JP2022166650A

JP2022166650A - Method for producing inner ear cell

Info

Publication number: JP2022166650A
Application number: JP2021072002A
Authority: JP
Inventors: 和作神谷; Kazusaku Kamiya; 一朗福永; Ichiro Fukunaga
Original assignee: Juntendo University
Current assignee: Juntendo University
Priority date: 2021-04-21
Filing date: 2021-04-21
Publication date: 2022-11-02

Abstract

To provide a method for efficiently producing an inner ear cell having connexin 26 gap junction from a pluripotent stem cell.SOLUTION: A method for producing an inner ear cell having connexin 26 gap junction includes culturing an embryoid body, which is a pluripotent stem cell cultured in the presence of insulin, in the presence of a cochlea-derived feeder cell.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、コネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞の新たな製造法に関する。 The present invention relates to a new method for producing inner ear cells with connexin 26 gap junctions.

難聴は、最もよくみられる先天性感覚障害であり、約１０００人に１人は、出生時又は幼児期に重度の難聴を発症し、これは言語習得時前難聴と定義されており、その約半分は遺伝的要因によるものである。同定された遺伝子座と関連して１００以上の形式の非症候性難聴があることが知られている。
コネキシン２６（ＣＸ２６）をコードするギャップ結合ベータ２遺伝子（Ｇｊｂ２）における変異は、非症候性感音性難聴の原因の５０％を占める。Ｇｊｂ２及びＧｊｂ６にコードされるＣＸ２６及びＣＸ３０は、集合し細胞間のギャップ結合形成に関わる。これらのコネキシンは、蝸牛で最も豊富に発現するギャップ結合形成タンパク質の２つである。
ギャップ結合は、蝸牛有毛細胞からのＫ+イオンの急速な除去を促進し、Ｋ+を内リンパに戻すことによって、蝸牛の恒常性が維持される。ＣＸ２６及びＣＸ３０は、多くの蝸牛ギャップ結合プラーク（ＧＪＰｓ）及びインビトロの実験において、異種及び異型チャンネルを形成する。本発明者の最近の研究では、ＣＸＧＪＰの崩壊がＧＪＢ２関連難聴発症に関し、蝸牛ＧＪＰの集合がＣＸ２６に依存することが分かった（非特許文献１）。また、アデノ関連性ウイルスを使用したＧｊｂ２の蝸牛遺伝子導入により、顕著にＧＪＰ形成及び聴覚機能が改善したことを報告した（非特許文献２）。本発明者は、また骨髄間葉系幹細胞を用いた内耳細胞治療のための新たな戦略を開発した（非特許文献３）。
さらに、本発明者らは、マウスｉＰＳＣなどの多能性幹細胞を、ＢＭＰ、ＴＧＦ－β１受容体阻害剤及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上の添加剤との存在下に培養して得られた胚様体を、蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に培養すれば、ＣＸ２６ギャップ結合を有する内耳細胞が製造できることを報告した（非特許文献４、特許文献１）。 Hearing loss is the most common congenital sensory disorder, with about 1 in 1000 people developing severe hearing loss at birth or in early childhood, defined as preverbal hearing loss, of which about Half are due to genetic factors. Over 100 forms of non-syndromic hearing loss are known to be associated with identified loci.
Mutations in the gap junction beta2 gene (Gjb2), which encodes connexin 26 (CX26), account for 50% of non-syndromic sensorineural hearing loss. CX26 and CX30, encoded by Gjb2 and Gjb6, assemble and participate in intercellular gap junction formation. These connexins are two of the most abundantly expressed gap junction forming proteins in the cochlea.
Gap junctions maintain cochlear homeostasis by facilitating the rapid removal of K + ions from cochlear hair cells and returning K + to the endolymph. CX26 and CX30 form heterologous and heterotypic channels in many cochlear gap junction plaques (GJPs) and in vitro experiments. Our recent study found that disruption of CX GJP is associated with GJB2-associated deafness development, and cochlear GJP assembly is dependent on CX26 (Non-Patent Document 1). They also reported that cochlear gene transfer of Gjb2 using adeno-associated virus significantly improved GJP formation and auditory function (Non-Patent Document 2). The present inventor also developed a new strategy for inner ear cell therapy using bone marrow mesenchymal stem cells (Non-Patent Document 3).
Furthermore, the present inventors obtained by culturing pluripotent stem cells such as mouse iPSCs in the presence of one or more additives selected from BMP, TGF-β1 receptor inhibitors and FGF. It has been reported that inner ear cells having CX26 gap junctions can be produced by culturing the obtained embryoid bodies in the presence of cochlea-derived feeder cells (Non-Patent Document 4, Patent Document 1).

国際公開第２０１７／１４６０３５号パンフレットInternational Publication No. 2017/146035 Pamphlet

Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４，１５９８－１６０７（２０１４）J. Clin. Invest. 124, 1598-1607 (2014) Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２４，３６５１－３６６１（２０１５）Hum. Mol. Genet. 24, 3651-3661 (2015) Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７１，２１４－２２６（２００７）Am. J. Pathol. 171, 214-226 (2007) ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ（２０１６）７（６），１０２３－１０３６Stem Cell Reports (2016) 7(6), 1023-1036

しかしながら、本発明者らが以前に報告した多能性幹細胞からＣＸ２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法は、収率の点で未だ十分ではなく、さらに効率的なＣＸ２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法の提供が望まれる。 However, the method for producing inner ear cells with CX26 gap junctions from pluripotent stem cells previously reported by the present inventors is still insufficient in terms of yield. It would be desirable to provide a manufacturing method.

そこで本発明者は、多能性幹細胞から胚様体への分化誘導の際の添加剤について検討した結果、従来使用していたＢＭＰ、ＴＧＦ－β１受容体阻害剤、ＦＧＦなどの増殖因子や成長因子に代えてインスリンの存在下に多能性幹細胞を培養して胚様体を形成し、次いで当該胚様体を蝸牛由来のフィーダー細胞の存在下に培養すれば、ＣＸ２６ギャップ結合を有する内耳細胞が高い効率で得られることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventors investigated additives for inducing differentiation from pluripotent stem cells to embryoid bodies, and found that conventionally used growth factors such as BMP, TGF-β1 receptor inhibitors, and FGF, and growth factors such as By culturing pluripotent stem cells in the presence of insulin instead of factors to form embryoid bodies, and then culturing the embryoid bodies in the presence of cochlea-derived feeder cells, inner ear cells with CX26 gap junctions can be obtained with high efficiency, and completed the present invention.

すなわち、本発明は、次の［１］～［４］を提供するものである。 That is, the present invention provides the following [1] to [4].

［１］インスリンの存在下に多能性幹細胞を培養して得られた胚様体を、蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に培養することを特徴とする、コネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法。
［２］蝸牛由来フィーダー細胞が、蝸牛細胞をトリプシン処理した後、培養によりコロニーを形成した細胞である［１］記載の内耳細胞の製造法。
［３］多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞である［１］又は［２］記載の内耳細胞の製造法。
［４］多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である［１］～［３］のいずれか１項記載の内耳細胞の製造法。 [1] Production of inner ear cells having connexin 26 gap junctions, characterized by culturing embryoid bodies obtained by culturing pluripotent stem cells in the presence of insulin in the presence of cochlea-derived feeder cells law.
[2] The method for producing inner ear cells according to [1], wherein the cochlear-derived feeder cells are cells formed by culture to form colonies after trypsinizing cochlear cells.
[3] The method for producing inner ear cells according to [1] or [2], wherein the pluripotent stem cells are iPS cells or ES cells.
[4] The method for producing inner ear cells according to any one of [1] to [3], wherein the pluripotent stem cells are human iPS cells or human ES cells.

本発明方法により得られる内耳細胞は、蝸牛と同様にＣＸ２６及びＣＸ２６を含有するギャップ結合プラークを形成するとともに、耳前駆細胞のマーカーであるＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＧＡＴＡ３をアップレギュレートしており、蝸牛細胞のマーカーであるＣＸ３、ＳＯＸ２、ＳＰＡＲＣＬ１、ＫＣＣ３、ＫＩＡＡ１１９９、ＭＩＡ、ＯＴＯＲを発現している。また、難聴患者ｉＰＳＣ由来のコネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞を製造し、ＧＪＢ２関連難聴の病態を再現することができた。従って、本発明により得られる内耳細胞を用いれば、ＧＪＢ２変異型難聴の遺伝性難聴の薬剤のスクリーニング、内耳再生医療に応用可能である。 The inner ear cells obtained by the method of the present invention form gap junction plaques containing CX26 and CX26, as in the cochlea, and upregulate GJB2, GJB6, PAX2, PAX8, and GATA3, markers of ear progenitor cells. They express cochlear cell markers CX3, SOX2, SPARCL1, KCC3, KIAA1199, MIA, and OTOR. In addition, inner ear cells with connexin 26 gap junctions derived from iPSCs of hearing-impaired patients were produced, and the pathology of GJB2-associated hearing loss could be reproduced. Therefore, the use of the inner ear cells obtained by the present invention can be applied to the screening of drugs for hereditary deafness of GJB2 mutant deafness and inner ear regenerative medicine.

インスリンによる処理が、ｉＰＳＣｓにおけるＧＪＢ２／ＧＪＢ６遺伝子及び耳前駆体マーカー遺伝子を誘導することを示す。（Ａ）ＳＦＥＢｑ培養におけるヒトｉＰＳＣからのＣＸ２６発現細胞の分化の手順。（Ｂ）ＮＡＮＯＧ、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、及びＧＡＴＡ３の発現について、未分化ヒトｉＰＳＣ（０日目）及びｉＰＳＣ由来集合体（７日目）に関する定量的ＰＣＲ分析（２回から４回の独立した実験からｎ = ４）。ｍＲＮＡ発現レベルは、インスリンなしでの７日目集合体（Ｉｎｓ（－））に対して計算した。ＳＦ：ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ；Ｙ：Ｙ－２７６３２；Ｉｎｓ：インスリン。統計学的有意差はＳｃｈｅｆｆｅの多重比較検定により決定した。平均値±標準誤差（ＳＥ）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Insulin treatment induces GJB2/GJB6 genes and otic progenitor marker genes in iPSCs. (A) Procedure for differentiation of CX26-expressing cells from human iPSCs in SFEBq culture. (B) Quantitative PCR analysis of undifferentiated human iPSCs (day 0) and iPSC-derived aggregates (day 7) for expression of NANOG, GJB2, GJB6, PAX2, PAX8, and GATA3 (2–4 rounds of n = 4 from independent experiments). mRNA expression levels were calculated relative to day 7 aggregates without insulin (Ins(-)). SF: StemFit AK02N; Y: Y-27632; Ins: insulin. Statistical significance was determined by Scheffe's multiple comparison test. Mean±standard error (SE), *p<0.05, **p<0.01. インスリンによる処理が、ｉＰＳＣｓにおけるＣＸ２６発現細胞を誘導することを示す。（Ａ→Ｄ）７日目のＣＸ２６（赤色）の免疫染色は凝集している。矢印はＣＸ２６＋小胞を示す。枠線（Ａ）と（Ｂ）の領域をそれぞれ（Ｃ）と（Ｄ）で拡大してある。（Ｅ）７日目凝集体のｍｍ３当たりのＣＸ２６＋小胞の数（ｎ＝９又は２又は３からの１５の凝集体）（独立実験）。（Ｆ）７日目のＣＸ２６＋小胞の平均直径は凝集する（ｎ＝８又は３個からの２０個のＣＸ２６＋小胞）（独立実験）。（Ｇ）７日目のＣＸ２６＋小胞から成る細胞の平均数は、３つの独立した実験からの集合体（ｎ＝１２のＣＸ２６＋小胞）であった。（Ｈ）７日目の集合体におけるＣＸ２６陽性細胞対ＣＸ２６陰性細胞の割合（７日目からｎ＝９又は１４）２から３つの独立した実験）の集合体。白色のカラムはＣＸ２６陰性（ＣＸ２６－）細胞である。黒いカラムはＣＸ２６陽性（ＣＸ２６＋）細胞である。（Ｉ～Ｎ）７日目のＣＸ２６＋小胞上のＣＸ２６（赤色）とＦ－ＡＣＴＩＮ（緑）の免疫染色は凝集する。核ＤＡＰＩによる対比染色（Ｌ～Ｎで青）。（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｌ）、（Ｍ）の四角で囲んだ部分を（Ｊ）で拡大し、（Ｋ）、（Ｍ）それぞれ（Ｎ）（Ｏ,Ｐ）ＧＪＰを示す。３次元画像を（Ｍ）の画像から再構成した。矢印はＧＪＰを指す。スケールバー：２００μｍ（ＡとＢ）；５０μｍ（ＣとＤ）；２０μｍ（ＩとＬ）；１０μｍ（Ｊ、Ｍ、Ｐ）、５μｍ（Ｋ、Ｎ、Ｏ）。統計学的有意差はスチューデントｔ検定、平均±ＳＥ； *ｐ＜０．０５； **** ｐ＜０．０１。Insulin treatment induces CX26-expressing cells in iPSCs. (A→D) Immunostaining of CX26 (red) on day 7 is aggregated. Arrows indicate CX26+ vesicles. The areas of frame lines (A) and (B) are enlarged in (C) and (D), respectively. (E) Number of CX26+ vesicles per mm3 of day 7 aggregates (n=15 aggregates from 9 or 2 or 3) (independent experiments). (F) Mean diameter of CX26+ vesicles on day 7 aggregates (n=8 or 20 CX26+ vesicles from 3) (independent experiments). (G) Average number of cells composed of CX26+ vesicles on day 7 was aggregates (n=12 CX26+ vesicles) from three independent experiments. (H) Percentage of CX26-positive vs. CX26-negative cells in day 7 aggregates (n=9 or 14 from day 7) aggregates from 2 to 3 independent experiments. White columns are CX26 negative (CX26-) cells. Black columns are CX26 positive (CX26+) cells. (IN) Aggregate immunostaining of CX26 (red) and F-ACTIN (green) on day 7 CX26+ vesicles. Counterstaining with nuclear DAPI (blue for LN). (I), (J), (L), and (M) are enlarged by (J), and (K) and (M) show (N) (O, P) GJP, respectively. A three-dimensional image was reconstructed from the images in (M). Arrows point to GJP. Scale bars: 200 μm (A and B); 50 μm (C and D); 20 μm (I and L); 10 μm (J, M, P), 5 μm (K, N, O). Student's t-test, mean ± SE; *p < 0.05; ****p < 0.01. 付着培養上のｉＣＸ２６ＧＪＣの増殖を示す。（Ａ）付着培養を用いたヒトｉＰＳＣ集合体からのｉＣＸ２６ＧＪＣの増殖のための手順。（Ｂ）２１日目の付着培養物からの位相差顕微鏡（ＰＣＭ）画像。（Ｃ）ＣＸ２６（赤色）とＰＣＭ（白色）の染色（Ｂ）の枠付き領域の拡大図。（Ｄ～Ｇ）ＣＸ２６（赤色）とＦ－ＡＣＴＩＮ（緑）の染色。（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）の四角で囲んだ領域を拡大して示す。（Ｅ）、（Ｆ）それぞれ（Ｇ）、及び（Ｇ）（ＨとＩ）ＣＸ２６（赤色）とＤＡＰＩ（青）の染色（Ｈ）、（Ｆ）と（Ｇ）では（Ｉ）と（Ｈ）は同じ領域である。枠線（Ｈ）の領域を（Ｉ）で拡大する。（Ｊ，Ｋ）ＧＪＰを示す３次元画像を（Ｉ）の画像から再構成した。矢頭ＧＪＰを指摘する。スケールバー（Ｂ）；１００μｍ、（Ｄ）；５０μｍ、（Ｃ及びＥ）；１０μｍ、（Ｆ及びＨ）；５μｍ（Ｇ及びＩ～Ｋ）Growth of iCX26GJC on adherent culture is shown. (A) Procedure for expansion of iCX26GJC from human iPSC aggregates using adherent culture. (B) Phase-contrast microscopy (PCM) images from day 21 adherent cultures. (C) Magnification of the boxed area of (B) staining for CX26 (red) and PCM (white). (DG) CX26 (red) and F-ACTIN (green) staining. (D), (E), and (F) are shown by enlarging the areas enclosed by the squares. (E), (F) respectively (G), and (G) (H and I) CX26 (red) and DAPI (blue) staining (H), (F) and (G) (I) and (H) ) are in the same region. The area of the frame line (H) is enlarged with (I). (J,K) A three-dimensional image showing GJP was reconstructed from the image in (I). Point out the arrow head GJP. Scale bar (B); 100 μm, (D); 50 μm, (C and E); 10 μm, (F and H); 5 μm (G and I to K) 付着性で増殖したｉＣＸ２６ＧＪＣにおける既知蝸牛マーカーの免疫染色と遺伝子発現を示す。（Ａ～Ｇ）ＣＸ２６（赤色）とＣＸ３０（Ａ、緑）、ＳＯＸ２（Ｂ、緑）、ＳＰＡＲＣＬ１（Ｃ、緑）、ＳＬＣ１２Ａ６（ＫＣＣ３；Ｄ、緑）、Ｐａｎ-ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（Ｐ-ＣＫ；Ｅ、緑）、ＣＫ８（Ｆ、緑）、ＣＫ１８（Ｇ、緑）の核はＤＡＰＩ（青）で染色した。（Ｈ）発現のための未分化ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）及びｉＣＸ２６ＧＪＣに関する定量的ＰＣＲ分析。ＮＡＮＯＧ, ＳＯＸ２, ＫＩＡＡ１１９９, ＳＰＡＲＣｌ１, ＭＩＡ,及びＯＴＯＲ（２回から３回の独立した実験からｎ=４)。ｍＲＮＡ発現レベルは、未分化ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）に対して計算した。スケールバー（Ａ～Ｇ）２０μｍ（Ａ：２列目、３列目、４列目）１０μｍ。統計学的有意差はスチューデントｔ検定、平均±ＳＥ； *ｐ＜０．０５； ** ｐ＜０．０１で決定した。Immunostaining of known cochlear markers and gene expression in iCX26GJCs grown adherently are shown. (A-G) CX26 (red) and CX30 (A, green), SOX2 (B, green), SPARCL1 (C, green), SLC12A6 (KCC3; D, green), Pan-cytokeratin (P-CK; E, Nuclei of CK8 (F, green), CK18 (G, green) were stained with DAPI (blue). (H) Quantitative PCR analysis on undifferentiated human iPSCs (hiPSCs) and iCX26GJCs for expression. NANOG, SOX2, KIAA1199, SPARC11, MIA, and OTOR (n=4 from two to three independent experiments). mRNA expression levels were calculated for undifferentiated human iPSCs (hiPSCs). Scale bar (AG) 20 μm (A: 2nd, 3rd, 4th rows) 10 μm. Statistical significance was determined by Student's t-test, mean ± SE; *p < 0.05; **p < 0.01. 正常又は患者ｉＰＳＣ由来ｉＣＸ２６ＧＪＣにおけるＣＸ３０ＧＪＰ形成及びＧＪＰ長さを示す。（Ａ）これらｉＣＸ２６ＧＪＣが由来した個人の家族歴。四角は男性を示す。家族；円は女性を示す；塗りつぶした形状は診断された家族を示す。（Ｂ及びＣ）患者１（Ｂ）及び患者２（Ｃ）の聴力検査表現型は、重度の難聴を示す。（Ｄ）通常（２０１Ｂ７）又は患者（ＧＰ０５-２３５ｄｅｌＣ、ＧＰ０６-２３５ｄｅｌＣ）ｉＰＳＣによるｉＣＸ２６ＧＪＣの形成。これらの試料を抗ＣＸ２６（赤色）及び抗ＣＸ３０（緑）抗体で共標識した。（Ｅ）単一細胞境界に沿った最大のＧＪＰの長さ（平均±ＳＥ、ｎ = ２７、３０、３個からの３７個の細胞境界）４つの独立した実験）。統計学的有意差はＳｃｈｅｆｆｅの多重比較検定により決定した。平均値±標準誤差、*ｐ＜０．０５、** ｐ＜０．０１。CX30 GJP formation and GJP length in normal or patient iPSC-derived iCX26GJCs. (A) Family history of individuals from whom these iCX26GJCs were derived. Squares indicate males. Families; circles indicate females; filled shapes indicate diagnosed family members. (B and C) Audiometry phenotypes of patient 1 (B) and patient 2 (C) show severe hearing loss. (D) Formation of iCX26GJC by normal (201B7) or patient (GP05-235delC, GP06-235delC) iPSCs. These samples were co-labeled with anti-CX26 (red) and anti-CX30 (green) antibodies. (E) Maximum GJP length along a single cell boundary (mean ± SE, n = 27, 30, 37 cell boundaries from 3 4 independent experiments). Statistical significance was determined by Scheffe's multiple comparison test. Mean±s.e.m., *p<0.05, **p<0.01. 細胞のスクレープ‐ローディング及びその後の定量分析後の色素転写を示す。（Ａ～Ｏ）スクレープ負荷後の培養細胞のデジタル蛍光画像。健常なヒトｉＰＳＣｓ（２０１Ｂ７）（Ａ～Ｃ）、フィーダー細胞（ＴＲＩＣｓ）（Ｄ～Ｆ）、健常なヒトｉＰＳＣｓ（２０１Ｂ７-ｉＣＸ２６ＧＪＣｓ）（Ｇ～Ｉ）から誘導されたｉＣＸ２６ＧＪＣｓ、健常な対照として患者１のｉＰＳＣｓ（ＧＰ５-２３５ｄｅｌＣ-ｉＣＸ２６ＧＪＣｓ）（Ｊ～Ｌ）及び患者２のｉＰＳＣｓ（ＧＰ６-２３５ｄｅｌＣ-ｉＣＸ２６ＧＪＣｓ）（Ｍ～Ｏ）から誘導されたｉＣＸ２６ＧＪＣｓを含むｉＰＳＣ由来の付着培養。（Ａ, Ｄ, Ｇ, Ｊ, Ｍ）ルシファーイエローを用いた色素転写（Ｂ, Ｅ, Ｈ, Ｋ, Ｎ）。以下を示す擬似カラー画像。上図と同じ領域の低(黒)信号強度から高(赤色)信号強度への転写範囲画像。（Ｃ, Ｆ, Ｉ, Ｌ, Ｏ）同部位の位相差顕微鏡観察の画像を示す。（Ｐ）スクレープ負荷後の細胞間色素転写の定量分析。カラムは平均値を表す。スクラップラインからの染料移動距離（ＴＲＩＣｓと無差別２０１Ｂ７：５個の独立した実験からｎ=４０；２０１Ｂ７－ｉＣＸ２６ＪＣｓ、ＧＰ５－２３５ｄｅｌＣ-ｉＣＸ２６ＪＣｓ、ＧＰ６-２３５ｄｅｌＣ－ｉＣＸ２６ＪＣｓ：ｎ＝４０、２、３回の独立した実験から）。統計学的有意差はＳｃｈｅｆｆｅの多重比較検定で求めた。平均±ＳＥ;異なる文字（ａ～ｃ）は有意差を表し、ｐ＜０．０１。スケールバーは５０ｍを表す。Dye transfer after scrape-loading of cells and subsequent quantitative analysis is shown. (AO) Digital fluorescence images of cultured cells after scrape loading. Healthy human iPSCs (201B7) (AC), feeder cells (TRICs) (DF), iCX26GJCs derived from healthy human iPSCs (201B7-iCX26GJCs) (GI), patient 1 as a healthy control. iPSC-derived adherent cultures containing iPSCs (GP5-235delC-iCX26GJCs) (JL) and iCX26GJCs derived from patient 2 iPSCs (GP6-235delC-iCX26GJCs) (MO). (A, D, G, J, M) Dye transfer using Lucifer Yellow (B, E, H, K, N). Pseudocolor image showing: Transfer area image from low (black) signal intensity to high (red) signal intensity for the same area as above. (C, F, I, L, O) Images of the same sites observed with a phase-contrast microscope. (P) Quantitative analysis of intercellular dye transfer after scrape loading. Columns represent mean values. Dye migration distance from scrap line (TRICs and indiscriminate 201B7: n=40 from 5 independent experiments; from an independent experiment). Statistical significance was determined by Scheffe's multiple comparison test. Mean±SE; different letters (ac) represent significant differences, p<0.01. Scale bar represents 50 m. ＢＭＰ及び／又はＳＢ処理による、ヒトｉＰＳＣ培養からＣＸ２６発現細胞への分化の手順を示す。７日目にｇｆＣＤＭにＢＭＰ４（１０ｎｇ/ｍｌ）及び／又はＳＢ（１０μｍ）を添加した。FIG. 1 shows the procedure for differentiation from human iPSC cultures to CX26-expressing cells by BMP and/or SB treatment. BMP4 (10 ng/ml) and/or SB (10 μm) were added to gfCDM on day 7. ＢＭＰ及び／又はＳＢ処理による、ＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ培養におけるＣＸ２６発現細胞の誘導を促進しないことを示す。ＧＪＢ２（Ｂ）及びＧＪＢ６（Ｃ）（３つの独立した実験からｎ=３）の発現について、７日目の（Ｂ及びＣ）ｑＰＣＲ分析。（Ｄ→Ｉ）７日目のＣＸ２６（赤：Ｄ→Ｆ）とＦ－ＡＣＴＩＮ（緑：Ｇ→Ｉ）の免疫染色は集合体。矢印はＣＸ２６陽性小胞を示す。（Ｊ）７日目のＣＸ２６陽性小胞の平均は凝集する（３つの独立した実験からのｎ＝８－１６凝集体）。ＢＭＰ、ＢＭＰ４、ＳＢ、ＳＢ４３１５４２．各棒は平均±ＳＥを表す。検体間の差は、一元配置分散分析及びシェフェの多重比較検定により評価した；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。BMP and/or SB treatment does not promote induction of CX26-expressing cells in SFEBq/gfCDM cultures. (B and C) qPCR analysis at day 7 for expression of GJB2 (B) and GJB6 (C) (n=3 from 3 independent experiments). (D→I) Aggregate immunostaining of CX26 (red: D→F) and F-ACTIN (green: G→I) on day 7. Arrows indicate CX26-positive vesicles. (J) Average of CX26-positive vesicles on day 7 aggregates (n=8-16 aggregates from 3 independent experiments). BMP, BMP4, SB, SB431542. Each bar represents the mean ± SE. Differences between subjects were assessed by one-way ANOVA and Scheffe's multiple comparison test; *p < 0.05; **p < 0.01. 培養７日目集合体の形態を示す。（Ａ）０日目または７日目の形態が凝集する。インスリン（－）を含まないｇｆＣＤＭにおけるヒトｉＰＳＣ凝集体の分化は、インスリン（＋）を伴うｇｆＣＤＭよりも細胞破片を産生した。（Ｂ）７日目の直径は（＋）インスリンの有無にかかわらず凝集する。（３つの独立した実験からのｎ＝３０集計）統計学的有意差はスチューデントｔ検定、平均±ＳＥ＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１により決定した。スケールバー：２００μｍ（Ａ）。The morphology of aggregates on day 7 of culture is shown. (A) Day 0 or day 7 morphologies are aggregated. Differentiation of human iPSC aggregates in gfCDM without insulin (-) produced more cell debris than gfCDM with insulin (+). (B) Diameter at day 7 (+) aggregates with or without insulin. (n=30 aggregates from 3 independent experiments) Statistical significance was determined by Student's t-test, mean±SE *p<0.05; **p<0.01. Scale bar: 200 μm (A). ヒトｉＰＳＣ培養からのＣＸ２６発現細胞の分化の手順を示す。７日目にｇｆＣＤＭにＢＭＰ４（１０ｎｇ/ｍｌ）及び／又はＳＢ（１０μＭ）を添加した。FIG. 2 shows the procedure for differentiation of CX26-expressing cells from human iPSC cultures. BMP4 (10 ng/ml) and/or SB (10 μM) were added to gfCDM on day 7. ＢＭＰ及び／又はＳＢによる処理は、インスリンによるＳＦＥＢｑ／ｇｆＣＤＭ培養におけるＣＸ２６発現細胞の誘導を促進しないことを示す。ＧＪＢ２（Ｂ）及びＧＪＢ６（Ｃ）（４つの独立した実験からｎ=４）の発現について、７日目の（Ｂ及びＣ）ｑＰＣＲ分析。（Ｄ→Ｉ）７日目のＣＸ２６（赤：Ｄ→Ｆ）とＦ－ＡＣＴＩＮ（緑：Ｇ→Ｉ）の免疫染色は集合体。矢印はＣＸ２６陽性小胞を示す。（Ｊ）７日目のＣＸ２６陽性小胞の平均は凝集する（３つの独立した実験からのｎ＝８－１６凝集体)。インスリン（Ｉｎｓ, Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ＢＭＰ、ＢＭＰ４、ＳＢ、ＳＢ４３１５４２.各棒は平均±ＳＥを表す。検体間の有意差は、一元配置分散分析及びシェフェの多重比較検定により評価した；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１We show that treatment with BMP and/or SB does not promote the induction of CX26-expressing cells in SFEBq/gfCDM cultures with insulin. (B and C) qPCR analysis at day 7 for expression of GJB2 (B) and GJB6 (C) (n=4 from 4 independent experiments). (D→I) Aggregate immunostaining of CX26 (red: D→F) and F-ACTIN (green: G→I) on day 7. Arrows indicate CX26-positive vesicles. (J) Average of CX26-positive vesicles on day 7 aggregates (n=8-16 aggregates from 3 independent experiments). Ins, Insulin, BMP, BMP4, SB, SB431542. Each bar represents the mean ± SE. Significant differences between samples were assessed by one-way ANOVA and Scheffe's multiple comparison test; *p < 0.05; **p < 0.01 皮膚に発現する他のサイトケラチンは、ヒトｉＣＸ２６ＧＪＣでは観察されないことを示す。付着培養におけるＣＸ２６（赤色）及びＣＫ５、１０、１４（緑）の免疫染色ＤＡＰＩ（青）による核対比染色を示す。スケールバー：１０μｍ。No other cytokeratin expressed in skin is observed in human iCX26GJC. Nuclear counterstaining with immunostaining DAPI (blue) of CX26 (red) and CK5, 10, 14 (green) in adherent cultures is shown. Scale bar: 10 μm.

本発明は、インスリンの存在下に多能性幹細胞を培養して得られた胚様体を、蝸牛由来フィーダー細胞の存在下に培養することを特徴とする、ＣＸ２６ギャップ結合を有する内耳細胞の製造法である。 The present invention is characterized by culturing embryoid bodies obtained by culturing pluripotent stem cells in the presence of insulin in the presence of cochlea-derived feeder cells to produce inner ear cells having CX26 gap junctions. Law.

本発明に用いられる多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞が挙げられる。また、多能性幹細胞としては、マウスなどの非ヒト動物由来の多能性幹細胞を用いることもできるが、ヒト由来のｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞を用いるのが好ましい。本明細書において、ｉＰＳ細胞をｉＰＳＣと略すことがある。また、ＥＳ細胞をＥＳＣと略すことがある。 Pluripotent stem cells used in the present invention include iPS cells and ES cells. As pluripotent stem cells, non-human animal-derived pluripotent stem cells such as mice can be used, but human-derived iPS cells and human ES cells are preferably used. In this specification, iPS cells are sometimes abbreviated as iPSC. Also, ES cells are sometimes abbreviated as ESC.

本発明における、多能性幹細胞を原料とする胚様体の形成は、インスリンの存在下に多能性幹細胞を培養して行うことができる。特許文献１及び非特許文献４に記載の方法で用いたＢＭＰ、ＴＧＦ－β１受容体阻害剤及びＦＧＦなどは用いる必要がない。
インスリンの培地への添加濃度は、１～２０μｇ／ｍＬが好ましく、１～１５μｇ／ｍＬがより好ましい。 In the present invention, formation of embryoid bodies using pluripotent stem cells as a raw material can be performed by culturing pluripotent stem cells in the presence of insulin. BMP, TGF-β1 receptor inhibitor, FGF and the like used in the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 4 need not be used.
The concentration of insulin added to the medium is preferably 1-20 μg/mL, more preferably 1-15 μg/mL.

多能性幹細胞由来胚様体の形成には、多能性幹細胞を培養するための公知の培地、例えば、ｇｆＣＤＭ培地、ＤＦＮＢ培地、Ｎ２β２７培地、ＧＥＭ培地等の培地中、多能性幹細胞にインスリンを添加し、３０～４０℃で７～１０日培養するのが好ましい。胚様体の形成は細胞の凝集体の形成、感覚上皮細胞への分化により確認することができる。また、感覚上皮細胞への分化は、ＣＸ２６及びＣＸ３０のｍＲＮＡ濃度の上昇により確認することができる。 For the formation of pluripotent stem cell-derived embryoid bodies, insulin is added to pluripotent stem cells in known media for culturing pluripotent stem cells, such as gfCDM medium, DFNB medium, N2β27 medium, and GEM medium. and cultured at 30-40° C. for 7-10 days. The formation of embryoid bodies can be confirmed by the formation of cell aggregates and differentiation into sensory epithelial cells. In addition, differentiation into sensory epithelial cells can be confirmed by an increase in the mRNA concentration of CX26 and CX30.

得られた多能性幹細胞由来胚様体を、蝸牛由来フィーダー細胞上で培養すれば、ＣＸ２６ギャップ結合を有する内耳細胞が得られる。
当該蝸牛内耳フィーダー細胞は、例えば、蝸牛細胞をトリプシン処理した後、培養によってコロニーを形成した細胞であるのが好ましい。蝸牛外側壁及びコルチ器を含む蝸牛膜迷路組織にトリプシン０．２５％を添加して培養し、コロニーを形成した細胞を取得するのが好ましい。
分解した胚様体を培養するために用いる蝸牛由来フィーダー細胞の播種量は、５×１０³ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²～５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²が好ましい。培地は、ｇｆＣＤＭ培地、ＤＦＮＢ培地、ＤＭＥＭＧｌｕｔａＭＡＸ＋１０％ウシ胎児血清が用いられる。培養は３０～４０℃で３～４日間が好ましい。 When the obtained pluripotent stem cell-derived embryoid bodies are cultured on cochlea-derived feeder cells, inner ear cells having CX26 gap junctions can be obtained.
The cochlear inner ear feeder cells are preferably cells formed by, for example, trypsinizing cochlear cells and then culturing them to form colonies. It is preferable to obtain colony-forming cells by adding 0.25% trypsin and culturing the cochlear labyrinth tissue including the outer cochlea wall and the organ of Corti.
The seeding amount of cochlea-derived feeder cells used for culturing decomposed embryoid bodies is preferably 5×10 ³ cells/cm ² to 5×10 ⁴ cells/cm ² . The medium used is gfCDM medium, DFNB medium, DMEM GlutaMAX+10% fetal bovine serum. Cultivation is preferably carried out at 30-40° C. for 3-4 days.

前記培養により、ＣＸ２６ギャップ結合を有する内耳細胞が効率良く得られる。ここでＣＸ２６発現の確認は、Ｃｘ２６のｍＲＮＡ濃度の上昇により確認することができる。
本発明により得られる内耳細胞は、蝸牛と同様にＣＸ２６及びＣＸ２６を含有するギャップ結合プラークを形成するとともに、耳前駆細胞のマーカーであるＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＧＡＴＡ３をアップレギュレートしており、蝸牛細胞のマーカーであるＣＸ３、ＳＯＸ２、ＳＰＡＲＣＬ１、ＫＣＣ３、ＫＩＡＡ１１９９、ＭＩＡ、ＯＴＯＲを発現している。また、難聴患者ｉＰＳＣ由来のコネキシン２６ギャップ結合を有する内耳細胞を製造し、ＧＪＢ２関連難聴の病態を再現することができた。従って、本発明により得られる内耳細胞を用いれば、ＧＪＢ２変異型難聴の遺伝性難聴の薬剤のスクリーニング、内耳再生医療に応用可能である。 The culture efficiently yields inner ear cells having CX26 gap junctions. Here, confirmation of CX26 expression can be confirmed by an increase in Cx26 mRNA concentration.
The inner ear cells obtained by the present invention form gap junction plaques containing CX26 and CX26, as in the cochlea, and upregulate the ear progenitor cell markers GJB2, GJB6, PAX2, PAX8, and GATA3. , expressing cochlear cell markers CX3, SOX2, SPARCL1, KCC3, KIAA1199, MIA, and OTOR. In addition, inner ear cells with connexin 26 gap junctions derived from iPSCs of hearing-impaired patients were produced, and the pathology of GJB2-associated hearing loss could be reproduced. Therefore, the use of the inner ear cells obtained by the present invention can be applied to the screening of drugs for hereditary deafness of GJB2 mutant deafness and inner ear regenerative medicine.

次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。 The present invention will now be described in more detail with reference to examples.

実施例１
（方法）
（１）ヒトｉＰＳＣの培養
健康なヒトｉＰＳＣ株（２０１Ｂ７）はＲＩＫＥＮバイオリソースセンター細胞バンクから提供された。
ＧＰＳＣ-２３５ｄｅｌＣ/２３５ｄｅｌＣとＧＰ６-２３５ｄｅｌＣ/２３５ｄｅｌＣの２つの表現型ｉＰＳＣライン（すなわち、ＧＰ５-２３５ｄｅｌＣとＧＰ６-２３５ｄｅｌＣ；家族歴と聴力像を図５、Ａ～Ｃに示す）は、兄弟患者から発生したＰＢＭＣから発生した２つの表現型ｉＰＳＣライン（それぞれ、ＪＵＦＭＤＯｉ００５-ＡとＪＵＦＭＤＯｉ００６、特定細胞株名）が、知られている。
これら３つのヒトｉＰＳＣ系統をＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ（ＡｊｉｎｏｍｏｔｏＷａｋｏ）によるｉＭａｔｒｉｘ―５１１（Ｎｉｐｐｉ）被覆プレート上で、フィーダーフリー培養システム下で維持した。 Example 1
(Method)
(1) Culture of human iPSCs A healthy human iPSC line (201B7) was provided by the RIKEN BioResource Center Cell Bank.
Two phenotypic iPSC lines, GPSC-235delC/235delC and GP6-235delC/235delC (i.e., GP5-235delC and GP6-235delC; family history and audiograms are shown in Figure 5, AC), originated from sibling patients. Two phenotypic iPSC lines (JUFMDOi005-A and JUFMDOi006, respectively, specific cell line names) generated from the PBMCs obtained from the culture are known.
These three human iPSC lines were maintained on iMatrix-511 (Nippi) coated plates by StemFit AK02N (AjinomotoWako) under a feeder-free culture system.

（２）ヒトｉＰＳＣの分化
ヒトｉＰＳＣを０．５％ＴｒｙｐＬＥセレクトで解離させ、Ｙ－２７６３２（２０μＭ）を添加した維持培地（ＳｔｅｍＦｉｔ）に懸濁した後、９６ウェル低細胞付着Ｖ－ボトムプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１００μＬ／ウェル（９０００細胞）で平板培養した。
３７℃、３％ＣＯ₂で２日間インキュベーション後、２％マトリゲル（コーニング）を含むｇｆＣＤＭ（下記表１）１００μＬ中の９６穴低細胞付着Ｖ底板（住友ベークライト）に凝集体を移した。
７～１１日目に、凝集体を、鉗子を用いて半切開した。
ＤＦＮＢ培地（下記表１）に蝸牛由来フィーダー細胞（ＴＲＩＣ、後述）を含む付着培養物に凝集物を移した。７日間のインキュベーション後、培地を増殖培地（１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭＧｌｕｔａＭＡＸ；下記表１）に変更した。 (2) Differentiation of human iPSCs Human iPSCs were dissociated with 0.5% TrypLE select, suspended in maintenance medium (Stem Fit) supplemented with Y-27632 (20 μM), and placed in a 96-well low cell attachment V-bottom plate. (Thermo Fisher Scientific) at 100 μL/well (9000 cells).
After 2 days of incubation at 37° C., 3% CO ₂ , aggregates were transferred to 96-well low cell attachment V-bottom plates (Sumitomo Bakelite) in 100 μL of gfCDM (Table 1 below) containing 2% Matrigel (Corning).
Aggregates were semi-dissected using forceps on days 7-11.
Aggregates were transferred to adherent cultures containing cochlear-derived feeder cells (TRIC, described below) in DFNB medium (Table 1 below). After 7 days of incubation, the medium was changed to growth medium (DMEM GlutaMAX with 10% FBS; Table 1 below).

（３）蝸牛由来フィーダー細胞（トリプシン耐性内耳細胞：ＴＲＩＣ）の調製
ＴＲＩＣを調製するために、蝸牛組織を、コルチ器官、基底膜、及び側壁を含み、主に基底膜の支持細胞、有毛細胞、蝸牛線維細胞、及び他の細胞から成る１０週齢マウス（ＣＬＥＡＪａｐａｎ，Ｉｎｃ．）から得た。
ＴＲＩＣは、蝸牛組織をトリプシンに曝露し、トリプシン耐性細胞をスクリーニングすることにより作製し、これらの細胞を増殖培地下で維持した。
この細胞株を、耳前駆細胞を増殖させる内耳由来フィーダー細胞として用いた。フィーダー細胞層については、３時間のマイトマイシンＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）処理後に、３×１０⁵ ＴＲＩＣｓ／ｃｍ²を２４ウェル培養プレートのゼラチン被覆ウェルに播種した。 (3) Preparation of Cochlear-Derived Feeder Cells (Trypsin-Resistant Inner Ear Cells: TRICs) , cochlear fibrocytes, and other cells from 10-week-old mice (CLEA Japan, Inc.).
TRICs were generated by exposing cochlear tissue to trypsin and screening for trypsin-resistant cells, which were maintained in growth medium.
This cell line was used as inner ear-derived feeder cells to propagate ear progenitor cells. For feeder cell layers, 3×10 ⁵ TRICs/cm ² were seeded in gelatin-coated wells of 24-well culture plates after mitomycin C (10 mg/mL) treatment for 3 hours.

（４）ＧＪＢ２及びＧＪＢ６ｍＲＮＡ発現の定量的逆転写ＰＣＲ
７日目の集合体を採取し、ＤＰＢＳで洗浄した後、全ＲＮＡを単離した。ＮｅａｓｙＰｌｕｓＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）の試薬を用いて全ＲＮＡを単離し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ）の試薬を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
逆転写産物であるＴａｑＭａｎＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘ試薬（アプライドバイオシステムズ）、及びＳｔｅｐＯｎｅＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲシステム(アプライドバイオシステムズ)上の遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブ(下記参照;アプライドバイオシステムズ)を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。各サンプルを３回ずつ実施した。ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェア（アプライドバイオシステムズ）を用いて、各ｍＲＮＡのＣｔ値を分析し、その発現を内因性コントロールであるアクチンβｍＲＮＡに対して標準化した。
ＴａｑＭａｎプローブ（アッセイＩＤ; ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ヒトＧＪＢ２（Ｈｓ００２６９６１５＿Ｓ１）、ＧＪＢ６（Ｈｓ００９２２７４２＿Ｓ１）、ＮＡＮＯＧ（Ｈｓ０２３８７４００＿Ｇ１）、ＰＡＸ２（Ｈｓ０１０５７４１６＿Ｍ１）、ＰＡＸ８（Ｈｓ００２４７５８６＿Ｍ１）、ＧＡＴＡ３（Ｈｓ００２３１１２２＿Ｍ１）、ＯＴＯＲ（Ｈｓ００３７５３０４＿Ｍ１）、ＭＩＡ（Ｈｓ００１９７９５４＿Ｍ１）、SＯＸ２（Ｈｓ０１０５３０４９＿Ｓ１）、ＳＰＡＲＣＬ１（Ｈｓ００９４９８８６＿Ｍ１）、ＡＣＴＢ（Ｈｓ９９９９９９０３＿Ｍ１）、及び１８Ｓ（Ｈｓ９９９９９９０１＿Ｓ１）ｍＲＮＡの発現を検出した。 (4) Quantitative reverse transcription PCR of GJB2 and GJB6 mRNA expression
Aggregates on day 7 were harvested and washed with DPBS before isolation of total RNA. Total RNA was isolated using reagents from the Neasy Plus Mini kit (Qiagen) and reverse transcribed into cDNA using reagents from the PrimeScript II first-strand cDNA synthesis kit (Takara).
Real-time PCR was performed using reverse transcriptase TaqMan Fast Advanced Master Mix reagents (Applied Biosystems) and gene-specific TaqMan probes (see below; Applied Biosystems) on the StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Carried out. Each sample was run in triplicate. StepOne software (Applied Biosystems) was used to analyze the Ct value of each mRNA and normalize its expression to the endogenous control actin β mRNA.
ＴａｑＭａｎプローブ（アッセイＩＤ; ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ヒトＧＪＢ２（Ｈｓ００２６９６１５＿Ｓ１）、ＧＪＢ６（Ｈｓ００９２２７４２＿Ｓ１）、ＮＡＮＯＧ（Ｈｓ０２３８７４００＿Ｇ１）、ＰＡＸ２（Ｈｓ０１０５７４１６＿Ｍ１）、ＰＡＸ８（Ｈｓ００２４７５８６＿Ｍ１）、ＧＡＴＡ３（Ｈｓ００２３１１２２＿Ｍ１）、ＯＴＯＲ（Ｈｓ００３７５３０４＿Ｍ１）、ＭＩＡ (Hs00197954_M1), SOX2 (Hs01053049_S1), SPARCL1 (Hs00949886_M1), ACTB (Hs99999903_M1), and 18S (Hs99999901_S1) mRNA expression was detected.

（５）免疫染色と画像取得
凝集体を０．０１ＭＰＢＳ中室温で４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで１時間固定した。ホールマウントについては、０．０１ＭＰＢＳ中０．５％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間凝集体を透過処理した。次に、試料を０．０１ＭのＰＢＳで２回洗浄し、０．０１ＭのＰＢＳ中の２％（ｗ/ｖ）ＢＳＡで３０分間ブロックした。付着培養由来の細胞を０．０１ＭＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで室温１５分間固定した後、０．０１ＭＰＢＳ中の０．５％（ｗ/ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で５分間透過処理した。サンプルを０．０１ＭＰＢＳで２回洗浄し、２％（ｗ/ｖ）のＢＳＡで３０分間０．０１ＭＰＢＳで遮断した。
免疫蛍光染色には、０．０１ＭＰＢＳ中の１％（ｗ/ｖ）ＢＳＡを用いて、一次及び二次抗体溶液を希釈した。一次抗体溶液は、ＣＸ２６（ウサギＩｇＧ、７１－５００；マウスＩｇＧ、３３－５８００、ライフテクノロジーズ)、ＣＸ３０（ウサギＩｇＧ，７１－２２００、ライフテクノロジーズ）、Ｐａｎ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（マウスＩｇＧ、Ｃ２５６２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ８（マウスＩｇＧ、ＭＡ５－１４４２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Cｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１８（マウスＩｇＧ、ＭＡ５－１２１０４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＯＸ２（ヤギＩｇＧ、ＳＣ－１７３２０、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ１（マウスＩｇＧ、ＡＦ２７２８、Ｒ＆Ｄシステム）、及びＳＬＣ１２Ａ６（ＫＣＣ３、ウサギＩｇＧ）を使用した。二次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合抗｛ｍｏｕｓｅＩｇＧ又は抗]ヤギＩｇＧ、Ｃｙ３結合抗]ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ａ１１０７０）、Ｆ－ａｃｔｉｎに対するファロイジンＦＩＴＣ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, １２３７９）であった。
検体は０．０１ＭＰＢＳで２回洗浄し、装着媒体(ベクター社ＤＡＰＩ添加ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤＭｏｕｎｔｉｎｇＭｅｄｉｕｍ)を装着した。
ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で蛍光共焦点画像を得た。画像は０．５μｍ間隔(ｚ－スタック)で収集し、単一画像スタックはＬＳＭ画像Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて構築した。ＩＭＡＲＩＳ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いてｚ積層共焦点画像から三次元画像を構築した。 (5) Immunostaining and Image Acquisition Aggregates were fixed with 4% (w/v) paraformaldehyde in 0.01 M PBS at room temperature for 1 hour. For whole mounts, aggregates were permeabilized with 0.5% (w/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich) in 0.01 M PBS for 30 minutes. Samples were then washed twice with 0.01 M PBS and blocked with 2% (w/v) BSA in 0.01 M PBS for 30 minutes. Cells from adherent cultures were fixed with 4% (w/v) paraformaldehyde in 0.01M PBS for 15 minutes at room temperature, followed by 5% (w/v) Triton X-100 in 0.01M PBS. Permeabilized for minutes. Samples were washed twice with 0.01 M PBS and blocked with 2% (w/v) BSA for 30 minutes in 0.01 M PBS.
For immunofluorescent staining, 1% (w/v) BSA in 0.01 M PBS was used to dilute primary and secondary antibody solutions. Primary antibody solutions were CX26 (rabbit IgG, 71-500; mouse IgG, 33-5800, Life Technologies), CX30 (rabbit IgG, 71-2200, Life Technologies), Pan-Cytokeratin (mouse IgG, C2562, Sigma-Aldrich ), Cytokeratin 8 (mouse IgG, MA5-14428, Invitrogen), Cytokeratin 18 (mouse IgG, MA5-12104, Invitrogen), SOX2 (goat IgG, SC-17320, Santa Cruz), SPARC-like 1 (mouse IgG, AF2728, R&D system), and SLC12A6 (KCC3, rabbit IgG) were used. Secondary antibodies were Alexa Fluor 488-conjugated anti-{mouse IgG or anti-]goat IgG, Cy3-conjugated anti-rabbit IgG (Invitrogen, A11070), phalloidin FITC staining for F-actin (Invitrogen, 12379).
The specimen was washed twice with 0.01 M PBS and mounted with a mounting medium (VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI added by Vector).
Fluorescence confocal images were obtained with an LSM780 confocal microscope (Zeiss). Images were collected at 0.5 μm intervals (z-stacks) and single image stacks were constructed using the LSM Image Browser (Zeiss). Three-dimensional images were constructed from z-stacked confocal images using IMARIS (Bitplane).

（６）スクレープローディング／色素転写（ＳＬ／ＤＴ）アッセイ
ＳＬ／ＤＴアッセイは、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１７，５５０－５５６（２０１１）及びＪ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５０，７６－８３（２００５）に従って実施した。ｉＣＸ２６ＧＪＣ含有増殖細胞を、ＴＲＩＣ（フィーダー細胞）への移入後７～１４日間増殖させた。未分化ｉＰＳＣ及びＴＲＩＣを対照として皿上でコンフルエントに増殖させた。
培地をＨＢＳＳ＋０．１％ルシファーイエローＣＨ（Ｌ４５３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に変更した。多くの平行線をかみそりブレードで皿に切断し、Ｌｕｃｉｆｅｒｙｅｌｌｏｗを負荷した１５分後の細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、画像化した。スクレープ負荷は、スクレープラインから蛍光強度がバックグラウンド強度に落ちる点までの距離を測定することにより定量化した。画像を処理し、ＮＩＨＩｍａｇｅＪソフトウェアで解析し、平均距離はＭｉｃｒｏＷｅｂＥｘｃｅｌソフトウェアを用いて算出した。 (6) Scrape loading/dye transfer (SL/DT) assay The SL/DT assay was performed according to Mol. Med. , 17, 550-556 (2011) and J. Am. Hum. Genet. 50, 76-83 (2005). iCX26GJC-containing expanded cells were expanded for 7-14 days after transfer to TRIC (feeder cells). Undifferentiated iPSCs and TRIC were grown to confluency on dishes as controls.
The medium was changed to HBSS + 0.1% Lucifer Yellow CH (L453, Invitrogen). A number of parallel lines were cut into the dish with a razor blade and cells were washed 3 times with HBSS 15 minutes after loading with Lucifer yellow and imaged. Scrape load was quantified by measuring the distance from the scrape line to the point where fluorescence intensity drops to background intensity. Images were processed and analyzed with NIH ImageJ software and mean distances were calculated using MicroWeb Excel software.

（７）統計
このデータはＭｉｃｒｏＷｅｂＥｘｃｅｌソフトウェアを用いて分析し、平均値±標準誤差（ＳＥ）で表示した。ｍＲＮＡレベル、色素移動距離、ＧＪＰ長の比較には、ｐ＜０．０５を有意基準とした一元配置分散分析とＳｃｈｅｆｆｅの多重比較検定又は両側スチューデントｔ検定を用いた。 (7) Statistics The data were analyzed using MicroWeb Excel software and expressed as mean±standard error (SE). For comparison of mRNA levels, pigment migration distances, and GJP lengths, one-way ANOVA with p<0.05 as the significance criterion and Scheffe's multiple comparison test or two-tailed Student's t-test were used.

（結果）
（１）ヒトｉＰＳＣのＣＸ２６発現細胞への分化
ＳＦＥＢｑ培養と接着培養技術の組合せであるヒトｉＰＳＣｓからのｉＣＸ２６ＧＪＣｓの誘導方法を、マウスｉＰＳＣｓに対する発明者らの以前の方法（特許文献１）から改変し、次に分化に必要な条件を評価した。
ＳＦＥＢｑ培養では、ヒトｉＰＳＣを再凝集（９０００個／ｗｅｌｌ）し、維持培地（ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０２Ｎ）で２日間（ｄａｙ ♯２～ｄａｙ０）培養した。次に、凝集体を、増殖因子を含まない化学的に規定された培地（ｇｆＣＤＭ；前記表１）に移した。
ＳＦＥＢｑ培養の３日目に、マウスｉＣＸ２６ＧＪＣ誘導法に従い、ｇｆＣＤＭにＢＭＰ４（ＢＭＰ）及び／又はアクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦ－β経路阻害剤（ＳＢ４３１５４２：ＳＢ）を添加した（図７）。
しかし、これらのサプリメントの追加は、ＧＪＢ２／ＧＪＢ６ｍＲＮＡ発現とＣＸ２６陽性細胞質量（ＣＸ２６＋小胞）産生を増大させなかった。
逆に、ＳＢの添加はＧＪＢ２ｍＲＮＡ発現とＣＸ２６＋小胞製造の低下を誘導した（図８）。
これらの結果から、以下の実験では、０日目からｇｆＣＤＭにインスリン（７μｇ／ｍＬ）を加えた。
ヒトｉＰＳＣのＣＸ２６発現細胞への分化のための改変ＳＦＥＢｑ培養を、図１Ａ（ＳＦＥＢｑ培養）及び３Ａ（接着培養）に示す。 (result)
(1) Differentiation of human iPSCs into CX26-expressing cells The method of inducing iCX26GJCs from human iPSCs, which is a combination of SFEBq culture and adherent culture technology, was modified from our previous method for mouse iPSCs (Patent Document 1). , then evaluated the conditions necessary for differentiation.
In SFEBq culture, human iPSCs were reaggregated (9000 cells/well) and cultured in a maintenance medium (StemFit AK02N) for 2 days (day #2 to day 0). Aggregates were then transferred to growth factor-free chemically defined medium (gfCDM; Table 1 above).
On day 3 of SFEBq culture, gfCDM was supplemented with BMP4 (BMP) and/or Activin/Nodal/TGF-β pathway inhibitor (SB431542: SB) according to mouse iCX26GJC induction method (FIG. 7).
However, addition of these supplements did not increase GJB2/GJB6 mRNA expression and CX26-positive cell mass (CX26+ vesicles) production.
Conversely, addition of SB induced a decrease in GJB2 mRNA expression and CX26+ vesicle production (Fig. 8).
Based on these results, insulin (7 μg/mL) was added to gfCDM from day 0 in the following experiments.
Modified SFEBq cultures for differentiation of human iPSCs into CX26-expressing cells are shown in Figures 1A (SFEBq cultures) and 3A (adherent cultures).

（２）ＳＦＥＢｑ培養における高ＣＸ２６発現のスクリーニング
改良ＳＦＥＢｑ培養では、７日目に凝集体を採取し、各培養群のｍＲＮＡ（ＧＪＢ２，ＧＪＢ６，ＰＡＸ２，ＰＡＸ８，ＧＡＴＡ３）を測定した。
ＧＪＢ６遺伝子はＣＸ３０蛋白質をコードしており、蝸牛支持細胞においてＣＸ２６と共発現している（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４６７，２０７－２３１（２００３），Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ.，４９９，５０６－５１８（２００６））。
ＰＡＸ２, ＰＡＸ８、及びＧＡＴＡ３遺伝子セットは、ＥＳＣ／ｉＰＳＣの内耳細胞への分化を目的としたいくつかの研究において、耳前駆細胞マーカーとして用いられている（Ｃｅｌｌ１４１，７０４－７１６（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ，４９０，２７８－２８２（２０１２）等）。
７日目の集合体では、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、及びＧＡＴＡ３遺伝子が未分化ｉＰＳＣ（０日目）におけるそれらよりもアップレギュレートされていた。さらに、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８及びＧＡＴＡ３遺伝子の発現は、未分化ｉＰＳＣと比較して有意に増加した（図１Ｂ）。
インスリンを添加したｇｆＣＤＭで培養したｉＰＳＣは、インスリン非添加培養と比較して、これらのｍＲＮＡの発現が有意に高かった（ＧＪＢ２：２０．３倍増加、ＧＪＢ６：１３．７倍増加、ＰＡＸ８：１．７倍増加、ＧＡＴＡ３：３０４．０倍増加）（図１Ｂ）。インスリンを含まない７日目の凝集体では、凝集体の周囲に細胞破片が観察された。対照的に、骨材にインスリンを添加した場合、破片は観察されなかった（図９Ａ）。
さらに、７日目の凝集体の直径は、インスリンあり（平均=８７６．６±６．９０μｍ）の方がインスリンなし（平均=６４４．８±２４．５８μｍ）よりも有意に大きかった（図９Ｂ）。 (2) Screening for high CX26 expression in SFEBq culture In the improved SFEBq culture, aggregates were collected on day 7, and mRNA (GJB2, GJB6, PAX2, PAX8, GATA3) in each culture group was measured.
The GJB6 gene encodes the CX30 protein and is co-expressed with CX26 in cochlear supporting cells (J. Comp. Neurol., 467, 207-231 (2003), J. Comp. Neurol., 499, 506- 518 (2006)).
The PAX2, PAX8, and GATA3 gene sets have been used as ear progenitor cell markers in several studies aimed at differentiating ESC/iPSCs into inner ear cells (Cell 141, 704-716 (2010), Nature , 490, 278-282 (2012), etc.).
GJB2, GJB6, PAX2, PAX8, and GATA3 genes were upregulated in day 7 aggregates over those in undifferentiated iPSCs (day 0). Furthermore, the expression of PAX2, PAX8 and GATA3 genes was significantly increased compared to undifferentiated iPSCs (Fig. 1B).
iPSCs cultured in insulin-supplemented gfCDM had significantly higher expression of these mRNAs compared to non-insulin-supplemented cultures (GJB2: 20.3-fold increase, GJB6: 13.7-fold increase, PAX8: 1 .7-fold increase, GATA3: 304.0-fold increase) (Fig. 1B). Cellular debris was observed around the aggregates at 7 days without insulin. In contrast, no debris was observed when insulin was added to the aggregate (Fig. 9A).
Furthermore, the diameter of aggregates at day 7 was significantly larger with insulin (mean=876.6±6.90 μm) than without insulin (mean=644.8±24.58 μm) (FIG. 9B). ).

ｉＰＳＣ凝集体におけるＣＸ２６の局在を解析するため、７日目の凝集体で免疫組織化学を行った。インスリンの有無にかかわらず、７日目の凝集体では、ＣＸ２６発現細胞質量（ＣＸ２６+小胞）が観察された（図２ＡＤ）。
インスリンで処理した細胞は、インスリンなしで培養した細胞（平均=１．７±０．３７）に比べ、ＣＸ２６＋小胞が有意に多かった（平均=２．７±０．２１）（図２Ｅ）。
一方、インスリン添加ｇｆＣＤＭにＳＢ及び／又はＢＭＰを添加しても、ｍＲＮＡ発現及びＣＸ２６＋小胞製造は増加しなかった（図１０、１１）。
ＣＸ２６＋小胞の直径に関して、インスリンで処理した細胞（平均=１６１．３±１０．８３μｍ）は、インスリンなしの細胞(平均=１２９．２±４．７０μｍ)よりも有意に大きかった（図２Ｆ）。
さらに、これらのＣＸ２６＋小胞は、それぞれ２８１．９±４１．４細胞（インスリンあり）又は１８４．２±１２．０７細胞（インスリンなし）から構成されていた（図２Ｇ）。
凝集体からなるＣＸ２６陽性細胞（ＣＸ２６（＋））及びＣＸ２６陰性細胞（ＣＸ２６（－））の割合は、インスリン（－）凝集体でそれぞれ４．１８%及び９５．８%、インスリン（＋）凝集体でそれぞれ８．８６％及び９．１３％であった（図２Ｈ）。
インスリン投与７日目集合体の共焦点解析では、ＣＸ２６発現細胞はＣＸ２６+小胞全体に播種していた（図２,Ｉ－Ｎ）。これらの細胞は細胞－細胞境界でＣＸ２６＋ＧＪを形成した（図２,Ｊ,Ｋ,Ｍ及びＮ）。共焦点画像の三次元再構成では、平面ＣＸ２６含有ＧＪＰｓを観察した（図２、Ｏ及びＰ）。 To analyze the localization of CX26 in iPSC aggregates, immunohistochemistry was performed on day 7 aggregates. CX26-expressing cell mass (CX26 + vesicles) was observed in day 7 aggregates with or without insulin (Fig. 2AD).
Cells treated with insulin had significantly more CX26+ vesicles (mean=2.7±0.21) compared to cells cultured without insulin (mean=1.7±0.37) (FIG. 2E). .
On the other hand, addition of SB and/or BMP to insulin-supplemented gfCDM did not increase mRNA expression and CX26+ vesicle production (Figs. 10, 11).
In terms of CX26+ vesicle diameter, cells treated with insulin (mean=161.3±10.83 μm) were significantly larger than cells without insulin (mean=129.2±4.70 μm) (FIG. 2F). .
Furthermore, these CX26+ vesicles were composed of 281.9±41.4 cells (with insulin) or 184.2±12.07 cells (without insulin), respectively (Fig. 2G).
The percentages of CX26-positive cells (CX26(+)) and CX26-negative cells (CX26(-)) composed of aggregates were 4.18% and 95.8%, respectively, for insulin (-) aggregates and 95.8% for insulin (+) aggregates. 8.86% and 9.13% in aggregates, respectively (Fig. 2H).
Confocal analysis of insulin day 7 aggregates revealed that CX26-expressing cells were seeded throughout the CX26 + vesicles (FIG. 2, IN). These cells formed CX26+GJs at cell-cell boundaries (Fig. 2, J, K, M and N). In three-dimensional reconstructions of confocal images, planar CX26-containing GJPs were observed (Fig. 2, O and P).

ｉＣＸ２６ＧＪＣは典型的な蝸牛細胞マーカーを発現した。ｉＣＸ２６ＧＪＣ含有ＣＸ２６＋小胞を有する領域を７～１１日目に凝集体から分離し、Ｎ２／Ｂ２７を添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ‘ｓＦ１２（ＤＦＮＢ培地）でマウス蝸牛由来フィーダー細胞（トリプシン耐性内耳細胞、ＴＲＩＣ）に移入した（図３Ａ）。移入されたｉＣＸ２６ＧＪＣ含有領域は実際にＴＲＩＣフィーダー細胞上でコロニーを形成し、コロニーはｉＣＸ２６ＧＪＣｓを含んでいた（図３、Ｂ及びＣ）。これらの増殖細胞は細胞－細胞境界にＣＸ２６陽性のＧＪを形成していた（図３、Ｄ－Ｈ）。共焦点画像の三次元構築において、大きな平面ＣＸ２６含有ＧＪＰｓを観察した（図３、Ｉ－Ｋ）。 iCX26GJC expressed typical cochlear cell markers. Regions with iCX26GJC-containing CX26+ vesicles were separated from aggregates on days 7-11 and incubated with mouse cochlea-derived feeder cells (trypsin-resistant inner ear cells, TRIC ) (Fig. 3A). The transferred iCX26GJC-containing region indeed formed colonies on the TRIC feeder cells, and the colonies contained iCX26GJCs (Fig. 3, B and C). These proliferating cells formed CX26-positive GJs at cell-cell boundaries (Fig. 3, DH). Large planar CX26-containing GJPs were observed in the three-dimensional construction of confocal images (Fig. 3, IK).

ｉＣＸ２６ＧＪＣが蝸牛支持細胞と類似しているかどうかを決定するために、蝸牛支持細胞及び／又は線維細胞で観察された以下の蛋白質（ＣＸ３０、ＳＯＸ２、ＳＰＡＲＣＬ１、ＫＣＣ３、及びいくつかのサイトケラチン）及び遺伝子（ＳＯＸ２、ＳＰＡＲＣＬ１、ＫＩＡＡ１１９９、ＭＩＡ、及びＯＴＯＲ）の発現を調べた。
ｉＣＸ２６ＧＪＣの免疫染色及びｑＰＣＲの結果を表２及び３にまとめた。 To determine whether iCX26GJC resembles cochlear supporting cells, the following proteins (CX30, SOX2, SPARCL1, KCC3, and some cytokeratins) and genes observed in cochlear supporting cells and/or fibrocytes (SOX2, SPARCL1, KIAA1199, MIA, and OTOR) expression was examined.
Immunostaining and qPCR results for iCX26GJC are summarized in Tables 2 and 3.

ヒトｉＣＸ２６ＧＪＣでは、ＣＸ３０とＣＸ２６の発現が同じ細胞で観察されたが、これらのタンパク質は必ずしもギャップ結合プラークで共集合しなかった（図４Ａ）。ヒト蝸牛らせん靭帯の線維細胞では、ＣＸ２６／ＣＸ３０タンパク質は別々のＧＪＰを形成し、ＧＪＰでは必ずしも共集合しない（ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ.，３６５，１３－２７（２０１６））。しかし、これらの蛋白質が蝸牛線維細胞と同様に蝸牛支持細胞においてギャップ結合プラークを形成するかどうかは不明である。一方、げっ歯類では、ＣＸ２６／ＣＸ３０蛋白質の発現パターンは蝸牛支持細胞（六角形を形成）と側壁線維芽細胞（多角形を形成しない）で異なる（ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ．，３３３，３９５－４０３（２００８），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２４，１５９８－１６０７（２０１４））。
以上より、我々の標的であるヒト蝸牛支持細胞において、ＣＸ２６／ＣＸ３０蛋白質はラセン靭帯の線維細胞のようにＧＪＰを共集合させないと結論することはできない。 In human iCX26GJC, expression of CX30 and CX26 was observed in the same cells, but these proteins did not necessarily co-assemble at gap junction plaques (Fig. 4A). In human cochlear spiral ligament fibrocytes, CX26/CX30 proteins form separate GJPs and do not necessarily co-assemble in GJPs (Cell Tissue Res., 365, 13-27 (2016)). However, it is unclear whether these proteins form gap junctional plaques in cochlear supporting cells as well as in cochlear fibrocytes. On the other hand, in rodents, the CX26/CX30 protein expression pattern differs between cochlear supporting cells (which form hexagons) and lateral fibroblasts (which do not form polygons) (Cell Tissue Res., 333, 395-403 ( 2008), J. Clin. Invest., 124, 1598-1607 (2014)).
From the above, we cannot conclude that in our target human cochlear feeder cells, the CX26/CX30 proteins do not co-assemble GJPs as in fibrocytes of the spiral ligament.

さらに、ｉＣＸ２６ＧＪＣはＳＯＸ２, ＳＰＡＲＣＬ１, ＫＣＣ３, ｐ－ＣＫ, ＣＫ８, ＣＫ１８蛋白質を共発現していた（図４、Ｂ－Ｇ）。
対照的に、ｉＣＸ２６ＧＪＣｓでは皮膚マーカーであるＣＫ５、ＣＫ１０、ＣＫ１４の免疫標識は検出されなかった（図１２）。さらに、ＧＪＢ２、ＧＪＢ６、ＫＩＡＡ１１９９、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＡ、ＯＴＯＲ遺伝子は、未分化ｉＰＳＣと比較して有意にアップレギュレートされていた（図４Ｈ）。一方、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧの発現レベルは、未分化ｉＰＳＣと比較して有意に減少した。ＮＡＮＯＧと同じ未分化マーカーであるＳＯＸ２遺伝子の発現レベルは減少したが、ＮＡＮＯＧほど激減しなかった。
蝸牛非感覚細胞には、ＳＯＸ２を発現する細胞（内指節細胞、内柱細胞、外柱細胞、Ｄｅｉｔｅｒｓ細胞、Ｈｅｎｓｅｎｓ細胞）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５，１８３９６－１８４０１（２００８））とＳＯＸ２を発現しない細胞（内溝細胞、外溝細胞、線維細胞）があることが知られている。
また、本発明者らが特許文献１で報告したマウスｉＰＳＣ由来ｉＣＸ２６ＧＪＣでは、蝸牛支持細胞と同様にＳＯＸ２発現の有無を観察していた。
以上より、ヒトｉＰＳＣ由来ｉＣＸ２６ＧＪＣではＮＡＮＯＧのようなｍＲＮＡ発現の有意な低下は認められないと考えた。 Furthermore, iCX26GJC co-expressed SOX2, SPARCL1, KCC3, p-CK, CK8 and CK18 proteins (FIG. 4, BG).
In contrast, no immunolabeling of skin markers CK5, CK10, CK14 was detected in iCX26GJCs (Fig. 12). Furthermore, GJB2, GJB6, KIAA1199, SPARCL1, MIA, OTOR genes were significantly upregulated compared to undifferentiated iPSCs (Fig. 4H). On the other hand, the expression level of NANOG, an undifferentiated marker, was significantly decreased compared to undifferentiated iPSCs. The expression level of the SOX2 gene, which is the same undifferentiated marker as NANOG, decreased, but not as sharply as NANOG.
Cochlear non-sensory cells include SOX2-expressing cells (inner phalanx cells, inner column cells, outer column cells, Deiters cells, Hensens cells) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 18396-18401 (2008). )) and cells that do not express SOX2 (inner groove cells, outer groove cells, fibrocytes).
In addition, in mouse iPSC-derived iCX26GJCs reported by the present inventors in Patent Document 1, the presence or absence of SOX2 expression was observed in the same manner as in cochlear supporting cells.
Based on the above, it was considered that human iPSC-derived iCX26GJC did not exhibit a significant decrease in mRNA expression like NANOG.

（３）健常及び疾患ｉＰＳＣに由来するｉＣＸ２６ＧＪＣにおけるＣＸ２６／ＣＸ３０ギャップ結合プラークの形成
ＧＪＢ２におけるホモ接合体２３５ｄｅｌＣの突然変異を有する兄弟患者から作成した２つのｉＰＳＣ系列から、疾患固有のｉＣＸ２６ＧＪＣを生成した（図５Ａ）。
２３５ｄｅｌＣ突然変異は、日本を含むアジアで最も一般的なＧＪＢ２突然変異であり、重度聴覚障害の聴力像をもたらす。
ヒトｉＰＳＣの２系列、ＧＰ５－２３５ｄｅｌＣ／２３５ｄｅｌＣ及びＧＰ６－２３５ｄｅｌＣ／２３５ｄｅｌＣ（以下、それぞれＧＰ５－２３５ｄｅｌＣ及びＧＰ６－２３５ｄｅｌＣ；重度難聴の聴力像を図５、Ｂ及びＣに示す）は、先に（それぞれ特殊細胞株名:ＪＵＦＭＤＯｉ００５－Ａ及びＪＵＦＭＤＯｉ００６）として特徴づけられている。
マウスモデルで観察されたＧＪＢ２難聴の病態であるＣＸ２６／ＣＸ３０高分子複合体（１５, ２９）の破壊が、患者ｉＰＳＣ由来ｉＣＸ２６ＧＪＣでも観察されるかどうかを調べるために、免疫染色によりＣＸ２６とＣＸ３０について確認した。
健常ｉＰＳＣ（２０１Ｂ７）由来ｉＣＸ２６ＧＪＣは、細胞境界部に大型で平面的なＣＸ３０ＧＪＰを示した（図５Ｄ、左列）。対照的に、患者ｉＰＳＣ（ＧＰ５－２３５ｄｅｌＣ、ＧＰ６－２３５ｄｅｌＣ）導出のｉＣＸ２６ＪＣｓは、部分的にＧＪＰｓを短縮した（図５Ｄ、中、右列）。
図５Ｅに示すように、罹患ｉＰＳＣ由来ｉＣＸ２６ＧＪＣｓ（ＧＰ５―２３５ｄｅｌＣ―ｉＣＸ２６ＧＪＣ：６．１３±０．３５μｍ；ＧＰ６―２３５ｄｅｌＣ―ｉＣＸ２６ＧＪＣ：５．９１±０．３７μｍ）におけるＧＪＰ長さは、正常ｉＰＳＣ由来ｉＣＸ２６ＧＪＣ：（８．６２±０．３１μｍ）よりも有意に短かった。 (3) Formation of CX26/CX30 Gap Junction Plaques in iCX26GJCs Derived from Healthy and Diseased iPSCs Disease-specific iCX26GJCs were generated from two iPSC lines generated from sibling patients with the homozygous 235delC mutation in GJB2 ( Figure 5A).
The 235delC mutation is the most common GJB2 mutation in Asia, including Japan, and results in an audiogram of severe deafness.
Two lines of human iPSCs, GP5-235delC/235delC and GP6-235delC/235delC (hereafter GP5-235delC and GP6-235delC, respectively; audiograms of severe hearing loss are shown in Figure 5, B and C), were previously (respectively Characterized as special cell line names: JUFMDOi005-A and JUFMDOi006).
In order to investigate whether the disruption of the CX26/CX30 macromolecular complex (15, 29), which is the pathology of GJB2 deafness observed in mouse models, is also observed in patient iPSC-derived iCX26GJC, CX26 and CX30 were analyzed by immunostaining. confirmed.
Healthy iPSC (201B7)-derived iCX26GJCs displayed large, planar CX30 GJPs at the cell boundaries (Fig. 5D, left column). In contrast, iCX26JCs derived from patient iPSCs (GP5-235delC, GP6-235delC) partially shortened GJPs (Fig. 5D, middle, right columns).
As shown in FIG. 5E, the GJP length in diseased iPSC-derived iCX26GJCs (GP5-235delC-iCX26GJC: 6.13±0.35 μm; GP6-235delC-iCX26GJC: 5.91±0.37 μm) : significantly shorter than (8.62±0.31 μm).

（４）健常及び罹患ｉＰＳＣに由来するｉＣＸ２６ＧＪＣにおけるギャップ結合細胞間コミュニケーション（ＧＪＩＣ）の機能評価
健常ｉＣＸ２６ＧＪＣと罹患ｉＣＸ２６ＧＪＣの間でＧＪＩＣネットワークの機能に差があるかどうかを調べるために、ルシファーイエロー（ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，７，１０２３－１０３６（２０１６），Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ. ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ.,２９３,Ｃ１０３２－１０４８（２００７））によるスクレープローディング／色素透過性試験（ＳＬ／ＤＴ）を行った。
ＳＬ／ＤＴは、健常人（２０１Ｂ７－ｉＣＸ２６ＧＪＣ）由来のｉＰＳＣに由来するｉＣＸ２６ＧＪＣ及びＧＰ５－２３５ｄｅｌＣ－ｉＣＸ２６ＧＪＣ及びＧＰ６－２３５ｄｅｌＣ―ｉＣＸ２６ＧＪＣに実施した。比較のために未分化ｉＰＳＣ（２０１Ｂ７）とフィーダー細胞（ＴＲＩＣ）を含めた。
スクレープ線から蛍光強度がバックグラウンド蛍光強度に落ちる点までの距離を測定することにより、色素移動の程度を定量した。
これらのｉＣＸ２６ＧＪＣ培養において、ルシファーイエローが傷ついた親細胞（図６、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、及びＮ）を越えて拡散することを観察し、ＧＪＩＣの存在を示した。対照的に、未分化ｉＰＳＣ又はＴＲＩＣフィーダー細胞では、この程度の色素透過性は観察されなかった（図６、Ａ、Ｂ、Ｄ、及びＥ）。図６Ｐに示すように、２０１Ｂ７－ｉＣＸ２６ＧＪＣｓ（１１４．３±４．０５μｍ）、ＧＰ５－２３５ｄｅｌＣ－ｉＣＸ２６ＧＪＣｓ（３６．４±１．５５μｍ）、及びＧＰ６－２３５ｄｅｌＣ－ｉＣＸ２６ＧＪＣｓ（３３．３±０．６９μｍ）における色素透過性の定量距離は、未分化ｉＰＳＣｓ（２２．４±０．６５μｍ）又はＴＲＩＣフィーダー細胞（２３．８±０．９９μｍ）よりも有意に長かった。さらに、患者由来のｉＣＸ２６ＪＣ（ＧＰ５－２３５ｄｅｌＣ－ｉＣＸ２６ＪＣ及びＧＰ０６－２３５ｄｅｌＣ－ｉＣＸ２６ＪＣ）のいずれにおいても、色素透過距離は、ＧＪＢ２突然変異なしでｉＰＳＣから作成したｉＣＸ２６ＪＣよりも著しく短かった（２０１Ｂ７－ｉＣＸ２６ＪＣ）。 (4) Functional assessment of gap junctional intercellular communication (GJIC) in iCX26GJCs derived from healthy and diseased iPSCs Cell Reports, 7, 1023-1036 (2016), Am. J. Physiol.
SL/DT was performed on iCX26GJC and GP5-235delC-iCX26GJC and GP6-235delC-iCX26GJC derived from iPSCs from a healthy subject (201B7-iCX26GJC). Undifferentiated iPSCs (201B7) and feeder cells (TRIC) were included for comparison.
The extent of dye migration was quantified by measuring the distance from the scrape line to the point where fluorescence intensity drops to background fluorescence intensity.
In these iCX26GJC cultures, we observed that Lucifer Yellow diffused beyond the injured parental cells (FIG. 6, G, H, J, K, M, and N), indicating the presence of GJIC. In contrast, this degree of dye permeability was not observed in undifferentiated iPSCs or TRIC feeder cells (Fig. 6, A, B, D, and E). As shown in FIG. 6P, 201B7-iCX26GJCs (114.3±4.05 μm), GP5-235delC-iCX26GJCs (36.4±1.55 μm), and GP6-235delC-iCX26GJCs (33.3±0.69 μm). The quantification distance of dye permeability in 1 was significantly longer than undifferentiated iPSCs (22.4±0.65 μm) or TRIC feeder cells (23.8±0.99 μm). Furthermore, in both patient-derived iCX26JCs (GP5-235delC-iCX26JC and GP06-235delC-iCX26JC), the dye penetration distance was significantly shorter than iCX26JC generated from iPSCs without the GJB2 mutation (201B7-iCX26JC).

（考察）
（１）ヒトｉＰＳ細胞のｉＣＸ２６ＧＪＣへの効率的な分化方法
本試験では、特許文献１のようにＳＦＥＢｑ培養と接着培養を用いることにより、ヒトｉＰＳＣから蝸牛支持細胞の特性を有するＣＸ２６ギャップ結合形成細胞（ｉＣＸ２６ＧＪＣ）を作製した。さらに、この誘導法を患者由来ｉＰＳＣに応用し、ＧＪＢ２関連難聴の病態を再現した。
ＳＦＥＢｑ培養系は、各種外胚葉由来組織、例えば、前脳、中脳、後脳、視神経カップ、及びＥＳＣｓ／ｉＰＳＣｓからの耳カップを誘導するのに最も適した方法である。ＳＦＥＢｑ培養でのｇｆＣＤＭの使用とインスリンの添加は、中脳及び後脳領域への分化を促進し、胚様体に含まれるこれらの領域を増加させる。
我々の標的であった内耳は、後脳の一部に隣接する非神経外胚葉（ＮＮＥ）の表面の一部である耳プラコードに由来する。
以上より、ＳＦＥＢｑ培養におけるこれらの条件は耳誘発に適していると仮定した。
ＥＳＣ／ｉＰＳＣの耳前駆細胞（ＯＰＣ）への分化に関するいくつかの報告では、ＯＰＣマーカーとしてＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＧＡＴＡ３が用いられている。本試験では、これらの遺伝子セットに加えて、培養条件の指標としてＧＪＢ２とＧＪＢ６を用いた。ＧＪＢ６遺伝子はＣＸ３０蛋白質をコードしており、蝸牛支持細胞においてＣＸ２６と共発現している。これらのマーカー遺伝子は、ＳＦＥＢｑ培養においてインスリンの添加によりアップレギュレートされることを確認した。
これらの結果は、ＳＦＥＢｑ培養においてｇｆＣＤＭにインスリンを添加することがｉＣＸ２６ＧＪＣｓを誘導するために最も適した方法であることを示唆した。いくつかの報告では、ＥＳＣ／ｉＰＳＣから誘導された蝸牛細胞様細胞を、複数のマーカーを用いて特性化している。免疫染色（ＣＸ３０、ＳＯＸ２、ＳＰＡＲＣＬ１、ＫＣＣ３、及び一部のサイトケラチン）及びｑＰＣＲ（ＳＯＸ２、ＫＩＡＡ１１９９、ＳＰＡＲＣＬ１、ＭＩＡ、及びＯＴＯＲ）を用いることにより、これらのマーカーがＳＦＥＢｑ培養後である接着培養中の増殖したヒトｉＣＸ２６ＧＪＣに発現することを確認した。これらの蛋白質あるいは遺伝子マーカーは、いくつかの研究により蝸牛支持細胞あるいは線維細胞に発現していることが報告されている。これらの特性により、ｉＣＸ２６ＧＪＣは、哺乳類蝸牛支持細胞又は線維細胞と考えられる。 (Consideration)
(1) Efficient method for differentiating human iPS cells into iCX26GJC In this test, CX26 gap junction-forming cells having characteristics of cochlear supporting cells were converted from human iPSCs by using SFEBq culture and adhesion culture as in Patent Document 1. (iCX26GJC) was produced. Furthermore, by applying this induction method to patient-derived iPSCs, we reproduced the pathology of GJB2-related hearing loss.
The SFEBq culture system is the most suitable method to derive various ectodermal-derived tissues such as forebrain, midbrain, hindbrain, optic nerve cups, and ear cups from ESCs/iPSCs. The use of gfCDM in SFEBq cultures and the addition of insulin promotes differentiation into midbrain and hindbrain regions and increases the inclusion of these regions in embryoid bodies.
Our target, the inner ear, originates from the ear placode, which is part of the surface of the non-neural ectoderm (NNE) adjacent to part of the hindbrain.
From the above, we hypothesized that these conditions in SFEBq culture are suitable for ear induction.
Several reports on the differentiation of ESC/iPSCs into otic progenitor cells (OPCs) use PAX2, PAX8, and GATA3 as OPC markers. In this test, in addition to these gene sets, GJB2 and GJB6 were used as indicators of culture conditions. The GJB6 gene encodes the CX30 protein and is co-expressed with CX26 in cochlear supporting cells. These marker genes were confirmed to be upregulated by the addition of insulin in SFEBq cultures.
These results suggested that adding insulin to gfCDM in SFEBq cultures was the most suitable method to induce iCX26GJCs. Several reports have characterized cochlear-like cells derived from ESC/iPSCs using multiple markers. By using immunostaining (CX30, SOX2, SPARCL1, KCC3, and some cytokeratins) and qPCR (SOX2, KIAA1199, SPARCL1, MIA, and OTOR), these markers were detected in adherent cultures after SFEBq culture. Expression was confirmed in proliferated human iCX26GJC. Some studies have reported that these proteins or gene markers are expressed in cochlear supporting cells or fibrocytes. These properties make iCX26GJCs considered mammalian cochlear support cells or fibrocytes.

（２）患者ｉＰＳＣ由来ｉＣＸ２６ＧＪＣはＧＪＢ２関連難聴の病態を再現した。
哺乳類の蝸牛では、コネキシンギャップ結合を介した細胞間イオン移動が蝸牛の恒常性を維持している。トランスフェクトされたＣＯＳ－７細胞を用いた先行研究では、２３５ｄｅｌＣによる変質したＣＸ２６蛋白質の異常なサブセル局所化が機能の喪失をもたらし、深刻な聴覚障害をもたらすことが示唆されている。 (2) Patient iPSC-derived iCX26GJC reproduced the pathology of GJB2-associated hearing loss.
In the mammalian cochlea, intercellular ion transfer through connexin gap junctions maintains cochlear homeostasis. Previous studies using transfected COS-7 cells suggest that aberrant subcellular localization of the altered CX26 protein by 235delC leads to loss of function and severe hearing impairment.

Claims

A method for producing inner ear cells having connexin 26 gap junctions, which comprises culturing embryoid bodies obtained by culturing probable stem cells in the presence of insulin in the presence of cochlea-derived feeder cells.

2. The method for producing inner ear cells according to claim 1, wherein the cochlea-derived feeder cells are cells formed by culture to form colonies after trypsinizing cochlear cells.

3. The method for producing inner ear cells according to claim 1 or 2, wherein the pluripotent stem cells are iPS cells or ES cells.

The method for producing inner ear cells according to any one of claims 1 to 3, wherein the pluripotent stem cells are human iPS cells or human ES cells.