JP2022188773A - 神経学的障害及び他の障害を治療するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、2018年1月2日に出願された米国仮特許出願第62/612,906号明細書の出願日の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に援用される。
本発明は、米国陸軍医学研究・兵器司令部(W81XWH-12-1-0065)及びNIH(AG050431)からの助成金、アルツハイマー協会からのゼニス・フェロー賞(ZEN-17-438829)及び米国退役軍人局からの功労賞(1I01BX003033)の政府支援を受けて実施された。連邦政府は、本発明について一定の権利を有する。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。好ましい方法及び材料が以下に記載されるが、ただし、本発明の実施又は試験において、本明細書に記載されるものと類似した又は均等な方法及び材料が使用され得る。
本明細書で開示される治療方法は、ペプチド組成物又はペプチド組成物の医薬組成物を投与する任意の数の様式を含み得る。投与様式としては、錠剤、丸薬、糖衣丸、硬質及び軟質ゲルカプセル、顆粒、ペレット、水性、若しくは脂質、若しくは油性、若しくは他の溶液、水中油型エマルションなどのエマルション、リポソーム、水性又は油性懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、固体エマルション、固体分散体又は分散性粉末が挙げられ得る。経口投与のための医薬組成物の調製では、ペプチド組成物は、例えば、アラビアガム、滑石、デンプン、糖類(例えば、マンニトース、メチルセルロース、ラクトースなど)、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、水性又は非水性溶剤、パラフィン誘導体、架橋剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存剤、香味剤(例えば、エーテル性油)、溶解促進剤(例えば、安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール)又は生物学的利用能促進剤(例えば、GELUCIRE)などの一般に知られて使用されている、アジュバント及び賦形剤と混合され得る。医薬組成物中では、薬剤は、例えば、ナノ微粒子などの微粒子組成物中に分散され得る。
Rush Religious Order Study(RROS)(44、45)から得られた、認知機能障害なし(NCI;n=12)、軽度認知機能障害(MCI;n=11)及びAD(n=10)の死亡前臨床診断を有する33症例を分析した(表S1)。全ての参加者は、詳細な年次臨床評価及び死亡時の脳供与に同意した。
NCI、MCI及びADの診断のための臨床基準は、別の場所で報告されている(44、46)。ミニメンタルステート検査(MMSE)と一連の19の認知性検査とを含む、最終的な臨床及び神経心理学的検査を死亡前2年以内に実施した。19の検査を含む全体的認知性zスコア(GCS)は、全ての症例で利用できた(47)。神経原線維濃縮体(NFT)のBraak病期診断(48)は、以前記載された通り実施した(44)。AD以外の病理学的所見(例えば、脳卒中、パーキンソン病、レビー小体型認知症)を有する対象は、研究から除外した。組織及び臨床情報は、健康情報プライバシー管理規則の保護下にある。
上前頭前皮質(ブロードマン野9)は、解凍を防ぐためのドライアイス上での剖検時、白質を含まない状態で解剖し、アッセイまで-80℃に維持した。組織を均質化し、前述されたように(22)処理した。組織抽出物及び細胞溶解産物(30μg)は、連続緩衝系中の8又は10%ビス-トリスSDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、セミドライブロッター(Pierce)を用いてニトロセルロース膜(BioRad)に転写して、前述されたように(22、49-51)免疫ブロットした。ブロットをバイナリに変換し、ImageJ(NIH)を使用して分析し、ローディング対照(β-アクチン)に対して正規化した。
TLR2完全長コンストラクト(pLenti-cmyc-DDK/tlr2)は、Origeneから購入した。TOPO TAクローニングキット(K5310-00;Life Technologies)を使用して、c-mycでタグ付けされたcTLR2(640~784個のアミノ酸)をレンチベクターにクローニングした。簡潔に述べると、TLR2のC末端TIRドメインの上流にコザック配列を組み込んだ。次に、cTLR2をレンチベクターにクローニングし、HEK293FT細胞を使用したレンチウイルス内のパッケージングがそれに続いた。48時間後、培地を採取し、Lenti-X濃縮器で濃縮した(カタログ番号631231;Clontech)。この濃縮レンチウイルスsupをウイルス形質導入に使用した。Mycアフィニティカラムを通過させることにより、cTLR2タンパク質をHEK293細胞溶解産物から単離した。10kD分子カットオフ濾過システムを使用することにより、精製タンパク質を脱塩し濃縮した。
TLR2とTIDMペプチドとの結合を分析するために、Reichert4SPR機器(Reichert Technologies,Buffalo,NY)を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)実験を実行した。TLR2を捕捉するために、500kDaのカルボキシメチルデキストランゴールドセンサースライド(Reichert Inc.)を使用して、結合アッセイを実施した。タンパク質の固定化は、0.8mg/mLのTLR2溶液を用いて、PBS中で30μl/分の流速で3分間であった。分析物の結合について、PBS泳動用緩衝液中の異なる濃度のwtTIDM及びmTIDMペプチドを2.5分間30μl/分の速度で注入し、3分間の解離期がそれに続いた。センサー表面は、緩衝液を40μl/分で最低15分間流すことにより、各解離サイクル後に再生させた。システムソフトウェアを用いて標準操作手順に従い、TLR2結合表面で得られた信号から、参照セルで得られた信号を差し引いた。差し引かれた信号の濃度依存性を分析し、TLR2とwtTIDMペプチド及びTLR2とmTIDMペプチドの結合親和性を判定した。
前述されたように(52、53)、Applied Biosystems 7500の標準リアルタイムサーマルサイクラー装置内で熱シフトアッセイを実施した。各反応では、キットで提供される18μLの熱シフト緩衝液及び1~2μLの色素に精製タンパク質(0.5μg~1μg)を添加した。反応は、96ウェルPCRプレートを暗所で設定し、次の二段階プログラムを用いて、サーマルサイクラー装置に入れた[(25℃で2分間)1サイクル;(27℃で15秒間、26℃で1分間)70サイクル;両方の段階で1℃の自動増分]。クエンチャーフィルターなし、パッシブフィルターなしで、フィルターをROXに設定した。
本発明者らは、Expert Protein Analytical System(ExPASy)のオンライン高分子分析ツールであるDeep View3.7β2を利用して、様々なTLR(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7及びTLR9)のTIRドメインの構造をモデル化した。モデル化された構造の品質を評価するために、本発明者らは、モデル全体の包括的な品質を推定する複合スコア付けツールであるQuality Measurement Analysysツール(QMEAN)及びモデル内の異なる領域の局所的な残基毎の分析を使用した。残基レベルの相互作用は、Cβ原子ポテンシャルによって評価し、長距離相互作用は、全原子ポテンシャルによって検証した。溶媒和ポテンシャルを実装し、残基の埋没状況を分析した。各構造の局所的な幾何配置は、3つの連続アミノ酸にわたるねじれ角ポテンシャルによって分析した。wtTIDM又はmTIDMペプチドのいずれかとTIRドメインとのドッキングポーズは、pydock剛体タンパク質間ドッキングツールから導出した。
B6SJL-Tg(APPSwFlLon、PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/J遺伝子組換え(5XFAD、本明細書ではTgと称される)マウスは、Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)から購入した。6ヶ月齢のオスのTgマウスをwtTIDM又はmTIDMペプチド(0.1mg/Kg体重/2日)で30日間鼻腔内処置した。簡潔に述べると、TIDMペプチドを5μlの生理食塩水に溶解し、マウスを背臥位に保ち、ピペットマンを使用して生理食塩水を1つの鼻孔に送達した。
オスのC57BL/6マウスは、本発明者らによって記載されたように(54、55)、100μgのMOG35-55で免疫化した。マウスに対して、免疫後(dpi)0日目及び2日目に2用量の百日咳毒素(150ng/マウス)も投与した。免疫後10日目から開始して、wtTIDM又はmTIDMペプチド(0.1mg/kg体重/日)をマウスに鼻腔内投与した。
オスのDBA/1Jマウス(8~9週齢)は、フロイントの不完全アジュバントに乳化した100μgのウシII型コラーゲン及び結核菌(M.tuberculosis)H37RAを用いて、尾の付け根で皮内免疫化した。免疫後21日目に100μgのウシII型コラーゲンの腹腔内注射によりマウスを追加免疫化した。wtTIDM又はmTIDMペプチド(1mg/Kg体重/日)を免疫後29日目から開始してマウスを処置した。
小繊維Aβ1-42(Anaspec,Fremont,CA)は、50μMで新鮮に可溶化したペプチドを滅菌蒸留水中において37℃で5日間インキュベートすることによって調製した(56)。小繊維Aβ1-42の形態については、図27を参照されたい。
製造業者のプロトコルに従い、Ultraspec-II RNA試薬(Biotecx Laboratories,Inc.,Houston,TX)を使用して、海馬から全RNAを単離した。混入しているあらゆるゲノムDNAを除去するために、全RNAをDNaseで消化した。RT-PCRは、RT-PCRキット(Clontech,Mountain View,CA)を使用して、前述されたように(23、57)実行した。
DNaseで消化されたRNAは、前述されたように(23、57)、ABI-Prism7700配列検出システム(Applied Biosystems,Foster City,CA)内でリアルタイムPCRによって分析した。
核抽出物を単離し、前述されたように(22、23)、EMSAを実行した。
迷路実験は、本発明者らによって記載されたように(52、57)実施した。簡潔に述べると、バーンズ迷路のために、マウスを2日間連続して訓練し、3日目の試験がそれに続いた。各訓練セッション後、迷路及び脱出トンネルを中性洗剤で徹底的に洗浄し、慣れた物体からのマウスの匂いに起因する本能的な匂い回避を避けた。3日目に、動物が脱出トンネルに入るように動機付けるのに十分な光及び熱を生成する高ワット数の光で迷路を照射し、遅延(4本の足が全て脱出ボックスの床にある前の時間)及び誤り(4本の足が全て脱出ボックスの床にある前の不正確な応答)を測定できるようにした。
他の研究者ら(58)及び本発明者ら(57)によって記載されたように、新規物体認識タスクを実施して短期記憶をモニターした。簡潔に述べると、訓練中、赤外線センサーで囲まれた四角い新規な箱(長さ20インチ×高さ8インチ)にマウスを入れた。互いに18インチ離れた環境の特定の場所に、着色、形状及び質感が変化する2つのプラスチック製の玩具(2.5インチ~3インチ)を配置した。マウスは、環境及び物体を15分間自由に探索でき、次に個々のホームケージに戻された。30分後、マウスは、同じ場所に2つの物体がある環境に戻されたが、今度はなじみ深い物体の1つを第3の新規物体に置き換えた。次に、再び15分間、マウスに両方の物体を自由に探索させた。物体は、中性洗剤で徹底的に洗浄した。
免疫蛍光顕微鏡観察のために、マウスをケタミン-キシラジン注射剤で麻酔し、PBS、次にPBS中の4%(w/v)パラホルムアルデヒドで灌流し、各マウスからの脳の解剖がそれに続いた(23、59)。簡潔に述べると、サンプルを4℃において、0.05%Tween 20(PBST)と10%スクロースとを含有するPBS中で3時間、次に30%スクロースを含有するPBS中で一晩インキュベートした。次に、脳を-80℃でO.C.T(Tissue Tech)に包埋し、従来の凍結切片作成のために処理した。凍結切片(30μm)を冷エタノール(-20℃)で処理し、PBS中の2回の洗浄、PBST中の3%BSAによるブロッキング及び2つの抗体による二重標識がそれに続いた(表S3)。PBST中での3回の洗浄後、切片をCy2及びCy5と共にさらにインキュベートした(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)。サンプルをマウントし、Olympus IX81蛍光顕微鏡下で観察した。タッチカウントモジュールを利用してOlympus Microsuite Vソフトウェアを使用し、カウント分析を実施した。
これは、前述されたように(10、22)、市販のキット(TdT FragELTM,Calbiochem)を使用して実施した。
海馬組織をTBS中で均質化し、×150,000gで30分間ペレット化した。ペレットを3容積(wt/vol元の組織重量)のTBS+1%トリトンX-100に再懸濁し、×150,000gで30分間ペレット化して上清を回収し保存した。製造業者の使用説明(BioLegend)に従ってELISAを実施する前にサンプルのタンパク質濃度をアッセイして10倍に希釈した。
ヒト組織の臨床及び生化学的データは、外れ値、非正規性及び不均等サンプルサイズに対してより堅固なノンパラメトリック検定(すなわちクラスカル・ワリス検定又はフィッシャーの正確確率検定、多重比較のためのダンの補正を伴う)を用いて診断間で比較した。両側スピアマン順位相関は、認知試験スコアとタンパク質光学密度との間の可変的な関連性を評価した。これらの測定基準は、臨床群間で有意差がなかったため、相関関係は、人口統計情報(すなわち年齢、性別など)について調整しなかった。SPSS 19(IBM)を用いて統計学的検定を実施し、有意性はα=.05(両側)に設定した。
ラッシュ大学医療センターのヒト調査委員会は、RROS試験を承認した。米国国立衛生研究所ガイドラインに従い、動物を飼育して実験が実施され、ラッシュ大学医療センター施設内動物管理使用委員会によって承認された。
ADの病態形成におけるTLR2の役割を調べるために、本発明者らは、AD認知症(n=10)、軽度認知機能障害(MCI;n=11)を有して死亡した個人及び認知機能障害がない年齢をマッチさせた個人(NCI;n=12)の33人の対象からの前頭前皮質(PFC; ブロードマン野9)における免疫ブロット分析により、TLR2のレベルをモニターした(表S1)。年齢、性別、死後の間隔、脳重量又はBraakスコアに関して、群間に有意差は認められなかった(表S1)。比較のために、本発明者らは、TLR4を含めた。TLR3以外のTLRは、全てMyD88を用いているため、本発明者らは、MyD88についても調査した。PFCにおけるTLR2及びMyD88の両方のレベルは、群間で有意に変化し、NCI及びMCI症例と比較して、AD症例は、TLR2及びMyD88をより多く発現していた(図1A~C及び表S2)。対照的に、TLR4レベルは、群間に有意差はなかった(図1A及びD;表S2)。スピアマン順位相関は、前頭前皮質のTLR2及びMyD88レベルの両方がBraak病期診断と正に相関することを示した(図1E~F及び表S2)。他方、本発明者らは、TLR4とBraakスコアとの間にいかなる関連性も見いださなかった(図1G及び表S2)。重要なことに、MyD88は、ミニメンタルステート検査(MMSE)及び全体的認知性zスコア(GCS)とも負の相関がある(図1H~M及び表S2)。
次に、本発明者らは、5XFAD Tgマウスの海馬におけるTLR2及びMyD88の状態を調べた。AD対象のCNSで観察されたのと同様に、本発明者らは、Tgマウスの皮質及び海馬の異なる部分において、齢数をマッチさせた非Tgマウスと比較してより高いレベルのTLR2(図9A~B)とMyD88(図10A~B)を認めた。本発明者らは、Tgマウスの大脳皮質と海馬において、Iba-1免疫反応性の増加及び多くのIba-1陽性細胞とTLR2(図9B)及びMyD88(図10B)との共局在も見いだした。ウエスタンブロット実験でも、非Tgマウスと比較して、Tgマウスの海馬でTLR2(図9C~D)及びMyD88(図10C~D)が増加していることが確認された。
TLR2の特異的阻害剤がないことから、本発明者らは、治療目的でTLR2の標的化を試みた。リガンド結合後、TLR2は、MyD88を介して機能する(14、15)。そのため、本発明者らは、剛体タンパク質間相互作用ツールを応用して、TLR2のTLR相互作用ドメイン(TIR)とMyD88との間の相互作用をモデル化した。マウスTLRのTIRの結晶構造が入手できなかったため、本発明者らは、インシリコ相同性モデル化ストラテジーを採用し、全ての異なるTLRからTIRの三次元構造を構築した(図11A~G)。以前の知見(20)と同様に、本発明者らのインシリコモデル化解析から導き出されたMyD88及びTIRの複合体のドッキングポーズは、TLR2のBBループがMyD88のCDループと強いファンデルワールス(VDW)相互作用によって結合していることを明らかにした(図2A)。そのため、本発明者らは、MyD88のTLR2相互作用ドメイン(TIDM)に対応する以下のペプチドをCDループから設計して、TLR2とMyD88との間の相互作用を破壊した。
野生型(wt)TIDM:drqikiwfqnrrmkwkkPGAHQK(配列番号2)
変異型(m)TIDM:drqikiwfqnrrmkwkkPGWHQD(配列番号3)
異なるTLRを発現する小グリア細胞は、神経変性、炎症、ウイルス感染及び細菌感染などの様々な病理学的条件下で活性化される(7、21)。そのため、本発明者らは、TIDMペプチドが、異なる刺激によって誘導される小グリア細胞活性化を抑制できるかどうかを調査した。様々な濃度のwtTIDM及びmTIDMペプチドで1時間前処置された小グリア細胞は、小繊維Aβ1-42(ADの病因試薬)、MPP+(パーキンソン病毒素)、LTA(TLR2の作動薬)、ポリIC(TLR3の作動薬)、LPS(TLR4の作動薬)、フラジェリン(TLR5の作動薬)及びCpG DNA(TLR9の作動薬)で刺激した。予測通り、小繊維Aβ(図4A)、MPP+(図4D)、LTA(図4G)、ポリIC(図14A)、LPS(図4J)、フラジェリン(図4M)及びCpG DNA(図4P)は、小グリア細胞においてNF-κB活性化を誘導した。しかし、wtTIDMペプチドは、小繊維Aβ媒介及びLTA媒介のNF-κB活性化を阻害した(図4A及び4G)。対照的に、wtTIDMペプチドは、小グリア細胞における、MPP+(図4D)、ポリIC(図14A)、LPS(図4J)、フラジェリン(図4M)及びCpG DNA(図4P)によって誘導されるNF-κBの活性化を抑制できないままであった。mTIDMペプチドは、いずれの刺激によって誘導されたNF-κBの活性化にも影響を及ぼさなかったことから、これらの結果は特異的であった。古典的なNF-κB経路の活性化は、IκBαのリン酸化と、それに続くp65及びp50の核転位を伴う。そのため、本発明者らは、活性化された小グリア細胞におけるp65及びp50の核転移に対するwtTIDMペプチドの効果についても調査した。予想通り、小グリア細胞では、小繊維Aβ1-42(図15A~C)及びLPS(図15D~F)に応答して、p65及びp50の核転移が増加していることが観察された。しかし、wtTIDMペプチド処理は、LPS(図15D~F)ではなく、小繊維Aβ1-42(図15A~C)で刺激された小グリア細胞において、p65及びp50の核転移を阻害し、wtTIDMペプチドの特異性が示唆された。これらの結果を確認するために、本発明者らは、NF-κB活性化によって駆動される炎症促進性分子であるIL-1β及びiNOSの発現もモニターした。全ての刺激は、小グリア細胞において、IL-1β及びiNOSの発現を誘導した(図4B~C、4E~F、4H~I、4K~L、4N~O、4Q~R、図13A~F及び図14B~D)。NF-κB活性化に対するwtTIDMの効果と矛盾なく、wtTIDMペプチドは、MPP+(図13B及び図4E~F)、ポリIC(図14B~D)、LPS(図S6D及び図4K~L)、フラジェリン(図13E及び図4N~O)及びCpG DNA(図13F及び図4Q~R)ではなく、小繊維Aβ(図13A及び図4B~C)及びLTA(図13C及び図4H~I)によってのみ誘導される炎症促進性分子の発現を阻害した。これらの結果は、wtTIDMペプチドが、他のTLRではなく、TLR2の作動薬によって誘導される、小グリア細胞炎症を特異的に阻害することを示唆する。
wtTIDMペプチドは、TLR2とMyD88との間の物理的結合を破壊することから、本発明者らは、機械論的な原理証明として、Tlr2-/-小グリア細胞のAβ1-42誘導活性化に対するwtTIDMペプチドの効果を調べた。BV-2小グリア細胞と同様に、小繊維Aβ1-42ペプチドは、WTマウスから単離された初代小グリア細胞においてNF-κBの活性化を強く誘導し、これは、wtTIDMペプチドによって阻害された(図16A)。他方、小繊維Aβ1-42ペプチドは、Tlr2-/-小グリア細胞においてNF-κBのDNA結合活性を弱く誘導した(図16A)。しかし、WT小グリア細胞とは対照的に、wtTIDMペプチドは、Tlr2-/-小グリア細胞における、小繊維Aβ1-42が誘導するNF-κBの活性化を阻害できないままであった(図16A~B)。さらに確認するために、本発明者らは、上清中の一般的な炎症促進性サイトカイン(TNFα及びIL-1β)のレベルも測定した。NF-κB活性化と同様に、小繊維Aβ1-42によるTNFα及びIL-1β産生の誘導は、WT小グリア細胞と比較してTlr2-/-小グリア細胞で低かった(図16C~F)。しかし、wtTIDMペプチドは、Tlr2-/-、小グリア細胞ではなく、WTで、小繊維Aβ1-42ペプチドが誘導するTNFα及びIL-1β産生を阻害した(図16C~F)ことから、wtTIDMペプチドがその機能を示すためにTLR2が必要であることが示唆された。
グリア炎症がAD及び他の神経変性障害における神経細胞の喪失に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある(7、9、22~24)。wtTIDMペプチドは、小繊維Aβ1-42媒介小グリア細胞活性化を特異的に阻害したことから、本発明者らは、5XFADTgマウスにおけるその治療的翻訳可能性を試験することにした。本発明者らは、まず、wtTIDMペプチドが海馬に侵入できるかどうかを判定した。TgマウスをTIDMペプチドの鼻腔内投与で処置し、投与の60分後、本発明者らは、エレクトロスプレーイオン化共役質量分析法により、Tgマウスの海馬中にwtTIDMペプチドを検出した(図5A及びC)。対照的に、生理食塩水処置されたTgマウスの海馬は、wtTIDMペプチドのいかなるピークも示さなかった(図5B)。wtTIDMペプチドのレベルは、生理食塩水処置されたTgマウスでは皆無であったのと比較して、wtTIDM処置されたTgマウスの海馬では、脳組織1グラム当たり23.33±14.14ngであった。赤外線スキャンにより、本発明者らは、鼻腔内処置後の海馬からもTIDMペプチドを検出した(図17)。したがって、鼻腔内投与後、TIDMペプチドは、海馬に侵入する。
神経炎症は、神経細胞のアポトーシスに関連し得るため、次に、本発明者らは、wtTIDMペプチド処置がTgマウスの海馬における神経細胞のアポトーシスを減少できるかどうかを調べた。Tgマウスの海馬では、非Tgマウスと比較して、いくつかのTUNEL陽性体がNeuNと共局在していた(図6A~C)。しかし、mTIDMではなく、wtTIDMペプチドが海馬の神経細胞のアポトーシスを弱めた(図6A~C)。この結果は、切断されたカスパーゼ3の検出によって確認された。予測通り、切断されたカスパーゼ3のレベルは、Tgマウスの海馬において増加した(図6D~E)。しかし、mTIDMではなく、wtTIDMペプチドによるTgマウスの処置は、海馬において切断されたカスパーゼ3の上昇したレベルが減少し(図6D~E)、wtTIDMペプチド処置がTgマウスの海馬における生体内での神経細胞のアポトーシスを減少できることが示唆された。したがって、可塑性関連分子(PSD-95、NR2A及びGluR1)のレベルは、非Tgマウスと比較してTgマウスの海馬で低下した(図6F~I)。しかし、神経細胞アポトーシスの抑制と矛盾なく、mTIDMではなく、wtTIDMペプチドによるTgマウスの処置が海馬における生体内PSD-95、NR2A及びGluR1タンパク質の有意な回復をもたらした(図6F~I)。
wtTIDMペプチドが、生体内でそのその機能を提示するために、実際にTLR2を必要とすることを立証するために、本発明者らは、Tlr2-/-マウスとTgマウスを交配し、Tlr2をヌルにした5XFADマウス(Tg-Tlr2-/-)を作製した。Tlr2ノックダウンは、5XFAD導入遺伝子の挿入又は発現を変化させず、その逆も同様であった(図S24A)。6ヶ月齢WT、Tlr2-/-、Tg及びTg-Tlr2-/-マウスは、総体重又は湿潤脳重量に関して有意差がなかった(図24B~C)。本発明者らはまた、この齢数の遺伝子型間で食事、糞便塊、社会的交流及び興奮をはじめとする顕性表現型のいかなる差異も見いださなかった。wtTIDMペプチドは、Tgマウスにおいて斑負荷を減少させ、空間的学習及び記憶を改善したが(図5~6)、Tg-Tlr2-/-マウスではそれができないままであり(図24D~G)、wtTIDMペプチドは、Tlr2の非存在下で効果がないことが示唆された。
自然免疫経路の重要なメンバーであるMyd88依存型TLR2シグナル伝達は、多様な感染性及び自己免疫障害の病態形成に重要な役割を果たす(31、32)。そのため、本発明者らは、wtTIDMペプチドの機能が5XFADマウスのみに限定されるか又は他の疾患モデルでも機能するかどうかを調べた。EAEは、多発性硬化症(MS)の広く使用されている動物モデルであり、EAEの慢性型は、MOG35-55で免疫化されたオスのC57/BL6マウスにおいてモデル化される。5XFADマウスにおけるその効果と同様に、wtTIDMペプチドを用いたEAEマウスの鼻腔内投与は、EAEの臨床症状を強く阻害した(図7A)。ダネットの多重比較分析で群間の平均値を比較する間、本発明者らは、EAEとEAE+wtTIDMとの間に平均値の有意差があることを見いだした(調整後p<0.001)。他方、mTIDMペプチドは、効果がなく(図7A)、効果の特異性が示唆された。予測通り、EAEの誘導は、ヒートマップ解析(図7B)、移動距離(図7C)、立ち上がり行動(図7D)、速度(図7E)及び加速度(図7F)によって明らかなように、マウスの自発運動活性を低下させた。足跡解析(図25)も、正常なマウスと比較して、EAEマウスにおける歩幅(図7G)、及び点長さ(図7H)の減少、及び揺れ長さ(図7I)、及びつま先の広がり(図7J)の増加を示した。本発明者らは、EAEマウスで足指の引きずりが頻繁であることも見いだした(図25)。しかし、mTIDMではなく、wtTIDMペプチドによる鼻腔内処置は、EAEマウスの自発運動活性を改善し、足跡を正常化した(図7A~K及び図25)。CIAは、広く使用されているリウマチ様関節炎の動物モデルである。EAEマウスと同様に、mTIDMではなく、wtTIDMペプチドがマウスにおけるCIAの臨床症状も減少させた(図7L)。ダネットの多重比較分析で群間の平均値を比較する間、本発明者らは、CIAとCIA+wtTIDMとの間に平均値の有意差があることを見いだした[調整後p=0.0148(<0.05)]。wtTIDMペプチドはまた、自発運動活性を増強し(図7N~R)、足跡の挙動を改善した(図7S~V及び図26)。
パーキンソン病(PD)の病理学的所見としては、SNpcのドーパミン作動性神経細胞の選択的喪失と、生き残った神経細胞中のレビー小体型のα-synタンパク質の細胞質内凝集の存在とが挙げられる。PDに加えて、α-synの蓄積は、レビー小体型認知症(DLB)及び多系統萎縮症(MSA)の重要な病理学的特徴でもある。したがって、レビー小体の病理を減少させることは、PD、DLB及びMSAにおいて治療的に重要である。小グリア細胞の活性化は、レビー小体疾患の病態形成に重要な役割を果たしており、小繊維α-synは、小グリア細胞の活性化のためにTLR2を必要とすることが示されている。最近、本発明者らは、MyD88のTLR2相互作用ドメイン(TIDM)に対応するペプチドがTLR2の活性化を選択的に阻害することを実証している。この研究は、α-シヌクレイン症の軽減におけるTIDMペプチドの重要性を強調する。野生型(wt)TIDMペプチドの鼻腔内投与は、A53T遺伝子組換えマウスの黒質における誘導性酸化窒素シンターゼ(iNOS)の小グリア細胞発現を減少させた(図28A~B)。wtTIDMペプチドは、iNOSの発現を阻害したが、本発明者らは、wtTIDM処置後、A53Tマウスの黒質におけるアルギナーゼ-1の増加を観察し(図29A~B)、wtTIDMペプチドにより、小グリア細胞活性化がM1からM2モードに切り替えることが示唆された。wtTIDMペプチドによるA53Tマウスの毎日の鼻腔内処置はまた、オリゴマー及びモノマーα-synの減少(図30A~C)並びにチロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミン作動性神経細胞内のα-syn封入体の抑制(図31A~D)をもたらした。本発明者らは、wtTIDMペプチド処置後、A53Tマウスの黒質における小グリア細胞α-synの減少も観察した(図32A~B)。最終的に、wtTIDMペプチド処置は、A53Tマウスの自発運動活性を改善した(図33A~E)。変異TIDMペプチドは、A53Tマウスでいかなるこのような保護効果も示さなかったため、これらの結果は、特異的であった。したがって、wtTIDMペプチドの鼻腔内処置は、PD、MSA及びDLBに有益であり得る。
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Claims (23)
- 患者における障害を治療する方法であって、前記治療を必要とする前記患者に、治療的有効量の、MyD88のTLR2相互作用ドメインを含むペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、前記治療的有効量は、少なくともTLR2-MyD88シグナル伝達を減少させる量であり、前記障害は、TLR2-MyD88シグナル伝達が疾患の病態形成において役割を果たすものである、方法。
- 前記MyD88のTLR2相互作用ドメインは、配列PGAHQK(配列番号1)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MyD88のTLR2相互作用ドメインは、6~10個のアミノ酸を含有する、請求項2に記載の方法。
- 前記ペプチドは、アンテナペディアホメオドメインをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記アンテナペディアホメオドメインは、MyD88のTLR2相互作用ドメインを含む前記ペプチドのC末端に連結する、請求項3に記載の方法。
- ペプチド配列は、drqikiwfqnrrmkwkkpgahqk(配列番号2)である、請求項2に記載の方法。
- 前記ペプチドは、細胞内送達細胞及び血液脳関門を越えるアクセスの少なくとも1つを提供する送達ベクターに連結する、請求項1に記載の方法。
- 前記送達ベクターは、アンテナペディアホメオドメインであり、前記送達ベクターは、前記MyD88のTLR2相互作用ドメインを含む前記ペプチドのC末端に連結する、請求項7に記載の方法。
- 前記障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病及び多系統萎縮症からなる群から選択される神経学的障害である、請求項1に記載の方法。
- 前記障害は、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、ウイルス感染症、敗血症及び脳膿瘍からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記障害は、多発性硬化症及びリウマチ様関節炎からなる群から選択される自己免疫障害である、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物は、鼻腔内投与される、請求項12に記載の方法。
- 前記組成物は、経口、皮下、関節内、皮内、静脈内、腹腔内及び筋肉内経路からなる群から選択される経路によって投与される、請求項12に記載の方法。
- 前記患者は、ヒト患者である、請求項1に記載の方法。
- 患者における障害を治療する方法であって、前記治療を必要とする前記患者に、治療的有効量の、配列PGAHQK(配列番号1)を含むペプチドを含む組成物を投与するステップを含み、前記治療的有効量は、少なくともTLR2-MyD88シグナル伝達を減少させる量であり、前記障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ハンチントン病及び多系統萎縮症からなる群から選択される神経学的障害である、方法。
- 前記ペプチドは、6~10個のアミノ酸を含有する、請求項16に記載の方法。
- 前記ペプチドは、アンテナペディアホメオドメインをさらに含む、請求項17の方法。
- 前記アンテナペディアホメオドメインは、前記配列PGAHQK(配列番号1)のC末端に連結する、請求項18に記載の方法。
- ペプチド配列は、drqikiwfqnrrmkwkkpgahqk(配列番号2)である、請求項19に記載の方法。
- 細胞内送達細胞及び血液脳関門を越えるアクセスの少なくとも1つを提供する送達ベクターに連結されるペプチド配列PGAHQK(配列番号1)を含む組成物。
- 前記送達ベクターは、アンテナペディアホメオドメインである、請求項21に記載の組成物。
- ペプチド配列drqikiwfqnrrmkwkkpgahqk(配列番号2)を含む、請求項22に記載の組成物。
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