JP2022512773A - 加齢関連クローン性造血およびそれに関係する疾患の予防 - Google Patents

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Abstract

スプライシング因子における１つ以上の変異について陽性である、高リスク対象における造血障害または悪性腫瘍を予防する方法が開示される。方法は、スプライソソーム活性を阻害することができるが、ＲＢＭ３９活性を阻害しない薬剤を対象に投与することを含む。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１８年１０月２８日に出願されたイスラエル特許出願第２６２６５８号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の記載
本出願の出願と同時に提出された、１０９キロバイトを有する、７９２９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという表題のＡＳＣＩＩファイルは、２０１９年１０月２８日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、スプライソソーム機構変異を保有する高リスク対象における白血病の予防、より具体的には、限定されないが、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤の使用による白血病の予防に関する。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、転帰の改善が強く求められている血液悪性腫瘍である。最近の研究により、前白血病変異（ｐＬＭ）を保有する前白血病造血幹細胞および前駆細胞（ｐｒｅＬＨＳＰＣ）がＡＭＬおよびＭＤＳの起源細胞であることが発見され、これらの障害の病因の見解が変わった。ｐｒｅＬＨＳＰＣは、診断の数年前に白血病関連変異を獲得し、明白な疾患への形質転換の数年前までほぼ正常な機能を維持する。ｐＬＭは、ＡＭＬおよびＭＤＳの発症が予定される個体の間で発見され得るが、健康な個体の２０～３０％にも存在し、その大部分は生涯、ＡＭＬ／ＭＤＳを発症しない。明白な疾患を伴わないｐＬＭの存在は、加齢関連クローン性造血（ＡＲＣＨ）と呼ばれる。
ＡＭＬの初期段階におけるＡＲＣＨ体細胞事象の役割が最近研究された［Ａｂｅｌｓｏｎ ｅｔ．ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ（２０１８）５５９：４００－４０４（２０１８）］。特異的変異によってＡＭＬを診断の数年前に予測できるかどうかを理解するために、ＡＭＬ診断の平均７年前に末梢血（ＰＢ）を採取し、配列決定し、年齢が一致する対照とＡＲＣＨ事象について比較した。前ＡＭＬ症例および対照の両方における最も一般的な変異遺伝子がＤＮＭＴ３ａおよびＴＥＴ２変異であることが特定されたが、驚くべきことに、スプライソソーム機構変異（ＳＭＭ）は、前ＡＭＬにほぼ限定されていることが明らかになった。ＳＭＭを保有する５０～６０歳のほぼすべての個体がＡＭＬを発症した。前ＡＭＬの中では、対照と比較して、より若い年齢でＳＭＭが発生する傾向があった。明白なＭＤＳ／ＡＭＬにおけるＳＭＭは、ほとんどの場合、明白なＭＤＳ／ＡＭＬの有害な転帰に関連するＳＲＳＦ２およびＵ２ＡＦ１の変異によって、特定の 「ホットスポット」 残基においてＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２およびＵ２ＡＦ１に影響を及ぼす［Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７８：６４－６９；Ｐａｐａｅｍｍａｎｕｉｌ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２０１１）３６５：１３８４－１３９５；Ｇｒａｕｂｅｒｔ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（２０１２）４４：５３－５７］。前白血病の状況では、コドンＰ９５でのＳＲＳＦ２、ならびにコドンＳ３４およびＱ１５７でのＵ２ＡＦ１の変異は、圧倒的に前ＡＭＬ症例で見られた。Ｕ２ＡＦ１変異の保有者は、全員ＡＭＬを発症した。
ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２およびＵ２ＡＦ１におけるＳＭＭは一貫してヘテロ接合性であり非常に限定された残基において点変異として生じ、これらが発癌性の機能転換の変化であることを示唆する。これと一致して、これらの変化の各々を有する細胞のトランスクリプトーム分析により、これらの因子の各々における変異が、機能喪失とは異なる様式でスプライシングを変化させることが特定された。例えば、エクソンスプライシングエンハンサーに結合してスプライシングを促進する補助スプライシング因子であるＳＲＳＦ２に影響を及ぼす変異は、そのＲＮＡ結合優先性を配列特異的に変化させ、それによってエクソン封入の効率を変化させる。３’ｓｓでＡＧジヌクレオチドに結合するＵ２ＡＦヘテロ二量体の小サブユニットであるＵ２ＡＦ１に影響を及ぼす変異は、ＡＧジヌクレオチドに隣接する配列に基づいて３’ｓｓを促進または抑制する。
スプライシング機構に対するＳＦ３Ｂ１、Ｕ２ＡＦ１およびＳＲＳＦ２の変異の効果は互いに異なるが、これらの３つの因子に影響する変異が互いに排他的である理由は不明である。Ｓｒｓｆ２またはＳｆ３ｂ１における変異の誘導性発現を、単独でまたは合わせて有するマウスの評価によって、各変異が異なる様式でＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすことが明確に実証された。それにもかかわらず、これらの２つの変異は、同じ細胞で共発現された場合には許容されなかった。同様に、ヘミ接合性（Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＫＯ）またはホモ接合性（Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／Ｐ９５Ｈ）状態での変異型Ｓｒｓｆ２の発現により、造血機能が完全に失われた。まとめると、これらのデータは、ＳＭＭを有する細胞がスプライシングプロセスに対するさらなる遺伝的摂動に耐えられないことを示している［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２０１５）２７（５）：６１７－６３０］。
ＳＭＭ細胞は残りのＷＴ対立遺伝子の発現に依存し、共存するスプライソソーム遺伝子変異は合成致死であるので、ＳＭＭを発現する細胞がスプライソソーム機能を損なう化合物に感応し得るかどうかをさらに試験した。ＳＦ３Ｂ１に結合し、スプライソソームのＵ２ ｓｎＲＮＰ成分の活性を阻害する薬物Ｅ７１０７およびＨ３Ｂ－８８００を含む、スプライソソーム機能を損なう様々な化合物をＡＭＬ治療のために試験した。Ｅ７１０７の抗白血病効果は、ＳＲＳＦ２変異を有する、または有さない同質遺伝子型ＭＬＬ－ＡＦ９マウスＡＭＬモデルにおいて例証された。ここで、スプライソソーム－変異ＡＭＬは、同質遺伝子型スプライソソーム－ＷＴ対照物と比べて、インビボでのスプライシングの阻害に対して差次的に感応することが確認された［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１６）２２：６７２～６７８］。ＳＦ変異を有する、または有さないＡＭＬ患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルでは、スプライソソーム変異白血病はＥ７１０７に応答して、それらのＷＴ対照物よりもヒト白血病細胞量を大きく減少させたが、完全な根絶は達成できないことが示された［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｍｅｄ（２０１６）、前掲］。Ｈ３Ｂ－８８００と呼ばれる、Ｅ７１０７の経口で生物学的に利用可能な類似体もまた、スプライシング忠実度の用量依存的減少を誘導し、ＳＦ３Ｂ１およびＳＲＳＦ２変異ＡＭＬならびに慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）において優先的効果を示した［Ｓｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１８）２４（４）：４９７－５０４］。
さらなる背景技術には、以下が含まれる。
米国特許出願第２０１５００２５０１７号は、１つ以上のスプライソソームタンパク質ＰＨＦ５Ａ、Ｕ２ＡＦ１またはＤＤＸ１のアンタゴニストを用いて癌を治療するための組成物および方法を開示している。そのようなスプライソソーム阻害剤には、スデマイシン、スプライソスタチン、ＦＲ９０１４６４、プラジエノリド、Ｅ７１０７、ヘルボキシジエンおよびメアヤマイシンが含まれる。
米国特許出願第２０１４０３６４４３９号は、ＳＦ３Ｂ１を調節する化合物、例えば、スプライソスタチン、Ｅ７１０７、またはプラジエノリドの投与による慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療を開示している。
米国特許出願第２０１６０２７１１４９号は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を抑制して腫瘍増殖を低減する治療化合物を開示している。
米国特許出願第２０１８０１４０５７８号は、スプライシング因子（すなわち、Ｕ２ＡＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、およびＺＲＳＲ２）に変異を示し、かつ／または対照と比較してＤＣＡＦ１５の量が増加している対象における癌を治療する方法を開示している。治療は、対象におけるＲＢＭ３９の活性を、例えばアリールスルホンアミド（例えば、インジスラム、タシスラム、クロロキノキサリンスルホンアミド）の使用によって阻害することで行われる。
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、スプライシング因子の１つ以上の変異について陽性である高リスク対象における造血障害または悪性腫瘍を予防する方法が提供され、方法は、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤を対象に投与することを含み、薬剤はＲＢＭ３９活性を阻害しない。
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、スプライシング因子の１つ以上の変異について陽性である高リスク対象における造血障害または悪性腫瘍の予防に使用するための、ＲＢＭ３９活性を阻害せずにスプライソソーム活性を阻害することができる薬剤が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤は、ＥＣ番号２．１．１．３１９、２．１．１．３２０または２．１．１．３２１に示されるような、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）を阻害することができる薬剤である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤は、スプライシング阻害剤である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤は、プロテアソーム分解化合物である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＲＭＴは、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ １）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ ３）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ ４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ ５）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ ６）およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ ９）からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＲＭＴを阻害することができる薬剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小分子である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤ＭＳ－０２３二塩酸塩、またはその誘導体もしくは類似体である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＲＭＴは、ＰＲＭＴ５を含み、薬剤は、ＧＳＫ５９１二塩酸塩またはＧＳＫ３３２６５９５、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＲＭＴは、ＰＲＭＴ１を含み、薬剤は、Ｃ－２１、フラミジン二塩酸塩またはＴＣ－Ｅ ５００３、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＲＭＴは、ＰＲＭＴ３を含み、薬剤は、ＳＧＣ７０７またはＵＮＣ２３２７、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＲＭＴは、ＰＲＭＴ４を含み、薬剤は、ＭＳ０４９シュウ酸塩またはＴＰ０６４、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＲＭＴはＰＲＭＴ６を含み、薬剤はＭＳ０４９シュウ酸塩、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、スプライシング阻害剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小分子である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、スプライシング阻害剤は、スデマイシン、スプライソスタチン、ＦＲ９０１４６４、プラジエノライド、ヘルボキシジエン、メアヤマイシン、イソギンクゲチン、マドラシン（Ｍａｄｒａｓｉｎ）、テトロカルシン、Ｎ－パルミトイル－Ｌ－ロイシン、プソロム酸、クロトリマゾール、ＮＳＣ６３５３２６、ナプタザリン、エリスロマイシン、ＳＡＨＡ、ガルシノール、オカダ酸、ＮＢ－５０６、ユビスタチン、Ｇ５、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、スプライシング阻害剤は、Ｅ７１０７、Ｈ３Ｂ－８８００、ＦＤ－８９５、ＧＥＸ１Ｑ１－５、ＲＱＮ－１８６９０、ＮＳＣ６５９９９９、ＢＮ８２８６５、ＮＳＣ９５３９７、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、スプライトマイシン、タウトマイシン、ミクロシスチン、ジオスピリン、クロルヘキシジンまたはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、プロテアソーム分解化合物は、ＳＦ３ｂ複合体のコアメンバー、Ｕ２ＡＦ複合体、またはＰＲＭＴ酵素およびＲＮＡ結合タンパク質からなる群から選択されるスプライソソーム関連タンパク質を標的とする。
本発明のいくつかの実施形態によれば、プロテアソーム分解化合物は、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＰＨＦ５ａ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＰＲＭＴ５、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ２、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、ＰＲＭＴ８、ＳＵＰＴ６Ｈ、ｈｎＲＮＰＨおよびＳＲＳＦ１０からなる群から選択されるスプライソソーム関連タンパク質を標的とする。
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、Ｕ２ＡＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、およびＺＲＳＲ２からなる群から選択されるスプライシング因子における変異である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、点変異である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、点変異は、挿入、欠失または置換である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、Ｕ２ＡＦ１ポリペプチドのＳ３４またはＱ１５７における変異である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドにおけるＲ６２５Ｌ、Ｎ６２６Ｈ、Ｋ７００Ｅ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｑ９０３Ｒ、Ｅ６２２Ｄ、Ｒ６２５Ｇ、Ｑ６５９Ｒ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｄ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ６６６ＲまたはＧ７４２Ｄの変異である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、ＳＲＳＦ２ポリペプチドにおけるＰ９５の変異である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、前白血病性造血幹細胞および前駆細胞において検出される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、変異は、対象の生物学的サンプルにおいて検出される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、造血障害または造血悪性腫瘍は、白血病である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、造血障害また造血悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はヒト対象である。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。
本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、単なる例として本明細書に記載されている。以下の図面に関する詳細な具体的な言及と共に、示されている詳細は例示のためのものであり、本発明の実施形態の例示的な説明のためのものであることを強調する。この点に関して、図面を用いてなされた説明により、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
スプライシングに対するＰＲＭＴ阻害の効果を示す。（図１Ａ）スプライシング制御におけるＰＲＭＴ５およびＩ型ＰＲＭＴの役割の図である。ＰＲＭＴは、スプライシングタンパク質上のアルギニンをメチル化してスプライソソーム集合を促進し、適切なスプライシング機能に必要とされる。ＰＲＭＴ５阻害剤ＧＳＫ５９１（図１Ｂ）、またはＰＲＭＴ１阻害剤ＭＳ－０２３（図１Ｃ）に曝露したスプライソソーム変異急性骨髄性白血病細胞またはそれらのＷＴ対照物のＩＣ５０曲線。（図１Ｂ）および（図１Ｄ）それぞれの細胞からの、（図１Ｄ）対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）または（図１Ｅ）非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）のウエスタンブロット。 ＳＭＭ、またはＰＲＭＴ５の部分的喪失を伴うＡＭＬ細胞の、スプライシング、ＰＲＭＴまたはＬＳＤ１の阻害剤に対する薬物感受性を示す。ＭＬＬ－ＡＦ９ Ｓｒｓｆ２ＷＴ／ＷＴ；ＭＬＬ－ＡＦ９ Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴまたはＭＬＬ－ＡＦ９ Ｐｒｍｔ ５＋／－細胞を、示された化合物によって（化合物ごとに、５つの上昇させた濃度）３８４ウェル中で７日間処理した。７日目の生存率をＭＴＳアッセイによって記録し、対照処理細胞（ＤＭＳＯで同等に希釈）に対する比として報告した。実験は生物学的トリプリケートで実行し、それぞれ個々の実行をテクニカルトリプリケートで繰り返した。 ＳＭＭ ＡＭＬがＩ型またはＩＩ型ＰＲＭＴの阻害に対して優先的に感応することを示す。ＭＬＬ－ＡＦ ９／Ｓｒｓｆ２ＷＴ細胞（黒色）またはＭＬＬ－ＡＦ ９／Ｓｒｓｆ２変異細胞（赤色）を移植し、続いてＰＲＭＴ５阻害剤ＧＳＫ５９１（左）またはＩ型ＰＲＭＴ阻害剤ＭＳ－０２３（右）で処置したレシピエントマウスのカプラン・マイヤー曲線。 スルホンアミドがＲＢＭ３９の分解によってＳＭＭ細胞に優先的効果を示すことを示す。（図４Ａ）スルホンアミドはＲＢＭ３９をＣＵＬ４－ＤＤＢ１－ＤＤＡ１－ＤＣＡＦ１５ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体に架橋し、ＲＢＭ３９のポリユビキチン化およびプロテアソーム分解をもたらす。同質遺伝子型の（図４Ｂ）Ｋ５６２および（図４Ｃ）ＮＡＬＭ６ ＷＴまたはＳＦ３Ｂ１変異体におけるスルホンアミドＥ７８２０のＩＣ５０曲線。（図４Ｄ）１ｍＭのスルホンアミドインジスラムまたはＥ７８２０に暴露した、（図４Ｃ）の細胞からのＲＢＭ３９のレベルのウエスタンブロット。 スプライソソーム変異造血細胞がインジスラムに対して優先的に応答することを示す。（図５Ａ）同質遺伝子型Ｋ５６２細胞（左）およびＮＡＬＭ－６細胞（右）のインジスラムに対するＩＣ５０プロット。これらは、内因性遺伝子座にスプライソソーム遺伝子変異が導入された細胞である。（図５Ｂ）インジスラムの漸増投与での（図５Ａ）のＫ５６２細胞におけるＲＢＭ３９のウエスタンブロット。（図５Ｃ）スプライシング因子に自然発生する変異を伴うＡＭＬ細胞株の、インジスラムに対する応答のＬｏｇ１０ ＩＣ５０ウォーターフォールプロット。赤色棒は、スプライシング因子に自然発生する変異を伴う細胞を表す。（図５Ｄ）親細胞、ＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ／ＷＴおよびＳＲＳＦ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴ Ｋ ５６２細胞にわたる差次的スプライシング事象の数の棒グラフ。各棒の上の数字は、差次的にスプライシングされた事象の数を示す。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、スプライソソーム機構変異を保有する高リスク対象における白血病の予防、より具体的には、限定されないが、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤の使用による白血病の予防に関する。
本発明の原理および作用は、図面および添付の説明を参照してよりよく理解され得る。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明のためのものであり、限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。
最近の研究により、前白血病変異（ｐＬＭ）を保有する前白血病造血幹細胞および前駆細胞（ｐｒｅＬＨＳＰＣ）がＡＭＬおよびＭＤＳの起源細胞であることが発見され、ＡＭＬおよびＭＤＳの病因の見解が変わった。ｐｒｅＬＨＳＰＣは、診断の数年前に白血病関連変異を獲得し、明白な疾患への形質転換の数年前までほぼ正常な機能を維持する。ｐＬＭは、ＡＭＬおよびＭＤＳの発症が予定される個体の間で発見され得るが、健康な個体の２０～３０％にも存在し、その大部分は生涯、ＡＭＬ／ＭＤＳを発症しない。ＡＭＬ／ＭＤＳのリスクがある、加齢関連クローン性造血（ＡＲＣＨ）を有する個体の特定は、ＭＤＳおよびＡＭＬの有病率および治療に重要な意味を有し得る大きな課題である。
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、臨床パラメータに基づいて前白血病を発症することが予定されている、ＡＲＣＨを有する患者を治療するための手段を発見し、したがって、これらの患者における前白血病の発症を予防するための手段を発見した。
具体的には、本発明者らは、スプライソソーム機構変異（ＳＭＭ）の存在が前白血病を高度に予測し、ＡＲＣＨを有する高リスク個体を、疾患を発症する前の時点で特定および治療するために使用できることを確認した。さらに、本発明者らは、スプライソソーム阻害剤（例えば、Ｅ７１０１、Ｈ３Ｂ－８８００）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を抑制する化合物（例えば、ＧＳＫ５９１、ＧＳＫ３３２６５９５）および／またはプロテアソーム分解化合物（例えば、スルホンアミド系薬物）を含むスプライシング阻害剤を使用して、高リスクの健康な個体においてＳＭＭを保有する（例えば、それらの末梢血にＳＲＳＦ２またはＵ２ＡＦ１ホットスポット変異を保有する）前白血病細胞を標的化し、それによってＳＭＭを保有する細胞のクローンサイズを減少させ、それらのさらなる増殖を予防し、疾患発症を予防または遅延させることができることを示した。
したがって、本発明の１つの態様によれば、スプライシング因子の１つ以上の変異について陽性である高リスク対象における造血障害または悪性腫瘍を予防する方法が提供され、方法は、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤を対象に投与することを含み、薬剤はＲＢＭ３９活性を阻害しない。
本発明の１つの態様によれば、スプライシング因子の１つ以上の変異について陽性である高リスク対象における造血障害または悪性腫瘍の予防に使用するための、ＲＢＭ３９活性を阻害せずにスプライソソーム活性を阻害することができる薬剤が提供される。
特定の実施形態によれば、薬剤は、ＲＢＭ３９活性を直接阻害しない。
本明細書で使用される「直接阻害する」という語句は、ＲＢＭ３９と相互作用し、その生物学的活性を阻害する薬剤を指す。
１つの実施形態によれば、薬剤は、ＲＢＭ３９分解を直接促進しない。
本明細書で使用される「スプライソソーム」という用語は、多くの真核生物の遺伝子転写を中断する、イントロン配列の除去を担う高分子複合体を指す。スプライソソームは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５およびＵ６として知られる５つの核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）と、１００を超えるさらなるタンパク質とから構成される。
本明細書で使用される場合、「スプライシング因子」という用語は、スプライソソーム上のｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングに関与するタンパク質のいずれかを指す。例示的なスプライシング因子としては、これらに限定されないが、Ｕ２ＡＦ１（Ｕ２ＡＦ３５としても知られるＵ２核内低分子ＲＮＡ補助因子１、例えばアクセション番号ＮＭ＿００１０２５２０３．１（配列番号１）、ＮＭ＿００１０２５２０４．１（配列番号２）またはＮＭ＿００６７５８．２（配列番号３）（ｍＲＮＡ）、またはＮＰ＿００６７４９．１（配列番号４）、ＮＰ＿００１０２０３７５．１（配列番号５）またはＮＰ＿００１０２０３７４．１（配列番号６）（タンパク質）を有する）、スプライソソームのＵ２ ｓｎＲＮＰ複合体の成分；ＳＦ３Ｂ１（ＳＦ３Ｂ１５５またはＳＡＰ１５５としても知られるスプライシング因子３ｂサブユニット１、例えばアクセション番号ＮＭ＿００１００５５２６．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７），ＮＭ＿００１３０８８２４．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）またはＮＭ＿０１２４３３．３（配列番号９）（ｍＲＮＡ）、またはＮＰ＿００１２９５７５３．１（配列番号１０）、ＮＰ＿００１００５５２６．１（配列番号１１）またはＮＰ＿０３６５６５．２（配列番号１２）（タンパク質）を有する）；ＳＲＳＦ２（ＳＣ３５またはＳＦＲＳ２としても知られるセリンおよびアルギニンリッチスプライシング因子２、例えばアクセション番号ＮＭ＿００１１９５４２７．１（配列番号１３）、ＮＭ＿００３０１６．４（配列番号１４）またはＸＭ＿０１７０２４９４２．２（配列番号１５）（ｍＲＮＡ）、またはＮＰ＿００３００７．２（配列番号１６）、ＮＰ＿００１１８２３５６．１（配列番号１７）またはＸＰ＿０１６８８０４３１．１（配列番号１８）（タンパク質）を有する）；およびＺＲＳＲ２（ＵＲＰとしても知られるＵ２核内低分子リボ核タンパク質補助因子３５ｋＤａサブユニット関連タンパク質２、例えば、アクセション番号ＮＭ＿００５０８９．３（配列番号１９）、ＸＭ＿００５２７４５９７．３（配列番号２０）、ＸＭ＿０１１５４５５８９．３（配列番号２１）、ＸＭ＿０１７０２９８８１．２（配列番号２２）またはＸＭ＿０１７０２９８８２．２（配列番号２３）（ｍＲＮＡ）、またはＸＰ＿０２４３０８２２３．１（配列番号２４）、ＸＰ＿０１６８８５３７１．１（配列番号２５）、ＸＰ＿０１６８８５３７２．１（配列番号２６）、ＮＰ＿００５０８０．１（配列番号２７）、またはＸＰ＿００５２７４６５４．２（配列番号２８）（タンパク質）を有する）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、スプライソソーム機構変異（ＳＭＭ）と呼ばれるスプライシング因子の１つ以上の変異を、造血障害または悪性腫瘍の検出および予防に使用することができる。そのような変異は、典型的にスプライソソーム遺伝子産物（例えば、スプライソソームタンパク質）に影響を及ぼし、不完全な細胞スプライシング機構をもたらし、その結果、タンパク質コードＲＮＡにメッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）の不完全なＲＮＡスプライシングをもたらす。
１つの実施形態によれば、変異は体細胞変異である。
１つの実施形態によれば、変異は点変異である。
１つの実施形態によれば、点変異は、挿入、欠失または置換である。
１つの実施形態によれば、変異は、単一ヌクレオチドの変異である（例えば、挿入、欠失または置換）。あるいは、変異は、少なくとも２、３、４、５、１０またはそれ以上のヌクレオチドの変異であり得る。
１つの実施形態によれば、変異は、ミスセンス変異をもたらす。
特定の実施形態によれば、変異は、Ｕ２ＡＦ１ポリペプチドにおける残基Ｓ３４またはＱ１５７の変異である。したがって、例えば、変異は、Ｕ２ＡＦ１遺伝子から翻訳されたタンパク質のアミノ酸３４におけるＳからＦまたはＹへの置換（例えば、配列番号４および６に示すもの）であり得る。別の例によれば、変異は、Ｕ２ＡＦ１遺伝子から翻訳されたタンパク質のアミノ酸１５７におけるＱからＰまたはＲへの置換であり得る（例えば、配列番号４および６に示すもの）。
特定の実施形態によれば、変異は、ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドにおける残基Ｒ６２５、Ｎ６２６、Ｋ７００、Ｇ７４０、Ｋ７４１、Ｑ９０３、Ｅ６２２、Ｒ６２５、Ｑ６５９、Ｈ６６２、Ｋ６６６またはＧ７４２の変異である。したがって、例えば、変異は、ＳＦ３Ｂ１遺伝子から翻訳されたタンパク質の、アミノ酸６２５におけるＲからＬへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸６２６におけるＮからＨへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸６６２におけるＨからＱまたはＤへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸７００におけるＫからＥへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸７４０におけるＧからＥへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸７４１におけるＫからＮへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸９０３におけるＱからＲへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸６２２におけるＥからＤへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸６２５におけるＲからＧへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸６５９におけるＱからＲへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸６６６におけるＫからＮ、Ｔ、Ｅ、ＲまたはＱへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）；アミノ酸７４２におけるＧからＤへの置換（例えば、配列番号１２に示されるもの）であり得る。
特定の実施形態によれば、変異は、ＳＲＳＦ２ポリペプチドにおける残基Ｐ９５の変異である。したがって、例えば、変異は、ＳＲＳＦ２遺伝子から翻訳されたタンパク質のアミノ酸９５におけるＰからＨ、ＬまたはＲへの置換（例えば、配列番号１６～１８に示されるもの）であり得る。
いくつかの実施形態では、対象は、健康な対象よりも高いＤＣＡＦ１５のレベルを示す。
本明細書で使用される「健康な対象」という用語は、スプライシング因子に変異を有さず、造血障害または悪性と診断されておらず、造血障害または悪性の症状に罹患しておらず、造血障害または悪性腫瘍を発症するリスクが高くない対象を指す（以下に考察される）。
本明細書で使用される場合、「ＤＣＡＦ１５」という用語は、アクセッション番号ＮＰ＿６１２３６２．２（配列番号３０）（タンパク質）またはＮＭ＿１３８３５３．３（配列番号２９）（ｍＲＮＡ）を有する、ホモサピエンス由来のＤＤＢ１ Ａｎｄ ＣＵＬ４ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ １５を指す。
特定の実施形態では、スプライシング因子（例えば、Ｕ２ＡＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、およびＺＲＳＲ２）の変異を示す対象は、健康な対象と比較して、ＤＣＡＦ１５のレベルが上昇している。
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、変異を検出することができる。例えば、実施され得る染色体およびＤＮＡ染色方法には、これらに限定されないが、
例えばＱｕｉｊａｄａ－Ａｌａｍｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；１０：８３で教示される、間期染色体の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析；
遺伝子欠失の検出（Ｔｈａｒａｐｅｌ ＳＡ ａｎｄ Ｋａｄａｎｄａｌｅ ＪＳ，２００２．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１０７：１２３－１２６）、胎児の性別の判定（Ｏｒｓｅｔｔｉ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．、１９９８．Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．１８：１０１４－１０２２）、および染色体異数性の同定（Ｍｅｎｎｉｃｋｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２００３．Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．１８：１１４－１２１）に用いられるＰＲＩＮＳ分析；
Ｌｅｍｋｅ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７１：１０５１－１０５９，２００２）によって詳細に記載されている、ＹＡＣ／ＢＡＣおよび領域特異的顕微解剖ＤＮＡライブラリーを間期染色体用のＤＮＡプローブとして使用する、間期染色体の高解像度マルチカラーバンディング（ＭＣＢ）；
特異的プローブの蛍光強度の変動を測定することによって染色体異常を検出する定量的ＦＩＳＨ（Ｑ－ＦＩＳＨ）、が含まれる。Ｑ－ＦＩＳＨは、以前に記載されたように（Ｐｅｌｌｅｓｔｏｒ ＦおよびＰａｕｌａｓｏｖａ Ｐ、２００４；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １１２：３７５－３８０）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチドプローブを使用して実施することができる。あるいは、Ｔｒｕｏｎｇ Ｋ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２３：１４６－５１に記載されているように、間期核で全染色体ペインティングプローブ（例えば、染色体２１および２２用）を共ハイブリダイズさせることによって、Ｑ－ＦＩＳＨを実施することができる。
追加的または代替的に、スプライシング因子遺伝子における配列変化、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）を決定するために、限定するものではないが、以下を含む様々な方法を使用することができる。
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）－この方法は、ＲＦＬＰの生成または破壊をもたらす制限酵素の認識部位を修飾する、単一ヌクレオチド（ＳＮＰヌクレオチド）の変化を使用する。ＤＮＡヘテロ二重鎖の単一ヌクレオチドのミスマッチも認識され、いくつかの化学物質によって切断され、一般に「ミスマッチ化学的切断」（ＭＣＣ）（Ｇｏｇｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：６８０７－６８１７、１９９０）と呼ばれる、単一塩基置換を検出するための代替戦略を提供する。しかしながら、この方法は、臨床検査室での使用に適さない非常に有害な２つの化学物質、すなわち四酸化オスミウムおよびピペリジンの使用を必要とする。
配列決定分析－単離されたＤＮＡは、ダイターミネーター（非標識プライマーおよび標識ジデオキシヌクレオチド）またはダイプライマー（標識プライマーおよび非標識ジデオキシヌクレオチド）サイクル配列決定プロトコルを使用して、自動化ジデオキシターミネーター配列決定反応に供される。ダイターミネーター反応では、非標識ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ反応を実施し、続いてプライマー、デオキシヌクレオチドおよび標識ジデオキシヌクレオチドミックスのうちの１つの存在下で配列決定反応を実施する。ダイプライマー反応では、ユニバーサルプライマーまたはリバースプライマー（各方向に１つ）にコンジュゲートしたＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ反応を実施し、続いてユニバーサル配列またはリバース配列に特異的な標識プライマーおよび対応する非標識ジデオキシヌクレオチドをそれぞれ含む４つの個別のミックス（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔヌクレオチドに対応する）の存在下で配列決定反応を実施する。
マイクロシーケンシング分析－この分析は、上記のような増幅反応（ＰＣＲ）によって得ることができるスプライシング因子遺伝子の特定の領域に対してマイクロシーケンシング反応を行うことによって達成され得る。マイクロシーケンシングプロトコルは、例えば、Ｎｙｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０８（１）：１７１～１７５およびＰａｓｔｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：６０６～６１４に記載されている。
ポリメラーゼおよびリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイ－「オリゴヌクレオチド連結アッセイ」（ＯＬＡ）は、標的分子の一本鎖の隣接配列にハイブリダイズできるように設計された２つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの一方はビオチン化されており、他方は検出可能に標識されている。ＯＬＡは、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３－８９２７に記載のとおり、一塩基多型を検出することができ、ＰＣＲと有利に組み合わせてもよい。
Ｌｉｇａｓｅ／Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）－核酸分子の予め選択された部位におけるヌクレオチドの同一性を決定するための別の方法（国際公開第９５／２１２７１号に記載）。
ハイブリダイゼーションアッセイ方法－一塩基変化の検出を可能にするハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、１０、１５、２０、または３０～１００ヌクレオチド長であり得るオリゴヌクレオチドの使用に依存する。米国特許第５，４５１，５０３号は、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡ中のＳＮＰを検出するために利用され得るオリゴヌクレオチド配置のいくつかの例を提供している。
オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション－例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子での、出芽酵母変異株での、およびＨＩＶ－１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子での変異のスクリーニングのために記載されるチップ／アレイ技術［Ｈａｃｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１９９６；１４（４）：４４１－４４７；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９６；１４（４）：４５０－４５６；Ｋｏｚａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９６；２（７）：７５３－７５９を参照のこと］。
集積システム－配列変化を分析するために使用され得る別の技術は、単一の機能装置内でＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動反応などのプロセスを小型化および区画化する、多成分集積システムを含む。そのような技術の例は、ＰＣＲ増幅およびキャピラリー電気泳動のチップへの集積について記載する、米国特許第５，５８９，１３６号に開示されている。
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）－この方法では、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、プライマー伸長またはライゲーション事象がマッチまたはミスマッチの指標として使用され得るように、多型ヌクレオチドに近接してハイブリダイズするように設計される。放射性標識された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とのハイブリダイゼーションもまた、特異的ＳＮＰの検出に適用されている（Ｃｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０：２７８－２８２，１９８３）。
使用され得るさらなる配列決定方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）分析（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）、Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ（商標）分析（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）、米国特許出願第２０１５００２５０１７号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている配列決定方法、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）、マイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技法、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
追加的または代替的に、変異の検出は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列分析、例えば、気相シークエンサー、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）／酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫特異性反応を利用するエドマン法を用いて、または質量分析法、例えば、Ｑ－ＴＯＦ／ＭＳ法によってポリペプチドレベルで行われ得る。
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、疾患または障害のリスクがあり得るが、疾患または障害、例えば造血障害または悪性腫瘍（例えば、白血病またはＭＤＳ）を有するとまだ診断されていない対象において、疾患、障害または状態の発生を防ぐことを指す。
本明細書で使用される場合、「対象」または「それを必要とする対象」という用語は、病理、例えば造血障害または悪性腫瘍（例えば、白血病またはＭＤＳ）を発症するリスクがある、あらゆる年齢または性別の哺乳動物、好ましくはヒトを含む動物を指す。
１つの実施形態によれば、対象は、定期的な健康診断を受けている。
１つの実施形態によれば、対象は、７０歳未満、６５歳未満、６０歳未満、５５歳未満、５０歳未満、４５歳未満、４０歳未満、３５歳未満、３０歳未満、２５歳未満または２０歳未満である。
１つの実施形態によれば、対象は、造血障害または悪性腫瘍を発症するリスクがあり（例えば、造血障害または悪性腫瘍を発症する遺伝的または他の素因を有するヒト）、造血障害または悪性腫瘍（例えば、白血病またはＭＤＳ）と診断されていない。
特定の実施形態によれば、対象は、スプライシング因子に少なくとも１つの変異を有するが、造血器悪性腫瘍の症状、例えば、（末梢血変異体対立遺伝子頻度（ＰＢ－ＶＡＦ）によって測定される）大型細胞クローン（ｌａｒｇｅｒ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ）、２つ以上のＡＲＣＨ定義事象、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の増大、単球細胞数の減少、血小板細胞数の減少、赤血球数の減少、白血球数の減少、ヘモグロビンレベルの低下、コレステロールレベルの低下、長期の発熱、リンパ節および／または脾臓の腫大のいずれかの組み合わせに罹患していない。
本明細書で使用される場合、「高リスク対象」は、本明細書に記載されるような造血障害または悪性腫瘍の発症と相関する測定可能なパラメータである、１つ以上のいわゆるリスク因子に起因して造血障害または悪性腫瘍（例えば、白血病またはＭＤＳ）を発症する可能性が高い対象である。これらのリスク因子の１つ以上を有する対象は、これらのリスク因子を有しない個体と比較して、造血障害または悪性腫瘍を発症する確率が高い。
１つの実施形態によれば、対象は、疾患または障害、例えば造血障害または悪性腫瘍（例えば白血病またはＭＤＳ）を有すると診断されていない。
１つの実施形態によれば、対象は、（上記で論じられたような）スプライシング因子における１つ以上の変異について陽性である。
本明細書で使用される場合、「陽性」という用語は、当技術分野で公知の任意の方法（本明細書上記に詳細に記述）によって判定される、スプライシング因子に少なくとも１つの変異を示す対象のゲノムを指す。
さらなるリスク因子には、例えば、年齢、性別、人種、食事、体重、過去の病歴、前駆疾患（例えば、前白血病）の存在、遺伝的（例えば、世襲的）考慮事項、および環境曝露（例えば、放射線または化学的曝露）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、造血障害または悪性腫瘍（例えば、白血病またはＭＤＳ）を発症するリスクが高い対象には、例えば、その血縁者がこの疾患を経験しており、そのリスクが遺伝的マーカーまたは生化学的マーカーの分析によって決定される対象が含まれる。そのような対象は、以下で詳細に説明するように、特定の遺伝的異常の存在によって識別され得る。
いくつかの実施形態では、造血障害または悪性腫瘍（例えば、白血病またはＭＤＳ）を発症するリスクが高くない対象、例えば健康な対象と比較して、これらに限定されないが、（末梢血変異体対立遺伝子頻度（ＰＢ－ＶＡＦ）によって測定される）大型細胞クローン（ｌａｒｇｅｒ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ）、２つ以上のＡＲＣＨ定義事象、赤血球分布幅（ＲＤＷ）の増大、単球細胞数の減少、血小板細胞数の減少、赤血球数の減少、白血球数の減少、ヘモグロビンレベルの低下、コレステロールレベルの低下、長期の発熱、リンパ節および／または脾臓の腫大、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを対象が示す場合、造血障害または悪性腫瘍（例えば、白血病またはＭＤＳ）を発症するリスクが高い対象である。
リスク因子の決定は、アンケートの使用、身体検査および標準的な血液検査（例えばＣＢＣ）の使用などによって、当業者によって行われ得る。
１つの実施形態によれば、高リスク対象は、単一のＳＭＭ変異を有する。
１つの実施形態によれば、高リスク対象は、２、３、４、５つまたはそれ異常の（上記で論じられたような）ＳＭＭ変異を有する。
１つの実施形態によれば、対象は、リスク因子（上記のリスク因子、例えば年齢、性別、人種、細胞数、ヘモグロビンレベルなどのいずれかを伴うＳＭＭ変異）の組合せを有する。
したがって、本明細書に詳述される予防方法は、場合によっては、１つ以上のＳＭＭ変異、例えばＵ２ＡＦ１およびＳＲＳＦ２変異、またはそれらの任意の組み合わせの存在または非存在を検出することによる高リスクの対象の選択を利用できることが理解される。さらに、本発明の方法は、場合により、上記のリスク因子（例えば、年齢、性別、人種、細胞数、ヘモグロビンレベル、またはそれらの任意の組み合わせ）のいずれかを評価することによる高リスクの対象の選択を利用することができる。
１つの実施形態によれば、変異および／または他のリスク因子は、造血幹細胞および造血前駆細胞において検出される。
１つの実施形態によれば、変異および／または他のリスク因子は、前白血病性の造血幹細胞および造血前駆細胞において検出される。
１つの実施形態によれば、変異および／または他のリスク危険因子は、対象の生物学的サンプルにおいて検出される。
本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」は、これらに限定されないが、全血、血漿、血清、血球、髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器、腸および泌尿生殖路、涙液、唾液、痰、乳汁、腫瘍、嚢胞、神経組織、器官を含む、対象から単離された組織または体液のサンプル、およびインビボ細胞培養成分のサンプルを指す。
特定の実施形態によれば、生物学的サンプルは、前白血病性造血幹細胞および前駆細胞を含む。
変異の存在を判定するために、組織または体液を収集する数多くの周知の方法を利用して、生物学的サンプルを対象から収集することができる。収集方法には、これらに限定されないが、細針生検、針生検、コア針生検および外科生検（例えば、脳生検）、頬側スミアおよび洗浄が含まれる。使用される手順にかかわらず、一度生検／サンプルを得れば、変異体のレベルを測定することができ、したがって選択を行うことができる。
スプライシング因子の変異を伴う多くの疾患および状態は、本教示を使用して予防することができる。スプライシング因子の変異を伴う最も一般的な状態は、造血障害または悪性腫瘍である。
「造血障害」という用語は、これらに限定されないが、造血器悪性腫瘍、異常ヘモグロビン症、および免疫不全を含むあらゆる血液障害を指す。
本明細書で使用される「造血器悪性腫瘍」（血液悪性腫瘍とも呼ばれる）という用語は、血球の無制御な異常増殖を特徴とする、あらゆる血球癌を指す。用語「造血器悪性腫瘍」には、白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫および形質細胞障害が含まれるが、これらに限定されない。
「白血病」という用語は、身体の組織中の白血球の数の異常な増加を特徴とし、対応して循環血液中の白血球が増加する、またはしない、血液形成組織の疾患を指す。本発明の白血病には、リンパ性（リンパ芽球性）白血病および骨髄性（骨髄性または非リンパ性）白血病が含まれる。白血病の例示的なタイプには、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）［慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）としても知られる］、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）［急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）および急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）としても知られる］が含まれるが、これらに限定されない。
「急性白血病」という用語は、悪性細胞へと変化する未成熟血液細胞の数が急速に増加し、悪性細胞が急速に発達および蓄積し、それが血流に流れ出て身体の他の器官に広がることを特徴とする疾患を意味する。
「慢性白血病」という用語は、比較的成熟しているが異常である白血球の過剰な増進を特徴とする疾患を意味する。
１つの実施形態によれば、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
「骨髄異形成症候群」または「ＭＤＳ」という用語は、骨髄が前白血病プロセスを示唆する定性的および定量的変化を示すが、必ずしも急性白血病として終結しない慢性経過を有する状態を指す。
「リンパ腫」という用語は、Ｂリンパ球に由来するリンパ芽球の悪性腫瘍を指す。例示的なタイプのリンパ腫には、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、成熟Ｂ細胞リンパ腫、成熟Ｔ細胞リンパ腫およびナチュラルキラー細胞リンパ腫、ならびに免疫不全関連リンパ増殖性障害が含まれるが、これらに限定されない。
「形質細胞障害」という用語は、形質細胞増殖による形質細胞増加症を指す。例示的なタイプの形質細胞障害には、多発性骨髄腫（ＭＭ）および形質細胞白血病（ＰＣＬ）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「異常ヘモグロビン症」という用語は、ヘモグロビンとして知られる血液の酸素運搬成分に関する障害を指す。異常ヘモグロビン症の例示的なタイプとしては、限定されないが、鎌状赤血球貧血、ファンコーニ貧血およびサラセミアが挙げられる。
本明細書で使用される「免疫不全」という用語は、正常な免疫応答の開始が不可能であることを指す。「免疫不全症」という用語は、遺伝性（遺伝子的）および後天性免疫不全症の両方を包含する。免疫不全症の例示的なタイプには、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、免疫複合体病（例えば、ウイルス性肝炎）およびＡＩＤＳが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中上記で述べられたように、本発明の方法は、ＲＢＭ３９活性を阻害することなく、スプライソソーム活性を阻害することができる治療有効量の薬剤を、それを必要とする対象に投与することによって実行される。そのような薬剤がスプライソソーム機構変異（例えば、前白血病細胞）を既に含む細胞にとって致死的であるのは、これらの細胞が、残りの野生型対立遺伝子の発現に依存するからである。
「スプライソソーム活性を阻害する」という用語は、薬剤と接触していない細胞と比較して、細胞のスプライシング活性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％低下させることを指す。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）の発現、集合または活性をダウンレギュレーションすることによって、スプライシング活性を低下させることができる。したがって、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）のダウンレギュレーションは、ゲノムレベル（例えば、相同組換えおよび部位特異的エンドヌクレアーゼによって）、ならびに／または転写および／もしくは翻訳を妨害する種々の分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤）を使用した転写レベル、ならびに／またはタンパク質レベル（例えば、アプタマー、小分子および阻害性ペプチド、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素、抗体など）で行うことができる。
同じ培養条件では、発現は、一般に、薬剤と接触していないかまたは対照とも呼ばれるビヒクル対照と接触した、同じ種の細胞における発現と比較して表現される。
発現のダウンレギュレーションは、一過性または永続的のいずれかであり得る。
特定の実施形態によれば、発現のダウンレギュレーションとは、それぞれＲＴ－ＰＣＲまたはウエスタンブロットによって検出されるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の非存在を指す。
他の特定の実施形態によれば、発現のダウンレギュレーションとは、ＲＴ－ＰＣＲまたはウェスタンブロットによってそれぞれ検出されるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの低下を指す。低下は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の低下であり得る。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）の発現のダウンレギュレーションによってスプライソソーム活性を阻害することができる薬剤の非限定的な例は、本明細書中下記で詳細に記載される。
１つの実施形態によれば、薬剤は、スプライシング因子の活性または発現を直接ダウンレギュレーションする。「直接」という用語は、薬剤が、補因子、スプライシング因子の上流活性化因子または下流エフェクターではなく、スプライシング因子核酸配列またはタンパク質に作用し、かつ／またはそれらと直接相互作用することを意味する。そのような薬剤は、典型的にはスプライシングを遮断する。
１つの実施形態によれば、スプライソソーム活性の阻害がスプライシング阻害剤によって行われる。
１つの実施形態によれば、スプライシング阻害剤は、スプライシング複合体形成が起こらないようにスプライソソーム集合を妨害する。
１つの実施形態によれば、スプライシング阻害剤は、スプライソソームタンパク質のアセチル化状態を妨害する。
１つの実施形態によれば、スプライシング阻害剤は、スプライソソーム活性に関連するキナーゼおよびホスファターゼを標的とする。
１つの実施形態によれば、薬剤は、これらに限定されないが、Ｕ２ＡＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、およびＺＲＳＲ２を含むスプライシング因子を阻害する。
例示的なスプライシング阻害剤には、スデマイシン（Ｓｕｄｅｍｙｃｉｎ）、スプライソスタチン、ＦＲ９０１４６４、プラジエノリド、ハーボキシジエン、メアヤマイシン（Ｍｅａｙａｍｙｃｉｎ）、イソギンクゲチン、マドラシン（Ｍａｄｒａｓｉｎ）、テトロカルシン（Ｔｅｔｒｏｃａｒｃｉｎ）、Ｎ－パルミトイル－Ｌ－ロイシン、プソロム酸、クロトリマゾール、ＮＳＣ６３５３２６、ナプタザリン（Ｎａｐｔｈａｚａｒｉｎ）、エリスロマイシン、ＳＡＨＡ、ガルシノール、オカダ酸、ＮＢ－５０６、ウビスタチン、Ｇ５、またはそれらの誘導体もしくは類似体が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態によれば、スプライシング阻害剤には、Ｅ７１０７、Ｈ３Ｂ－８８００、ＦＤ－８９５、ＧＥＸ１Ｑ１－５、ＲＱＮ－１８６９０、ＮＳＣ ６５９９９９、ＢＮ８２８６５、ＮＳＣ９５３９７、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、スプライトマイシン、タウトマイシン、ミクロシスチン、ジオスピリン、クロルヘキシジンまたはそれらの誘導体もしくは類似体が含まれるが、これらに限定されない。
本教示に従って使用することができるさらなるスプライシング阻害剤は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｒｓｔｉｎ Ａ．Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｖｅｒｏｎｉｃａ Ｋ．Ｕｒａｂｅ、およびＭｅｌｉｓｓａ Ｓ．Ｊｕｒｉｃａ、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ」、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ．著者原稿；ＰＭＣ ２０１８年３月１日、に開示されている。
１つの実施形態によれば、薬剤は、スプライシング因子の活性または発現を間接的にダウンレギュレーションする。「間接的に」という用語は、薬剤が補因子、スプライシング因子の上流活性化因子または下流エフェクターに作用することを意味する。
１つの実施形態によれば、スプライソソーム活性は、プロテアソーム分解を介してスプライシングを乱すことによって阻害される。
特定の実施形態によれば、薬剤は、ＲＢＭ３９活性を阻害しない。
１つの実施形態によれば、薬剤は、ＲＢＭ３９の生物学的活性を変化させない。
１つの実施形態によれば、薬剤は、インビボポリユビキチン化アッセイによって決定されるようなＲＢＭ３９のユビキチン化をもたらさない。
１つの実施形態によれば、薬剤は、例えば、ウエスタンブロットアッセイ、内因性ＲＢＭ３９のＣ末端タグ付けアッセイ、ＲＢＭ３９のオーキシン誘導分解アッセイおよび／またはＲＢＭ３９複合体の免疫沈降によって判定されるように、ＲＢＭ３９分解をもたらさない。
１つの実施形態によれば、薬剤は、ＲＢＭ３９のユビキチン化および分解をもたらさない。
「ＲＢＭ３９」という用語は、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質３９を指す。いくつかの実施形態では、ＲＢＭ３９は、ホモサピエンスに由来し、アクセション番号ＮＭ＿００４９０２（配列番号３１）（ｍＲＮＡ）またはＮＰ＿００４８９３（配列番号３２）（タンパク質）を有する。
１つの実施形態によれば、薬剤は、アリールスルホンアミドではない。
特定の実施形態によれば、薬剤は、インジスラムではない。
特定の実施形態によれば、薬剤は、タシスラムではない。
特定の実施形態によれば、薬剤は、クロロキノキサリンスルホンアミド（ＣＱＳ）ではない。
１つの実施形態によれば、薬剤は、これらに限定されないが、ＳＦ３ｂ複合体（例えば、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、およびＰＨＦ５ａ）、Ｕ２ＡＦ複合体（例えば、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２）、ＰＲＭＴ酵素（例えば、ＰＲＭＴ５、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ２、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、およびＰＲＭＴ８）またはＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ、例えばＳＵＰＴ６Ｈ、ｈｎＲＮＰＨおよびＳＲＳＦ１０）のコアメンバーを含む、スプライソソームタンパク質の分解を促進する。
特定の実施形態によれば、薬剤は、ＳＦ３ｂ複合体（例えば、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、およびＰＨＦ５ａ）、Ｕ２ＡＦ複合体（例えば、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２）、ＰＲＭＴ酵素（例えば、ＰＲＭＴ５、ＰＲＭＴ１、２、３、４、６、および８）またはＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ、例えばＳＵＰＴ６Ｈ、ｈｎＲＮＰＨ、およびＳＲＳＦ１０）のコアメンバーのプロテアソーム分解が可能であり、本教示に従って使用することができる。
１つの実施形態によれば、スプライソソーム活性の阻害は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）の阻害によって達成される。
本明細書中で使用される場合、「タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ」または「ＰＲＭＴ」とは、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質の対称性または非対称性メチル化を触媒する能力によって広範囲の標的遺伝子の発現を調節するタンパク質のファミリーを指す。
例示的なＰＲＭＴには、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１、例えばＥＣ番号２．１．１．３１９に記載されている）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ２（ＰＲＭＴ２、例えば、ＥＣ番号２．１．１．３１９に記載されている）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３、例えば、ＥＣ番号２．１．１．－に記載されている）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５、例えば、ＥＣ番号２．１．１．３２０に記載されている）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６、例えば、ＥＣ番号２．１．１．３１９に記載されている）、、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ７（ＰＲＭＴ７、例えば、ＥＣ番号２．１．１．３２１に記載されている）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８、例えば、ＥＣ番号２．１．１．－に記載されている）、およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９、４ｑ３１とも呼ばれる）が含まれるが、これらに限定されない。
１つの実施形態によれば、薬剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼのメチルトランスフェラーゼ活性を阻害する。
特定の実施形態によれば、薬剤は、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤であるＭＳ－０２３二塩酸塩、またはその誘導体もしくは類似体である。
特定の実施形態によれば、ＰＲＭＴがＰＲＭＴ５を含む場合、薬剤は、ＧＳＫ５９１二塩酸塩またはＧＳＫ３３２６５９５、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
特定の実施形態によれば、ＰＲＭＴがＰＲＭＴ１を含む場合、薬剤は、Ｃ－２１、フラミジン二塩酸塩またはＴＣ－Ｅ５００３、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む。
特定の実施形態によれば、ＰＲＭＴがＰＲＭＴ３を含む場合、薬剤は、ＳＧＣ７０７またはＵＮＣ２３２７、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
特定の実施形態によれば、ＰＲＭＴがＰＲＭＴ４を含む場合、薬剤は、ＭＳ０４９オキサレート塩またはＴＰ０６４、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
特定の実施形態によれば、ＰＲＭＴがＰＲＭＴ６を含む場合、薬剤は、ＭＳ０４９オキサレート塩、またはその誘導体もしくは類似体を含む。
本教示に従って使用することができるさらなるＰＲＭＴ阻害剤は、Ｈ．Ｕｍｉｔ Ｋａｎｉｓｋａｎ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ．ＭａｒｔｉｎｉおよびＪｉａｎ Ｊｉｎ、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ」、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２０１８）１１８：９８９－１０６８；ならびにＨａｏ Ｈｕ，Ｋｕｎ Ｑｉａｎ，Ｍｅｎｇ－Ｃｈｉａｏ Ｈｏ，およびＹ．Ｇｅｏｒｇｅ Ｚｈｅｎｇ、「Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．（２０１６）２５（３）：３３５－３５８に開示され、両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
上記の薬剤に加えて、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）をダウンレギュレーションできる薬剤は、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）に結合し、かつ／またはそれを切断する任意の分子であり得る。そのような分子は、小分子、アンタゴニスト、または阻害性ペプチドであり得る。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）の少なくとも触媒部分または結合部分の非機能的類似体も、スプライソソーム活性を阻害する薬剤として使用できることが理解されよう。
代替的または追加的に、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）のタンパク質機能（例えば、触媒作用または相互作用）を妨害する小分子またはペプチドを使用することができる。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）をダウンレギュレーションするために本発明のいくつかの実施形態と共に使用することができる別の薬剤は、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）の活性化または基質結合を防止する分子である。
ポリペプチドレベルでスプライソソーム活性を阻害することができるさらなる薬剤としては、抗体、抗体断片およびアプタマーが挙げられる。
特定の実施形態によれば、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）をダウンレギュレーションすることができる薬剤は、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）に特異的に結合することができる抗体または抗体断片である。好ましくは、抗体は、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を指す。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特有の三次元構造特性および特有の電荷特性を有する。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）は細胞内に局在するので、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）に特異的に結合することができる抗体または抗体断片は、典型的には細胞内抗体である。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれらの断片を生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照されたい。）。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）をダウンレギュレーションするために、本発明のいくつかの実施形態と共に使用することができる別の薬剤は、アプタマーである。本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、タンパク質などの特定の分子標的に結合する二本鎖または一本鎖ＲＮＡ分子を指す。タンパク質特異的アプタマーを設計するために使用することができる様々な方法が、当技術分野で公知である。当業者は、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ Ｒ、Ｒｅｉｎｅｍａｎｎ ＣおよびＳｔｒｅｈｌｉｔｚ Ｂ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００７）２４（４）：３８１－４０３）に記載されているように、効率的な選択のためにＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）を使用することができる。
核酸レベルでのダウンレギュレーションは、典型的には、核酸骨格、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの模倣物またはそれらの組み合わせを有する核酸作用物質を使用して行われる。核酸作用物質は、ＤＮＡ分子からコードされ得るか、またはそれ自体が細胞に提供され得る。
したがって、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）のダウンレギュレーションは、ＲＮＡサイレンシングによって達成することができる。本明細書中で使用される場合、語句「ＲＮＡサイレンシング」とは、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される調節機構［例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、抑制、共抑制および翻訳抑制］の群を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、および真菌を含む多くの種類の生物において観察されている。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡサイレンシング剤」という用語は、標的遺伝子の発現を特異的に阻害または「サイレンシング」することができるＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシング機構を介してｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を妨げることができる。ＲＮＡサイレンシング剤には、非コードＲＮＡ分子、例えば対の鎖を含むＲＮＡ二重鎖、およびそのような小さい非コードＲＮＡを生成することができる前駆体ＲＮＡが含まれる。例示的なＲＮＡサイレンシング剤には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡが含まれる。
一実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。
別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制をもたらすことができる。
本発明の一実施形態によれば、ＰＣＲ、ウエスタンブロット、免疫組織化学および／またはフローサイトメトリーによって判定されるように、ＲＮＡサイレンシング剤は、標的ＲＮＡ（例えば、スプライシング因子）に特異的であり、標的遺伝子に対して９９％以下の全体的相同性、例えば、標的遺伝子に対して９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満の全体的相同性を示す他の標的またはスプライス変異体を相互抑制またはサイレンシングしない。
ＲＮＡ干渉とは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によってもたらされる、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。
以下は、本発明の特定の実施形態に従って使用することができるＲＮＡサイレンシング剤に関する詳細な説明である。
ＤｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ－細胞中の長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、ｄｓＲＮＡの、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片へのプロセシングに関与する。ダイサー活性から誘導された低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１～約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断をもたらす、一般にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、ｄｓＲＮＡを使用してｍＲＮＡからのタンパク質発現をダウンレギュレーションすることを意図する。
１つの実施形態によれば、３０ ｂｐよりも長いｄｓＲＮＡが使用される。様々な研究により、長いｄｓＲＮＡを使用して、ストレス応答を誘導することなく、または著しいオフターゲット効果を引き起こすことなく、遺伝子発現をサイレンシングできることが実証されている。例えば、［Ｓｔｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３ ３８０３－３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５－１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１－３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３－１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７－１３４］を参照のこと。
本発明のいくつかの実施形態によれば、インターフェロン経路が活性化されていない細胞にｄｓＲＮＡが提供される。例えば、Ｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００１，Ｖｏｌ ９８、１４４２８－１４４３３頁、およびＤｉａｌｌｏ ｅｔ ａｌ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３年１０月１日、１３（５）：３８１－３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照のこと。
本発明の一実施形態によれば、長いｄｓＲＮＡは、遺伝子発現をダウンレギュレーションするために、インターフェロン経路およびＰＫＲ経路を誘導しないように特異的に設計される。例えば、品川および石井 ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０－１３４５，２００３］は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターから長い二本鎖ＲＮＡを発現するための、ｐＤＥＣＡＰと呼ばれるベクターを開発した。ｐＤＥＣＡＰからの転写物は、細胞質へのｄｓ－ＲＮＡの輸送を促進する５’－キャップ構造および３’－ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰからの長いｄｓ－ＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない。
哺乳動物系におけるインターフェロン経路およびＰＫＲ経路を回避する別の方法は、トランスフェクションまたは内因性発現のいずれかによる低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入によるものである。
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子阻害ＲＮＡ二重鎖（一般に１８～３０塩基対）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ ｂｐ二重鎖領域および末端に対称的な２塩基３’オーバーハングを有する２１量体として化学合成されるが、最近では、２５～３０塩基長の化学合成されたＲＮＡ二重鎖は、同じ位置の２１量体と比較して効力が１００倍増加し得ることが記載されている。ＲＮＡｉの誘発において、より長いＲＮＡを使用して効力の増加が得られたことは、産物（２１量体）の代わりに基質（２７量体）をダイサーに提供したことに起因し、これによってｓｉＲＮＡ二重鎖のＲＩＳＣへの進入の速度または効率が向上することが示唆される。
３’－オーバーハングの位置はｓｉＲＮＡの効力に影響を及ぼし、アンチセンス鎖上に３’－オーバーハングを有する非対称二重鎖は、センス鎖上に３’－オーバーハングを有するものよりも一般に強力であることが見出されている（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．、２００５）。これは、アンチセンス転写物を標的化する場合に逆の有効性パターンが観察されることから、ＲＩＳＣへの非対称鎖ロードに起因する可能性がある。
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、ヘアピンまたはステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成するように連結され得る。したがって、述べられたように、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤はまた、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ステム－ループ構造を有し、相補性配列の第１および第２の領域を含み、領域の相補性および配向の程度が領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１および第２の領域がループ領域によって連結され、ループがループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如から生じる、ＲＮＡ作用物質を指す。ループ内のヌクレオチドの数は、３～２３、または５～１５、または７～１３、または４～９、または９～１１を含む範囲の数である。ループ内のヌクレオチドの一部は、ループ内の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’－ＣＡＡＧＡＧＡ－３’および５’－ＵＵＡＣＡＡ－３’（国際特許出願第ＷＯ２０１３１２６９６３号および同第ＷＯ２０１４１０７７６３号）が挙げられる。得られた一本鎖オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム－ループまたはヘアピン構造を形成することは、当業者によって認識されるであろう。
本発明のいくつかの実施形態での使用に適したＲＮＡサイレンシング剤の合成は、以下のように達成され得る。最初に、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）ｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列のＡＵＧ開始コドンの下流でスキャンする。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの発生は、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。非翻訳領域（ＵＴＲ）は調節タンパク質結合部位が豊富であるので、ｓｉＲＮＡ標的部位は、好ましくはオープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る［Ｔｕｓｃｈｌ ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９－２４５］。しかし、５’ ＵＴＲに向けられたｓｉＲＮＡが細胞ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの約９０％の減少をもたらし、タンパク質レベルを完全に無効にしたＧＡＰＤＨについて実証されているように、非翻訳領域に向けられたｓｉＲＮＡも有効であり得ることが理解されよう（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｍｂｉｏｎ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２（ｄｏｔ）ｈｔｍｌ）。
第２に、潜在的な標的部位を、ＮＣＢＩサーバーから入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェア（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｎｃｂｉ（ｄｏｔ）ｎｌｍ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）などの任意の配列アラインメントソフトウェアを使用して、適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列と有意な相同性を示す推定標的部位を除外する。
適格な標的配列をｓｉＲＮＡ合成の鋳型として選択する。低いＧ／Ｃ含有量を含む配列は、５５％を超えるＧ／Ｃ含有量を有する配列と比較して、遺伝子サイレンシングの媒介においてより効果的であることが証明されているので、好ましい配列である。いくつかの標的部位を、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択することが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のために、陰性対照を併用することが好ましい。陰性対照ｓｉＲＮＡは、好ましくはｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する有意な相同性を欠く。したがって、他のいかなる遺伝子に対しても有意な相同性を何ら示さないならば、ｓｉＲＮＡのスクランブルされたヌクレオチド配列を使用することが好ましい。
例えば、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）に対する適切なｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から購入することができる。
本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、本明細書中上記で言及されるように、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが理解されるであろう。
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ模倣物－別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤はｍｉＲＮＡであり得る。
「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲ」という用語は同義であり、遺伝子発現を調節する約１９～２８ヌクレオチド長の非コード一本鎖ＲＮＡ分子の集合体を指す。ｍｉＲＮＡは、広範囲の生物（ウイルス→ヒト）において見出され、発達、恒常性および疾患病因において役割を果たすことが示されている。
以下、ｍｉＲＮＡ活性の機構について簡単に説明する。
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子が転写され、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして知られるｍｉＲＮＡ前駆体の生成をもたらす。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、典型的には、複数のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを含むポリシストロニックＲＮＡの一部である。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ステムおよびループを有するヘアピンを形成し得る。ステムは、ミスマッチ塩基を含み得る。
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩエンドヌクレアーゼであるドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）によって認識される。ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）は、典型的には、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡにおける末端ループを認識し、およそ二つのらせん状ターンをステムに切断して、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして知られる６０ヌクレオチド～７０ヌクレオチド前駆体を生成する。ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的な互い違いの切断によってｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを切断し、５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステムループをもたらす。ステムのおよそ１つのらせん状ターン（約１０ヌクレオチド）がドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）切断部位を越えて延びることが、効率的なプロセシングに必須であると推定される。その後、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ－ＧＴＰおよび搬出受容体Ｅｘ－ｐｏｒｔｉｎ－５によって核から細胞質へ活発に輸送される。
次いで、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムが、ＲＮａｓｅ ＩＩＩエンドヌクレアーゼでもあるダイサーによって認識される。ダイサーはまた、ステムループの塩基における５’リン酸および３’オーバーハングを認識し得る。次いで、ダイサーは、末端ループの２つのらせん状ターンをステムループの塩基から切断し、さらなる５’リン酸および約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残す。ミスマッチを含み得る、得られたｓｉＲＮＡ様二重鎖は、成熟ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ＊として知られる類似サイズの断片とを含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの対向するアームから誘導される。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローン化ｍｉＲＮＡのライブラリーにおいて見出され得るが、典型的にはｍｉＲＮＡよりも低い頻度で見出され得る。
ｍｉＲＮＡは、最初はｍｉＲＮＡ＊との二本鎖種として存在するが、最終的には一本鎖ＲＮＡとして、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のリボ核タンパク質複合体に組み込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、これにより、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制または活性化）、およびｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のどの鎖がＲＩＳＣにロードされるかを変化させることができる。
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣにロードされると、ｍｉＲＮＡ＊が除去され、分解される。ＲＩＳＣにロードされるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖は、その５’末端があまり緊密に対合していない鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両端がほぼ同等の５’対合を有する場合、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の両方が遺伝子サイレンシング活性を有し得る。
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高レベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７によって標的核酸を特定する。
いくつかの研究では、翻訳の効率的な阻害を達成するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対合要件を調査した（Ｂａｒｔｅｌ ２００４、Ｃｅｌｌ １１６－２８１によって検討）。哺乳動物細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要であり得る（Ｄｏｅｎｃｈ＆Ｓｈａｒｐ ２００４ ＧｅｎｅｓＤｅｖ ２００４－５０４）。しかしながら、マイクロＲＮＡの他の部分もｍＲＮＡ結合に関与し得る。さらに、３’での十分な塩基対形成は、５’での不十分な対形成を補うことができる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ、２００５ ＰＬｏＳ ３－ｅ ８５）。全ゲノムに対するｍｉＲＮＡ結合を分析する計算研究は、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’における塩基２～７についての特異的な役割を示唆しているが、通常「Ａ」であることが見出された最初のヌクレオチドの役割もまた認識された（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｔ ２００５ Ｃｅｌｌ １２０－１５）。同様に、Ｋｒｅｋら（２００５、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７－４９５）は、ヌクレオチド１～７または２～８を使用して標的を同定および検証した。
ｍＲＮＡ中の標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域内にあり得る。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡは、同じ部位または複数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節し得る。遺伝子的に同定されたほとんどの標的における複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在は、複数のＲＩＳＣの協同作用が最も効率的な翻訳阻害を提供することを示し得る。
ｍｉＲＮＡは、２つの機構、すなわちｍＲＮＡ切断または翻訳抑制のいずれかによって遺伝子発現をダウンレギュレーションするようにＲＩＳＣに指示し得る。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対してある程度の相補性を有する場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を指定し得る。ｍｉＲＮＡが切断を誘導する場合、切断は、典型的には、ｍｉＲＮＡの残基１０および１１に対するヌクレオチド対合の間である。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有しない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制し得る。動物はｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性の程度がより低い可能性があるので、翻訳抑制は、動物においてより一般的であり得る。
ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊のいかなる対の５’末端および３’末端にも変動性があり得ることに留意されたい。この変動性は、ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）およびダイサーの酵素プロセシングの切断部位に関する変動性に起因し得る。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の５’末端および３’末端における変動性はまた、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因し得る。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団をもたらし得る。ステム構造の変動性はまた、ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）およびダイサーによる切断産物の変動性をもたらし得る。
「マイクロＲＮＡ模倣物」または「ｍｉＲＮＡ模倣物」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡ模倣物は、内因性ｍｉＲＮＡの機能を模倣し、成熟した二本鎖分子または模倣前駆体（例えば、またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣物は、修飾または非修飾のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、または代替的な核酸化学物質（例えば、ＬＮＡまたは２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ））から構成され得る。成熟した二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物の場合、二重鎖領域の長さは、１３～３３、１８～２４または２１～２３ヌクレオチドの間で変動し得る。ｍｉＲＮＡはまた、合計で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチドを含み得る。ｍｉＲＮＡの配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの最初の１３～３３ヌクレオチドであり得る。ｍｉＲＮＡの配列はまた、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの最後の１３～３３ヌクレオチドであり得る。
ｍｉＲＮＡ模倣物の調製は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、化学合成または組換え方法など）によって達成され得る。
本明細書中上記で提供される記述から、細胞とｍｉＲＮＡとの接触は、細胞に、例えば成熟した二本鎖ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをトランスフェクションすることによって達成され得ることが理解されるであろう。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～９０、６０～８０または６０～７０ヌクレオチドを含み得る。
ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は、４５～３０，０００、５０～２５，０００、１００～２０，０００、１，０００～１，５００または８０～１００ヌクレオチドを含み得る。
アンチセンス－アンチセンスは、そのｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることによって遺伝子の発現を防止または阻害するように設計された一本鎖ＲＮＡである。スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）のダウンレギュレーションは、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いて達成され得る。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）を効率的にダウンレギュレーションするために使用され得るアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチにとって重要な２つの態様を考慮しながら行われなければならない。第１の態様は、適切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第２の態様は、細胞内の指定されたｍＲＮＡに、その翻訳を阻害する方法で特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
先行技術は、オリゴヌクレオチドを多種多様なタイプの細胞に効率的に送達するために使用することができる、いくつかの送達戦略を教示している ［例えば、Ｊａａｓｋｅｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．（２００２）７（２）：２３６－７；Ｇａｉｔ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２００３）６０（５）：８４４－５３；Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００９）２００９：４１０２６０；Ｇｒｉｊａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ．（２０１４）２４（７）：８０１－１９；Ｆａｌｚａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．（２０１４）２４（１）：８７－１００；Ｓｈｉｌａｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．（２０１４）２０１４：５２６３９１；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１４）４２（１３）：８７９６－８０７およびＡｓｓｅｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．（２０１４）１６（７－８）：１５７－６５を参照されたい］。
さらに、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造変化のエネルギー論を説明する熱力学的サイクルに基づいて、標的ｍＲＮＡに対する結合親和性が最も高いと予測される配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：１－９（１９９９）を参照されたい］。そのようなアルゴリズムは、細胞においてアンチセンスアプローチを実施するために首尾よく使用されている。
さらに、インビトロシステムを使用した、特定のオリゴヌクレオチドを設計し、効率を予測するためのいくつかのアプローチも公開された（Ｍａｔｖｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：１３７４－１３７５（１９９８）］。
したがって、非常に正確なアンチセンス設計アルゴリズムおよび多種多様なオリゴヌクレオチド送達システムの生成により、当業者は、過度の試行錯誤の実験に頼る必要なく、既知の配列の発現をダウンレギュレーションするのに適したアンチセンスアプローチを設計および実施することが可能になる。
核酸作用物質は、以下に要約されるようにＤＮＡレベルで作用することもできる。
スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）のダウンレギュレーションはまた、遺伝子構造における機能喪失型変化（例えば、点変異、欠失および挿入）を伴う標的化変異の導入を通して遺伝子（例えば、スプライシング因子）を不活性化することによっても達成され得る。
本明細書で使用される場合、「機能喪失型変化」という語句は、発現産物、すなわちｍＲＮＡ転写産物および／または翻訳されたタンパク質の発現レベルおよび／または活性のダウンレギュレーションをもたらす遺伝子（例えば、スプライシング因子）のＤＮＡ配列におけるあらゆる変異を指す。そのような機能喪失型変化の非限定的な例としては、ミスセンス変異、すなわちタンパク質中のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で変化させ、それによってタンパク質の酵素活性を消失させる変異；ナンセンス変異、すなわちタンパク質中に終止コドン、例えば酵素活性を欠くより短いタンパク質をもたらす初期終止コドンを導入する変異；フレームシフト変異、すなわち変異、通常はタンパク質のリーディングフレームを変化させ、終止コドンをリーディングフレームに導入することによる早期の終了（例えば、酵素活性を欠く短縮型タンパク質），または タンパク質の二次または三次構造に影響を及ぼし、かつ非変異ポリペプチドの酵素活性を欠く非機能性タンパク質をもたらす、より長いアミノ酸配列（例えば、リードスルータンパク質）をもたらし得る核酸の欠失または挿入；フレームシフト変異または修飾終止コドン変異に起因する（すなわち、終止コドンがアミノ酸コドンへと変異する場合）、酵素活性の消滅を伴うリードスルー変異；プロモーター変異、すなわち、プロモーター配列、通常は５’から遺伝子の転写開始部位における、特定の遺伝子産物のダウンレギュレーションをもたらす変異；制御変異、すなわち、上流または下流領域、または遺伝子内における、遺伝子産物の発現に影響を及ぼす変異；欠失変異、すなわち、遺伝子配列中のコード核酸を除去する、フレームシフト変異またはインフレーム変異をもたらし得る変異（コード配列内での、１つ以上のアミノ酸コドンの欠失）；挿入変異、すなわち、コードまたは非コード核酸を遺伝子配列に挿入する、１つ以上のアミノ酸コドンのフレームシフト変異またはインフレーム挿入をもたらし得る変異；逆転、すなわち、コードまたは非コード配列の逆転をもたらす変異；スプライス変異、すなわち、異常なスプライシングまたは不十分なスプライシングをもたらす変異；および重複変異、すなわち、インフレームであり得るか、またはフレームシフトを引き起こし得る、コードまたは非コード配列の重複をもたらす変異、が含まれる。
特定の実施形態によれば、遺伝子の機能喪失型変化は、遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を含み得る。
本明細書で使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子座の１つ以上の代替形態のいずれかを指し、その全ての対立遺伝子は形質または特徴に関連する。二倍体細胞または生物において、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、相同染色体対上の対応する遺伝子座を占める。
他の特定の実施形態によれば、遺伝子の機能喪失型変化は、遺伝子の両方の対立遺伝子を含む。そのような場合、例えば、スプライソソームタンパク質（例えば、スプライシング因子）は、ホモ接合型またはヘテロ接合型であり得る。
目的の遺伝子に核酸変化を導入する方法は、当技術分野で周知であり［例えば、Ｍｅｎｋｅ Ｄ．Ｇｅｎｅｓｉｓ（２０１３）５１：－６１８；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８－１２９２；Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００８）１０５：５８０９－５８１４、国際特許出願第ＷＯ ２０１４０８５５９３号、同第ＷＯ ２００９０７１３３４号および同第ＷＯ ２０１１１４６１２１号、米国特許第８７７１９４５号、同第８５８６５２６号、同第６７７４２７９号、およびＵＰ特許出願公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５００２６１５７号、同第２００６００１４２６４号を参照されたい（その内容は参照によりその全体が組み込まれる）］、標的相同組換え、部位特異的リコンビナーゼ、ＰＢトランスポザーゼ、および操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集が含まれる。目的の遺伝子に核酸変化を導入するための薬剤は、公に利用できる原料で設計することができ、またはＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ、ＡｄｄｇｅｎｅおよびＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入することができる。
以下は、本発明の特定の実施形態に従って使用することができる、目的の遺伝子に核酸変化を導入するために使用される様々な例示的方法およびそれを実施するための薬剤の説明である。
操作されたエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集－このアプローチは、人工的に操作されたヌクレアーゼを使用して、特定の二本鎖切断をゲノム内の所望の位置で切断および生成し、次いで、相同組換え修復（ＨＤＳ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞内因性プロセスによって修復される逆遺伝学法を指す。ＮＨＥＪは、二本鎖切断のＤＮＡ末端を直接接合する一方、ＨＤＲは、切断点で欠損ＤＮＡ配列を再生するための鋳型として相同配列を利用する。ゲノムＤＮＡに特定のヌクレオチド修飾を導入するために、所望の配列を含むＤＮＡ修復鋳型がＨＤＲ中に存在しなければならない。
ほとんどの制限酵素はＤＮＡ上のいくつかの塩基対をそれらの標的として認識し、認識された塩基対の組み合わせがゲノム全体の多くの位置で見出され、所望の位置に限定されない複数の切断をもたらす確率が非常に高いため、従来の制限エンドヌクレアーゼを使用してゲノム編集を行うことはできない。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖または二本鎖切断を作り出すために、いくつかの異なる部類のヌクレアーゼがこれまでに発見され、生物工学的に作られた。これらは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。
メガヌクレアーゼ－メガヌクレアーゼは、一般に４つのファミリー、すなわちＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つまたは２つのコピーを有することを特徴とする。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造要素、したがってＤＮＡ認識配列特異性および触媒活性に関して互いに大きな隔たりがある。メガヌクレアーゼは、一般に微生物種において見られ、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという独特の特性を有するため、当然所望の位置での切断に非常に特異的になる。
これは、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断を作製するために利用することができる。当業者は、これらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、そのような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、変異誘発およびハイスループットスクリーニング法を使用して、独特の配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体を作製してきた。例えば、様々なメガヌクレアーゼが融合され、新しい配列を認識するハイブリッド酵素が作製されている。
あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸を変更して、配列特異的メガヌクレアーゼを設計することができる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照されたい）。メガヌクレアーゼは、例えば、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３－９７５；米国特許第８，３０４，２２２号；８，０２１，８６７号；８，１１９，３８１号；８，１２４，３６９号；８，１２９，１３４号；８，１３３，６９７号；８，１４３，０１５号；８，１４３，０１６号；８，１４８，０９８号；または８，１６３，５１４に記載されている方法を用いて設計することができ、各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。あるいは、部位特異的切断特性を有するメガヌクレアーゼは、市販の技術、例えばＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を使用して得ることができる。
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ－操作されたヌクレアーゼの２つの異なる部類、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、両方とも標的二本鎖切断の作成に有効であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、１９９６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。
基本的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ制限エンドヌクレアーゼ技術は、特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結された非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する（それぞれ一連のジンクフィンガードメインまたはＴＡＬＥ反復のいずれか）。典型的には、ＤＮＡ認識部位と切断部位とが互いに離れている制限酵素が選択される。切断部分を分離し、次いでＤＮＡ結合ドメインに連結することにより、所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。そのような特性を有する例示的な制限酵素は、Ｆｏｋｌである。さらに、Ｆｏｋｌは、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化を必要とするという利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーが固有のＤＮＡ配列を認識するにつれて特異性が劇的に増加することを意味する。この効果を増強するために、Ｆｏｋｌヌクレアーゼは、ヘテロ二量体としてのみ機能することができるように、かつ触媒活性が増加するように操作されている。ヘテロ二量体機能ヌクレアーゼは、望ましくないホモ二量体活性の可能性を回避するので、二本鎖切断の特異性が増す。
したがって、例えば、特定の部位を標的とするために、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ対として構築され、対の各メンバーは、標的部位で隣接配列に結合するように設計される。細胞での一過性発現時に、ヌクレアーゼはそれらの標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量体化して二本鎖切断を作成する。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を通じたこれらの二本鎖切断の修復は、ほとんどの場合、小さな欠失または小さな配列挿入をもたらす。ＮＨＥＪによって行われる各修復は独特であるので、単一のヌクレアーゼ対の使用は、標的部位に様々な異なる欠失を有する対立遺伝子系列を生成することができる。
欠失は、典型的には、数塩基対から数百塩基対のいずれかの範囲に及ぶが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって、より大きな欠失が細胞培養において正常に発生した（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。さらに、標的領域と相同性を有するＤＮＡの断片をヌクレアーゼ対と併せて導入すると、相同組換え修復によって二本鎖切断を修復して、特異的修飾を生じさせることができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、２０１０；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．、２００５）。
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は同様の特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼの違いは、それらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮはＣｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依存し、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依存する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインの両方は、組み合わせでそれらのタンパク質中に当然に見られるという特徴を有する。Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的には、３ ｂｐ間隔の繰り返しで見られ、様々な核酸相互作用タンパク質中の多様な組み合わせで見られる。他方、ＴＡＬＥは、アミノ酸および認識されたヌクレオチド対間の認識比１対１で繰り返しで見られる。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥの両方が反復パターンで発生するので、種々の組み合わせを試して、多種多様な配列特異性を作り出すことができる。部位特異性ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、例えば、モジュラー組み立て（トリプレット配列と相関するジンクフィンガーが連続して付着されて、必要な配列をカバーする）、ＯＰＥＮ（トリプレットヌクレオチドに対するペプチドドメインの低ストリンジェンシー選択、続いて細菌系での最終標的に対するペプチド組み合わせの高ストリンジェンシー選択）、およびジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングなどが挙げられる。ＺＦＮは、設計することもでき、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入することもできる。
ＴＡＬＥＮを設計および入手する方法は、例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２年 ５月；３０（５）：４６０－５；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３－１４８；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ ８２およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９－５３に記載されている。最近開発されたＭｏｊｏ Ｈａｎｄという名のウェブベースのプログラムは、ゲノム編集用途のためのＴＡＬおよびＴＡＬＥＮ構築物を設計するためにＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃによって導入された（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇからアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮは、設計することもでき、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入することもできる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム－多くの細菌および古細菌は、侵入するファージおよびプラスミドの核酸を分解することができる内因性ＲＮＡベースの適応免疫系を含む。これらのシステムは、ＲＮＡ成分を生成する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子と、タンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルスおよびプラスミドとの短い範囲の相同性を含み、対応する病原体の相補性核酸を分解するようにＣａｓヌクレアーゼに指示するガイドとして作用する。化膿性連鎖球菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究は、３つの成分、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に対して２０塩基対の相同性を有するｃｒＲＮＡ、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、合わせると配列特異的ヌクレアーゼ活性に十分であることを示した。（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６－８２１。）。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の融合物で構成される合成キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、インビトロでｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９に指示することができることがさらに実証された。合成ｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９の一過性発現を使用して、様々な異なる種において標的化二本鎖切断を生成できることも実証された（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１３；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１３ａ、ｂ；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．、２０１３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．、２０１３）。
ゲノム編集のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムは、２つの異なる成分、すなわちｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を含む。
ｇＲＮＡは、典型的には、標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）と、ｃｒＲＮＡを単一のキメラ転写物中のＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に連結する内因性細菌ＲＮＡとの組み合わせをコードする２０ヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と補体ゲノムＤＮＡとの間の塩基対合によって標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合を成功させるために、ゲノム標的配列はまた、標的配列の直後に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有しなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合は、Ｃａｓ９がＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断を引き起こすことができるように、Ｃａｓ９をゲノム標的配列に局在化させる。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生成される二本鎖切断は、相同組換えまたはＮＨＥＪを被ることができる。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能ドメイン、すなわちＲｕｖＣおよびＨＮＨを有し、それぞれが異なるＤＮＡ鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を引き起こす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの重要な利点は、合成ｇＲＮＡを容易に作製する能力と相まって、このシステムの高い効率が、複数の遺伝子を同時に標的化することを可能にすることである。さらに、変異を保有する細胞の大部分は、標的遺伝子において二対立遺伝子変異を提示する。
しかしながら、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対合形成相互作用における明らかな柔軟性は、Ｃａｓ９によって切断される標的配列に対する不完全なマッチを可能にする。
単一の不活性触媒ドメイン、ＲｕｖＣ－またはＨＮＨ－のいずれかを含有するＣａｓ９酵素の修飾バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。ただ１つの活性ヌクレアーゼドメインを含む、Ｃａｓ９ニッカーゼは標的ＤＮＡの唯一の鎖を切断し、一本鎖切断または「ニック」を形成する。一本鎖切断またはニックは、通常、無傷の相補性ＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、ＨＤＲ経路を通して迅速に修復される。しかしながら、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近位の反対鎖ニックは、しばしば「二重ニック」ＣＲＩＳＰＲと呼ばれるシステムにおいて、二本鎖切断として扱われる。二重ニックは、遺伝子標的に対する所望の効果に応じて、ＮＨＥＪまたはＨＤＲのいずれかによって修復することができる。したがって、特異性および低いオフターゲット効果が重要である場合、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して、２つのｇＲＮＡを標的配列のすぐ近く、かつゲノムＤＮＡの反対鎖上に設計することによって二重ニックを作成すると、いずれか１つのｇＲＮＡがゲノムＤＮＡを変化させないニックをもたらすので、オフターゲット効果が低下する。
２つの不活性触媒ドメイン（死んだＣａｓ９、またはｄＣａｓ９）を含有するＣａｓ９酵素の修飾バージョンは、ヌクレアーゼ活性を有さないが、ｇＲＮＡ特異性に基づいて、依然としてＤＮＡに結合することができる。ｄＣａｓ９は、不活性酵素を既知の調節ドメインに融合することによって、ＤＮＡ転写調節因子が遺伝子発現を活性化または抑制するためのプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列へのｄＣａｓ９単独の結合は、遺伝子転写を妨害し得る。
標的配列の選択および／または設計を支援するために利用可能な、公に利用できるいくつかのツール、ならびに異なる種の異なる遺伝子について生物情報学的に決定した固有のｇＲＮＡのリスト、例えば、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ－ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ、ＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒなどが数多くある。
ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するためには、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方が標的細胞において発現されなければならない。挿入ベクターは、単一のプラスミド上に両方のカセットを含有することができ、あるいはカセットは２つの別個のプラスミドから発現される。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅのｐｘ３３０プラスミドなどが市販されている。
「ヒットエンドラン」または「イン－アウト」－２工程組換え手順を含む。第１の工程では、二重陽性／陰性選択マーカーカセットを含む挿入型ベクターを使用して、所望の配列変化を導入する。挿入ベクターは、標的遺伝子座と相同性を有する単一の連続領域を含み、目的の変異を有するように修飾される。この標的化構築物を、相同領域内の１つの部位で制限酵素を用いて線状化し、細胞に電気穿孔し、陽性選択を行って相同組換え体を単離する。これらの相同組換え体は、選択カセットを含む介在ベクター配列によって分離された局所重複を含む。第２の工程では、標的化クローンを陰性選択に供して、重複配列間の染色体内組換えによって選択カセットを失った細胞を特定する。局所的組換え事象は、重複を除去し、組換え部位に応じて、対立遺伝子は、導入された変異を保持するか、または野生型に戻る。最終結果は、いずれの外因性配列も保持することなく所望の修飾を導入することである。
「二重置換」または「タグおよび交換」戦略－ヒットエンドラン手法と同様の２工程選択手順を含むが、２つの異なる標的化構築物の使用を必要とする。第１の工程では、３’および５’相同性アームを有する標準的なターゲティングベクターを使用して、変異が導入される位置の近くに二重陽性／陰性選択可能カセットを挿入する。電気穿孔および陽性選択の後、相同的に標的化されたクローンを特定する。次に、所望の変異と相同する領域を含む第２のターゲティングベクターを標的化クローンに電気穿孔し、陰性選択を適用して選択カセットを除去し、変異を導入する。最終対立遺伝子は、望ましくない外因性配列を排除しながら所望の変異を含有する。
部位特異的リコンビナーゼ－Ｐ１バクテリオファージ由来のＣｒｅリコンビナーゼおよび酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＦｌｐリコンビナーゼは、それぞれ固有の３４塩基対のＤＮＡ配列（それぞれ「Ｌｏｘ」および「ＦＲＴ」と呼ばれる）を認識する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、Ｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位のいずれかに隣接する配列は、ＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼのそれぞれの発現時に部位特異的組換えによって容易に除去することができる。基本的に、部位特異的リコンビナーゼシステムは、相同組換え後に選択カセットを除去するための手段を提供する。トランスポザーゼ－本明細書で使用される場合、「トランスポザーゼ」という用語は、トランスポゾンの末端に結合し、トランスポゾンのゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。本明細書で使用される場合、「トランスポゾン」という用語は、単一細胞のゲノム内の異なる位置に移動することができるヌクレオチド配列を含む可動性遺伝要素を指す。このプロセスにおいて、トランスポゾンは、変異を引き起こし、かつ／または細胞のゲノム中のＤＮＡの量を変化させることができる。
例えば脊椎動物の細胞内で転位することもできる、いくつかのトランスポゾンシステム、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ［Ｉｚｓｖａｋ ａｎｄ Ｉｖｉｃｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）９，１４７－１５６］、ｐｉｇｇｙＢａｃ ［Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００７）１５，１３９－１４５］、Ｔｏｌ ２［川上ら、ＰＮＡＳ（２０００）９７（２１）：１１４０３－１１４０８］またはＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ ［Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｃ １，（２００３）３１（２３）：６８７３－６８８１］などが、単離または設計されている。一般に、ＤＮＡトランスポゾンは、単純なカットアンドペースト方式で１つのＤＮＡ部位から別のＤＮＡ部位に転位する。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プラットフォームを使用したゲノム編集－このゲノム編集プラットフォームは、哺乳動物生細胞のゲノム内のＤＮＡ配列の挿入、欠失または置換を可能にするｒＡＡＶベクターに基づく。ｒＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）分子であり、陽性または陰性のいずれかが感知され、約４．７ ｋｂの長さである。これらの一本鎖ＤＮＡウイルスベクターは、高い形質導入率を有し、ゲノム内の二本鎖ＤＮＡ切断の非存在下で内因性相同組換えを刺激するという独特の特性を有する。当業者は、所望のゲノム遺伝子座を標的とし、細胞内で全体的および／または微妙な内因性遺伝子変更の両方を実施するためのｒＡＡＶベクターを設計することができる。ｒＡＡＶゲノム編集は、単一の対立遺伝子を標的とし、いかなるオフターゲットゲノムも変更しないという利点を有する。ｒＡＡＶゲノム編集技術は、例えばＨｏｒｉｚｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）からｒＡＡＶ ＧＥＮＥＳＩＳ（商標）システムとして市販されている。
有効性を認定し、配列変化を検出するための方法は、当技術分野で周知であり、ＤＮＡ配列決定、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイ、例えばＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロットおよびドットブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
特定の遺伝子における配列変化はまた、例えばクロマトグラフィー、電気泳動法、ＥＬＩＳＡなどの免疫検出アッセイおよびウエスタンブロット分析および免疫組織化学を使用してタンパク質レベルで決定することができる。
スプライソソーム活性の阻害は、培養中の細胞の増殖阻害または細胞傷害性を使用するなど、当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価することができる。追加的または代替的に、選択内因性遺伝子転写物のスプライシングを測定するインビトロアッセイを実施することができる。そのような方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｒｓｔｉｎ Ａ．Ｅｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｖｅｒｏｎｉｃａ Ｋ．Ｕｒａｂｅ、およびＭｅｌｉｓｓａ Ｓ．Ｊｕｒｉｃａ、「Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ」、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ．著者原稿；ＰＭＣ ２０１８年３月１日、に説明されている。
本発明のいくつかの実施形態の薬剤は、それ自体を、または適切な担体もしくは賦形剤と混合される医薬組成物で生物に投与することができる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を含む、本明細書に記載の活性成分の１つ以上の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
本明細書において、「有効成分」という用語は、生物学的効果を説明できる、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤を指す。
以下、交換可能に使用され得る「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対して重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの語句の下に含まれる。
本明細書において、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖およびデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の製剤化および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版にて見出すことができる。
適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸または非経口送達、例えば、筋肉内、皮下および髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、心臓内、例えば、右または左心室腔内、一般的な冠動脈内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が挙げられ得る。
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来のアプローチには、神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを利用する試みにおける薬剤の分子操作（例えば、それ自体がＢＢＢを通過することができない薬剤と組み合わせて、内皮細胞表面分子に対して親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の生成）；薬剤の脂質溶解度が増加するように設計される薬理学的戦略（例えば、水溶性薬剤と脂質またはコレステロール担体とのコンジュゲーション）；および 高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一時的な破壊（頸動脈中へのマンニトール溶液の注入またはアンジオテンシンペプチドなどの生物学的に活性な薬剤の使用により生じる）が含まれる。しかしながら、これらの戦略の各々は、制限、例えば侵襲的外科処置に関連する特有のリスク、内因性輸送系に特有の制限によって課されるサイズ制限、ＣＮＳの外側で活性であり得る担体モチーフから構成されるキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、およびＢＢＢが破壊される脳の領域内の脳損傷のリスクの可能性などを有するので、最適ではない送達方法である。
あるいは、例えば、医薬組成物を患者の組織領域に直接注射することによって、全身的ではなく局所的に医薬組成物を投与することができる。
「組織」という用語は、１つまたは複数の機能を果たすように設計された細胞からなる、生物の一部分を指す。例としては、脳組織、網膜、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、骨、軟骨、結合組織、血液組織、筋肉組織、心臓組織、脳組織、血管組織、腎組織、肺組織、性腺組織、造血組織が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥方法によって製造することができる。
本発明のいくつかの実施形態に従って使用するための医薬組成物は、したがって、賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で製剤化することができ、これによって、活性成分の薬学的に使用可能な調製物への加工が容易になる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
注射の場合、医薬組成物の活性成分は、水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンガー液または生理学的塩緩衝液に製剤化され得る。経粘膜投与の場合、浸透されるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られている。
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体は、患者による経口摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物を、固体賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、顆粒の混合物を加工することで作製し、所望に応じて適切な補助剤を添加した後、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなどの充填剤；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム；および／または生理学的に許容されるポリマー、例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加してもよい。
糖衣錠コアには適切なコーティングが施されている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意選択的に含有し得る濃縮糖溶液を使用してもよい。識別のために、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
経口的に使用することができる医薬組成物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールで作られた軟密封カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により安定剤と混合して活性成分を含有し得る。軟カプセルの場合、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のための全ての製剤は、選択された投与経路に適した投与量でなければならない。
頬側投与の場合、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとることができる。
経鼻吸入による投与の場合、本発明のいくつかの実施形態による使用のための活性成分は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ－テトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。ディスペンサーで使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含めて製剤化され得る。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化され得る。注射用製剤は、単位剤形で、例えばアンプルで、または場合により防腐剤を添加した複数回投与容器で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンであってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含有してもよい。
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性調製物の水溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドもしくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなど、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。場合により、懸濁液はまた、適切な安定剤、または活性成分の溶解度を上げて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含有し得る。
あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌したパイロジェンフリーの水性溶液と構成するための粉末形態であってもよい。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化され得る。
本発明のいくつかの実施形態の状況での使用に適した医薬組成物には、有効成分が意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、白血病またはＭＤＳ）の症状を予防、緩和もしくは改善するため、または治療されている対象の生存を延長するために有効な有効成分（スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤）の量を意味する。
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
前白血病の動物モデルは、例えば、Ｍａｇｇｉｏ ｅｔ ａｌ．、Ｙａｌｅ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．（１９７８）５１（４）：４６９－７６およびＣｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．（２０１３）Ｊｕｎ；３２（０）：６３－７６に記載されている。
本発明の方法で使用されるあらゆる調製物について、治療有効量または用量は、最初にインビトロおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は、動物モデルに製剤化して、所望の濃度または力価を達成することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書に記載の活性成分の毒性および治療有効性は、インビトロ、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを使用して、ヒトで使用するための投与量の範囲を策定することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて変化し得る。正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．，１９７５，「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃｈ．１ ｐ．１を参照されたい）。
投与量および投与間隔を個々に調整して、生物学的効果を誘導または抑制するのに十分な活性成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を前白血病細胞（例えば造血幹細胞および前駆細胞）に与えることができる。ＭＥＣは調製物ごとに異なるが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個体の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して血漿濃度を決定することができる。
予防される状態の重症度および応答性に応じて、投薬は、単回または複数回の投与であってもよく、一連の治療は、数日から数週間、または治癒がもたらされるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
投与される組成物の量は、当然のことながら、治療される対象、苦痛の重大性、投与様式、処方医師の判断などに依存するであろう。
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望に応じて、有効成分を含有する１つ以上の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置、例えばＦＤＡ承認キットで提供され得る。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えば、ブリスターパックなどを含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための説明書を付随させてもよい。パックまたはディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に関連する通知に適合させてもよく、この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的投与に対する、政府機関の承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認されたラベル、または承認された製品添付文書の通知であってもよい。適合性医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、調製され、適切な容器に入れられ、上記でさらに詳述されるような、示される状態の治療についてラベルを付けられてもよい。
別の実施形態によれば、造血障害または悪性腫瘍の予防を強化するために、本発明は、治療に有益であり得るさらなる治療法を対象に投与することをさらに想定する。当業者は、そのような決定を行うことができる。
したがって、例えば、本明細書中に記載される組成物は、栄養補助食品、ホルモン療法、標的療法、免疫療法、化学療法、放射線療法または外科的処置と併せて投与され得る。そのような抗癌療法およびそれを利用する方法は、当業者に周知である。
本出願から満了までの特許の存続期間中に、スプライソソーム活性を阻害することができる多くの関連する薬剤が開発されることが予想され、薬剤という用語の範囲は、そのようなすべての新しい技術を先験的に含むことが意図される。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」およびそれらの活用形は、「含むが限定されない」ことを意味する。
用語「からなる」は、「含み、かつ限定される」ことを意味する。
「から本質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得るが、追加の成分、工程および／または部分が、特許請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合に限ることを意味する。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜および簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５、および６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書において数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内の任意の引用される数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指示数と第２の指示数との「間の範囲に及ぶ（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ）」、および第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲に及ぶ（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｆｒｏｍ）」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１および第２の指示数ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術および手順、例えば限定されないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の分野の当業者に公知であるか、または当業者によって公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される様式、手段、技術および手順を指す。
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行の抑止、実質的な阻害、遅延もしくは逆転、状態の臨床的もしくは審美的症状の実質的な改善、または状態の臨床的もしくは審美的症状の出現の実質的な予防を含む。
明確にするために別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせで、または本発明の他の任意の適切な実施形態に記載されて提供されてもよい。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
上記で正確に概説され、以下の特許請求の範囲の項で特許請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。
ここで、本発明を上記の説明と共に非限定的に例示する、以下の実施例に言及する。
一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験室手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；４，６８３，２０２号；４，８０１，５３１号；５，１９２，６５９号および５，２７２，０５７号に記載されている方法論；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．、ｅｄ．（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．、ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたい；利用可能な免疫測定法は、特許および科学文献に広範囲にわたり記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；３，８３９，１５３号；３，８５０，７５２号；３，８５０，５７８号；３，８５３，９８７号；３，８６７，５１７号；３，８７９，２６２号；３，９０１，６５４号；３，９３５，０７４号；３，９８４，５３３号；３，９９６，３４５号；４，０３４，０７４号；４，０９８，８７６号；４，８７９，２１９号；５，０１１，７７１号および５，２８１，５２１号を参照のこと；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ、Ｍ．Ｊ．、ｅｄ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．、ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．、Ｅｄｓ．（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ．Ｉ．、ｅｄ．（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌ．１－３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。これらの全ては、あたかも本明細書に完全に記述されるかのように、参照によって組み込まれる。他の一般参照は、本文書全体にわたり提供されている。その中の手順は、当技術分野で周知であり、読者の利便性のために提供される。そこに含まれるすべての情報は、参照によって本明細書に組み込まれる。
一般的な材料および実験手順
細胞
自家幹細胞移植からのサンプルを同定し、ＳＭＭについて配列決定した。これらのサンプルは、異種移植片モデルで研究することができる高頻度のヒトｐｒｅＬ－ＨＳＰＣを含んでいた。
動物
ＳＭＭの保有者由来のＰｒｅＬ－ＨＳＰＣを、ＮＳＧマウスまたはＮＳＧ－ＳＧＭ３の右大腿骨に注射した。注射したマウスおよび対照群を、スプライソソーム阻害剤で処置した。８週間後に骨髄細胞を採取し、抗ヒトＣＤ４５によってヒト細胞の頻度を推定することによって、ヒト生着を評価した。
タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）の阻害
同質遺伝子型マウスＳｒｓｆ２ＷＴおよび変異型（Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴ）ＭＬＬ－ＡＦ ９ ＡＭＬ細胞を、ＰＲＭＴ５阻害剤（ＧＳＫ ５９１）および全ＰＲＭＴ Ｉ型阻害剤（ＭＳ－０２３）を含む、いくつかのメチルトランスフェラーゼ／デメチラーゼ阻害剤（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｔｏｒｏｎｔｏからの化学プローブ収集物）でインビトロ処理した。ＳＦ３Ｂ１阻害剤、Ｅ７１０７を陽性対照と同じアッセイで使用した。
ＲＢＭ３９のプロテオソーム分解
インジスラムおよびスルホンアミド類似体Ｅ７８２０の効果を、最初に遺伝的に異なる１８のＡＭＬ細胞株のパネルにわたって試験した。
インビボ薬物研究
生着後にＳＭＭを保有する、骨髄細胞およびリンパ系細胞の両方を生着（多系統異種移植）させることができるＳＭＭ保有サンプルを使用した。ＳＭＭを調節するあらゆる処置がｐｒｅＬ－ＨＳＰＣを選択的に標的化しているかどうかを試験するために、処置群および未処置対照群において全ヒト生着を測定した。さらに、マウスから抽出されたヒト細胞におけるＳＭＭの変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）を、処理マウス対非処理マウスにおいて測定した。ＣＤ３４＋細胞（１０，０００～５０，０００）を、５匹の治療マウスおよび５匹の未治療マウスに大腿骨内（ＩＦ）注射した。注射後３５日目に、マウスを以下の化合物、すなわちＨ３Ｂ－８８００、ＧＳＫ３３２６５９５、ＭＳ－０２３、Ｅ７８２０、またはビヒクル対照で処置した。細胞注射後５６日目に、マウスを絶命させた。他の対照実験には、ヒト臍帯血由来および再発性前白血病性変異を有しない高齢者由来のＣＤ３４＋細胞を使用した同じ実験が含まれた。ｐｒｅＬ－ＨＳＰＣの標的化が完全白血病の治療よりも有利であるという証拠を提供するために、ＳＭＭを有するＡＭＬサンプルもＮＳＧマウスおよびＳＧＭ３マウスに注射し、白血病生着（ＣＤ３３＋）を同定した。
スプライソソームモジュレーターＥ７１０７のインビトロおよびインビボ投与
すべてのインビトロ実験のために、Ｅ７１０７をＤＭＳＯに溶解した。薬物感受性研究のために、細胞を１０μＭ～０．０５ｎＭのＥ７１０７に曝露した。インビボ投与のために、Ｅ７１０７をビヒクル（滅菌ＰＢＳ中の１０％エタノールおよび４％ツイーン８０）に溶解し、４ ｍｇ／ｋｇ／日でＩ．Ｖ．注射によって投与した。薬物有効性研究のために、薬物投与の開始前に全血球計算（ＣＢＣ）分析を行い、ＷＢＣ数平均が治療群とビヒクル群で同等であることを確認することによって無作為化を行った。全てのマウスにＥ７１０７を１０回連続して投与した。インビボ薬物研究またはデータ分析では盲検化を行わなかった。マウスＭＬＬ－ＡＦ ９白血病モデルにおけるＲＮＡ－ｓｅｑ分析のために、Ｅ７１０７を５回連続投与し、最後の投与の３時間後にマウスを絶命させ、ＢＭ Ｍａｃ １＋ＧＦＰ＋細胞をフローサイトメトリーによって精製した。
ＲＮＡ－ｓｅｑリードマッピング
すべてのヒトおよびマウスサンプルを同じパイプラインを使用して処理した。
工程１：リードを、Ｂｏｗｔｉｅ ｖ１．０．０およびＲＳＥＭ ｖ．１．２．４を使用して、それらのそれぞれのゲノムアセンブリにマッピングした。後者は、－ｖ ２でＢｏｗｔｉｅを呼び出すように内部修正され、パラメータ－－ｂｏｗｔｉｅ－ｍ １００－－ｂｏｗｔｉｅ－ｃｈｕｎｋｍｂｓ ５００－－ｃａｌｃ－ｃｉ－ｏｕｔｐｕｔ－ｇｅｎｏｍｅ－ｂａｍで遺伝子アノテーションファイル上で実行された。
工程２：工程１からのＢＡＭファイルを濾過してリードを除去し、ここで（ｉ）アライメントマップｑスコアは０であり、（ｉｉ）スプライスジャンクションオーバーハングは６ヌクレオチド未満であった。
工程３：パラメータ－－ｂｏｗｔｉｅ １－－ｒｅａｄ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ３－－ｒｅａｄ－ｅｄｉｔ－ｄｉｓｔ ２－－ｎｏ－ｍｉｘｅｄ－ｎｏ－ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ－－ｍｉｎ－ａｎｃｈｏｒ－ｌｅｎｇｔｈ ６－－ｓｐｌｉｃｅ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ０－－ｍｉｎ－ｉｎｔｒｏｎ－ｌｅｎｇｔｈ １０－－ｍａｘ－ｉｎｔｒｏｎ－ｌｅｎｇｔｈ １００００００－－ｍｉｎ－ｉｓｏｆｏｒｍ－ｆｒａｃｔｉｏｎ ０．０－－ｎｏ－ｎｏｖｅｌ－ｊｕｎｃｓ－ｎｏ－ｎｏｖｅｌ－ｉｎｄｅｌｓ－－ｒａｗ－ｊｕｎｃｓで呼び出されたＴｏｐＨａｔ ｖ ２．０．８ｂを使用して、残りのすべてのアライメントされていないリードをスプライスジャンクションアノテーションファイルにマッピングした。－－ｍａｔｅ－ｉｎｎｅｒ－ｄｉｓｔおよび－－ｍａｔｅ－ｓｔｄ－ｄｅｖ引数は、リードを構成的にスプライシングされたエクソンジャンクションにマッピングするＭＩＳＯ ｅｘｏｎ＿ｕｔｉｌｓ．ｐｙ ｓｃｒｉｐｔを使用して計算した。
工程４：スプライスジャンクションにアラインメントされたリードを工程２と同様に濾過した。
工程５：得られたすべてのＢＡＭファイルを組み合わせて、すべてのアライメントされたＲＮＡ－ｓｅｑリードの組み合わせファイルを作成した。
差次的スプライシングの同定および定量化
すべての選択的スプライシング事象についてのアイソフォーム割合を、ＭＩＳＯ ｖ ２．０を使用して定量した。構成的にスプライシングされたエクソンおよびイントロンを、ジャンクション全域のリードを使用して定量した。コンディショナルノックインマウスおよびノックアウトマウスをペアワイズ様式で比較し、各ペアについて、どちらかまたは両方のアイソフォームをサポートする２０以上のリードを含むスプライシング事象に分析を限定し、そこで事象は、サンプルペアにおいて選択的にスプライシングされていた。その事象のサブセットから、以下の基準を満たすものを差次的にスプライシングされたと定義した。（ｉ）両方のサンプルにおいて少なくとも２０の関連リードを有した、（ｉｉ）絶対的アイソフォームの割合の変化が１０％以上であった、（ｉｉｉ）ワーゲンメイカーズの枠組みを使用して計算した場合、アイソフォーム割合の統計分析が５以上のベイズ因子を有した。ヒトＡＭＬサンプルを、２８個すべてのＳＲＳＦ２野生型サンプルにわたるアイソフォーム割合の中央値を計算し、それを各ＳＲＳＦ２変異体サンプルとペアワイズ様式で比較することによって、ノックインマウスおよびノックアウトマウスと同じ方法論を用いて分析した。Ｍｘ１－Ｃｒｅ＋Ｓｒｓｆ２＋／＋またはＭｘ１－Ｃｒｅ＋Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／＋Ｅ７１０７処置マウスを、同じ方法論を使用して、それらのビヒクル処置対照物のアイソフォーム割合の中央値とペアワイズ様式で比較した。ＭＬＬ－ＡＦ９ ＡＭＬ形質転換マウスについては、Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈおよび野生型遺伝子型内で個別に群ベースの比較を行うのに十分な反復実験があった（各遺伝子型と処置の組み合わせについてＮ＝５）。Ｅ７１０７処置マウスとビヒクル処置マウスとを、各処置群内のアイソフォームリードの総数を用いて両側ウィルコクソン順位和検定で比較した。以下の基準を満たす場合、事象を差次的にスプライシングされたものとして分類した。（ｉ）両方のサンプルで少なくとも２０の関連リードを有した、（ｉｉ）絶対的アイソフォーム割合の中央値の変化が１０％以上であった、（ｉｉｉ）Ｐ値が０．０１未満であった。
スプライソソーム機構変異（ＳＭＭ）を示す細胞の治療標的化
本発明者らは、疾患発症前にスプライシング忠実度を変えるための新しい手段を検討した。この目的のために、ＳＭＭ白血病において優先的効果を示すスプライシングを標的とする手段として、以下のアプローチが特定された。
タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）の阻害によるスプライシング忠実度の低下：
Ｓｍタンパク質のタンパク質アルギニンメチル化の阻害によってスプライソソーム集合を阻害することは、治療的スプライシング阻害の代替手段を提供することが報告されている［Ｋｏｈ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）５２３：９６－１００］。具体的には、ＰＲＭＴ５の遺伝子欠失または薬理学的阻害により、Ｓｍタンパク質の対称性ジメチル化、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）に必要なプロセスおよびスプライソソーム集合が減少した［Ｋｏｈ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１５）、前掲］。これらの結果に基づいて、本発明者らは、アルギニンメチル化を阻害することによってスプライシング忠実度を低下させると、野生型対照物よりもＳＦ変異白血病細胞が強力に優先的に死滅することを今回発見した。
これらの研究は、Ｓｒｓｆ２変異細胞は、ＰＲＭＴ５阻害剤（ＧＳＫ５９１）および全ＰＲＭＴ Ｉ型阻害剤（ＭＳ－０２３）に対して感受性がより高いことを明らかにした（図１Ａ～図１Ｅ）。注目すべきことに、ＳＦ３Ｂ１阻害剤であるＥ７１０７を陽性対照と同じアッセイで使用した。同様の変異選択的効果が、ＧＳＫ５９１およびＭＳ－０２３のインビボ試験において見られた（図３）。注目すべきことに、それぞれアルギニンの非対称性および対称性ジメチル化を触媒するＩ型（ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ４およびＰＲＭＴ６）ならびにＩＩ型ＰＲＭＴ酵素（ＰＲＭＴ５およびＰＲＭＴ９）の両方が、スプライソソームの成分をメチル化する。スプライシング、ＰＲＭＴまたはＬＳＤ１の阻害剤に対する、ＳＭＭ、またはＰＲＭＴ５の部分的喪失を有するＡＭＬ細胞を図２に示す。ＭＬＬ－ＡＦ９ Ｓｒｓｆ２ＷＴ／ＷＴ；ＭＬＬ－ＡＦ９ Ｓｒｓｆ２Ｐ９５Ｈ／ＷＴまたはＭＬＬ－ＡＦ９ Ｐｒｍｔ ５＋／－細胞を、示された化合物によって（化合物ごとに、５つの上昇させた濃度）３８４ウェル中で７日間処理した。７日目の生存率をＭＴＳアッセイによって記録し、対照処理細胞（ＤＭＳＯで同等に希釈）に対する比として報告した。実験は生物学的トリプリケートで実行し、それぞれ個々の実行をテクニカルトリプリケートで繰り返した。
ＲＢＭ３９のプロテアソーム分解によるスプライシングの撹乱：
既知の抗がん特性を有するスルホンアミド薬物の部類が、それらの優勢な抗腫瘍作用機構としてスプライシングを阻害することが以前に発見された［Ｕｅｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１７）１３：６７５－６８０］。興味深いことに、これらの薬物は、細胞ユビキチンリガーゼ機構を利用して、重要なスプライソソームタンパク質であるＲＢＭ３９のプロテオソーム分解を促進する。これらの観察に基づいて、本発明者らは、スルホンアミドがＳＭＭを有する細胞に対して優先的効果を示すことを確認した（図４Ａ～図４Ｄ）。これには、ＲＮＡスプライシング因子に変異を有するまたは有さない同質遺伝子型細胞、ならびにＲＮＡスプライシング因子に自然発生の変異を有するＡＭＬ細胞に対するインジスラムの優先的効果を実証するデータが含まれる（図４Ａ～図４Ｄおよび図５Ａ～図５Ｃ）。これらの実験は、インジスラムおよびスルホンアミド類似体Ｅ７８２０の両方を使用して行った。
インジスラムおよびスルホンアミド類似体Ｅ７８２０の効果を、最初に遺伝的に異なる１８のＡＭＬ細胞株のパネルにわたって試験した。スルホンアミド曝露時の細胞生存率の測定により、多くのＡＭＬサブタイプにわたって強力な阻害活性による幅広い抗白血病効果が明らかにされ、ほとんどの細胞株がマイクロモル以下の感受性を示した。スプライシング因子の白血病関連変異に変異を有する白血病細胞は、スルホンアミドに対する感受性が最も高い細胞中にあることが見出された。さらに、スプライソソーム遺伝子変異を有しないいくつかのＡＭＬ細胞株も、スルホンアミドに対する感受性を示した。相対的ＤＣＡＦ１５ ｍＲＮＡ発現の評価により、ＤＣＡＦ１５ ｍＲＮＡの相対レベルの最高および最低が、Ｅ７８２０に対する応答の最高および最低とそれぞれ相関することが明らかになった。スプライソソーム遺伝子変異を有する白血病細胞に対するスルホンアミドの優先的効果は、Ｅ７８２０およびインジスラムへの曝露によって、内因性遺伝子座およびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＮＡＬＭ－６細胞）からのＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、およびＵ２ＡＦ１にホットスポット変異を発現するように操作された一連の同質遺伝子型ＡＭＬ株（Ｋ ５６２およびＴＦ－１）においてさらに確認された。各例において、スプライソソーム変異細胞は、スルホンアミドの増殖阻害に対してスプライソソーム野生型細胞よりも優先的に感応した。同質遺伝子型細胞では、Ｅ７８２０への曝露は、白血病細胞株においてＲＢＭ３９の同様の用量依存的分解をもたらした。
スプライソソーム変異細胞に対するスルホンアミドの優先的効果の基礎を理解するために、スプライソソーム遺伝子変異のノックインを含む、または含まない同質遺伝子型ＡＭＬ細胞のパネルにわたるＲＢＭ３９タンパク質レベルを評価した。これは、ＲＢＭ３９の分解が、スプライソソーム遺伝子変異の状態にかかわらず、細胞株にわたって同等の用量依存的様式で起こったことを示し（図５Ｂ）、残りの野生型スプライシング機能に対する依存性の増加が、スプライソソーム変異細胞のスルホンアミドに対する感受性の増加の基礎であり得ることを示唆した。スプライソソーム変異細胞がそれらの野生型対照物よりもスプライシングの変化に対して優先的に感応することを考慮して、１μＭのＥ７８２０（親Ｋ５６２細胞に対するＥ７８２０のＩＣ５０を意味する。図５Ｄ）で処理した親Ｋ５６２ならびにＳＦ３Ｂ１Ｋ７００ＥおよびＳＲＳＦ２Ｐ９５Ｈ変異を発現する同質遺伝子株のＲＮＡ配列決定を行った。並行して、ＳＦ３Ｂ１の分岐点への結合を妨げることによってスプライシングを阻害する小分子である、Ｅ７１０７で処理した同じ細胞株からＲＮＡ－ｓｅｑを実行した［Ｆｉｎｃｉ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．、（２０１８）、３２：３０９～３２０］。Ｅ７８２０またはＥ７１０７のいずれかで、各薬物の親Ｋ５６２細胞に対するＩＣ５０で処理すると、スプライソソーム遺伝子変異状態にかかわらず、ＤＭＳＯ処理と比較してカセットエクソンンスキッピングおよびイントロン保持が増加した。しかしながら、興味深いことに、等効力の非毒性用量では、Ｅ７８２０は、この用量でのＥ７１０７と比較して、各細胞型内および各スプライシングカテゴリにわたってスプライシングをより大きく変化させた。さらに、ＳＦ３Ｂ１野生型対照物と比較して、Ｅ７８２０で処理したＳＦ３Ｂ１Ｋ７００Ｅ細胞では、各タイプのスプライシング内でより多くの差次的スプライシング事象が確認された。これらのデータは、野生型細胞と比較したＳＦ３Ｂ１変異体に対するスルホンアミドの優先的効果の少なくとも１つの理由が、ＲＢＭ３９分解に対するＳＦ３Ｂ１変異体細胞のスプライシング応答の違いであることを示唆している。
本発明者らはまた、スルホンアミド曝露時の多数の差次的スプライシング事象が、アップレギュレーションされ、ＡＭＬ細胞の生存のために必要とされるＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）をコードするｍＲＮＡに関与することに気付いた。これらには、ＳＵＰＴ６Ｈ、ｈｎＲＮＰＨおよびＳＲＳＦ１０が含まれ、Ｅ７８２０曝露は、スプライソソーム変異細胞で最も顕著なイントロン保持をもたらした。さらに、ＲＢＭ３９の分解によってまた、スプライソソーム変異ＡＭＬにおけるＨＯＸＡ９標的遺伝子ＢＭＩ－１およびＭＹＢおよびいくつかのＲＢＰの異常スプライシングが、ＷＴ型の対照物と比較して増強された（Ｕ２ＡＦ２およびＲＢＭ３における異常スプライシング事象を含む）。さらに、Ｅ７８２０に応答した差次的スプライシング事象の遺伝子セット濃縮分析により、ＭＹＣおよびＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲシグナル伝達の標的、ならびに炎症に応答して関与するｍＲＮＡのダウンレギュレーションも明らかにされ、これらはすべてＡＭＬの病因または進行において重要であることが知られている。したがって、ＲＢＭ３９の遺伝的分解および薬理学的分解の両方が、白血病誘発性に必要なスプライシングならびに他の経路を破壊する。全体として、これらのデータは、スプライソソーム遺伝子変異の存在ならびにＤＣＡＦ１５発現が、ＡＭＬにおけるＲＢＭ３９分解に対する応答の重要な予測因子として役立ち得ることを示唆している。
ＡＭＬ／ＭＤＳ診断前のＳＭＭ細胞の治療標的化
上記の治療アプローチの各々は、明白なＭＤＳ、ＡＭＬおよび関連する骨髄性悪性腫瘍の状況で評価されており、ＳＭＭを保有する細胞に対する優先的効果を実証している。本発明者らは、前白血病期およびＡＲＣＨの前臨床モデルならびにインビトロおよびインビボにおける、スプライス阻害剤、例えばＰＲＭＴ阻害剤およびスルホンアミドの、ＳＭＭを保有するｐｒｅＬ－ＨＳＰＣに対する効果を試験している。
ＳＭＭを有する前ＡＭＬに対するスプライソソーム調節化合物のインビトロ有効性：
スプライソソーム調節化合物に対するｐｒｅＬ－ＨＳＰＣの応答性を判定するために、本発明者らは、ＳＭＭを保有するＣＤ３４＋ｐｒｅＬ－ＨＳＰＣをＭＳ５細胞と共培養している。試験される薬物には、臨床グレードのＳＦ３ｂ調節化合物（Ｈ３Ｂ－８８００）、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤（ＧＳＫ３３２６５９５）、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤（ＭＳ－０２３）、スルホンアミド化合物（Ｅ７８２０）、またはビヒクル対照治療薬が含まれる。ウェル（６ウェルプレート）あたり１０，０００のｐｒｅＬ－ＨＳＰＣを７２時間培養した後、薬物をさらに７２時間添加する。曝露後の細胞は、ＦＡＣＳ分析に供し、ＳＭＭの対立遺伝子量ならびにスプライシングおよび遺伝子発現についてＲＮＡ－ｓｅｑで分析する。これらのインビトロ試験により、様々な治療下での細胞の死および生存の機構をよりよく理解すること、および異なる薬物の組み合わせを試験することが可能になる。
ＳＭＭを有する前ＡＭＬに対するスプライソソーム調節化合物のインビボ有効性の研究：
生着後にＳＭＭを保有する骨髄細胞およびリンパ系細胞の両方を生着させる（多系統異種移植）ことができるサンプルを、多系統異種移植が可能な、寛解期にあるＡＭＬ患者からの自己移植バッグと共にこれらの研究で使用する。ＳＭＭを調節するあらゆる処置がｐｒｅＬ－ＨＳＰＣを選択的に標的化しているかどうかを試験するために、処置群および未処置対照群において全ヒト生着を測定する。さらに、マウスから抽出されたヒト細胞におけるＳＭＭのＶＡＦを、処置マウス対非処置マウスにおいて測定する。ＣＤ３４＋細胞（１０，０００～５０，０００）を、５匹の処置マウスおよび５匹の未処置マウスに大腿骨内（ＩＦ）注射する。注射後３５日目に、マウスを以下の化合物、すなわちＨ３Ｂ－８８００、ＧＳＫ３３２６５９５、ＭＳ－０２３、Ｅ７８２０、またはビヒクル対照で処置する。細胞注射後５６日目に、マウスを絶命させる。他の対照実験には、ヒト臍帯血由来および再発性前白血病性変異を有しない高齢者由来のＣＤ３４＋細胞を使用した同じ実験が含まれる。ｐｒｅＬ－ＨＳＰＣの標的化が完全白血病の治療よりも有利であるという証拠を提供するために、本発明者らはまた、ＳＭＭを有するすべてのＡＭＬサンプルをＮＳＧマウスおよびＳＧＭ３マウスに注射し、白血病生着（ＣＤ３３＋）を同定している。白血病生着サンプルが同定された後、それらを注射し、上記でｐｒｅＬ－ＨＳＰＣのために提案されたように、治療対ビヒクルで再び分析する。
本発明をその特定の実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替形態、修正形態および変形形態が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範囲に含まれるすべてのそのような代替形態、修正形態および変形形態を包含することが意図されている。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、その全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用される場合において、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
さらに、本出願のあらゆる優先権書類は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (29)

  1. 高リスク対象における造血障害または悪性腫瘍を予防する方法であって、前記対象がスプライシング因子の１つ以上の変異について陽性であり、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤を前記対象に投与することを含み、前記薬剤がＲＢＭ３９活性を阻害しない、方法。
  2. スプライシング因子の１つ以上の変異について陽性である、高リスク対象における造血障害または悪性腫瘍の予防に使用するための、スプライソソーム活性を阻害することができる薬剤であって、ＲＢＭ３９活性を阻害しない薬剤。
  3. スプライソソーム活性を阻害することができる前記薬剤が、ＥＣ番号２．１．１．３１９、２．１．１．３２０または２．１．１．３２１に示されるタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）を阻害することができる薬剤である、請求項１に記載の方法、または請求項２に記載の使用のための薬剤。
  4. スプライソソーム活性を阻害することができる前記薬剤が、スプライシング阻害剤である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用のための薬剤。
  5. スプライソソーム活性を阻害することができる前記薬剤が、プロテアソーム分解化合物である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用のための薬剤。
  6. 前記ＰＲＭＴが、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法または請求項３に記載の使用のための薬剤。
  7. 前記ＰＲＭＴを阻害することができる前記薬剤が、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小分子である、請求項３もしくは６に記載の方法または請求項３もしくは６に記載の使用のための薬剤。
  8. 前記薬剤が、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤ＭＳ－０２３二塩酸塩、またはその誘導体もしくは類似体である、請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  9. 前記ＰＲＭＴがＰＲＭＴ５を含む場合、前記薬剤がＧＳＫ５９１二塩酸塩またはＧＳＫ３３２６５９５、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  10. 前記ＰＲＭＴがＰＲＭＴ１を含む場合、前記薬剤がＣ－２１、フラミジン二塩酸塩またはＴＣ－Ｅ ５００３、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  11. 前記ＰＲＭＴがＰＲＭＴ３を含む場合、前記薬剤が、ＳＧＣ７０７またはＵＮＣ２３２７、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  12. 前記ＰＲＭＴがＰＲＭＴ４を含む場合、前記薬剤が、ＭＳ０４９オキサレート塩またはＴＰ０６４、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  13. 前記ＰＲＭＴがＰＲＭＴ６を含む場合、前記薬剤が、ＭＳ０４９オキサレート塩、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の方法、または請求項３、６もしくは７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  14. 前記スプライシング阻害剤が、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小分子である、請求項４に記載の方法または請求項４に記載の使用のための薬剤。
  15. 前記スプライシング阻害剤が、スデマイシン、スプライソスタチン、ＦＲ９０１４６４、プラジエノライド、ヘルボキシジエン、メアヤマイシン、イソギンクゲチン、マドラシン（Ｍａｄｒａｓｉｎ）、テトロカルシン、Ｎ－パルミトイル－Ｌ－ロイシン、プソロム酸、クロトリマゾール、ＮＳＣ６３５３２６、ナプタザリン、エリスロマイシン、ＳＡＨＡ、ガルシノール、オカダ酸、ＮＢ－５０６、ユビスタチン、Ｇ５、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される、請求項４もしくは１４に記載の方法または請求項４もしくは１４に記載の使用のための薬剤。
  16. 前記スプライシング阻害剤が、Ｅ７１０７、Ｈ３Ｂ－８８００、ＦＤ－８９５、ＧＥＸ１Ｑ１－５、ＲＱＮ－１８６９０、ＮＳＣ６５９９９９、ＢＮ８２８６５、ＮＳＣ９５３９７、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、スプライトマイシン、タウトマイシン、ミクロシスチン、ジオスピリン、クロルヘキシジン、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される、請求項４、１４もしくは１５のいずれか一項に記載の方法、または請求項４、１４もしくは１５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  17. 前記プロテアソーム分解化合物が、ＳＦ３ｂ複合体のコアメンバー、Ｕ２ＡＦ複合体、またはＰＲＭＴ酵素およびＲＮＡ結合タンパク質からなる群から選択されるスプライソソーム関連タンパク質を標的とする、請求項５に記載の方法または請求項５に記載の使用のための薬剤。
  18. 前記プロテアソーム分解化合物が、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＦ３Ｂ３、ＰＨＦ５ａ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＰＲＭＴ５、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ２、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、ＰＲＭＴ８、ＳＵＰＴ６Ｈ、ｈｎＲＮＰＨおよびＳＲＳＦ１０からなる群から選択されるスプライソソーム関連タンパク質を標的とする、請求項１７に記載の方法または使用のための薬剤。
  19. 前記変異が、Ｕ２ＡＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２およびＺＲＳＲ２からなる群より選択されるスプライシング因子にある、請求項１もしくは３～１７のいずれか一項に記載の方法、または請求項２～１７のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  20. 前記変異が点変異である、請求項１もしくは３～１９のいずれか一項に記載の方法、または請求項２～１９のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  21. 前記点変異が、挿入、欠失または置換である、請求項２０に記載の方法または請求項２０に記載の使用のための薬剤。
  22. 前記変異が、Ｕ２ＡＦ１ポリペプチド中のＳ３４またはＱ１５７における変異である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法または請求項１９～２１のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  23. 前記変異が、ＳＦ３Ｂ１ポリペプチドにおけるＲ６２５Ｌ、Ｎ６２６Ｈ、Ｋ７００Ｅ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｑ９０３Ｒ、Ｅ６２２Ｄ、Ｒ６２５Ｇ、Ｑ６５９Ｒ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｄ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ６６６ＲまたはＧ７４２Ｄの変異である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法または請求項１９～２１のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  24. 前記変異が、ＳＲＳＦ２ポリペプチド中のＰ９５における変異である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法または請求項１９～２１のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  25. 前記変異が、前白血病性造血幹細胞および前駆細胞において検出される、請求項１もしくは３～２４のいずれか一項に記載の方法、または請求項２～２４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  26. 前記変異が、前記対象の生体サンプル中で検出される、請求項１もしくは３～２５のいずれか一項に記載の方法、または請求項２～２５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  27. 前記造血障害または悪性腫瘍が白血病である、請求項１もしくは３～２６のいずれか一項に記載の方法、または請求項２～２６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  28. 前記造血障害または悪性腫瘍が骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、請求項１もしくは３～２６のいずれか一項に記載の方法、または請求項２～２６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
  29. 前記対象がヒト対象である、請求項１もしくは３～２８のいずれか一項に記載の方法、または請求項２～２８のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
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