JP2022508458A - 薬物送達システム - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗癌治療のためのナノ医療分野に関する。白金系化合物を使用する癌治療には、生体適合性、担持効率、蓄積中および血流中への薬物漏出といった複数の欠点が存在している。より詳細には、この欠点は、白金を送達するためのナノ担体の性質に起因する欠点である。本発明者らの発見によると、新規なナノシステムにより、in vivoにおける白金系薬物の性能、動態および効能が改善されうる。とりわけ、本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関する。このナノ粒子は、少なくとも、（ａ）白金系薬物、（ｂ）ポリＬ－アルギニン、および（ｃ）ヒアルロン酸から形成される。具体的には、本発明者らは、これらのナノ粒子の封入効率を測定した。また、in vitroにおける実験として、２Ｄ細胞培養（Ｂ６ＫＰＣ３細胞、Ａ５４９細胞およびＨＴ－２９細胞に関する生存性研究）と、３Ｄ細胞モデル（ＨＴＣ－１１６から作製したスフェロイド）とを実施して、封入効率を実証した。さらに、in vivoにおける実験も実施して（ナノ粒子または比較対象であるオキサリプラチン溶液をマウスに静脈内注入した）、封入効率を実証した。

Description

本発明は、抗癌治療のためのナノ医療分野に関しており、少なくとも白金系薬物が封入されている新規なナノ粒子を提案する。
また、本発明は、これらのナノ粒子の製造方法、これらのナノ粒子を含んでいる医薬組成物、および、治療におけるこれらのナノ粒子の利用に関する。
過去数十年の間、抗癌治療のためのナノ医療分野では、薬物送達研究に目覚ましい進歩があったことが知られている。ナノ医療製品は治療戦略の改善において非常に有望視されている。これは、ナノ医療製品ならば、組織または細胞特異的に標的化された薬物送達によってバイオアベイラビリティおよび治療効率などの薬物の性能を向上させることができ、また毒性も抑制することができるためである。
手術によってはほとんど対処できず、現在の化学療法薬に強い耐性のある腫瘍および／または癌に対して、標的化された薬物送達が特に有効であることは明白である。例えば、膵管腺癌は膵臓癌の最も一般的な形態であり、この癌は膵頭部に発生するため、さながら難攻不落の要塞といった様相を呈している。
腫瘍に対するナノ医療の選択性を増やすために、「受動的標的化」と「能動的標的化」の２つの主だったアプローチが考案されてきた。受動的標的化は、迷入血管構造およびリンパ管への排出低下に起因する、ＥＰＲ（Enhanced permeation and retention）効果を利用している。能動的標的化は、親和性リガンド（抗体、ビタミンなど）、標的化ペプチド、腫瘍標的化または特定の受容体（すなわちＣＤ４４）の過剰発現を利用している。
腫瘍および／または癌の治療用とされている薬物の中でも、白金系薬物は、世界中で承認されている（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの白金（ＩＩ）系化合物）。
米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）が管理している臨床試験データベースには、１８０箇国超に及ぶ１８．６万件超の臨床試験が登録されている。このデータベースによると、現在進行中の臨床試験における有効成分として、他のどの抗癌剤よりもシスプラチンが挙げられている。欧州臨床試験レジストリにおいても、同様の傾向が見られる。このレジストリは、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって管理されており、欧州臨床試験データベース（ＥｕｄｒａＣＴ）プロトコルには２．５万件超の臨床試験が登録されている。また、ＷＨＯの国際臨床試験登録プラットフォームでも同様の傾向が見られる。
これらの作用薬は、化学療法における重要な成分である。しかし、用量を制限する重篤な副作用や、腫瘍が急速に耐性を獲得するという制限がある（とりわけ、シスプラチンの場合）。臨床的に確立された白金化合物の中でも、シスプラチンは、臓器（神経系、コルチ器官、腎臓など）に対する用量依存性の毒性が最も強い。カルボプラチンおよびオキサリプラチンは、従来の用量では腎毒性を示さない。また、これらの薬物はいずれも、シスプラチンとは異なり催吐性は穏やかである。オキサリプラチンの用量を制限するの最も重篤な副作用は、末梢性の知覚神経障害である。また、オキサリプラチン処置に引き続く重度のアナフィラキシーが報告されている。用語「オキサリプラチン誘導性の過敏性反応」とは、急性の知覚神経性症状、ＩＬ－６およびＴＮＦαの血漿濃度の上昇を伴うサイトカイン放出症候群、または、抗体形成およびヒスタミン放出を伴う免疫反応のいずれかを表しうる。
白金系化合物の作用機序には、以下の４つの重要なステップが含まれている。（i）細胞への取込み。（ii）アクア化／活性化。（iii）ＤＮＡへの結合。（iv）細胞がＤＮＡを損傷することにより導かれる細胞死。
シスプラチンは細胞内で加水分解（アクア化）されて、反応性の高い荷電白金錯体［Ｐｔ（ＮＨ３）２ＣｌＨ２Ｏ］＋を生成する。アクア化はほとんど細胞質内で発生し、血流中ではこの活性化は抑制される。この錯体は、さらに加水分解された後、Ｎ７原子（好ましくはグアニン）を介してＤＮＡの塩基と結合する。このＤＮＡ架橋メカニズムにより、細胞分裂および複製が妨害される。損傷したＤＮＡによって修復機構が開始されるが、修復が成功しない場合には、アポトーシスに至る。
オキサリプラチンは、シスプラチン耐性の癌に対して使用され、シスプラチンとの交差耐性を示さない。オキサリプラチンは有機白金構造を取っており、白金原子が、ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨとも称する）および脱離基であるシュウ酸リガンドと錯体化している。アクア化すると、巨大分子と共有結合する一時的な反応種が何種類か形成される（モノアクアＤＡＣＨ白金、ジアクアＤＡＣＨ白金など）。最初は一量体付加物のみが形成されるが、最終的には、オキサリプラチンが２つのヌクレオチド塩基と同時に結合し、これによりＤＮＡが架橋される。この架橋は、隣接する２つのグアニン（ＧＧ）、隣接するアデニンおよびグアニン（ＡＧ）、ならびに介在ヌクレオチドを挟むグアニン（ＧＮＧ）のＮ７位の間で形成される。この架橋によって、ＤＮＡの複製および転写が阻害される。なお、オキサリプラチンの細胞毒性は、細胞周期に非特異的である。
上述した通り、シスプラチン療法の用量を制限する毒性を低減するために設計された第２世代の白金錯体に関する研究は、カルボプラチンの開発という成功を収めた。カルボプラチンは、腎毒性の発生が顕著に低下している。
第３世代の白金錯体の設計で目指されたのは、シスプラチン／カルボプラチンに対する細胞の耐性を克服することであった。何千もの白金錯体が設計・評価された中で、ｃｉｓ－ジクロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＤＡＣＨＰｔＣｌ２、二塩素ジアミノシクロヘキサン白金とも称する）が、強力な抗癌剤として発見された。この錯体は、シスプラチンのアミンリガンドをＤＡＣＨに改変したものである。
白金化合物は、リガンドの性質により水溶性が異なる。実際に、例えば、オキサリプラチンの溶解度は６ｍｇ／ｍＬである。ＤＡＣＨＰｔＣｌ２の溶解度は０．２５ｍｇ／ｍＬであるが、硝酸銀ＡｇＮＯ３の存在下におけるＤＡＣＨＰｔ（ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ））への変換反応により大幅に向上する（７．５ｍｇ／ｍＬ）。
完全に解明されていない内因性反応を除くと、副作用の大部分は、薬物分布特異性の低さに起因することが多い。そしてこれにより、重篤な二次副作用が生じる（上記を参照）。
溶解性および標的化に関する問題を解決するために、白金化合物の性能を改善するナノ担体を開発する試みが多く報告されている。
白金化合物の封入を目論む担体の第一の類型は、リポソームである。例えば、Senzer et al. (Mol Cancer Ther. 2009;8 (Supplement 1):C36-C36)に開示されているものや、Hang et al. (Biochem Compd. 2016;4(1):1)に開示されているものがあった。
他の類型の白金化合物用担体も研究された。例えば、蒸留水中において、ＤＡＣＨＰｔＣｌ２とポリ（エチレングリコール）－ポリ（グルタミン酸）ブロック共重合体との高分子－金属錯体の形成により高分子ミセルが調製された（Cabral et al.: J Control Release. 2005;101(1-3):223-232 and J Control Release. 2007;121(3):146-155）。Lipoplatin (TM)は、商標登録されたシスプラチン（ＣＰＴ）のリポソーム製剤であり、ＦＤＡの承認を受けている。アロプラチン(TM)（Ｌ－ＮＤＤＰ、ＡＲ７２６）は、化学療法用の白金アナログであるｃｉｓ－（ｔｒａｎｓ－Ｒ，Ｒ－１，２－ジアミノシクロヘキサン）ビス（ネオデカン酸）白金（ＩＩ）（ＮＤＤＰ）を封入した、細胞毒性物質として市販されているリポソーム製品である。
しかし、白金送達用のナノ担体に頻発する複数の欠点を解決する必要が、以前として残されている（生体適合性、担持効率、蓄積中および血流中への薬物漏出など）。
さらに、標的化作用によって、無差別的な全身性の分布および非標的組織への蓄積を防止できるかもしれない。そのため、白金化合物の副作用の発生を抑制できるかもしれない（神経毒性（神経障害）、視覚障害、聴器毒性、骨髄抑制など）。
これらの事実に基づくと、白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物および／または白金（ＩＶ）系薬物、好ましくはＤＡＣＨＰｔなどの白金（ＩＩ）系薬物）の、in vivoにおける性能、動態および効能を改善する傾向を、ナノ粒子システムは依然として有している。
このように、白金化合物などの薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物および／または白金（ＩＶ）系薬物、好ましくはＤＡＣＨＰｔなどの白金（ＩＩ）系薬物）の効能を、封入効率、バイオアベイラビリティの向上、悪性細胞への標的化された薬物送達による治療効果の増強といった点において改善し、さらに、健康な組織に対する暴露を最小限にとどめ、毒性が低減された抗癌製品を提供することが、本技術分野において必要とされている。
また、生体適合性および生分解性を有しており、かつ、白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物および／または白金（ＩＶ）系薬物、好ましくはＤＡＣＨＰｔなどの白金（ＩＩ）系薬物）との適合性があるナノ担体を含有する抗癌剤を提供することも、本技術分野において必要とされている。
また、化学合成を必須としないナノ担体を含有する抗癌剤を提供することも、本技術分野において必要とされている。
また、随時使用可能な凍結乾燥ナノ粒子の形態に製剤化できる、安定な抗癌剤を提供することも、本技術分野において必要とされている。
本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関する。このナノ粒子は、少なくとも、（ａ）白金系薬物、（ｂ）ポリＬ－アルギニンおよび（ｃ）ヒアルロン酸から形成されている。
また、本発明は、上記ナノ粒子の製造方法、当該方法によって得られるナノ粒子、上記ナノ粒子の１種類以上と薬学的に許容可能な添加剤の１種類以上とを含んでいる医薬組成物、ならびに、癌の予防および／または治療に用いるための上記ナノ粒子にも関する。
蒸留水中およびヒト血清中にて１時間インキュベートした後における、蛍光標識したＰＡｒｇ－ＨＡナノ粒子のＳＰＴ（Single Particle Tracking）計測の結果を示す。 ３７℃にて２４時間インキュベートした後における、Ｂ６ＫＰＣ３細胞（Ａ）、ＨＴ－２９細胞（Ｂ）およびＡ５４９細胞（Ｃ）の生存性評価の結果を示す。オキサリプラチン、ブランクＮＰおよびＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰの濃度を、段階的に変化させている（０～２００μＭ）。平均値±ＳＤ。Ａにおいてはｎ＝６。ＢおよびＣにおいてはｎ＝３。 ３５．９μｇのＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子（図３Ａ）またはオキサリプラチン溶液（図３Ｂ）を静脈内ボーラス注入したマウスにおける、Ｐｔ誘導体の血漿濃度－時間の曲線を示す。丸印「○」は、個々のマウスにおいて観測された血漿濃度を表す。曲線は、データから求めた最適近似曲線を表す。図３Ａでは、横軸は時刻（単位：時間）を表し、縦軸はＤＡＣＨＰｔの濃度（単位：ｍｇ／Ｌ）を表す。図３Ｂでは、横軸は時刻（単位：時間）を表し、縦軸はオキサリプラチン溶液の濃度（単位：ｍｇ／Ｌ）を表す。 ＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰおよびオキサリプラチンでそれぞれ処理した後における、多細胞ＨＴ１１６スフェロイドの正規化した体積を示す（濃度：５μＭ）。 ＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰおよびオキサリプラチンでそれぞれ処理した後における、多細胞ＨＴ１１６スフェロイドの正規化した体積を示す（濃度：２５μＭ）。 ブランクＮＰ、ＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰおよびオキサリプラチンでそれぞれ処理した後における、多細胞ＨＴ１１６スフェロイドの正規化した体積を示す（濃度：５０μＭ）。 未処理の多細胞ＨＴ１１６スフェロイドと、ＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰおよびオキサリプラチン溶液（濃度：５０μＭ）でそれぞれ処理した後におけるスフェロイドとについて、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目および７日目に撮影した写真を示す。
本発明者らは、安定なナノ粒子（本発明ではＮＰとも称する）を見出した。
このナノ粒子は、白金系有効成分を効率的に組込むことができ、薬物動態プロファイルに応じた白金系有効成分の放出による最適な治療活性を保証し、とりわけ抗癌活性を最適化できる。
より正確には、本発明者らが見出したナノ粒子は、（i）白金系薬物、（ii）ポリＬ－アルギニンおよび（iii）ヒアルロン酸の組合せを含んでいる。このナノ粒子には、治療上有効な量の白金系薬物が封入されている。白金系薬物は、異なる構造および／または生理化学的特性を有している様々な白金系薬物から選択されてよい（シスプラチン、ＤＡＣＨＰｔなど）。
さらに、本開示により提供される白金を含有しているナノ粒子は、有効成分による最適な治療効果を保証する薬物動態プロファイルに応じて、封入された白金系薬物を放出できる。本明細書の実施例に示されるように、ナノ粒子によれば、封入されていない同じ白金系薬物と比較して、封入された白金系薬物のＡＵＣを大幅に向上させられる。
ＡＵＣを向上させられる製剤に関して非常に驚くべきことに、本明細書に記載のナノ粒子は、封入されていない同じ白金系薬物と比較して、白金系薬物のＣｍａｘも向上させられる。
また、本開示に係るナノ粒子中に白金系薬物が封入されていることにより、血漿血液循環が実質的に増加する（分布半減期に反映されている）。その一方で、オキサリプラチン溶液と比較しても、排出半減期は延長されない。
さらに、本明細書の実施例において薬物動態シミュレーションで示したように、白金を含有しているナノ粒子は、内部に封入された白金系薬物の蓄積を防止できるが、その一方で、投与後は速やかに定常状態に達する。つまり、本開示に係る白金を含有しているナノ粒子は、白金系薬物を蓄積させることなく、内部に封入されている薬物による暴露性を高めることを保証できる。このような薬物動態プロファイルの証明するところによると、本明細書に記載の白金を含有しているナノ粒子は、反復投与レジメンに完全に適合している。
したがって、第１の態様によれば、本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関している。このナノ粒子は、以下の成分から少なくとも形成されている。
（ａ）白金系薬物
（ｂ）ポリＬ－アルギニン
（ｃ）ヒアルロン酸
したがって、本明細書に記載のナノ粒子は、白金系薬物送達システム（白金を含有している薬物送達システム）からなる。
好適な実施形態において、白金系薬物は、白金錯体（ＩＩ）、白金錯体（ＩＶ）、およびそれらの混合物から選択される白金錯体である。
いくつかの実施形態によれば、（ａ）白金系薬物は、白金（ＩＩ）系薬物、白金（ＩＶ）系薬物、およびそれらの混合物からなる群より選択され、好ましくは白金（ＩＩ）系薬物であり、より好ましくはＤＡＣＨＰｔである。本開示において、「白金系薬物」を「白金を含有している薬物」と表現する場合がある。
本発明のナノ粒子は、溶媒を使用せずに水溶液中で製造される。白金系薬物の水溶性が低いときは（例えば、塩素原子を有している場合）、塩素原子を除去することにより、水溶性の高い形態（例えば、塩素原子を有さない形態）に変換できる。白金系薬物の塩素形態を避けねばならない場合には、ポリＬ－アルギニン中は塩素原子を含んでいない必要がある。
いくつかの実施形態において、（ａ）白金系薬物は、塩素原子を欠いた形態で存在している。すなわち、白金系薬物は塩素を含んでいない。
本発明の意味において、「塩素原子を含んでいない」「塩素原子を欠いている」または「塩素を含有していない」という表現は、白金系薬物が塩素原子を全く含んでいないことを表している。つまり、（ａ）白金系薬物中に存在する塩素原子の数は、０である。
他の実施形態によれば、（ａ）白金系薬物は、塩素原子を含んでいる。
いくつかの実施形態によれば、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、塩酸塩の形態ではない。すなわち、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、塩化物イオンを欠いている（例えば、塩化物イオンを含有していない）。
本発明の意味において、「塩化物イオンを含んでいない」「塩化物イオンを欠いている」または「塩化物イオン含有していない」という表現は、（ｂ）ポリＬ－アルギニン（例えば、塩酸塩の形態のポリ－Ｌ－アルギニン）が、検出可能な量の塩化物イオンを含んでいないこと、あるいは塩化物イオンを含んでいないことを表している。
さらなる実施形態によれば、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、塩化物イオンを含んでいる形態で提供される。例えば、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、当該ポリＬ－アルギニンに含まれているアルギニン残基のモノマーユニット１つあたり、１個の塩化物イオンを含んでいることが好ましい。
さらに他の実施形態によれば、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、塩化物イオンを含んでいない形態および塩化物イオンを含んでいる形態の混合物として提供される。好ましくは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩とポリＬ－アルギニン水酸化物との混合物である。
本開示のナノ粒子は、ヒアルロン酸ポリマーおよびポリＬ－アルギニンからなるネットワークを有する単純な構造を有している。この構造中に、白金系薬物の分子が封入されている。したがって、本開示のナノ粒子は、コア－シェル構造を構成しない。
いくつかの実施形態によれば、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の化合物は、互いに非共有性の結合で結合している。
白金（ＩＩ）化合物（オキサリプラチンなど）を含有しているナノ粒子は、例えば、ＵＳ２０１２／０１７７７２８や、Brown et al. (J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 4678)において、既に開示されている。この先行技術に開示されているナノ粒子は、それぞれ、脂質系ナノ粒子および金系ナノ粒子である。このように、この先行技術に開示されているナノ粒子は、ヒアルロン酸およびポリアルギニンを含んでいない。
ヒアルロン酸およびポリアルギニンの両方を含んでいるナノ担体自体は、本技術分野において公知である。例えば、Oyazurn-Ampuero et al. (Eur J Pharm Biopharm Off J Arbeitsgemeinschaft Fuer Pharm Verfahrenstechnik eV. 2011; 79(1):54-57)では、ヒアルロン酸およびポリアルギニンを使用してナノ担体を得て、ナノ担体の安定性を評価した。ただし、このナノ担体には、いかなる薬物も封入されていない。この論文の著者は、親水性薬物を担持させることにより、特にペプチドの経口送達の観点からナノ担体の適合性をさらに考察している。また、Kim et al. (2009, Gene Med, Vol. 11: 791-803)では、負電荷を帯びたヒアルロン酸とカチオン性ポリＬ－アルギニンとの静電的複合体化により形成されたナノ粒子について検討している。
他の態様によれば、本発明は、本明細書に記載のナノ粒子の製造方法に関する。この製造方法は、以下の工程を少なくとも含む。
（i）塩素原子を含んでいないアクア錯体形態の白金系薬物を提供する工程
（ii）塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンの水溶液を提供する工程
（iii）工程（i）のアクア錯体形態の白金系薬物と、工程（ii）の水溶液とを混合する工程
（iv）ナノ粒子の形成に適した条件下にて、工程（iii）で得られた混合物に、ヒアルロン酸を加える工程
（v）任意構成で、工程（iv）で得られたナノ粒子を回収する工程
特定の実施形態によれば、工程（i）における塩素原子を含んでいないアクア錯体形態の白金系薬物は、白金系薬物の二塩化物形態を、ＡｇＮＯ３（硝酸銀）による前処理で変換することにより形成される。
にてのを形成する。
特定の実施形態によれば、工程（ii）における塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩（ＰＡｒｇ－Ｃｌ）から得られる。
本発明の他の主題は、上述の製造方法によって得られるナノ粒子に関する。
他の主題によれば、本発明は、本発明で定義されるナノ粒子の１種類以上と、薬学的に許容可能な添加剤の１種類以上と、を含んでいる医薬組成物に関する。
本発明の他の主題によれば、本発明は、癌の予防および／または治療に用いるための、本明細書に記載のナノ粒子に関する。癌の例としては、膵臓癌（特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、卵巣癌、精巣癌、乳癌、脳腫瘍、肉腫、リンパ腫、頭頸部癌、転移性大腸癌、胃癌(gastric cancer)、卵巣癌、食道癌、膀胱癌、子宮頸癌、白血病（慢性骨髄性白血病など）、前立腺癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、骨肉種、子宮癌、リンパ腺癌、胃癌(stomach cancer)、腸癌が挙げられる。
また、本発明は、癌の予防および／または治療に用いるための本明細書に記載のナノ粒子に関連する。この癌は、通常、シスプラチン耐性の癌である。
〔本発明に係るナノ粒子〕
本明細書の他の箇所で言及されている通り、本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関する。このナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）白金系薬物
（ｂ）ポリＬ－アルギニン
（ｃ）ヒアルロン酸
特定の実施形態によれば、本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関する。このナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）塩素原子を含んでいない形態で存在する白金系薬物
（ｂ）ポリＬ－アルギニン水酸化物
（ｃ）ヒアルロン酸
好ましい特定の実施形態によれば、本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関する。このナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）ＤＡＣＨＰｔ
（ｂ）ポリＬ－アルギニン水酸化物
（ｃ）ヒアルロン酸
（ａ）白金系薬物としてＤＡＣＨＰｔを使用する特定の実施形態においては、（ｂ）ポリＬ－アルギニンとしてポリＬ－アルギニン塩酸塩またはポリＬ－アルギニン水酸化物とポリＬ－アルギニン塩酸塩との混合物を使用せずに、ポリＬ－アルギニン水酸化物を使用すれば、ＤＡＣＨＰｔＣｌ２の形成を回避できるので有利である。ＤＡＣＨＰｔＣｌ２は、非水溶性なので沈澱してしまう。ＤＡＣＨＰｔＣｌ２の存在は、本発明に係る薬物を担持したナノ粒子の形成を大きく妨げる可能性がある。
他の特定の実施形態によれば、本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関する。このナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）塩素原子を含んでいる白金系薬物
（ｂ）ポリＬ－アルギニン塩酸塩
（ｃ）ヒアルロン酸
好ましい特定の実施形態によれば、本発明は、薬物送達システムとして有用なナノ粒子に関する。このナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）シスプラチン
（ｂ）ポリＬ－アルギニン塩酸塩
（ｃ）ヒアルロン酸
（ａ）白金系薬物としてシスプラチンを使用し、（ｂ）ポリＬ－アルギニンとしてポリＬ－アルギニン塩酸塩を使用する特定の実施形態は、とりわけ、薬物が血漿タンパク質から保護され、腫瘍中においてより特異的に薬物が蓄積されるので、有利である。
本発明に係るナノ粒子は、マトリクスシステムを含む高分子ナノシステムを形成している。
本発明に係るナノ粒子は、球状である。
より詳細には、本発明に係るナノ粒子は、マトリクス内部において白金系薬物を封入（白金系薬物と会合）している。
例えば、負に帯電しているＨＡと、塩化物イオン含有していない形態のカチオン性ポリＬ－アルギニン（ＰＡｒｇ－ＯＨなど）との静電的複合体化により、水溶液中にてＤＡＣＨＰｔナノ粒子が形成されたと仮定する。この仮定に基づくと、白金系薬物、ポリＬ－アルギニンおよびヒアルロン酸は、互いに非共有性の結合で結合している。
本発明に係る担持ナノ粒子の平均粒径（すなわち、流体力学的径）は、凍結乾燥前において、２００ｎｍ以下であり、好ましくは１００～２００ｎｍであり、より好ましくは１３０～１８０ｎｍである。平均粒径は、Malvern Zetasizer (R) apparatus DTS 1060（Nano Series ZS, Malvern Instruments S.A., Worcestershire, UK）を用い、脱イオン水で１／６０に稀釈したナノ粒子分散液を、２５℃にて３回測定する。
実施例に記載の通り、白金系薬物を担持したナノ粒子（ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子など）は、対応するブランクシステム（何も担持していないナノ粒子）よりも小さい。この違いは、薬物の存在により高分子鎖が様々に再配置されることに起因していると示唆される。ＤＡＣＨＰｔの形成を促進する主要な力は、白金の正電荷と、ＨＡのカルボキシル基の負電荷と間の相互作用であると推定される。
さらに、本発明に係るナノ粒子のゼータ電位（ＺＰ）は、凍結乾燥前において、－５０～－１０ｍＶであり、好ましくは－４７～－２７ｍＶである。ゼータ電位は、Malvern Zetasizer (R) apparatus DTS 1060（Nano Series ZS, Malvern Instruments S.A., Worcestershire, UK）を用い、脱イオン水で１／６０に稀釈したナノ粒子分散液を、２５℃にて３回測定する。
さらに、本発明に係るナノ粒子の多分散度（ＰＤＩ）は、凍結乾燥前において、０．２０以下であり、好ましくは０．０１～０．２０であり、より好ましくは０．０３～０．０６である。
さらに、本発明に係るナノ粒子は、凍結乾燥物の形態であることが特に有利である。
実際に、ナノ粒子の凍結乾燥（またはフリーズドライ）粉末を精製水で再構成すると、得られる懸濁液のｐＨおよび重量モル浸透圧濃度は、例えば、静脈内（ＩＶ）注射に完全に適した値になる。
さらに、凍結乾燥粉末の保存寿命は、より長期化している。粒径が２４０時間しか安定しないミセルなどの従来製剤と比べると、この結果は非常に有利である。
したがって、特定の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子は凍結乾燥される。凍結乾燥工程は、RZ6 Vacubrand pomp（Fisher Scientific, Illkirch, France）を備えたALPHA 1-4 LSC（CHRIST）凍結乾燥機により、実施ができる。このようにして、随時使用可能な安定な凍結乾燥形態のナノ粒子が得られる。
凍結乾燥後におけるナノ粒子の粒径、多分散度およびゼータ電位は、粉末を水に再懸濁した後、凍結乾燥前について上述したものと同じ方法および装置を用いて評価できる。それぞれの数値範囲の定義は、下記の通りである。
本発明に係るナノ粒子の平均粒径（すなわち、流体力学的径）は、凍結乾燥後において、３００ｎｍ以下であり、好ましくは１００～３００ｎｍであり、特に好ましくは２００～３００ｎｍである。
上記の記載から明らかなように（また、実施例で実証されているように）、本発明に係るナノ粒子の平均粒径（流体力学的径）は、凍結乾燥後において僅かに増加する。しかし、この変化は、ナノ粒子システムの安定性の低下には繋がらない。
さらに、本発明に係るナノ粒子の多分散度（ＰＤＩ）は、凍結乾燥後において、０．２０以下であり、好ましくは０．０１０～０．２００であり、特に好ましくは０．０５０～０．１５０であり、さらに好ましくは０．０５４～０．１３３である。
実施例に示されているように、凍結乾燥前または後におけるナノ粒子のＰＤＩの値によると、得られたナノ粒子は非常に均質であり、単分散である。
形状および粒径が２００ｎｍ程度であり、多分散度が低い（ＰＤＩ：０．２未満）製剤は、血管外遊出および拡散により、in vivoにおいて腫瘍内での蓄積に至ると予期される。
さらに、本発明に係るナノ粒子の封入効率は、３５％～９０％であり、好ましくは４０％～８０％であり、より好ましくは４２％～７５％である。
封入効率が高いと、同じ投与量でも薬効の向上が予期されるので、システムがよく標的化されていると見做される。
白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物）と高分子とが会合するメカニズムは、白金系薬物、ＨＡおよびＰＡｒｇの３成分による複合体の形成にある。負に帯電しているＨＡのカルボキシル官能基（ＣＯＯ－）と、正電荷を有している白金金属イオンおよびＰＡｒｇとが結合し、その相互作用により高分子網状組織が誘導され、ナノ粒子の複合体が形成される。
様々な［ＨＡ］／［Ｐａｒｇ］の重量比によって得られた粒子の表面負電荷が示すところによると、粒子表面の大部分はＨＡである。負電荷と組合せた高分子の生体適合性により、血中循環が促進され、細網内皮系のマクロファージによる取込みがされると予想される。
この製剤の主な利点は、有機溶媒を必要とせず、それゆえ生成物の分解を回避でき、製造工程を簡略化できる点にある。本発明に係るナノ粒子と、Cabral et al (J Control Release. 2005;101(1-3):223-232)が開発したミセルとを比較すると、ＨＡ／ＰＡｒｇナノ粒子の製剤化に使用される高分子は薬学的に許容可能な物質であり、化学修飾を必要しない。
例えば、白金系薬物がジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＤＡＣＨＰｔ：オキサリプラチンの活性形態）であるとき、新しく製剤化したナノ粒子の粒径の安定性は、溶液中で約２週間である。これは、オキサリプラチンが１４日後には分解してしまうためである。
この問題を解決するためには、高分子溶液を、凍結防止剤として機能するマンニトール１０％（ｗ／ｗ）溶液中にて調製する。粒径および封入効能の安定性は、約１箇月間保証される。ナノ粒子におけるマンニトールの最終濃度は、約７％（ｗ／ｗ）である。
［ナノ粒子の組成］
本発明に係るナノ粒子は、高分子ナノシステムを形成している。高分子ナノシステムは、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびポリＬ－アルギニンから調製される。高分子ナノシステムにより、白金系薬物（特に、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）などの白金（ＩＩ）系薬物）が封入される（または会合する）。
（ａ．白金系薬物）
上記のように、本発明に好適な白金系薬物としては、白金（ＩＩ）系薬物、白金（ＩＶ）系薬物、およびこれらの混合物が挙げられる。
白金（ＩＩ）系薬物の例としては、ＤＡＣＨＰｔ、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチンが挙げられる。
白金（ＩＶ）系薬物の例としては、サトラプラチンが挙げられる。
特定の実施形態によれば、（ａ）白金系薬物は、塩素原子を含んでいない形態で存在する。
好ましい特定の実施形態によれば、塩素原子を含んでいない（ａ）白金系薬物は、白金（ＩＩ）系薬物である。
より好ましい特定の実施によれば、塩素原子を含んでいない（ａ）白金系薬物は、ＤＡＣＨＰｔ、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチン、ｃｉｓ－ジアンミンジアクア白金（ＩＩ）、ジアクア（１，２－ジアミノメチルシクロブタン）白金（ＩＩ）、ジアクア（４，５－ジアミノメチル－２－イソプロピル－１，３－ジオキソラン）白金（ＩＩ）、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
さらに好ましい特定の実施形態によれば、塩素原子を含んでいない（ａ）白金系薬物は、ＤＡＣＨＰｔである。
他の特定の実施形態によれば、（ａ）白金系薬物は、塩素原子を含んでいる。
好ましい特定の実施形態によれば、塩素原子を含んでいる（ａ）白金系薬物は、白金（ＩＩ）系薬物および白金（ＩＶ）系薬物からなる群より選択される。
より好ましい特定の実施形態によれば、塩素原子を含んでいる（ａ）白金系薬物は、シスプラチンおよびサトラプラチンからなる群より選択される。
さらに好ましい特定の実施形態によれば、塩素原子を含んでいる（ａ）白金系薬物は、シスプラチンである。
シスプラチン（ＣＤＤＰ；ｃｉｓ－ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ））は、古典的白金錯体の最初の一つである。白金原子は、リガンドである２個の塩素原子および２個のＮＨ３基と錯体を形成している。
カルボプラチン（ｃｉｓ－ジアンミン（１，１－シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ））は第２世代の白金製剤である。
カルボプラチンでは、シスプラチンに存在していた２個の塩素原子が、酸素を含んでいるリガンドに置換されている。このリガンドは、Ｃ３ジカルボン酸に由来しており、Ｃ３ジカルボン酸の中央の炭素原子は、３個の炭素原子とともにシクロブチル環を形成している。
ネダプラチン（ｃｉｓ－ジンアミングリコラト白金（ＩＩ））は、第２世代の白金製剤である。
オキサリプラチンは、第３世代の白金製剤である。オキサリプラチンは、白金と１，２－ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）とからなる有機錯体であり、脱離基としてのシュウ酸塩リガンドを有している（ジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）シュウ酸塩）。ＩＵＰＡＣ名は、（Ｒ，Ｒ）－１，２－ジアミノシクロヘキサン（エタンジオアト－Ｏ，Ｏ）白金である。現在、オキサリプラチンは、進行性大腸癌および転移性胃癌の治療用として、SanofiからEloxatin (R)の商品名で市販されている。多くの場合、オキサリプラチンは、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）および／またはホリナート塩（ロイコボリン）とともに投与される（ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩ）。
オキサリプラチンの抗癌剤としての活性には、複数の経路が存在する。主な効果は、白金原子がＤＮＡに結合して、複数のグアニンを結合するより一本鎖または二本鎖を形成し、細胞の増殖を阻害して死に至らしめることにある。オキサリプラチンは、細胞に入ると加水分解され、シュウ酸塩部分が塩素イオンとイオン交換される。その結果、二塩化ジアミノシクロヘキサン白金（ＤＡＣＨＰｔＣｌ２）が形成される。最終的な加水分解により、薬物は活性化されて、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）形態の形態となる。
ロバプラチンは第３世代の白金製剤であり、乳酸から形成されたキレートである。化学名は、ｃｉｓ－［（１Ｒ＊，２Ｒ＊）－１，２－シクロブタンビス（メチルアミノ）－Ｎ，Ｎ’］［（２Ｓ）－２－ヒドロキシプロパノアト（２－）－Ｏ１，Ｏ２］白金である。
ヘプタプラチンはマロン酸白金錯体である。化学名は、ｃｉｓ－マロナト（４，５－ビス（アミノメチル）－２－イソプロピル－１，３－ジオキソラン）白金（ＩＩ）である。これも第三世代の白金系製剤である。
白金（ＩＶ）化合物の具体例としては、サトラプラチンが挙げられる。
本開示のナノ粒子内に存在している本発明に好適な白金系薬物の量は、白金系薬物の種類に応じて大幅に異なりうる。実際に当業者ならば、白金系薬物に関する多くの文献に基づいて、ナノ粒子内に封入すべき白金系薬物の適当な量を決定できると理解する。
本発明に好適な白金系薬物の含有量は、ナノ粒子の総重量に対して、０．０００１～１５重量％、好ましくは０．００１～１０重量％、より好ましくは０．００１～１重量％である。
（ｂ．ポリＬ－アルギニン（ＰＡｒｇ））
従来、ポリＬ－アルギニンは、塩酸塩型（すなわち、ポリＬ－アルギニン塩酸塩（ＰＡｒｇ－Ｃｌ））が使用されている。多くの場合、ポリＬ－アルギニン塩酸塩は、Alamanda (R) Polymersが販売しているものである（Ｍｗは５ｋＤａ～１００ｋＤａ、好ましくは５ｋＤａ～１５ｋＤａ、または好ましくは５０ｋＤａ～１００ｋＤａ、または好ましくは２０ｋＤａ～５０ｋＤａ）。
この商品は、正に帯電している合成ポリアミノ酸であり、アルギニン１ユニットあたり１個のＨＣｌを有している。この商品は、水溶性の結晶性固体である。安全性プロファイルは非常に興味深く、ヒト酵素による分解においてポリペプチドに類似した挙動を示し、生物体内ではほとんど蓄積しない。
特定の実施形態によれば、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、塩化物イオン含んでいる形態で提供される。すなわち、高分子中に存在するアルギニン１ユニットあたり１個の塩化物イオン（または１個のＨＣｌ）を含んでいる形態で提供される。
好ましい特定の実施形態によれば、塩化物イオンを含んでいる形態で提供される（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩である。
他の特定の実施形態によれば、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、塩化物イオンを含んでいない形態で提供される。
好ましい特定の実施形態によれば、塩化物イオンを含んでいない形態で提供される（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン水酸化物（ＰＡｒｇ－ＯＨ）である。
他の特定の実施形態によれば、（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、塩化物イオンを含んでいない形態と塩化物イオン含んでいる形態との混合物として提供される。好ましくは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩とポリＬ－アルギニン水酸化物との混合物である。
本発明に係るナノ粒子において、ポリＬ－アルギニン塩酸塩のポリＬ－アルギニン水酸化物に対する重量比は、（０／１００）～（１００／０）であってもよく、特に０／１００、２５／７５、５０／５０、７５／２５または１００／０であってもよい。
理解されたいことには、例えば、ポリＬ－アルギニン塩酸塩のポリＬ－アルギニン水酸化物に対する重量比が０／１００であるとき、これは、（ｂ）ポリＬ－アルギニンが全てポリＬ－アルギニン水酸化物であることを意味する。あるいは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩のポリＬ－アルギニン水酸化物に対する重量比が１００／０であるとき、これは、（ｂ）ポリＬ－アルギニンが全てポリＬ－アルギニン塩酸塩であることを意味する。
ＰＡｒｇ－ＯＨは、イオン交換樹脂を充填したカラムに塩基（ＮａＯＨなど）を通して、ＰＡｒｇ－Ｃｌをイオン交換樹脂で改質することにより調製できる。このようにして得たポリＬ－アルギニン（ＰＡｒｇ－ＯＨ）は、カラムの末端から回収する。
好適には、本発明に係るＰＡｒｇ－ＯＨの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは３０００～１７０００Ｄａであり、より好ましくは５０００～１５０００Ｄａである。
本発明に係る（ｂ）ポリＬ－アルギニンの含有量は、ナノ粒子の総重量に対して、２～３０重量％であり、好ましくは５～２０重量％であり、より好ましくは１０～１７重量％である。
（ｃ．ヒアルロン酸（ＨＡ））
ヒアルロン酸（ヒアルロナンまたはヒアルロナートとも称する）は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンおよびＤ－グルクロン酸を含んでいる二糖ユニットから構成されるアニオン性多糖である。人体（生物流体および生体組織）に天然に存在し、薬学において広汎に使用されている。
Figure 2022508458000001
ＨＡは非毒性であり、粘膜付着性があり、生分解性である。
また、ＨＡは、ＣＤ４４に対して親和性のあるリガンドとして作用するため、固有の標的化活性を有している。ＣＤ４４は、腫瘍細胞において発現しており、ある種の耐性細胞株および癌幹細胞において過剰発現している（特に、ゲムシタビンなどの抗癌剤による治療後に過剰発現する）。
さらに都合のよいことに、腫瘍性の微小環境には、通常、ヒアルロニダーゼが豊富に存在している。そのため、より大量の薬物をin situで放出させられる。
本発明に係るヒアルロン酸の重量平均分子量（Ｍｗ）は、１０～１００ｋＤａであり、好ましくは１０～３０ｋＤａであり、好ましくは１５～２５ｋＤａであり、より好ましくは２０ｋＤａである。あるいは、好ましくは５０～１００ｋＤａである。
本明細書において、ヒアルロン酸の「分子量」を表している全ての数は、重量平均分子量（Ｍｗ）を示すと理解されたい（単位：ダルトン（Ｄａ））。
本発明に好適なヒアルロン酸としては、Lifecore Biomedicalから市販されているヒアルロン酸（ＨＡ、ＬＭＷＨＡ（Ｍｗ≒２０ｋＤａ））が挙げられる。
本発明に係るヒアルロン酸の含有量は、ナノ粒子の総重量に対して、２．５～１２重量％であり、好ましくは４～１２重量％である。
実施例に示されるように、［ＨＡ］／［ＰＡｒｇ］の質量比が０．５／２．５未満であるならば、ゼータ電位が正であるナノ構造が得られる。このことは、ナノシステムの表面が、正に帯電したＰＡｒｇから主に構成されうることを示す。この比率を上回ると構造が逆転し、ＨＡ鎖が表面に露出する。薬物を担持したナノ構造に関して、［ＨＡ］／［ＰＡｒｇ］の質量比が（７／２．５）～（１２／２．５）であるならば、粒径には差が見られなかった。これは、ナノシステムが安定しており、ＨＡをさらに追加したとしても、会合状態が変化しないことを示唆している。
したがって、これらのナノ粒子の［ＨＡ］／［Ｐａｒｇ］の重量比（または質量比）は、０．５／２．５（＝０．２）超であり、好ましくは０．６／２．５（＝０．２４）～１５／２．５（＝６）であり、より好ましくは３／２．５（＝１．２）～１２／２．５（＝４．８）であり（例えば、３／２．５、４／２．５（＝１．６）、７／２．５（＝２．８）、９／２．５（＝３．６）、１０／２．５（＝４）、１１．２５／２．５（＝４．５）および１２／２．５であり）、より好ましくは１１．２５／２．５である。
さらに、これらのナノ粒子の［白金系薬物］／（［ＨＡ］＋［ＰＡｒｇ］）の重量比（または質量比）は、０．０１～１．００であり、好ましくは０．０３～０．５０であり、より好ましくは０．０４～０．１０である。
好ましい実施形態によれば、本発明に係る薬物送達システムとして有用なナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）白金（ＩＩ）系薬物
（ｂ）ポリＬ－アルギニン
（ｃ）ヒアルロン酸
より好ましい実施形態によれば、本発明に係る薬物送達システムとして有用なナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）
（ｂ）ポリＬ－アルギニン
（ｃ）ヒアルロン酸
さらにより好ましい実施形態によれば、本発明に係る薬物送達システムとして有用なナノ粒子は、少なくとも、以下の成分から形成されている。
（ａ）ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）
（ｂ）ポリＬ－アルギニン水酸化物
（ｃ）ヒアルロン酸
実施例に示されているように、本発明に係るナノ粒子は、凍結乾燥後であっても安定しており（特に粒径が安定しており）、そして生物学的な条件においても安定している。
さらに、実施例（より詳細には「in vitroにおける実験」の欄）で示されているように、何も担持していないナノ担体は、検討した細胞株に対して毒性がないことが実証された。この点は、in vivoにおける使用にとって有望である。
ナノ粒子化されていない薬物のＩＣ５０と、薬物を担持したナノ粒子のＩＣ５０とを比較すると、細胞毒性の効果は、後者が前者を上回ることが実証された。
本発明において、ナノ粒子の流体力学的径および多分散度（ＰＤＩ）は、動的光散乱（ＤＬＳ）法によって測定した。脱イオン水でサンプルを適当な濃度に稀釈し、２５℃、検出角度１７３°にて各サンプルの分析を行った。
本発明において、ゼータ電位（ＺＰ）は、レーザドップラー流速計（ＬＤＡ）により測定された電気泳動移動度の平均値から計算した。ＬＤＡ測定では、予め稀釈したサンプルを電気泳動セルに入れて用いた。
ＤＬＳ分析およびＬＤＡ分析は、NanoZS (R)（Malvern Instruments S.A., Worcestershire, United Kingdom）を用いて、３回ずつ行った。
〔本発明に係るナノ粒子の製造方法〕
上述した通り、本発明は、本発明に係るナノ粒子の製造方法に関する。この製造方法は、少なくとも、以下の工程を含む。
（i）塩素原子を含んでいないアクア錯体形態の白金系薬物を提供する工程
（ii）塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンの水溶液を提供する工程
（iii）工程（i）のアクア錯体形態の白金系薬物と、工程（ii）の水溶液とを混合する工程
（iv）ナノ粒子の形成に適した条件下にて、工程（iii）で得られた混合物に、ヒアルロン酸を加える工程
（v）任意構成で、工程（iv）で得られたナノ粒子を回収する工程
この製造方法は、改良されたイオン向性ゲル化法である（下記に説明する）。イオン向性ゲル化法の一般的な手順は、例えば、Oyarzun-Ampuero et al. (Eur J Pharm Biopharm Off J Arbeitsgemeinschaft Fuer Pharm Verfahrenstechnik eV. 2011;79(1):54-57)に記載されている。
特定の実施形態によれば、本発明は、本発明に係るナノ粒子の製造方法に関する。この製造方法は、少なくとも、以下の工程を含む。
（i）ＤＡＣＨＰｔを提供する工程
（ii）ポリＬ－アルギニン水酸化物の水溶液を提供する工程
（iii）工程（i）のＤＡＣＨＰｔと、工程（ii）の水溶液とを混合する工程
（iv）ナノ粒子の形成に適した条件下にて、ヒアルロン酸を工程（iii）で得られた混合物に加える工程
（v）任意構成で、工程（iv）で得られたナノ粒子を回収する工程
都合のよいことに、本発明に係る製造方法によれば、白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物に対応するアクア錯体）に塩化物（任意に、ポリアルギニン溶液中に存在している）を加えることにより、安定な白金系薬物ナノ粒子（特に、白金（ＩＩ）系薬物ナノ粒子）を提供できる。
［工程（i）］
工程（i）では、塩素原子を含んでいないアクア錯体形態の白金系薬物を提供する。
アクア錯体形態の白金系薬物は、当業者に知られている任意の工程によって得られる。
アクア錯体の調製方法の例としては、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を用いる前処理によって、白金系薬物の二塩化物形態を変換することが挙げられる。この工程は、Oberoi et alに既に記載されている18。
白金系薬物の二塩化物形態（ＤＡＣＨＰｔＣｌ２など）を蒸留水で懸濁する。その後、例えば磁気攪拌しながら、暗所、室温（２５℃）にて、硝酸銀と混合する（［ＡｇＮＯ３］／［白金系薬物の二塩化物形態］＝１）。混合時間は、１時間～４８時間であり、好ましくは１０時間～２４時間であり、より好ましくは２４時間である。このようにして、アクア錯体を形成させる。
白金系薬物の二塩化物形態の例としては、ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（シスプラチン）、ジクロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＤＡＣＨＰｔＣｌ２）、ジクロロ（１，２－ジアミノメチルシクロブタン）白金（ＩＩ）、ジクロロ（４，５－ジアミノメチル－２－イソプロピル－１，３－ジオキソラン）白金（ＩＩ）、およびそれらの混合物が挙げられる。
好ましくは、白金系薬物の二塩化物形態は、ジクロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）である。
ジクロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）は、例えば、Sigma Aldrichが販売しているＤＡＣＨＰｔＣｌ２（Ｍｗ＝３８０．１７Ｄａ）であってもよい。
反応後、塩化銀（ＡｇＣｌ）の沈澱が形成される。
その後、ＡｇＣｌの沈澱を、３０００ｒｐｍにて、１０～２０分間（より好ましくは２０分間）遠心分離して除去する。
次に、上清を０．２２μｍのフィルタで濾過して精製し、アクア錯体を回収する。
したがって、塩素原子を含んでいないアクア錯体形態の白金系薬物は、ジアミンジアクア白金（ＩＩ）、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＤＡＣＨＰｔ）、ジアクア（１，２－ジアミノメチルシクロブタン）白金（ＩＩ）、ジアクア（４，５－ジアミノメチル－２－イソプロピル－１，３－ジオキソラン）白金（ＩＩ）、およびそれらの混合物から選択されてもよく、好ましくはジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）である。
［工程（ii）］
工程（ii）は、塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンの水溶液の提供からなる。
特定の実施形態によれば、塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩（ＰＡｒｇ－Ｃｌ）から得られる。
他の特定の実施形態によれば、塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンの水溶液は、ポリＬ－アルギニン水酸化物（ＰＡｒｇ－ＯＨ）の水溶液である。
例えば、塩基およびイオン交換樹脂を用いてポリＬ－アルギニン塩酸塩（ＰＡｒｇ－Ｃｌ）を脱塩することにより、ポリＬ－アルギニン水酸化物を得られる。このように、イオン交換樹脂（カラム）によりＰＡｒｇ－Ｃｌを改質する。イオン交換樹脂は、とりわけアニオン交換樹脂であるAmberlite (R) IRA 900 Clの名称でRohm&Haasから販売されているものなど）。
まず、湿潤状態の樹脂が充填されているカラムに、塩基を加える。本発明に好適な塩基は、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨなどや、それに加えてこれらの混合物から選択されうる。
十分な時間後（例えば、１５分間～１時間、好ましくは３０分間）、溶液のｐＨが中性に達するまで、精製水でカラムをリンスする。
次に、ＰＡＲｇ－Ｃｌ溶液、（例えば、Alamanda (TM) Polymersから市販されているポリＬ－アルギニン塩酸塩）をカラムの頂端から入れる。ポリＬ－アルギニン塩酸塩のＭｗは、５～１００ｋＤａであり、好ましくは５～１５ｋＤａであり、または好ましくは５０～１００ｋＤａであり、または好ましくは２０～５０ｋＤａである。カラムを通過するとき、ＰＡＲｇ－Ｃｌの塩化物イオンがカラム内のＯＨイオンと交換される。
次に、ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液をカラムの末端から回収する。次に、ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液が所望の濃度（例えば１２．５ｍｇ／ｍＬ）に達するまで、精製水で溶液をリンスする。
ＰＡｒｇ－ＣｌからＰＡｒｇ－ＯＨへの特異的な改質により、残留塩化物（Ｃｌ－）を除去できる。残留塩化物（Ｃｌ－）は、活性化白金系薬物（ＤＡＣＨＰｔなど）を沈澱性のジクロロ白金系薬物（ＤＡＣＨＰｔＣｌ２など）に変化させるので、薬物を担持したナノ粒子の形成を大きくに妨げてしまう。
このように、工程（ii）により、ＰＡｒｇ塩化物塩と、白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物）との間の不適合性の問題が克服される。そのため、工程（ii）は、後に安定なナノ粒子を得ることに寄与している。
［工程（iii）］
工程（iii）は、工程（i）の塩素原子を含んでいない白金系薬物のアクア錯体と、工程（ii）の塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンの水溶液と、の混合に相当する。
塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニン水溶液（ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液など）と、白金系薬物のアクア錯体（塩素原子を含んでいない白金（ＩＩ）系薬物など）とを、例えばバイアル内で混合する。この際、１分間～２０分間（好ましくは１０分間）攪拌し続ける。
このようにして、工程（i）および工程（ii）の２種類の成分の混合物が得られる。
［工程（iv）］
工程（iv）では、ヒアルロン酸（例えばLifecore Biomedicalが販売しているＨＡ（ＬＭＷＨＡ（Ｍｗ≒２０ｋＤａ））を、工程（iii）で得られた混合物に添加し、所望のナノ粒子を得る。
好適には、混合前に、溶液を０．２２μｍフィルタで濾過して無菌性を確保する。
次に、工程（iii）において得られた（i）のアクア錯体と（ii）の水溶液との混合物と、ＨＡと組合せる。この工程は、単に、室温にて高分子水溶液を磁気攪拌しながら混合することによって行う。このようにして、担持ナノ粒子を得る。
工程（iv）においては、異なる濃度のＨＡを加えてもよい（例えば２．５～１２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５～１２ｍｇ／ｍＬ）。こうすれば、異なる［ＨＡ／ＰＡｒｇ］の質量比が異なるナノ粒子が得られる。そのため、ナノシステムに対する高分子の寄与を決定する一助となりうる。また、正に帯電した親水性分子（ＤＡＣＨＰｔなど）を組込むために、ナノ粒子を改良する一助ともなる。
さらに、１０％ｗ／ｖのマンニトールの存在下にて調製する全ての製剤について、ｐＨおよび浸透圧を確認する。
ｐＨが中性であるとき、ＨＡは負に帯電している多糖であり、ＰＡｒｇは正電荷を有するポリアミノ酸である。これらは、静電相互作用（非共有性の結合）によりナノ粒子を形成できる。
［工程（v）］
工程（v）は任意工程であり、工程（iv）で得られるナノ粒子の単離からなる。
システムを単離するために、所定の体積（例えば１ｍＬ）のナノ粒子懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、所定の体積（例えば２０μＬ）のグリセロール床の上で遠心分離する（例えば１６０００ｇ、３０分間、２５℃）。
次に、上清を廃棄し、ピペッティングおよび激しいボルテックスにより、ナノ粒子を水中に再懸濁させる。
本発明に係る製造方法によれば、生体に作用する高分子ナノ担体が得られる。このナノ単体は、上記に定義したヒアルロン酸および上記に定義したポリアルギニンから構成される。
実施例に示されるように、このナノ構造は、白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物、例えばオキサリプラチンの活性型（ＤＡＣＨＰｔ））を上手く封入する（または会合させる）ことができる。
白金系薬物（特に、ＤＡＣＨＰｔなどの白金（ＩＩ）系薬物）の会合を促進する主な力は、白金の正電荷と、ＨＡの電気的陰性なカルボキシル基との相互作用にあると思われる。
したがって、白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物）分子、ポリＬ－アルギニン分子およびヒアルロン酸分子は、静電相互作用（非共有性の結合）を介して互いに結合している。
有利であることに、上記の方法は、既報17, 25, 39にて報告された多くの担体とは異なり、単純でありかつ有機溶媒を必要としない。それゆえ、含まれる工数が非常に少ないので、大規模実施の可能性を秘めている。
必然的に、その単純さゆえに、無菌環境およびＧＭＰ（良好な製造慣行）条件下における本発明に係る製造方法の実施が容易に想像できる。
〔治療用途〕
実施例に例示されるように、本発明で定義されるナノ粒子は、癌を予防および／または治療できる。癌の例としては、膵臓癌（特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、卵巣癌、精巣癌、乳癌、脳腫瘍、肉腫、リンパ腫、頭頸部癌、転移性大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、膀胱癌、子宮頸癌、白血病（慢性骨髄性白血病など）、前立腺癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、骨肉種、子宮癌、リンパ腺癌、胃癌、腸癌が挙げられる。
したがって、本発明に係るナノ粒子は、医薬（特に、癌の予防および／または治療に有用な医薬）の調製に使用できる。癌の例としては、膵臓癌（特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、卵巣癌、精巣癌、乳癌、脳腫瘍、肉腫、リンパ腫、頭頸部癌、転移性大腸癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、膀胱癌、子宮頸癌、白血病（慢性骨髄性白血病など）、前立腺癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、骨肉種、子宮癌、リンパ腺癌、胃癌、腸癌が挙げられる。
したがって、本発明の他の態様において、本発明は、本発明に係るナノ粒子を含んでいる医薬を提供する。
これらの医薬は、治療目的で（特に、上述した癌の治療および／または予防に）使用される。
〔医薬組成物および投与形態〕
本発明のもう一つの態様によれば、本発明は、本発明に係るナノ粒子を有効成分として含んでいる医薬組成物に関する。より詳細には、これらの医薬組成物は、本発明に係るナノ粒子の効果的な用量と、薬学的に許容可能な添加剤の１種類以上とを含有している。
小粒径のナノ粒子を考慮すると、これは、静脈内投与（ＩＶまたはｉ．ｖ．）、皮下投与（ＳＱまたはｓ．ｑ．）、皮内投与（ＩＣまたはｉ．ｃ．）、筋肉内投与（ＩＭまたはｉ．ｍ．）または腹腔内投与（ＩＰまたはｉ．ｐ．）できる。好ましくは、水性懸濁液の形態で静脈内投与できる。そのため、血管の微小循環に適している。
したがって、非経口的投与、静脈内投与、または他の任意の適切な経路により、医薬組成物を投与できる。
一実施形態において、腫瘍部位の近傍に当該組成物を注入することにより、医薬組成物を非経口投与する。本明細書において用いられるとき、「腫瘍部位の近傍」とは、腫瘍部位に対する組成物の局所的標的化および送達を表している。この表現には、腫瘍に対する直接注入も含まれるし、腫瘍から約１ｃｍ以内（１ｃｍ以内、約５ｍｍ以内、５ｍｍ以内、約２ｍｍ以内、２ｍｍ以内など）に対する注入も含まれる。医薬組成物は、例えば、単回注入または複数回注入によって投与できる。複数回注入とは、例えば、医薬組成物を腫瘍内および腫瘍周辺の両方に注入する場合である。
他の実施形態においては、医薬組成物を被験体に対して全身性投与する。
例えば、被験体の循環系に組成物を注射するなどして、医薬組成物を静脈内投与する場合が挙げられる。
他の例示的な実施形態においては、医薬組成物を経腸投与する。例えば、消化管内の腫瘍を灌注する場合が挙げられる。
薬学的に許容可能な添加剤は、所望の調剤形態および投与方法に応じて、当業者に知られた一般的な添加剤から選択される。
本発明の医薬組成物において、本発明に係るナノ粒子は、ユニット形態で、従来の医薬添加剤との混合物として、上述の癌の予防または治療のために動物およびヒトに投与してもよい。
他の有用な実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子は、凍結乾燥物の形態をしている。そのため、ナノ粒子を含有している随時使用可能で安定な凍結乾燥製剤を調製・保存できる。凍結乾燥粉末を精製水で再構成すると、懸濁液のｐＨおよび重量モル浸透圧濃度は、例えば静脈内注入に完全に適合する。
本発明に係る組成物に適合する薬学的製剤の例としては、特に、以下が挙げられる。
・静脈内注射
・静脈内輸液
ナノ粒子を水性分散液として使用する場合には、金属イオン封鎖剤もしくはキレート剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤および／または緩衝剤などの添加剤と組合せてもよい。
上述の化合物に加えて、本発明に係る医薬組成物は、防腐剤、湿潤剤、可溶化剤および着色剤などの薬剤を含有してもよい。
しかしまた、医薬組成物は、他の作用薬を含有してもよい。この作用薬は、白金系薬物（特に白金（ＩＩ）系薬物）の効果と合わせて、治療上有益な利点が得られうる薬である。
本発明に係るナノ粒子と組合せうる有効成分の代表例としては、とりわけ、抗癌作用もしくは細胞抑制作用を有している他の分子もしくは巨大分子（本発明に好適な白金系薬物からは区別される白金塩、５－フルオロウラシル、ホリニン酸もしくはその塩、アントラサイクリン、有糸分裂紡錘体毒、トポイソメラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤など）；コルチコイド型抗炎症剤（デキサメタゾンなど）もしくは非コルチコイド型の抗炎症剤、または免疫アジュバント活性を有している他の分子（抗癌活性を有している抗体など）；鎮痛活性を有している分子（デキストロプロポキシフェン、トラマドール、ネホパム、パラセタモール、コデイン、アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）など）が挙げられる。ＮＳＡＩＤの例としては、アスピリン、イブプロフェン、インドメタシン、メフェナム酸、オキシカム誘導体、コキシブ（セレコキシブ(R)、ロフェコキシブ(R)、バルデコキシブ(R)、パレコキシブ(R)など）、スルフォナニリド（ニメスリド(R)など）が挙げられる。
さらにまた、酸化防止剤（カテキン、ポリフェノール、フラボノール、フラボノン、カフェイン、アスコルビン酸、クエン酸、酒石酸、レシチン、または天然もしくは合成トコフェロールなど）も挙げられる。
白金系薬物の製剤（特に、ナノ粒子形態の白金（ＩＩ）系薬物の製剤）は、他の種類の作用薬との間に、いかなる化学的凝集作用も生じさせない。そのため、白金系薬物の製剤は、両者を同じ製剤に含めることができる。
〔投与量〕
高用量または低用量が適切である特定の症例はありうる。このような用量であっても、本発明の範囲を外れるものではない。通常の慣行においては、各患者にとって適切な用量は、投与方法ならびに患者の体重および反応に応じて医師が決定する。
例えば、個体に対して単回投与または複数回投与される量は、種々の因子に応じて変化する。このような因子の例としては、薬物動態特性、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、同時に行っている治療、治療頻度および所望の効果が挙げられる。
〔単独療法および併用療法〕
癌を予防および／または治療するために、本発明に係るナノ粒子を単独療法に使用することができる。それを必要とする患者または被験体が、他の特定の抗癌剤に対する耐性を有しているか否かにかかわらず、単独療法は好ましく推奨される。
あるいは、本発明に係るナノ粒子は、同じまたは異なる作用機序を有している有効な抗癌性化合物の１種類以上（例えば、上記で定義されるもの）と組合せて使用してもよい。
したがって、本発明の他の態様において、本発明に係るナノ粒子は、関連するまたは関連しない作用機序を有している２種類以上の抗癌性化合物の投与を含む併用治療の一部であってもよい。本発明に係るナノ粒子と、本発明で定義されるナノ粒子とは異なる他の抗癌性有効成分の１種類以上との組合せは、同一の製剤に含まれていてもよいし（上述のものなど）、異なる製剤に含まれていてもよい。
一実施形態によれば、この組合せが同一の製剤に含まれる場合、この組合せは、用量が固定されていることが好ましい。すなわち、ナノ粒子と当該ナノ粒子とは異なる他の抗癌性有効成分の１種類以上とは、例えば、同じバイアル中で同じ粉末として製剤化できることが好ましい。
他の実施形態によれば、この組合せが別々の製剤に含まれる場合、それぞれの有効成分は、同時に投与してもよいし、逐次的に投与してもよい。
いくつかの実施形態において、本発明に係るナノ粒子は、他の抗癌剤、抗癌療法または手術の前後に、またはそれらと組合せて投与してもよい。
〔治療方法〕
他の態様によれば、本発明は、上述した病理に対する処置方法を提供する。この方法は、本発明に係るナノ粒子の効果的な用量を患者に投与する工程を含む。任意構成で、上記に定義された他の抗癌剤および／または他の有効成分と組合せて投与してもよい。
以下、実施例によって本発明を説明する。しかし、本発明は、これら実施例には限定されない。
〔Ａ．材料および方法〕
［Ａ－１．化学物質］
ジクロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＤＡＣＨＰｔＣｌ２、Ｍｗ＝３８０．１７Ｄａ）、硝酸銀ＡｇＮＯ３（Ｍｗ≒１６９．９７Ｄａ）、マンニトール（Ｍｗ＝１８２Ｄａ）およびＮ１培地サプリメント（１００×）は、Sigma Aldrich（Saint Quentin Fallavier, France）から購入した。Ｎ１培地サプリメント（１００×）には、０．５ｍｇ／ｍＬの組換えヒトインスリン、０．５ｍｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（一部鉄飽和）、０．５μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム、１．６ｍｇ／ｍＬのプトレシン、および０．７３μｇ／ｍＬのプロゲステロンが含まれている。
ポリＬ－アルギニン塩酸塩（Ｍｗ＝５ｋＤａ～１５ｋＤａ）は、Alamanda (TM) Polymers（Huntsville, USA）から購入した。
ヒアルロン酸（ＨＡ、ＬＭＷＨＡ（Ｍｗ≒２０ｋＤａ））は、Lifecore Biomedical（Chaska, USA）から購入した。
MTS cell titer 96 (R) Aqueous Oneは、Promega（France）から入手した。
Alexa Fluor 647カルボン酸トリス（トリエチルアンモニウム）塩（０．８ｍｇ／ｍＬ）（Invitrogen, Merelbeke, Belgium）は、Gent University, BelgiumのPr Katrien Remautからご提供いただいた。
［Ａ－２．ブランクナノ粒子およびＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子のキャラクタライゼーション］
（Ａ－２－１．ナノ粒子の物理化学的キャラクタライゼーション）
実験に使うナノ粒子の粒径分析およびゼータ電位の測定には、Malvern Zetasizer (R) apparatus DTS 1060（Nano Series ZS, Malvern Instruments S.A., Worcestershire, UK）を用いた。脱イオン水で１／６０に稀釈したナノ粒子分散液を、２５℃にて３回測定した。
形態の分析は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により行った。Orius (TM) CCD Camera Controller（Gatan, Pleasanton CA, USA）を備えたJEM-1400（JEOL, Tokyo, Japan）を用いた。
ナノ粒子をFormvar (R)グリッドに固定して半日間乾燥させ、リンタングステン酸１％（ｗ／ｖ）をネガティブコントロールとして用いた。
（Ａ－２－２．ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の封入効率（ＥＥ））
封入効率（ＥＥ）は、間接法で特定した。ＤＡＣＨＰｔを担持したサンプルを、Amicon Ultra-filter遠心分離チューブ（カットオフ：３０ｋＤａ、Merck Millipore, Cork, Ireland）に入れて遠心分離した（７０００ｇ、３０分間、２０℃）。下層の溶液の濃度を、ＩＣＰ－ＯＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光法）（ICP-OES ICAP 7200 duo Thermo Scientific）により測定した。
（Ａ－２－３．ブランクナノ粒子およびＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の凍結乾燥）
ナノシステムを凍結乾燥するために、ＨＡおよびＰＡｒｇを１０％ｗ／ｖマンニトール溶液に溶解させて、ブランクナノ粒子およびＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子をそれぞれ調製した。マンニトール１０％（ｗ／ｗ）を凍結防止剤として選択したのは、ナノ粒子の物理化学的特性を最もよく維持できたためである（データ省略）。凍結乾燥工程は、RZ6 Vacubrand pomp（Fisher Scientific, Illkirch, France）を備えたALPHA 1-4 LSC（CHRIST）凍結乾燥機により実行した。凍結乾燥させた粉末を水中に再懸濁した後、粒径、多分散度、ゼータ電位および封入効率を評価した。
（Ａ－２－４．血清中および蒸留水中におけるＤＡＣＨＰｔを担持した蛍光ナノ粒子のＳＰＴ）
ｆＳＰＴ（Fluorescence Single particle tracking）により、緩衝液中および血清中におけるナノ粒子の拡散をキャラクタライズした。
ｆＳＰＴでは、iXon ultra EMCCD camera（Andor Technology, Belfast, UK）と、MLC 400 B laser（Agilent technologies, California, USA）を備えたＳＦＣ（swept-field confocal）顕微鏡（Nikon eclipse Ti, Japan）を使用して、蛍光標識された１個ずつの粒子の映像を得た。これらの映像を、自家開発した画像処理ソフトウェアで解析し、拡散係数の分布を得た。実験的に求めた生物流体の粘性を考慮に入れたStokes-Einstein方程式を用いて、拡散係数の分布を粒径の分布に変換した。ＳＰＴは、生物流体（ヒト血清、腹水液、ヒト血漿および血液など）中に存在するナノ粒子の粒径のキャラクタライゼーションにとって、理想的かつ好適である。
広汎に使用されている粒径測定技術（動的光散乱（ＤＬＳ）など）と比較したｆＳＰＴの主な利点は、生物流体中に存在するタンパク質の影響を受けることなく、稀釈していない生物流体中において粒径を測定できる点にある。
９０体積％のＦ－ＰＡｒｇ－ＨＡナノ粒子が含まれている生物流体のＳＰＴ計測を、以下の手順で行った。
まず、ナノ製剤を蒸留水で１５倍に稀釈した。次に、調製した稀釈液５μＬを、４５μＬの緩衝液またはヒト血清（９０体積％）に加えて、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、７μＬのサンプルを、厳重に密着させた粘着スペーサ（８ウェル、直径：９ｍｍ、深さ：０．１２ｍｍ、Invitrogen, Merelbeke, Belgium）の中央にある、顕微鏡用スライドに載置した。スライドをカバースリップ（２４×５０ｍｍ）で覆い、サンプルの蒸発を防ぎ、完全に自由拡散させた。次に、スライドをＳＦＣ顕微鏡に載置し、顕微鏡用スライドの底面より約５μｍ上方に焦点を合わせて映像を撮影した。映像は、室温（２２．５℃）にて撮影した。撮影には、ＥＭＣＣＤカメラを作動させるNIS Elements software（Nikon, Japan）と、CFI Plan Apo VC100×NA1.4油浸対物レンズ（Nikon, Japan）を備えたＳＦＣ顕微鏡を用いた。
映像の分析には、自家開発したソフトウェアを用いた。ヒト血清は、上述の通り健康なドナーから採取した。
〔Ａ．ブランクナノ粒子、ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子およびＨＡ－ＰＡｒｇ蛍光ナノ粒子の調製〕
ブランクナノ粒子およびＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子を、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびポリアルギニン（ＰＡｒｇ）から調製した。調製に際しては、以下に説明するイオン向性ゲル化法を用いた。
［実施例１：ＤＡＣＨＰｔの調製］
ＤＡＣＨＰｔＣｌ２（５ｍＭ、９．５０４ｍｇ）を蒸留水で懸濁し、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）（４．２４ｍｇ）と混合して（［ＡｇＮＯ３］／［ＤＡＣＨＰｔ］＝１）、ＤＡＣＨＰｔのアクア錯体を形成させた。２５℃にて暗所に２４時間、磁気攪拌しながら溶液を保持した。反応後、塩化銀（ＡｇＣｌ）の沈澱が見られた。混合物を２０００ｇにて２０分間遠心分離し、ＡｇＣｌの沈澱を除去した。その後、０．２２μｍフィルタによる濾過で上清を精製して、無菌性を確保した。
［実施例２：ＰＡｒｇ溶液の調製］
ＰＡｒｇ－Ｃｌをイオン交換樹脂（Amberlite (R) IRA 900 Cl）で処理して、ＰＡｒｇを調製した。簡潔に説明すると、１ｍＬの湿潤状態の樹脂が充填されているカラムに、３ｍＬのＮａＯＨ（１Ｍ）を通した。３０分後、溶液のｐＨが中性になるまで、精製水でカラムをリンスした。次に、１ｍＬのＰＡｒｇ－Ｃｌ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）をカラムの頂端から投入し、ＰＡｒｇ－ＯＨを末端から回収した。その後、溶液が目的の濃度（１２．５ｍｇ／ｍＬ）に達するまで、２～３ｍＬの精製水でリンスした。体積を測定して、１２ｍｇ／ｍＬになるまでの稀釈度を確認した。
［実施例３：ブランクナノ粒子の調製および物理的キャラクタライゼーション］
ブランクナノ粒子（白金系薬物を担持していないナノ粒子）は、Oyarzun-Ampuero et al (Eur J Pharm Biopharm Off J Arbeitsgemeinschaft Fuer Pharm Verfahrenstechnik eV. 2011;79(1):54-57)に開示されている方法を改変して得た。
ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液およびＨＡ溶液は、使用に先立って、０．２２μｍフィルタで濾過して無菌性を確保した。
５００μＬの実施例２におけるＰＡｒｇ－ＯＨ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）と、５００μＬの蒸留水とを、バイアル中で混合した。次に、５００μＬのＨＡ溶液（０．５～１２ｍｇ／ｍＬの様々な濃度）を加え、室温にて磁気攪拌しながら、溶液を１０分間放置した。
１０％ｗ／ｖのマンニトールの存在下にて高分子を溶解させることにより、全ての製剤を調製した。
表１は、［ＨＡ］／［ＰＡｒｇ］の質量比と対応する物理化学的性質のスクリーニング結果を示す。すなわち、ブランクナノ粒子製剤の粒径、多分散度（ＰＤＩ）およびゼータ電位（ＺＰ）を示す。ｎは３以上である（つまり、３回以上測定を行った）。
Figure 2022508458000002
［実施例４：本発明に係るＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の調製および物理的キャラクタライゼーション─ＨＡ／ＰＡｒｇ質量比による影響］
ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子を得るために、実施例２で得たＰＡｒｇ－ＯＨ溶液に、水に代えて実施例１で得たＤＡＣＨＰｔ溶液５００μＬを加え、何も担持していないナノ粒子について記載した実施例３と同様の工程を施した。詳細には、実施例１で得られたＤＡＣＨＰｔ溶液を、実施例２で得られたＰＡｒｇ－ＯＨ溶液と混合し、攪拌しながら１０分間放置した。ＤＡＣＨＰｔ－ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液にＨＡを加えることにより、ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子を形成させた。
調製した全ての製剤について、ｐＨおよび重量モル浸透圧濃度を調べた。
システムを単離するために、１ｍＬのナノ粒子懸濁液をエッペンドルフチューブに移し、２０μＬのグリセロールに載せた状態で遠心分離した（１６０００ｇ、３０分間、２５℃）。
上清を廃棄し、ピペッティングおよび強いボルテックスによりナノ粒子を水に再懸濁させた。
ナノシステムに対する高分子の影響を決定し、正電荷を有する親水性分子（ＤＡＣＨＰｔ）を組込むためのナノ粒子を改良すべく、ＨＡ／ＰＡｒｇの質量比を何通りかスクリーニングした。全ての製剤は、１０％ｗ／ｖのマンニトールの存在下にて調製した。
表２は、スクリーニングした［ＨＡ］／［ＰＡｒｇ］の質量比と対応する物理化学的性質を示す。すなわち、ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子製剤の粒径、ｐＨ、多分散度（ＰＤＩ）およびゼータ電位（ＺＰ）を示す。ｎは３以上である（つまり、３回以上測定を行った）。製剤１ｍＬあたりＤＡＣＨＰｔを６６０μｇ含有している。
Figure 2022508458000003
以上の結果から、ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子は、対応するブランクシステムよりも小さいことが分かる。
モル比率を考慮すると、電荷比（負電荷の正電荷に対する非率）は、１．３４から１．８９にしている。これは、白金が大きな正電荷に与えるため、システムを網状に発達させている可能性がある。
さらに、多分散度は、実験した全ての製剤について許容範囲であった（０．２未満）。これは、得られた集合が非常に均質であり単分散であることを示している。
さらに、ゼータ電位は負である。比率が４／２．５を超えると、それぞれの比率の間、ゼータ電位には余り差がない。
ナノ粒子の構造を確認するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析を行った。［ＨＡ］／［ＰＡｒｇ］の質量比が１１．２５／２．５であるＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の形態学的構造を調査した。コントラストとして用いるリンタングステン酸（１％ｗ／ｖ）でナノ粒子を染色した。得られた顕微鏡像によると、ナノ担体は球状であり、凝集しておらず、境界が鮮明であった。観測された粒径および多分散度は、動的光散乱で得られた結果に合致していた。
［実施例５：ＨＡ－ＰＡｒｇ蛍光ナノ粒子の調製］
ＰＡｒｇ－ＨＡナノ製剤を標識する手段として、Alexa Fluor 647カルボン酸を使用した。
８０μＬのＰＡｒｇ－ＯＨ溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）と、１２０μＬのAlexa Fluor 647カルボン酸トリス（トリエチルアンモニウム）塩（０．８ｍｇ／ｍＬ）（Invitrogen, Merelbeke, Belgium）とを、褐色ガラス製のバイアル内で磁気攪拌子を用いて混合した。次に、１００μＬのＨＡ溶液（９ｍｇ／ｍＬ）を渦の中央に注ぎ、分散液を磁気攪拌しながら１０分間保持した。
ナノ粒子を単離するために、２０μＬのグリセロールを入れたエッペンドルフチューブに３００μＬのナノ担体分散液を移し、１６０００ｇ、２５℃にて３０分間遠心分離した。次に、上清を廃棄し、強くボルテックスしてペレットを蒸留水に再懸濁した。その後、蛍光標識したナノ粒子を４℃にて保管した。
〔Ｂ．ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の形成におけるＰＡｒｇの存在の影響〕
ＨＡ溶液（濃度：９～１１．２５ｍｇ／ｍＬ）とＤＡＣＨＰｔ溶液とを混合して、ＰＡｒｇの存在がナノ粒子の形成に必要か否かを調べた。
ＤＬＳ（動的光散乱）によっては、ナノ粒子の形成が観測できなかった。このことから、安定なナノシステムを得るためには、ＰＡｒｇとＨＡとの相互作用が重要であることが明らかになった。
〔Ｃ．ナノ粒子のＤＡＣＨＰｔ封入効率（ＥＥ）〕
凍結乾燥させた種々の製剤（異なるＨＡ／ＰＡｒｇの比率で調製されている）の、ＤＡＣＨＰｔ封入効率を測定した。
材料および方法の欄に記載した通り、封入効率は、ＩＣＰ－ＯＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光法）により評価した。製剤は再構成してから使用するように意図・設計されているので、凍結乾燥前の封入効率を測定することは適当である。また、凍結乾燥によりＥＥは顕著に向上する。
表３は、凍結乾燥後に再構成した溶液について、ＨＡ／ＰＡｒｇの比率に応じた封入効率および重量モル浸透圧濃度を示す。ｎは３以上である（つまり、３回以上測定を行った）。
Figure 2022508458000004
以上の結果から、凍結乾燥後におけるナノ粒子へのＤＡＣＨＰｔの封入は、［ＨＡ］／［Ｐａｒｇ］の重量比が２超のときに特に有効であると分かる。
〔Ｄ．ブランクナノ粒子およびＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の安定性〕
粒径およびゼータ電位に関するナノ粒子の安定性は、凍結乾燥後に測定した。測定方法は、上述の通りである。
表４に示すように、実験した全てのナノ粒子において粒径が増加したが、この変化はシステムの安定性を損なうことはなかった。ＤＡＣＨＰｔは光に対する反応性が高いため、全てのサンプルは、暗所中、＋４℃にて茶色ガラス製のバイアル内で１～３箇月間保管した。バイアルは、ゴムキャップおよびアルミニウムシールで密封した。粒径の安定性はＤＬＳで評価し、再構成した後４週間以上は安定であった。また、再構成した後における重量モル浸透圧濃度はヒト血漿の重量モル浸透圧濃度（２９０ｍｍｏｌ／Ｌ）に非常に近く、ＩＶ（静脈内）注射に好適である（表３）。
表４は、様々な［ＨＡ］／［ＰＡｒｇ］の質量比における、凍結乾燥前後のＤＡＣＨＰｔを担持したＨＡ－ＰＡｒｇナノ粒子の物理化学的性質を示す。ｎは３以上である（つまり、３回以上測定を行った）。
Figure 2022508458000005
〔Ｅ．ヒト血清中および蒸留水中におけるＤＡＣＨＰｔを担持した蛍光ナノ粒子のＳＰＴ（Single Particle Tracking）〕
生物流体中のタンパク質の存在によりＤＬＳ測定中に光が散乱され、その結果、ナノ粒子の特性評価が妨げられる場合があることが実証されている。生物流体中におけるナノ粒子の物理化学的性質を調査する際にはＤＬＳは採用し難い技術であることを鑑みて、稀釈されていない生物流体（ヒト血清、血液、腹水など）中におけるナノシステムの粒径を測定する有力な方法として、ＳＰＴが提案された。
図１の示すところによると、Alexa Fluor 647で標識したＰＡｒｇ－ＨＡナノ担体を蒸留水で稀釈したときの平均粒径は、２６６ｎｍであった。また、９０体積％のヒト血清中、３７℃にて１時間インキュベートしたナノ粒子は、粒度分布が狭く、平均粒径は２７５ｎｍであった。
この結果から、生物学的状態下にあるＰＡｒｇ－ＨＡナノシステムの、コロイドとしての安定性が実証された。このことは、産業上における生物医学的応用にとって極めて重要である。
〔Ｆ．in vitroにおける実験〕
［Ｇ．１．細胞培養］
（細胞株）
ヒト肺胞癌Ａ５４９細胞（Prof. L. Migliore, University of Pisaよりご提供いただいた）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｍＭのＧｌｎおよび抗生物質を添加したHam's F12培地中で増殖させた。ヒト大腸腺癌ＨＴ－２９細胞（Prof. P. Petronini, University of Parmaよりご提供いただいた）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｎおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）中で増殖させた。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２存在下にてインキュベートした。全ての細胞は、解凍後１０継代を経ないうちに使用した。
［Ｇ．２．Ｂ６ＫＰＣ３細胞、Ａ５４９細胞およびＨＴ２９細胞を用いた生存性調査：ＭＴＳ試験］
（Ｂ６ＫＰＣ３細胞、Ａ５４９細胞およびＨＴ２９細胞の生存性）
３．５×１０３個のＢ６ＫＰＣ３細胞およびＡ５４９細胞、ならびに７．５×１０３個のＨＴ－２９細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、１％ＮＥＡＡ（Non Essential Amino Acids 100x, Gibco, Monza, Italy）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich, Milan, Italy）、１％Ｎ１培地サプリメント（０．５ｍｇ／ｍＬの組換えヒトインスリン、０．５ｍｇ／ｍＬの一部鉄飽和ヒトトランスフェリン、０．５μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム、１．６ｍｇ／ｍＬのプトレシンおよび０．７３μｇ／ｍＬプロゲステロンを含有している；Sigma-Aldrich）を添加した、ＦＢＳを含んでいない新しい培養培地に交換した。このとき、市販のオキサリプラチン（Oxaliplatin Hospira (R)の５ｍｇ／ｍＬ溶液）、ＤＡＣＨＰｔ、ブランクＨＡＰＡｒｇ－ＮＰおよびＤＡＣＨＰｔを担持したＨＡＰＡｒｇ－ＮＰの濃度を、種々に変化させて（０～２００μＭ）培地に加えた。２４時間後、MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit（Novus Biologicals, Abingdon, UK）を用いて細胞生存性を評価した。簡潔に説明すると、培地を除去し、無血清培地の中で１：１０に稀釈したＭＴＳ溶液を１００μＬずつウェルに注入した。予備実験において、各細胞型の代謝に応じたＭＴＳへの曝露時間を決定しておいた（ＨＴ－２９細胞：１時間、Ａ５４９細胞：３時間）。マイクロプレートリーダ（EnSpire (R) Multimode Plate Reader, Perkin Elmer, Boston, MA, US）を用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
以下の式によって細胞生存性（ＣＶ）を評価した。
ＣＶ（％）＝（吸光度（処理ウェル））／（吸光度（対照ウェル））×１００
薬物を含まない培地中でインキュベートした未処理細胞の吸光度を、吸光度（対照ウェル）とした。
［Ｇ．３．ＨＴ－２９細胞、Ａ５４９細胞およびＢ６ＫＰＣ３細胞を用いた生存性研究の結果：ＭＴＳ試験］
Ｂ６ＫＰＣ３細胞（図２Ａ）ＨＴ－２９細胞（図２Ｂ）およびＡ５４９細胞（図２Ｃ）を４８時間インキュベートした。この際、オキサリプラチン（Oxaliplatin Hospira (R) 5mg/ml）、ＤＡＣＨＰｔ、ブランクナノ粒子およびＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰの濃度を、種々に変化させた（０～２００μＭ）。したがって、オキサリプラチン、ＤＡＣＨＰｔおよびブランクナノ粒子は、対照として使用されている。次に、ＭＴＳアッセイにより生存性を評価した（材料および方法の欄を参照）。対照（未処理細胞）に対する百分率（％）でデータを表す。３者の測定のいずれも、データは、２回の実験の平均値±標準偏差である（各実験で３回の測定を行った）。
Ｂ６ＫＰＣ３細胞（図２Ａ参照）、ＨＴ－２９細胞（図２Ｂ参照）およびＡ５４９細胞（図２Ｃ参照）の生存性の用量に応じた反応。オキサリプラチン、ＤＡＣＨＰｔ、ブランクＨＡＰＡｒｇ－ＮＰおよびＤＡＣＨＰｔを担持したＨＡＰＡｒｇ－ＮＰに対する。その結果によると、これらの細胞は、オキサリプラチンよりも、ＤＡＣＨＰｔに対する感受性が高かった。ＨＴ－２９細胞のＩＣ５０は、ＤＡＣＨＰｔでは３９μＭであり、オキサリプラチンでは７４μＭであった。Ｂ６ＫＰＣ３細胞では、ＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰのＩＣ５０（１８μＭ）は、オキサリプラチン溶液のＩＣ５０（２３μＭ）に比べて１．３倍低かった。Ａ５４９細胞株では、ＮＰの毒性とオキサリプラチン溶液の毒性とは同程度であった（それぞれのＩＣ５０は、１１μＭおよび１２μＭ）。ブランクＮＰは、全ての濃度（表４－２参照）において細胞生存性に影響しなかった。
Figure 2022508458000006
［実施例６：ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の薬物動態］
（Ａ．材料および方法）
健康なマウス（８週齢の雌、Ｃ５７ＢＬ／６）に、２００μＬのＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子およびオキサリプラチン溶液を、マウス１匹あたりに投与する白金当量が３５．９μｇとなるようにＩＶ注入した。
特定の時刻において（投与から１５分後、３０分後、１時後、１．５時間後、３時間後、５時間後、８時間後および１２時間後）、２００μＬの血液を採取し、血漿を分離した。ＩＣＰ／ＭＳによりＰｔ含有量を測定した。
WinNonlin6.4,Connect1.4を用いて、Phoenix（Pharsight - a Certara (TM) L.P. software 1998-2014, Build 6.4.0.78）using WinNonlin 6.4, Connect 1.4でコンパートメントＰＫ分析を行った。データのフィッティングには、１次近似、ボーラス投与による２コンパートメントモデル、ＣＬおよびＶで表した式を採用した。１／ｙｈａｔ ２を重み付け関数とした。平均データまたは個別データのいずれかを用いてモデルをフィッティングし、その結果は、いずれの場合でも同程度であった。
次に、このモデルを使用して複数回投与レジメンをシミュレートした。「週に２回」のレジメンを採用し、３．５ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチン溶液またはＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の８サイクル投与をシミュレートした（Marmiroli P. et al., Susceptibility of different mouse strains to oxaliplatin peripheral neurotoxicity: Phenotypic and genotypic insights, PLoS One）。マウス１匹あたりの平均体重は２５ｇであり、絶対投与量は８７．５μｇであった。レジメンのスケジュールは、下記のいずれかである。
・１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目、１８日目、２２日目および２５日目にＩＶ点滴（２時間）
・１週間あたり合計２用量を４週間投与
（Ｂ．結果）
いくつかの薬物について、静脈内ボーラス注入後の血漿濃度－時間の曲線は、明らかな二相性パターンを示した。この二相性パターンは、白金誘導体が様々な組織に広範囲に分布した後、最終的に体内から排出された結果である。得られたプロファイル（図３Ａおよび３Ｂ）に基づいて、２コンパートメントモデルを用いてデータを分析した。ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子に由来するＰｔ濃度およびＤＡＣＨＰｔ濃度を評価・比較したところ、その結果は同程度であった。最後に、オキサリプラチン溶液に由来するＰｔ濃度、およびＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子に由来するＤＡＣＨＰｔ濃度を、時間の関数としてプロットした。
近似曲線から得たパラメータを下記表５に示す。
Figure 2022508458000007
得られたＰＫの結果によると、ＤＡＣＨＰｔナノ粒子の投与後における薬物のＡＵＣは２４ｈｒ・ｍｇ／Ｌであり、オキサリプラチン溶液の投与後における値（３．７６ｈｒ・ｍｇ／Ｌ）の６倍高かった。Ｃｍａｘ（０時間目において血中で検出される最大薬物濃度として定義される）は、ナノ粒子は１１．４ｍｇ／Ｌであり、オキサリプラチン溶液は２．４８ｍｇ／Ｌであった。つまり、ナノ粒子のＣｍａｘは、オキサリプラチンよりも約５倍高い。
分布半減期および排出半減期によると、薬物がナノ粒子中に封入されている場合、その分布（α相の半減期）がより遅くなることが示された（α相の半減期は、ナノ粒子：０．３７０時間、オキサリプラチン溶液：０．１３５時間）。
しかし、排出速度（β相の半減期）は、ナノ粒子の方がオキサリプラチン溶液よりも速かった（β相の半減期は、ナノ粒子：６．４９時間、オキサリプラチン溶液：１３．６時間）。
この結果から示されるのは、オキサリプラチン溶液を投与した場合の血漿中のＰｔ濃度は、ナノシステムを投与した場合と比べ、低いレベルで始まり、初期のうちに急速に減少するということである。Ｋ１２（中央コンパートメントから末梢コンパートメントへの分布に関する速度定数）は、オキサリプラチン溶液（４．１４ｈｒ－１）の方が、ＤＡＣＨＰｔナノ粒子（１．０８ｈｒ－１）よりも高い。一方、Ｋ２１（末梢コンパートメントから中央コンパートメントへの分布に関する速度定数）は、オキサリプラチンの場合（０．３９８ｈｒ－１）もＤＡＣＨＰｔナノ粒子の場合も（０．４１８ｈｒ－１）、同程度であった。
中央および周辺コンパートメントの分布容積は、ナノ粒子の方がオキサリプラチン溶液よりも低かった（ナノ粒子は、Ｖｃ：０．００３、Ｖｐ：０．００８Ｌ；オキサリプラチン溶液は、Ｖｃ：０．０１４、Ｖｐ０．１５０Ｌ）。定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）も、ナノ粒子の方がオキサリプラチン溶液よりも低かった（ナノ粒子：０．０１１Ｌ、オキサリプラチン：０．１６５Ｌ）。血漿クリアランスは６倍異なっており、ナノ粒子では０．００２Ｌ／ｈであり、オキサリプラチン溶液では０．０１０Ｌ／ｈであった。
薬物療法の維持を研究すべく、反復投与レジメンをシミュレートした。反復投与のスケジュールは、副作用を最小限に抑えつつ、血漿中および作用部位における治療薬物の濃度を維持することを意図している。サイクルにおける投与回数、頻度および持続期間は、患者のニーズおよび全身状態に依存する（Cisterna A et al. Targeted nanoparticles for colorectal cancer, Nanomedicine (Lond). 2016）。in vivoにおける複数投与レジメンをシミュレートするために、３．５ｍｇ／ｋｇのオキサリプラチン溶液またはＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子を、８サイクル投与することにした（Marmiroli P. et al., Susceptibility of different mouse strains to oxaliplatin peripheral neurotoxicity: Phenotypic and genotypic insights, PLoS One）。
一般的に、定常状態における濃度の平均に影響する因子は、投与率（この場合、週に２回×４週間）および血漿クリアランスである。一方、血漿濃度の変動に影響する因子は、薬物投与の頻度および排出半減期である。今回比較検討した投薬スケジュールにおいては、同じ頻度および同等のＰｔ投与量でシミュレートした。ＤＡＣＨＰｔナノ粒子およびオキサリプラチン溶液の血漿クリアランスは、互いに異なっている。血液からの薬物クリアランスは、ナノ粒子の方が、オキサリプラチン溶液よりも低い。
しかし、排出半減期は、両者の間で全く異なっていた。具体的には、オキサリプラチン溶液では１３時間であり、ＤＡＣＨＰｔナノ粒子では６時間であった。
シミュレーションから明らかなように、プロットした全ての化合物に関して、Ｐｔの蓄積はなく、急速に定常状態に達した。一般的に、反復投与スケジュールでは、前回の投薬が完全に消失する前に投薬をすれば、蓄積が生じる。これにより、体内の薬物量が次第に上昇してゆく。
今回のシミュレーション結果から分かるのは、薬物は蓄積することなく常に消失していることであった。ナノ粒子の場合には、投与中および投与直後において、高度な露出が達成されていることは明らかである。その後、オキサリプラチン溶液およびＤＡＣＨＰｔナノ粒子いずれの場合も、有効成分濃度は急速に減少した。
ＤＡＣＨＰｔの場合には、高度な露出は２日間以上持続している。しかし、オキサリプラチン溶液の場合は、血液中から検出された薬物量は、開始時点においてすら非常に低い。
これらの結果は、コンパートメント分析から得られたＣｍａｘ値と整合している。実際に、０時間目において血液中で検出される最大薬物濃度は、ナノ粒子の方が対照薬物よりも５倍高い。
このシミュレーションよれば、ＤＡＣＨＰｔナノ粒子を投与すると、薬物の蓄積を避けつつ、長時間にわたる高度な薬物曝露状態を維持できることは疑いない。
臨床試験では、２時間のオキサリプラチン点滴の終了時において、投与した白金のうち１５％しか体循環に存在しないことが判明された。既報の通り、オキサリプラチン投与後におけるヒト血漿限外濾過液中の白金のＰＫは、通常は二相性である。白金のＰＫは、初期分布相が短く、終期排出相が長いのが特徴である。また、白金は、血漿タンパク質（主に血清アルブミン）および赤血球と不可逆的に結合する。赤血球は体循環中の白金のリザーバとならず、血球に白金が蓄積するとは、臨床的には妥当であると考えにくい（M.A. Graham, G.F. Lockwood, D. Greensdale, S. Brieza, M. Bayssas, E. Gamelin, Clinical pharmacokinetics of oxaliplatin: a critical review, Clin. Cancer Res. 6 (2000) 1205-1218）。
以上を総合して考えると、コンパートメント分析および複数回投与レジメンシミュレーションの結果によれば、ＨＡ－ＰＡｒｇナノ粒子は効率的に薬物と会合でき、ＤＡＣＨＰｔと血漿タンパク質との結合に起因する急速な薬物の排出を防げる。Ｃｍａｘおよびα相の半減期が、この仮説を支持している。さらに、分布容積およびクリアランスの減少から明らかに示されることには、封入された薬物は、組織分布がより限定され、蓄積が発生せず、薬物排出が低下する。
薬物を担持したナノシステムの薬物動態評価に関する文献を深く研究したところ、長時間にわたり循環するナノ粒子製剤の開発に多大な努力が傾注されていることが分かった（Preparation and biological properties of dichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum(II) (DACHPt)-loaded polymeric micelles, Journal of controlled release 2005）。しかしまた、循環時間を長くすると、ナノ粒子の組織分布が遅くなり（標的組織においても）、薬物放出も非常に遅くなる。加えて、オキサリプラチンの場合、薬物が血中に放出されるとタンパク質または赤血球と結合する（上述の通り）。したがって、副作用を回避するためには、長い循環特性と分布および排出速度との良好なバランスが必要である（Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles,Molecular pharmaceutics,2008）。
本実施例に示された結果は、薬物単独と比較したナノ粒子の、高い安定性（高度な薬物暴露）、遅い放出および排出に関連している。
［実施例７：様々なＰＡＲｇ－ＯＨ／ＰＡＲｇ－Ｃｌ重量比で調製したＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の会合効率］
（ＰＡｒｇＯＨおよびＰＡｒｇＣｌ（混合系）－ＨＡナノ粒子を得るためのプロトコル）
ＰＡｒｇＣｌに由来するＣｌイオンの影響を調べるために、ＰＡｒｇＯＨおよびＰＡｒｇＣＬを異なる質量比（または重量比）で含んでいるナノ粒子を作製した。
使用に先立って、ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液、ＰＡｒｇ－Ｃｌ溶液およびＨＡ溶液を、０．２２μｍフィルタで濾過して無菌性を確保しておいた。
ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子を得るために、実施例１で得たＤＡＣＨＰｔ溶液５００μＬを、ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液とＰＡｒｇ－Ｃｌ溶液との混合物に加えた（下記表６に示す質量比で混合した）。
ＤＡＣＨＰｔ－ＰＡｒｇ－ＯＨ溶液にＨＡを加えることにより、担持したナノ粒子を形成させた。
カプセル化効率（すなわち、封入効率または会合効率）を、上述した通りに求めた。カプセル化効率は、凍結乾燥ナノ粒子を水中に再懸濁した後に評価した。
表６は、ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子の会合効率に対する、ＰＡｒｇ－ＯＨ／ＰＡｒｇ－Ｃｌの重量比の影響を示す。
Figure 2022508458000008
以上の結果から、ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子では、ＰＡｒｇ－ＯＨの量が多ければ多いほどカプセル化効率が高いことが分かる。
［実施例８：シスプラチンを担持したナノ粒子の会合効率］
（シスプラチンを担持したＨＡ－ＰＡｒｇナノ粒子を得るためのプロトコル）
シスプラチンを担持したＨａ－ＰＡｒｇナノ粒子を得るために、上述したＤＡＣＨＰｔナノ粒子の作製と同様のプロトコルを施した。ＤＡＣＨＰｔと同じ濃度のシスプラチンをＰａｒｇ－ＯＨ溶液と混合した後、上記と同じプロトコルを施した。ナノシステムを１０％ｗ／ｖマンニトールの存在下にて調製し、凍結乾燥させた。再懸濁した後、カプセル化効率を上記のプロトコルと同様に評価した。
表７は、凍結乾燥前後における、ＨＡ／Ｐａｒｇ（塩素を含有していないナノシステム）とシスプラチンとの会合効率を示す。
Figure 2022508458000009
以上の結果から、シスプラチンを担持したナノ粒子の会合効率は、凍結乾燥前よりも凍結乾燥後の方が大きいことが分かる。
［実施例９：ナノ粒子の活性評価のためのin vitroにおける研究］
（３Ｄ細胞モデル：ＭＣＴＳの形成および処理）
多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＣＴＳ）を、既報に従って形成させた（Virgone-Carlotta A, Lemasson M, Mertani HC, et al. In-depth phenotypic characterization of multicellular tumor spheroids: Effects of 5-Fluorouracil. PLOS ONE. 2017;12(11):e0188100. doi: 10.1371/journal.pone.0188100）。簡潔に説明すると、細胞と基板との接着を避けるためにUltra Low Attachment (ULA) 96 wells Round-Bottom plate（Greiner bio-one）中にて、ＨＴＣ－１１６細胞株を用いてＭＣＴＳを形成させた。細胞をトリプシン処理し、１ｍＬあたり２４００個の細胞となるように、Malassez gridを用いて計数した。この細胞濃度（体積２００μＬのウェルあたり４８０個の細胞）は、実験の終了時において、１ウェルあたり１個の直径５００μｍ未満のスフェロイドが存在するように選択した。１２００ｇ、室温にて、５分間プレートを遠心分離し、スフェロイドの形成を開始させた。実験の全過程にわたり、３７℃、５％ＣＯ２存在下のインキュベータにプレートを置き、振盪し続けた。播種後第１日目の終わりに１００μＬの培養培地を加え、３次元的に適切に成長させた。播種から２日後、オキサリプラチン水溶液またはＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子（ＮＰ）を用いてＭＣＴＳを処理した。薬物の濃度は、５μＭ、２５μＭまたは５０μＭである。３日間にわたり処理を更新した。結果を図４～６に示す。
また、ブランクＮＰを使用して、システムにより生じるかもしれない非特異的毒性を評価した。処理後０日目、１日目、２日目、３日目、４日目および７日目のＭＣＴＳをモニタリングした。各濃度（５μＭ、２５μＭおよび５０μＭ）につき、８個のスフェロイドを調査した（ｎ＝８）。処理から１日後、剥離した細胞の環が自然に現れた。スフェロイドを新しいウェルプレートに移して、非凝集性の周辺細胞層を物理的に除去し、さらに薬物および培養培地を交換した。したがって、生存能力および凝集性の喪失に起因して、処理期間中に体積の減少が見られた。
結果を表８～１０に示す。これらの表は、ブランクナノ粒子、ＤＡＣＨＰｔを担持したナノ粒子（ＮＰ）およびオキサリプラチン（ＯＸＰ）で処理した多細胞ＨＴ１１６スフェロイドの大きさの減少度（％）を表している。各表における薬物の濃度は、それぞれ５μＭ、２５μＭおよび５０μＭである。スフェロイドの大きさは、、同じ日における対照スフェロイドの大きさとの比較により表した。
Figure 2022508458000010
Figure 2022508458000011
Figure 2022508458000012
（位相差によるＭＣＴＳの体積の追跡）
倒立顕微鏡（Leica DMIRB）で、９６ウェルプレート内のＭＣＴＳの位相差写真を撮影した。撮影時期は、オキサリプラチンに曝露してから０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、７日目の時点である。Image J softwareを利用して、Soble閾値により各スフェロイドをエッジ検出した。ImageJ "Analyse Particles" pluginを利用して、得られた二値画像を、長軸（ＬＭ）および短軸（Ｌｍ）を有する楕円に近似した。これにより、平均直径Ｄを計算した（Ｄ＝（ＬＭ＋Ｌｍ）／２）。次に、スフェロイドを球体であると仮定し、体積Ｖを求めた（Ｖ＝πＤ３／６）。結果を図７に示す。
（結果）
より生体に類似したin vitro培養系におけるナノ粒子の腫瘍生存に対する影響を検討した。そのために、オキサリプラチン溶液およびＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰの用量に対する反応を比較した。３日間にわたり処理を施し、ＨＣＴ－１１６細胞株由来の多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＣＴＳ）に対する影響を調査した。位相差顕微鏡像に基づいてＭＣＴＳの体積を評価し、これを細胞毒性効果の出力とした。図４～６のデータは、種々の処理に関して、対照の体積（未処理のＭＣＴＳ）で正規化したＭＣＴＳの体積を示す。３種類の異なる薬物濃度（５μＭ、２５μＭおよび５０μＭ）を検討した。
図４～６に示すように、ＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰは、薬物の投与量が５μＭであっても、処置から２日後にスフェロイドの体積を減少させられた。細胞毒性効果は、より高い投与量において顕著であった（２５μＭおよび５０μＭ）。観測開始から７日後、薬物の濃度が２５μＭおよび５０μＭである場合には、ＤＡＣＨＰｔ－ＮＰの使用による腫瘍体積の減少は、オキサリプラチン溶液による減少よりも顕著であった（図５および６）。このことは、オキサリプラチン溶液よりもカプセル化した薬物の活性の方が高いことを示唆している。何も担持していないナノ粒子は、ＭＣＴＳの大きさに影響しなかった。
処理後のＭＣＴＳの写真を撮影して、スフェロイドの変化を示す。図７では、未処理のスフェロイドと、最高濃度（５０μＭ）のオキサリプラチンおよびＤＡＣＨＰｔを担持したＮＰで処理したＭＣＴＳとを比較している。ＤＡＣＨＰｔ－ＮＰで処理するとスフェロイドが崩壊したのに対し、オキサリプラチンで処理すると少数の細胞が依然として存在し凝集体を形成していることが分かる。

Claims (15)

  1. 薬物送達システムとして有用なナノ粒子であって、少なくとも下記（ａ）～（ｃ）から形成されており、
    （ａ）白金系薬物；
    （ｂ）ポリＬ－アルギニン；
    （ｃ）ヒアルロン酸；
    上記白金系薬物は、白金錯体（ＩＩ）、白金錯体（ＩＶ）、およびそれらの混合物から選択される白金錯体である、ナノ粒子。
  2. 上記（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン水酸化物、ポリＬ－アルギニン塩酸塩、およびポリＬ－アルギニン水酸化物とポリＬ－アルギニン塩酸塩との混合物から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. 上記白金系薬物は、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、ロバプラチン、ヘプタプラチン、ｃｉｓ－ジアンミンジアクア白金（ＩＩ）、ジアクア（１，２－ジアミノメチルシクロブタン）白金（ＩＩ）、ジアクア（４，５－ジアミノメチル－２－イソプロピル－１，３－ジオキソラン）白金（ＩＩ）、およびそれらの混合物から選択される白金（ＩＩ）系薬物であり、
    好ましくは、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）である、
    請求項１または２に記載のナノ粒子。
  4. 上記（ａ）白金系薬物は、塩素原子を含んでいない形態で存在し、
    上記（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン水酸化物であり、
    好ましくは、上記（ａ）白金系薬物は、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）である、
    請求項１～３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
  5. 上記（ａ）白金系薬物は、塩素原子を含んでおり、
    上記（ｂ）ポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩である、
    請求項１に記載のナノ粒子。
  6. ［ＨＡ］／［Ｐａｒｇ］の重量比が、０．５／２．５超であり、
    好ましくは（０．６／２．５）～（１５／２．５）であり、
    より好ましくは（３／２．５）～（１２／２．５）であり（例えば３／２．５、４／２．５、７／２．５、９／２．５、１０／２．５、１１．２５／２．５および１２／２．５）、
    さらに好ましくは１１．２５／２．５である、
    請求項１～５のいずれか１項に記載のナノ粒子。
  7. ［白金系薬物］／（［ＨＡ］＋［ＰＡｒｇ］）の重量比が、０．０１～１．００であり、
    好ましくは０．０３～０．５０であり、
    より好ましくは０．０４～０．１０である、
    請求項１～６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のナノ粒子の製造方法であって、少なくとも下記（i）～（v）の工程を含む方法：
    （i）塩素原子を含んでいないアクア錯体形態の白金系薬物を提供する工程；
    （ii）塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンの水溶液を提供する工程；
    （iii）工程（i）の上記アクア錯体形態の白金系薬物と、工程（ii）の上記水溶液とを混合する工程；
    （iv）ナノ粒子の形成に適した条件下にて、工程（iii）で得られた混合物に、ヒアルロン酸を加える工程；
    （v）任意構成で、工程（iv）で得られたナノ粒子を回収する工程。
  9. 上記アクア錯体形態は、ジアミンジアクア白金（ＩＩ）、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＤＡＣＨＰｔ）、ジアクア（１，２－ジアミノメチルシクロブタン）白金（ＩＩ）、ジアクア（４，５－ジアミノメチル－２－イソプロピル－１，３－ジオキソラン）白金（ＩＩ）、およびそれらの混合物から選択され、
    好ましくは、ジアクア（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）である、
    請求項８に記載の方法。
  10. 工程（ii）の上記塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン塩酸塩から得られる、請求項８に記載の方法。
  11. 工程（ii）の上記塩化物イオンを含んでいないポリＬ－アルギニンは、ポリＬ－アルギニン水酸化物である、請求項８に記載の方法。
  12. 請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法によって得られるナノ粒子。
  13. 請求項１～７および１２のいずれか１項に記載のナノ粒子の１種類以上と、
    薬学的に許容可能な添加剤の１種類以上と、
    を含んでいる医薬組成物。
  14. 癌の予防および／または治療に用いる、請求項１～７および１２のいずれか１項に記載のナノ粒子。
  15. 上記癌は、膵臓癌（特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、卵巣癌、精巣癌、乳癌、脳腫瘍、肉腫、リンパ腫、頭頸部癌、転移性大腸癌、胃癌(gastric cancer)、卵巣癌、食道癌、膀胱癌、子宮頸癌、白血病（慢性骨髄性白血病など）、前立腺癌、肝臓癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、骨肉種、子宮癌、リンパ腺癌、胃癌(stomach cancer)および腸癌から選択される、請求項１４に記載のナノ粒子。
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