒子コアは通常、多面体または球状形状を有する。ナノ粒子またはナノ粒子コアの「直径」への言及は通常、ナノ粒子またはナノ粒子コアそれぞれの最長寸法を意味すると解釈される。実質的に多面体形状または球状形状を有するナノ粒子では、粒子を横切る最短寸法は通常、粒子を横切る最長寸法の５０％以内であり、例えば、２５％または１０％以内であり得る。

複数の炭水化物含有リガンドを含むナノ粒子は、例えば、国際公開第２００２／０３２４０４号、同第２００４／１０８１６５号、同第２００５／１１６２２６号、同第２００６／０３７９７９号、同第２００７／０１５１０５号、同第２００７／１２２３８８号、同第２００５／０９１７０４号（これらそれぞれの全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されており、このようなナノ粒子は、本発明により使用され得る。

本明細書で使用される場合、「コロナ」は、層またはコーティングを指し、それはナノ粒子コアの露出表面を部分的にまたは完全に被覆し得る。コロナは、ナノ粒子のコアに共有結合した複数のリガンドを含む。したがって、コロナは、金属コアを取り囲むまたは部分的に取り囲む有機層であると見なされ得る。特定の実施形態では、コロナは、ナノ粒子のコアの不動態化を提供および／またはそれに関与する。したがって、特定の事例では、コロナは、実質的にコアを安定化するために充分に完全なコーティング層を含み得る。特定の事例では、コロナは、本発明のナノ粒子の溶解性、例えば、水溶解性を促進する。

ナノ粒子は、小さい粒子、例えば、金属または半導体原子のクラスターであり、不動化リガンドのための基材として使用され得る。

好ましくは、ナノ粒子は、０．５～５０ｎｍ、より好ましくは０．５～１０ｎｍ、より好ましくは０．５～５ｎｍ、より好ましくは０．５～３ｎｍ、さらにより好ましくは０．５～２．５ｎｍの平均直径のコアを有する。リガンドがコアに付加されると見なされる場合、好ましくは粒子の全体平均直径は、２．０～５０ｎｍ、より好ましくは３～１０ｎｍおよび最も好ましくは４～５ｎｍである。平均直径は、当該技術分野において周知の透過型電子顕微鏡などの技術を用いて測定できる。

コア材料は、金属または半導体であり得、２種以上の原子から形成され得る。好ましくは、コア材料は、Ａｕ、ＦｅまたはＣｕから選択される金属である。ナノ粒子コアは、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／ＧｄおよびＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄを含む合金からも形成され得、かつ本発明で使用され得る。好ましいコア材料は、ＡｕおよびＦｅであり、最も好ましい材料は、Ａｕである。ナノ粒子のコアは、ナノメートル範囲のコア直径を得るために、好ましくは、約１００～５００個の原子、または１００～２，０００個の原子（例えば、金原子）を含む。他の特に有用なコア材料は、ＮＭＲ活性である１種または複数の原子でドープされ、インビトロおよびインビボの両方でＮＭＲを用いるナノ粒子の検出を可能にする。ＮＭＲ活性である原子の例は、Ｍｎ^＋２、Ｇｄ^＋３、Ｅｕ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｖ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｎｉ^＋２、Ｆｅ^＋２、Ｆｅ^＋３およびランタニド^＋３、または量子ドットを含む。

半導体化合物を含むナノ粒子コアは、ナノメートルスケールの半導体結晶として検出でき、量子ドットとして機能でき、すなわち、それらは、光を吸収し、それにより材料中の電子をより高いエネルギー準位に励起し、その後、その材料に特徴的な周波数で光のフォトンを放出できる。半導体コア材料の例は、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウムである。硫化亜鉛などの亜鉛化合物も含まれる。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子またはそのリガンドは、検出可能な標識を含む。標識は、ナノ粒子またはリガンドのコアの要素であり得る。標識は、ナノ粒子のその要素の固有の特性のために、または検出可能なさらなる部分と連結される、複合化されるまたは結合されることにより、検出され得る。

葉酸拮抗剤
本明細書で使用される場合、「葉酸代謝拮抗薬（ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ）」または「葉酸拮抗剤（ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ ｄｒｕｇ）」は、葉酸の作用と拮抗する葉酸代謝拮抗薬のクラスのメンバーを指す。本明細書で意図される葉酸代謝拮抗薬は特に、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラリトレキセドおよびプララトレキサートを含む。それらの遊離型では、葉酸拮抗剤は通常、例えば、アミドカップリングを受けるのに有用な末端カルボン酸を有する。

いくつかの実施形態では、葉酸拮抗剤は、次の構造：

を含み、式中、
Ｘは、３～８員（例えば、５または６員）炭素環、ヘテロ環、炭素芳香環またはヘテロ芳香環であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有するリンカー基であり、
Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有する１個または複数の基で任意に置換され、
Ｑは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルから選択される１個または複数の基で任意に置換される融合二環式ヘテロ環またはヘテロ芳香環である。特に、Ｑは、置換プテリジンであり得る。

いくつかの実施形態では、例えば、葉酸受容体を標的にする用途での使用のために、Ｄは、葉酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｄは、次の構造：

から選択され得る。

メトトレキサート
以前はアメトプテリンとして知られていた、メトトレキサート（ＭＴＸ）は、化学療法剤および免疫系抑制剤である。これは、種々の癌、自己免疫疾患、子宮外妊娠の治療で、および薬剤誘発性人工流産のために使用された。
ＭＴＸは、ＣＡＳ番号５９－０５－２であり、下に示す構造を有する：

本明細書で使用される場合、「メトトレキサート」または「ＭＴＸ」は、上記の化学式の化合物を指すのみでなく、１個または複数の官能基がリンカーＬを介したナノ粒子への結合のために修飾されているＭＴＸの誘導体も指す。特に、ＭＴＸは、例えば、上記構造中のカルボン酸基（特に、上記構造中に示される２個のカルボン酸基のアミド結合にさらに由来するカルボン酸基）で形成されたアミドを介してリンカーＬに結合され得る。

葉酸受容体
「葉酸受容体」は具体的には、ヒト葉酸受容体アルファ（ユニプロット受入番号Ｐ１５３２８、１９９４年６月１日－ｖ３、チェックサムＤ４５８Ｄ８ＢＢ０４７Ｃ９６Ａ６、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）、ヒト葉酸受容体ベータ（ユニプロット受入番号Ｐ１４２０７、２００６年１０月１７日－ｖ４、チェックサムＦ５８５７１５ＣＦ５６３１Ｃ９８）およびヒト葉酸受容体ガンマ（ユニプロット受入番号Ｐ４１４３９、１９９５年１１月１日－ｖ１、チェックサムＡＣ７６３６ＥＢ５３５５６４７Ｂ）を含む。「葉酸受容体結合物質」または「葉酸受容体標的化薬剤」は、葉酸受容体に結合する葉酸代謝拮抗薬または葉酸であり得る、化合物を指す。いくつかの事例では、葉酸受容体結合物質は、葉酸受容体により結合され、エンドサイトーシスを介して細胞中に輸送され得る。いくつかの事例では、葉酸受容体結合物質は、葉酸または葉酸代謝拮抗薬であり得る（例えば、メトトレキサートまたはリンカー結合メトトレキサート、例えば、ＭＴＸ－（ＥＧ）_３－ＮＨ_２）。

エチレングリコール
本明細書で使用される場合、エチレングリコール含有リンカーまたは鎖は、１個または複数のエチレングリコールサブユニットが存在することを意味する。これは、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ－または（ＥＧ）_ｍまたは（ＰＥＧ）_ｍまたはＰＥＧ_ｍまたはＰＥＧｍなどの様々な方法で示され、または表され得、式中、ｍは、数である。文脈が別義を指示しない限り、これらの用語は、本明細書では同じ意味で用いられる。したがって、用語の「ＰＥＧ」は、より短い、例えば、ＰＥＧ３またはＰＥＧ８などのオリゴマー長さの鎖のエチレングリコール単位、を意味し、これらは、それぞれ、（ＥＧ）_３および（ＥＧ）_８と同じ意味を有する。

ゲル
ゲルは、その体積全体にわたり流体により広げられた非流体コロイド状ネットワークまたはポリマーネットワークである。本発明の場合では、ゲルは、薬学的に許容可能なゲル、例えば、ヒドロゲルであり得る。特に好適な種類のヒドロゲルは、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手でき、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｕｂｒｉｚｏｌ．ｃｏｍ／Ｌｉｆｅ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｃａｒｂｏｐｏｌ－Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓに記載される、架橋ポリアクリル酸ポリマーのカーボポール（登録商標）ファミリーから形成されるヒドロゲルである。

投与および治療
本発明のナノ粒子および組成物は、腸内または非経口の経路を含むいくつかの異なる経路により患者に投与され得る。非経口的投与としては、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、眼内、経上皮、腹腔内および局所（皮膚、経眼、直腸、経鼻、吸入およびエアロゾルを含む）、ならびに直腸全身性経路が挙げられる。好ましい投与経路は、皮膚への局所投与による皮膚投与である。

本発明のナノ粒子は、固体または液体組成物の形態であり得る医薬組成物として処方し得る。このような組成物は通常、何らかの担体、例えば、水、石油、動物または植物油、鉱物油または合成油などの固体担体または液体担体を含む。生理食塩水、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。このような組成物および製剤は通常、少なくとも０．１重量％の化合物を含む。

静脈内、皮膚または皮下注射、または痛み部位の注射の場合、有効成分は、非経口的に許容可能な水溶液または液体の形態であり、それは発熱性物質非含有であり、かつ好適なｐＨ、張性および安定性を有する。当該技術分野において関連する技能を有する人は、例えば、生理食塩水、グリセロール、液体ポリエチレングリコールまたは油を用いて調製された分散液中の、化合物またはそれらの誘導体の溶液などを用いて、好適な溶液をうまく調製できるであろう。

１種または複数の化合物に加えて、任意選択で別の有効成分と組み合わせて、組成物は、１個または複数の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤、等張化剤、保存剤または酸化防止剤または当業者に周知の他の物質を含んでよい。このような物質は、非毒性である必要があり、また、有効成分の効力を妨害してはならない。担体または他の物質の詳細な性質は、投与経路、例えば、局所投与または静脈内注射に依存し得る。

好ましくは、医薬組成物は、予防的有効量または治療的有効量で（場合に応じて、予防は治療と見なされる場合もある）個体に投与され、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。通常、これは、個体に利益をもたらす治療的に有用な作用を与える。投与される化合物の実際の量、ならびに投与の速度および投与の時間的経過は、治療される状態の性質および重症度に依存する。治療の処方、例えば、投与量などの決定は、一般医および他の医師の管理下にあり、通常は、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に既知の他の因子を考慮に入れる。前述の技術およびプロトコルの例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ．Ｍ．Ａｓｈ ａｎｄ Ｉ．Ａｓｈ），２００１（Ｓｙｎａｐｓｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｄｉｃｏｔｔ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４で見つけることができる。一例として、組成物は、好ましくは、１ｋｇの体重当たり、約０．０１～１００ｍｇの活性化合物の投与量で、より好ましくは約０．５～１０ｍｇ／（ｋｇの体重）の活性化合物の投与量で患者に投与される。皮膚障害の治療の場合、本発明の組成物の局所投与の１つの利点は、得られるメトトレキサートの全身濃度が、メトトレキサートが全身投与された場合よりも顕著に低いことであろう。これは、メトトレキサートの毒性および他の望ましくない副作用が最小化され、または実質的に回避でき、一方でそれにもかかわらず、対象の皮膚患部で臨床的に有益なメトトレキサート濃度を達成できることを意味する。
以下は、一例として提示され、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例
比較例１－メトトレキサート結合金ナノ粒子（ＭＴＸ－ＧＮＰ）の合成
リガンドの調製および［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠Ａｕ ＧＮＰの合成
アルファガラクトース－Ｃ２（α－Ｇａｌ）および１－アミノ－６－メルカプトヘキサエチレングリコール（「アミノリンカー」または「ＡＬ」としても知られるＳＨ－ＣＨ_２－（ＥＧ）_６－ＮＨ_２）リガンドのコロナを有する金ナノ粒子を、以前に記載のように合成した（国際公開第２０１１／１５４７１１号、実施例１および２、および国際公開第２０１６／１０２６１３号、実施例１を参照されたい、これら公開特許の両方は、参照により本明細書に組み込まれる）。

２－チオエチル－α－Ｄ－ガラクトシド（α－ガラクトース－Ｃ２ＳＨ 「α－Ｇａｌ」）の調製

２－ブロモエタノール（３０ｍｌ）中のガラクトース（３ｇ、１６．６５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、酸樹脂アンバーライト１２０－ＨをｐＨ２に達するまで加える。反応物を、５０～６０℃で１６時間撹拌する。反応混合物を、濾過し、ＭｅＯＨで洗浄する。トリエチルアミンを、ｐＨ８に達するまで加える。反応の粗製物を、濃縮し、トルエンと共に３回共沸蒸留する。反応混合物を、ピリジン（７５ｍＬ）およびＡｃ２Ｏ（３５ｍＬ）に溶解し、触媒量のＤＭＡＰを、０℃で加え、室温で３時間撹拌する。混合物を、ＡｃＯＥｔで希釈し、１．Ｈ_２Ｏ；２．ＨＣｌ（１０％） ３．ＮａＨＣＯ_３ ｄｉｓ ４．Ｈ_２Ｏで洗浄する。有機層を集め、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させる。ＴＬＣ（ヘキサン：ＡｃＯＥｔ ３：１、２回溶出）は、主要生成物（目的のもの）およびより低いＲｆの小量生成物を示す。生成物を、ヘキサン：酢酸エチル ６：１の混合物を溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、２－ブロモエチル－アルファガラクトシド（２）を得る。

前の反応の生成物、２を、２７ｍｌの２－ブタノンに溶解する。この溶液に、触媒量のテトラブチルアンモニウムヨージドおよび４当量のカリウムチオアセテートを加える。得られた懸濁液を、室温で２時間攪拌する。この期間中、反応物を、出発材料の消滅についてＴＬＣ（ヘキサン－ＡｃＯＥｔ ２：１、２回溶出）により検査する。混合物を、２０ｍｌのＡｃＯＥｔで希釈し、ＮａＣｌの飽和溶液で洗浄する。有機相を、乾燥し、濾過し減圧下で留去する。生成物を、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ ２：１→１：１で精製して、アセチルチオ－アルファガラクトシド３を得る。

反応の新規生成物、３を、ジクロロメタン：メタノール ２：１の混合物に溶解する。この混合物に、１Ｎのナトリウムメトキシドの溶液（１当量）を加え、室温で１時間撹拌する。アンバーライト ＩＲ－１２０Ｈ樹脂を、ｐＨ５～６に達するまで加える。得られた混合物を次に、濾過し、濃縮乾固して、最終生成物（α－ガラクトース Ｃ２ＳＨ）を得る。

アミノチオールリンカー（ＡＬ）の調製

２０ｍｌの無水ＴＨＦ中のＰＰｈ_３（３ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＡＣ（２．３ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を加える。混合物を、白色生成物が出現するまで０℃で１５分間撹拌する。この混合物に、乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のヘキサエチレングリコール（１．４５ｍｌ、５．７ｍｍｏｌ）およびＨＳＡｃ（６１０μｌ、８．５５ｍｍｏｌ）の溶液を滴加する（滴加漏斗）。１５分後、生成物が、ＴＬＣ上にＲｆ０．２で出現し始める。溶液を、蒸発装置中で濃縮する。反応粗製物を、５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、Ｋ_２ＣＯ_３の１０％溶液で洗浄する。有機相を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮する。溶出液としてＡｃＯＥｔ：ヘキサン １：１、ＡｃＯＥｔ、および最終的にＤＣＭ：ＭｅＯＨ ４：１を用いる粗製生物のフラッシュクロマトグラフィーは、アセチルチオ－ヘキサエチレングリコール誘導体を与えた。

反応生成物を、５ｍｌのＤＭＦに溶解し、ＰＰｈ_３（２．２５ｇ、８．５５ｍｍｏｌ）、ＮａＮ_３（０．７４１ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）およびＢｒＣｌ_３Ｃ（０．８４５ｍｌ、８．５５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を続いて、室温で４０分間撹拌した。得られた生成物は、ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ ２５：１）を実施すると、出発生成物より高いＲｆを有する。反応混合物を、１００ｍｌのジエチルエーテルで希釈し、Ｈ_２Ｏで３回洗浄する。有機相を、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で留去する。生成物を、溶出液の混合物、ＤＭＣ／ＭｅＯＨ ２００：１およびＤＣＭ／ＭｅＯＨ ４０：１を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、アジド－アセチルチオ－ヘキサエチレングリコール誘導体を得る。

トリフェニルホスフィンオキシドを除去するために、反応生成物を、１０ｍｌのＴＨＦに溶解し、０．５ｇのＭｇＣｌ_２を、この溶液に加える。反応物を、白色沈殿物が出現するまで８０℃で２時間撹拌し、その後、セライトを通して濾過する。

生成物を、エタノール：Ｈ_２Ｏ ３：１の混合物に溶解し、Ｚｎダスト（０．４５ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）およびＮＨ_４Ｃｌ（０．６ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を加える。反応物を、ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ２５：１）により出発材料の存在が検出されなくなるまで、１時間、還流下攪拌した。反応物を、セライトを通して濾過し、溶媒を、留去する。粗製反応生成物を、ＡｃＯＥｔで希釈し、５ｍｌのＨ_２Ｏで抽出する。水相を、蒸発乾固させて、アミノチオール－ヘキサエチレングリコール生成物を得る。

［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠Ａｕ ＧＮＰの合成
アルファガラクトースＣ２誘導体３およびヘキサエチレングリコールアミンリンカー６を、Ｍｉｄａｔｅｃｈ Ｂｉｏｇｕｎｅストックから採取した。Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ＨＡｕＣｌ_４、ＮａＢＨ_４を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。イミダゾール－４－酢酸・一塩酸塩を、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した。カンパニーハイクオリティＭｅＯＨおよびナノピュア水（１８．１ｍΩ）を、全実験および溶液に使用した。

ＭｅＯＨ（４９ｍＬ）中の１：１の比（０．５８ｍｍｏｌ、３当量）でのアミンメルカプトヘキサエチレングリコールリンカー６およびアルファガラクトースリガンド３の混合物に、金塩（７．８６ｍＬ、０．１９ｍｍｏｌ、０．０２５Ｍ）の水溶液を加えた。反応物を、３０秒間攪拌した後、ＮａＢＨ_４の水溶液（１Ｎ）を、数回に分けて添加した（４．３２ｍＬ、４．３２ｍｍｏｌ）。反応物を、９００ｒｐｍで１００分間震盪した。この時間の後で、懸濁液を、１４０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清を、除去し、沈殿物を、２ｍＬの水に溶解した。次に、２ｍＬの懸濁液を、２つのフィルター（Ａｍｉｃｏｎ、１０ＫＤａ、４ｍＬ）に導入し、４５００ｇで５分間遠心分離した。フィルター中の残留物を、水でさらに２回洗浄した。最終残留物を、８０ｍＬの水に溶解した。

メトトレキサートによる［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠Ａｕ ＧＮＰの官能化
上述のように調製した［α－Ｇａｌ］_２２［ＡＬ］_２２＠Ａｕナノ粒子のメトトレキサートによる官能化を、下記のスキームに従い室温でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて実施した：

手順
ナノ粒子を、遠心分離により濃縮し、ＤＭＳＯ（３．６２ｍＬ）で集めて約８０００ｐｐｍの金濃度を得た。

薬物活性化
ＤＭＳＯ中のＭＴＸ（０．１Ｍ）の溶液に、ＥＤＣ（３８．４μＬ；０．５Ｍ）を加え、混合物を、約５分間撹拌した。その後、ＮＨＳ（１９．２μＬ；１．０Ｍ）を加え、混合物を、室温で３０分間活性化した。

薬物官能化
［α－Ｇａｌ］２２［ＡＬ］２２＠Ａｕ ＧＮＰ（７５０μＬ）を、前に活性化した溶液に加え、カップリング系を、暗所で室温にて一晩インキュベートした、

精製
ナノ粒子を、ＮａＯＨ ０．１Ｍを溶出液として用いて遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分）により精製した。含有物を、５００μＬのＨ_２Ｏ（１２．００μｇ／μＬ）中に集め、さらなる分析のために貯蔵した。

分析
金含量を、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）により、サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）により、静電荷を、ゼータ電位により、および構造を、^１Ｈ ＮＭＲにより評価した。
ＤＬＳサイズは、５．１５ｎｍに主ピークを示した。しかし、１．６１ｎｍの副次的ピークも同様に観察され、ナノ粒子の２つの集団を示した。微分型遠心沈降（ＤＣＳ）分析は、３．０ｎｍおよび８．０ｎｍのサイズを有する２つのナノ粒子集団の存在を確証した。
ゼータ電位は、－５１．１ｍＶ（すなわち、負に帯電）であることが明らかになった。
上記手順を、異なる当量のＭＴＸを用いて反復した。それぞれの場合で、ナノ粒子当りのＭＴＸの最終担持を、^１Ｈ ＮＭＲ分析により決定した。２当量／ＧＮＰ～最大で約５当量／ＧＮＰのＭＴＸ担持を得た。

結論
上記結果は、１０ｎｍ未満のサイズと最大５当量のＭＴＸを有する［α－Ｇａｌ］－［ＭＴＸ－ＡＬ］＠Ａｕ ＧＮＰの合成の成功を実証した。しかし、ばらつきが、ＧＮＰサイズとゼータ電位のバッチ間で観察された。メトトレキサートは、正に帯電したＧＮＰ上のアミン基への結合能力の変動に繋がり得る、２つの潜在的カルボキシレート結合部位を有する（すなわち、生じ得るＭＴＸの二重ＥＤＣ活性化が、不均一な生成物を説明し得る）。

実施例２－修飾メトトレキサートの合成
本発明者らは、ＧＮＰ当りのＭＴＸ担持を増大させること、および実施例１で観察されたＭＴＸ上のカルボキシル基に起因する変動を低減することを目標とした。
この目的のために、（ＥＧ）_３ＮＨ_２リンカーを有する修飾メトトレキサートを、合成した。
４－［（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタン酸
構造式：

分子式：
Ｃ_３０Ｈ_４４Ｎ_１０Ｏ_７
分子量：
６５６．７５ｇ／ｍｏｌ

４－［（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタン酸の合成を、スキーム１に従い行った。
スキーム１：

合成手順の説明
１．１． ４－［（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタン酸の合成

ステップ：ＢＯＣ保護

手順
ビス－（３－アミノプロピル）ジエチレングリコール（９８ｇ、９７．５ｍＬ、０．４４ｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１９６０ｍＬ、２０体積当量）に溶解し、ＤＣＭ（９８０ｍＬ、１０体積当量）中のＢｏｃ－無水物（３８．８４ｇ、０．１７７ｍｏｌ）を、０℃で４時間以内に滴加した。混合物を、室温で一晩反応させた。反応を、ＴＬＣに従って完結し、反応混合物を、約０．５Ｌに蒸発させ、残留物を、飽和ＮａＣｌ溶液（各５００ｍＬ）で４回洗浄して過剰ジアミンを除去した。有機層を、１０重量％のＫＨＳＯ_４でｐＨ約４にクエンチした。有機相を分離し、二重保護ジアミンを除去し、水相を、６ＮのＮａＯＨでｐＨ約１０に塩基化し、ＤＣＭ（３＊２５０ｍＬ）で抽出し、有機層を、水およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、減圧下で濃縮して、標記化合物（４１ｇ、７１．９％収率）を無色油として得た。ＴＬＣ対照（ＳｉＯ_２、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：水中２５重量％ＮＨ_３＝８：２：０．２）：Ｒｆ＝０．６、ニンヒドリン染色。^１Ｈ ＮＭＲにより構造および純度を確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ５．１２（ｓ，１Ｈ），３．６８－３．４９（ｍ，１２Ｈ），３．２３（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７６（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）．

ステップ：アミドカップリング：

手順
Ｚ－Ｌ－Ｇｌｕ－ＯＭｅ（３２ｇ、０．１０８ｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４８０ｍＬ、１５体積当量）に溶解し、１，１’－カルボニルジイミダゾール（１９．３２ｇ、０．１１９ｍｏｌ）を加え、混合物を、４５分間撹拌した。ｔｅｒｔ－ブチル Ｎ－（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバメート １３２３－００９（３９．９３ｇ、０．１２５ｍｏｌ）を、さらに加え、混合物を、２５℃で６５時間撹拌した。反応の完結後、ＴＨＦを、減圧下で留去し、水（２００ｍＬ）を、残留物に加え、続いて酢酸エチル（１５０＊３ｍＬ）で抽出した。有機層を、１０％のＫＨＳＯ_４、１Ｎ ＮａＯＨ、ブラインで洗浄した後、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を、減圧下留去して、６０．１ｇ（９２．７９％収率）のメチル ２－｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝４－［（３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］ブタノエートを黄色がかった油として得た。注：化合物を、追加の精製を行わないで、以降のステップで使用した。^１Ｈ ＮＭＲにより構造および純度を確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．４３－７．３０（ｍ，５Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．９８（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｔｄ，Ｊ＝８．３，４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｄｄｄｄ，Ｊ＝２２．１，１６．４，８．８，４．３Ｈｚ，１２Ｈ），３．３６（ｑｄ，Ｊ＝６．１，１．９Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３１－２．１５（ｍ，３Ｈ），２．０８－１．９６（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｐ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）．

ステップ：Ｚ－脱保護

手順
ＭｅＯＨ（２９０ｍＬ、５体積当量）中のメチル ２－｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝－４－［（３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］ブタノエート １３２３－０１３（５８ｇ、０．０９７ｍｏｌ）の溶液に、５．８ｇ（１０重量％）のパラジウム活性炭（１０重量％Ｐｄ）を加えた。反応物を、パールシェーカー型水素添加装置で、約３．５気圧、２５℃にて１８時間水素添加した。反応完了後に、反応混合物を、セライトパッドを通して濾過し、減圧下で濃縮した。粗製物収量：緑色を帯びた油として４５ｇ（収率：定量的）。注：粗生成物を、次のステップに使用した。ＴＬＣ対照（ＳｉＯ_２、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１）：Ｒｆ＝０．４、ニンヒドリン染色。^１Ｈ ＮＭＲにより構造および純度を確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ６．４６（ｓ，１Ｈ），５．０４（ｓ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．６７－３．４８（ｍ，１２Ｈ），３．３７（ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．３６－２．２４（ｍ，２Ｈ），１．９６（ｓ，３Ｈ），１．８８－１．６４（ｍ，５Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．

ステップ：アミドカップリング（Ｚ－保護）

手順
無水ＴＨＦ（１５０ｍＬ、１０体積当量）中の４－（メチルアミノ）安息香酸（１５ｇ、０．０９９ｍｏｌ）の撹拌溶液に、０℃でＮａＨＣＯ_３（２０．０８ｇ、０．２３８ｍｏｌ）およびベンジルクロロホルメート（１６．９９ｍＬ、０．１１９ｍｏｌ）を加え、反応混合物を、室温に温め、混合物を、１８時間撹拌した。反応混合物を、濾過した。濾液を、減圧下で濃縮し、残留物を１ＭのＮａＯＨ水溶液に溶解した。水溶液を、Ｅｔ_２Ｏで洗浄し、６Ｍの塩酸でｐＨ３に酸性化し、ＡｃＯＥｔで抽出した。有機層を、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、（ベンジルオキシカルボニル）－４－（メチルアミノ）安息香酸を無色粒子として得た（２５．８ｇ、９１．１３％収率）。
^１Ｈ ＮＭＲにより構造および純度を確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ８．１８－８．０５（ｍ，２Ｈ），７．４６－７．４０（ｍ，２Ｈ），７．４０－７．３０（ｍ，５Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ）．
ＮＭＲ

ステップ：アミドカップリング

手順
４－｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］（メチル）アミノ｝安息香酸 １３２３－０１４ ２１．５４ｇ（０．０７５ ｍｏｌ、１当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール １１．２２２ｇ（０．０８３ ｍｏｌ、１．１当量）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ′－エチルカルボジイミド塩酸塩１５．９２ｇ（０．０８３ｍｏｌ、１．１当量）を、ＣＨ_３ＣＮ（５２５ｍｌ、１５体積当量）に溶解した。得られた溶液を、２０℃で１時間撹拌し、３５ｇ（０．０７５ｍｏｌ、１当量）のメチル ２－アミノ－４－［（３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］ブタノエート １３２３－０１６を、加えた。ＲＭを、約０℃に冷却し、５２．７４ｍｌ（０．３ｍｏｌ、４当量）のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを、２５分かけて加え、同時に温度を１０℃未満に維持した。溶液を、２４℃にゆっくり加熱し、２０℃で６５時間（週末に）保持した。反応の完結後に、ＡＣＮを、減圧下で留去し、水（２５０ｍＬ）を、残留物に加え、続いて酢酸エチル（１５０ｘ３ｍＬ）で抽出した。有機層を、１０％のＫＨＳＯ_４、１Ｎ ＮａＯＨ、ブラインで洗浄した後、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を、減圧下留去して、４９ｇ（８８．８％収率）の標記生成物を無色油として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ８．１０（ｓ，１Ｈ），７．９５－７．８４（ｍ，２Ｈ），７．４４－７．３０（ｍ，７Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｓ，２Ｈ），４．９９（ｓ，１Ｈ），４．６７（ｄｄｄ，Ｊ＝８．０，６．６，４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．６７－３．４８（ｍ，１２Ｈ），３．４４－３．２９（ｍ，５Ｈ），３．２１（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４９－２．１５（ｍ，４Ｈ），１．８０－１．６６（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）．

ステップ：Ｚ－脱保護 ＃２

手順
ＭｅＯＨ（３４０ｍＬ、７体積当量）中のメチル ２－［（４－｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］－４－［３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］ブタノエート １３２３－０１９（４８．５ｇ、０．０６６ｍｏｌ）の溶液に、４．９ｇ（１０重量％）のパラジウム活性炭（１０重量％Ｐｄ）を加えた。反応物を、パールシェーカー型水素添加装置で、約３．５気圧、２５℃で１８時間水素添加した。

反応完了後に、反応混合物を、セライトパッドを通して濾過し、減圧下で濃縮した。
収量：黄色がかった油として３８．５ｇ（収率：９７．２３％）。
^１Ｈ ＮＭＲにより構造および純度を確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．８３－７．６３（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７３（ｓ，１Ｈ），６．６２－６．５２（ｍ，２Ｈ），５．０３（ｓ，１Ｈ），４．６９（ｄｄｄ，Ｊ＝８．８，７．１，４．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｓ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．６８－３．４７（ｍ，１２Ｈ），３．３４（ｔｔ，Ｊ＝１３．７，６．７Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｓ，３Ｈ），２．４５－２．１０（ｍ，４Ｈ），１．７５（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．７Ｈｚ，４Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．

ステップ：アルキル化

手順
無水ＤＭＡ（１６０ｍＬ、１０体積当量）中のメチル ４－［（３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルモイル］－２－｛［４－（メチルアミノ）フェニル］ホルムアミド｝ブタノエート １３２３－０２２（１６ｇ、２６．８４ｍｍｏｌ、１当量）の室温での撹拌溶液に、２，４－ジアミノプテリジン臭化水素酸塩（１３．５２ｇ、４０．２５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、混合物を、５５℃で３時間撹拌した。反応完了後に、反応混合物を、減圧下で濃縮し、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で処理し、ＥｔＯＡｃで抽出し（いくつかの不純物を分離した）、その後ＤＣＭ（３ｘ２５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて、水、ブラインで洗浄後、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を、減圧下留去して、１７ｇの粗製メチル ４－［（３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタノエートを黄色油として得た。化合物を、ＦＣ（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ－勾配溶出）を用いて精製した。表題化合物を、黄色発泡体として得た。収量：７．５ｇ（３６．２５％）。^１Ｈ ＮＭＲにより構造および純度を確認した。
注：試料は、２８．５７モル％または４．３８重量％のＥｔＯＡｃを含む。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．５８（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７５－７．７２（ｍ，２Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ），６．８６－６．７９（ｍ，２Ｈ），６．６６（ｓ，２Ｈ），４．８０（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｑ，Ｊ＝７．５，５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．５４－３．４０（ｍ，８Ｈ），３．３７（ｔｄ，Ｊ＝６．４，２．６Ｈｚ，４Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ），３．０７（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９６（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２３－２．１４（ｍ，２Ｈ），２．１１－２．０１（ｍ，１Ｈ），１．９４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｐ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）．

ステップ：エステルの加水分解

手順：
ＭｅＯＨ（３４ｍＬ、２０体積当量）中のメチル ４－［（３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルモイル］－２－｛［４－（メチルアミノ）フェニル］ホルムアミド｝ブタノエート １３２３－０２８（１．７ｇ、２．２１ｍｍｏｌ、１当量）の室温での撹拌溶液に、ＬｉＯＨ＊Ｈ_２Ｏ（０．１８５ｇ、４．４１ｍｍｏｌ、２当量）を加え、混合物を、２５℃で４時間撹拌した。反応完了後に、反応混合物を、減圧下で濃縮した。
ＵＰＬＣによる純度：９７．２％（方法 ６分、２５４ｎｍ、Ｒ_ｔ＝２．３分、ｍ／ｚ＝７５７．７５［Ｍ＋Ｈ］）
注：乾燥した反応混合物を、単離せず次の段階に直接使用した。
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ８．５９（ｓ，１Ｈ），７．８３－７．７１（ｍ，２Ｈ），６．９２－６．８６（ｍ，２Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ），４．４６（ｄｄ，Ｊ＝３．９，７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．６３－３．５３（ｍ，８Ｈ），３．４８（ｄｔ，Ｊ＝６．２，１２．０Ｈｚ，４Ｈ），３．３１（ｓ，５Ｈ），３．２０（ｔｄ，Ｊ＝１．２，６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４０－１．９９（ｍ，４Ｈ），１．７１（ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，４Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．

ステップ：Ｂｏｃ脱保護

手順：
リチウムイリデン ４－［（３－｛２－［２－（３－｛［（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル］アミノ｝プロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタノエート（１３２３－０４９－１^ｓｔステップ由来の粗製物、６．１６ｍｍｏｌ）を、水中の１７重量％ＨＣｌ（９５ｍＬ、２０体積当量）に溶解し、得られた混合物を、室温で３時間撹拌した。溶媒を、減圧下で留去（無加熱）して、粗製油を得て、これを、分取クロマトグラフィーにより精製した。純粋画分を、減圧下２５℃で出発時の体積の約１０％に蒸発させ、残留物を、凍結乾燥により乾燥した。
ＬＣＭＳによる純度：９８．０２％（方法 Ｇｅｍｉｎｉ Ｒｏｔ ｌｏｎｇ ７、２４３ｎｍ、Ｒｔ＝７．４０７分、ｍ／ｚ＝６５５．０２［Ｍ－Ｈ］^＋）
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．５７（ｓ，１Ｈ），８．２９（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｔ，Ｊ＝５．６ Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝６．９ Ｈｚ，１Ｈ），７．７０－７．６２（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），６．８７－６．７４（ｍ，２Ｈ），６．６２（ｓ，２Ｈ），４．７８（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｑ，Ｊ＝６．６ Ｈｚ，１Ｈ），３．５４－３．４４（ｍ，１０Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝６．４ Ｈｚ，３Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），３．０８（ｑ，Ｊ＝６．３ Ｈｚ，２Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝７．３ Ｈｚ，２Ｈ），２．１１（ｑ，Ｊ＝５．９，６．６ Ｈｚ，２Ｈ），２．０５－１．９２（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｄｔ，Ｊ＝６．４，１３．９ Ｈｚ，１Ｈ），１．７８（ｓ，２Ｈ），１．５９（ｐ，Ｊ＝６．５ Ｈｚ，２Ｈ）．

バッチ １３２３－０４９－最終
^１Ｈ ＮＭＲ分析を、溶媒としてのＤＭＳＯ－ｄ６中で行った。^１Ｈ ＮＭＲにより生成物の構造を確認した（図２参照）。

実施例３－修飾メトトレキサート結合金ナノ粒子（ＭＴＸ－ＧＮＰ）の合成

実施例２で記載のように合成したリンカーを有するメトトレキサート誘導体の化学名は、４－［（３－｛２－［２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）カルバモイル］－２－［（４－｛［（２，４－ジアミノプテリジン－６－イル）メチル］（メチル）アミノ｝フェニル）ホルムアミド］ブタン酸である。
この実験の目的は、ＧＮＰ当り１２当量超のＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２（ＭＴＸ－（ＥＧ）_３－ＮＨ_２としても知られる）担持を有する５０ｍｇのＧＮＰを合成することであった。

ベースのＧＮＰ粒子は、（［α－ＧａｌＣ２］_５２％［ＨＳＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］_４８％＠Ａｕ）であり、カップリングを、ＥＤＣ／ＮＨＳ法を用いて実施した。実施例１の正に帯電したＡＬとは対照的に、この実施例では、ベースＧＮＰは、α－Ｇａｌ－Ｃ２リガンドに加えて、カルボン酸末端官能基（負に帯電）を有するＰＥＧ_８（すなわち、（ＥＧ）_８含有）リガンドを有する。ベースＧＮＰ［α－ＧａｌＣ２］_５２％［ＨＳＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］_４８％＠Ａｕを、基本的に国際公開第２０１７／０１７０６３号（この実施例５を参照）に記載のように合成した。この公開特許は、参照により本明細書に組み込まれる。

反応スキーム

溶媒：１）ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化用の９０％ＤＭＳＯ；
２）ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２カップリング用のヘペス緩衝液（ｐＨ＝７．８３）。

ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化
３８．１２ｍｇのＥＤＣを、最初に３．３１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、その後、この６０ｍＭのＥＤＣ ＤＭＳＯストックの３．１６ｍＬを、４３．６７ｍｇのＮＨＳと混合して、ＥＤＣ（６０ｍＭ）／ＮＨＳ（１２０ｍＭ）の最終ＤＭＳＯストックを得た。
１１ｍＬの９０％ＤＭＳＯ ＧＮＰ溶液（６０ｍｇ Ａｕ）を、５００ｒｐｍで撹拌し続けた後、２．７９ｍＬのＥＤＣ／ＮＨＳ ＤＭＳＯストックを、滴加した。反応混合物を、２時間室温にて５００ｒｐｍで撹拌し続けた（［Ａｕ］≒４．３５ｍｇ／ｍＬ）。
２時間の活性化後に、ＧＮＰ－ＮＨＳ ＤＭＳＯ溶液を、遠心分離（４３００ｒｐｍ、８分）により８ｘ１５ｍＬのＡｍｉｃｏｎチューブ（１０Ｋ）中で濃縮した。ＧＮＰ最終濃度は、約１２ｍＬであった。
ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２カップリング：
ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２（ＮＰ当り６０当量）：（６０ｍｇ Ａｕ／１９６．９７）÷１００ｘ６０ｘ６５６．７５＝１２０ｍｇ
１２０ｍｇのＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２を最初に、２０ｍＬのヘペス緩衝液（ｐＨ＝７．８３）に溶解し、次にこれを、２５０ｍＬの丸底フラスコに移した。室温（約２２℃）にて６００ｒｐｍで撹拌しながら、１２ｍＬの濃縮ＧＮＰ－ＮＨＳ溶液を、滴加した。その後、２０ｍＬのヘペス緩衝液を、この混合物に加えた。反応混合物を、室温（約２２℃）にて６００ｒｐｍで一晩撹拌した（［Ａｕ］＝１．１５ｇ／Ｌ）。
翌朝、反応溶液混合物を、１５ｍＬのＡｍｉｃｏｎチューブ（１０Ｋ）中で濃縮し、ミリＱ水で洗浄することにより精製した（ｘ８、４３００ｒｐｍ、８分／洗浄）。濃縮溶液を次に、１３．３Ｇで５分間（ｘ２）遠心分離して、全ての大きなサイズの粒子を溶液から除去した。最終濃縮ＧＮＰ溶液を、ミリＱ水で希釈して、１１ｍＬの最終体積を得た。

ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２含量を、下記の試料調製を行いＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣにより評価した：８μｇのＡｕを、０．２ＭのＴＣＥＰで希釈して、４０μＬの最終体積を得た（［Ａｕ］＝０．２ｇ／Ｌ）後、３７℃でインキュベートし、６００ｒｐｍで１時間撹拌した。インキュベーション後に、４０μＬのミリＱ水を加えて、８０μＬの最終総体積（［Ａｕ］＝０．１ｇ／Ｌ）を得た。この溶液を、ＨＰＬＣにより分析した（２０μＬ注入→２μｇ Ａｕ）。ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２の標準のために：４μＬの２ｇ／Ｌ ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２ストック水溶液および３６μＬの０．２Ｍ ＴＣＥＰを、３７℃でインキュベートし、６００ｒｐｍで１時間撹拌した。これに、１６０μＬのミリＱ水を加えた（総体積＝２００μＬ ［ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２］＝０．０４ｇ／Ｌ）。この溶液を、ＨＰＬＣにより分析した（１０μＬ注入→０．４μｇ、２０μＬ→０．８μｇおよび３０μＬ→１．２μｇ）。
検量線を、生成した（比色分析による金の定量化時に黄色ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２化合物の効果を考慮し、それにより金濃度を修正する）。ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２担持は、ＧＮＰ当り１６．７当量であると決定され、９７．４％の組み込みであった。

まとめると、このＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２粒子のバッチは、次の特性を有した：小サイズの単一サイズ集団（５．６７８ｎｍ）、負のゼータ電位（－２２．８ｍＶ）、５２０ｎｍにプラズモンバンドなし、ＧＮＰ上のＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２組み込みは９７．４％であり、および最終粒子の担持はＧＮＰ当り１６．７当量（平均）であった。一致した結果が、異なる反応器サイズ（５０ｍおよび１００ｍｇ Ａｕ）のバッチ間でも認められた。これらの結果は、実施例１で得られた結果と比べて遜色がない。特に、修飾ＭＴＸ（ＭＴＸＰＥＧ３ＮＨ２）は、顕著に高い担持（１６．７当量対約５当量のＭＴＸ）、高添加量効率（９７．４％）および単一サイズ集団を促進した。特定の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＧＮＰのＰＥＧ_８ＣＯＯＨリガンドへのＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２のカップリングは、実施例１で記載のＭＴＸ上の複数のカルボキシル部位の問題を回避し、およびこれは、単一粒度分布／集団（実施例２）と２つのサイズ分布／集団（実施例１）の間の観察された差異を説明し得ると考えている。さらに、ここで測定された９７．４％の担持効率は、Ｂｅｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６で報告された一番高い担持効率の８３±２％よりもさらに顕著に高い。Ｂｅｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６の担持は、ＧＮＰ当りのＭＴＸ当量の観点から報告されていない。しかし、Ｂｅｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６の合成で使用されたＭＴＸ薬物に対するＡｕ－３ＭＰＳの重量比は、５：１（すなわち、ＧＮＰの過剰）であった。

結論として、［α－ＧａｌＣ２］［ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ－ＣＯ－ＰＥＧ_８］＠Ａｕ ＧＮＰは、比較例１の非修飾ＭＴＸで観察された担持に比較して、高いＭＴＸ担持を示す。

実施例４－［α－ＧａｌＣ２］［ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ－ＣＯ－ＰＥＧ_８］＠Ａｕ ＧＮＰのヒドロゲルへの製剤化。
現在利用可能なメトトレキサートの市販の局所製剤は、生理学的ｐＨ（ｐＨ６）で解離型である、薬物の水溶性に主に起因して、角質層を介する浸透が不十分である。炭水化物リガンドを含むコロナを有する本明細書で開示のＧＮＰの超小寸法（＜５ｎｍ）は、好適な正味表面電荷を可能にし、無処理の皮膚を横切るメトトレキサートの浸透能力を高める可能性を提供し得る。

最近、局所金ナノ粒子クリーム製剤が、メトトレキサート複合化ＧＮＰの予備試験で不十分な経皮吸着を示すと、Ｂｅｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．２０１６により報告された。ヒドロゲルはまた、それらが製剤からの薬物送達のより大きな柔軟性および制御を可能にし得る単一相担体を提供するので、局所ナノ粒子製剤の開発にも適用されてきた。加えて、ヒドロゲルは、薬物と製剤基剤の間の高親和性が効率的な皮膚内への薬物移行を損なう市販の軟膏に比べて、皮膚上に残留製剤を残さない急速蒸発の利点を提供する。従って、カーボポールヒドロゲルを、ＧＮＰベース局所製剤の開発のために選択した。

次のポリマー（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、評価した：カーボポール（登録商標）ＥＴＤ２０２０（Ｃ１０－３０アルキルアクリレート架橋ポリマー）、カーボポール（登録商標）９８０ＮＦポリマーおよびカーボポール（登録商標）９７４Ｐ ＮＦポリマー。ゲルを、１～３％ｗ／ｖのカーボポールポリマー（ｗ／ｖ）を一定混合しながら精製水中に分散させ、５時間にわたり水和させることにより調製した。ゲルの調製中にロッカー上で溶液をゆっくり撹拌することにより、空気の閉じ込めを回避するように注意した。５時間後に、ゲルのｐＨを、ｐＨを中和するためにトリエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ロット＃ＳＴＢＦ６１６Ｖ）を用いてｐＨ７．４に調節し、溶液を、ゲルに変化させた。２％のカーボポール（登録商標）９８０ゲルは、透明で均質なゲルを生成することがわかったが、ＥＤＴ２０２０ゲルは、均一にするのがより困難であった。従って、金グリコナノ粒子のヒドロゲルへの製剤化を、カーボポール（登録商標）９８０ＮＦポリマーにより進めた。

ＭＴＸＰＥＧ_３ＮＨ_２担持ＧＮＰを、基本的に実施例２に記載のように調製した。メトトレキサート－ＧＮＰヒドロゲルの製造のために、２％ｗ／ｖカーボポール（登録商標）９８０を最初に、一定混合しながら５時間分散させた。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりＡｍｉｃｏｎ遠心濾過チューブ（１０Ｋ分画分子量膜）を用いて濃縮した。２％カーボポール（登録商標）９８０溶液への添加の前に、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを、ｐＨ２．６に調節した。酸性ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを次に、２％カーボポール（登録商標）９８０溶液に添加した。しかし、ナノ粒子は、カーボポール（登録商標）９８０溶液中で急速に沈殿することが観察された。プレーンメトトレキサート薬物ゲルを、水中にＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２を水中に溶解すること、およびｐＨをｐＨ４．５に調節することにより調製した。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２溶液を、以前に作製した２％カーボポール（登録商標）９８０溶液に加えた。しかし、小量の黄色沈殿も観察された。

金ナノ粒子をカーボポール（登録商標）８９０ゲル中に製剤化する方法を、対照［α－Ｇａｌ］［ＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］＠Ａｕ ＧＮＰを用いて、ｐＨの影響およびナノ粒子の添加速度を試験することにより最適化した。沈殿物のない均質のナノ粒子ゲルが、［α－Ｇａｌ］［ＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］＠Ａｕ ＧＮＰを一定混合しながら滴加する前に、カーボポール（登録商標）９８０溶液のｐＨをｐＨ７．４に調節した場合に得られた。同様に、メトトレキサートゲル（ナノ粒子のない）についても、沈殿物のない均質の黄色ゲルが、修飾メトトレキサートの滴加の前にカーボポール（登録商標）９８０溶液のｐＨをｐＨ７．４に調節した場合に得られた。ゲルを全て、４℃で貯蔵した。

メトトレキサート－ＧＮＰヒドロゲルの製造のために、２％ｗ／ｖカーボポール（登録商標）９８０を、一定混合しながら５時間分散させた。カーボポール（登録商標）９８０溶液のｐＨを、７．４に調節して明確なゲルを生成した。ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰを、Ａｍｉｃｏｎ遠心濾過チューブを用いて濃縮した後、２％カーボポール（登録商標）９８０ゲルに添加した。得られたＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲルは、均質褐色ゲルであり、ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰの沈殿はゲル中で観察されなかった。［α－Ｇａｌ－Ｃ２］［ＰＥＧ_８ＣＯＯＨ］＠Ａｕ ＧＮＰを用いて、対照ＧＮＰ（薬物なし）ゲルも同様に調製し、褐色の均質ゲルを生成することが分かった。プレーンメトトレキサート薬物ゲルを、ｐＨ７．４に調節したカーボポール（登録商標）９８０ゲル（２％）に、水中に溶解したＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２を添加することにより調製した。メトトレキサートは、容易に取り込まれ、黄色で均質のヒドロゲルを生成し、メトトレキサート誘導体の沈殿が観察されないことが明らかになった。

ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰヒドロゲル中のＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２の濃度は、０．１８～０．２％（ｗ／ｗ）の範囲であった。
以前に報告された局所製剤中のＭＴＸ濃度は通常、０．２５％～０．５％の範囲である（例えば、Ｌａｋｓｈｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ Ｌｅｐｒｏｌ，２００７，Ｖｏｌ．７３，ｐｐ．１５７－１６１ ａｎｄ Ｊａｂｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｆａｃ Ｍｅｄ Ｂａｇｈｄａｄ，２０１０，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．１，ｐｐ．３２－３６を参照のこと）。

実施例５－ＭＴＸ－ＰＥＧ_３－ＮＨ_２－担持ＧＮＰのＨＥＰ３ＢおよびＵ８７ＭＧ細胞に対する細胞増殖抑制性活性
メトトレキサート、リンカー修飾メトトレキサート、ＭＴＸ－（ＥＧ）_３－ＮＨ_２およびＭＴＸ－（ＥＧ）_３－ＮＨ_２－担持金ナノ粒子（ＧＮＰ）（［ＭＴＸ－（ＥＧ）_３－ＮＨＣ（Ｏ）－（ＥＧ）_８］［アルファ－Ｇａｌ］［ＣＯＯＨ－（ＥＧ）_８］＠Ａｕ）の細胞傷害性または細胞増殖抑制性活性を、Ｈｅｐ３ＢおよびＵ８７ＭＧ細胞の処理により評価した。インキュベーション時間は７２時間であり、濃度範囲は４０ｐＭ～５００μＭであった。
結果はＩＣ_５０で表され、以下の通りである：

これらの結果は、リンカー修飾ＭＴＸは、単独でまたはＧＮＰに結合された場合、試験細胞株に対し細胞傷害性または細胞増殖抑制性活性を示すことを実証する。

実施例６．Ｎ－［４－［［（２，４－ジアミノ－６－プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］－Ｌ－グルタモイル－［１－アミノ－４，９－ジオキサ－１２－ドデカン］の合成
２，４－ジアミノ－６－（ヒドロキシメチル）プテリジン
２，４－ジアミノ－６－（ヒドロキシメチル）プテリジン塩酸塩（３．３４ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、１．００当量）を、Ｈ_２Ｏ（１２０ｍＬ）中に懸濁し、得られた混合物を、４０℃に加熱した。４０℃で３０分の撹拌後に、懸濁はまだ観察された。混合物を室温に冷却し、１ＭのＮａＯＨ（１２ｍＬ）を、５分以内に室温で滴下した。黄色固体が沈殿した。得られた混合物を、室温で３０分間撹拌した。黄色固体を、濾過し、水（２ｘ６ｍＬ）で洗浄し、減圧下４０℃で乾燥して、２，４－ジアミノ－６－（ヒドロキシメチル）プテリジン（２．４ｇ、黄色固体）を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。

Ｎ－［４－［［（２，４－ジアミノ－６－プテリジニル）メチル］メチルアミノ］安息香酸
２，４－ジアミノ－６－（ヒドロキシメチル）プテリジン（２．４ｇ）を、無水ＤＭＡ（２０ｍＬ）に懸濁し、トリフェニルホスフィンジブロミド（１３．８７ｇ、３２．９ｍｍｏｌ、２．２５当量）を加えた。懸濁液を、室温で２０時間撹拌した後、４－（メチルアミノ）安息香酸（２．４５ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（５．３４ｍＬ、３０．７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液を、ブロミドがＵＰＬＣ分析により認められなくなるまで、室温で４８時間攪拌した。暗色反応混合物を、０．３３ＭのＮａＯＨ（１９０ｍＬ）に注ぎ込み、沈殿物を、濾過により除去し、濾液を、１０％ＡｃＯＨ水溶液（２０ｍＬ）で約ｐＨ４．５に酸性化した。沈殿物を、濾過により集め、水（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、メタノール（２３ｍＬ）を用いて４０℃でトリチュレートして、暗黄色固体を得、これを、減圧下４０℃で乾燥して、目的の生成物（３．７３ｇ、７８％収率、ＵＰＬＣ：９２％）を得た。

α－ｔ－ブチル－Ｎ－［４－［［（２，４－ジアミノ－６－プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］－Ｌ－グルタメート
ＤＭＦ（無水、４０ｍＬ）およびトリエチルアミン（１．７ｍＬ、１２．３ｍｍｏｌ、２．０当量）中のプテロイン酸（２．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ＴＰＴＵ（１．８３ｇ、６．１ｍｍｏｌ、１．０当量）で処理し、懸濁液を、室温で２．５時間撹拌した。別のフラスコ中で、ＤＭＦ（無水、３０ｍＬ）中のＬ－グルタミン酸－α－ｔ－ブチルエステル（１．４４ｇ、７．１ｍｍｏｌ、１．１５当量）およびトリエチルアミン（１．０ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ、１．２当量）の懸濁液を、調製した。活性エステルを、グルタミン酸の懸濁液にゆっくり加え、得られた混合物を、室温で７２時間撹拌した。ＤＭＦを、減圧下５０℃で除去した。暗褐色油の残留物を、酢酸エチル（７０ｍＬ）で処理し、得られた混合物を、３０分間撹拌し、得られた黄色固体を、濾過により集め、クロロホルム（７０ｍＬ）でトリチュレートした。固形物を、濾過により集め、クロロホルム（２ｘ３０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥（２時間）して、目的の生成物（２．７８ｇ、収率８９％）を得た。

α－ｔ－ブチル－Ｎ－［４－［［（２，４－ジアミノ－６－プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］－Ｌ－グルタモイル－［１－（ｔ－ブチルオキシカルボニルアミノ）－４，９－ジオキサ－１２－ドデカン］
α－ｔ－ブチル－Ｎ－［４－［［（２，４－ジアミノ－６－プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］－Ｌ－グルタメート（５．７６ｇ、１１．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（無水、１１５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（５．０ｍＬ、３６．１ｍｍｏｌ、３．２当量）を加えた。ＴＰＴＵ（３．３５ｇ、１１．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、溶液を、室温で３０分間撹拌した。ＤＭＦ（無水、８６．０ｍＬ）中の１－（ｔ－ブチルオキシカルボニル－アミノ）－４，９－ジオキサ－１２－ドデカンアミン（４．３４ｇ、１３．５ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を加えた。得られた混合物を、室温で７２時間撹拌し、ＤＭＦを、減圧下５０℃で除去して、粗製物質（１４．６ｇ）を褐色油として得た。

Ｎ－［４－［［（２，４－ジアミノ－６－プテリジニル）メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］－Ｌ－グルタモイル－［１－アミノ－４，９－ジオキサ－１２－ドデカン］
保護アミン（０．０７ｇ、０．１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＴＦＡ（４ｍＬ）に溶解し、室温で１６時間撹拌した。溶媒を除去し（無加熱）て、橙赤色油を得、これをジエチルエーテル（１０ｍＬ）で処理し、数分後に黄色固体が形成された。懸濁液を、室温で１時間撹拌し、濾過して、極端に吸湿性の固体を得、これをＡＣＮ、水およびＤＭＳＯに溶解し、分取ＨＰＬＣにより精製した。
ステップ＿３＿生成物（２．７０ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＴＦＡ（５．１ｍＬ、２０当量）に溶解した。反応を、室温で一晩実施し、ＤＣＭで希釈し、蒸発乾固させて（無加熱）、粗生成物をＴＦＡ塩の褐色油（６．４ｇ）として得、これを分取ＨＰＬＣ（Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μｍ Ｃ１８（２５０ｘ２１．２ｍｍ）、１１０Åカラムを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＰ）により精製した。

本明細書で引用される全ての参考文献は、それぞれ個別の刊行物または特許または特許出願が具体的に、個別にその全体が参照によって組み込まれることが示された場合と同程度にそれらの全体があらゆる目的において参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で記載の特定の実施形態は、限定するためではなく、一例として提供されている。本明細書のいずれのサブタイトルも便宜上の理由のみの目的で挿入されており、多少なりとも本開示を限定するものと解釈されるべきではない。

Claims (57)

1. 金属および／または半導体を含むコア、および
   前記コアに共有結合した複数のリガンド、
   を含むナノ粒子であって、
   前記リガンドは、
   （ｉ）炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を含む少なくとも１種の希釈リガンド、および
   （ｉｉ）式Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２のリガンドであって、式中、Ｄは、葉酸拮抗剤または葉酸を含み、Ｌ_１は、Ｃ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２アルキル鎖を含む第１のリンカー部分を含み、Ｌ_２は、Ｃ２－Ｃ１２グリコールおよび／またはＣ１－Ｃ１２アルキル鎖を含む第２のリンカー部分を含み、Ｌ_１およびＬ_２は、同じであるまたは異なってよく、かつＺは、Ｌ_１およびＬ_２を連結する最大１０個の原子の二価のリンカー基であり、かつＺは、少なくとも２個のヘテロ原子を含みかつＬ_２は、前記コアに結合される、リガンド
   を含む、ナノ粒子。
2. Ｄは、次の構造：
   

   

   を含み、式中、
   Ｘは、３～８員炭素環、ヘテロ環、炭素芳香環またはヘテロ芳香環であり、
   Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有するリンカー基であり、
   Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有する１個または複数の基で任意に置換され、かつ
   Ｑは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルから選択される１個または複数の基で任意に置換される融合二環式ヘテロ環またはヘテロ芳香環である、
   請求項１に記載のナノ粒子。
3. Ｄは、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラリトレキセド（Ｒａｌｔｉｔｒａｘｅｄ）およびプララトレキサートからなる群より選択される葉酸拮抗剤を含む、請求項２に記載のナノ粒子。
4. Ｄは、次の構造：
   

   

   から選択される、請求項３に記載のナノ粒子。
5. Ｚは、３～１０員炭素芳香環、３～１０員炭素環、３～１０員複素環、３～１０員ヘテロ芳香環、イミド、アミジン、グアニジン、１，２，３－トリアゾール、スルホキシド、スルホン、チオエステル、チオアミド、チオウレア、アミド、エステル、カルバメート、カーボネートエステルまたはウレアを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
6. Ｌ_１は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ－を含みかつＬ_２は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ－を含みかつｐおよびｑのそれぞれは、２～１０の範囲の数であり、かつｐおよびｑは、同じであるまたは異なってよい、請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
7. ｐは、３でありかつｑは、８である、請求項６に記載のナノ粒子。
8. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
   

   

   である、請求項１～７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
9. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
   

   

   である、請求項１～７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
10. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
    

    

    である、請求項１～７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
11. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
    

    

    である、請求項１～７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
12. Ｌ_２は、末端硫黄原子を介してコアに結合される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
13. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
    

    

    である、請求項１２に記載のナノ粒子。
14. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
    

    

    であり、式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、６、７、８、９または１０である、請求項１２に記載のナノ粒子。
15. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
    

    

    であり、式中、ｎは、１～１５の整数である、請求項１２に記載のナノ粒子。
16. Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２は、式：
    

    

    であり、式中、ｎは、１～１５の整数である、請求項１２に記載のナノ粒子。
17. 前記希釈リガンドは、単糖または二糖である炭水化物を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
18. 前記希釈リガンドは、ガラクトース、グルコース、マンノース、フコース、マルトース、ラクトース、ガラクトサミンおよび／またはＮ－アセチルグルコサミンを含む、請求項１７に記載のナノ粒子。
19. 前記希釈リガンドは、２’－チオエチル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドまたは２’－チオエチル－β－Ｄ－グルコピラノシド含む、請求項１７または請求項１８に記載のナノ粒子。
20. 前記コアは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｇｄ、Ｚｎまたはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される金属を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
21. 前記コアは、金を含む、請求項２０に記載のナノ粒子。
22. 前記コアの直径は、１ｎｍ～５ｎｍの範囲である、請求項１～２１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
23. そのリガンドを含む前記ナノ粒子の直径は、３ｎｍ～５０ｎｍの範囲である、請求項１～２２のいずれか１項に記載のナノ粒子。
24. コア当りのリガンドの総数は、２０～２００個の範囲である、請求項１～２３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
25. コア当りの前記式Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２のリガンドの数は、少なくとも１０個、任意選択で少なくとも１５個である、請求項１～２４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
26. 次の構造：
    

    

    を有し、式中、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、かつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である、請求項１に記載のナノ粒子。
27. 次の構造：
    

    

    を有し、式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、かつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である、請求項１に記載のナノ粒子。
28. 次の構造：
    

    

    を有し、式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、かつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である、請求項１に記載のナノ粒子。
29. 次の構造：
    

    

    を有し、式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、かつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である、請求項１に記載のナノ粒子。
30. 前記複数のリガンドは、治療的に活性な薬剤または検出可能部分をさらに含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
31. 前記治療的に活性な薬剤は、抗癌剤を含む、請求項３０に記載のナノ粒子。
32. 前記抗癌剤は、マイタンシノイド（例えば、マイタンシノイドＤＭ１またはマイタンシノイドＤＭ４）、ドキソルビシン、イリノテカン、白金（ＩＩ）、白金（ＩＶ）、テモゾロミド、カルムスチン、カンプトテシン、ドセタキセル、ソラフェニブ、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびパノビノスタットからなる群から選択される、請求項３１に記載のナノ粒子。
33. 請求項１～３２のいずれか１項に記載の複数のナノ粒子および少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。
34. 前記医薬組成物は、ゲル、任意選択でヒドロゲルの形態である、請求項３３に記載の医薬組成物。
35. 前記ゲルは、カーボポール（登録商標）９８０、カーボポール（登録商標）９７４およびカーボポール（登録商標）ＥＴＤ２０２０からなる群より選択される、請求項３４に記載の医薬組成物。
36. 前記ゲル中の前記葉酸拮抗剤の濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約２ｍｇ／ｍＬである、請求項３４または請求項３５に記載の医薬組成物。
37. 前記ナノ粒子コアは、金でありかつ前記ゲル中の金の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬの範囲、任意選択で約４ｍｇ／ｍＬである、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
38. 前記組成物は、局所投与用である、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
39. 前記組成物は、全身投与用である、請求項３３に記載の医薬組成物。
40. 医薬での使用のための請求項１～３２のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項３３～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
41. 哺乳動物対象における増殖性障害、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療での使用のための請求項１～３２のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項３３～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
42. 治療を必要とする対象に請求項１～３２のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項３３～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物対象における増殖性障害、炎症性疾患または自己免疫疾患を治療する方法。
43. 請求項４２に記載の方法での使用のための薬物の調製における請求項１～３２のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項３３～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
44. 請求項１～３２のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項３３～３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、
    前記ナノ粒子または医薬組成物を入れるための容器、および
    添付文書または標識、
    を含む製品。
45. 添付文書および／または標識は、哺乳動物対象における増殖性障害、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療での前記ナノ粒子または医薬組成物の使用に関連する説明書、投与量および／または投与情報を提供する、請求項４４に記載の製品。
46. 式Ｄ－Ｌ_１－Ｒ_１の化合物の化合物であって、Ｄは、葉酸拮抗剤または葉酸を含み、Ｌ_１は、－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ－を含み、ｐは、１～１０の範囲の整数であり、かつＲ_１は、アミン基を含む、化合物。
47. 構造式：
    

    

    を有し、式中、
    Ｘは、３～８員炭素環、ヘテロ環、炭素芳香環またはヘテロ芳香環であり、
    Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有するリンカー基であり、
    Ｙは、Ｈ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１個または複数の原子を含む１～２０個の原子を有する１個または複数の基で任意に置換され、かつ
    Ｑは、アミノ、ヒドロキシル、カルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルから選択される１個または複数の基で任意に置換される融合二環式ヘテロ環またはヘテロ芳香環である、
    請求項４６に記載の化合物。
48. 構造式：
    

    

    を有する、請求項４６または請求項４７に記載の化合物。
49. 次のステップ：
    

    

    （ｉ）式（ｂ）のアミンによる置換反応で使用されて式（ｃ）の化合物を得るハロゲン化合物（ａ１）を得るための式（ａ）のアルコールのハロゲン化、
    （ｉｉ）式（ｃ）と（ｄ）の化合物を用いてアミドカップリングを実施して式（ｅ）のアミドを得ること、
    （ｉｉｉ）式（ｅ）と（ｆ）の化合物を用いてアミドカップリングを実施して式（ｇ）のアミドを得ること、
    （ｉｖ）前記式（ｇ）の化合物のアミンおよびカルボン酸保護基を除去して式（ｈ）の化合物を得ること、
    を含み、Ｒ１は、カルボン酸保護基でありかつＲ２は、アミン保護基である、請求項４６または請求項４７に記載の化合物の製造のための工程。
50. Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル保護基である、請求項４９に記載の工程。
51. ｎは、３である請求項４９または請求項５０に記載の工程。
52. 下記ステップを含む、請求項１に記載のナノ粒子を形成するための工程：
    

    
53. Ｌ_２リガンドおよび炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を含む少なくとも１種の希釈リガンドを有するペイロード不含ナノ粒子、および
    遊離Ｄ－Ｌ_１リガンド、
    を混合するステップを含み、
    式中、Ｄ、Ｌ_１、ＺおよびＬ_２は、請求項１で定義の通りでありかつ前記Ｌ_２リガンドと前記Ｄ－Ｌ_１リガンドの１つは、末端アルキン基を有しかつもう一方は、末端アジド基を有し、
    それによりナノ粒子がＤ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２ペイロードリガンドを有して形成されＺは、１，２，３－トリアゾールである、
    請求項１に記載のナノ粒子の形成工程。
54. 下記ステップ：
    

    

    を含み、式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも２０個でありかつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも１０個である、請求項５３に記載のナノ粒子を形成するための工程。
55. 下記ステップ：
    

    

    を含み、式中、ｎは、１～１５の整数であり、コア当りのリガンドの総数は、少なくとも５個であり、かつコア当たりのメトトレキサート含有リガンドの総数は、少なくとも３個である、請求項５３に記載のナノ粒子を形成するための工程。
56. 式Ｄ－Ｌ_１－Ｚ－Ｌ_２のリガンドをペイロード不含ナノ粒子と混合するステップを含み、
    前記ペイロード不含ナノ粒子は、炭水化物、グルタチオンまたはエチレングリコール含有部分を有する複数の希釈リガンドに共有結合される金属および／または半導体を含むコアを有し、
    それによりいくつかの前記希釈リガンドが前記リガンドにより置換される、請求項１～３２のいずれか１項に記載のナノ粒子を形成するための工程。
57. 前記希釈リガンドは、イオウ原子を介して前記ペイロード不含ナノ粒子に共有結合される、請求項５６に記載の工程。
    
    

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