JP2022500409A - 肺炎球菌融合タンパク質ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年9月12日に出願された米国仮出願第62/730,199号の利益を主張するものであり、その仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願では、文脈から別途明確でない限り、(i)「a」という用語は、「少なくとも1つ」を意味すると理解され得、(ii)「または」という用語は、「及び/または」を意味すると理解され得、(iii)「含む(comprising)」及び「含む(including)」という用語は、それ自体で提示されるか1つ以上の追加の構成要素またはステップと一緒に提示されるかにかかわらず、項目別の構成要素またはステップを包含すると理解され得、(iv)「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるであろう標準偏差を許容すると理解され得、(v)範囲が提供されている場合、端点が含まれる。
[発明を実施するための形態]
本開示は、S.pneumoniaeの新規免疫原性融合タンパク質について記載する。WO2014/124228において、本発明者らは、肺炎球菌抗原SP0785及びSP1500がそれぞれ、再刺激したヒトPBMC中及び肺炎球菌に曝露したマウスの脾細胞中で、強力なIL−17想起応答を誘発したことを実証した。コレラ毒素アジュバントを加えたSP0785、またはコレラ毒素アジュバントを加えたSP1500によるマウスの免疫化は、肺炎球菌のコロニー形成を大幅に低減(100倍程度)させた。SP0785のニューモリソイドPdTへの融合体、またはSalmonella typhiの多糖にさらにコンジュゲートさせたSP0785のニューモリソイドPdTへの融合体による免疫化は、S.pneumoniae生菌による致死性の曝露において、マウスの80%を敗血症から保護した。Salmonella typhiの多糖にさらにコンジュゲートさせた、SP0785、SP1500とニューモリソイドPdTの融合体による免疫化もまた、肺炎球菌のコロニー形成を大幅に低減(10倍程度)させた。
SP0785は、WO2014/124228に記載されている、保存された仮想のS.pneumoniaeタンパク質である。いくつかの実施形態では、SP0785ポリペプチドは、S.pneumoniae株全体にわたり保存されている排出トランスポータータンパク質である。いくつかの実施形態では、SP0785ポリペプチドは、完全長SP0785ポリペプチドであるか、またはそれを含む。例えば、いくつかの実施形態では、完全長SP0785ポリペプチドは、399個のアミノ酸(38kDa)を有し、配列番号3に記載のアミノ酸配列によって表される。配列番号3のアミノ酸1〜32は、SP0785ポリペプチドのシグナル配列及び膜貫通ドメイン(完全長タンパク質のアミノ酸1〜32)であると予測されている。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、S.pneumoniaeのSP0785ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、45個、50個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、367個または399個のSP0785ポリペプチドの連続したアミノ酸を含む。
SP1500は、WO2014/124228に記載されている。いくつかの実施形態では、SP1500ポリペプチドは、S.pneumoniae株全体にわたり保存されているアミノ酸結合ポリペプチドであるアミノ酸ABCトランスポーターである。いくつかの実施形態では、SP1500ポリペプチドは、完全長SP1500ポリペプチドであるか、またはそれを含む。例えば、いくつかの実施形態では、完全長SP1500ポリペプチドは、278個のアミノ酸(28kDa)を有し、配列番号6に記載のアミノ酸配列によって表される。配列番号6のアミノ酸1〜26は、SP1500ポリペプチドのシグナル配列(完全長タンパク質のアミノ酸1〜26)であると予測されている。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、S.pneumoniaeのSP1500ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも7つ、8つ、9つ、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、45個、50個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、150個、200個、252個または278個のSP1500ポリペプチドの連続したアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、非共有結合性の多重抗原提示系(MAPS)免疫原性複合体の成分である。いくつかの実施形態では、MAPS複合体は、ビオチンまたはビオチン誘導体と、予測される顕著なヒトタンパク質との相同性を有さないビオチン結合タンパク質であるリザビジンとの間の高親和性(解離定数[KD]約10−15M)非共有結合性結合を利用する。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、1つ以上のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、1つ以上のアミノ酸であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、リンカーによってビオチン結合部分に連結された抗原ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第1の抗原ポリペプチド、第2の抗原ポリペプチド、ビオチン結合部分及び少なくとも1つのリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第1の抗原ポリペプチド及び第2の抗原ポリペプチドは、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、第1の抗原ポリペプチドまたは第2の抗原ポリペプチドは、リンカーによってビオチン結合部分に連結される。いくつかの実施形態では、第1の抗原ポリペプチド及び第2の抗原ポリペプチドは、第1のリンカーによって連結され、第1の抗原ポリペプチドまたは第2の抗原ポリペプチドは、第2のリンカーによってビオチン結合部分に連結される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、タグを含み得る。タグは、N末端またはC末端であり得る。例えば、タグを(コードするDNA配列上への付加または修飾を介して)ポリペプチドに追加して、精製、検出、溶解性を促進させるか、またはタンパク質に他の望ましい特性を付与することができる。いくつかの実施形態では、タグは、アフィニティー精製に使用され得るペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、タグは、ポリヒスチジン(His)、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、タンデムアフィニティー精製(TAP)、FLAG、myc、ヒトインフルエンザヘマグルチニン(HA)、マルトース結合タンパク質(MBP)、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV−G)、チオレドキシン、V5、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質(BCCP)、カルモジュリン、Nus、Sタグ、リポタンパク質D及びガラクトシダーゼのうちの1つ以上であるか、それらを含むか、またはそれらに由来する。いくつかの実施形態では、Hisタグは、Hn(式中、nは2〜10の整数である)のアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。例示的なHisタグには、HHHHHH(配列番号15)及びMSYYHHHHHH(配列番号16)が含まれる。他の実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質精製タグなどのタグを含まず、精製タグに対する親和性に依存しない方法によって精製される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、表1のポリペプチドまたは表2の融合タンパク質の一方または両方の末端に、1つ以下、2つ以下、3つ以下、4つ以下、5つ以下、10個以下または20個以下の追加のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド及び/または融合タンパク質のうちの1つ以上をコードする核酸、例えば、DNA、RNAまたはそれらの類似体を提供する。本明細書に記載のポリペプチドの基礎となるDNA配列を、タンパク質産物の配列に影響を及ぼさない方法で修飾することができ、そのような配列は本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、DNA配列をコドン最適化して、宿主、例えば、E.coliなどの細菌細胞株、昆虫細胞株(例えば、バキュロウイルス発現系の使用)、または哺乳動物(例えば、ヒトもしくはチャイニーズハムスター卵巣)細胞株中の発現を改善することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、溶血活性を有さないか、またはごくわずかな溶血活性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質の溶血活性を、赤血球の50%が溶解するタンパク質濃度を決定するために、融合タンパク質を異なる希釈度で赤血球(例えば、ヒツジ赤血球)とともにインキュベートした後に、比濁法(OD420)により明らかにすることができる。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質の溶血活性は、例えば、所与のタンパク質濃度について0.3未満、0.25未満、0.2未満またはそれ以下を含む、0.4未満またはそれ以下のOD420によって特徴付けることができる。
本開示はまた、本明細書に記載の1つ以上の融合タンパク質の免疫原性組成物(例えば、ワクチン組成物)、または本明細書に記載の1つ以上の融合タンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、表2に記載の融合タンパク質に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%または100%の配列同一性を有する1つ以上の融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号17〜26のいずれか1つに対して少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または100%の同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号23に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または100%の同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、CP1(例えば、図1に記載の通りのCP1)に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%または100%の同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれを含む融合タンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物(例えば、ワクチン組成物)は、本明細書に記載の融合タンパク質に加えて、1つ以上または2つ以上の既知のS.pneumoniae抗原を含む。場合によっては、既知のS.pneumoniae抗原が、主に抗体の標的である。場合によっては、既知のS.pneumoniae抗原は、多糖である。場合によっては、既知のS.pneumoniae抗原は、S.pneumoniaeのコロニー形成から、あるいはS.pneumoniae誘発性の敗血症、肺炎、髄膜炎、中耳炎、副鼻腔炎、またはS.pneumoniaeによる他の部位もしくは器官の感染から保護する。
本開示はまた、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする1つ以上の核酸の免疫原性組成物(例えば、ワクチン組成物)、または本明細書に記載の融合タンパク質をコードする1つ以上の核酸を含む免疫原性組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、表2に記載の融合タンパク質に対して、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%または100%の配列同一性を有する融合タンパク質をコードする1つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号17〜26のいずれか1つに対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%または100%の同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号23に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または99.5%の同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、CP1に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%または100%の同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1つ以上の融合タンパク質を含む免疫原性組成物またはワクチンは、ELISA及び/または機能的抗体アッセイによって測定した場合に、1つ以上の融合タンパク質に対するオプソニン化能力または免疫応答のうちの1つ以上が所定のレベルと比較して増加することを特徴とする。いくつかの実施形態では、1つ以上の融合タンパク質に対するオプソニン化能力または免疫応答のうちの1つ以上は、ELISA及び/または機能的抗体アッセイによって測定した場合に、所定のレベルと比較して、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%以上を含む、少なくとも30%以上増加する。いくつかの実施形態では、1つ以上の融合タンパク質に対するオプソニン化能力または免疫応答のうちの1つ以上は、ELISA及び/または機能的抗体アッセイによって測定した場合に、所定のレベルと比較して、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍または5倍増加する。いくつかの実施形態では、所定のレベルは、免疫前レベル(例えば、対象が免疫化されていない場合、または本明細書に記載の1つ以上の融合タンパク質の非存在下で免疫化されている場合に観察されるレベル)である。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の融合タンパク質を含む免疫原性組成物またはワクチンで免疫化した哺乳動物中で産生された抗体を含む、抗体組成物を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナルAb(mAb)及び抗イディオタイプ抗体からなる群から選択される少なくとも1つの抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、単離されたガンマグロブリン画分を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、ポリクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体組成物は、対象に投与される。
本明細書に記載の融合タンパク質を含む特定のワクチンの成分の最適量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準的試験によって確認することができる。最初の免疫化の後、対象は、適切な時間間隔で1回または複数回の追加免疫化を受けることができる。
本明細書に記載の融合タンパク質を含むワクチン製剤及び免疫原性組成物は、アジュバントを含み得る。一般に、アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強する作用物質である。アジュバントは、その主な作用機序に基づいて、ワクチン送達系及び免疫刺激性アジュバントの2つのクラスに大きく分けることができる(例えば、Singh et al,2003を参照されたい)。ほとんどのワクチン製剤では、アジュバントは、免疫系が抗原に対する応答を生じるように免疫系にシグナルを提供し、抗原は、病原体に対する応答の特異性を促進するために必要とされる。ワクチン送達系は、多くの場合、粒子状製剤、例えば、エマルション、微粒子、免疫刺激複合体(ISCOM)、ナノ粒子(例えば、粒子及び/またはマトリックスであり得る)、ならびにリポソームである。対照的に、免疫刺激性アジュバントは、時として病原体に由来するかまたはそれから誘導され、自然免疫系の細胞を活性化する病原体関連分子パターン(PAMP)、例えば、リポ多糖(LPS)、モノホスホリルリピドA(MPL)、またはCpG含有DNAを示すことができる。
本明細書に記載の融合タンパク質及び上述のアジュバントに加えて、ワクチン製剤または免疫原性組成物は、1つ以上の追加の成分を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む免疫原性組成物またはワクチンは、肺炎球菌感染症を発症するリスクのある対象、例えば、乳児、幼児、若年または高齢者に投与される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物またはワクチンは、肺炎球菌感染症を発症するリスクが高い対象、例えば、免疫不全状態の対象、鎌状赤血球症もしくは他の異常ヘモグロビン症、先天性もしくは後天性無脾症、脾臓機能不全、慢性腎不全もしくはネフローゼ症候群、免疫抑制薬もしくは放射線療法による処置に関連付けられる疾患(悪性新生物、白血病、リンパ腫、ホジキン病、もしくは実質臓器移植を含む)、先天性もしくは後天性免疫不全、HIV感染症、脳脊髄液漏出症、人工内耳(複数可)、慢性心疾患、慢性肺疾患、糖尿病、アルコール依存症、慢性肝疾患、喫煙、喘息、全身性悪性腫瘍、多発性骨髄腫、または実質臓器移植を有する対象に投与される。対象は、疾患の何らかの症状であると診断されていなくても、疾患を発症するリスクがあると見なされ得ることが理解されよう。例えば、対象が、感染のリスクが比較的高い状況に置かれていることが知られているか、またはその状況に置かれることが予定されている場合、その対象は、疾患を発症するリスクがあると見なされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む免疫原性組成物またはワクチンは、別の作用物質と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態では、作用物質は、PCV13であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、作用物質は、PPSV23であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、作用物質は、抗生物質であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む免疫原性組成物またはワクチンの投与は、単回用量の送達を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、適切な間隔で、初回用量とそれに続く1回または複数回の追加の免疫化用量を含み得る。免疫化スケジュールは、対象の1つ以上の特定の年齢において、1つ以上の特定の投与経路によって、1つ以上の特定の肺炎球菌ワクチンの1つ以上の特定の用量を投与するためのプログラムである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物、免疫原性組成物またはワクチンの免疫原性を評価する方法は、ELISAによる抗体レベル、マルチプレックスELISA、MSD、Luminex、フローサイトメトリー、Th1/Th17細胞応答、サイトカインレベル測定及びOPKにより測定される機能的抗体レベルなどのB細胞応答及びT細胞応答、血清殺菌(serum bactericidal killing)(SBA)、凝集、運動性、細胞傷害性または接着性を含む1つ以上のin vitroバイオアッセイ;ならびに肺炎球菌感染症(例えば、肺炎、菌血症、髄膜炎、敗血症、中耳炎、鼻咽頭コロニー形成)の動物モデルにおけるin vivoアッセイを使用して、免疫応答を評価、測定及び/または比較することを含む。in vivoアッセイのパラメータには、免疫原性組成物の標的である肺炎球菌病原体による曝露後の、粘膜表面または血流からの細菌の除去、菌血症、髄膜炎、敗血症または中耳炎の低減または予防、鼻咽頭のコロニー形成の低減または予防、死亡率の低減、ならびに受動的保護及び能動的保護が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫応答を、対照組成物と比較する。
目的:
本実施例は、アジュバントであるコレラ毒素(CT)による経鼻免疫化後の、個々のStreptococcus pneumoniaeタンパク質SP0785及びSP1500と例示的な融合タンパク質CP1の、Th17応答を刺激しマウスをS.pneumoniaeによる鼻コロニー形成から保護する能力を比較する。例示的な融合タンパク質CP1は、トランケート型リザビジン(アミノ酸[45〜179]、Rhaviと表記)、SP0785ポリペプチド及びSP1500ポリペプチドを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質CP1は、Rhavi−リンカー(GGGGSSS)−SP1500−リンカー(AAA)−SP0785であるか、またはこれを含む。
概要:
1.S.pneumoniaeタンパク質SP0785及びSP1500、ならびに融合タンパク質CP1は、アジュバントであるコレラ毒素(CT)とともに鼻腔内免疫化した後のインターロイキン17A(IL−17A)の分泌から実証されるように、マウスにおいてそれぞれ強力なTh17応答を生じさせることができる。
2.S.pneumoniaeの鼻コロニー形成は、SP1500もしくはSP0785及びCTで、またはCP1及びCTで、別々にマウスを鼻腔内免疫化した後に大幅に低減した。
組換えタンパク質の生成
ヒスチジンタグ付き組換えタンパク質をEscherichia coli中で発現させ、Ni−ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。Superdex200カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより、2回目の精製を実施した。ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Bio−Rad)を使用して、タンパク質濃度を測定した。
コレラ毒素(CT)を鼻腔内免疫化用のアジュバントとして使用して、単独でタンパク質に対するT細胞応答の誘導を促進した。タンパク質または肺炎球菌全細胞ワクチン(表5に示されている量)を、投与前に1用量あたり20μlの最終容量で、生理食塩水溶液中の1μgのCTと混合した。
CTアジュバントしたタンパク質及びクロロホルムで不活化した肺炎球菌全細胞ワクチン(WCC)による鼻腔内免疫化のために、C57BL/6マウス(n=10の群)に1週間間隔で2回の免疫化を行った。末梢血試料を、刺激物質としての適切な抗原(複数可)の存在下におけるex vivoのIL−17A刺激のために、最終免疫化の3週間後に採取した。
注:すべての組換えタンパク質はHisタグ付きである。
最終鼻腔内免疫化の3週間後に採取した末梢血試料のex vivo刺激を、96ウェル丸底プレートで実施した。すべての刺激物質を、刺激培地(DMEM F−12;10%FBS、50μM 2−メルカプトエタノール、10μg/mlシプロフロキサシン)で最終濃度10μg/mlで希釈した。各ウェルにて、25μlのヘパリン添加血を、示した刺激物質を含有する刺激培地225μlに添加後、37℃、5%CO2で6日間インキュベートした。遠心分離後に上清を採取し、IL−17AをELISAキット(R&D systems)で分析した。
採血の1〜2週間後、107CFUの6B型肺炎球菌(603株)でマウスを鼻腔内曝露させた。安楽死させたマウスの鼻咽頭洗浄を、感染の7日後に実施した。鼻洗浄ごとのS.pneumoniaeのCFUを、血液寒天プレート上で増殖させた後に算出した。
統計学的分析を、PRISM(GraphPad Software)を使用して実施した。IL−17Aの濃度及び鼻咽頭コロニー形成の密度に関するすべてのデータを、マン・ホイットニーのU検定を使用して分析した。IL−17Aの幾何平均濃度を各群について算出し、コロニー形成の幾何平均密度を各群について算出した。
SP1500、SP0785またはCP1による鼻腔内免疫化後のIL−17A応答、及びコロニー形成の低減。
図2の左パネルに見られるように、CTでアジュバントしたSP0785またはSP1500のいずれかによる鼻腔内免疫化は、精製したSP0785またはSP1500で末梢血をex vivoで刺激した後のIL−17A産生の増加によって示されているように、CT単独での免疫化と比較して、強力な抗原特異的Th17応答を誘導した。IL−17A分泌の増加は、免疫化マウスの曝露の7日後に鼻咽頭洗浄から回収したS.pneumoniaeのCFUにおける、対応する統計学的に有意な低減と相関した(図2、右パネル)。
材料及び方法:
細菌の増殖
S.pneumoniae株6B、15A、16F及び35Bを、酵母抽出物を含むTodd Hewitt Broth(THB)の培養物10mLに接種した。培養物を、OD600が0.5〜0.8(対数増殖期中期)に達するまで、5%CO2中、37℃で4〜7時間インキュベートした。細菌を4℃、3,000gで7分間スピンさせることにより回収し、細菌ペレットを10%グリセロールを含む10mLのTHBに再懸濁させ、−80℃で保管した。コロニー形成単位(CFU)の推定値を、5%ヒツジ血液を含むTrypticase soy寒天培地(Becton,Dickenson,and Company)上で凍結ストックを段階希釈し、37℃、5%CO2中で18〜24時間インキュベートすることにより測定した。
S.pneumoniae凍結ストックを解凍し、アッセイ緩衝液(10%熱不活化FBSを含むハンクス緩衝生理食塩水)中に2×105CFU/mlで再懸濁させた。96ウェルプレートに対し、10μlの細菌懸濁液を各ウェルに添加し、次に、アッセイ緩衝液で希釈した20μlの熱不活化ウサギ血清をアッセイで試験した。細菌及びウサギ血清を、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。10μlのベビーウサギ補体(Pel−Freeze Biologicals)を各ウェルに添加し、次に、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。HL60細胞(ATCC)をアッセイ緩衝液で洗浄し、1×107細胞/mlまで再懸濁させた。HL60懸濁液40μlを各ウェルへ添加し(200:1のHL60対細菌比)、次に、振盪しながら37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。プレートを氷に移し、20分間インキュベートした。次に、各試料(未希釈、水で1/5希釈及び1/25希釈)を5%血液寒天プレートに播種した。37℃、5%CO2で一晩インキュベートした後、各試料及び希釈度についてCFUを計数した。
ニュージーランド白ウサギ(n=3)を、1用量あたり100ugのRhavi−リンカー(GGGGSSS)−SP1500−リンカー(AAA)−SP0785(CP1、Hisタグ付き)及びAlPO4に由来する0.625mgの元素アルミニウムで、各免疫化の間を2週間あけて、合計3回の用量で免疫化した(ウサギ87、88及び1762)。免疫化前(P0)及び3回目の免疫(P3)の2週間後に血清を採取し、−80℃で保管した。
CP1を対象とする抗体のS.pneumoniaeのオプソニン作用活性
S.pneumoniaeのタンパク質抗体媒介性殺傷を調査するために、改変濃縮オプソニン作用アッセイ(COPA)を確立した。CP1で免疫化した2匹のウサギからの血清(ウサギ87及び88からのP3)を、免疫前血清(P0)と比較してアッセイした。市販のPrevnar13ワクチンに組み込まれている型であるS.pneumoniae血清型6Bに対して、両方のウサギについて試験したすべての希釈度で、免疫前血清(P0)とのインキュベーションと比較して、P3免疫血清とのインキュベーションによりCFUの低減が生じ(図4)、または同じ結果の代替的な表示では、殺傷活性パーセントの増加が生じた(図7、パネルA)。免疫血清の殺傷活性は、HL60細胞及び活性補体の両方に依存した(データは示さず)。同じ血清を、市販のワクチンに組み込まれていない2種の血清型である、S.pneumoniae血清型15A(図5及び図7、パネルB:1/2希釈)及び血清型35B(図6及び図7、パネルC:1/2希釈)でアッセイした。CP1で免疫化した3番目のウサギの血清(ウサギ1762のP3)を、市販のワクチンに組み込まれていないさらなる血清型である、S.pneumoniae血清型16Fに対する免疫前血清(P0)と比較してアッセイした(図7、パネルD:1/2、1/6、1/18、1/54希釈)。試験したすべてのウサギ及び非ワクチン血清型について、免疫前血清(P0)とのインキュベーションと比較して、P3免疫血清とのインキュベーションによりCFUの低減が生じたか、あるいは、殺傷活性パーセントの増加を示した。免疫血清の殺傷活性は、HL60細胞及び活性補体の両方に依存した(データは示さず)。
材料及び方法:
組換えタンパク質の生成
ヒスチジンタグ付き組換えタンパク質をEscherichia coli中で発現させ、Ni−ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。Superdex200カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより、2回目の精製を実施した。ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Bio−Rad)を使用して、タンパク質濃度を測定した。
コレラ毒素(CT)を鼻腔内免疫化用のアジュバントとして使用して、単独でタンパク質に対するT細胞応答の誘導を促進した。タンパク質(表6に示されている量)を、投与前に1用量あたり20μlの最終容量まで、生理食塩水溶液中の1μgのCTと混合した。
CTアジュバントしたタンパク質による鼻腔内免疫化のために、C57BL/6マウス(n=15の群)に1週間間隔で2回の免疫化を行った。末梢血試料を、刺激物質としての適切な抗原(複数可)の存在下におけるex vivoのIL−17A刺激のために、最終免疫化の3週間後に採取した。
注:すべての組換えタンパク質はHisタグ付きである。
最終鼻腔内免疫化の3週間後に採取した末梢血試料のex vivo刺激を、96ウェル丸底プレートで実施した。すべての刺激物質(精製タンパク質または死滅(不活化)した肺炎球菌全細胞)を、刺激培地(DMEM F−12;10%FBS、50μM 2−メルカプトエタノール、10μg/mlシプロフロキサシン)で最終濃度10μg/mlで希釈した。各ウェルにて、25μlのヘパリン添加血を、示した刺激物質を含有する刺激培地225μlに添加後、37℃、5%CO2で6日間インキュベートした。遠心分離後に上清を採取し、IL−17AをELISAキット(R&D systems)で分析した。
統計学的分析を、PRISM(GraphPad Software)を使用して実施した。IL−17Aの濃度に関するすべてのデータを、マン・ホイットニーのU検定を使用して分析した。IL−17Aの幾何平均濃度を各群について算出した。
SP1500、SP0785及びRhaviタンパク質の混合物、またはCP1もしくはSP0785−リンカー(SSSGG)−SP1500−リンカー(SSVDKL)−PdTによる鼻腔内免疫化後のIL−17A応答。
図8に見られるように、CTでアジュバントしたCP1による鼻腔内免疫化は、CTでアジュバントしたSP0785もしくはSP1500、またはCT単独(対照)による免疫化と比較して、より強力な抗原特異的Th17応答を誘導した。このTh17応答は、精製したSP0785(パネルA)、精製したSP1500(パネルB)または死滅(不活化)した肺炎球菌全細胞(WCV、パネルC)で免疫化したマウスの末梢血をex vivoで刺激した後のIL−17A産生の増加によって示される。
材料及び方法:
組換えタンパク質の生成
ヒスチジンタグ付き組換え融合タンパク質であるCP1及びSP0785−リンカー(SSSGG)−SP1500−リンカー(SSVDKL)−PdTを、Escherichia coli中で発現させ、Ni−ニトリロ三酢酸アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。Superdex200カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより、2回目の精製を実施した。ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Bio−Rad)を使用して、タンパク質濃度を測定した。
Benton et al,1997によるアッセイを適用した。アッセイ緩衝液は、10mMジチオスレイトール、pH7.4のPBS中の0.1%ウシ血清アルブミン、及び2%ヒツジ赤血球を含有していた。ヒツジ赤血球を以下のように調製した:200μlのヒツジ血液+1mlのPBS(pH7.4)を添加し、十分に混合し、ペレット化して、8,000rpmで3回、それぞれ30秒間洗浄し、最後に血球を10mlの冷却PBSに再懸濁させ、使用時まで氷上で保持する。ニューモリシン標準物質(Ply)、ニューモリソイドPdT及び試験する融合タンパク質(CP1及びSP0785−リンカー(SSSGG)−SP1500−リンカー(SSVDKL)−PdT)を、プレート全体にわたり100μl/ウェルで示した濃度で希釈して、次いで、すべてのウェルに50μlの2%ヒツジ赤血球を添加することによりアッセイを実施した。プレートを、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを室温、2000rpmで5分間遠心分離し、上清100μlを空の96ウェルプレートに移して、OD420での吸光度を測定した[Benton,K.A.,J.C.Paton,and D.E.Briles.1997.Differences in virulence for mice among Streptococcus pneumoniae strains of capsular types 2,3,4,5,and 6 are not attributable to differences in pneumolysin production.Infect Immun.65:1237−44]。
図11に見られるように、融合タンパク質CP1とのヒツジ赤血球のインキュベーションは、試験した濃度のいずれにおいても溶血を生じさせなかった。融合タンパク質SP0785−リンカー(SSSGG)−SP1500−リンカー(SSVDKL)−PdTまたはニューモリソイドPdT単独との、それぞれ1mg/ml及び0.5mg/mlを超える濃度でのインキュベーションにより、ヒツジ赤血球のほぼ完全な溶血が生じた。これらの結果は、2つの融合タンパク質のSP0785部分及びSP1500部分が、溶血活性に寄与しないことを示す。融合タンパク質SP0785−リンカー(SSSGG)−SP1500−リンカー(SSVDKL)−PdTの溶血活性は、その代わりに、ニューモリソイドPdTに起因する。
配列番号1、完全長リザビジンタンパク質[アミノ酸1〜179]:
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注:SP0785 NCBI配列ABJ54007.1及びYP816180と1箇所のT394Aミスマッチ
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GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP
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WO2012/155007
WO2012/155053
US2009/0285846
当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
Claims (16)
- (i)ビオチン結合部分、
(ii)SP1500ポリペプチドまたは断片、及び
(iii)SP0785ポリペプチドまたは断片
を含む、融合タンパク質。 - (i)配列番号2と少なくとも80%、85%、90%同一であるアミノ酸配列を含むビオチン結合部分またはそのビオチン結合部、
(ii)配列番号7と少なくとも80%、85%、90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原部、及び
(iii)配列番号4と少なくとも80%、85%、90%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその抗原部
を含む、融合タンパク質。 - (i)配列番号2と少なくとも80%、85%、90%同一であるアミノ酸配列を含むビオチン結合部分またはそのビオチン結合部、
(ii)配列番号7と少なくとも80%、85%、90%同一であるアミノ酸配列を含む第1のポリペプチドまたはその抗原部、
(iii)配列番号4と少なくとも80%、85%、90%同一であるアミノ酸配列を含む第2のポリペプチドまたはその抗原部、ならびに
(iv)前記ビオチン結合部分と前記第1のポリペプチドとの間に配置された第1のリンカー及び/または前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドとの間に配置された第2のリンカー
を含む、融合タンパク質。 - 前記第1のリンカーが、アミノ酸配列GGGGSSSを含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 前記第2のリンカーが、アミノ酸配列AAAを含む、請求項3または4に記載の融合タンパク質。
- 前記ビオチン結合部分が、前記第1のポリペプチドにC末端で連結している、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記ビオチン結合部分が、前記第1のポリペプチドにN末端で連結している、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチドが、前記第2のポリペプチドにC末端で連結している、請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記第1のポリペプチドが、前記第2のポリペプチドにN末端で連結している、請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記第2のポリペプチドが、前記ビオチン結合部分にC末端で連結している、請求項1〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記第2のポリペプチドが、前記ビオチン結合部分にN末端で連結している、請求項1〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号23と少なくとも80%、85%、90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、CP1である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
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