JP2022513326A - ワクチンおよび方法 - Google Patents

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Abstract

病原体に対して広域中和免疫応答、および関連するＴ細胞応答を誘導することが可能な最適化抗原性病原体ポリペプチドを同定するための方法、ならびにそのようなポリペプチドをコードする核酸配列を記載する。最適化抗原性病原体ポリペプチドまたは最適化病原体ポリペプチドをコードする核酸による免疫後の被験体において広域中和免疫応答が誘導されるか否かを決定する方法もまた記載される。核酸分子、ポリペプチド、ベクター、細胞、融合タンパク質、医薬組成物、および病原体に対する、特に新興または再興病原体（特にＲＮＡウイルス）に対するワクチンとしてのそれらの使用もまた記載する。

Description

本発明は、病原体に対して広域中和免疫応答を誘導することが可能な最適化抗原性病原体ポリペプチドを同定するための方法、そのような最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする核酸配列を同定するための方法、および最適化抗原性病原体ポリペプチドまたは最適化病原体ポリペプチドをコードする核酸による免疫後の被験体において広域中和免疫応答が誘導されるか否かを決定する方法に関する。本発明はまた、核酸分子、ポリペプチド、ベクター、細胞、融合タンパク質、医薬組成物、および病原体に対する、特に新興病原体または再興病原体（特にＲＮＡウイルス）に対するワクチンとしてのそれらの使用にも関する。本発明はまた、シュードタイプ化ウイルス粒子にも関する。
ワクチンの根本的原理は、病原体との遭遇に備えて免疫系を準備することである。ワクチンは、免疫系を誘発して抗体およびＴ細胞応答を産生させ、これは感染と闘うために役立つ。歴史的には、病原体が単離および成長されると、これを大量に産生して死滅させるかまたは弱毒化させ、ワクチンとして使用した。後に、単離病原体からの組換え遺伝子を使用して組換えタンパク質を生成し、免疫応答を刺激するためにこれをアジュバントと混合した。より最近では、病原体遺伝子をベクターシステム（弱毒化細菌またはウイルス）にクローニングし、抗原をｉｎ ｖｉｖｏで発現および送達した。これらの戦略は全て、将来の流行を防止するために過去の大流行から単離された病原体に依存している。有意に変化しないかまたは変化が遅い病原体にとっては、この従来の技術は有効である。しかし、一部の病原体は変異する傾向があり、抗体は異なる株の病原体を必ずしも認識しない。新興および再興病原体はしばしば、その脆弱な抗原を免疫系から隠すかまたは変装する。
新興疾患および再興疾患の中で、不釣り合いなほど多くの数（３７％）がリボ核酸（ＲＮＡ）ウイルスによって引き起こされている（Ｈｅｅｎｅｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００６； ２６０： ３９９－４０８）。ＲＮＡウイルスは、その遺伝材料としてＲＮＡを有するウイルスである。この核酸は通常一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）であるが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）でもあり得る。ＲＮＡウイルスは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング能を欠如することから、一般的にＤＮＡウイルスと比較して非常に高い変異率を有する。このことは、ＲＮＡウイルスによって引き起こされる疾患を防止する有効なワクチンを作製することが難しい１つの理由である。たいていの場合、ＲＮＡウイルスに対する現在のワクチン候補は、ワクチンインサートとして使用されるウイルス株に限定され、これはしばしば情報によって設計されるのではなく野生型の株を入手できるか否か基づいて選択される。エンベロープを有するＲＮＡウイルスのためのワクチンを開発する場合の技術的問題としては、ｉ）野生型の野生分離株糖タンパク質（ＧＰ）のウイルスによる変動が、ワクチン抗原として保護の限定的な幅をもたらすこと；ｉｉ）ワクチンインサートによって発現されるワクチン抗原の選択が非常に経験的であり、免疫原の選択が、遅い試行錯誤のプロセスであること；ｉｉｉ）発生しつつあるかまたは予想外のウイルス流行では、新規ワクチン候補の開発は時間がかかり、ワクチン展開を遅らせ得ることが挙げられる。
ＲＮＡウイルスによって引き起こされる顕著なヒト疾患としては、いくつかの別個の科のウイルスによって引き起こされる疾病の群であるウイルス出血熱（ＶＨＦ）が挙げられる。一般的に、用語「ウイルス出血熱」は、重度の多臓器症候群（すなわち、体の複数の臓器系が罹患する）を記載するために使用される。特徴的には、全身の血管系が損傷を受け、体が自己を調節する能力が損なわれる。これらの症状はしばしば出血（失血）を伴うが、失血そのものが生命を脅かすことはまれである。出血熱ウイルスの一部の型は、比較的軽度の疾病を引き起こし得るが、ウイルスの多くは重度の生命を脅かす疾患を引き起こす。ＶＨＦは、少なくとも５つの別個の科：Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、およびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅのウイルスによって引き起こされる。これらの科のウイルスは全て、ＲＮＡウイルスであり、全てが脂肪（脂質）の外被で覆われているかまたは外被にエンベロープを有する。ＶＨＦからの生存は、動物または昆虫宿主（天然のリザーバー）に依存する。ウイルスは、その宿主種が生存している地域に地理的に限定され、ヒトは、感染宿主と接触すると感染する。一部のウイルスに関しては、宿主からの伝播後、ヒトはウイルスを互いに伝播し得る。これらのウイルスによって引き起こされる出血熱のヒト症例または大流行は、散発的で不規則に起こる。大流行の発生は容易に予測することができない。一部の例外はあるものの、ＶＨＦの治癒はなく、確立された薬物処置もない。
アレナウイルスおよびフィロウイルスによって共に引き起こされるＶＨＦは、西アフリカから中央アフリカに至る広い地理的地域に及び、感染した動物リザーバーが移動し得るがヒト疾患がまだ報告されていない隣接地域を脅かす。フィロウイルスは、それらのゲノムを一本鎖のマイナスセンスＲＮＡの形態でコードする。一般に知られているこの科の２つのメンバーは、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスである。エボラは、新興および再興ＲＮＡウイルス疾患である。大流行は必ずしも正確に同じウイルスによって引き起こされる訳ではないが、同じウイルス科の異なる親戚（型）によって引き起こされ、その中には近縁の兄弟（例えば、エボラＭａｙｉｎｇａおよびエボラキクウィト）、近縁のいとこ（タイフォレストおよびブンディブギョ）、遠縁のいとこ（スーダン）、および遠縁の親戚（マールブルグウイルス）が存在する。２０１４年の西アフリカにおけるエボラの大流行は、ウイルス病が初めて認識されて以来最大であった。アレナウイルスは２つの群：旧世界ウイルスおよび新世界ウイルスに分類される。これらの群の間の差は、地理的および遺伝的に区別される。少なくとも８つのアレナウイルスが、重症度が異なるヒト疾患を引き起こすことが公知である。無菌性髄膜炎は、脳および脊髄に及ぶ炎症を引き起こす重度のヒト疾患であり、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染から生じ得る。出血熱症候群は、グアナリトウイルス（ＧＴＯＶ）、フニンウイルス（ＪＵＮＶ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）、ルジョウイルス（ＬＵＪＶ）、マチュポウイルス（ＭＡＣＶ）、サビアウイルス（ＳＡＢＶ）、またはホワイトウォーターアロヨウイルス（ＷＷＡＶ）などの感染に由来する。
ラッサ熱ウイルス（ＬＡＳＶ）、エボラ（ＥＢＯＶ）およびマールブルグ（ＭＡＲＶ）ウイルスは、西アフリカおよび中央アフリカにおける最も重要な出血熱である。ラッサ熱は、西アフリカの風土病であり、感染は推定で３００，０００～１００万の範囲であり、年間に５，０００人が死亡する。ラッサ熱ウイルス（ＬＡＳＶ）、エボラ（ＥＢＯＶ）、およびマールブルグ（ＭＡＲＶ）ウイルスは全て、封じ込めレベル４の病原体であり、ヒトの罹病率および死亡率は高く、確立された治癒はなく、現在これらのウイルスによって引き起こされる感染に対して認可されたワクチンはない。
インフルエンザウイルスは、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。インフルエンザウイルスには３つの型が存在し、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、およびインフルエンザＣ型と呼ばれる。インフルエンザＡ型ウイルスは、ヒト、ウマ、海洋哺乳動物、ブタ、フェレット、およびニワトリを含む広く多様な鳥類および哺乳動物に感染する。動物では、ほとんどのインフルエンザＡ型ウイルスが、呼吸器および腸管の軽度の局在感染を引き起こす。しかし、高病原性インフルエンザＡ株、例えばＨ５Ｎ１は、家畜において全身性の感染を引き起こし、死亡率は１００％に達し得る。２００９年では、Ｈ１Ｎ１インフルエンザは、ヒトインフルエンザの最も一般的な原因であった。ブタ起源のＨ１Ｎ１の新規株が２００９年に出現し、世界保健機構によってパンデミックであると宣言された。この株は、「ブタインフルエンザ」と呼ばれた。Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスもまた、１９１８年のスペイン風邪パンデミック、１９７６年のフォートディックス大流行、および１９７７～１９７８年のロシア風邪流行の要因でもあった。現在、２種類のインフルエンザワクチンアプローチ － 不活化スプリットワクチンおよび生弱毒化ウイルスワクチンが米国において認可されている。不活化ワクチンは、液性免疫応答を効率よく誘導することができるが、一般的に細胞性免疫応答の誘導は不良である。生ウイルスワクチンは、感染のリスクの増加により、免疫無防備状態の患者または妊娠患者には投与することができない。
したがって、新興疾患および再興疾患、特にＶＨＦおよびインフルエンザを含むＲＮＡウイルスなどのウイルスによって引き起こされる疾患に対して保護するために広域中和免疫応答を誘導する有効なワクチンを提供することが必要である。
Ｈｅｅｎｅｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００６）２６０：３９９～４０８
本発明によれば、病原体に対して広域中和免疫応答を誘導することが可能なリード候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを同定するための方法であって、
ｉ）複数の異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを含むポリペプチドライブラリーを提供するステップであって、各々の異なる候補のアミノ酸配列が病原体ポリペプチドの複数の異なるアミノ酸配列から最適化されており、病原体ポリペプチドの各々の異なるアミノ酸配列とは異なり、病原体ポリペプチドの各々の異なるアミノ酸配列が、異なる単離体のポリペプチドのアミノ酸配列を含み、各々の異なる単離体が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科の病原体の単離体である、ステップ；
ｉｉ）各々が広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科の病原体に結合するおよび／またはそれを中和することができる、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子による結合に関してポリペプチドライブラリーの候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをスクリーニングするステップ；ならびに
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において抗原結合分子のうちの１つまたは複数によって結合される候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを、病原体に対して広域中和免疫応答を誘導することが可能なリード候補最適化抗原性病原体ポリペプチドであると同定するステップ
を含む方法が提供される。
必要に応じて、病原体の各々の異なる単離体または複数の異なる単離体の各々は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ亜型または型の単離体である。
必要に応じて、病原体の各々の異なる単離体または複数の異なる単離体の各々は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ種または属の単離体である。
必要に応じて、異なる単離体は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科内の異なる亜型または型の単離体を含む。
必要に応じて、異なる単離体は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科内の異なる種または属の単離体を含む。
用語「病原体」は、本明細書で使用される場合、疾患を引き起こし得るあらゆるもの、特に疾患を引き起こし得る感染病原体、例えばウイルス、細菌、真菌、または寄生生物を指す。
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合によって共に連結されて鎖を形成する複数のアミノ酸残基を含むポリマーを指す。タンパク質は全て、ポリペプチドである。用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と互換的に使用される。用語「ポリペプチド」は、具体的には、天然に存在するタンパク質ならびに組換えまたは合成により産生されたタンパク質を網羅することが意図される。必要に応じて、ポリペプチドは、改変ポリペプチド、例えば、翻訳と同時にまたは翻訳後に改変されたポリペプチド、例えばグリコシル化ポリペプチドまたはグリコシル化タンパク質（「糖タンパク質」）である。糖タンパク質は、アミノ酸側鎖に共有結合したオリゴ糖鎖（グリカン）を含有するタンパク質である。炭水化物は、翻訳と同時のまたは翻訳後のグリコシル化によってタンパク質に結合される。
「病原体ポリペプチド」は、病原体の任意のポリペプチド形成部分を指す。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、病原体の構造タンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、病原体の表面に露出した構造タンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、ウイルスタンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、ウイルスエンベロープタンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、糖タンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、ウイルス糖タンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、外部ウイルスエンベロープ糖タンパク質（またはその一部）である。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。必要に応じて、病原体ポリペプチドは、最大１０００、９００、８００、７００、または６００アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む。
完全にアセンブルされた感染性ウイルスは、ビリオンとして公知である。最も単純なビリオンは、核酸（一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ）およびカプシドタンパク質コートからなる。カプシドは、一重または二重のタンパク質シェルとして形成され、１つまたは少数の構造タンパク質種のみからなる。エンベロープウイルスは、その保護的タンパク質カプシドを覆うエンベロープを有する。エンベロープは典型的に、宿主膜（リン脂質およびタンパク質）の一部に由来するが、ウイルスにコードされる糖タンパク質を含む。
エンベロープ表面の糖タンパク質は、宿主膜上の受容体部位を同定してそれに結合するために役立つ。次にウイルスエンベロープは、宿主膜と融合し、カプシドおよびウイルスゲノムが宿主に侵入して感染することが可能となる。ウイルス－細胞膜融合は、それによってヒト病原体、例えばフィロウイルス、インフルエンザウイルス、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む全てのエンベロープウイルスが細胞に侵入し、ウイルス感染を開始する手段である。この膜融合プロセスは、１つまたは複数のウイルスエンベロープ糖タンパク質によって実行される。融合は、細胞形質膜またはエンドソーム膜上で起こり得る。
糖タンパク質は、ウイルスが宿主免疫系を回避するために役立ち得る。エンベロープウイルスは、大きい適応性を有し、短期間で変化して宿主免疫系を回避することができる。エンベロープウイルスは持続感染を引き起こし得る。エンベロープＲＮＡウイルスとしては、例えば、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、Ｄ型肝炎、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、フィロウイルスが挙げられる。レトロウイルスは、エンベロープウイルスである。エンベロープＤＮＡウイルスは、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルスを含む。
ほとんどの外部ウイルスエンベロープタンパク質は糖タンパク質であり、しばしば二量体または三量体としてアセンブルされ、膜に固定されたスパイクとして存在する。フィロウイルスのエンベロープ上の三量体糖タンパク質（ＧＰ）スパイクは、結合、侵入、および融合を含むウイルス侵入の全ての段階を媒介する。細胞受容体の認識部位はしばしば、ウイルスエンベロープから最も離れたドメイン（遠位末端）に位置するが、近位ドメインは、エンベロープの脂質二重層と相互作用する。オリゴ糖側鎖（グリカン）は、Ｎ－グリコシド結合によって結合し、またはまれにＯ－グリコシド結合によって結合する。これらは、細胞のグリコシルトランスフェラーゼによって合成されることから、これらのグリカンの糖組成は、宿主細胞膜糖タンパク質の組成と類似である。
細胞表面上のフィロウイルスの侵入は、ＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３－ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ；ＣＤ２０９としても知られる）およびＬ－ＳＩＧＮ（肝臓およびリンパ節ＳＩＧＮ；ＣＬＥＣ４Ｍとしても知られる）を含むＣ型レクチン、ならびにいくつかの細胞表面タンパク質、例えばインテグリン、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有（ＴＩＭ）タンパク質、およびチロシンタンパク質キナーゼ受容体３（ＴＹＲＯ３）ファミリーメンバーなどの宿主細胞結合因子によって媒介されることが示されている。細胞表面に結合後、フィロウイルスは、マクロピノサイトーシス様のプロセスによって内部移行し、その後初期および後期エンドソームを通して輸送される。次に、ウイルスエンベロープが後期エンドソームの膜と融合した後、ウイルスゲノムが細胞質の中に侵入する。細胞質において、ウイルスゲノムは複製および転写され、新規ウイルスタンパク質が合成されて、後代ビリオンをアセンブルし、これが細胞表面から出芽する。
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）の表面糖タンパク質ＧＰは、多くのワクチンの重要な構成成分であり、中和抗体の標的である。ＥＢＯＶ ＧＰは、単一のポリペプチドとして合成され、次に、フリン様プロテアーゼによってＧＰ１およびＧＰ２サブユニットへと切断され、これらはサブユニット間ジスルフィド結合および非共有結合相互作用を通して共に保持され、ウイルス表面上でＧＰ１－ＧＰ２ヘテロ二量体の三量体を形成する。しかし、フリン切断は、ＥＢＯＶ ＧＰをプライミングするために十分ではない。細胞に侵入後、ウイルスは最終的に後期エンドソームへと輸送され、そこでＧＰはさらにプライミングされて一部の「キャップ」構成成分を除去し、それによってウイルス侵入につながる重要な膜融合事象の誘導を誘発する。ＥＢＯＶ ＧＰプライミングは、システインプロテアーゼであるカテプシンＢおよびカテプシンＬによって媒介され、これらはβ１３－β１４ループ内のＧＰ１を切断する。カテプシン切断は、ＧＰ１から、ムチン様ドメイン、グリカンキャップ、および提唱される受容体結合領域の最も外側のβ鎖を含むアミノ酸の約６０％を除去し、ＧＰのプライミング型を生じる（ＧＰｃｌと呼ぶ、１９ｋＤａ ＧＰ１プラスＧＰ２）。全長のＧＰとは異なり、プライミングされたＧＰｃｌは、ＥＢＯＶ感染にとって必須の宿主侵入因子であるエンドソーム膜タンパク質ニーマン・ピックＣ１（ＮＰＣ１）に結合することができない。遊離のＮＰＣ１－ＣおよびＧＰｃｌとのその複合体の結晶構造は決定されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ２０１６， １６４， ２５８－２６８）。エボラウイルス感染の間、ＧＰ遺伝子の主産物は分泌されたＧＰ（ｓＧＰ）であり、これはＧＰ２およびムチン様ドメインを欠如するが、ＧＰ１の２９５個のアミノ酸を共有する可溶性二量体である。
インフルエンザビリオンは、分節化したマイナス鎖センスＲＮＡゲノムを含有し、これは、以下のタンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックス（Ｍｌ）、プロトンイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質１（ＰＢ１）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、および非構造タンパク質２（ＮＳ２）をコードする。ＨＡ、ＮＡ、Ｍｌ、およびＭ２は、膜に会合するが、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＳ２は、ヌクレオカプシド関連タンパク質である。Ｍｌタンパク質は、インフルエンザ粒子における最も豊富なタンパク質である。ＨＡおよびＮＡタンパク質は、ウイルスの結合およびウイルス粒子の細胞への侵入の要因となるエンベロープ糖タンパク質であり、ウイルス中和および保護免疫に関する主要な免疫優性エピトープの起源である。ＨＡおよびＮＡタンパク質はいずれも、予防的インフルエンザワクチンのための最も重要な構成成分であると考えられている。
細菌または真菌に関して、適した病原体ポリペプチドは、細菌または真菌の繁殖にとって、または細菌もしくは真菌がヒトに感染するもしくは疾患を引き起こす能力にとって必須であるポリペプチドを含む。適切な例としては、表面発現ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：８２． ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１７．０００８２； Ｓａｎｔｏｓ ａｎｄ Ｌｅｖｉｔｚ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ． ２０１４； ４（１１）： ａ０１９７１１を参照されたい）が挙げられる。
用語「抗原性」は、本明細書で使用される場合、宿主生物において免疫応答を誘導することが可能な物質を指す。免疫応答は、液性および／または細胞性免疫応答であり得る。細胞性免疫応答は、抗原またはワクチンなどの刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、または多型核白血球などの免疫系の細胞の応答である。免疫応答は、例えばインターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関係する体の任意の細胞を含み得る。免疫応答は、自然免疫応答または炎症を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、保護的免疫応答は、被験体を感染または疾患から保護する（すなわち、感染を防止する、または感染に関連する疾患の発生を防止する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は当技術分野で周知であり、例えば、リンパ球（例えば、ＢまたはＴ細胞）の増殖および／または活性、サイトカインもしくはケモカインの分泌、炎症、または抗体産生を測定することを含む。
必要に応じて、最適化抗原性病原体ポリペプチドは、ポリペプチドが投与されている（ポリペプチドとして、または例えば投与された核酸発現ベクターから発現された）ヒトまたは非ヒト動物における抗体の産生および／またはＴ細胞応答を誘導することができる。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、Ｂリンパ系細胞によって産生される、特定のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、ヒトまたは他の動物において特異的抗原（免疫原）によって誘発される。抗体は、一部の実証可能な様式で抗原と特異的に反応することによって特徴付けられ、抗体および抗原は各々、他方に関連して定義される。「抗体応答を誘発する」は、抗原または他の分子が抗体の産生を誘導する能力を指す。
「中和」抗体または抗原結合分子は、病原体、例えばウイルスに結合するのみならず、それらが感染または感染の進行を阻害する（すなわち、低減する）、または遮断するように結合する。中和抗体または抗原結合分子は、受容体との相互作用を遮断し得るか、またはゲノムの脱外被を阻害するようにウイルスカプシドに結合し得る。用語「中和抗体」または「中和抗原結合分子」はまた、サイトカイン応答を促進することによって、または免疫細胞による取込みおよび除去を促進することによって、病原体、例えばウイルスの感染を防止することができる抗体または抗原結合分子を含む。特に、用語「中和抗体」は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）によって病原体の感染（または感染の進行）を阻害または遮断することが可能な抗体（またはその断片もしくは誘導体）を含む。中和可能であるのは、ウイルスに結合する多くの抗体のごく小さいサブセットに過ぎない。
用語「広域中和抗原結合分子」は、本明細書で使用される場合、病原体の少なくとも２つの異なる亜型もしくは種、例えばウイルスの少なくとも２つの異なる亜型もしくは種、細菌の少なくとも２つの異なる亜型もしくは種、または真菌の少なくとも２つの異なる亜型もしくは種の感染を阻害する（すなわち、低減する）、中和する、または防止することができる抗原結合分子、例えば抗体またはその断片または誘導体を含む。必要に応じて、広域中和抗原結合分子は、病原体のほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種、例えばウイルスのほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種、細菌のほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種、または真菌のほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種の感染を阻害する（すなわち、低減する）、中和する、または防止することができる。必要に応じて、広域中和抗体は、同じ科内の病原体（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）の少なくとも２つの異なる型のメンバーの感染を阻害する（すなわち、低減する）、中和する、または防止することができる。
必要に応じて、複数の異なる広域中和抗原結合分子は、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において使用される。必要に応じて、各々の異なる広域中和抗原結合分子は、ポリペプチドライブラリーの候補最適化抗原病原体ポリペプチドの異なる領域またはエピトープに結合する。
用語「広域中和免疫応答」は、本明細書で使用される場合、病原体の少なくとも２つの異なる亜型もしくは種、例えばウイルスの少なくとも２つの異なる亜型もしくは種、細菌の少なくとも２つの異なる亜型もしくは種、または真菌の少なくとも２つの異なる亜型もしくは種の感染および／または感染の進行を阻害する（すなわち、低減する）、中和する、または防止するために十分である、被験体において誘発された免疫応答を意味する。必要に応じて、広域中和免疫応答は、病原体のほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種、例えばウイルスのほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種、細菌のほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種、または真菌のほとんどもしくは全ての異なる亜型もしくは種の感染および／または感染の進行を阻害する、中和する、または防止するために十分である。必要に応じて、広域中和免疫応答は、同じ科内の病原体（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）の少なくとも２つの異なる型のメンバーの感染および／または感染の進行を阻害する、中和する、または防止するために十分である。必要に応じて、広域中和免疫応答は、同じ科内の病原体（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）の少なくとも２つの異なる属のメンバーの感染および／または感染の進行を阻害する、中和する、または防止するために十分である。
病原体に対するいくつかの広域中和抗体が公知である。例えば一部の抗体は、フィロウイルス科中の多様な亜型のウイルス単離体を中和することが可能であることが実証されている。エボラウイルス糖タンパク質に対するモノクローナル抗体の系統的分析が、Ｓａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ． （Ｃｅｌｌ， ２０１８； １７４（４）： ９３８－９５２）によって記載されている。エボラウイルスに対する広域中和抗体の例は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１７ （Ｃｅｌｌ １６９， ８９１－９０４）によって記載される免疫誘発マカク抗体ＣＡ４５である。ＨＩＶ－１エンベロープタンパク質に対する広域中和モノクローナル抗体は、Ｂｒｕｕｎ ｅｔ ａｌ． （ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（１０）： ｅ１０９１９６． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０９１９６）において参照されている。Ｃｏｒｔｉら（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ． ２０１７ Ｊｕｎ；２４：６０－６９）は、インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスに対する広域反応性のモノクローナル抗体の特異性、抗ウイルスおよび免疫学的作用機序、ならびに臨床開発に関する総説を提供する。
必要に応じて、病原体はウイルスである。
ウイルスは主に、表現型特徴、例えば形態学、核酸型、複製様式、宿主生物、およびそれらが引き起こす疾患のタイプによって分類される。ウイルスを分類する１つのスキームであるボルティモア分類システムは、ウイルスを、その核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、鎖形成性（一本鎖または二本鎖）、センス、および複製方法の組合せに応じて７つの群の１つに分類する：
・ Ｉ：ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）；
・ ＩＩ：ｓｓＤＮＡウイルス（＋鎖または「センス」）ＤＮＡ（例えば、パルボウイルス）；
・ ＩＩＩ：ｄｓＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス）；
・ ＩＶ：（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（＋鎖またはセンス）ＲＮＡ（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス）；
・ Ｖ：（－）ｓｓＲＮＡウイルス（－鎖またはアンチセンス）ＲＮＡ（例えば、オルトミクソウイルス、フィロウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス）；
・ ＶＩ：生活環においてＤＮＡ中間体を有するｓｓＲＮＡ－ＲＴウイルス（＋鎖またはセンス）ＲＮＡ（例えば、レトロウイルス）；
・ ＶＩＩ：生活環においてＲＮＡ中間体を有するｄｓＤＮＡ－ＲＴウイルスＤＮＡ（例えば、ヘパドナウイルス）。
必要に応じて、ウイルスはＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスは以下を含む：
第ＩＩＩ群：ウイルスは二本鎖ＲＮＡゲノムを有する；
第ＩＶ群：ウイルスは、プラス－センス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ピコルナウイルス（Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、および口蹄疫ウイルスなどの周知のウイルスを含むウイルス科である）、ＳＡＲＳウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、および風疹ウイルスを含む多くの周知のウイルスがこの群で見出される；
第Ｖ群：ウイルスは、マイナス－センス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。エボラおよびマールブルグウイルスは、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、麻疹、ムンプス、および狂犬病と共にこの群の周知のメンバーである。
異なるＲＮＡウイルス科のボルティモア分類に基づく分類を以下の表に記載する：
Figure 2022513326000001
必要に応じて、ウイルスは、新興または再興ＲＮＡウイルスである。新興または再興ＲＮＡウイルスの例としては、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサウイルス、インフルエンザウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルスが挙げられる。
必要に応じてウイルスは、フィロウイルスまたはアレナウイルスである。必要に応じて、ウイルスは、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスである。必要に応じて、ウイルスはラッサウイルスである。必要に応じて、ウイルスはインフルエンザウイルスである。
必要に応じて、病原体はＤＮＡウイルスである。必要に応じて、病原体は、ポックスウイルス科のメンバー、例えばサル痘ウイルスである。
ＤＮＡウイルスは以下を含む：
第Ｉ群：ウイルスは二本鎖ＤＮＡを有する。水痘およびヘルペスを引き起こすウイルスはこの群に見出される。
第ＩＩ群：ウイルスは一本鎖ＤＮＡを有する。
異なるＤＮＡウイルス科のボルティモア分類による分類を以下の表に記載する：
Figure 2022513326000002
必要に応じて、病原体は、逆転写ウイルスである。逆転写ウイルスは以下を含む：
第ＶＩ群：ウイルスは、ＤＮＡ中間体を通して複製する一本鎖ＲＮＡウイルスを有する。レトロウイルスは、この群に含まれ、ＨＩＶはそのメンバーである。
第ＶＩＩ群：ウイルスは、二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、逆転写酵素を使用して複製する。Ｂ型肝炎ウイルスは、この群に見出され得る。
用語「亜型」は、本明細書で使用される場合、病原体（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）の遺伝子バリアントまたは株を指す。例えば、エボラウイルス属は、フィロウイルス科に含まれるウイルス学上の分類群である。この属のメンバーはエボラウイルスと呼ばれる。６つの公知のエボラウイルス亜型が、各々が初めて同定された地域の名称をつけられている：ブンディブギョ、レストン、スーダン、タイフォレスト、ザイール、およびボンバリ。インフルエンザＡ型ウイルスは、ウイルスの表面上の２つのタンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて亜型に分類される。１８の公知のＨＡ亜型および１１の公知のＮＡ亜型が存在する。ＨＡおよびＮＡタンパク質の多くの異なる組合せが可能である。例えば、「Ｈ７Ｎ２ウイルス」は、ＨＡ７タンパク質およびＮＡ２タンパク質を有するインフルエンザＡ型ウイルス亜型を指定する。同様に、「Ｈ５Ｎ１」ウイルスは、ＨＡ５タンパク質およびＮＡ１タンパク質を有する。
Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科の天然のバリアントのウイルスの命名は、Ｋｕｈｎら（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． ２０１３ Ｊａｎ； １５８（１）： ３０１－３１１）において考察されている。著者らによれば、（天然の）ウイルス株は、「それが天然の条件下で安定であり続ける一部の独自の表現型特徴を保有することから認識可能である所定のウイルスのバリアント」である。そのような「独自の表現型特徴」は、比較される参照ウイルスとは異なる生物特性、例えば独自の抗原性特性、宿主範囲、またはそれが引き起こす疾患の徴候である。「ゲノム配列の単純な差を有するウイルスバリアントは、認識可能な別個のウイルス表現型が存在しないことから個別の株の状態を与えられない」。したがって、株は、それが感染（異なる種類の疾患、異なる種類の宿主に感染する、異なる手段によって伝播される等）の有意に異なる観察可能な表現型を引き起こすという点において、天然の参照ウイルス（典型的なバリアント）とは異なる遺伝的に安定なウイルスバリアントである。「遺伝的に安定な」とは、表現型の変化に関連するゲノムの変化が自然選択を通して経時的にほぼ保存されることを意味する。ゲノム配列の変動の程度は、別個の表現型が時にいくつかの変異から生じることから、株としてのバリアントの分類とは無関係である。「観察可能な表現型」は、例えば比較可能な動物実験において、研究者が、動物にどのウイルスを投与したかを知らなくとも、および２つのウイルス間の差に関するいかなる情報もなくとも、参照の対照ウイルス感染動物と、新規株と思われる株に感染した動物との間を区別することが可能であることを意味する。ウイルスバリアントをウイルス株として指定することは、国際専門家グループの責任である。これまで、この定義に従う天然のフィロウイルス株は報告されていない。例えばＥＢＯＶに関して記載された全ての遺伝子バリアントは、ヒトにおいておよび実験動物においても類似の出血熱を引き起こし、同様に伝播される。公知のＥＢＯＶ遺伝子バリアントのいずれも、臨床的な見地のみでは他のバリアントと区別することができない。実際に、その多様性は、成長速度論およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのプラーク形成のわずかな差、または実験動物における疾患期間のわずかな変化に限定され、最終的に限定的な、しかし安定なゲノム配列の差に由来する様に思われる。このことはまた、ＭＡＲＶ、ＲＡＶＶ、ＢＤＢＶ、ＲＥＳＴＶ、およびＳＵＤＶ（現在、ＴＡＦＶの単離体は１つのみであり、ＬＬＯＶの単離体はない）の異なる遺伝子バリアントについても当てはまる。
Ｋｕｈｎらによれば、天然の遺伝的フィロウイルスバリアントは、参照フィロウイルス（特定のフィロウイルス種の典型ウイルス）の配列とはそのゲノムコンセンサス配列が≦１０％異なるが、参照フィロウイルスとは同一ではなく、疾患の観察可能な異なる表現型を引き起こさない天然のフィロウイルスである（フィロウイルス株は、遺伝的フィロウイルスバリアントであるが、ほとんどの遺伝的フィロウイルスバリアントは、株の定義を進めるとフィロウイルス株ではない）。
ウイルスを分類するための別のスキームは、国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）のシステムである。システムは、細胞生物の分類系と多くの特色、例えば分類群構造を共有する。しかし、この命名システムは、他の分類学コードとはいくつかの点で異なる。ウイルス分類は、目のレベルから始まり、以下のように進み、分類群の接尾辞をイタリック体で示す：
目（－ｖｉｒａｌｅｓ）
科（－ｖｉｒｉｄａｅ）
亜科（－ｖｉｒｉｎａｅ）
属（－ｖｉｒｕｓ）
種
種の名称はしばしば、特に高等植物および動物に関する［疾患］ウイルスの形態をとる。
目の確立は、それが含有するウイルス科が共通の祖先から進化した可能性が最も高いという推定に基づく。ウイルス科の大部分は解明されていないままである。２０１７年現在、９つの目、１３１の科、４６の亜科、８０３の属、および４，８５３の種のウイルスがＩＣＴＶによって定義されている。目は、Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒａｌｅｓ、Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓ、Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ、Ｏｒｔｅｒｖｉｒａｌｅｓ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌｅｓ、Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓ、およびＴｙｍｏｖｉｒａｌｅｓである。これらの目は、多様な宿主範囲を有するウイルスに及ぶ。
・ Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓは、テールを有するｄｓＤＮＡ（第Ｉ群）バクテリオファージである。
・ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒａｌｅｓは、大きい真核生物ｄｓＤＮＡウイルスを含有する。
・ Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓは、直鎖状のｄｓＤＮＡ（第Ｉ群）始生代ウイルスを含有する。
・ Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓは、非分節型（－）鎖ｓｓＲＮＡ（第Ｖ群）植物および動物ウイルスを含む。
・ Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓは、脊椎動物宿主を有する（＋）鎖ｓｓＲＮＡ（第ＩＶ群）ウイルスで構成される。
・ Ｏｒｔｅｒｖｉｒａｌｅｓは、ＤＮＡ中間体を通して複製する一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを含有する（第ＶＩ群および第ＶＩＩ群）。
・ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌｅｓは、多様な植物、昆虫、および動物宿主に感染する小さい（＋）鎖ｓｓＲＮＡウイルスを含有する。
・ Ｔｙｍｏｖｉｒａｌｅｓは、植物に感染する一分節（＋）ｓｓＲＮＡウイルスを含有する。
・ Ｂｕｎｙａｖｉｒａｌｅｓは、三分節（－）ｓｓＲＮＡウイルスを含有する（第Ｖ群）。
ＩＣＴＶによれば、ウイルス種は、「その特性が複数の基準によって他の種の特性と区別することができるウイルスの単系統群」である。
用語「単離体」は、本明細書で使用される場合、感染した個体から得られている純粋な病原体試料を指す。ウイルス感染細胞は、わずか１ラウンドの複製後でゲノム集団を既に含有し、これらのゲノムに由来するビリオンは、互いにわずかに異なる。同様に、感染した個体から採取した試料は、多数のビリオンを含有し、その多くは非常にわずかに異なる。その結果、「単離体」は集団を指し、「単離体」の「配列」は、分析した試料に存在するゲノムの集団のコンセンサス配列である。ウイルス単離体は、「特定のウイルスの例」として定義され得る。天然のフィロウイルス単離体は、特定の天然のフィロウイルスの例であるか、または特定の遺伝的バリアントの例である。単離体は、コンセンサス配列または個々の配列が同一であるか、または互いにわずかに異なり得る。
必要に応じて、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子は、広域中和免疫応答を誘発することが望ましい病原体と同じ科の病原体に曝露されている被験体から得られている抗体、または得られている抗体に由来する抗体を含む。
必要に応じて、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子は、広域中和免疫応答を誘発することが望ましい病原体と同じ亜型または型の病原体に曝露されている被験体から得られている抗体、または得られている抗体に由来する抗体を含む。
必要に応じて、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子は、広域中和免疫応答を誘発することが望ましい病原体と同じ種または属の病原体に曝露されている被験体から得られている抗体、または得られている抗体に由来する抗体を含む。
必要に応じて、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子は、非抗体の抗原結合タンパク質を含む。例えば、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アプタマー、アンチカリン、またはＴ細胞受容体分子を含み得る。
ＤＡＲＰｉｎは、典型的に非常に特異的かつ高親和性の標的タンパク質結合を示す遺伝子操作された抗体模倣タンパク質である。それらは、天然のアンキリンタンパク質に由来し、大きい潜在的標的相互作用表面を有する安定なタンパク質ドメインを形成する繰返し構造単位を含む。典型的に、ＤＡＲＰｉｎは、４つまたは５つのリピートを含み、そのうち最初（Ｎ－キャッピングリピート）および最後（Ｃ－キャッピングリピート）は、親水性表面を提供するために役立つ。ＤＡＲＰｉｎは、天然のアンキリンリピートタンパク質ドメインの平均的なサイズに対応する。３つ（すなわち、キャッピングリピートおよび１つの内部リピート）より少ないリピートを有するタンパク質は、十分に安定な三次構造を形成しない。ＤＡＲＰｉｎの分子量は、リピートの総数に依存する：
Figure 2022513326000003
１０１２個を超えるバリアントの多様性を有するランダムな潜在的標的相互作用残基を有するＤＡＲＰｉｎをコードする核酸のライブラリーを生成することができる。これらのライブラリーから、翻訳と同時の分泌を可能にするシグナル配列を使用するリボソームディスプレイまたはファージディスプレイを使用して、ピコモル濃度の親和性および特異性を有する所望の選択標的に結合するＤＡＲＰｉｎを選択することができる。このように、ＤＡＲＰｉｎのライブラリーのスクリーニングによって、病原体の１つより多くの亜型に結合するおよび／またはそれを中和する１つまたは複数のＤＡＲＰｉｎを同定することができる。ＤＡＲＰｉｎを同定するためのライブラリーに基づくスクリーニングは、例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１８ Ｖｏｌ． １０： １２８－１４３）に記載されている。
必要に応じて、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において記載された１つまたは複数の抗原結合分子は、広域中和抗体（または広域中和活性を保持するその断片もしくは誘導体）、例えば広域中和モノクローナル抗体（ＢＮｍＡｂ）（または広域中和活性を保持するその断片もしくは誘導体）を含む。
必要に応じて、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において記載された１つまたは複数の抗原結合分子は、広域中和免疫応答を誘発することが望ましい病原体と同じ亜型、型または科の病原体の大流行を生き延びた被験体から得られた抗体、または得られた抗体に由来する抗体を含む。
必要に応じて、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において記載された１つまたは複数の抗原結合分子は、広域中和免疫応答を誘発することが望ましい病原体と同じ種、属または科の病原体の大流行を生き延びた被験体から得られた抗体、または得られた抗体に由来する抗体を含む。
用語「大流行」は、本明細書で使用される場合、定義された施設（例えば、病院または医療センター）、共同体、地理的地域、または期間において通常予想されるより多くの症例の疾患の発生を指す。大流行は、限局された地理的地域で起こり得るか、またはいくつかの国にわたって広がり得る。これは、数日または数週間、または数年持続し得る。大流行の存在を示す症例数は、病原体、曝露された集団のサイズおよびタイプ、疾患に対する過去の経験または曝露の欠如、ならびに発生の期間および場所に応じて変化する。したがって、大流行の状況は、同じ地域における、同じ共同体中での、１年の同じ季節でのその疾患の通常の頻度と相関する。大流行の存在は、現在の情報を、１年の同じ時期の間の集団または共同体における過去の発生率と比較して、観察された症例数が予想数を超えるか否かを決定することによって確立され得る。
必要に応じて、病原体の大流行は、地域（例えば、大陸域）または国、または集団もしくは共同体において１回もしくは複数回の季節または１年にわたって通常予想されるより多くの症例の、病原体によって引き起こされる疾患の存在を指し得る。
必要に応じて、病原体（例えば、ウイルス）の大流行は、ある季節にわたってある地域（例えば、大陸域）において通常予想されるより多くの症例の、病原体によって引き起こされる疾患の存在である。
必要に応じて、病原体（例えば、ウイルス）の大流行は、ある季節にわたってある集団において通常予想されるより多くの症例の、病原体によって引き起こされる疾患の存在である。
大陸域の例は、アフリカ地域を含む：
・ 北アフリカ：アルジェリア；カナリア諸島；セウタ；エジプト；リビア；マデイラ；メリリャ；モロッコ；スーダン；チュニジア；西サハラ；
・ 東アフリカ：ブルンジ；コモロ諸島；ジブチ；エリトリア；エチオピア；ケニア；マダガスカル；マラウイ；モーリシャス；マヨッテ；モザンビーク；レユニオン；ルワンダ；セーシェル諸島；ソマリア；南スーダン；タンザニア；ウガンダ；ザンビア；ジンバブエ；
・ 中央アフリカ：アンゴラ；カメルーン；中央アフリカ共和国；チャド；コンゴ民主共和国；コンゴ共和国；赤道ギニア；ガボン；サントメ・プリンシペ；
・ 西アフリカ：ベナン；ブルキナファソ；カーボベルデ；コートジボワール；ガンビア；ガーナ；ギニア；ギニアビサウ；リベリア；マリ；モーリタニア；ニジェール；ナイジェリア；セントヘレナ；セネガル；シエラレオネ；トーゴ；
・ 南アフリカ：ボツワナ；レソト；ナミビア；南アフリカ；スワジランド。
必要に応じて、抗体が得られているまたは由来している被験体は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物被験体である。
ポリペプチドライブラリーの候補最適化抗原性病原体ポリペプチドは、任意の適した発現系を使用して発現され得る。適した例としては、哺乳動物細胞、または酵母、または昆虫、または細菌細胞が挙げられる。
必要に応じて、ポリペプチドライブラリーの候補最適化抗原性病原体ポリペプチドは、発現系の細胞表面上に発現される。細胞表面発現は、候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが正確にフォールディングされる可能性を増加させる。
必要に応じて、候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを、フローサイトメトリーによって１つまたは複数の抗原結合分子による結合に関してスクリーニングする。例えば、候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを発現する細胞を、フローサイトメトリーアッセイにおいて使用してもよい。
必要に応じて、候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを、第１のアッセイ（例えば、フローサイトメトリー）を使用して１つまたは複数の広域中和抗原結合分子による結合に関して、および第２のアッセイ（例えば、中和アッセイ）を使用して１つまたは複数の広域中和抗原結合分子による結合に関してスクリーニングする。
必要に応じて、病原体はウイルスであり、候補最適化抗原性病原体ポリペプチドは、候補最適化抗原性ウイルスポリペプチドであり、病原体ペプチドはウイルスポリペプチドである。
必要に応じて、ポリペプチドライブラリーは、各々の異なるウイルスシュードタイプが、異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチド、例えば異なる候補最適化抗原性ウイルスポリペプチド（例えば、ウイルス糖タンパク質）を含む、複数の異なるウイルスシュードタイプを含むウイルスシュードタイプライブラリーである。
必要に応じて、ステップ（ｉｉ）において、１つまたは複数の抗原結合分子による結合および／または中和に関してウイルスシュードタイプをスクリーニングすることによって、候補最適化抗原性ウイルスポリペプチドを、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子による結合に関してスクリーニングする。
シュードタイプ化は、外来のウイルスエンベロープタンパク質と組み合わせてウイルスまたはウイルスベクターを産生するプロセスである。結果は、シュードタイプ化ウイルス粒子である。シュードタイプ化粒子は、追加のウイルスエンベロープタンパク質を産生するための遺伝子材料を有しないことから、表現型の変化を後代ウイルス粒子に伝えることができない。「シュードタイプ」は、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ゲノムを封入するタンパク質ヌクレオカプシド（「コア」）を、コア自身が宿主細胞に由来する脂質「エンベロープ」膜に封入された状態で含むハイブリッドウイルス粒子として定義され得る。このエンベロープは、出芽によって細胞からコアが出る際に獲得され、他のウイルスに由来するタンパク質を含む。これらの異種エンベロープタンパク質の多くは、宿主免疫系の抗原性標的である。シュードタイプでは、これらのエンベロープタンパク質の１つまたは複数が研究ウイルスに由来し得る。多くのシュードタイプはまた、そのゲノムの中に操作された「導入」遺伝子と呼ばれる外来遺伝子も有する。感受性細胞の存在下で、エンベロープタンパク質が、細胞への侵入を可能にする細胞受容体に結合すると、最終的に導入遺伝子の発現が起こる。ラブドウイルス（例えば、水痘－帯状疱疹ウイルス、ＶＳＶ）およびレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）は、シュードタイプ化のためのコアとして広く利用されている。レトロウイルスの場合、その重要な特徴は、その二量体の一本鎖ＲＮＡを二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）コピーへと逆転写できることであり、このコピーはその後ウイルスおよび細胞の酵素の使用を介して細胞ゲノムへ組み込まれる。レトロウイルスシュードタイプの場合、これは通常、導入／レポーター遺伝子の発現をもたらし、後者は容易に定量可能である。レポーター遺伝子発現は、ウイルスエンベロープ／受容体相互作用の効率と直接相関し、個々の抗体応答または抗ウイルス剤が天然のウイルスの侵入および複製プロセスを干渉できるか否かと逆相関する。
広域中和抗原結合分子に対するウイルスシュードタイプの結合は、当業者に公知の任意の適切な技術、例えばヘマグルチニン阻害（ＨＩ）アッセイ、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定され得る。糖タンパク質（ＧＰ）に対する抗体結合のＥＬＩＳＡ分析は、エボラウイルスＧＰに対するモノクローナル抗体の分析に関連してＳａｐｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１８ （Ｃｅｌｌ １７４（４）： ９３８－９５２）に記載されている。
レトロウイルスシュードタイプの産生、ならびにシュードタイプ中和アッセイおよび免疫原性試験におけるそれらの使用は、Ｔｅｍｐｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５ （Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓ － Ｆｒｏｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｏｏｌｓ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｔｙ． Ｉｎ： ｅＬＳ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ： Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ． ＤＯＩ： １０．１００２／９７８０４７００１５９０２．ａ００２１５４９．ｐｕｂ２）において詳細に概説されている。
レトロウイルスの７つ全ての属の代表がシュードタイプ化研究において用いられているが、今日まで広く使用されているのは、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスシュードタイプのみである。レンチウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科の１つの属であり、ガンマレトロウイルスとは異なり非増殖細胞に感染することができ、そのためそれらは筋肉またはニューロンを含む高度に分化したまたは静止期の細胞（例えば、Ｇ０細胞周期相）を伴う遺伝子治療適用を受け入れられる。シュードタイプ化のために使用される最も一般的なレンチウイルスベクターはＨＩＶ－１型（ＨＩＶ－１）であるが、サル免疫不全ウイルスも同様に用いられている。
レトロウイルスシュードタイプの生成は、外来エンベロープタンパク質遺伝子、コアレトロウイルス遺伝子、および導入遺伝子（例えば、レポーターまたは治療遺伝子）のクローニング型を産生細胞、通常高度にトランスフェクト可能な細胞株、例えばヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３クローン１７Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＃ＣＲＬ－１１２６８）に同時に導入することを通して達成される（Ｐｅａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０： ８３９２－８３９６）。
１．エンベローププラスミド。研究ウイルスのエンベロープ遺伝子を、適切な発現プラスミドにクローニングする。遺伝子は通常、特異的プライマーを使用してウイルスｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅を介して、またはカスタム遺伝子合成から誘導される。一部の発現ベクターは市販されており、シュードタイプ生成の有効性に影響を及ぼし得る、異なる通常強い構成的遺伝子プロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子）を利用する。
２．レトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌプラスミド。ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、ポリタンパク質をコードし、次にこれは切断されて、コア内に見出される構造タンパク質（マトリックス、カプシド、およびヌクレオカプシドを含む）、および構造タンパク質のプロセシングの要因であるウイルス複製に関係するタンパク質（プロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ）を放出し、ｓｓＲＮＡウイルスゲノムをｄｓＤＮＡに変換し、宿主細胞ゲノムへの組み込み（導入遺伝子の）を確実にする。加えてレンチウイルスｇａｇ－ｐｏｌ構築物では、ｒｅｖ遺伝子が含まれる。Ｒｅｖタンパク質は、翻訳のために核からサイトゾルへのウイルスｍＲＮＡの輸送に関係している。
３．導入／レポータープラスミド。これは、宿主細胞ＤＮＡに安定に組み込まれる遺伝子であり、そこから遺伝子は様々なｃｉｓ作用転写エレメントを介して発現される。導入プラスミドは、シュードタイプ生成の際に、遺伝子を含有するウイルスＲＮＡのウイルスコアへの取込みを確実にするために遺伝子の上流にパッケージングシグナルを含有する。
細胞の機構が、トランスフェクトされた遺伝子を転写および翻訳した後、導入遺伝子のＲＮＡ二量体（長い末端反復；ＬＴＲ間の領域）が、パッケージングシグナルを介してシュードタイプに組み込まれる。導入プラスミドは、パッケージングシグナルを含有するように操作された唯一のプラスミドであることから、他の核酸は成熟シュードタイプ粒子に組み込まれない。ＧａｇのＮ末端でのドメインは、ヌクレオカプシドを、その中にエンベロープタンパク質が挿入されている細胞形質膜に標的化する。細胞から出芽したシュードタイプ粒子は、細胞膜に封入されてウイルスエンベロープを形成する。
シュードタイプ化ウイルスは、産生細胞の培養培地に放出される。この上清を標的細胞上で滴定し、機能的粒子の濃度を測定することができる。これらは、エンベロープタンパク質－受容体相互作用を介して細胞に結合し、その後膜融合および内部移行が起こる。導入／レポーター遺伝子を有するシュードタイプゲノムが宿主細胞ＤＮＡに組み込まれ、そこで発現される。レポーター遺伝子の発現レベルは、生存可能な粒子による形質導入レベルと相関する。導入遺伝子のみがシュードタイプに存在することから、ウイルスタンパク質は標的細胞において産生されず、さらなるシュードタイプ産生および繁殖は起こらない。このことは、野生型ウイルスでの作業と比較してシュードタイプでの作業における安全性を提供する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に基づくシュードタイプは、蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーを使用して容易に滴定され、ルシフェラーゼシュードタイプはルミノメトリーによって、およびβ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）シュードタイプは呈色反応によって容易に滴定される。
多くの標準的な血清学的アッセイは、ウイルス感染性の阻害ではなくて、抗体結合のみを測定する（ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）およびＥＬＩＳＡ）。中和アッセイは、機能的抗体応答の感度のよい検出を可能にする。しかし、高い封じ込めウイルス（例えば、エボラ）の場合、高い生物安全性研究施設および特に訓練された人員が必要であることから、これらのアッセイは広く適用可能ではない。中和アッセイに使用するために「代用ウイルス」などの病原体のエンベロープによってシュードタイプ化されたレトロウイルスおよびレンチウイルス粒子を使用することは、この問題を回避する１つの方法である。シュードタイプ戦略を使用する場合、必要であるのはウイルスのエンベロープタンパク質のみであり、組換えウイルスまたは天然のウイルスが逃避する可能性がない。これらのシュードタイプは、複製不全であり、複製コンピテント後代を生じることができない。
シュードタイプは、ビリオンがレポーター遺伝子を含有し、表面上に異種ウイルスエンベロープタンパク質を有し得ることから、ウイルス中和アッセイのための優れた血清試薬である。これらのレポーター遺伝子の標的細胞への導入は、ウイルスエンベロープタンパク質の機能に依存し、したがってエンベロープに対する中和抗体の力価は、レポーター遺伝子導入および発現の低減によって測定することができる。ＰＶ中和アッセイは現在、多数のウイルス科からの広範囲のＲＮＡウイルスに関して開発されている（Ｔｅｍｐｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、上記の表１を参照されたい）。
シュードタイプに基づくインフルエンザ中和アッセイは、広域中和抗体を測定するために非常に効率的であることが示されており、それらはパンデミックの潜在性がある複数の亜型に対する交差反応性の応答を研究するための理想的な血清学ツールとなる（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３ （６０４４）： ８５０－８５６）。
フィロウイルス糖タンパク質によってシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターの産生は、Ｓｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７ （Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１７；１６２８：６５－７８）に記載される。
ウイルスシュードタイプを産生するための適切な一般的方法の例は以下の通りである：
トランスフェクションの場合、５×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を播種した２４時間後、ＤＮＡの細胞への輸送を促進するプラスミドＤＮＡとＰＥＩとを含む複合体を添加する。レトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌプラスミドおよびレポータープラスミドを、必要なエンベローププラスミドと同時トランスフェクトさせる。
適切な中和アッセイの例は以下の通りである：
９６ウェルプレートにおいて、１×１０５の相対光単位（ＲＬＵ）の出力をもたらす約１００×ＴＣＩＤ５０のシュードタイプ化ウイルスを、血清の希釈物と共に３７％（５％ＣＯ２）で１時間インキュベートした後、１×１０４個の標的細胞を添加した。これらをさらに４８時間インキュベートし、その後培地を除去し、新鮮な培地とルシフェラーゼ試薬の５０：５０混合物と交換する。ルシフェラーゼ活性を、ルミノメーター上でプレートを読み取ることによって２．５分後に検出する。全ての結果に関して、バックグラウンドＲＬＵ（ウイルス単独またはＤＥｎｖ）を分析前に推定する。
Ｓａｐｈｉｒｅら（上記）は、エボラウイルスＧＰに対するモノクローナル抗体の分析に関連してｍＡｂ中和の評価に関する３つの独立したアッセイを記載している：
ｉ）生物学的に封じ込められたＥＢＯＶ（ΔＶＰ３０）（Ｈａｌｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００８； １０５：１１２９－１１３３）；ならびに
ｉｉ）ＢＳＬ－２＋、ＢＳＬ－３、およびＢＳＬ－４封じ込め下で実施した真正ＥＢＯＶ；ならびに
ｉｉｉ）ＥＢＯＶ ＧＰを有する複製コンピテント水疱口内炎ウイルス（ｒＶＳＶ）。
エボラΔＶＰ３０－ＲｅｎＬｕｃウイルスの中和
レポーター遺伝子であるウミシイタケルシフェラーゼがウイルス転写因子ＶＰ３０を置換するエボラウイルス（エボラΔＶＰ３０－ＲｅｎＬｕｃウイルス）を使用して、ＶＰ３０をｉｎ ｔｒａｎｓで安定に発現するＶｅｒｏ細胞株（Ｖｅｒｏ ＶＰ３０）を補完し、このようにして、ＢＳＬ－３での分析を可能にする（Ｈａｌｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。２％ウシ胎仔血清を含む最小基本培地中で希釈したエボラΔＶＰ３０－ＲｅｎＬｕｃウイルスの全体で５×１０３個のフォーカス形成単位を、５０μｇ／ｍｌモノクローナル抗体と共に３７℃で３時間インキュベートする。ウイルス／抗体混合物を感染多重度（ＭＯＩ）０．００１で、９６ウェルプレートにおいて細胞９×１０３個／ウェルで前日に播種したＶｅｒｏ ＶＰ３０細胞に添加し、３７℃および５％ＣＯ２で３日間インキュベートする。使用する場合、モルモット補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を最小基本培地に最終濃度１０％で添加する。次に、生細胞ルシフェラーゼ基質であるＥｎｄｕＲｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、細胞と共に３時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ値を、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して相対光単位（ＲＬＵ）として測定する。アッセイは、二連で実施し、公知の中和（ＧＰ １３３／３．１６）および非中和モノクローナル（ＶＰ３５ ５／６９．３．２）をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として使用する。ルシフェラーゼシグナルを≧９５％中和する抗体を強い中和剤として定義し、ルシフェラーゼシグナルの５０％～９４％阻害は、中等度の中和剤であると考えられ、４９％またはそれより低い阻害を有する中和剤を弱い／非中和剤として分類する。
真正ＥＢＯＶの中和
真正ＥＢＯＶの中和を評価するアッセイを、Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇら（Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２０１５； ９０：２６６－２７８）に記載される方法に従って実施する。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を、黒色９６ウェルプレートの内部６０個のウェルに細胞２．５×１０－４個／ウェルで播種した２４時間後にウイルスを感染させる。抗体を、Ｖｅｒｏ増殖培地（アール塩およびＬ－グルタミン、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むイーグル最小基本培地）中で２回連続希釈し、所望の最終濃度（５０μｇ／ｍｌ）を得て、生存ＥＢＯＶの等量と混合し、１５分毎に混合しながら３７℃で１時間インキュベートする。次に抗体／ウイルス混合物をＭＯＩ ０．２でＶｅｒｏ細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳによって洗浄し、増殖培地のみを全てのウェルに添加してプレートを３７℃でさらに４８時間インキュベートする。次に、細胞を１０％中性緩衝ホルマリンによって固定し、感染細胞のパーセンテージを、ＥＢＯＶ特異的ヒトｍＡｂ ＫＺ５２および二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを使用する間接的免疫蛍光アッセイによって決定する。画像を、Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）において倍率２０倍の対物レンズで２０視野／ウェルで獲得する。Ｏｐｅｒｅｔｔａ画像を、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）において利用可能な画像分析機能から構築したカスタム化アルゴリズムによって分析する。各抗体の阻害のパーセンテージを、培地単独と共にインキュベートした対照細胞と比較して決定する。感染細胞のパーセンテージを＞８０％低減させた抗体を、強い中和剤として分類し、感染を５０％～７９％低減させた抗体および５０％未満低減させた抗体はそれぞれ、中等度の中和剤および弱い／非中和剤であると考えられる。
ｒＶＳＶ－ＥＢＯＶ ＧＰの中和
ｅＧＦＰおよびＶＳＶ Ｇの代わりに組換え表面ＧＰの両方を発現する組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（ｒＶＳＶ－ＥＢＯＶ）は、既に記載されている（Ｗｅｃ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｓｃｉｅｎｃｅ； ３５４：３５０－３５４； Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｖｉｒｏｌ．； ８４：１６３－１７５）。中和アッセイの場合、Ｖｅｒｏ細胞を６．０×１０４個細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したイーグル最小基本培地（ＥＭＥＭ）中で、３７℃および５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、ウイルスを、無血清ＥＭＥＭ中、３３０ｎＭ（約５０μｇ／ｍｌ）から開始する抗体の連続３倍希釈物と共に室温で１時間インキュベートした後、９６ウェルプレートにおけるＶｅｒｏ細胞層に感染させる。感染のために使用するウイルスの量は、抗体を有しない対照ウェルにおいて３５～５０％の最終感染（ＭＯＩは約０．１感染単位／細胞）を達成するウイルス保存液の滴定に基づいて決定する。ウイルスを、２％ＦＢＳ、１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した５０体積／体積％のＥＭＥＭ中で細胞と共に３７℃でおよび５％ＣＯ２で１４～１６時間インキュベートした後、細胞を固定し、核をＨｏｅｓｃｈｔによって染色した。ｒＶＳＶの感染性を、Ｃｅｌｌｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５自動顕微鏡および添付のソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、核染色によって示される細胞総数と比較してＥＧＦＰ陽性細胞を計数することによって測定する。抗体を欠如する対照ウェルにおける感染レベルを１００％に設定し、３連で試験した各抗体希釈物に関して感染をその値に対して正規化する。平均値を決定し、完全な９点希釈曲線を使用して、半最大阻害剤濃度ＩＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６を使用して決定する。ＩＣ５０≦５ｎＭを有する抗体は、強い中和剤であると考えられ、５ｎＭ＜ＩＣ５０＜５０ｎＭおよび≦５０ｎＭを有する抗体はそれぞれ、中等度の中和剤および弱い／非中和剤であると考えられる。抗体効力の指標である非中和画分もまた、試験した最高濃度３３０ｎＭで抗体を使用し、無処置対照細胞のシグナルと比較してＧＦＰシグナルを測定することによって決定する。シグナルを≧９８％、５０～９８％、および５０％未満低減する画分はそれぞれ、強い、中等度、および弱い／非中和剤であると考えられる。
ポリペプチドライブラリーをスクリーニングする方法は、Ｂｒｕｕｎ ｅｔ ａｌ． （ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（１０）： ｅ１０９１９６に記載されている。
必要に応じて、本発明の方法は、ポリペプチドライブラリーを生成するステップをさらに含む。
必要に応じて、ポリペプチドライブラリーは、複数の異なる核酸を含む核酸ライブラリーから異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを発現させることによって生成され、各々の異なる核酸は、ポリペプチドライブラリーの異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
必要に応じて、異なる候補最適化病原体ポリペプチドは、哺乳動物細胞中に、またはその表面上に発現される。適切な方法は当業者に周知である。
必要に応じて、核酸ライブラリーの各々の異なる核酸のヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞中におけるコードされたポリペプチドの発現に関して最適化する。
必要に応じて、核酸ライブラリーの各々の異なる核酸は、哺乳動物細胞中における核酸の発現のための発現ベクターの一部である。
必要に応じて、病原体はウイルスであり、候補最適化抗原性病原体ポリペプチドは候補最適化抗原性ウイルスポリペプチドであり、病原体ペプチドはウイルスポリペプチドである。
必要に応じて、核酸ライブラリーは、ウイルスシュードタイプベクターライブラリーであり、ライブラリーの各々の異なる核酸は、コードされるウイルスポリペプチドを含むウイルスシュードタイプを産生するための発現ベクターの一部であり、ポリペプチドライブラリーは、ウイルスシュードタイプベクターライブラリーの発現ベクターからウイルスシュードタイプを産生することによって生成されたウイルスシュードタイプライブラリーであり、ウイルスシュードタイプライブラリーは、複数の異なるウイルスシュードタイプを含み、各々の異なるウイルスシュードタイプは、ウイルスシュードタイプベクターライブラリーの異なる核酸配列によってコードされる異なる候補最適化ウイルスポリペプチドを含む。
必要に応じて、ウイルスシュードタイプベクターライブラリーは、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９個の異なるメンバーを含む。
必要に応じて、発現ベクターはまた、ワクチンベクターでもある。
ワクチンベクターの例としては、ウイルスワクチンベクター、細菌ワクチンベクター、ＲＮＡワクチンベクター、またはＤＮＡワクチンベクターが挙げられる。
ウイルスワクチンベクターは、生きたウイルスを使用して核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をヒトまたは非ヒト動物細胞へと運ぶ。ウイルスに含有される核酸は、感染したヒトまたは非ヒト動物細胞において発現された場合に、免疫応答を誘発する１つまたは複数の抗原をコードする。液性および細胞媒介性免疫応答の両方を、ウイルスワクチンベクターによって誘導することができる。ウイルスワクチンベクターは、核酸ワクチンの正の性質の多くを生弱毒化ワクチンの性質と組み合わせる。核酸ワクチンと同様に、ウイルスワクチンベクターは、抗体を含む広範囲の免疫応答を刺激するように調整することができる抗原性タンパク質を産生するために宿主に核酸を運ぶ。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）、および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）は免疫を媒介した。ウイルスワクチンベクターは、核酸ワクチンとは異なり、能動的に宿主細胞に侵入して複製する潜在性もまた有し、生弱毒化ワクチンと非常に類似のように、アジュバントのように免疫系をさらに活性化する。したがって、ウイルスワクチンベクターは一般的に、無関係な生物からのタンパク質抗原をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を運ぶように遺伝子操作された生弱毒化ウイルスを含む。ウイルスワクチンベクターは一般的に、核酸ワクチンより強い免疫応答を産生することができるが、一部の疾患では、ウイルスベクターは、異種プライム－ブーストと呼ばれる戦略において他のワクチン技術と組み合わせて使用される。このシステムでは、１つのワクチンをプライミングステップとして与え、その後ブースターとして代替ワクチンを使用してワクチン接種する。異種プライム－ブースト戦略は、より強い全体的な免疫応答を提供することを目的とする。ウイルスワクチンベクターは、この戦略の一部としてプライムおよびブーストワクチンの両方として使用され得る。ウイルスワクチンベクターは、Ｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４ （Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１４， ２， ６２４－６４１）およびＣｈｏｉ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ， ２０１３ （Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３；２：９７－１０５）において概説されている。
必要に応じて、ウイルスワクチンベクターは、ウイルス送達ベクター、例えばポックスウイルス（例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＮＹＶＡＣ、ＡＶＩＰＯＸ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＣＭＶ、任意の宿主種のアデノウイルス）、モルビリウイルス（例えば、麻疹）、アルファウイルス（例えば、ＳＦＶ、センダイ）、フラビウイルス（例えば、黄熱病）、またはラブドウイルス（例えば、ＶＳＶ）に基づくウイルス送達ベクター、細菌送達ベクター（例えば、サルモネラ、Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＲＮＡ発現ベクター、またはＤＮＡ発現ベクターに基づく。
必要に応じて、ベクターは、ｐＥＶＡＣに基づく発現ベクターである。ｐＥＶＡＣ発現ベクターは以下の実施例７においてより詳細に記載する。
他の実施形態では、異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドは、細菌、酵母、または昆虫細胞中に、またはその表面上に発現される。
必要に応じて、本発明の方法は、複数の異なる核酸を合成することによって核酸ライブラリーを生成するステップをさらに含み、各々の異なる核酸は、異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする異なるヌクレオチド配列を含む。
必要に応じて、本発明の方法はさらに、ｉ）異なる病原体単離体の病原体ポリペプチドのアミノ酸配列、および／または病原体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得るステップ；ならびにｉｉ）複数の異なるヌクレオチド配列を生成するステップであって、各々の異なるヌクレオチド配列が異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードし、各々の異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドのコードされるアミノ酸配列が、病原体ポリペプチドの得られたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列から最適化され、得られたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列の各々とは異なる、ステップを含む。
必要に応じて、上記のステップ（ｉｉ）における複数の異なるヌクレオチド配列の生成は、上記のステップ（ｉ）において得られたアミノ酸またはヌクレオチド配列のマルチプル配列アライメントを実施するステップ；マルチプル配列アライメントから、異なる病原体単離体のポリペプチド間で高度に保存されているアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列を同定するステップ；および複数の異なるヌクレオチド配列を生成するステップであって、各々の異なるヌクレオチド配列が異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードし、異なるヌクレオチド配列の１つまたは複数が、マルチプル配列アライメントから同定された高度に保存されたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列をコードする配列を含む、ステップを含む。
異なる病原体単離体のポリペプチド間で高度に保存されたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列は、長さ少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸残基であり得る。
必要に応じて、異なる病原体単離体の病原体ポリペプチドのアミノ酸配列の数、または病原体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の数は、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０６、１０９、または１０１２である。典型的には、マルチプル配列アライメントのために使用する配列数は多ければ多いほどよい。
必要に応じて、本発明の方法は、マルチプル配列アライメントから、祖先アミノ酸配列であるアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列を同定するステップ；およびマルチプル配列アライメントから同定された祖先アミノ酸配列をコードする配列を、異なる生成されたヌクレオチド配列の１つまたは複数の中に含めるステップをさらに含む。
祖先アミノ酸配列をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含めることは、現存のアミノ酸配列について高度に保存された祖先アミノ酸配列が病原体の生存および／または繁殖にとって構造的および／または機能的に重要であると予想されることから、有利であり得る。同様に、病原体単離体は極めて多様であり得（特に、例えば新興または再興病原体の単離体、例えば新興または再興ＲＮＡウイルス）、これらの２つの病原体集団の間の進化的距離が大きい可能性があることから、１人の患者の病原体集団に対して作用するように設計されたワクチンは異なる患者では作用しない。しかし、その直近の共通の祖先は、２つの病原体集団の互いに対するより各々に対してより近縁である。このように、共通の祖先に関して設計されたワクチンは、循環する株のより大きい集団にとって有効である見込みがより大きいであろう。
祖先配列再構築（ＡＳＲ）は、Ｒａｎｄａｌｌら（Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ７：１２８４７ ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ １２８４７ （２０１６））において考察されている。著者らは、ＡＳＲの定義を「ツリーの特定のノードで祖先配列を推定するための進化的／系統樹の状況における近代配列の分析プロセス」と呼ぶ。祖先配列再構築（ＡＳＲ）は、分子進化の研究において使用される。タンパク質を研究するための従来の進化的アプローチとは異なり、系統樹の異なる枝の末端からの関連するタンパク質ホモログの水平比較により、ＡＳＲは、ツリーのノード内で統計学的に推定される祖先タンパク質を垂直方向にプロービングする（図１を参照されたい）。系統樹は、その物理的または遺伝的特徴の類似性および差に基づいて様々な生物種または他の実体における進化的関係を示す分岐ダイアグラムである。有根系統樹では、子孫を有する各々のノードは、それらの子孫の推定される直近の共通の祖先を表す。ＡＳＲでは、目的のタンパク質のいくつかの関連するホモログを選択し、マルチプル配列アライメント（ＭＳＡ）において整列させ、枝のノードで統計学的に推定される配列によって系統樹を構築する。これらの配列がいわゆる「祖先」である。対応するＤＮＡを合成する、それを細胞に形質転換する、およびタンパク質を産生するプロセスは、いわゆる「再構築」である。
祖先配列は、典型的には、最尤法によって算出されるが、ベイズ法もまた実装される。祖先は、系統発生から推定されることから、系統発生の形態および組成は、出力としてのＡＳＲ配列において主要な役割を果たす。ＡＳＲは、祖先タンパク質／ＤＮＡの実際の配列を再形成することを要求せず、むしろノードにある配列と類似である可能性がある配列を要求する。最尤（ＭＬ）法は、使用される推定法によって各々の位置の残基がその位置を占有する可能性が最も高いと予想される配列を生成することによって作用する。典型的には、これは、現存の配列から算出されたスコア行列（ＢＬＡＳＴまたはＭＳＡにおいて使用されるものと類似）である。代替法は、配列進化モデルに基づいて配列を構築する最大節約法（ＭＰ）を含み、これは通常、ヌクレオチド配列変化数が最も少ないものが、進化が起こる最も効率的かつ最も可能性が高い経路を表すという考え方である。ＭＰはしばしば、それがおそらく進化を十億年の尺度では適用可能でない程度に過剰に単純化することから、最も信頼度の低い再構築方法であると考えられている。他の方法としてはベイズの方法が挙げられ、これは残基の不確実性の考慮を含む。そのような方法は時に、ＭＬを補完するために使用されるが、典型的にはより多義的な配列（すなわち、明確な置換を予測することができない残基位置を含む配列）を生じる。そのような例では、互いと比較して多義性の大半を包含するいくつかのＡＳＲ配列を生じることが多い。
ＡＳＲの方法およびアルゴリズムは、Ｊｏｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２（７）： ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００４７６３の記載に基づいて以下により詳細に記載する。
必要に応じて、ＡＳＲは、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０６、１０９、または１０１２個の異なる配列について行われる。一部の例では、使用する配列数が多ければ多いほどよい。
必要に応じて、マルチプル配列アライメントのために使用される配列の各々は、病原体単離体の病原体ポリペプチドの全長の配列である。
祖先再構築でのいかなる試みも系統発生と共に始まる。一般的に、系統発生は、集団（分類群と呼ぶ）が共通の祖先からの系統に関連する順序に関するツリーに基づく仮説である。観察された分類群は、ツリーの先端または末端のノードによって表され、これらは枝によって次第にその共通の祖先へと結合され、共通の祖先は通常祖先ノードまたは内接点と呼ばれるツリーの分岐点によって表される。最終的に全ての系列は、分類群のサンプル全体の直近の共通の祖先に収束する。祖先再構築の文脈では、系統発生はしばしば、あたかも既知数であるかのように扱われる（ベイズのアプローチは重要な例外である）。データを説明するためにほぼ等しく有効である膨大な数の系統発生が存在し得ることから、データによって裏付けられる系統発生のサブセットを１つの代表値または点推定値に低減することは都合がよく、時に必要な単純化の仮定であり得る。祖先再構築は、所定の系統発生に仮説の進化モデルを適用した直接の結果として考えることができる。モデルが、１つまたは複数の自由なパラメーターを含有する場合、全体的な目標は、共通の祖先の子孫である観察された分類群（配列）における測定された特徴に基づいてこれらのパラメーターを推定することである。節約法は、このパラダイムの重要な例外である。これは、その希少性を定量する試みを行うことなく、形質状態の変化がまれであるという経験則に基づく。
最大節約法
節約法は、競合する仮説の最も単純なものを選択するという原理を指す。祖先再構築の文脈では、節約法は、ツリーの先端で観察される状態を説明するために必要な形質状態変化の総数を最小限にする所定のツリー内の祖先状態の分布を発見しようと努力する。この最大節約法は、祖先状態を再構築するための最も初期に公式化されたアルゴリズムの１つである。最大節約法は、いくつかのアルゴリズムの１つによって実装することができる。最も初期の例の１つは、Ｆｉｔｃｈの方法（Ｆｉｔｃｈ ＷＭ． Ｔｏｗａｒｄ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ： ｍｉｎｉｍｕｍ ｃｈａｎｇｅ ｆｏｒ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒｅｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９７１；２０（４）：４０６－１６）であり、これは、根付き二分木の２つの走査を介して節約法によって祖先形質状態を割り当てる。最初の段階は、その親より前に子孫（子）ノードを訪問することによりツリーの先端からルートに向かって進む後順走査（ｐｏｓｔ－ｏｒｄｅｒ ｔｒａｖｅｒｓａｌ）である。最初に、その子孫の観察された形質状態に基づいて、ｉ番目の祖先について起こり得る形質状態の集合Ｓｉを決定する。各割当ては、祖先の子孫の形質状態の積集合である。積が空集合の場合、それは和集合である。後者の場合、祖先とその２つの直系の子孫のうちの１つとの間で形質状態の変化が発生したことを意味する。そのような各々の事象は、最大節約法に基づいて代替ツリー間を区別するために使用され得るアルゴリズムのコスト関数を加算する。次に、ルートから先端に向かって進むツリーの前順走査（ｐｒｅｏｒｄｅｒ ｔｒａｖｅｒｓａｌ）を実行する。次に、その親と共有する形質状態に基づいて、各々の子孫に形質状態を割り当てる。ルートは親ノードを有しないことから、特にルートで１つより多くの可能な状態が再構築されている場合、形質状態を任意に選択する必要があり得る。節約法は、直感的に好ましく非常に効率的であるため、一部の例では初期の系統発生でＭＬ最適化アルゴリズムをシードするためになおも使用されている（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ Ａ． ＲＡｘＭＬ－ＶＩ－ＨＰＣ： ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ－ｂａｓｅｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｏｕｓａｎｄｓ ｏｆ ｔａｘａ ａｎｄ ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅｌｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００６；２２：２６８８－９０． ｐｍｉｄ：１６９２８７３３）。しかし、それらはいくつかの問題に悩まされる：
１．進化速度の変動。フィッチの方法は、全ての形質状態間の変化が等しく発生する可能性があると仮定している。このためいかなる変化も、所定のツリーに対して同じコストを発生させる。この仮定はしばしば非現実的であり、そのような方法の精度を制限し得る。例えば、核酸の進化では、遷移は転換よりも頻繁に発生する傾向がある。この仮定は、特定の形質の状態変化に異なるコストを割り当てることによって緩和することができ、加重節約アルゴリズムをもたらす（Ｓａｎｋｏｆｆ Ｄ． Ｍｉｎｉｍａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｒｅｅｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． ＳＩＡＭ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ． １９７５；２８（１）：３５－４２）。
２．急速な進化。そのような方法の根底にある「最小進化」ヒューリスティックの結論は、そのような方法が、変化がまれであると仮定しており、このため変化が例外ではなく標準である場合には不適切であるという点である（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ Ｄ， Ｐｒｉｃｅ Ｔ， Ｍｏｏｅｒｓ ＡＯ， Ｌｕｄｗｉｇ Ｄ． Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｏｒ ｓｔａｔｅｓ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． １９９７；５１（６）：１６９９－７１１； Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｊ． Ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｕｍ－ｓｔｅｐｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｒｅｅｓ ｆｒｏｍ ｄａｔａ ｏｎ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ． １９７３；２２（３）：２４０－９）。
３．系統間の時間の変動。節約法は、ツリーの全ての枝に同じ量の進化時間が経過したことを暗に仮定している。このため、それらは、進化的または時系列の時間の経過を定量化するためにしばしば使用されるツリー内の枝の長さの変動を考慮していない。この制限により、この技術は、例えば非常に長い枝で複数の変更が発生するのではなく、非常に短い枝で１つの変化が発生したと推定する傾向がある。この欠点は、ツリーの各枝に沿って展開する場合に進化の確率論的プロセスを推定するモデルに基づく方法（ＭＬ法とベイズ法の両方）によって対処される（Ｌｉ Ｇ， Ｓｔｅｅｌ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｌ． Ｍｏｒｅ ｔａｘａ ａｒｅ ｎｏｔ ｎｅｃｅｓｓａｒｉｌｙ ｂｅｔｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｓｔａｔｅｓ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ． ２００８；５７（４）：６４７－５３）。
４．統計的正当化。方法の基礎となる統計モデルがなくとも、その推定値は明確な不確実性を有しない。
最尤法（ＭＬ）
ＭＬ法の祖先状態再構築は、ツリーの内接点での形質状態をパラメーターとして扱い、仮説（進化のモデルと観察された配列または分類群に関連する系統学）を考慮して、データ（観察された形質状態）の確率を最大にするパラメーター値を発見しようと試みる。祖先の再構築に対する最も初期のＭＬアプローチのいくつかは、遺伝子配列の進化の状況で開発された（Ｙａｎｇ Ｚ， Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｎｅｉ Ｍ． Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． １９９５；１４１（４）：１６４１－５０； Ｋｏｓｈｉ ＪＭ， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＲＡ． Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． １９９６；４２（２）：３１３－２０）。類似のモデルは、離散形質進化の類似の場合についても開発された（Ｐａｇｅｌ Ｍ． Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｎ ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ． １９９９；４８（３）：６１２－２２）。
これらのアプローチは、系統樹を推定するために使用されるものと同じ確率論的フレームワークを用いる（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｊ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｒｅｅｓ ｆｒｏｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： ａ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． １９８１；１７（６）：３６８－７６）。簡単に言えば、遺伝子配列の進化は、時間可逆連続時間マルコフプロセスによってモデル化される。これらのうち最も単純なものでは、全ての形質は経時的に一定の速度で独立した状態遷移（例えば、ヌクレオチド置換）を受ける。この基本モデルは、ツリーの各枝で異なる速度を可能にするようにしばしば拡張される。実際に、変異率もまた経時的に変化し得る（例えば、環境の変化により）；これは、パラメーターの数を増加させるのではなく、速度パラメーターをツリーに沿って進化させることによってモデル化することができる。モデルは、長さｔの枝に沿って状態ｉからｊへの遷移確率を定義する（進化時間の単位で）。系統発生の尤度は、提唱されるツリーの階層構造に対応する遷移確率のネスト化された合計から計算される。各ノードで、その子孫の尤度を、そのノードで可能な全ての祖先の形質状態にわたって合計する：
Figure 2022513326000004
 （式中、直近の子孫ｙおよびｚを有するノードｘをルートとするサブツリーの尤度を計算し、Ｓｉは、ｉ番目のノードの形質状態を示し、ｔｉｊは、ノードｉとｊとの間の枝の長さ（進化時間）であり、Ωは、全ての起こり得る形質状態の集合である（例えば、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ））。このように、祖先再構築の目的は、所定のツリーに関する観察データの尤度を最大化する全てのｘ個の内接点に関してＳｘへの割当てを発見することである。
祖先再構成の問題は、代替ツリーの全体的な尤度を計算することではなく、最高の周辺ＭＬによって各々の祖先ノードで形質状態の組合せを発見することである。一般的に、この問題には２つのアプローチがある。まず、ツリーの子孫から上方に作業して、その直系子孫のみを考慮に入れて最も可能性が高い形質状態を各々の祖先に進行的に割り当てることができる。このアプローチは、周辺再構築（ｍａｒｇｉｎａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）と呼ばれる。これは、最適化問題の各々の段階で局所的に最適な選択を行うグリーディアルゴリズムに似ている。これは非常に効率的であり得るが、問題に対する大域的最適解に達することが保証されていない。次にその代わりに、データの尤度を合同に最大化するツリー全体の祖先形質状態の合同組合せを発見しようとしてもよい。このように、このアプローチは合同再構築（ｊｏｉｎｔ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）と呼ばれる。これは、周辺再構築ほど迅速ではないことから、近代の最適化法およびヒューリスティックが回避するように設計される非凸目標関数における局所的最適解で捉えられる可能性はより低い。祖先再構築の文脈では、これは周辺再構築が、局所最適解であるが、大域的最適解から離れた祖先形質状態の合同分布から外れる直系子孫に形質状態を割当てし得ることを意味する。合同再構築は、周辺再構築より計算が複雑である。それにもかかわらず、合同再構築のための効率的なアルゴリズムが、観察された分類群または配列の数とともに概して線形である時間計算量で開発されている。
ＭＬに基づく祖先再構築の方法は、形質間（またはゲノム内のサイト間）の進化速度の変動が存在する場合にはＭＰ法よりも高い精度を提供する傾向がある。しかし、これらの方法では、ヘテロタキとしても知られる、経時的な進化速度の変動に適合することはまだできない。特定の形質の進化速度が系統発生の枝で加速する場合、その枝で発生した進化の量は、枝の所定の長さに関して過小評価され、その形質の進化速度が一定であると仮定する。それに加えて、ヘテロタキを進化速度の形質間の変動と区別することは難しい。
ＭＬ（最大節約とは異なり）は、研究者が進化のモデルを指定する必要があるため、その精度は著しく不正確なモデルの使用（モデルの誤設定）によって影響を受ける場合がある。さらに、ＭＬは形質状態の単一の再構成（しばしば「点推定」と呼ばれる）を提供できるに過ぎず、尤度表面が非常に非凸で、複数のピーク（局所的最適解）を含む場合、単一点推定は適切な表現を提供することができず、ベイズアプローチがより適切な場合がある。
ベイズ推定
ベイズ推定は、観察データの尤度を使用して、研究者の考え方を更新するか、または事前分布を使用して事後分布を生じる。祖先の再構築の文脈では、目的は、所定のツリーの各々の内接点での祖先の形質状態の事後確率を推定することである。さらに、進化モデルのパラメーターと全ての可能なツリーの空間の事後分布について、これらの確率を統合することができる。これは、ベイズの定理の適用：
Figure 2022513326000005
 （式中、Ｓは祖先の状態を表し、Ｄは観察されたデータに対応し、θは進化モデルと系統樹の両方を表す。Ｐ（Ｄ／Ｓ、θ）は、上記のフェルゼンシュタインの剪定アルゴリズムによって計算することができる観察データの尤度である。Ｐ（Ｓ／θ）は、所定のモデルおよびツリーに関する祖先状態の事前確率である。最後に、Ｐ（Ｄ／θ）は、全ての可能な祖先状態にわたって統合された所定のモデルおよびツリーのデータの確率である）として表すことができる。２つの公式は、以下に考察するようにベイズの定理の２つの異なる適用を強調するために与えられる。
祖先配列再構築へのベイズアプローチの最初の実装の１つは、Ｙａｎｇと同僚によって開発され、進化モデルおよびツリーのＭＬ推定をそれぞれ使用して事前分布を定義した。このように、彼らのアプローチは、祖先の形質状態の事後確率を計算するための経験的ベイズ法の例であり、この方法は、ソフトウェアパッケージＰＡＭＬ（Ｙａｎｇ Ｚ． ＰＡＭＬ ４： ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００７；２４（８）：１５８６－９１）に最初に実装された。上記のベイズ規則の公式化に関して、経験的ベイズ法は、データから得たモデルおよびツリーの経験的推定に固定し、事後尤度、および式の前項から効果的に削除する。その上、Ｙａｎｇおよび同僚（Ｙａｎｇ Ｚ， Ｋｕｍａｒ Ｓ， Ｎｅｉ Ｍ． Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． １９９５；１４１（４）：１６４１－５０）は、θが与えられたとき、Ｓの全ての可能性がある値に対してＰ（Ｄ）を網羅的に計算する代わりに、分母において、観察されたヌクレオチド配列のそのアライメントにおける部位パターンの経験的分布（すなわち、ツリーの先端へのヌクレオチドの割当て）を使用した。計算上、経験的ベイズ法は、各々の内接点でのそれぞれの確率分布に基づいて状態のＭＬ割当てに関して検索するのではなく、確率分布そのものが直接報告されることを除き、祖先状態のＭＬ再構成に似ている。
祖先再構築のための経験的ベイズ法では、研究者は進化モデルのパラメーターおよびツリーがエラーなしで既知であると仮定する必要がある。データのサイズまたは複雑さによりこれが非現実的な仮定となる場合、完全に階層的なベイズアプローチを採用し、祖先の形質状態、モデル、およびツリーに対する合同事後分布を推定するほうがより賢明であり得る（Ｈｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋ ＪＰ， Ｂｏｌｌｂａｃｋ ＪＰ． Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ａｎｄ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｓｔａｔｅｓ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２００１；５０（３）：３５１－６６）。ＨｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋおよびＢｏｌｌｂａｃｋは、最初に、マルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）法を使用して、この合同事後分布から祖先配列をサンプリングすることにより、祖先再構築に対する階層ベイズ法を提唱した。類似のアプローチも使用して、真菌種の藻類との共生（苔癬化）の進化が再構築された（Ｌｕｔｚｏｎｉ Ｆ， Ｐａｇｅｌ Ｍ， Ｒｅｅｂ Ｖ． Ｍａｊｏｒ ｆｕｎｇａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ａｒｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｃｈｅｎ ｓｙｍｂｉｏｔｉｃ ａｎｃｅｓｔｏｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００１；４１１（６８４０）：９３７－４０）。例えば、ＭＣＭＣのメトロポリス・ヘイスティングスアルゴリズムは、事後確率の比率に基づいてパラメーターの割当てを受容または拒否することによって、合同事後分布を探索する。
このように、経験的ベイズアプローチは、特定のツリーおよび進化モデルに関する様々な祖先状態の確率を算出する。祖先状態の再構築を確率の集合として表現することにより、任意の特定の状態を祖先に割り当てる際の不確実性を直接定量化することができる。一方、階層ベイズアプローチは、観察されたデータが与えられた場合に、これらのツリーおよびモデルがどれほど類似するかに比例して、全ての可能なツリーおよび進化モデルに対してこれらの確率を平均する。
完全なベイズアプローチは、全ての可能なツリーの空間が急速に広大になり、連鎖サンプルが妥当な時間量で収束することが計算上不可能となるため、比較的少数の配列または分類群の分析に限定される。
病原体、特に新興または再興病原体、例えば新興または再興ＲＮＡウイルスは、極めて急激な速度で、哺乳動物または鳥類より急速な次数で進化する。これらの生物の場合、祖先再構築は、かなり短期間の尺度で適用され、例えば数百万年ではなくて数十年に及ぶ流行の地球全体のまたは局所的な前駆体を再構築することができる。そのような再構築された株を、今日の患者から単離された配列と比較してワクチン設計努力の標的として使用することが提唱されている（Ｇａｓｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００２；２９６（５５７７）：２３５４－６０）。
本発明の方法の実施形態によれば、ＡＲＳの任意の適切な方法を使用して、マルチプル配列アライメントから祖先アミノ酸配列であるアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列が同定され得る。
必要に応じて、マルチプル配列アライメントからの祖先アミノ酸配列の同定は、最大節約法の先祖配列再構築（ＭＰ－ＡＳＲ）を実行することを含む。
必要に応じて、マルチプル配列アライメントからの祖先アミノ酸配列の同定は、最大尤度祖先配列再構築（ＭＬ－ＡＳＲ）を実行することを含む。
必要に応じて、マルチプル配列アライメントからの祖先アミノ酸配列の同定は、ベイズ推定祖先配列再構築（ＢＩ－ＡＳＲ）を実行することを含む。
祖先配列再構築を実施する、利用可能な多くのソフトウェアパッケージが存在する。以下の表（Ｊｏｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， ＰＬＯＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２（７）： ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００４７６３から得たもの）は、異なる強度および特色で祖先再構築の方法を実装する広範な多様なパッケージの代表的なサンプルを提供する。
Figure 2022513326000006
これらのソフトウェアパッケージの大部分は、遺伝子配列データを解析するために設計される。例えば、ＰＡＭＬ（Ｙａｎｇ Ｚ． ＰＡＭＬ ４： ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００７；２４（８）：１５８６－９１）は、ＭＬによるＤＮＡおよびタンパク質配列アライメントの系統発生分析のプログラムコレクションである。祖先再構築は、ｃｏｄｅｍｌプログラムを使用して実行することができる。ＨｙＰｈｙ、Ｍｅｓｑｕｉｔｅ、およびＭＥＧＡもまた、配列データの系統発生分析のためのソフトウェアパッケージであるが、よりモジュール性でカスタマイズ可能となるように設計されている。ＨｙＰｈｙ（Ｐｏｎｄ ＳＬＫ， Ｍｕｓｅ ＳＶ． ＨｙＰｈｙ： ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ｔｅｓｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ． Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ； ２００５． ｐ． １２５－８１）は、そのバッチ言語でカスタマイズモデルを明記することによって地理的位置などの離散祖先形質状態のより全般化した範囲を再構築するために容易に適合させることができる祖先配列再構築のための同時ＭＬ法を実装する（Ｐｕｐｋｏ Ｔ， Ｐｅ Ｉ， Ｓｈａｍｉｒ Ｒ， Ｇｒａｕｒ Ｄ． Ａ ｆａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｊｏｉｎｔ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２０００；１７（６）：８９０－６）。Ｍｅｓｑｕｉｔｅ（Ｍａｄｄｉｓｏｎ Ｗ， Ｍａｄｄｉｓｏｎ Ｄ． Ｍｅｓｑｕｉｔｅ： ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ． ２．７５ ｅｄ２００１１）は、最大節約法およびＭＬ法の両方を使用して離散および連続形質の両方に関する祖先状態再構築法を提供する。同様に、祖先再構築の結果を解釈するためのいくつかの可視化ツールもまた提供する。ＭＥＧＡ（Ｔａｍｕｒａ Ｋ， Ｄｕｄｌｅｙ Ｊ， Ｎｅｉ Ｍ， Ｋｕｍａｒ Ｓ． ＭＥＧＡ４： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＥＧＡ） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００７；２４（８）：１５９６－９）もまた、モジュール性のシステムであるが、分析のカスタム化より使いやすさにより重点を置いている。バージョン５現在では、ＭＥＧＡによって、ユーザーは、最大節約法、ＭＬ、および経験的ベイズ法を使用して祖先状態を再構築することができる。
遺伝子配列のベイズ分析は、モデルの誤設定に対してより大きい堅牢性を付与し得る。ＭｒＢａｙｅｓ（Ｈｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋ ＪＰ， Ｒｏｎｑｕｉｓｔ Ｆ． ＭＲＢＡＹＥＳ： Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００１；１７（８）：７５４－５）は、完全な階層的ベイズアプローチを使用して祖先ノードでの祖先状態の推定を可能にする。ＰＨＡＳＴパッケージにおいて配布されるＰＲＥＱＵＥＬプログラムは、祖先配列再構築を使用して比較可能な進化ゲノミクスを実行する（Ｈｕｂｉｓｚ ＭＪ， Ｐｏｌｌａｒｄ ＫＳ， Ｓｉｅｐｅｌ Ａ． ＰＨＡＳＴ ａｎｄ ＲＰＨＡＳＴ： ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｓｐａｃｅ／ｔｉｍｅ ｍｏｄｅｌｓ． Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１１；１２（１）：４１－５１）。ＳＩＭＭＡＰは、系統発生上の変異を確率論的にマッピングする（Ｂｏｌｌｂａｃｋ ＪＰ． ＳＩＭＭＡＰ： ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｔｒａｉｔｓ ｏｎ ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ． ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００６；７（１）：８８）。ＢａｙｅｓＴｒａｉｔｓ（Ｐａｇｅｌ Ｍ． Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｎ ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ． １９９９；４８（３）：６１２－２２）は、ベイズフレームワークにおいて離散または連続形質を分析し、進化モデルを評価し、祖先状態を再構築し、形質対の間での進化の相関を検出する。
他のソフトウェアパッケージは、質的および量的形質（表現型）の分析をより対象とする。例えば、統計学的計算環境Ｒにおけるａｐｅパッケージ（Ｐａｒａｄｉｓ Ｅ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ； ２００６）は、ＭＬを含むａｃｅ関数を通して離散および連続形質の両方に関する祖先状態再構築方法を提供する。ａｃｅは、ルート以外のノードでの再構築の精度に負の影響を及ぼし得る他のＭＬに基づく祖先再構築方法によって使用される周辺または同時尤度の代わりに目盛り付き条件付き尤度を計算することによって再構築を実施することに注意されたい。Ｐｈｙｒｅｘは、祖先遺伝子配列を再構築するためのＭＬ法に加えて、祖先遺伝子発現プロファイルを再構築するための最大節約法に基づくアルゴリズムを実装する（ＰＡＭＬのｂａｓｅｍｌ関数をラップアラウンドすることによって）（Ｒｏｓｓｎｅｓ Ｒ， Ｅｉｄｈａｍｍｅｒ Ｉ， Ｌｉｂｅｒｌｅｓ ＤＡ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｓｔａｔｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄａｔａ． ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２００５；６（１）：１２７）。
いくつかのソフトウェアパッケージもまた系統地理学を再構築する。ＢＥＡＳＴ（サンプリングツリーによるベイズ進化学分析（（Ｂｏｕｃｋａｅｒｔ Ｒ， Ｈｅｌｅｄ Ｊ， Ｋｕｅｈｎｅｒｔ Ｄ， Ｖａｕｇｈａｎ Ｔ， Ｗｕ Ｃ－ Ｈ， Ｘｉｅ Ｄ， ｅｔ ａｌ． ＢＥＡＳＴ ２： ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｂａｙｅｓｉａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ． ２０１４；１０（４）：ｅ１００３５３７））は、ベイズＭＣＭＣサンプリング法を使用して、位置データで注釈を付けた観察配列から祖先の地理的位置を再構築するためのツールを提供する。Ｄｉｖｅｒｓｉｔｒｅｅ（ＦｉｔｚＪｏｈｎ ＲＧ． Ｄｉｖｅｒｓｉｔｒｅｅ： ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２０１２；３（６）：１０８４－９２）は、Ｍｋ２（バイナリ形質進化の連続時間マルコフモデル）（Ｐａｇｅｌ Ｍ． Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ－ａ Ｇｅｎｅｒａｌ－ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ－Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｃｒｅｔｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． １９９４；２５５（１３４２）：３７－４５））およびＢｉＳＳＥモデルの下での祖先状態の再構築の方法を提供するＲパッケージである。Ｌａｇｒａｎｇｅは、系統樹の地理的範囲の進化の再構築に関する分析を実行する（Ｒｅｅ ＲＨ， Ｓｍｉｔｈ ＳＡ． Ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｒａｎｇｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｓｐｅｒｓａｌ， ｌｏｃａｌ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｌａｄｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２００８；５７（１）：４－１４）。Ｐｈｙｌｏｍａｐｐｅｒ（Ｌｅｍｍｏｎ ＡＲ， Ｌｅｍｍｏｎ ＥＭ． Ａ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｎ ａ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｌａｎｄｓｃａｐｅ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２００８；５７（４）：５４４－６１）は、遺伝子流動および祖先の地理的位置の過去のパターンを推定するための統計的フレームワークである。ＲＡＳＰ（Ｙｕ Ｙ， Ｈａｒｒｉｓ ＡＪ， Ｂｌａｉｒ Ｃ， Ｈｅ Ｘ． ＲＡＳＰ （Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔ Ａｎｃｅｓｔｒａｌ Ｓｔａｔｅ ｉｎ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ）： ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２０１５；８７：４６－９）は、統計的ＤＩＶＡ、Ｌａｇｒａｎｇｅ、ベイズ・Ｌａｇｒａｎｇｅ、ＢａｙＡｒｅａ、およびＢＢＭ法を使用して祖先状態を推定する。ＶＩＰ（Ａｒｉａｓ ＪＳ， Ｓｚｕｍｉｋ ＣＡ， Ｇｏｌｏｂｏｆｆ ＰＡ． Ｓｐａｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｉｃａｒｉａｎｃｅ： ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｕｓｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ． Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ． ２０１１；２７（６）：６１７－２８）は、分離した地理的分布を調べることにより、過去の生物地理学を推定する。
ゲノム再配列は、種間の比較ゲノミクスにおいて貴重な情報を提供する。ＡＮＧＥＳ（Ｊｏｎｅｓ ＢＲ， Ｒａｊａｒａｍａｎ Ａ， Ｔａｎｎｉｅｒ Ｅ， Ｃｈａｕｖｅ Ｃ． ＡＮＧＥＳ： ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ＡＮｃｅｓｔｒａｌ ＧＥｎｏｍｅＳ ｍａｐｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１２；２８（１８）：２３８８－９０）は、遺伝子マーカーの祖先の再構築を通じて、現存する関連ゲノムを比較する。ＢＡＤＧＥＲ（Ｌａｒｇｅｔ Ｂ， Ｋａｄａｎｅ ＪＢ， Ｓｉｍｏｎ ＤＬ． Ａ Ｂａｙｅｓｉａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． ２００５；３６（２）：２１４－２３）は、ベイズアプローチを使用して、遺伝子再配列の履歴を調べる。Ｃｏｕｎｔ（Ｃｓｕｏｓ Ｍ． Ｃｏｕｎｔ： ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｗｉｔｈ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ａｎｄ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１０；２６（１５）：１９１０－２）は、遺伝子ファミリーのサイズの進化を再構築する。ＥＲＥＭ（Ａｆｆｒｅ Ｌ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ， Ｄｅｂｕｓｓｃｈｅ Ｍ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ ａｎｄ ｉｓｌａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｅｎｄｅｍｉｃ Ｃｙｃｌａｍｅｎ ｂａｌｅａｒｉｃｕｍ （Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ． １９９７；８４（４）：４３７－５１）は、バイナリ形質によってコードされた遺伝的特徴の獲得および喪失を分析する。ＰＡＲＡＮＡ（Ｐａｔｒｏ Ｒ， Ｓｅｆｅｒ Ｅ， Ｍａｌｉｎ Ｊ， Ｍａｒｃａｉｓ Ｇ， Ｎａｖｌａｋｈａ Ｓ， Ｋｉｎｇｓｆｏｒｄ Ｃ． Ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１２；７（１）：１）は、遺伝子の喪失および重複を表す祖先の生物学的ネットワークの節約に基づく推定を実行する。
研究者らが、いかなるソフトウェアもインストールする必要なく、異なる形質タイプの祖先再構築のためにＭＬ方法を使用することができるいくつかのウェブサーバーに基づくアプリケーションも存在する。例えば、Ａｎｃｅｓｔｏｒｓ（Ｄｉａｌｌｏ ＡＢ， Ｍａｋａｒｅｎｋｏｖ Ｖ， Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｍ． Ａｎｃｅｓｔｏｒｓ １．０： ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１０；２６（１）：１３０－１）は、シンテニー領域の同定および配置によって祖先ゲノムを再構築するためのウェブサーバーである。ＦａｓｔＭＬ（Ａｓｈｋｅｎａｚｙ Ｈ， Ｐｅｎｎ Ｏ， Ｄｏｒｏｎ－Ｆａｉｇｅｎｂｏｉｍ Ａ， Ｃｏｈｅｎ Ｏ， Ｃａｎｎａｒｏｚｚｉ Ｇ， Ｚｏｍｅｒ Ｏ， ｅｔ ａｌ． ＦａｓｔＭＬ： ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１２；４０（Ｗ１）：Ｗ５８０－Ｗ４）は、インデル変動を再構築するためにギャップ形質モデルを使用するＭＬによる祖先配列の確率論的再構築のためのウェブサーバーである。ＭＬＧＯ（Ｈｕ Ｆ， Ｌｉｎ Ｙ， Ｔａｎｇ Ｊ． ＭＬＧＯ： ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅ－ｏｒｄｅｒ ｄａｔａ． ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ２０１４；１５（１）：１）は、ＭＬ遺伝子順序解析のためのウェブサーバーである。
ポリペプチドライブラリーの候補最適化抗原性病原体ポリペプチドは、ＡＲＳを通して同定されているアミノ酸配列の１つまたは複数の領域を含み得る。候補最適化抗原性病原体ポリペプチドの必要に応じて、祖先アミノ酸配列またはその各々の領域は、長さ少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸残基である。候補最適化抗原性病原体ポリペプチドの必要に応じて、祖先アミノ酸配列またはその各々の領域は、長さが最大５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００、６００、７００、または８００アミノ酸残基である。
必要に応じて、ポリペプチドライブラリーの候補最適化抗原性病原体ポリペプチドは、そこから候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが最適化される異なる単離体のうちの１つまたは複数の病原体ポリペプチドのアミノ酸配列と、その全長に沿って、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。
必要に応じて、本発明の方法は、発現系におけるコードされる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドの最適な発現のために異なる生成されたヌクレオチド配列のコドンを最適化するステップを含む。コドン最適化は、遺伝子コードの縮重を利用するが、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない。縮重のために、１つのタンパク質が多くの代替核酸配列によってコードされ得る。コドン選択性（コドン使用バイアス）は、各々の生物において異なり、これは、異種発現系において組換えタンパク質を発現させる際の難題となり、低い信頼できない発現をもたらし得る。
任意の適切な発現系を使用してもよい。哺乳動物、酵母、昆虫、または細菌細胞中における発現を含むいくつかの適切な例が当業者に周知である。必要に応じて、発現系は哺乳動物細胞を含む。必要に応じて、発現系は、酵母、昆虫、または細菌細胞を含む。
コドン最適化方法は当業者に周知である。コドン最適化アルゴリズムを使用して、アミノ酸をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を設計することができる。そのようなアルゴリズムは、所望の発現系におけるポリペプチドまたはタンパク質の発現を最大化するコドン最適化配列を提供することを目的とする。適切なコドン最適化アルゴリズムの例としては、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）アルゴリズム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）アルゴリズム（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、およびＧｅｎｅＧＰＳ（登録商標）（ＡＴＵＭ）が挙げられる。
必要に応じて、本発明の方法は、所望の発現系におけるタンパク質発現を最大化するための他の配列最適化も含む。そのような遺伝子最適化は、コドン使用バイアス、ならびに遺伝子発現に関係する他の配列関連パラメーター、例えば転写、スプライシング、翻訳、およびｍＲＮＡ分解を考慮に入れる。そのような配列関連パラメーターの例を以下に示す（パラメーターは、以下に転写効率、翻訳効率、またはタンパク質リフォールディングに影響を及ぼすとして分類されるが、パラメーターのいくつかはこれらのステップの１つより多くに影響を及ぼし得る）：
Figure 2022513326000007
遺伝子最適化アルゴリズム、例えば、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）およびＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）は、これらのパラメーターのいくつかを考慮に入れる。
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒトタンパク質の発現の遺伝子最適化は、Ｍａｅｒｔｅｎｓら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０ Ｖｏｌ． １９：１３１２－１３２６）によって考察されている。
必要に応じて、本発明の方法は、コードされる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドの抗原性に関して異なるヌクレオチド配列を最適化するステップを含む。
抗原性最適化は、以下のいずれかを含み得る：
（ａ）抗病原体ポリペプチド抗体の産生および／または機能を阻害すると考えられるアミノ酸配列をコードする核酸配列の欠失または改変（例えば、ムチン様ドメインの欠失または改変－例えば、Ｒｅｙｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２００９， ９５９６－９６０１を参照されたい）；
（ｂ）１つまたは複数の失われる可能性があるコードされるエピトープを回復するための領域スワッピング；
（ｃ）例えばＮ結合グリコシル化部位の部位特異的変異。典型的に、部位特異的変異は、Ｎ結合グリコシル化部位を欠失させるように設計されるが、例えば非中和抗体を誘発するエピトープをマスクするために追加の部位が導入されることが望ましい状況が存在し得る。グリコシル化が、ＨＡに対する抗体の結合を立体的に遮断する能力およびこのように宿主免疫応答に対する保護を提供する能力は、インフルエンザウイルスに関して実証されている。Ｓｕｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２０１３， ８７（１５）：８７５６－８７６６）は、多数のグリコシル化部位を有するウイルスによって誘導された抗体が、より少ないグリコシル化部位を有するウイルスによって誘導された抗体より広い中和活性を有することを実証している；
（ｄ）安定性を増強するための変化（例えば、ジスルフィド結合形成、コードされるポリペプチドのセリンプロテアーゼによる分解の低減）；
（ｅ）グリカンの除去（Ｂ細胞のアクセスの改善）；
（ｆ）例えば所望のエピトープをコードする核酸配列を挿入するための核酸配列の挿入。
ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０の外部ドメインの抗原性最適化は、Ｊｏｙｃｅら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２０１３ Ｆｅｂ；８７（４）：２２９４－３０６）によって記載されている。
必要に応じて、異なる病原体単離体は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ亜型の病原体の大流行からの異なる病原体単離体を含む。
必要に応じて、異なる病原体単離体は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と異なる亜型であるが同じ型の病原体の大流行からの異なる病原体単離体を含む。
必要に応じて、異なる病原体単離体は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と異なる型であるが同じ科の病原体の大流行からの異なる病原体単離体を含む。
必要に応じて、異なる病原体単離体は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ亜型、型、または科の病原体の異なる過去の病原体単離体を含む。
必要に応じて、異なる病原体単離体は、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ種、属、または科の病原体の異なる過去の病原体単離体を含む。
必要に応じて、病原体に対する広域中和免疫応答を誘導することが可能なリード候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを同定するための本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である。
本発明によれば、病原体に対する広域中和免疫応答を誘導することが可能な最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする核酸配列を同定するための方法であって、
ｉ）ヒトまたは非ヒト動物を、本発明による方法によって同定されたリード候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸によって免疫するステップ；
ｉｉ）広域中和免疫応答が、ステップ（ｉ）における免疫後にヒトまたは非ヒト動物において誘導されるか否かを決定するステップ；および
ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から広域中和免疫応答がヒトまたは非ヒト動物において誘導されることが決定される場合、核酸配列を、病原体に対する広域中和免疫応答を誘導することが可能な最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする核酸配列として同定するステップ
を含む方法もまた提供される。
必要に応じて、ヒトまたは非ヒト動物から得られた血清中の抗体が、広域中和免疫応答が望ましい病原体と同じ科内の１つより多くの病原体亜型に結合するか否かを決定することによって、広域中和免疫応答が、ヒトまたは非ヒト動物において誘導されるか否かが決定される。
必要に応じて、ヒトまたは非ヒト動物から得られた血清中の抗体が、広域中和免疫応答が望ましい病原体と同じ科内の１つより多くの病原体型に結合するか否かを決定することによって、広域中和免疫応答が、ヒトまたは非ヒト動物において誘導されるか否かが決定される。
任意の適切な非ヒト動物を使用してもよい。必要に応じて、非ヒト動物は哺乳動物である。必要に応じて、哺乳動物はモルモットまたはマウスである。必要に応じて、非ヒト動物は鳥である。
本発明によれば、
ｉ）配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１と同一である；
ｉｉ）配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるか、または配列番号２と同一である；
ｉｉｉ）配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号４と同一である；
ｉｖ）配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号５と同一である；
ｖ） 配列番号７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号７と同一である；または
ｖｉ）配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号８と同一である核酸配列
またはその相補体を含む単離された核酸分子もまた提供される。
本発明によれば、
ｉ）配列番号１０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１０と同一である；
ｉｉ）配列番号１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１２と同一である；または
ｉｉｉ）配列番号１４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１４と同一である核酸配列
またはその相補体を含む単離された核酸分子もまた提供される。
本発明によれば、
ｉ）配列番号１９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１９と同一である；
ｉｉ）配列番号２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２１と同一である；
ｉｉｉ）配列番号２３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２３と同一である；
ｉｖ）配列番号２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２５と同一である；
ｖ）配列番号２７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２７と同一である；
ｖｉ）配列番号２９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２９と同一である；または
ｖｉｉ）配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号３１と同一である核酸配列
またはその相補体を含む単離された核酸分子もまた提供される。
本発明によれば、
ｉ）配列番号１によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
ｉｉ）配列番号２によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
ｉｉｉ）配列番号４によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号４によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
ｉｖ）配列番号５によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号５によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
ｖ）配列番号７によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号７によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
ｖｉ）配列番号８によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号８によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
ｖｉｉ）配列番号１０によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１０によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
ｖｉｉｉ）配列番号１２によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１２によってコードされるアミノ酸配列と同一である；または
ｉｘ）配列番号１４によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１４によってコードされるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドがさらに提供される。
本発明によれば、
ｉ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号３と同一である；
ｉｉ）配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号６と同一である；
ｉｉｉ）配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号９と同一である；
ｉｖ）配列番号１１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１１と同一である；
ｖ）配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１３と同一である；または
ｖｉ）配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１５と同一である
アミノ酸配列を含む単離ポリペプチドもまた提供される。
本発明によれば、
ｉ）配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１８と同一である；
ｉｉ）配列番号２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２０と同一である；
ｉｉｉ）配列番号２２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２２と同一である；
ｉｖ）配列番号２４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２４と同一である；
ｖ）配列番号２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２６と同一である；
ｖｉ）配列番号２８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２８と同一である；または
ｖｉｉ）配列番号３０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号３０と同一である
アミノ酸配列を含む単離ポリペプチドもまた提供される。
アミノ酸または核酸配列間の類似性は、配列間の類似性に関して表記されるか、またはそうでなければ配列同一性と呼ばれる。配列同一性はしばしば、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）に関して測定され、パーセンテージがより高ければ、２つの配列はより類似である。所定の遺伝子またはタンパク質のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用して整列させた場合に、比較的高い程度の配列同一性を保有する。比較のための配列のアライメント方法は当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０； Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ ７３：２３７－２４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３， １９８９； Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ’ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１－１０８９０， １９８８； およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４， １９８８． Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ６：１１９－１２９， １９９４において記載されている。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴＴＭ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０， １９９０）は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネット上のいくつかのソースから入手可能であり、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用される。
核酸配列間またはアミノ酸配列間の配列同一性は、配列のアライメントを比較することによって決定することができる。比較される配列における等価の位置が同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占有されている場合、分子はその位置で同一である。同一性のパーセンテージとしてのアライメントのスコアリングは、比較される配列によって共有される位置での同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。配列を比較する場合、最適なアライメントは、配列における起こり得る挿入および欠失を考慮に入れるために、配列の１つまたは複数にギャップを導入する必要があり得る。配列比較法は、ギャップペナルティを用いてもよく、それによって比較される配列における同数の同一の分子に関して、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメントは２つの比較される配列間のより高い関連性を反映することから、多くのギャップを有するアライメントより高いスコアを達成する。最大パーセント同一性の算出は、ギャップペナルティを考慮に入れて、最適なアライメントを産生することを伴う。
配列比較を実施するための適切なコンピュータープログラムは、商業部門および公共部門において広く入手可能である。例としては、ＭａｔＧａｔ（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ４： ２９； ｐｒｏｇｒａｍ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｈｔｔｐ：／／ｂｉｔｉｎｃｋａ．ｃｏｍ／ｌｅｄｉｏｎ／ｍａｔｇａｔ）、Ｇａｐ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓｔａから入手可能なプログラム）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２．０およびＸ２．０（Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３： ２９４７－２９４８； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２から入手可能なプログラム）、およびＥＭＢＯＳＳペアワイズアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， ｓｕｐｒａ； Ｋｒｕｓｋａｌ， １９８３， Ｉｎ： Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ， ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ， Ｓａｎｋｏｆｆ ＆ Ｋｒｕｓｋａｌ （ｅｄｓ）， ｐｐ １－４４， Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎから入手可能なプログラム）が挙げられる。プログラムは全て、デフォルトパラメーターを使用して実行され得る。
例えば、ＥＭＢＯＳＳペアワイズアライメントアルゴリズムの「ｎｅｅｄｌｅ」法を使用して配列比較を行ってもよく、これはその全長にわたって考察した場合に２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を決定して、パーセンテージ同一性スコアを提供する。アミノ酸配列比較のためのデフォルトパラメーター（「タンパク質分子」オプション）は、ギャップ伸長ペナルティ：０．５、ギャップオープンペナルティ：１０．０、行列：Ｂｌｏｓｕｍ６２である。
配列比較を、参照配列の全長にわたって実行してもよい。
本発明によれば、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた提供される。
本発明によれば、配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた提供される。
本発明によれば、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む組成物もまた提供される。
本発明によれば、配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む組成物もまた提供される。
本発明によれば、（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む、組合せ調製物もまた提供される。
本発明によれば、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む、組合せ調製物もまた提供される。
本発明によれば、配列番号６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組成物もまた提供される。
本発明によれば、配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組成物もまた提供される。
本発明によれば、配列番号６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む融合タンパク質もまた提供される。
本発明によれば、配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドおよび配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む融合タンパク質もまた提供される。
本発明によれば、（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組合せ調製物もまた提供される。
本発明によれば、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組合せ調製物もまた提供される。
用語「組合せ調製物」は、本明細書で使用される場合、上記で定義の組合せ構成成分（ｉ）および（ｉｉ）を独立してまたは組合せ構成成分（ｉ）および（ｉｉ）の区別される量の異なる固定の組合せを使用することによって投与することができるという意味において「パーツのキット」を指す。構成成分は同時に、または順に投与することができる。構成成分を順に投与する場合、好ましくは投与間の間隔は、構成成分の組合せ使用の治療効果が、組合せ構成成分（ｉ）および（ｉｉ）のいずれか１つのみの使用によって得られる効果より大きくなるように選択される。
組合せ調製物の構成要素は、１つの組み合わせた単位剤形に存在してもよく、または構成成分（ｉ）の第１の単位剤形および別個の構成成分（ｉｉ）の第２の単位剤形として存在してもよい。組合せ調製物において投与される組合せ構成成分（ｉ）の組合せ構成成分（ｉｉ）に対する全量の比は、例えば処置される患者亜集団の必要性、または例えば患者の特定の疾患、年齢、性別、もしくは体重によるものであり得る単一の患者の必要性に対処するために多様であり得る。
好ましくは、少なくとも１つの有益な効果、例えば構成成分（ｉ）、または構成成分（ｉｉ）の効果を増強、または組合せ構成成分（ｉ）および（ｉｉ）の効果の相互増強、例えば相加効果を超える効果、追加の有利な効果、より少ない副作用、より少ない毒性、または組合せ構成成分（ｉ）および（ｉｉ）の１つまたは両方の有効投薬量と比較した組合せ治療効果、ならびに非常に好ましくは組合せ構成成分（ｉ）および（ｉｉ）の相乗効果が存在する。
本発明の組合せ調製物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与するための薬学的組合せ調製物として提供され得る。構成成分（ｉ）を、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤と一緒に提供してもよく、および／または構成成分（ｉｉ）を、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤と一緒に提供してもよい。
本発明によれば、本発明の核酸によってコードされるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子がさらに提供される。
本発明によれば、哺乳動物細胞中における発現のためにコドン最適化されている、本発明の核酸によってコードされるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子がさらに提供される。
本発明によれば、哺乳動物細胞中における発現のために遺伝子最適化されている、本発明の核酸によってコードされるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子がさらに提供される。
本発明によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸もまた提供される。
本発明によれば、核酸が哺乳動物細胞中における発現のためにコドン最適化されている、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子もまた提供される。
本発明によれば、核酸が哺乳動物細胞中における発現のために遺伝子最適化されている、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子もまた提供される。
本発明によれば、本発明の核酸を含むベクターもまた提供される。
必要に応じてベクターは、核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。
必要に応じてプロモーターは、哺乳動物における核酸によってコードされるポリペプチドの発現のためである。
必要に応じてプロモーターは、酵母、細菌、または昆虫細胞中の核酸によってコードされるポリペプチドの発現のためである。
必要に応じて、ベクターはワクチンベクターである。必要に応じて、ワクチンベクターは、ウイルスワクチンベクター、細菌ワクチンベクター、または核酸ベクター（例えば、ＲＮＡワクチンベクター、またはＤＮＡワクチンベクター）である。
本発明の核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み得る。核酸分子がＲＮＡ分子を含む実施形態では、分子は、各々の「Ｔ」ヌクレオチドが「Ｕ」に置き換えられている配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１２、１４、１９、２１、２３、２５、２７、２９、もしくは３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一であるＲＮＡ配列、またはその相補体を含み得ると認識される。
例えば、本発明の核酸を含むＲＮＡワクチンベクターが提供される場合、本発明の核酸の核酸配列はＲＮＡ配列であり、そのため例えば、各々の「Ｔ」ヌクレオチドが「Ｕ」に置き換えられている配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１２、１４、１９、２１、２３、２５、２７、２９、もしくは３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一であるＲＮＡ核酸配列、またはその相補体を含み得ると認識される。
本発明によれば、本発明のベクターを含むまたはベクターをトランスフェクトした単離された細胞もまた提供される。
本発明によれば、本発明のポリペプチドを含むウイルスシュードタイプ粒子もまた提供される。
本発明によれば、本発明の核酸を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含むウイルスシュードタイプ粒子を産生する方法も提供される。
本発明によれば、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質もまた提供される。
本発明によれば、本発明の核酸、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物がさらに提供される。
本発明によれば、本発明のベクター、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物もまた提供される。
本発明によれば、本発明のポリペプチド、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物もまた提供される。
必要に応じて、本発明の医薬組成物は、組成物のポリペプチド、または核酸によってコードされるポリペプチドに対する被験体における免疫応答を増強するためのアジュバントをさらに含む。
本発明によれば、被験体において病原体に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法もまた提供される。
必要に応じて、病原体はウイルスである。必要に応じて、ウイルスはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。
本発明によれば、被験体においてＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅまたはＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法もまた提供される。
本発明によれば、病原体に対して被験体を免疫する方法であって、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法もまた提供される。
必要に応じて、病原体はウイルスである。必要に応じて、ウイルスは、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。
本発明によれば、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法がさらに提供される。
本発明によれば、被験体においてＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法もまた提供される。
必要に応じて、本発明の核酸、ベクター、または医薬組成物は、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１２、もしくは１４のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一である配列を含む核酸を含むか、または配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１２、もしくは１４のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一である配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
必要に応じて、本発明のポリペプチド、ベクター、または医薬組成物は、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１２、もしくは１４のいずれかによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはそれらのいずれかと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、または配列番号３、６、９、１１、１３、もしくは１５のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本発明によれば、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法がさらに提供される。
本発明によれば、被験体においてＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明の核酸、本発明のポリペプチド、本発明のベクター、または本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法もまた提供される。
必要に応じて、本発明の核酸、ベクター、または医薬組成物は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、もしくは３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一である配列を含む核酸を含むか、または配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、もしくは３１のいずれかと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一である配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
必要に応じて、本発明のポリペプチド、ベクター、または医薬組成物は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、もしくは３１のいずれかによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むか、または配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、もしくは３０のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、またはそれらのいずれかと同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
任意の適切な投与経路を使用してもよい。投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、非経口、静脈内、皮下、膣、直腸、鼻腔内、吸入、または経口が挙げられるがこれらに限定されない。非経口投与、例えば皮下、静脈内、または筋肉内投与は一般的に、注射によって達成される。注射剤は、液体溶液または懸濁物のいずれかとしての通常の形態、注射前に液体中での溶解または懸濁のために適した固体形態、または乳剤として調製することができる。注射用溶液および懸濁物は、既に記載された種類の滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。投与は全身または局所であり得る。
組成物は、任意の適した様式で、例えば薬学的に許容される担体と共に投与され得る。薬学的に許容される担体は一部には、投与される特定の組成物、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。非経口投与のための調製物は、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁物、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳剤、または懸濁物を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、輸液（ｆｌｕｉｄ）および栄養補給剤、電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づく補給剤）等を含む。保存剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等も同様に存在してもよい。
組成物の一部は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸、ならびに有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸との反応によって形成される、または無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、ならびに有機塩基、例えばモノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミン、および置換エタノールアミンとの反応によって形成される、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として潜在的に投与され得る。
投与は、１回用量または複数回用量によって達成することができる。本開示の文脈において被験体に投与される用量は、被験体において経時的に有益な治療応答を誘導するために、または感染を阻害もしくは防止するために十分でなければならない。必要な用量は、被験体の種、年齢、体重、および全身状態、処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて被験体毎に異なる。適切な用量は、ルーチンの実験のみを使用して当業者が決定することができる。
薬学的に許容される担体としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。担体および組成物は、無菌的であり得、製剤は投与様式に適合する。組成物はまた、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含有することができる。組成物は、液体溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または散剤であり得る。組成物は、従来の結合剤および担体、例えばトリグリセリドと共に坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムを含み得る。一般的な薬学的担体、例えば滅菌食塩水溶液またはゴマ油のいずれも使用することができる。媒体はまた、従来の薬学的補助材料、例えば浸透圧を調節するための薬学的に許容される塩、緩衝液、保存剤等も含有することができる。本明細書に提供される組成物および方法と共に使用することができる他の媒体は、生理食塩水およびゴマ油である。
一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体および／またはアジュバントを含む。例えばアジュバントは、ミョウバン、フロイント完全アジュバント、生物学的アジュバント、または免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）であり得る。
本開示において有用である薬学的に許容される担体（ビヒクル）は従来通りである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９７５）は、１つまたは複数の治療組成物、例えば１つまたは複数のインフルエンザワクチン、および追加の薬剤の薬学的送達にとって適切な組成物および製剤を記載している。
一般的に、担体の性質は、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的および生理学的に許容される流体、例えば水、生理食塩水、緩衝塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）の場合、通常の非毒性の固体担体としては、例えば薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の非毒性の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。
必要に応じて、本発明の組成物は、筋肉内投与される。
必要に応じて、組成物は、針によって、または遺伝子銃もしくは電気穿孔によって筋肉内、皮内、皮下に投与される。
本発明によれば、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニングサイトを含む核酸発現ベクターもまた提供される。
必要に応じて、マルチクローニングサイトは、配列番号１６の核酸配列を含む。
必要に応じて、核酸発現ベクターは、核酸発現ベクター、およびウイルスシュードタイプベクターである。
必要に応じて、核酸発現ベクターはワクチンベクターである。
必要に応じて、核酸発現ベクターは、５’から３’方向に：プロモーター；スプライスドナー部位（ＳＤ）；スプライスアクセプター部位（ＳＡ）；およびターミネーターシグナルを含み、マルチクローニングサイトは、スプライスアクセプター部位とターミネーターシグナルとの間に位置する。
必要に応じて、プロモーターは、ＣＭＶ前初期１エンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ－ＩＥ－Ｅ／Ｐ）を含む、および／またはターミネーターシグナルは、ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を欠如するウシ成長ホルモン遺伝子（Ｔｂｇｈ）のターミネーターシグナルを含む。
必要に応じて、核酸発現ベクターはさらに、複製起点および抗生物質に対する耐性をコードする核酸を含む。必要に応じて、複製起点は、ｐＵＣ－プラスミド複製起点を含む、および／または核酸はカナマイシンに対する耐性をコードする。
必要に応じて、核酸発現ベクターは、配列番号１７の核酸配列（ｐＥＶＡＣ）を含む。
本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、作製された場合に、元のタンパク質の特性に最も干渉しない、すなわち、タンパク質の構造および特に機能が保存され、そのような置換によって有意に変化しない置換である。保存的置換の例を以下に示す：
Figure 2022513326000008
保存的置換は一般的に、（ａ）例えばシートもしくはヘリックスコンフォメーションとしての、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさを維持する。
一般的に、タンパク質特性に最大の変化を生じると予想される置換は、非保存的変化、例えば（ａ）親水性残基、例えばセリルもしくはトレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルを置換する（またはそれによって置換される）；（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基を置換する（またはそれによって置換される）；（ｃ）電気的に陽性の側鎖、例えばリシル、アルギニル、もしくはヒスチジルを有する残基が、電気的に陰性の残基、例えばグルタミルもしくはアスパルチルを置換する（またはそれによって置換される）；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが側鎖を有しない残基、例えばグリシンを置換する（またはそれによって置換される）変化であろう。
本発明の特定の実施形態では、配列アライメントおよび祖先配列再構築（ＡＳＲ）を使用して、病原体が変化させることができず、そのウイルス科、さらには最も変化しやすいＲＮＡウイルスの将来の大流行においても必然的に存在する高度に保存された免疫標的を同定することができる。合成遺伝子技術を使用して、高度に発現され、発現ベクター、例えばｐＥＶＡＣベクター（ウイルスシュードタイプを生成するための、ならびに動物および／またはヒトの直接のＤＮＡワクチン接種のための高度に汎用性の高い発現ベクターであることが証明されたベクター）に容易にクローニングすることができるコンピューターにより生成されたウイルス遺伝子を産生することができる。
ウイルスシュードタイプが迅速に生成されるように、ｐＥＶＡＣベクターを使用して大きい遺伝子パネルを生成することができる。これによって、各々が自身の独自のウイルスタンパク質を有するウイルスシュードタイプのライブラリーをモノクローナル抗体の大きいパネルによってプロービングすることが可能となる。このプロセスによって、インサートがコンフォメーション上正確なウイルス表面タンパク質を生成してウイルスのアキレス腱に対して最もアクセスしやすい標的が確実に提示される。シュードタイプ形成およびｍＡｂ結合によって候補の選択範囲を狭めることにより、ワクチン接種によって試験する上位候補体の候補リストが提供される。これは、ｐＥＶＡＣ－ワクチンインサートの合理化プロセスが送達されるモルモットにおいて行われ得る。必要であれば、これは、先進的な設計された都合のよいクローニングサイトに基づいて、ＤＮＡ ｐＥＶＡＣベクターから多様なウイルスベクターへのワクチンインサートのシャトルを可能にする。チンパンジーアデノベクター（ＣｈＡｄ）は、西アフリカでの大流行のために大半のエボラウイルスワクチン候補を評価するためにフェーズＩにおいて広く使用されたことから、本発明者らはヒトにおける直接比較のために同じベクターを使用して比較することを選択する。モルモットにおけるスクリーニングの場合、本発明者らは、ｐＥＶＡＣ－ワクチンインサートの後にＣｈＡｄ－ワクチンインサートによるＤＮＡプライミングを使用した。
本発明の特定の実施形態では：
１）ハイスループット「ディープ」シーケンシング技術は、現在のおよび過去の大流行からのウイルス変動データを提供する。このデータを分析することによって、最適なワクチンインサートを設計するための足場として使用することができ、公知のＢおよびＴ細胞エピトープを保存する構造的に高度に保存された領域を同定することができる。
２）ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）技術は、ワクチン標的、例えばウイルスエンベロープタンパク質に対する抗ウイルスｍＡｂの生成を可能にし、広域中和モノクローナル抗体（ＢＮｍＡｂ）が標的とするエピトープに富む領域を同定する。
３）最適な遺伝子設計および合成は、（１）において同定された遺伝子のデジタルモデル化された保存された足場を、これらの足場に最も広いＮｍＡｂエピトープを含むように組み入れる（ＢＮエピトープは、天然に保存されたＧＰ上で最適に提示されない可能性がある）。
４）ワクチンおよびシュードタイプベクターの要件にマッチする都合のよいクローニングサイトの下流の情報を、ワクチンインサートとしてのＲＮＡおよびコドン最適化合成遺伝子の設計および合成の際に考慮に入れて、迅速かつ非常に効率的なクローニングおよび異なるスクリーニング（すなわち、レンチウイルスシュードタイプ；ＰＶ）およびワクチン（すなわち、ＭＶＡ、ＣｈＡｄ、ＶＳＶ、ＤＮＡ等）ベクターへのシャトリングが可能となる。
５）デジタル設計されたインサートから生成されたウイルスシュードタイプ（レンチウイルス）を、形質導入および感染研究を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで機能性に関してスクリーニングする。これに加えて、ＢＮｍＡｂのパネルおよび患者血清を使用して中和アッセイを実施し、公知のエピトープが保存されることを確実にする。
６）いくつかの合成ワクチンインサートを最善のクラスのワクチンインサートへと選択範囲を狭めることにより、迅速なＤＮＡプライミングを（および必要であれば）高い再現性のある力価を生じる方法であるアデノウイルスブースティングと共に使用してモルモットにおける免疫原性に関して確認する。ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングは、どれが最も免疫原性であり、最大の中和幅を生じるかを確認する。
ウイルス糖タンパク質は細胞接着、融合、および脱外被において中心的な役割を果たすことにより、これは西アフリカのエボラ大流行時に先駆となったウイルスワクチンおよびモノクローナル抗体治療のための重要な抗原標的となる。ＥＢＯＶ種間でのＧＰ配列の分析から、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで高度の多様性（わずか約６０～６５％のｎｔ同一性）が示された。現在の従来のフィロウイルスワクチンアプローチでは、より保存される（ＧＰヌクレオチド配列における約９７～９８％同一性）各々の種に対して特異的なＧＰをコードするＧＰ標的化ワクチンは多価である必要がある。ＥＢＯＶのより古い株（ｒＶＳＶ．ＺＥＢＯＶ＝キクウィト）を使用するワクチンは、交差保護を提供し得ることを示唆しているが（Ｈｅｎａｏ－Ｒｅｓｔｒｅｐｏ ＡＭ， Ｌａｎｃｅｔ ２０１５）、これは他の多様な高度に病原性のフィロウイルスの将来の大流行に対する有効性が限定的であり得るという懸念がある。
本発明者らは、配列データ（必要に応じて、例えば大流行時の配列データを含む）に基づいて新規ウイルスバリアントに対するワクチン有効性の劇的な改善を達成し、合成の最適化ワクチンインサートを生成して、変化しやすいＲＮＡウイルスの将来の大流行に対して最も広域の可能性があるワクチン保護を提供することができる。特定の実施形態では、本発明者らの新規ワクチン技術は、
（１）大流行病原体の配列
（２）大流行の生存者に由来する広域抗ウイルス中和モノクローナル抗体（ＢＮｍＡｂ）
（３）コンピューターによるモデリング方法論
（４）合成遺伝子技術および抗原ディスプレイ技術
（５）ハイスループットウイルス結合および中和スクリーニング
（６）ｉｎ ｖｉｖｏ免疫選択およびワクチン有効性の読み出し
を融合させる。
最終産物は、保護的免疫応答の最も広域のスペクトルを誘発するために使用される新規免疫原である。本発明者らは、次世代単一ワクチンインサートが、エボラウイルス属（ザイール、スーダン、ブンディブギョ）に対して実際に広域中和プロファイルを誘導し、より遠縁のフィロウイルス、マールブルグウイルスをさらに標的化するという概念実証を提供する。
本発明の実施形態を、単なる例証によって、以下の添付の図面を参照して以下の実施例に説明する。
図１は、系統発生樹の例証および祖先配列再構築とのその関連を示す。
図２は、エボラウイルスとマールブルグウイルスとを比較する系統発生樹を示す。数字は、枝のパーセント信頼度を示す。
図３はｐＥＶＡＣのプラスミドマップを示す。
図４は、エボラチャレンジモデルのチャレンジ研究結果を示す。エボラチャレンジモデルは、非ワクチン接種モルモット（群１、下の線）では致死的であったが、ワクチン接種モルモット（群２、上の線）は全て保護され（左）、体重が増加し続けた（右）。
図５は、全てのエボラウイルス種およびマールブルグウイルスを表すシュードタイプ化ウイルスの表面上に発現された標的抗原に対する中和抗体応答の強度を例証するシュードタイプウイルス中和アッセイの結果を示す。中和の強度をヒートマップで示し、赤色（最も暗い網掛け）は、非常に強い中和であり、オレンジから黄色（次第に薄くなる網掛け）となるにつれて減少し、中和なし／陰性対照値に等しいは白色である。Ｔ２－４およびＴ２－６は、免疫したモルモットから採取した血清試料による前臨床段階の試験中の、Ｔ２－１１マールブルグ候補と組み合わせたリード候補最適化抗原性エボラポリペプチドをコードする核酸ワクチンである。
図６は、本発明の方法の実施形態を使用して同定された異なるリード候補最適化抗原性病原性ポリペプチドをコードする核酸ワクチンの有効性を決定する研究の結果を示す。抗体結合を、その表面上に２つの異なる群１インフルエンザＡ型糖タンパク質（Ｈ１パンデミックおよび季節性）を有する２つの細胞群を、プールしたマウス血清と共にインキュベートすることによって測定した。次に、あらゆる結合した抗体を二次抗体によって検出し、フローサイトメーターを使用して結果を記録した。結合は、全ての構築物によるワクチン接種の前後で有意に増加したが、ＰＢＳ（対照）によるワクチン接種後では増加しなかった。全体として、ワクチン候補は、両方の症例においてＣＯＢＲＡからの成績を上回った（＊）。
図７は、ＣＯＢＲＡまたはＤＩＯＳ ＨＡ遺伝子抗原のいずれかによって免疫した動物からのマウス血清による、その細胞表面上に２つの異なる群１インフルエンザＡ型糖タンパク質（季節性Ｈ１Ｎ１、およびパンデミック起源Ｈ１Ｎ１）を発現する細胞の結合を決定する研究の結果を示す。
図８は、ＤＩＯＳまたはＣＯＢＲＡ ＤＮＡ免疫マウスからの血清による、交差ＨＡ群の結合（左のパネル）およびＨ７Ｎ９（Ａ／上海２／２０１３）のシュードタイプ中和（右）の結果を示す。右のパネルでは、一番上の曲線はＣＲ９１１４に関し、グラフの左の最も低い２つの開始点から低下する２つの曲線は、Ｈ１Ｎ１に関し、残りの２つの曲線はＨ１Ｎ１ｐｄｍに関する。
非最適化エボラおよびマールブルグウイルス祖先核酸配列（すなわち、コドン最適化も遺伝子最適化もされていない配列）の例を、候補抗原性病原体ポリペプチドをコードする遺伝子最適化核酸配列と共に以下に示す。
方法論
所定のウイルス種に関して、候補の主要な配列を、例えばＧｅｎＢａｎｋ（および他の任意の入手可能なソース、例えば大流行データ）からダウンロードし、フィルタリングして同一の配列、目的のタンパク質の範囲外である配列、および多義的なヌクレオチドを多数有する配列を除外する。フィルタリングした配列のマルチプル配列アライメントを生成し（典型的に、ＭＡＦＦＴを使用して）、配列が正確なオープンリーディングフレームに確実に存在することを手作業でチェックする。最尤法による系統発生を、自動化モデル選択によるＩＱＴＲＥＥを使用して生成し、いくつかの方法：アウトグループ配列、中央点ルーティング（ｍｉｄｐｏｉｎｔ ｒｏｏｔｉｎｇ）、ツリー中心（ｃｅｎｔｒｅ－ｏｆ－ｔｈｅ－ｔｒｅｅ）、またはルートから先端までの距離とサンプリング時間との間の関連を最大化するツリーのうち１つを使用してルーティングする。祖先配列は、コドン置換のＦ３×４モデルによってＭＧ９４を仮定してＨｙＰｈｙを使用して生成し、公知のエピトープが確実に保存されていることをチェックする。主要な配列および祖先配列の両方を有する系統発生樹を、ＩＱＴＲＥＥを使用して生成し、祖先株の配置をチェックする。次に祖先配列をいくつかの方法：領域の欠失（例えば、ムチン様ドメインの除去）；領域スワッピング（失われる可能性があるエピトープを回復するため）；Ｎ結合グリコシル化部位の編集および安定性を増強するための変異の導入を含む、特定の部位（例えば、フィロウイルスの融合ドメインにおける）の変異によって改変する。
（実施例１）
エボラスーダン祖先（Ｔ２－４）
非最適化（配列番号１）
Figure 2022513326000009
Figure 2022513326000010
 遺伝子最適化（配列番号２）
Figure 2022513326000011
 非最適化および遺伝子最適化配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３）：
Figure 2022513326000012
（実施例２）
エボラウイルスの網羅的祖先（Ｔ２－６）
非最適化（配列番号４）
Figure 2022513326000013
 遺伝子最適化（配列番号５）
Figure 2022513326000014
 非最適化および遺伝子最適化配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）：
Figure 2022513326000015
（実施例３）
マールブルグウイルス祖先（Ｔ２－１１）
非最適化（配列番号７）
Figure 2022513326000016
 遺伝子最適化（配列番号８）
Figure 2022513326000017
 非最適化および遺伝子最適化配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号９）：
Figure 2022513326000018
（実施例４）
層２－４（ＳＵＤＶ＿ａｎｃ＿－ＭＬＤ）
ムチン様ドメインが欠失した（マイナス、「－」）スーダンエボラウイルス祖先配列
ヌクレオチド配列（配列番号１０）：
Figure 2022513326000019
 アミノ酸配列（配列番号１１）：
Figure 2022513326000020
（実施例５）
層２－６（ＳＵＤＶ＿ＥＢＯＶ－ＴＡＦＶ－ＢＤＢＶ＿ａｎｃ＿－ＭＬＤ）
ムチン様ドメインが欠失した４つの種、スーダン、ザイール、タイフォレスト、およびブンディブギョエボラウイルスに対する祖先配列
ヌクレオチド配列（配列番号１２）：
Figure 2022513326000021
Figure 2022513326000022
 アミノ酸配列（配列番号１３）：
Figure 2022513326000023
（実施例６）
層２－１１（ＲＡＶＶ＿ＭＡＲＶ＿ａｎｃ）
株マールブルグウイルスおよびラヴンウイルスに対する祖先配列
ヌクレオチド配列（配列番号１４）
Figure 2022513326000024
Figure 2022513326000025
 アミノ酸配列（配列番号１５）：
Figure 2022513326000026
（実施例７）
ｐＥＶＡＣ発現ベクター
図３は、ｐＥＶＡＣ発現ベクターのマップを示す。ベクターのマルチクローニングサイトの配列を以下に示し、その後にその全ヌクレオチド配列が続く。
ｐＥＶＡＣマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の配列（配列番号１６）：
Figure 2022513326000027
 ｐＥＶＡＣの全配列（配列番号１７）：
ＣＭＶ－ＩＥ－Ｅ／Ｐ：２４８－９８９ ＣＭＶ前初期１エンハンサー／プロモーター
ＫａｎＲ：３４４５－４０９８ カナマイシン耐性
ＳＤ：９９０－１２２０ スプライスドナー
ＳＡ：１２２１－１３４３ スプライスアクセプター
Ｔｂｇｈ：１３９２－１９４２ ウシ成長ホルモンからのターミネーターシグナル
ｐＵＣ－ｏｒｉ：２０９６－２７６９ ｐＵＣプラスミド複製起点
Figure 2022513326000028
Figure 2022513326000029
Figure 2022513326000030
（実施例８）
広域中和抗体応答を誘導することができるリード候補最適化抗原性エボラポリペプチド
２０１４年の西アフリカ大流行後にエボラに対するワクチンの開発に重大な関心が集まった。現在臨床開発中のプログラムはこれまで、ウイルスベクター骨格において発現させた１～３つの株からのエボラおよび／またはマールブルグウイルス表面糖タンパク質（ＧＰ）を使用するワクチン開発の「古典的アプローチ」をとっている。抗原特異性は、含まれるＥＢＯＶ株のみに由来し、例えばＭｅｒｃｋはキクウィトのＧＰを使用し；ＧＳＫは、Ｍａｙｉｎｇａ ＥＢＯＶおよびＧｕｌｕ ＳＵＤＶ株を使用し；Ｃｒｕｃｅｌｌ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｃｔｕｓ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓはいずれも、ザイールおよびスーダンエボラ株と一緒にマールブルグウイルスを使用し；Ｎｏｖａｖａｘのアプローチは独自であり、２０１４年のＭａｋｏｎａ ＥＢＯＶ株を使用している。
以下の表１は、全てのエボラウイルス種（亜型）およびマールブルグウイルスを表す標的抗原に対する抗体結合の強度を例証するフローサイトメトリーアッセイ結果を示す。結合の強度は、ヒートマップによって示され、赤色（グレースケールで見た場合に最も暗い網掛け）は非常に強い結合であり、オレンジから黄色（グレースケールで見た場合に次第に薄くなる網掛け）となるにつれて結合は減少し、結合なし／陰性対照値に等しいは白色である。血清試料１～２２は、他のエボラウイルスワクチン候補で免疫した個体から採取した。Ｔ２－４およびＴ２－６は、免疫したモルモットから採取した血清試料による前臨床段階の試験中の、Ｔ２－１１マールブルグ候補と組み合わせたリード候補最適化抗原性エボラポリペプチドをコードする核酸ワクチンである。
表１
Figure 2022513326000031
（実施例９）
エボラチャレンジモデルにおける三価ラッサ、エボラ、およびマールブルグウイルスワクチン（Ｔｒｉ－ＬＥＭｖａｃ）によって達成された保護
本発明者らは、出血熱ラッサ、エボラ、およびマールブルグウイルスのバリアントの将来の大流行に対して組合せワクチンの有効性を生じる三価ワクチン（Ｔｒｉ－ＬＥＭｖａｃ）を開発した。
本発明者らは、全ての利用可能なアレナウイルスおよびフィロウイルスデータベースからのＬＡＳＶ（Ｌ）ならびにＥＢＯＶ（Ｅ）およびＭＡＲＶ（Ｍ）のＧＰＣオープンリーディングフレームから合成糖タンパク質配列を生物情報学的に設計した。これらの保存された配列は、これらのウイルスの各々の中和抗体およびＴ細胞に富むエピトープからなる。これらの合成により設計されたＬＡＳＶ、ＥＢＯＶ、およびＭＡＲＶエンベロープが機能的および抗原性であることを確実にするために、それらをシュードタイプとして発現させ、広域中和抗体のパネルに対して結合および中和の両方に関して品質を管理した。本明細書において、本発明者らは、三量体ＬＥＭワクチンの構築のためにワクチン由来ベクター改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を選択する。
改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ワクチンプラットフォームは、非複製株（すなわち、ヒト細胞において複製しない）であり、第三世代の天然痘ワクチンおよびヒト臨床試験における最も進んだ組換えポックスウイルスワクチンベクターの１つである（Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｖａｃｃｉｎｅ， ２０１３， ３１（３９）：４２４７－５１）。ＭＶＡは、最大４つのトランスジーンを同時発現することが可能な堅牢なベクターシステムであり、強力なプロモーターおよび安定な挿入部位を促進する（Ｏｒｕｂｕ ｅｔ ａｌ， Ｐｏｎｅ， ２０１２，７（６）ｅ００４０１６７）。ＭＶＡは、以下の理由：１）１つの費用効果の高いワクチンロットにおける三価のＬＥＭワクチン接種のために、それが強力かつ時間調節型プロモーターを有する適合性の発現カセットを介して複数の独立したＯＲＦをそれが有意に安定に発現させることができる；２）特にＤＮＡまたはＲＮＡベクターによってプライミングまたはブースティングした場合に、それが動物およびヒトにおいて堅牢なＢおよびＴ細胞免疫応答を誘導することができる；ならびに３）コールドチェーンがない発展途上国における貯蔵および輸送のために、ワクチンロットを熱安定化することができる（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ， Ｖａｃｃｉｎｅ， ２０１５， ３３（３９）：５２２５－３４）から選択された。三価ワクチン候補の原理の証明は、ｉ）独立したＬ、Ｅ、およびＭ ＧＰＣ発現およびエピトープ提示のためのカセットの検証；ならびにｉｉ）フィロウイルスチャレンジによる前臨床での有効性によって実証されている。チャレンジ研究結果を図４に示す。エボラチャレンジモデルは、非ワクチン接種モルモット（群１、下の線）では致死的であったが、ワクチン接種したモルモット（群２、上の線）は全て保護され（左）、体重が増加し続けた（右）。
（実施例１０）
シュードタイプウイルス中和アッセイ
図５は、全てのエボラウイルス種およびマールブルグウイルスを表すシュードタイプ化ウイルスの表面上で発現された標的抗原に対する中和抗体応答の強度を例証するシュードタイプウイルス中和アッセイの結果を示す。中和の強度は、ヒートマップによって示され、赤色（グレースケールで見た場合に最も暗い網掛け）は非常に強い中和であり、オレンジから黄色（グレースケールで見た場合に次第に薄くなる網掛け）となるにつれて中和は減少し、中和なし／陰性対照値に等しいは白色である。
Ｔ２－４およびＴ２－６は、免疫したモルモットから採取した血清試料による前臨床段階の試験中の、Ｔ２－１１マールブルグ候補と組み合わせたリード候補最適化抗原性エボラポリペプチドを各々コードする核酸ワクチンである。
結果は、Ｔ２－６およびＴ２－１１ワクチンインサートの組合せを投与することが、免疫応答の幅の相乗的な増加を生じたことを示している。
（実施例１１）
抗体結合アッセイ
図６は、抗体結合アッセイの結果を示す。抗体結合は、その表面上に２つの異なる群１インフルエンザＡ型糖タンパク質（Ｈ１パンデミックおよび季節性）を有する２つの細胞群を、プールされたマウス血清とインキュベートすることによって測定した。次にあらゆる結合した抗体を二次抗体によって検出し、フローサイトメーターを使用して結果を記録した。結合は、全ての構築物によるワクチン接種の前後で有意に増加したが、ＰＢＳ（対照）によるワクチン接種後では増加しなかった。全体として、ＤＩＯＳワクチン候補は、両方の症例においてＣＯＢＲＡからの成績を上回った（＊）。
（実施例１２）
２つの異なるコンピューターによるアプローチによって誘導した免疫応答の比較
マウス６匹の４群を、本発明の実施形態に従う方法（ＤＩＯＳ）によって、または従来の方法（ＣＯＢＲＡ）のいずれかによって設計したＨＡ遺伝子抗原をコードする４つの別個のｐＥＶＡＣプラスミド２５μｇによって２週間間隔で５回免疫した。
抗体に基づくＦＡＣＳを、その表面上に２つの異なる群１インフルエンザＡ糖タンパク質（季節性Ｈ１Ｎ１、およびパンデミック起源Ｈ１Ｎ１）を発現する細胞について実施した。これらを使用して、ＣＯＢＲＡまたはＤＩＯＳ ＨＡ遺伝子抗原のいずれかによって免疫した動物からのマウス血清を試験した。結果を図７に示す。
全体として、ＤＩＯＳ ＨＡ遺伝子抗原は、ＣＯＢＲＡ ＨＡ遺伝子抗原とマッチしたか、またはより有意に成績が上回った（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
（実施例１３）
Ｈ７Ｎ９（Ａ／上海２／２０１３）の交差ＨＡ群結合、およびシュードタイプ中和
本発明者らは、実施例１２のＤＩＯＳ－Ｈ１Ｎ１ｐｄｍワクチン（Ｈ１Ｎ１－ＣＯＢＲＡよりパンデミックＨ１ ＨＡ抗原に対して高レベルの抗体結合を生じる）が、パンデミックの潜在性があるＨ７Ｎ９株Ａ／上海／２／２０１３からのウイルスＨＡなどの異なる群２のウイルスＨＡを認識して結合する抗体を誘発することができるか否かを試験した。
図８は、ＤＩＯＳまたはＣＯＢＲＡ ＤＮＡ免疫マウスの血清によるＨ７Ｎ９（Ａ／上海２／２０１３）の交差ＨＡ群結合（左のパネル）およびシュードタイプ中和（右）の結果を示す。シュードタイプ中和データ（右）によって確認されたＨ７結合データ（左）から、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍワクチン接種マウスが他の群と比較して最高の中和を示したことが示される。試験した他の群よりＤＩＯＳ－Ｈ１Ｎ１ｐｄｍワクチンによって有意により多くの結合が誘発され、陽性対照の広域中和モノクローナル抗体Ｆ１６（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｓｕｐｒａ）およびＣＲ９１１４（Ｄｒｅｙｆｕｓ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１２； ３３７（６１００）： １３４３－１３４８）と同等であった。
これらの結果は、ＤＩＯＳ－Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ免疫原がＨ７を交差中和する、および本発明の方法によって産生されたワクチンについて交差－ＨＡ群の免疫保護が可能であるという結論を支持する。
（実施例１４）
ラッサウイルス糖タンパク質
本実施例は、本発明の実施形態に従う方法を使用して産生されたラッサウイルス糖タンパク質祖先配列、および構造を安定化させることによってその免疫原性を改善させるための祖先配列の改変を記載する。
ラッサ熱は、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）として知られる旧世界（ＯＷ）アレナウイルスによって引き起こされる出血性疾患である。ウイルスは、１９６９年にナイジェリアで初めて単離され、現在西アフリカにおける風土病である。ラッサ出血熱に関連する高い有病率および死亡率のために、ＬＡＳＶはカテゴリーＡ病原体として分類されている。
ラッサウイルスは、２分節ゲノムを有するエンベロープを有するアンビセンスＲＮＡウイルスである。ウイルス粒子は、ウイルス侵入を媒介する成熟糖タンパク質（ＧＰ）三量体スパイクで覆われている。他のクラス１ウイルス融合タンパク質と同様に、エンベロープ糖タンパク質前駆体（ＧＰＣ）は、単一のポリペプチドとして翻訳され、タンパク質分解により３つのサブユニットに切断される。プロセシングは、最初に小胞体（ＥＲ）において細胞のシグナルペプチダーゼによって起こる。次にＧＰＣは、ｃｉｓ－ゴルジ体へと輸送され、細胞のプロタンパク質転換酵素であるサブチリシンケキシンアイソザイム－１／サイト－１プロテアーゼ（ＳＫＩ－１／Ｓ１Ｐ）によってプロセシングされ、非共有結合性の安定なシグナルペプチド（ＳＳＰ）／ＧＰ１／ＧＰ２ヘテロ三量体を産生する。他のクラス１融合タンパク質とは異なり、ＧＰＣの比較的長いシグナルペプチドは分解されず、これはＧＰの正確な輸送およびプロセシングのために必要なシャペロン様機能としての役目を果たす。ＳＳＰは、ＧＰ２の細胞質ドメインと相互作用し、ｐＨ感知に関係する。ＧＰ１は、細胞受容体に対する結合の要因であるが、ＧＰ２はウイルス侵入の際の膜融合を媒介する。
系列ＩＩＩおよびＩＶ（Ｌ－１０）に対するラッサウイルス糖タンパク質祖先配列（構築物１）を、本発明の実施形態に従う方法を使用して産生した。次に、親祖先配列（構築物１）に独立して改変を導入し、（Ａ）ＳＯＳＥＰ（構築物２）；および（Ｂ）ＦＬＥＰ（構築物４）、ならびに他のフレキシブルなヘテロ三量体を安定化させ、非共有結合によって連結した膜貫通ドメインからの糖タンパク質の外部ドメインの解離を防止するための、ＮｔｏＫと呼ばれるグリカンノックアウトとの組合せ（構築物３および５を提供する）を提供する。
（Ａ）２つのシステイン残基を、２０７位および３６０位に導入し、ＧＰの外部と膜貫通ドメインとの間でジスルフィド架橋（ＳＯＳ）を形成させる。これらの２つのドメインの完全な切断を容易にするために、フリン切断部位を、２５６～２５９位でＲＲＬＬからＲＲＲＲに改変した。３２９位でのグルタミン酸からプロリンへの変異（ＥＰ）により、構造の再配列が防止され、タンパク質はよりフレキシブルでなくなる。
（Ｂ）外部ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のフリン切断部位（２５６－ＲＲＬＬ－２５９）を、配列２５６－ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－２６５を有するフレキシブルリンカーによって置き換えた。加えて、（Ａ）におけるＥＰ変異を３３５位に導入した。
ＳＯＳＥＰ－ＮｔｏＫまたはＦＬＥＰ－ＮｔｏＫに関してそれぞれ、グリコシル化モチーフを不活化するために、２７２または２７８位でのアスパラギンからリシンへの変異をさらに含有する両方の設計のバリアントを生成した。この位置でのグリカンは、一部の中和抗体、例えば３７．７Ｈのアクセスを遮断し得る。
構築物１：
系列ＩＩＩおよびＩＶに対するラッサウイルス糖タンパク質祖先配列
（Ｌ－１０＝ＬＡＳＶ＿ＩＩＩ＿ＩＶ＿ａｎｃ）
アミノ酸配列（配列番号１８）：
Figure 2022513326000032
 ＤＮＡ配列（配列番号１９）：
Figure 2022513326000033
Figure 2022513326000034
 構築物２：
構築物１のＳＯＳＥＰ－バリアント（Ｌ－１０－ＳＯＳＥＰ）
アミノ酸配列（配列番号２０）：
Figure 2022513326000035
 ＤＮＡ配列（配列番号２１）：
Figure 2022513326000036
Figure 2022513326000037
 構築物３：
ＮからＫへの変異を有する構築物１のＳＯＳＥＰバリアント（Ｌ－１０－ＳＯＳＥＰ－ＮｔｏＫ）
アミノ酸配列（配列番号２２）：
Figure 2022513326000038
 ＤＮＡ配列（配列番号２３）：
Figure 2022513326000039
 構築物４：
構築物１のＦＬＥＰバリアント（Ｌ－１０－ＦＬＥＰ）
アミノ酸配列（配列番号２４）：
Figure 2022513326000040
 ＤＮＡ配列（配列番号２５）：
Figure 2022513326000041
 構築物５：
ＮからＫへの変異を有する構築物１のＦＬＥＰバリアント（Ｌ－１０－ＦＬＥＰ－ＮｔｏＫ）
アミノ酸配列（配列番号２６）：
Figure 2022513326000042
 ＤＮＡ配列（配列番号２７）：
Figure 2022513326000043
 （実施例１５）
ラッサウイルスヌクレオタンパク質
本実施例は、本発明の実施形態に従う方法を使用して産生されたラッサウイルスヌクレオタンパク質祖先配列を記載する。
構築物６：
ナイジェリアラッサ単離体のラッサウイルスヌクレオタンパク質祖先配列
（Ｌ－ＮＰ－１＝Ｌ－ＮＰ－ＣｏｖＡｎｃ－１＿Ｎ）
アミノ酸配列（配列番号２８）：
Figure 2022513326000044
 ＤＮＡ配列（配列番号２９）：
Figure 2022513326000045
Figure 2022513326000046
 （実施例１６）
ラッサウイルスヌクレオタンパク質
本実施例は、本発明の実施形態に従う方法を使用して産生されたラッサウイルスヌクレオタンパク質祖先配列を記載する。
構築物７：
シエラレオネ単離体のラッサウイルスヌクレオタンパク質祖先配列
（Ｌ－ＮＰ－１＝Ｌ－ＮＰ－ＣｏｖＡｎｃ－２＿ＳＬ）
アミノ酸配列（配列番号３０）：
Figure 2022513326000047
 ＤＮＡ配列（配列番号３１）：
Figure 2022513326000048
Figure 2022513326000049

Claims (110)

  1. 病原体に対する広域中和免疫応答を誘導することが可能なリード候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを同定するための方法であって、
    ｉ）複数の異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを含むポリペプチドライブラリーを提供するステップであって、各々の異なる候補のアミノ酸配列が、病原体ポリペプチドの複数の異なるアミノ酸配列から最適化されており、前記病原体ポリペプチドの各々の異なるアミノ酸配列とは異なり、前記病原体ポリペプチドの各々の異なるアミノ酸配列が異なる単離体のポリペプチドのアミノ酸配列を含み、各々の異なる単離体が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科の病原体の単離体である、ステップ；
    ｉｉ）各々が広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科の病原体に結合するおよび／またはそれを中和することができる、１つまたは複数の広域中和抗原結合分子による結合に関して前記ポリペプチドライブラリーの前記候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをスクリーニングするステップ：ならびに
    ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において抗原結合分子の１つまたは複数によって結合される候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを、前記病原体に対する広域中和免疫応答を誘導することが可能なリード候補最適化抗原性病原体ポリペプチドであると同定するステップ
    を含む、方法。
  2. 前記１つまたは複数の広域中和抗原結合分子が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科の病原体に曝露されている被験体から得られている抗体、または得られている抗体に由来する抗体を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記１つまたは複数の広域中和抗原結合分子が非抗体の抗原結合タンパク質を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記１つまたは複数の広域中和抗原結合分子が、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アンチカリン、アプタマー、またはＴ細胞受容体分子を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ポリペプチドライブラリーの前記候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが、哺乳動物細胞中に、またはその表面上に発現されている、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ポリペプチドライブラリーの前記候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが、細菌、酵母、または昆虫細胞中に、またはその表面上に発現されている、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  7. 前記病原体がウイルスであり、前記候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが候補最適化抗原性ウイルスポリペプチドであり、前記病原体ペプチドがウイルスポリペプチドである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ポリペプチドライブラリーが、複数の異なるウイルスシュードタイプを含むウイルスシュードタイプライブラリーであり、各々の異なるウイルスシュードタイプが異なる候補最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項７に記載の方法。
  9. ステップ（ｉｉ）において、前記候補最適化抗原性ウイルスポリペプチドが、前記抗原結合分子の１つまたは複数による結合および／または中和に関して前記ウイルスシュードタイプをスクリーニングすることによって、前記抗原結合分子の１つまたは複数による結合に関してスクリーニングされる、請求項８に記載の方法。
  10. 前記候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが、フローサイトメトリーアッセイによって、前記１つまたは複数の抗原結合分子による結合に関してスクリーニングされる、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  11. 前記ポリペプチドライブラリーを生成するステップをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  12. 前記ポリペプチドライブラリーが、複数の異なる核酸を含む核酸ライブラリーから前記異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドを発現させることによって生成され、各々の異なる核酸が、前記ポリペプチドライブラリーの異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記異なる候補最適化病原体ポリペプチドが、哺乳動物細胞中に、またはその表面上に発現される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記核酸ライブラリーの各々の異なる核酸の前記ヌクレオチド配列が、哺乳動物細胞中における前記コードされるポリペプチドの発現のためにコドン最適化され、必要に応じて遺伝子最適化される、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記核酸ライブラリーの各々の異なる核酸が、哺乳動物細胞中における前記核酸の発現のための発現ベクターの一部である、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記病原体がウイルスであり、前記候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが候補最適化抗原性ウイルスポリペプチドであり、前記病原体ペプチドがウイルスポリペプチドである、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記核酸ライブラリーがウイルスシュードタイプベクターライブラリーであり、前記ライブラリーの各々の異なる核酸が、前記コードされるウイルスポリペプチドを含むウイルスシュードタイプの産生のための発現ベクターの一部であり、前記ポリペプチドライブラリーが前記ウイルスシュードタイプベクターライブラリーの前記発現ベクターからウイルスシュードタイプを産生することによって生成されたウイルスシュードタイプライブラリーであり、前記ウイルスシュードタイプライブラリーが、複数の異なるウイルスシュードタイプを含み、各々の異なるウイルスシュードタイプが前記ウイルスシュードタイプベクターライブラリーの異なる核酸配列によってコードされる異なる候補最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記発現ベクターがまたワクチンベクターでもある、請求項１５から１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記ワクチンベクターがウイルスワクチンベクター、細菌ワクチンベクター、ＲＮＡワクチンベクター、またはＤＮＡワクチンベクターである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ワクチンベクターが、ウイルス送達ベクター、例えばポックスウイルス（例えば、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、ＡＶＩＰＯＸ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ、ＣＭＶ、任意の宿主種のアデノウイルス）、モルビリウイルス（例えば、麻疹）、アルファウイルス（例えば、ＳＦＶ、センダイ）、フラビウイルス（例えば、黄熱病）、またはラブドウイルス（例えば、ＶＳＶ）に基づくウイルス送達ベクター、細菌送達ベクター（例えば、サルモネラ、Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＲＮＡ発現ベクター、またはＤＮＡ発現ベクターに基づく、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 前記ベクターがｐＥＶＡＣに基づく発現ベクターである、請求項１５から２０のいずれかに記載の方法。
  22. 前記異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが、細菌、酵母、または昆虫細胞中に、またはその表面上に発現される、請求項１２に記載の方法。
  23. 複数の異なる核酸を合成することによって前記核酸ライブラリーを生成するステップをさらに含み、各々の異なる核酸が異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする異なるヌクレオチド配列を含む、請求項１２から２２のいずれかに記載の方法。
  24. ｉ）前記異なる病原体単離体の前記病原体ポリペプチドのアミノ酸配列、および／または前記病原体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得るステップ；ならびに
    ｉｉ）複数の異なるヌクレオチド配列を生成するステップであって、各々の異なるヌクレオチド配列が異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードし、各々の異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドの前記コードされるアミノ酸配列が、前記病原体ポリペプチドの前記得られたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列から最適化され、前記得られたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列の各々とは異なる、ステップ
    をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項２４のステップ（ｉｉ）における前記複数の異なるヌクレオチド配列の生成が、
    請求項２４のステップ（ｉ）において得られたアミノ酸またはヌクレオチド配列のマルチプル配列アライメントを実施するステップ；
    前記マルチプル配列アライメントから、前記異なる病原体単離体のポリペプチド間で高度に保存されたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列を同定するステップ；および
    複数の異なるヌクレオチド配列を生成するステップであって、各々の異なるヌクレオチド配列が異なる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードし、前記異なるヌクレオチド配列の１つまたは複数が、前記マルチプル配列アライメントから同定された高度に保存されたアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列をコードする配列を含む、ステップ
    を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記マルチプル配列アライメントから、祖先アミノ酸配列であるアミノ酸配列またはコードされるアミノ酸配列を同定するステップ；および
    前記マルチプル配列アライメントから同定された祖先アミノ酸配列をコードする配列を、前記異なる生成されたヌクレオチド配列の１つまたは複数の中に含めるステップ
    をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 発現系における前記コードされる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドの最適な発現のために、前記異なる生成されたヌクレオチド配列のコドン最適化、必要に応じて遺伝子最適化コドンを含む、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
  28. 前記発現系が哺乳動物細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記発現系が酵母、細菌、または昆虫細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記コードされる候補最適化抗原性病原体ポリペプチドの抗原性に関して前記異なるヌクレオチド配列を最適化するステップを含む、請求項２４から２９のいずれかに記載の方法。
  31. 前記抗原性最適化が、以下：
    抗病原体ポリペプチド抗体の産生および／または機能を阻害するアミノ酸配列をコードする核酸配列の欠失または改変（例えば、ムチン様ドメインの欠失または改変）；
    １つまたは複数の失われる可能性があるコードされるエピトープを回復するための領域スワッピング；
    例えばＮ結合グリコシル化部位の部位特異的変異；
    安定性を増強するための変化（例えば、ジスルフィド結合形成、前記コードされるポリペプチドのセリンプロテアーゼによる分解の低減）；
    グリカンの除去；
    例えば所望のエピトープをコードする核酸配列を挿入するための核酸配列の挿入
    のいずれかを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 請求項１のステップ（ｉｉ）において記載された前記１つまたは複数の広域中和抗原結合分子が、広域中和抗体、好ましくは広域中和モノクローナル抗体（ＢＮｍＡｂ）を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  33. 請求項１のステップ（ｉｉ）において記載された前記１つまたは複数の抗原結合分子が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ科、必要に応じて同じ亜型または型の病原体の大流行を生き延びた被験体から得られた抗体、または得られた抗体に由来する抗体を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  34. 前記抗体が得られているまたは由来している前記被験体がヒトまたは非ヒト哺乳動物被験体である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記１つまたは複数の抗原結合分子が広域中和モノクローナル抗体（ＢＮｍＡｂ）を含む、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記異なる病原体単離体が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ亜型の病原体の大流行からの異なる病原体単離体を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  37. 前記異なる病原体単離体が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と異なる亜型であるが同じ型の病原体の大流行からの異なる病原体単離体を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  38. 前記異なる病原体単離体が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と異なる群であるが同じ科の病原体の大流行からの異なる病原体単離体を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  39. 前記異なる病原体単離体が、広域中和免疫応答を誘導することが望ましい病原体と同じ亜型、型、または科の病原体の異なる過去の病原体単離体を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  40. 各々の候補最適化抗原性病原体ポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸残基を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  41. 前記病原体がウイルスである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  42. 前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ウイルスが新興または再興ＲＮＡウイルスである、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記ウイルスがフィロウイルス、アレナウイルス、またはオルトミクソウイルスである、請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
  45. 前記ウイルスがエボラウイルスまたはマールブルグウイルスである、請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
  46. 前記ウイルスがラッサウイルスである、請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
  47. 前記病原体ポリペプチドがウイルス糖タンパク質である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  48. ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  49. 病原体に対する広域中和免疫応答を誘導することが可能な最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする核酸配列を同定する方法であって、
    ｉ）先行請求項のいずれかに記載の方法によって同定されたリード候補最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸によって、ヒトまたは非ヒト動物を免疫するステップ；
    ｉｉ）広域中和免疫応答が、ステップ（ｉ）における免疫後に前記ヒトまたは前記非ヒト動物において誘導されたか否かを決定するステップ；および
    ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）から広域中和免疫応答が前記ヒトまたは前記非ヒト動物において誘導されることが決定される場合、前記核酸配列を、前記病原体に対する広域中和免疫応答を誘導することが可能な最適化抗原性病原体ポリペプチドをコードする核酸配列であると同定するステップ
    を含む、方法。
  50. 前記ヒトまたは前記非ヒト動物から得られた血清中の抗体が１つより多くの病原体亜型に結合するおよび／またはそれを中和するか否かを決定することによって、広域中和免疫応答が前記ヒトまたは前記非ヒト動物において誘導されるか否かを決定するステップを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記非ヒト動物が哺乳動物である、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 前記哺乳動物がモルモットまたはマウスである、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記非ヒト動物が鳥である、請求項４９または５０に記載の方法。
  54. ｉ）配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１と同一である；
    ｉｉ）配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２と同一である；
    ｉｉｉ）配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号４と同一である；
    ｉｖ）配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号５と同一である；
    ｖ）配列番号７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号７と同一である；または
    ｖｉ）配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号８と同一である
    核酸配列、またはその相補体を含む単離された核酸分子。
  55. ｉ）配列番号１０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１０と同一である；
    ｉｉ）配列番号１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１２と同一である；または
    ｉｉｉ）配列番号１４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１４と同一である
    核酸配列、またはその相補体を含む単離された核酸分子。
  56. ｉ）配列番号１９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１９と同一である；
    ｉｉ）配列番号２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２１と同一である；
    ｉｉｉ）配列番号２３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２３と同一である；
    ｉｖ）配列番号２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２５と同一である；
    ｖ）配列番号２７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２７と同一である；
    ｖｉ）配列番号２９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２９と同一である；または
    ｖｉｉ）配列番号３１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号３１と同一である
    核酸配列、またはその相補体を含む単離された核酸分子。
  57. ｉ）配列番号１によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｉｉ）配列番号２によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｉｉｉ）配列番号４によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号４によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｉｖ）配列番号５によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号５によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｖ）配列番号７によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号７によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｖｉ）配列番号８によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号８によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｖｉｉ）配列番号１０によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１０によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｖｉｉｉ）配列番号１２によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１２によってコードされるアミノ酸配列と同一である；
    ｉｘ）配列番号１４によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１４によってコードされるアミノ酸配列と同一である
    アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  58. ｉ）配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号３と同一である；
    ｉｉ）配列番号６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号６と同一である；
    ｉｉｉ）配列番号９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号９と同一である；
    ｉｖ）配列番号１１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１１と同一である；
    ｖ）配列番号１３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１３と同一である；または
    ｖｉ）配列番号１５と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１５と同一である
    アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  59. ｉ）配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号１８と同一である；
    ｉｉ）配列番号２０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２０と同一である；
    ｉｉｉ）配列番号２２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２２と同一である；
    ｉｖ）配列番号２４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２４と同一である；
    ｖ）配列番号２６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２６と同一である；
    ｖｉ）配列番号２８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号２８と同一である；または
    ｖｉｉ）配列番号３０と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または配列番号３０と同一である
    アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
  60. 哺乳動物細胞中における発現のためにコドン最適化、必要に応じて遺伝子最適化されている、請求項５４、５５、または５６に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
  61. 哺乳動物細胞中における発現のためにコドン最適化、必要に応じて遺伝子最適化されている、請求項５７、５８、または５９に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  62. 請求項５４、５５、５６、６０、または６１に記載の核酸を含むベクター。
  63. 前記核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項６２に記載のベクター。
  64. 前記プロモーターが、哺乳動物細胞中の前記核酸によってコードされるポリペプチドの発現のためである、請求項６３に記載のベクター。
  65. 前記プロモーターが、酵母または昆虫細胞中の前記核酸によってコードされるポリペプチドの発現のためである、請求項６３に記載のベクター。
  66. ワクチンベクターである、請求項６２から６５のいずれかに記載のベクター。
  67. ウイルスワクチンベクター、細菌ワクチンベクター、ＲＮＡワクチンベクター、またはＤＮＡワクチンベクターである、請求項６６に記載のベクター。
  68. 請求項６２から６５のいずれかに記載のベクターを含む単離された細胞。
  69. 請求項５７、５８、または５９に記載のポリペプチドを含むシュードタイプ化ウイルス粒子。
  70. 請求項６２から６４のいずれかに記載のベクターを宿主細胞にトランスフェクトするステップを含む、請求項６９に記載のシュードタイプ化ウイルス粒子を産生する方法。
  71. 請求項５７、５８、または５９に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
  72. 請求項５４、５５、５６、６０、または６１に記載の核酸、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
  73. 請求項６２から６４、６６、または６７のいずれかに記載のベクター、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
  74. 請求項５７、５８、または５９に記載のポリペプチド、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
  75. 前記組成物の前記ポリペプチド、または前記核酸によってコードされるポリペプチドに対する被験体における免疫応答を増強するためのアジュバントをさらに含む、請求項７２から７４のいずれかに記載の医薬組成物。
  76. 被験体においてＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項５４、５５、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５７もしくは５８に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
  77. Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、請求項５４、５５、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５７もしくは５８に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
  78. 被験体においてＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項５６、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５９に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
  79. Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、請求項５６、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５９に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
  80. 前記組成物が筋肉内投与される、請求項７６から７９のいずれかに記載の方法。
  81. ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩエンドヌクレアーゼ部位を含むマルチクローニングサイトを含む、核酸発現ベクター。
  82. 前記マルチクローニングサイトが、配列番号１６の核酸配列を含む、請求項８１に記載のベクター。
  83. 発現ベクター、およびウイルスシュードタイプベクターである、請求項８１または８２に記載のベクター。
  84. ワクチンベクターである、請求項８１から８３のいずれかに記載のベクター。
  85. ５’から３’方向に、プロモーター；スプライスドナー部位；スプライスアクセプター部位；およびターミネーターシグナルを含み、前記マルチクローニングサイトが前記スプライスアクセプター部位と前記ターミネーターシグナルとの間に位置する、請求項８１から８４のいずれかに記載のベクター。
  86. 前記プロモーターがＣＭＶ前初期１エンハンサー／プロモーターを含む、および／または前記ターミネーターシグナルがＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を欠如するウシ成長ホルモン遺伝子のターミネーターシグナルを含む、請求項８５に記載のベクター。
  87. 複製起点、および抗生物質に対する耐性をコードする核酸をさらに含む、請求項８１から８６のいずれかに記載のベクター。
  88. 前記複製起点が、ｐＵＣ－プラスミド複製起点を含む、および／または前記核酸がカナマイシンに対する耐性をコードする、請求項８７に記載のベクター。
  89. 配列番号１７の核酸配列を含む、請求項８１から８８のいずれかに記載のベクター。
  90. 配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  91. 配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  92. 配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む組成物。
  93. 配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む組成物。
  94. （ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む組合せ調製物。
  95. （ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸、および（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含む組合せ調製物。
  96. 配列番号６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組成物。
  97. 配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組成物。
  98. 配列番号６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む融合タンパク質。
  99. 配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む融合タンパク質。
  100. （ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組合せ調製物。
  101. （ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含む組合せ調製物。
  102. 医薬として使用するための、請求項５４、５５、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５７もしくは５８に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物。
  103. ウイルス感染、好ましくは新興または再興ウイルス、好ましくはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染の処置に使用するための、請求項５４、５５、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５７もしくは５８に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物。
  104. ウイルス感染、好ましくは新興または再興ウイルス、好ましくはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染の処置のための医薬の製造における、請求項５４、５５、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５７もしくは５８に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
  105. 医薬として使用するための、請求項５６、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５９に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物。
  106. ウイルス感染、好ましくは新興または再興ウイルス、好ましくはＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染の処置に使用するための、請求項５６、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５９に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物。
  107. ウイルス感染、好ましくは新興または再興ウイルス、好ましくはＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染の処置のための医薬の製造における、請求項５６、６０、もしくは６１のいずれかに記載の核酸、請求項５９に記載のポリペプチド、請求項６２から６４、６６、もしくは６７のいずれかに記載のベクター、または請求項７２から７５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
  108. 医薬として使用するための、請求項９０もしくは９１に記載の核酸、請求項９２、９３、９６、もしくは９７に記載の組成物、請求項９４、９５、１００、もしくは１０１に記載の組合せ調製物、または請求項９８もしくは９９に記載の融合タンパク質。
  109. ウイルス感染、好ましくは新興または再興ウイルス、好ましくはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染の処置に使用するための、請求項９０もしくは９１に記載の核酸、請求項９２、９３、９６、もしくは９７に記載の組成物、請求項９４、９５、１００、もしくは１０１に記載の組合せ調製物、または請求項９８もしくは９９に記載の融合タンパク質。
  110. ウイルス感染、好ましくは新興または再興ウイルス、好ましくはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染の処置のための医薬の製造における、請求項９０もしくは９１に記載の核酸、請求項９２、９３、９６、もしくは９７に記載の組成物、請求項９４、９５、１００、もしくは１０１に記載の組合せ調製物、または請求項９８もしくは９９に記載の融合タンパク質の使用。
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