JP2022191527A - Stable mRNA-encapsulating micelles in blood - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血中で安定なmRNA内包ミセルを提供する。 The present invention provides mRNA-encapsulating micelles that are stable in blood.
治療用核酸の送達は、現在難治である様々な疾患の治療を実現する可能性を有しているため注目を集めている。核酸による治療は、DNAやmRNAといった核酸を疾患に運ぶことで治療用タンパクを得ることで達成される。特に近年mRNAは、非分裂細胞に対しても遺伝子発現が可能、またDNAのようにゲノムインテグレーションを誘起しないことから有用な治療用核酸として注目度が高い。しかしながら、mRNAの生体内安定性は極めて低く、例えば血中では数秒でほとんどが分解を受ける。このことは、mRNAは疾患部位に到達する前に分解されて消えてなくなってしまうことを意味する。したがって、疾患部位までmRNAの活性を保ちつつ運ぶことがmRNAによる疾患治療実現に対するボトルネックであると言えよう。 The delivery of therapeutic nucleic acids has attracted attention due to its potential to enable treatment of a variety of currently intractable diseases. Nucleic acid therapy is achieved by delivering nucleic acids, such as DNA or mRNA, to the disease to obtain therapeutic proteins. In recent years, in particular, mRNA has attracted much attention as a useful therapeutic nucleic acid because it can express genes even in non-dividing cells and does not induce genome integration unlike DNA. However, the in vivo stability of mRNA is extremely low, and most of it undergoes degradation within seconds in blood, for example. This means that the mRNA is degraded and disappears before it reaches the disease site. Therefore, it can be said that the delivery of mRNA to the site of disease while maintaining its activity is a bottleneck in the realization of disease treatment using mRNA.
ところで、プラスミドDNAの血中安定性を高める技術として、親水性ブロック－温度応答性ブロック－ポリカチオン性ブロックからなる三元共重合体が開発されている（非特許文献１）。この三元共重合体は、プラスミドDNAと低温で混合するとミセルを形成する。このミセルでは、プラスミドDNAは前記三元共重合体のポリカチオン性ブロックと複合体を形成する。その後、温度を上昇させると、温度応答性ブロックが親水性から疎水性に変化し、これによりプラスミドDNAを覆う疎水性の中間層を形成させ、これをDNAの保護層として用いる技術である。しかし、mRNAの血中安定性が大きく改善されたミセル製剤技術はいまだ知られていない。 By the way, a terpolymer consisting of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a polycationic block has been developed as a technique for increasing the stability of plasmid DNA in blood (Non-Patent Document 1). This terpolymer forms micelles when mixed with plasmid DNA at low temperatures. In this micelle, plasmid DNA forms a complex with the polycationic blocks of the terpolymer. Then, when the temperature is raised, the temperature-responsive block changes from hydrophilic to hydrophobic, forming a hydrophobic intermediate layer covering plasmid DNA, which is used as a protective layer for DNA. However, a micelle preparation technique that greatly improves the blood stability of mRNA has not yet been known.
本発明は、血中で安定なmRNA内包ミセルを提供する。 The present invention provides mRNA-encapsulating micelles that are stable in blood.
ところで、mRNAの血中での分解速度は極めて高速であり、静脈内投与用製剤を実現するためにはmRNAの安定性を血中で少なくとも１０万倍～１００万倍以上高めることが必要であり、数十倍程度の安定化効果ではmRNAの静脈内投与製剤は成立し得ない。 By the way, the degradation rate of mRNA in blood is extremely high, and it is necessary to increase the stability of mRNA in blood by at least 100,000 to 1,000,000 times in order to realize preparations for intravenous administration. Intravenous formulations of mRNA cannot be established with a stabilizing effect of several tens of times.
本発明者らは、親水性ブロック－温度応答性ブロック－ポリカチオン性ブロックからなる三元共重合体を用いて形成したmRNA内包ミセルに内包されたmRNAは、裸のmRNAに対して１００万倍を超える安定化効果を奏することを見出した。また、本発明者らは、上記ミセルにさらに温度応答性ブロックからなる重合体を添加することにより、その安定化効果がいっそう高まることを見出した。しかも、ミセル形成に使用するポリマーのモル量は従来よりも低減することが可能であった。本発明は、これらの知見に基づく発明である。 The present inventors have found that mRNA encapsulated in mRNA-encapsulating micelles formed using a terpolymer consisting of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a polycationic block is 1,000,000 times larger than naked mRNA. It was found that a stabilizing effect exceeding Moreover, the present inventors have found that the addition of a polymer comprising a temperature-responsive block to the micelle further enhances the stabilizing effect. Moreover, it was possible to reduce the molar amount of the polymer used for micelle formation. The present invention is based on these findings.
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
（ａ）前記三元共重合体とRNAとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより得られる、
ミセル。
（２）前記ＲＮＡは、疎水性に変化した温度応答性ブロックで形成される外殻によって覆われている、上記（１）に記載のミセル。
（３）前記（ａ）において、前記三元共重合体とRNAとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で球形状のミセルを形成するように混合させる、上記（２）に記載のミセル。
（４）前記（ｂ）において、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることによりミセルの中間層として疎水性部が形成され、ＲＮＡが疎水性部の内部に封入された、上記（２）または（３）に記載のミセル。
（５）温度応答性重合体をさらに含む、上記（１）～（４）のいずれかに記載のミセル。
（６）温度応答性重合体が１ｍｇ／ｍＬ以下である、上記（５）に記載のミセル。
（７）上記（５）または（６）に記載のミセルであって、
前記三元共重合体とＲＮＡとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、ミセルを形成させ、その後、温度応答性重合体を添加し、さらに、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより形成される、ミセル。
（８）他のブロック共重合体を構成成分として含まない、上記（１）～（７）のいずれかに記載のミセル。
（９）三元共重合体とＲＮＡの電荷比が、４以下である、上記（１）～（８）のいずれかに記載のミセル。
（１０）三元共重合体とＲＮＡの電荷比が、１．５～２．５である、上記（１）～（９）のいずれかに記載のミセル。
（１１）ＲＮＡがｍＲＮＡである、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のミセル。
（１２）静脈内投与用の、上記（１）～（１１）のいずれかに記載のミセルを含む、医薬組成物。
（１３）ｍＲＮＡの血中残存量が、ｍＲＮＡの投与２．５分後に１０％以上である、上記（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）ｍＲＮＡの血中残存量が、ｍＲＮＡの投与２．５分後に２０％以上である、上記（１３）に記載の医薬組成物。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a micelle comprising RNA and
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
(a) mixing the terpolymer and RNA in an aqueous solution at a temperature below the lower critical solution temperature, and (b) thereafter raising the temperature of the aqueous solution to the lower critical solution temperature or higher. can get,
micelles.
(2) The micelle according to (1) above, wherein the RNA is covered with an outer shell formed of temperature-responsive blocks that have been modified to be hydrophobic.
(3) The above (2), wherein in (a), the terpolymer and RNA are mixed in an aqueous solution at a temperature lower than the lower critical solution temperature so as to form spherical micelles. micelles.
(4) In (b) above, a hydrophobic portion is formed as an intermediate layer of the micelle by raising the temperature of the aqueous solution to the lower critical solution temperature or higher, and the RNA is enclosed inside the hydrophobic portion. The micelle according to (2) or (3).
(5) The micelle according to any one of (1) to (4) above, further comprising a temperature-responsive polymer.
(6) The micelle according to (5) above, wherein the temperature-responsive polymer is 1 mg/mL or less.
(7) The micelle according to (5) or (6) above,
The terpolymer and RNA are mixed in an aqueous solution at a temperature below the lower critical solution temperature to form micelles, then the temperature-responsive polymer is added, and the temperature of the aqueous solution is reduced to the lower limit. Micelles formed by raising above the critical solution temperature.
(8) The micelle according to any one of (1) to (7) above, which does not contain any other block copolymer as a constituent component.
(9) The micelle according to any one of (1) to (8) above, wherein the charge ratio between the terpolymer and RNA is 4 or less.
(10) The micelle according to any one of (1) to (9) above, wherein the charge ratio between the terpolymer and RNA is 1.5 to 2.5.
(11) The micelle according to any one of (1) to (10) above, wherein the RNA is mRNA.
(12) A pharmaceutical composition for intravenous administration, comprising the micelle according to any one of (1) to (11) above.
(13) The pharmaceutical composition according to (12) above, wherein the residual amount of mRNA in the blood is 10% or more 2.5 minutes after administration of the mRNA.
(14) The pharmaceutical composition according to (13) above, wherein the residual amount of mRNA in the blood is 20% or more 2.5 minutes after administration of the mRNA.
本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。対象は、哺乳動物、例えば、ヒトであり、特に、本発明のミセルの投与が有益である哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。 As used herein, a "subject" is a mammal, including humans. A subject may be a healthy subject or a subject suffering from any disease. The subject may be a mammal, eg, a human, and particularly a mammal, eg, a human, who would benefit from administration of the micelles of the invention.
本明細書では、「薬剤送達用の」とは、生体適合性であること、および、薬剤を小胞に内包できることを意味する。本明細書では、「薬剤送達用の」とは、薬剤の血中残存時間を、裸の薬剤の血中残存時間と比べて長期化する用途、または、所定の組織への薬剤の送達量を向上させる用途を意味することがある。 As used herein, "for drug delivery" means biocompatible and capable of encapsulating the drug into the vesicles. As used herein, the term “for drug delivery” refers to an application that prolongs the blood residence time of a drug compared to the blood residence time of a bare drug, or to increase the delivery amount of a drug to a given tissue. It can mean the use to improve.
本明細書では、「小胞」とは、物質を内包できる微粒子や中空微粒子を指す用語を意図して用いられる。小胞は、好ましくは生体適合性の外殻または修飾を有する。 As used herein, the term "vesicle" is intended to refer to microparticles or hollow microparticles capable of encapsulating a substance. Vesicles preferably have a biocompatible shell or modification.
本明細書では、「ミセル」とは、高分子などの分子が集合して形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、生物学的利用能の改善の観点では、その外表面を非電荷親水性鎖で修飾することが好ましい。 As used herein, "micelle" means a vesicle formed by assembly of molecules such as macromolecules. Examples of micelles include micelles formed by amphipathic molecules such as surfactants, and micelles formed by polyion complexes (PIC micelles). From the viewpoint of improving bioavailability, micelles are preferably modified on their outer surface with uncharged hydrophilic chains.
本明細書では、「平均分子量」は、特に断りの無い限り、数平均分子量を意味する。 As used herein, "average molecular weight" means number average molecular weight unless otherwise specified.
本明細書では、「重合度」は、ポリマーにおける単量体単位の数を意味し、「平均重合度」は、特に断りのない限り数平均重合度を意味する。 As used herein, "degree of polymerization" means the number of monomeric units in a polymer, and "average degree of polymerization" means number average degree of polymerization, unless otherwise specified.
本明細書では、「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味する。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および二本鎖ＲＮＡ、並びにＲＮＡの誘導体が挙げられる。本明細書では、「裸」という用語はＲＮＡに対して述べられた場合には、遊離状態で存在する単独のＲＮＡを意味し、ミセルに内包されたＲＮＡとは異なることを強調するために用いられる用語である。 As used herein, "RNA" means ribonucleic acid. RNA includes messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA), non-coding RNA (ncRNA), siRNA, shRNA, and double-stranded RNA, as well as derivatives of RNA. As used herein, the term "naked" when referred to RNA means a single RNA that exists in a free state and is used to emphasize that it is distinct from RNA encapsulated in micelles. term used.
本明細書では、「カチオン性ブロック」とは、カチオン性の単量体を含む単量体単位を重合させて得られ、全体としてカチオン性であるポリマーを意味する。カチオン性ポリマーには、ホモカチオン性ポリマー、ホモカチオン性ポリマーと非電荷親水性鎖とが連結したポリマー等が挙げられる。カチオン性ポリマーが他のポリマーとブロック共重合体を形成しているとき、カチオン性ポリマー部分は、カチオン性ブロックと呼ばれることがある。本明細書では、カチオン性ポリマーは、薬学的に許容されるカチオン性ポリマーである。 As used herein, the term "cationic block" means a polymer obtained by polymerizing monomer units containing a cationic monomer and being cationic as a whole. Cationic polymers include homocationic polymers, polymers in which homocationic polymers and uncharged hydrophilic chains are linked, and the like. When the cationic polymer forms a block copolymer with another polymer, the cationic polymer portion is sometimes called a cationic block. As used herein, a cationic polymer is a pharmaceutically acceptable cationic polymer.
本明細書では、「親水性ブロック」とは、水性媒体に対して溶解性を示すポリマー鎖を意味する。本発明では、非電荷親水性鎖は、薬学的に許容される非電荷親水性鎖である。このような親水性鎖としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）が挙げられる。非電荷親水性鎖は、局所的にも全体的にも電荷が中和されている限り、極性原子を有していてもよい。 As used herein, "hydrophilic block" means a polymer chain that exhibits solubility in aqueous media. In the present invention the uncharged hydrophilic chain is a pharmaceutically acceptable uncharged hydrophilic chain. Such hydrophilic chains include polyethylene glycol (PEG) and poly(2-ethyl-2-oxazoline). The uncharged hydrophilic chains may have polar atoms as long as they are locally and globally charge neutralized.
本明細書では、「温度応答性ブロック」および「温度応答性重合体」とはそれぞれ、温度に依存して親水性から疎水性に変化することができるポリマーブロックおよびポリマーを意味する。温度に依存して親水性から疎水性に変化する物質は様々知られており、例えば、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）やポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）が挙げられる。このような温度応答性のポリマーは、下限臨界共溶温度（LCST）を有し、LCST未満では親水性であり、LCST以上では疎水性である。温度応答性重合体は、温度応答性ブロックを含んでなる。ある態様では、温度応答性重合体は、温度応答性ブロックと親水性ブロックとを含む。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。温度応答性重合体は、温度応答性ブロックから本質的になる重合体であっても、温度応答性ブロックからなる重合体であってもよい。 As used herein, "temperature responsive block" and "temperature responsive polymer" mean polymer blocks and polymers, respectively, that can change from hydrophilic to hydrophobic depending on temperature. Various substances that change from hydrophilic to hydrophobic depending on temperature are known, for example, poly(N-isopropylacrylamide), poly(2-n-propyl-2-oxazoline), poly(2-isopropyl- 2-oxazolines). Such temperature-responsive polymers have a lower critical solution temperature (LCST), being hydrophilic below the LCST and hydrophobic above the LCST. A temperature-responsive polymer comprises a temperature-responsive block. In one aspect, the temperature-responsive polymer comprises a temperature-responsive block and a hydrophilic block. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block. The temperature-responsive polymer may be a polymer essentially consisting of temperature-responsive blocks or a polymer consisting of temperature-responsive blocks.
本明細書では、「三元共重合体」または「トリブロック共重合体」とは、異なるポリマーブロックを３つ含むブロック共重合体を意味する。各ブロックは、リンカーやスペーサーを介して連結していてよい。三元共重合体は、３つの異なるブロック、Ａ、ＢおよびＣをこの順番で含む場合には、「Ａ－Ｂ－Ｃ」と表記することができる。記号「－」は、結合、またはリンカー若しくはスペーサーであり得る。三元共重合体は、３つの異なるポリマーブロックを含んでいる限り、他の異なるポリマーブロックを含んでいてもよい。三元共重合体は、３つの異なるポリマーブロック「Ａ－Ｂ－Ｃ」から実質的になる、または「Ａ－Ｂ－Ｃ」からなるものであってもよい。 As used herein, "terpolymer" or "triblock copolymer" means a block copolymer containing three different polymer blocks. Each block may be linked via a linker or spacer. A terpolymer can be written as "ABC" if it contains three different blocks, A, B and C, in that order. The symbol "-" can be a bond, or a linker or spacer. A terpolymer may contain other different polymer blocks as long as it contains three different polymer blocks. A terpolymer may consist essentially of three different polymer blocks "ABC" or consist of "ABC".
本明細書では、「外殻」とは、ＲＮＡを包む保護層を意味する。外殻は、必ずしも最外殻に存在することを意味するものではない。本明細書では、「保護層」は、それが無い場合と比較して、ＲＮａｓｅによる分解からＲＮＡを保護することができる。 As used herein, "shell" refers to a protective layer that encloses RNA. The outer shell does not necessarily mean that it exists in the outermost shell. As used herein, a "protective layer" can protect RNA from degradation by RNases as compared to its absence.
本明細書では、「を含んでなる」（comprise）とは、「からなる」（consist of）および「から本質的になる」（essentially consistof）を含む意味で用いられる。「を含んでなる」とは、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味し、「からなる」とは、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。本明細書では、「から本質的になる」とは、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様では含まないことを意味する。 As used herein, "comprise" includes "consist of" and "essentially consist of." "Comprising" means that it may contain elements other than the subject elements, and "consisting of" means not including elements other than the subject elements. means. As used herein, "consisting essentially of" means not including components other than the target component in a manner that performs a particular function.
本発明者らは、親水性ブロックと温度応答性ブロックとカチオン性ブロックを含む三元共重合体により形成されるミセルが、mRNAの血中安定性を劇的に向上させることを見出した。したがって、本発明によれば、RNAと、親水性ブロックと温度応答性ブロックとカチオン性ブロックを含む三元共重合体とを含むミセルが提供される。
このようなミセルは、以下の手順で調製することができる。すなわち、親水性ブロックと温度応答性ブロックとカチオン性ブロックを含む三元共重合体と、RNAとをミセルを形成できるようにLCST未満の温度の水溶液中で混合する。ミセルが得られたら、水溶液の温度をLCST以上に上昇させ、温度応答性ブロックを親水性から疎水性に変化させる。
The present inventors have found that micelles formed by a terpolymer containing a hydrophilic block, a temperature-responsive block and a cationic block dramatically improve blood stability of mRNA. Accordingly, the present invention provides micelles comprising RNA and a terpolymer comprising a hydrophilic block, a temperature responsive block and a cationic block.
Such micelles can be prepared by the following procedure. That is, a terpolymer containing a hydrophilic block, a temperature-responsive block and a cationic block and RNA are mixed in an aqueous solution at a temperature below the LCST so as to form micelles. Once micelles are obtained, the temperature of the aqueous solution is raised above the LCST to change the temperature-responsive block from hydrophilic to hydrophobic.
血液の温度がヒトの場合、３６℃～３７℃程度であることを考慮すると、三元共重合体のLCSTは、３５℃以下であることが好ましい。このようにすることで投与後に血中でミセルの状態が維持される。また、mRNAの調製を０～４℃程度で行うことを考慮すると、LCSTは、５℃以上であることが好ましい。なお、LCSTは、その他の様々な状況を考慮して適切なLCSTを設定することが好ましい。例えば、LCSTは、５℃～３５℃とすることができ、１０℃～３２℃とすることができ、または２５℃～３２℃とすることができる。一般に水溶性ポリマーは、LCSTを有する。本発明では、上記の温度範囲内にLCSTを有するポリマーであれば適宜温度応答性ブロックとして用いることができる。 Considering that the temperature of human blood is about 36°C to 37°C, the LCST of the terpolymer is preferably 35°C or less. By doing so, the micellar state is maintained in the blood after administration. Considering that mRNA is prepared at about 0 to 4°C, the LCST is preferably 5°C or higher. Note that it is preferable to set an appropriate LCST in consideration of other various situations. For example, the LCST can be from 5°C to 35°C, from 10°C to 32°C, or from 25°C to 32°C. Water-soluble polymers generally have a LCST. In the present invention, any polymer having an LCST within the above temperature range can be appropriately used as the temperature-responsive block.
したがって、本発明によれば、
親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性である、
ミセル
が提供される。このミセルは、以下の工程によって調製され得る：
（ａ）前記三元共重合体とRNAとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合する。
Therefore, according to the invention:
a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a micelle comprising RNA and
The temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature.
Micelles are provided. This micelle can be prepared by the following steps:
(a) mixing the terpolymer and RNA in an aqueous solution at a temperature below the lower critical solution temperature;
また、本発明によれば、
親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
（ａ）前記三元共重合体とRNAとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより得られる、
ミセル
が提供される。このようにして得られたミセルは、LCST以上の温度条件下では温度応答性ブロックが疎水性であるため、水溶液中では疎水性の層を形成し、この層の内部にRNAが封入され、RNAを分解から保護する役割を果たすと考えられる。
Moreover, according to the present invention,
a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a micelle comprising RNA and
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
(a) mixing the terpolymer and RNA in an aqueous solution at a temperature below the lower critical solution temperature, and (b) thereafter raising the temperature of the aqueous solution to the lower critical solution temperature or higher. can get,
Micelles are provided. In the micelles thus obtained, since the temperature-responsive block is hydrophobic under temperature conditions equal to or higher than the LCST, it forms a hydrophobic layer in an aqueous solution, and RNA is encapsulated inside this layer. is thought to play a role in protecting from decomposition.
工程（ａ）において、前記三元共重合体とＲＮＡとは、前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で球形状のミセルを形成するように混合することができる。このためには、例えば、三元共重合体とＲＮＡとの電荷比を指標として混合することができる。例えば、ある態様では、三元共重合体とＲＮＡの電荷比（三元共重合体の電荷/ＲＮＡの電荷）が、４以下である。ある態様では、三元共重合体とＲＮＡの電荷比が、１．５～２．５である。また、球形状のミセルを形成させるためには、前記三元共重合体とＲＮＡそれぞれの水溶液中の濃度を臨界ミセル濃度以上とすることができる。 In step (a), the terpolymer and RNA can be mixed to form spherical micelles in an aqueous solution at a temperature below the lower critical solution temperature. For this purpose, for example, the terpolymer and RNA can be mixed using the charge ratio as an indicator. For example, in some embodiments, the charge ratio of the terpolymer to RNA (charge of terpolymer/charge of RNA) is 4 or less. In one aspect, the charge ratio of the terpolymer to RNA is between 1.5 and 2.5. In addition, in order to form spherical micelles, the concentrations of the terpolymer and RNA in the aqueous solution can be made equal to or higher than the critical micelle concentration.
工程（ｂ）において、ミセルの中間層として疎水性部が形成されるようにすることができる。このためには、例えば、三元共重合体として、親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとをこの順番で含む三元共重合体を用いることができる。 In step (b), the hydrophobic part can be formed as an intermediate layer of the micelle. For this purpose, for example, a terpolymer containing a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block in this order can be used as the terpolymer.
このようにして得られるミセルは、おそらくミセルの中間層としてミセルの内部を包むように疎水性部が形成されており、疎水性部は、内部に内包されたmRNAを保護する働きをしていると考えられる。 The micelle obtained in this way probably has a hydrophobic part formed as an intermediate layer of the micelle so as to wrap the inside of the micelle, and the hydrophobic part functions to protect the mRNA encapsulated inside. Conceivable.
したがって、本発明によれば、
親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
RNAは、疎水性に変化した温度応答性ブロックで形成される外殻によって覆われている、ミセル
が提供される。このミセルは、例えば、上記工程（ａ）および（ｂ）により調製することができる。また、調製後は使用時までミセルを下限臨界共溶温度以上で維持することができる。
Therefore, according to the invention:
a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a micelle comprising RNA and
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
The RNA is provided in micelles covered by a shell formed of hydrophobically altered temperature responsive blocks. This micelle can be prepared, for example, by steps (a) and (b) above. In addition, after preparation, the micelle can be maintained at the lower critical solution temperature or higher until use.
本発明のある態様では、三元共重合体の親水性ブロックは、ポリエチレングリコールまたはポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）であり得る。親水性ブロックの平均分子量は、例えば、１０ｋＤ以上、１５ｋＤ以上、２０ｋＤ以上、３０ｋＤ以上、または４０ｋＤ以上とすることができる。親水性ブロックはまた、例えば、２０ｋＤ以下、３０ｋＤ以下、４０ｋＤ以下、または５０ｋＤ以下の平均分子量とすることができる。 In some aspects of the invention, the hydrophilic block of the terpolymer can be polyethylene glycol or poly(2-ethyl-2-oxazoline). The average molecular weight of the hydrophilic block can be, for example, 10 kD or greater, 15 kD or greater, 20 kD or greater, 30 kD or greater, or 40 kD or greater. The hydrophilic block can also have an average molecular weight of, for example, 20 kD or less, 30 kD or less, 40 kD or less, or 50 kD or less.
本発明のある態様では、三元共重合体の温度応答性ブロックは、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）やポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）、またはポリ（２－イソプロピル－２オキサゾリン）であり得る。温度応答性ブロックの平均分子量は、例えば、３ｋＤ以上、５ｋＤ以上、７ｋＤ以上、または１０ｋＤ以上であり得る。温度応答性ブロックの平均分子量はまた、例えば、１０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または２０ｋＤ以下であり得る。 In one aspect of the invention, the temperature-responsive block of the terpolymer is poly(N-isopropylacrylamide) or poly(2-n-propyl-2-oxazoline) or poly(2-isopropyl-2oxazoline) can be The average molecular weight of the temperature responsive block can be, for example, 3 kD or greater, 5 kD or greater, 7 kD or greater, or 10 kD or greater. The average molecular weight of the temperature responsive block can also be, for example, 10 kD or less, 15 kD or less, or 20 kD or less.
本発明のある態様では、三元共重合体のポリカチオン性ブロックは、天然または非天然のカチオン性アミノ酸を単量体単位として含むペプチドであり得る。三元共重合体のポリカチオン性ブロックは、例えば、リジンおよびオルニチンなどの天然のカチオン性アミノ酸を単量体単位として含むペプチド、例えば、ポリリジンまたはポリオルニチンであり得る。本発明のある態様では、三元共重合体のポリカチオン性ブロックは、例えば、ジエチレントリアミンまたはトリエチレンテトラアミンでカルボキシル基を修飾したアスパラギン酸やグルタミン酸を単量体単位として含むペプチド、例えば、ホモポリマーであり得る。ポリカチオン性ブロックの平均重合度は、例えば、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、または７０以上であり得る。ポリカチオン性ブロックの平均重合度はまた、７０以下、８０以下、９０以下、または１００以下であり得る。 In some aspects of the invention, the polycationic block of the terpolymer can be a peptide comprising natural or non-natural cationic amino acids as monomeric units. The polycationic block of the terpolymer can be, for example, a peptide containing natural cationic amino acids such as lysine and ornithine as monomeric units, eg polylysine or polyornithine. In one embodiment of the present invention, the polycationic block of the terpolymer is a peptide, e.g. can be The average degree of polymerization of the polycationic blocks can be, for example, 30 or greater, 40 or greater, 50 or greater, 60 or greater, or 70 or greater. The average degree of polymerization of the polycationic blocks can also be 70 or less, 80 or less, 90 or less, or 100 or less.
本発明のある態様では、三元共重合体は、親水性ブロックがポリエチレングリコールまたはポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）であり、温度応答性ブロックは、ポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）であり、ポリカチオン性ブロックは、ポリリジンまたはポリオルニチンである。本発明のある態様では、三元共重合体は、親水性ブロックがポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）であり、温度応答性ブロックは、ポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）であり、ポリカチオン性ブロックは、ポリリジンである。 In one aspect of the invention, the terpolymer is such that the hydrophilic block is polyethylene glycol or poly(2-ethyl-2-oxazoline) and the temperature responsive block is poly(2-n-propyl-2- oxazoline) and the polycationic block is polylysine or polyornithine. In one aspect of the invention, the terpolymer has poly(2-ethyl-2-oxazoline) as the hydrophilic block and poly(2-n-propyl-2-oxazoline) as the temperature-responsive block. and the polycationic block is polylysine.
本発明によれば、親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、ＲＮＡとの組合せが提供される。本発明によれば、親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、ＲＮＡとの組合せの使用であって、下記ミセルの製造における使用が提供される：
［１］親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
RNAは、疎水性に変化した温度応答性ブロックで形成される外殻によって覆われている、ミセル；または
［２］親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
ＲＮＡとを含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満以下で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
（ａ）前記三元共重合体とRNAとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより得られる、
ミセル。
According to the present invention, a combination of a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature responsive block and a cationic block and RNA is provided. According to the present invention there is provided the use of a combination of a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature responsive block and a cationic block and RNA in the preparation of micelles:
[1] a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a micelle comprising RNA and
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
RNA is covered by an outer shell formed of hydrophobically altered temperature-responsive blocks, micelles; or [2] a ternary copolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block coalescence and
a micelle comprising RNA and
The temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature,
(a) mixing the terpolymer and RNA in an aqueous solution at a temperature below the lower critical solution temperature, and (b) thereafter raising the temperature of the aqueous solution to the lower critical solution temperature or higher. can get,
micelles.
本発明によれば、温度応答性重合体は、親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、ＲＮＡとを含む、上記ミセルにおけるＲＮＡの安定性をさらに向上させた。
したがって、本発明によれば、親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、ＲＮＡとを含むミセルは、温度応答性重合体（例えば、温度応答性重合体）をさらに含んでいてもよい。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは同一分子でも異なる分子であり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。温度応答性重合体は、温度応答性ブロックからなる重合体とすることもできる。
ここで、血液の温度がヒトの場合、３６℃～３７℃程度であることを考慮すると、温度応答性重合体のLCSTは、３５℃以下であることが好ましい。このようにすることで投与後に血中でミセルの状態が維持される。また、mRNAの調製を０～４℃程度で行うことを考慮すると、温度応答性重合体のLCSTは、５℃以上であることが好ましい。このようにすることで調製中に三元共重合体を親水性に保つことが容易となる。なお、温度応答性重合体のLCSTは、その他の様々な状況を考慮して適切なLCSTを設定することが好ましい。例えば、LCSTは、５℃～３５℃とすることができ、１０℃～３２℃とすることができ、または２５℃～３２℃とすることができる。一般に水溶性ポリマーは、LCSTを有する。本発明では、上記の温度範囲内にLCSTを有する高分子ポリマーであれば適宜温度応答性ブロックとして用いることができる。
According to the present invention, the temperature-responsive polymer further enhances the stability of RNA in said micelles, comprising a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block, and RNA. improved.
Therefore, according to the present invention, a micelle containing a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block, and RNA is a temperature-responsive polymer (e.g., a temperature-responsive polymer). coalescing). In this aspect, the temperature-responsive polymer can be the same molecule or a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block. The temperature-responsive polymer can also be a polymer composed of temperature-responsive blocks.
Considering that the temperature of human blood is about 36° C. to 37° C., the LCST of the temperature-responsive polymer is preferably 35° C. or less. By doing so, the micellar state is maintained in the blood after administration. Moreover, considering that mRNA is prepared at about 0 to 4°C, the LCST of the temperature-responsive polymer is preferably 5°C or higher. This makes it easier to keep the terpolymer hydrophilic during preparation. Incidentally, it is preferable to set an appropriate LCST of the temperature-responsive polymer in consideration of other various situations. For example, the LCST can be from 5°C to 35°C, from 10°C to 32°C, or from 25°C to 32°C. Water-soluble polymers generally have a LCST. In the present invention, any polymer having an LCST within the above temperature range can be appropriately used as the temperature-responsive block.
より具体的には、本発明によれば、
親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
温度応答性重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
（ｉ）（ａ）前記三元共重合体とRNAと温度応答性重合体とを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより得られる、
ミセル
が提供される。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは同一の分子でも異なる分子であり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。温度応答性重合体は、温度応答性ブロックからなる重合体とすることもできる。
More specifically, according to the invention,
a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a temperature-responsive polymer;
a micelle comprising RNA and
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
(i) (a) mixing the terpolymer, the RNA, and the temperature-responsive polymer in an aqueous solution having a temperature lower than the lower critical solution temperature; Obtained by raising above the solution temperature,
Micelles are provided. In this embodiment, the temperature-responsive polymer can be the same molecule or a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block. The temperature-responsive polymer can also be a polymer composed of temperature-responsive blocks.
本発明によればまた、
親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
温度応答性重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
RNAは、疎水性に変化した三元共重合体の温度応答性ブロックと温度応答性重合体とで形成される外殻によって覆われている、ミセルが提供される。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは同一の分子でも異なる分子であり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。温度応答性重合体は、温度応答性ブロックからなる重合体とすることもできる。
According to the invention also
a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a temperature-responsive polymer;
a micelle comprising RNA and
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
A micelle is provided in which the RNA is covered by an outer shell formed of a hydrophobically modified terpolymer temperature-responsive block and a temperature-responsive polymer. In this embodiment, the temperature-responsive polymer can be the same molecule or a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block. The temperature-responsive polymer can also be a polymer composed of temperature-responsive blocks.
本発明によれば、さらに、親水性ブロックと温度応答性ブロックとカチオン性ブロックとの三元共重合体と、温度応答性重合体と、ＲＮＡとの組合せが提供される。本発明によれば、さらにまた、親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、温度応答性重合体と、ＲＮＡとの組合せの使用であって、下記ミセルの製造における使用が提供される：
［３］親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
温度応答性重合体と、
タンパク質発現用のｍＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
（ａ）前記三元共重合体とRNAと温度応答性重合体とを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより得られる、
ミセル；または
［４］親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、
温度応答性重合体と、
ＲＮＡと
を含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、
RNAは、疎水性に変化した三元共重合体の温度応答性ブロックと温度応答性重合体とで形成される外殻によって覆われている、ミセル。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは同一の分子でも異なる分子でもあり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。温度応答性重合体は、温度応答性ブロックからなる重合体とすることもできる。
The present invention further provides a combination of a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block, a temperature-responsive polymer, and RNA. According to the present invention there is further provided the use of a combination of a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature responsive block and a cationic block, a temperature responsive polymer and an RNA, wherein Use in the manufacture of micelles is provided:
[3] a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a temperature-responsive polymer;
a micelle containing mRNA for protein expression,
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
(a) mixing the terpolymer, RNA, and temperature-responsive polymer in an aqueous solution having a temperature lower than the lower critical solution temperature; obtained by increasing the
micelles; or [4] a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a temperature-responsive polymer;
a micelle comprising RNA and
the temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature;
RNA is surrounded by an outer shell formed by hydrophobically modified terpolymer temperature-responsive blocks and temperature-responsive polymers, micelles. In this aspect, the temperature-responsive polymer can be the same molecule or a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block. The temperature-responsive polymer can also be a polymer composed of temperature-responsive blocks.
本発明の上記ミセルは、血中安定性が高く、血中においてもｍＲＮＡを安定に維持することができる。したがって、本発明の上記ミセルは、医薬組成物、特に限定されないが、静脈内投与用の医薬組成物とすることができる。 The micelles of the present invention have high blood stability and can stably maintain mRNA even in blood. Therefore, the micelle of the present invention can be made into a pharmaceutical composition, although not particularly limited, a pharmaceutical composition for intravenous administration.
したがって、本発明によれば、親水性ブロックと温度応答性ブロックとカチオン性ブロックとの三元共重合体と、ＲＮＡとの組合せの使用であって、上記［１］または［２］に記載のミセルを含む医薬組成物の製造、特に静脈内投与用の医薬組成物の製造における使用が提供される。また、本発明によれば、親水性ブロックと、温度応答性ブロックと、カチオン性ブロックとの三元共重合体と、温度応答性重合体と、ＲＮＡとの組合せの使用であって、上記［３］または［４］に記載のミセルを含む医薬組成物の製造、特に静脈内投与用の医薬組成物の製造における使用が提供される。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子であり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。温度応答性重合体は、温度応答性ブロックからなる重合体とすることもできる。 Therefore, according to the present invention, the use of a combination of a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block, and RNA, which is described in [1] or [2] above. Use in the manufacture of pharmaceutical compositions comprising micelles, particularly for intravenous administration, is provided. Further, according to the present invention, the use of a combination of a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block, a temperature-responsive polymer, and RNA, wherein the above [ Use in the manufacture of a pharmaceutical composition comprising the micelle according to 3] or [4], especially in the manufacture of a pharmaceutical composition for intravenous administration is provided. In this aspect, the temperature responsive polymer can be a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block. The temperature-responsive polymer can also be a polymer composed of temperature-responsive blocks.
本発明の医薬組成物は、上記ミセルに加えて、賦形剤を含んでいてもよい。ミセルは体液一般に含まれるRNAseから内包したmRNAを保護することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、腹腔内投与、脳室内投与、心室内投与、筋肉内投与、および髄腔内投与などのあらゆる非経口投与により投与され得る。これらの投与に適した賦形剤は、当業者に知られた賦形剤を用いることができる。 The pharmaceutical composition of the present invention may contain excipients in addition to the micelles. Micelles can protect the encapsulated mRNA from RNAses commonly found in body fluids. Accordingly, the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered by any parenteral administration, including intravenous, subcutaneous, transdermal, intraperitoneal, intracerebroventricular, intraventricular, intramuscular, and intrathecal administration. can be As excipients suitable for these administrations, excipients known to those skilled in the art can be used.
上記の全ての態様において、ＲＮＡとしてｍＲＮＡが好ましく用いられ得る。また、ｍＲＮＡはタンパク質発現用のｍＲＮＡであり得る。 In all the above aspects, mRNA can be preferably used as RNA. The mRNA can also be mRNA for protein expression.
本発明の上記ミセルは、粒径が数十ｎｍから１００ｎｍ程度であり得る。このようなミセルは、Enhancedpermeability and retention（ＥＰＲ）効果により腫瘍に好ましく送達されうる。したがって、ある態様では、本発明の上記ミセルに含有させるｍＲＮＡは、抗腫瘍効果を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり得る。 The micelle of the present invention may have a particle size of several tens of nm to 100 nm. Such micelles can be preferentially delivered to tumors due to the Enhanced permeability and retention (EPR) effect. Therefore, in one aspect, the mRNA to be contained in the micelle of the present invention can be mRNA encoding a protein having an antitumor effect.
本発明では、薬剤送達用のキャリアやこれを含む組成物は、薬学上許容されるものである。「薬学上許容される」とは、許容されない毒性を奏しないこと、および／または、許容されない毒性を奏しない用量で投与されることを意味する。 In the present invention, the drug delivery carrier and the composition comprising the same are pharmaceutically acceptable. "Pharmaceutically acceptable" means that it does not produce unacceptable toxicity and/or is administered at a dose that does not produce unacceptable toxicity.
本発明によれば、RNA内包ミセルの製造方法であって、
（ａ）親水ブロックと５～３５℃の下限臨界共溶温度を有する温度応答性ブロックとカチオン性ブロックとを含む三元共重合体とRNAとを、前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合することと、
（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させること
を含む方法が提供される。この方法において、三元共重合体とＲＮＡには、温度応答性重合体（例えば、温度応答性ブロックからなる重合体）とさらに混合してもよい。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは同一の分子でも異なる分子でもあり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。
According to the present invention, there is provided a method for producing RNA-encapsulating micelles, comprising:
(a) a terpolymer containing a hydrophilic block, a temperature-responsive block having a lower critical solution temperature of 5 to 35° C., and a cationic block, and RNA, in an aqueous solution at a temperature lower than the lower critical solution temperature; mixing in;
(b) thereafter, increasing the temperature of the aqueous solution above said lower critical solution temperature; In this method, the terpolymer and RNA may be further mixed with a temperature-responsive polymer (eg, a polymer consisting of temperature-responsive blocks). In this aspect, the temperature-responsive polymer can be the same molecule or a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block.
本発明によれば、RNA内包ミセルを含む医薬組成物の製造方法であって、
（ａ）親水ブロックと５～３５℃の下限臨界共溶温度を有する温度応答性ブロックとカチオン性ブロックとを含む三元共重合体とRNAとを、前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合することと、
（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させること
を含む方法が提供される。上記（ａ）では、混合する材料は全て薬学的に許容されるものとしてもよく、水溶液は賦形剤を含んでいてもよい。この方法において、三元共重合体とＲＮＡには、温度応答性ブロックを含んでなる重合体（例えば、温度応答性ブロックからなる重合体）とさらに混合してもよい。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とはある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。異なる分子でもあり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。
According to the present invention, a method for producing a pharmaceutical composition containing RNA-encapsulating micelles, comprising:
(a) a terpolymer containing a hydrophilic block, a temperature-responsive block having a lower critical solution temperature of 5 to 35° C., and a cationic block, and RNA, in an aqueous solution at a temperature lower than the lower critical solution temperature; mixing in;
(b) thereafter, increasing the temperature of the aqueous solution above said lower critical solution temperature; In (a) above, all the materials to be mixed may be pharmaceutically acceptable, and the aqueous solution may contain excipients. In this method, the terpolymer and RNA may be further mixed with a polymer comprising a temperature-responsive block (eg, a polymer comprising a temperature-responsive block). In this aspect, the temperature-responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. It can also be different molecules. In one aspect, the temperature responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block.
本発明によれば、対象の体内にＲＮＡを送達する方法であって、本発明のミセルを対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明によれば、対象の体内にＲＮＡを送達する方法であって、
（ａ）親水ブロックと５～３５℃の下限臨界共溶温度を有する温度応答性ブロックとカチオン性ブロックとを含む三元共重合体とRNAとを、前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合することと、
（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることと、
（ｃ）得られたミセルを対象に投与することと
を含む、方法が提供される。この方法において、三元共重合体とＲＮＡには、温度応答性重合体（例えば、温度応答性ブロックからなる重合体）とさらに混合してもよい。この態様において、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは同一の分子でも異なる分子でもあり得る。ある態様では、温度応答性重合体は、前記三元共重合体とは異なる分子である。ある態様では、温度応答性重合体は、カチオン性ブロックを有しない。
According to the invention, a method of delivering RNA into the body of a subject is provided comprising administering to the subject a micelle of the invention. According to the present invention, a method of delivering RNA into the body of a subject, comprising:
(a) a terpolymer containing a hydrophilic block, a temperature-responsive block having a lower critical solution temperature of 5 to 35° C., and a cationic block, and RNA, in an aqueous solution at a temperature lower than the lower critical solution temperature; mixing in;
(b) thereafter increasing the temperature of the aqueous solution to the lower critical solution temperature or higher;
(c) administering the resulting micelles to a subject. In this method, the terpolymer and RNA may be further mixed with a temperature-responsive polymer (eg, a polymer consisting of temperature-responsive blocks). In this aspect, the temperature-responsive polymer can be the same molecule or a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer is a different molecule than the terpolymer. In one aspect, the temperature responsive polymer does not have a cationic block.
実施例１：トリブロック共重合体を用いたpDNAとmRNAの安定性向上効果の比較Example 1: Comparison of pDNA and mRNA stability improvement effects using triblock copolymers
[材料]
mRNAは、テンプレートのDNAをmMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion社) を用いてin vitroトランスクリプションする、またpoly(A) tailkit(Ambion社)を用いてpoly(A)修飾を施すことで調製した。またテンプレートのDNA作成には、New England Biolabs社より購入したpCMV-Gluc control plasmidを用いた。
ウシアルブミン血清（FBS）は大日本住友製薬から購入した。
pDNAは理研バイオリソースセンターより提供されたルシフェラーゼがコードされCAGプロモーターを持つpCAG-Luc2を用いた。
トリブロック共重合体は、親水性連鎖ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)(PEtOx)と温度応答性連鎖ポリ(2-n-プロピル-2-オキサゾリン)からなるブロックセグメントと、カチオン性連鎖ポリリジン（PLys）を合成し、これらを結合することで作成した。トリブロック共重合体の合成スキームは以下スキーム１～３に示される通りであった。
[material]
mRNA was prepared by in vitro transcription of template DNA using mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion) and poly(A) modification using poly(A) tailkit (Ambion). . A pCMV-Gluc control plasmid purchased from New England Biolabs was used for template DNA preparation.
Bovine albumin serum (FBS) was purchased from Sumitomo Dainippon Pharma.
pCAG-Luc2, which encodes luciferase and has a CAG promoter provided by the RIKEN BioResource Center, was used as the pDNA.
The triblock copolymer consists of block segments composed of hydrophilic chain poly(2-ethyl-2-oxazoline) (PEtOx) and temperature-responsive chain poly(2-n-propyl-2-oxazoline), and cationic chain polylysine (PLys) were synthesized and combined. Synthetic schemes for the triblock copolymers were as shown in Schemes 1-3 below.
より具体的には、トリブロック共重合体の合成では、まずアルキン末端を持つ重合開始剤p-トルエンスルホン酸プロパルギル(61 mg, 0.29 mmol)をアセトニトリル9 mLとクロロベンゼン9 mLに溶解させ、2-n-プロピル-2-オキサゾリン( 2.3 g, 20 mmol)を加えた。反応溶液を42 ℃で6日間反応させた後、2-エチル-2-オキサゾリン(4.3 g, 44 mmol)を加えてさらに6日間反応を行った。ここで用いたp-トルエンスルホン酸プロパルギルは東京化成より購入し、Wako社より購入した五酸化ニリンを脱水剤として用いて蒸留精製して使用した。オキサゾリンモノマーは東京化成より購入し、シグマアルドリッチ社より購入したカルシウムハイドライドを脱水材として用いて蒸留精製して使用した。反応溶媒のアセトニトリル、クロロベンゼンはwako社より購入し、それぞれカルシウムハイドライド、五酸化二リンを脱水剤として用いて蒸留精製して使用した。重合反応後、反応溶液を水に対して５回透析し、凍結乾燥することでアルキン末端を持つジブロック共重合体、Alkyne-PnPrOx-PEtOxを得た。得られたポリマーは、MALDI-TOFMS（UltraFlextreme, Bruker社）と1H-NMR（ESC400,JEOL）による解析から、PnPrOxの分子量が7.3k、PEtOxの分子量が13.7kであることが分かった。
別途、アジド末端を持つポリリジン（PLys-N3）を合成した。これは、シグマアルドリッチ社より購入した11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amineを開始剤として用い、非特許文献（J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167-1187）に則りFuchs-Farthing法により合成したLys(TFA)-NCAを重合、その後塩基で処理することで得られる。開始剤(22 mg, 0.10 mmol)を1Mの濃度のチオウレアを溶かしたDMF (DMF (1M TU))2 mLに溶解させた。別途Arバック中でLys(TFA)-NCA(1.35 g, 5.0 mmol)をフラスコに測りとり、15mLのDMF(1M TU)に溶解させた。調製したLys(TFA)-NCA溶液を、Ar雰囲気下で開始剤溶液に加え、25 ℃で2日間撹拌して重合反応を行った。反応溶液を水に対して5回透析したのち、凍結乾燥することでPoly(L-Lysine)(TFA) (PLys(TFA))を得た。 得られたPLys(TFA)を500 mg測りとり、25 mLのメタノールに溶解させた。反応後は、0.01 M HClに対して3回透析を行った後、水に対して3回透析を行い、凍結乾燥によりアジド末端を持つポリリジン、PLys-N3を回収した。得られたポリマーは、1H-NMR（ESC400,JEOL）による解析から、重合度が51であることが分かった。
続いて、Alkyne-PnPrOx-PEtOxとPLys-N3をClick Chemistryによりカップリングした。Alkyne-PnPrOx-PEtOx(210 mg, 0.01 mmol)を水2 mLに溶解し、1MのCuSO4溶液と1Mのアスコルビン酸ナトリウム溶液を20 μLずつ加え、撹拌した。別途、PLys-N3(35mg, 0.0044 mmol)を水1 mLに溶解し、Alkyne-PnPrOx-PEtOx溶液に加え、-20 ℃で一晩静置し、4 ℃で2時間かけて融解させた。生成物は、反応溶液を水に対して5回透析し、凍結乾燥することで回収した。ここでの回収物はトリブロック共重合体の他に、PLys-N3を全て反応させるために過剰に加えたAlkyne-PnPrOx-PEtOxも含まれている。これら二つのジオキサンへの溶解性の違いに着目し、精製作業を行った。回収物をwako社より購入した脱水ジオキサンに分散させて遠心分離により上澄みを取り除く工程を3回行い、ジオキサンへの溶解性が高いAlkyne-PnPrOx-PEtOxのみを取り除き、溶解性の低いトリブロック共重合体のみを沈殿物として回収した。
カップリングの進行や、精製作業後の回収物はGEヘルスケア社のカラムSuperdex 200を用いたSEC（AKTAexplorer,GE Helthcere）によって分析した。
本トリブロック共重合体の下限臨界共溶温度（LCST）は約３０℃であった。
More specifically, in the synthesis of the triblock copolymer, the alkyne-terminated propargyl p-toluenesulfonate (61 mg, 0.29 mmol) was first dissolved in 9 mL of acetonitrile and 9 mL of chlorobenzene, and 2- n-Propyl-2-oxazoline (2.3 g, 20 mmol) was added. After the reaction solution was reacted at 42° C. for 6 days, 2-ethyl-2-oxazoline (4.3 g, 44 mmol) was added and the reaction was further carried out for 6 days. The propargyl p-toluenesulfonate used here was purchased from Tokyo Kasei Co., Ltd., and purified by distillation using niline pentoxide purchased from Wako as a dehydrating agent. The oxazoline monomer was purchased from Tokyo Kasei and purified by distillation using calcium hydride purchased from Sigma-Aldrich as a dehydrating agent. Acetonitrile and chlorobenzene used as reaction solvents were purchased from Wako, and purified by distillation using calcium hydride and diphosphorus pentoxide as dehydrating agents, respectively. After the polymerization reaction, the reaction solution was dialyzed against water five times and freeze-dried to obtain an alkyne-terminated diblock copolymer, Alkyne-PnPrOx-PEtOx. Analysis by MALDI-TOFMS (UltraFlextreme, Bruker) and 1 H-NMR (ESC400, JEOL) of the obtained polymer revealed that the molecular weight of PnPrOx was 7.3 k and the molecular weight of PEtOx was 13.7 k.
Separately, azide-terminated polylysine (PLys-N 3 ) was synthesized. This was carried out using 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amine purchased from Sigma-Aldrich as an initiator, as described in J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2003, 41 1167. -1187) by polymerizing Lys(TFA)-NCA synthesized by the Fuchs-Farthing method, followed by treatment with a base. The initiator (22 mg, 0.10 mmol) was dissolved in 2 mL of DMF containing 1M thiourea (DMF (1M TU)). Separately, Lys(TFA)-NCA (1.35 g, 5.0 mmol) was weighed into a flask in an Ar bag and dissolved in 15 mL of DMF (1 M TU). The prepared Lys(TFA)-NCA solution was added to the initiator solution under an Ar atmosphere and stirred at 25° C. for 2 days to carry out a polymerization reaction. The reaction solution was dialyzed against water five times and then freeze-dried to obtain Poly(L-Lysine)(TFA) (PLys(TFA)). 500 mg of the obtained PLys(TFA) was weighed and dissolved in 25 mL of methanol. After the reaction, the product was dialyzed against 0.01 M HCl three times, then dialyzed against water three times, and polylysine with an azide end, PLys - N3, was recovered by freeze-drying. The obtained polymer was found to have a degree of polymerization of 51 by 1 H-NMR (ESC400, JEOL) analysis.
Alkyne-PnPrOx- PEtOx and PLys-N3 were subsequently coupled by Click Chemistry. Alkyne-PnPrOx-PEtOx (210 mg, 0.01 mmol) was dissolved in 2 mL of water, 20 μL each of 1 M CuSO 4 solution and 1 M sodium ascorbate solution was added and stirred. Separately, PLys-N 3 (35 mg, 0.0044 mmol) was dissolved in 1 mL of water, added to the Alkyne-PnPrOx-PEtOx solution, allowed to stand at -20°C overnight, and melted at 4°C over 2 hours. The product was recovered by dialyzing the reaction solution five times against water and lyophilizing. In addition to the triblock copolymer, the recovery here also contains Alkyne-PnPrOx- PEtOx added in excess to react all the PLys-N3. Focusing on the difference in solubility in these two dioxane, purification work was carried out. The collected material was dispersed in dehydrated dioxane purchased from Wako, and the process of removing the supernatant by centrifugation was performed three times. Only coalescence was recovered as a precipitate.
The progress of coupling and the product recovered after purification were analyzed by SEC (AKTAexplorer, GE Healthcere) using a column Superdex 200 from GE Healthcare.
The lower critical solution temperature (LCST) of this triblock copolymer was about 30°C.
[実験]
50 ng/μLの濃度に調製したpDNA溶液、またはmRNA溶液100 μLに対して、ポリカチオン／核酸の電荷比が2となるよう濃度を調製したトリブロック共重合体水溶液50 μLを4 ℃で混合し、その後37 ℃で10分間静置することでミセル溶液とした。これらのミセル溶液15 μLとFBS15 μLをそれぞれ混合し、37 ℃で15分間静置した。pDNAミセル溶液に対してはDNeasy kit (Qiagen社)を、mRNAミセル溶液に対してはRNeasykit (Qiagen社)を用いて核酸を抽出し、回収した。回収したDNAはそのままqRT-PCR( ,Biorad社)を用いて残存量を定量し、RNAについてはReverse Transfection kit (TOYOBO社)を用いてcDNAに逆転写した後、qRT-PCR（Biorad社）により定量した。
33.3 ng/μLの濃度に調製したpDNA溶液、mRNA溶液に対しても、FBSとの静置や抽出等、ミセル溶液と同様の操作をそれぞれ行った。結果は、図１に示される通りであった。
[experiment]
Mix 100 μL of pDNA solution or 100 μL of mRNA solution adjusted to a concentration of 50 ng/μL with 50 μL of triblock copolymer aqueous solution adjusted to a polycation/nucleic acid charge ratio of 2 at 4°C. After that, it was allowed to stand at 37°C for 10 minutes to obtain a micelle solution. 15 μL of these micelle solutions and 15 μL of FBS were mixed and allowed to stand at 37° C. for 15 minutes. Nucleic acids were extracted and recovered using DNeasy kit (Qiagen) for the pDNA micelle solution and RNeasykit (Qiagen) for the mRNA micelle solution. The recovered DNA was directly quantified using qRT-PCR (Biorad), and the RNA was reverse transcribed into cDNA using the Reverse Transfection kit (TOYOBO), followed by qRT-PCR (Biorad). quantified.
The pDNA solution and mRNA solution prepared to a concentration of 33.3 ng/μL were also subjected to the same operations as those for the micelle solution, such as standing with FBS and extraction. The results were as shown in FIG.
図１に示されるように、pDNAミセルの系では、pDNAを安定に保持することが確認された。これは既報（Biomacromolecules, 2016, 17, 354-361）の通りである。Nakedと比べると、その残存量は約18倍の値を示した。一方、mRNAミセルでは劇的な安定性向上効果が観察された。今回の実験では、nakedのmRNAの残存量はバックグラウンドと変わらず検出できなかったが、同実験条件においてmRNAの残存量は1.33×10-5%となるとの報告がなされている（Biomaterials, 2016, 82, 221-228.）。トリブロック共重合体でミセル化したmRNAについては50%程度の残存量を示しているので、その残存量は実に4,000,000倍程度であった。これはトリブロック共重合体によるミセルが、生体内で分解されやすいmRNAの核酸送達キャリアとして特に適していることを示している。上記トリブロック共重合体によるミセルは、意外にもmRNAに対しては数百万倍という高い保護効果が奏され、これにより、その保護効果は実用上意味のあるものであると評価された。上記トリブロック共重合体によるミセルが力学的に安定な球の形状を有していたことが、内包するmRNAの高い保護効果に起因していると考えられた。 As shown in FIG. 1, it was confirmed that the system of pDNA micelles stably retains pDNA. This is as previously reported (Biomacromolecules, 2016, 17, 354-361). Compared to Naked, its remaining amount showed a value of about 18 times. On the other hand, a dramatic stability improvement effect was observed with mRNA micelles. In this experiment, the residual amount of naked mRNA could not be detected, which was the same as the background, but it was reported that the residual amount of mRNA was 1.33 × 10 -5 % under the same experimental conditions (Biomaterials, 2016 , 82, 221-228.). The remaining amount of mRNA micellized with the triblock copolymer was about 50%, so the remaining amount was actually about 4,000,000 times. This indicates that triblock copolymer micelles are particularly suitable as nucleic acid delivery carriers for mRNA, which is easily degraded in vivo. Surprisingly, micelles made of the above-mentioned triblock copolymer exhibited a high protective effect of several million times against mRNA, and thus the protective effect was evaluated to be of practical significance. It was considered that the fact that the micelle made of the above triblock copolymer had a mechanically stable spherical shape was attributed to the high protective effect of the encapsulated mRNA.
実施例２： mRNAミセルの血中安定性Example 2: Blood stability of mRNA micelles
[材料]
トリブロック共重合体、mRNAについては実施例1と同様のものを用いた。動物実験に用いるマウス（Balb/c, ♀）は、チャールズリバー社より購入した。また今回の実験では対照として、温度応答性を持たず、カチオン鎖であるPLysの重合度はトリブロック共重合体と同じ51で、親水性鎖として分子量23kのPEtOxを持つジブロック共重合体を用意した。
[material]
The same triblock copolymer and mRNA as in Example 1 were used. Mice (Balb/c, female) used in animal experiments were purchased from Charles River. In addition, as a control in this experiment, a diblock copolymer with PEtOx with a molecular weight of 23k as a hydrophilic chain and a cationic chain PLys with a degree of polymerization of 51, which is the same as the triblock copolymer, was used as a control. prepared.
[実験]
300 ng/μLの濃度に調整したmRNA溶液と、ポリカチオン／核酸の電荷比が2となるよう濃度を調製したトリブロック共重合体を4 ℃で混合し、核酸の濃度が200 ng/μLのミセル溶液となるよう調節した。ミセル溶液を37 ℃で10分間静置した後、マウス尾静脈より投与した。投与後2.5、5、10分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取し、1%のメルカプトエタノールを含んだRLTバッファー350 μLに加えた。その後、RNeasy kit（Qiagen社）のプロトコールに則りRNAを抽出した。抽出したRNAはReverseTransfection kit (TOYOBO社)を用いてcDNAに逆転写した後、qRT-PCR（Biorad社）により定量した。同様に、ジブロック共重合体も用いて高分子ミセルを作成し、評価した。結果は、図２に示される通りであった。
[experiment]
The mRNA solution adjusted to a concentration of 300 ng/μL and the triblock copolymer adjusted to a polycation/nucleic acid charge ratio of 2 were mixed at 4°C, and the nucleic acid concentration was 200 ng/μL. A micellar solution was prepared. After allowing the micelle solution to stand at 37° C. for 10 minutes, it was administered through the mouse tail vein. 2.0 μL of blood was collected from the tail vein 2.5, 5 and 10 minutes after administration and added to 350 μL of RLT buffer containing 1% mercaptoethanol. After that, RNA was extracted according to the protocol of RNeasy kit (Qiagen). The extracted RNA was reverse transcribed into cDNA using a ReverseTransfection kit (TOYOBO) and then quantified by qRT-PCR (Biorad). Similarly, diblock copolymers were also used to prepare and evaluate polymeric micelles. The results were as shown in FIG.
図２に示されるように、トリブロック共重合体は有意に高い血中安定性を示した。血中半減期を計算すると、トリブロック共重合体では64秒でジブロック共重合体では27秒であることからも、疎水性保護層が効果的であることがはっきりと分かる。また現在このトリブロック共重合体からなるミセルと同等の血中半減期を持つmRNAキャリアも報告されているが（Biomaterials, 2016, 82,221-228.）、これは過剰にカチオンポリマーが存在する系である為、毒性の観点から考えると、トリブロック共重合体ミセルの方が好ましいと結論出来る。 As shown in Figure 2, the triblock copolymers exhibited significantly higher blood stability. The calculated blood half-life of 64 seconds for the triblock copolymer and 27 seconds for the diblock copolymer clearly demonstrates the effectiveness of the hydrophobic protective layer. In addition, an mRNA carrier with a blood half-life equivalent to micelles composed of this triblock copolymer has been reported (Biomaterials, 2016, 82, 221-228.), but this is a system in which cationic polymers are present in excess. Therefore, it can be concluded that triblock copolymer micelles are preferable from the point of view of toxicity.
実施例３：ミセルに対する刺激応答性ポリマーの添加と形態変化Example 3: Addition of stimuli-responsive polymer to micelles and morphological change
[材料]
実施例1、2で用いたものと同様のトリブロック共重合体とmRNA、また実施例2で用いたものと同様のジブロック共重合体を用意した。
ミセルに添加する刺激応答性ポリマーとして、分子量が20kのPnPrOxを用意した。開始剤p-トルエンスルホン酸プロパルギル(61 mg, 0.29 mmol)をアセトニトリル9 mL、クロロベンゼン9 mLに加えた。ここに2-n-プロピル-2-オキサゾリン(7.2g, 64 mmol)を加え、42 ℃で10日間反応させた。ここで用いたp-トルエンスルホン酸プロパルギルは東京化成より購入し、Wako社より購入した五酸化ニリンを脱水剤として用いて蒸留精製して使用した。オキサゾリンモノマーは東京化成より購入し、シグマアルドリッチ社より購入したカルシウムハイドライドを脱水材として用いて蒸留精製して使用した。反応溶媒のアセトニトリル、クロロベンゼンはwako社より購入し、それぞれカルシウムハイドライド、五酸化二リンを脱水剤として用いて蒸留精製して使用した。
[material]
A triblock copolymer and mRNA similar to those used in Examples 1 and 2, and a diblock copolymer similar to that used in Example 2 were prepared.
PnPrOx with a molecular weight of 20k was prepared as a stimuli-responsive polymer to be added to the micelles. The initiator propargyl p-toluenesulfonate (61 mg, 0.29 mmol) was added to 9 mL of acetonitrile and 9 mL of chlorobenzene. 2-n-Propyl-2-oxazoline (7.2 g, 64 mmol) was added thereto and reacted at 42° C. for 10 days. The propargyl p-toluenesulfonate used here was purchased from Tokyo Kasei Co., Ltd., and purified by distillation using niline pentoxide purchased from Wako as a dehydrating agent. The oxazoline monomer was purchased from Tokyo Kasei and purified by distillation using calcium hydride purchased from Sigma-Aldrich as a dehydrating agent. Acetonitrile and chlorobenzene used as reaction solvents were purchased from Wako, and purified by distillation using calcium hydride and diphosphorus pentoxide as dehydrating agents, respectively.
[実験]
50 ng/μLの濃度に調製したmRNA溶液100 μLに対して、ポリカチオン／核酸の電荷比が2となるよう濃度を調製したトリブロック共重合体溶液50 μLを4 ℃で混合した。続いて37 ℃で10分間静置し、これに対して37 ℃で動的光散乱測定(Zetasizer, Malvern)を行い、粒径、粒径分布を見た。また別途、4 ℃においてミセル溶液50 μLと0.5 mg/mLに調整したPnPrOx溶液25 μLを混合した溶液を調整し、37 ℃で10分間静置後、動的光散乱測定により形態を評価した。同様の測定を、ジブロック共重合体から形成されたミセルに対しても行った。結果は図３－１および３－２に示される通りであった。
[experiment]
100 µL of the mRNA solution adjusted to a concentration of 50 ng/µL was mixed with 50 µL of the triblock copolymer solution adjusted to a polycation/nucleic acid charge ratio of 2 at 4°C. Subsequently, it was allowed to stand at 37° C. for 10 minutes, and subjected to dynamic light scattering measurement (Zetasizer, Malvern) at 37° C. to observe particle size and particle size distribution. Separately, a solution was prepared by mixing 50 μL of the micelle solution and 25 μL of the PnPrOx solution adjusted to 0.5 mg/mL at 4° C., and after standing at 37° C. for 10 minutes, the morphology was evaluated by dynamic light scattering measurement. Similar measurements were also performed on micelles formed from diblock copolymers. The results were as shown in Figures 3-1 and 3-2.
図３－１に示されるように、動的光散乱測定によると、トリブロックからなるミセルは、37 ℃において平均粒径が64 nm、粒径分布を示すPDIが0.24であった。これに対し、PnPrOxをミセルに後から加えた系では、平均粒径が77 nm、PDIが0.14であり、少し粒径が増加してより粒径分布の狭い粒子となった。また、透過電子顕微鏡によると粒子は球形であった。 As shown in FIG. 3-1, according to dynamic light scattering measurement, the triblock micelle had an average particle size of 64 nm at 37° C. and a PDI indicating particle size distribution of 0.24. In contrast, the system in which PnPrOx was post-added to the micelles had an average particle size of 77 nm and a PDI of 0.14, showing a slight increase in particle size and a narrower particle size distribution. The particles were also spherical by transmission electron microscopy.
LCST未満の低温では、ミセル状態における中間層である温度応答性ブロックPnPrOxは親水性であり、親水性である他の中間層と一定以上の密度で密集しており、他方で後に添加したPnPrOxは溶液中を浮遊していると考えられる。ここで、LCST以上に温度を上昇させると、PnPrOxが疎水性に変化し、ミセル状態における中間層である温度応答性ブロックPnPrOxがまず相互作用を起こして疎水性の核を形成する。そして、後から添加したPnPrOxは、先に疎水性相互作用を起こしたミセル中間層を核として遅れて疎水吸着を起こし、これにより粒径を増大させたものと考えられる。図3-2(b)に見られるように、疎水性保護層が存在しないミセルに対しては、粒径分布は二峰性となる。この二峰性のピークはそれぞれ図3-2(a)および(c)のジブロック共重合体のミセルおよびPnPrOx凝集体を示す粒径分布に対応することから、図3-2(b)の二つのピークは、ジブロックポリマーより形成されたミセルと、PnPrOxの凝集体に起因するものであることが分かった。したがって、温度応答性ブロックを有しないジブロック共重合体では、PnPrOxはミセルと複合体を形成できないが、温度応答性ブロックを有するトリブロック共重合体では、PnPrOxはミセルに取り込まれたことが示された。この結果は、PnPrOxがトリブロックミセルに疎水吸着していることを支持するものである。これにより、トリブロック共重合体を用いて形成させたRNAミセルは、力学的に安定な形状（すなわち、球の形状）を有し、かつ、力学的に安定な構造（疎水結合）を有することが明らかとなった。 At a low temperature below the LCST, the temperature-responsive block PnPrOx, which is the intermediate layer in the micellar state, is hydrophilic and densely packed with other hydrophilic intermediate layers at a certain density or higher. It is thought that it floats in the solution. Here, when the temperature is raised above the LCST, PnPrOx changes to be hydrophobic, and the temperature-responsive block PnPrOx, which is the intermediate layer in the micelle state, first interacts to form a hydrophobic nucleus. It is considered that PnPrOx, which was added later, causes delayed hydrophobic adsorption with the micelle intermediate layer, which has previously caused hydrophobic interaction, as the nucleus, thereby increasing the particle size. As seen in Figure 3-2(b), the particle size distribution is bimodal for the micelles without the hydrophobic protective layer. This bimodal peak corresponds to the particle size distributions showing the micelles and PnPrOx aggregates of the diblock copolymer in Figures 3-2(a) and (c), respectively. The two peaks were found to be due to micelles formed from the diblock polymer and aggregates of PnPrOx. Therefore, it was shown that PnPrOx was unable to form a complex with micelles in the diblock copolymer without the temperature-responsive block, whereas PnPrOx was incorporated into the micelle in the triblock copolymer with the temperature-responsive block. was done. This result supports the hydrophobic adsorption of PnPrOx to the triblock micelles. As a result, the RNA micelles formed using the triblock copolymer have a mechanically stable shape (i.e., spherical shape) and a mechanically stable structure (hydrophobic bond). became clear.
実施例４：刺激応答性ポリマー添加によるRNase Aに対する酵素分解の抑制Example 4: Suppression of Enzymatic Degradation of RNase A by Addition of Stimuli-Responsive Polymer
[材料]
実施例1、2、3で用いたものと同様のトリブロック共重合体とmRNA、また実施例3で用いたものと同様である分子量20kのPnPrOxを用意した。
RNase Aはタカラバイオ株式会社より購入したものを用いた。
[material]
A triblock copolymer and mRNA similar to those used in Examples 1, 2 and 3, and PnPrOx having a molecular weight of 20 k similar to that used in Example 3 were prepared.
RNase A purchased from Takara Bio Inc. was used.
[実験]
50 ng/μLの濃度に調製したmRNA溶液200 μLに対して、ポリカチオン／核酸の電荷比が2となるよう濃度を調製したトリブロック共重合体溶液100 μLを4 ℃で混合した。ミセル溶液60 μLを測りとり、4 ℃において5,2.5, 0.5, 0 mg/mL濃度に調整したPnPrOx水溶液30 μLのいずれかと混合し、37 ℃で10分間静置した。これら調整したミセル溶液 15 μLに対してそれぞれ 6 μg/mLのRNase A溶液15 μLを加え、37 ℃で1時間静置した。その後、RNeasykit（Qiagen社）のプロトコールに則りRNAを抽出した。抽出したRNAはReverse Transfection kit (TOYOBO社)を用いてcDNAに逆転写した後、qRT-PCR（Biorad社）により定量した。結果は、図４に示される通りであった。
[experiment]
200 µL of the mRNA solution adjusted to a concentration of 50 ng/µL was mixed with 100 µL of the triblock copolymer solution adjusted to a polycation/nucleic acid charge ratio of 2 at 4°C. 60 μL of the micelle solution was measured, mixed with 30 μL of PnPrOx aqueous solution adjusted to 5, 2.5, 0.5, 0 mg/mL concentration at 4° C., and allowed to stand at 37° C. for 10 minutes. 15 μL of 6 μg/mL RNase A solution was added to 15 μL of each of these prepared micelle solutions, and left standing at 37° C. for 1 hour. After that, RNA was extracted according to the protocol of RNeasykit (Qiagen). The extracted RNA was reverse transcribed into cDNA using a Reverse Transfection kit (TOYOBO) and then quantified by qRT-PCR (Biorad). The results were as shown in FIG.
図４に示される通り、トリブロック共重合体ミセルに対してPnPrOxを添加することで内包されるmRNAのRNase A耐性の向上が見られた。この結果から、PnPrOxがミセル中間層に吸着し、疎水性層をより強固にしていると考えられた。このようにして、PnPrOxをミセル形成後に添加することによって、高分子ミセルの更なる安定化を達成することが出来た。 As shown in FIG. 4, the addition of PnPrOx to the triblock copolymer micelle improved the RNase A resistance of the encapsulated mRNA. From this result, it was considered that PnPrOx was adsorbed on the micelle intermediate layer and strengthened the hydrophobic layer. Thus, by adding PnPrOx after micelle formation, further stabilization of polymeric micelles could be achieved.
実施例５：刺激応答性ポリマーを添加したミセルの血中安定性評価Example 5: Evaluation of stability in blood of micelles containing stimuli-responsive polymer
[材料]
実施例1、2、3で用いたものと同様のトリブロック共重合体とmRNA、また実施例3で用いたものと同様である分子量20kのPnPrOxを用意した。動物実験に用いるマウスはBalb/c ♀をチャールズリバー社より購入した。
[material]
A triblock copolymer and mRNA similar to those used in Examples 1, 2 and 3, and PnPrOx having a molecular weight of 20 k similar to that used in Example 3 were prepared. Balb/c ♀ mice used for animal experiments were purchased from Charles River.
[実験]
300 ng/μLの濃度に調整したmRNA溶液と、ポリカチオン／核酸の電荷比が2となるよう濃度を調製したトリブロック共重合体を4 ℃で混合し、核酸の濃度を200 ng/μLになるよう調節した。4 ℃においてミセル溶液200 μLに対して0.5 mg/mLに調節したPnPrOx溶液100 μLを混合し、37 ℃で10分間静置した。このように調整したミセル溶液300 μLをマウス尾静脈より投与し、投与後2.5分後に尾の静脈より2.0 μLの血液を採取、1%のメルカプトエタノールを含んだRLTバッファー350 μLに加えた。その後、RNeasykit（Qiagen社）のプロトコールに則りRNAを抽出した。抽出したRNAはReverse Transfection kit (TOYOBO社)を用いてcDNAに逆転写した後、qRT-PCR（Biorad社）により定量した。結果は、図５に示される通りであった。
[experiment]
The mRNA solution adjusted to a concentration of 300 ng/μL and the triblock copolymer adjusted to a polycation/nucleic acid charge ratio of 2 were mixed at 4°C, and the nucleic acid concentration was adjusted to 200 ng/μL. adjusted to be 200 μL of the micelle solution was mixed with 100 μL of the PnPrOx solution adjusted to 0.5 mg/mL at 4° C. and allowed to stand at 37° C. for 10 minutes. 300 μL of the micelle solution prepared in this way was administered through the tail vein of the mouse, and 2.5 minutes after administration, 2.0 μL of blood was collected from the tail vein and added to 350 μL of RLT buffer containing 1% mercaptoethanol. After that, RNA was extracted according to the protocol of RNeasykit (Qiagen). The extracted RNA was reverse transcribed into cDNA using a Reverse Transfection kit (TOYOBO) and then quantified by qRT-PCR (Biorad). The results were as shown in FIG.
図５に示されるように、PnPrOxを添加することで、血中半減期が64秒から80秒に向上した。PnPrOx添加によるトリブロック共重合体ミセルの疎水性保護層の強化は、内包されるmRNAの血中安定性向上に有効であることが分かった。 As shown in Figure 5, the addition of PnPrOx improved the blood half-life from 64 seconds to 80 seconds. It was found that enhancement of the hydrophobic protective layer of triblock copolymer micelles by addition of PnPrOx is effective in improving blood stability of encapsulated mRNA.
Claims (14)
ＲＮＡとを含む、ミセルであって、
温度応答性ブロックは、５℃～３５℃の下限臨界共溶温度を有し、下限臨界共溶温度未満で親水性であり、下限臨界共溶温度以上で疎水性であり、（ａ）前記三元共重合体とRNAとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、（ｂ）その後、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより得られる、ミセル。 a terpolymer of a hydrophilic block, a temperature-responsive block, and a cationic block;
a micelle comprising RNA and
The temperature-responsive block has a lower critical solution temperature of 5° C. to 35° C., is hydrophilic below the lower critical solution temperature, and is hydrophobic above the lower critical solution temperature; A micelle obtained by mixing an original copolymer and RNA in an aqueous solution having a temperature lower than the lower critical solution temperature, and (b) then raising the temperature of the aqueous solution to the lower critical solution temperature or higher.
前記三元共重合体とＲＮＡとを前記下限臨界共溶温度未満の温度の水溶液中で混合し、ミセルを形成させ、その後、温度応答性重合体を添加し、さらに、水溶液の温度を前記下限臨界共溶温度以上に上昇させることにより形成される、ミセル。 A micelle according to claim 5 or 6,
The terpolymer and RNA are mixed in an aqueous solution at a temperature below the lower critical solution temperature to form micelles, then the temperature-responsive polymer is added, and the temperature of the aqueous solution is reduced to the lower limit. Micelles formed by raising above the critical solution temperature.
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