JP2022160431A - 免疫グロブリン単一可変ドメインでｔｔｐを処置する方法、およびその使用 - Google Patents

免疫グロブリン単一可変ドメインでｔｔｐを処置する方法、およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、ヒトTTP患者へのvWFに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドの投与が、応答までの時間の著しい短縮を提供するという知見に基づく。【解決手段】本発明は、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを提供する。本発明はさらに、TTPを処置するための投与単位形態、キットおよび医学的使用に関する。【選択図】なし

Description

１．発明の分野
本発明は、ヒトTTP患者へのvWFに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドの投与が、応答までの時間の著しい短縮とより少ない合併症を提供するという知見に基づく。本発明は、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを提供する。本発明はさらに、TTPを処置するための投与単位形態、キットおよび医学的使用に関する。
２．発明の背景
２．１ 血小板凝集におけるvWFの役割
多量体血漿タンパク質フォン・ヴィレブランド因子（vWF）は、血管の傷害の際に損傷を受けた血管壁へ循環血小板を動員するために必須である。この動員は、vWF A1ドメインの血小板受容体糖タンパク質GPIb-IX-Vとの結合を通して媒介される。
vWFは、内皮細胞により発現された後、超巨大多量体または超巨大vWF（ultra-large vWF：ULvWF）として、循環中に分泌される。これらの多量体は、ADAMTS13による酵素的切断を通して、より小さな通常のサイズの多量体にプロセッシングされる。これらの通常のサイズのvWFの多量体において、A1ドメイン中のGPIb-IX-V血小板受容体結合部位は隠されており、血小板と自発的には反応しない。A1ドメイン中のGPIb-IX-V血小板受容体結合部位の立体構造的活性化は、固定化により、または剪断応力の条件下において引き起こされ、血小板接着およびその後の血栓形成をもたらす。
２．２ TTPの病態生理学におけるvWFおよびvWFのプロセッシングの役割
血栓性血小板減少性紫斑病（「TTP」）は、ULvWF多量体が関連していると考えられている血液凝固系の稀かつ生命を脅かす疾患であり、過剰な血小板凝集に起因する小血管における血栓形成のリスクの増大をもたらす。状態は、微小循環中の全身性の血小板凝集により特徴づけられ、多くの臓器において変動性の虚血（fluctuating ischaemia）をもたらす。持続する場合、これは、重度の血小板減少症および赤血球の断片化を伴う組織梗塞を引き起こし得る。
ULvWF多量体は、血小板受容体GPIb-IX-Vと自発的に相互作用する天然の能力を有する。健康な対象において、これらのULvWF多量体は、vWFプロテアーゼADAMTS13による切断を介して、即座に通常のサイズのvWF多量体へとプロセッシングされる。しかし、ADAMTS13活性は、遺伝性TTPならびに後天性の特発性TTPにおいて著しく欠損していることが見出された。TTPを有する患者の多くは、ADAMTS13に対する自己抗体を有し、これがULvWF多量体のプロセッシングの障害をもたらす。結果として、ULvWFのA1ドメインは、恒常的に活性であり、GPIb-IX-V血小板受容体と容易に相互作用する。これが、最終的に、TTP患者集団において見出される特徴的な血餅の形成をもたらす。
血漿交換（本明細書において「PE」または「PEX」と略される）および輸血による現行のTTP治療は、補充のADAMTS13を提供し、当該酵素に対する抗体を取り除いて、それにより、次第にULvWFのプロセッシングの正常化をもたらす。しかし、この処置は、何日間にもわたる複数回の交換および輸血を必要とし、その時間の間、ULvWFにより媒介される血小板凝集の活性プロセスの直接的な薬理学的ターゲティングは存在しない。
PEおよび輸血の導入は、過去３０年間にわたりTTPによる死亡率を著しく減少させたが、状態は、なお、著しい死亡率および罹患率のリスクを有する。現行の治療で処置される患者における急性特発性TTPにおける急性発作の死亡率は、なお１０％～３０％程度である（Vesely et al. Blood 2003；102: 60-68；Allford et al. Br.J.Haematol. 2003；120: 556-573；Sadler et al. Hematology. Am.Soc.Hematol.Educ.Program. 2004；407-423）。続発性TTPの症例において、PEおよび輸血は、有効性がより低いことが認められており、死亡率は著しくより高い。疾患が妊娠に続発する症例においては、PEが妥当な有効性を有すると考えられているが、TTPの急性発作の死亡率は約２５％であり、同時に妊娠中毒症を有する症例においては４０％超まで上昇する（Martin et al. Am.J.Obstet.Gynecol. 2008；199: 98-104）。しかし、例えば基礎の悪性腫瘍または骨髄移植に続発する症例においては、かかる処置レジメンの使用にも関わらず、死亡率はなお４０％～６０％である（Sadler et al. 2004、上記；Elliott et al. Mayo Clin.Proc. 2003；78：421-430；Kremer Hovinga and Meyer Curr.Opin.Hematol. 2008；15：445-450.）。
TTPからの顕著な死亡率のレベルの持続、ならびに観察されるPEおよび輸血の合併症を考慮すると、これらの処置の方法を補充するか、潜在的にその必要性を低下させるための、さらなる治療的アプローチの開発についての必要性が明らかに存在する。
過去３０年間にわたりTTPについて行われた研究は、当該疾患の病態生理学の理解を改善し、基礎疾患のプロセスを標的とする新規の剤の潜在的な開発を可能にした。しかしながら、現在、TTPのための認可された治療は存在せず、現在評価が行われている、より新しい治療は存在するが、これらの潜在的処置の研究は、比較的初期段階にある。
vWFに対する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）は、例えばWO2004/015425、WO2004/062551、WO2006/074947、WO2006/122825、WO2009/115614およびWO2011/067160において記載されている。
vWFに対するISVD（例えばALX 0081）は、多量体vWFに活発に結合し、それにより、任意のサイズおよび活性段階の多量体vWFのGPIb-IX-V血小板受容体との相互作用を遮断することが示されている。ALX 0081とvWFとの相互作用は、高度に特異的であり、それは、ヒト血球細胞または血小板とは相互作用しない。さらに、その血小板GPIb-IX-V受容体に対する干渉は、vWF A1ドメインの結合を通して選択的であり、それは、vWFが線維性コラーゲンまたはＶＩ型コラーゲンと相互作用する能力に影響を及ぼさない。また、VWFに対するISVD（例えばALX 0081）は、（残りの）vWF-プロテアーゼADAMTS13の活性に影響を及ぼさず、それらはFVIIIのvWFへの結合にも干渉しないことが示されている。
第Ｉ相の研究において、ALX 0081は安全であり、健康な志願者において良好に耐容されることが示された。
しかし、ヒトの健康な志願者は、一般的にVWFに対するISVD、または具体的にALX 0081の、TTP患者の基礎病態における効力について予測的ではない。vWFは、TTP患者において量のみならず質においても異常である。ULvWFがTTP患者における止血において正常に機能しないことは受け入れられているが、基底にある機構は理解されていない。TTP患者においては、急性のエピソードの間に、より高いvWFレベルが予測される（Lotta et al. 2011 J Thromb Haemost 9：1744-51；Stufano et al. 2012 J Thromb Haemost 10:728-730）。
適切な動物モデルの欠如に起因して、in vivoでALX 0081がULvWFを中和する効力は実証されていない。
したがって、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド、例えばALX 0081が、TTP患者において有益であるか否か、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド、例えばALX 0081が、PEに対して正の効果を有するか否か、ならびにどのような処置および用量のレジメンが有効であるかについては、まだ解明されていない。
TTP患者のための改善された治療についての必要性が存在する。
３．発明の要旨
本発明は、ヒトTTP患者へのvWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチドの投与が、血小板≧１５０，０００／μＬの回復により客観化される応答までの時間（time-to-response）の２日間の短縮を提供するという、予想外の知見に基づく。血小板カウントの増加は、血小板凝集の病的な減少の徴候であり、それにより、この疾患の特徴である血小板－vWF複合体により開始される血栓プロセスが減少する。本発明のポリペプチドに対するプラセボのハザード比（「HR」）は、驚くべきことに、９５％ＣＩ（１．２８、３．７８）、ｐ＝０．０１３で、２．２であった。この応答は、応答までの時間の４８時間後まで確認した。したがって、本発明のポリペプチドの概念証明は、統計学的有意性および確認された血小板応答までの時間の臨床的に有意義な短縮により、実証された。さらに、増悪の数は、プラセボ群における１１から処置群における３へと減少した。プラセボ群における２人の死亡と比較して、処置群においては死亡は存在しなかった。
さらに、TTP患者による本臨床研究はまた、本発明のポリペプチド（例えばALX 0081）が、良好に耐容される剤であること、特に、出血のリスクについての可能性は、存在するとは考えられるが、低く、管理可能であることを示す。現在利用可能なデータは、したがって、本発明のポリペプチド自体の使用からの著しい有害効果を伴うことなく、PEおよび輸血ならびにそれらに伴う合併症の軽減が達成されることを示す。このことは、TTPを有する患者の処置における本発明のポリペプチドの使用についての明らかな安全性の利益を表す。
したがって、ヒトTTP患者へのvWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチドの投与は、応答までの時間の予想外の短縮、持続的かつ長期の効果、増悪の減少、入院の減少、罹患率の低下、死亡の減少、PEの数の減少を提供する。
現在のPEおよび輸血によるTTPの治療は、補充のADAMTS13を提供し、当該酵素に対する抗体を取り除き、それにより次第にULvWFのプロセッシングの正常化をもたらす。しかし、この処置は、何日間にもわたる複数回の交換および輸血を必要とし、その時間の間、ULvWFにより媒介される血小板凝集の活性なプロセスの直接的な薬理学的ターゲティングは存在しない。
今や、さらに予想外なことに、本発明のポリペプチドは、血漿輸血により交換された酵素を妨害しないことが示された。本発明のポリペプチド（例えばALX 0081）は、PEおよび輸血と組み合わせて、微小血管系における継続性の小血栓の形成および血小板の消費を直接的に阻害するために利用することができることが示された。このことにより、基礎血栓プロセスおよび付随する血小板消費のより迅速な制御が可能になり、これは、虚血性および出血性の合併症の程度を軽減する利益を伴う。それはまた、より迅速な臨床的回復およびより低い罹患率をもたらし、これによりPEおよび輸血の期間は短くなり、回数は減少する。実際に、特異的かつ臨床的に適切な臓器損傷バイオマーカーであるLDH、トロポニンＴまたはＩおよびクレアチニンについての分析により、微小血管組織の虚血をより迅速に短縮することは臨床的利益を有すると予測されることが示唆された。加えて、本発明のポリペプチド（例えばALX 0081）により、ULvWFにより媒介される血小板相互作用の阻害が示されたことと、抗血栓効果が観察されたことから、患者がTTPの急性発作から回復した後で疾患の再発を予防するための、より長期のその使用についての可能性が生じる。TTPの急性発作の頻度の減少は、TTPに関連する死亡率および罹患率の低下と、さらに患者の生涯にわたるPEおよび輸血の必要性の減少についての可能性を伴う、著しい利益を表す。
TTPからのより迅速な回復ならびに増悪および再発の減少は、処置効力に関する明らかな臨床的利益であるが、一方、PEおよび輸血の期間および頻度の減少もまた、患者の安全に関するさらなる利益を提供する。PEおよび輸血は、現在、TTPの管理における標準的な処置とみなされているが（Scully et al. Br.J.Haem. 2012；158:323-335）、手法は、著しい合併症のリスクを有する。PEの手法は、高い液体容積および流速を必要とし、これは中心静脈デュアルルーメン血液透析カテーテルの使用を必要とする。当該手法からの合併症として、カテーテル挿入からの出血、敗血症、カテーテル血栓症、気胸、水分過負荷、低酸素および低血圧が挙げられる（Fontana et al. Semin.Hematol. 2004; 41: 48-59; George J.Intensive Care Med. 2007; 22: 82-91; Howard et al. Transfusion 2006; 46: 154-156; Rizvi et al. Transfusion 2000; 40: 896-901; Nguyen et al. Transfusion 2009; 49: 392-394）。手法の０．２５％～０．５％にアナフィラキシー様反応が併発する（Allford et al 2003、上記；George 2007、上記）。加えて、血液製剤を含む血漿の注入は、非感染性TRALIを引き起こし得る。この状態は、輸血関連致死の最も頻繁な原因のうちの一つとして認識され、発生率は、１日平均１７血漿単位により、血漿含有単位ごとに０．０２％～０．０５％であると概算され、１日のリスクは、０．３４％～０．８５％の範囲であると計算することができる。TTPを有する殆どの患者は、複数回のPEおよび輸血を必要とする。急性特発性TTPを有する患者は、毎日の処置を必要とし、平均約１６回の処置が、寛解を達成するために必要とされる（Allford et al. 2003年、上記）。難治性の症例においては、処置の頻度は、１日２回まで増加してもよい（Allford et al. 2003年、上記）。家族性TTPを有する患者の症例においては、２～３週間の間隔での定期的な予防的血漿注入が推奨される（Lammle et al. J.Thromb.Haemost. 2005；3：1663-1675）。このように、アナフィラキシーおよびTRALIは、その処置が、PEおよび輸血のかかる頻度および規則性を必要とするTTPを有する患者に対する明らかなリスクを表す。このリスクは、フレッシュな凍結血漿の代わりに溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）で処理された血漿が用いられる場合により低くなると考えられるが、一方で、大容積のＳ／Ｄ血漿の使用は、静脈性血栓塞栓症のリスクの増大を伴い得る（Allford et al. 2003年、上記；Fontana et al. 2004年、上記）。全体的に、患者の約３０％～４０％が、PEおよび輸血からの有害効果を経験するであろうことが概算され、当該手法からの死亡率は、２％～３％程度である（George et al. Semin.Hematol. 2004；41：60-67；George 2007、上記）。したがって、PEおよび輸血の期間および頻度の減少もまた、患者の安全に関するさらなる利益を提供する。
TTPの発作からの回復の後で、多くの患者は、長年にわたる認知異常を述べ、記憶、集中、エネルギー低下および疲労による厄介な問題を報告する。かかる症状は、患者の日々の生活の質に対して負の影響を有する。さらに、このクオリティ・オブ・ライフの欠陥は、TTPを有する全ての患者において、病因および重篤度に関わりなく起こり得る（Lewis et al. Transfusion 2009；49：118-124）。これらの症状は、組織虚血の残留効果を反映している可能性があると考えられる。これに基づいて、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが提供するTTPからのより迅速な回復および微小血管系における血栓形成の限定が、患者のクオリティ・オブ・ライフに関して、患者にとってのより長期の予後の改善をもたらすことが、合理的に提案され得る。
したがって、本発明は、対象にvWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチドを投与することにより、対象においてvWF関連疾患を処置または緩和するための方法を提供し、ここで、投与されるポリペプチドの量は、応答までの時間を短縮するために、増悪を減少させるために、入院を減少させるために、虚血を減少させるために、死亡者数を減少させるために、および／または必要とされるPEの回数を減少させるために有効である。本発明は、vWF関連疾患に対するこれらの効果のうちの１または２以上をもたらす、本発明のポリペプチドのための特定の用量範囲および投与スケジュールを提供する。特に、本発明は、現在用いられているかおよび／または当該分野において公知の剤、組成物、方法および／または投与スケジュールと比較して特定の利点を有する薬理学的に活性な剤、組成物、方法および／または投与スケジュールを提供し、これは、PEを行う必要性がより低頻度となることを含む。これらの利点は、以下のさらなる説明から明らかとなるであろう。
したがって、本発明は、前記ヒトに、１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの前記ポリペプチドの第１の用量を投与することを含む、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドを投与した後に、５分間～８時間以内に、第１の血漿交換（PE）を行う。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記第１の用量の投与の前に、好ましくは前記第１のPEの３６時間以内、例えば３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間以内、例えば７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間以内またはわずか５分間以内に、事前の血漿交換（PE）を行う。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記第１のPEの後に、前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの第２の用量を、好ましくは皮下注射により、好ましくは前記第１のPEの１～６０分間以内に、より好ましくは３０分間以内に投与する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記の事前のPEは、前記第１のPEの３６時間以内、好ましくは３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８または１６時間以内、好ましくは約２４時間以内に行う。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドは、非経口的に、好ましくは皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内注射により、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスプッシュ（bolus push）注射により、投与する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドを投与した後に、５分間～８時間以内、例えば１０分間～６時間または１５分間～４時間以内、例えば８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間以内に、PEを行う。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記のそれを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することは、さらに以下：
（ｉ）PEを行うこと；ならびに（その後に）
（ｉｉ）前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇの用量を、ステップ（ｉ）の前記PEの５分～４時間後に投与すること；ならびに
（ｉｉｉ）任意に、前記患者の血小板カウントおよび／またはADAMTS13活性を測定すること；
を含み、
ここで、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、好ましくは前記患者の血小板カウントが≧１５００００／μｌとなるか、および／または、前記ADAMTS13活性が、ADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％またはさらには５０％となるまで、１日あたり１回繰り返す。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドであって、前記患者の血小板カウントが、初めて≧１５０．０００／μｌとなった後、前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、９０または１２０日間にもわたり、１日あたり１回投与することをさらに含む、前記ポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドであって、前記ヒトが寛解するまで、前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を、１日あたり１回投与することをさらに含む、前記ポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドであって、ADAMTS13活性が、ADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％または５０％にまでもなるまで、前記ポリペプチドを投与することを含む、前記ポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記用量は、約１～８０ｍｇ、または５～４０ｍｇ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０または８０ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇの前記ポリペプチドである。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記ヒトは、TTPの急性のエピソード、TTPの増悪またはTTPの再発を罹患する。
好ましい側面において、本発明は、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを提供し、これは、以下を含む；
（１）任意に、事前の血漿交換（PE）を行うこと；
（２）前記ヒトに、前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの第１の用量を投与すること（ステップ（１）が行われる場合は、好ましくはステップ（１）（の終了）の３６時間以内、例えば３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間以内、例えば７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間以内に）；
（３）血漿交換（PE）を行うこと（任意に、ステップ（２）の５分間～８時間以内、例えば１０分間～６時間または１５分間～４時間以内、例えば８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間以内に）；
（４）前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇのさらなる用量を投与すること（好ましくはステップ（３）（の終了）の５分間～８時間以内、例えば１０分間～６時間または１５分間～４時間以内、例えば８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間以内に）；
（５）ステップ（３）およびステップ（４）を１日あたり１回繰り返すこと；任意に、前記患者の血小板カウントが≧１５００００／μｌとなるまで、および／または前記ADAMTS13活性が、ADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％またはさらには５０％となるまで。
（６）任意に、前記患者の血小板カウントが初めて≧１５０．０００／μｌとなった後で、またはADAMTS13活性が、ADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％またはさらには５０％となるまで、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、９０または１２０日間にもわたって、１日あたり１回、前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与すること。
加えて、本発明は、ヒトに、前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与することにより、ヒトにおいてvWF関連疾患（の症状）の再発を予防することにおける使用のための、２つの抗ヒトvWF ISVDを含むポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対する前記ISVDは、配列番号２０に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対する前記ISVDは、従来の４本鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、または重鎖抗体もしくはNanobodyから誘導される重鎖可変ドメインを含む。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記Nanobodyは、VHHである。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記vWFに対するISVDが、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
ａ）CDR1は、以下：
－アミノ酸配列YNPMG；または
－アミノ酸配列YNPMGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
を含むか、これらから本質的になり、
ならびに
ｂ）CDR2は、以下：
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEG；または
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
を含むか、これらから本質的になり、
ならびに
ｃ）CDR3は、以下：
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；または
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列
を含むか、これらから本質的になる。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで：
ａ）CDR1はYNPMG（配列番号２０）であり；
ｂ）CDR2はAISRTGGSTYYPDSVEG（配列番号２１）であり；ならびに
ｃ）CDR3はAGVRAEDGRVRTLPSEYTF（配列番号２２）である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対するISVDは、配列番号１９（12A02H1）により代表される。
本発明は、vWFに対する少なくとも２つのISVDを含むかこれらからなる、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対する前記の少なくとも２つのISVDのうちの各々のISVDが、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
ａ）CDR1は、以下：
－アミノ酸配列YNPMG；または
－アミノ酸配列YNPMGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
を含むか、これらから本質的になり、
ならびに
ｂ）CDR2は、以下：
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEG；または
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
を含むか、これらから本質的になり、
ならびに
ｃ）CDR3は、以下：
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；または
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列
を含むか、これらから本質的になる。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここでvWFに対する各々のISVDが、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
ａ）CDR1はYNPMG（配列番号２０）であり；
ｂ）CDR2はAISRTGGSTYYPDSVEG（配列番号２１）であり；ならびに
ｃ）CDR3はAGVRAEDGRVRTLPSEYTF（配列番号２２）である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号１～１９、好ましくは配列番号１９を含むかこれらから本質的になる。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対する前記ISVDは、１または２以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対する前記ISVDは、一価または多価である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対する前記ISVDは、単一特異的または多特異的である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、１または２以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、CDRグラフト化されるか、ヒト化されるか、ラクダ化（camelize）されるか、脱免疫化されるか、またはファージディスプレイにより選択される。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対する前記ISVDは、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明は、２つの抗ヒトvWF免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）および１つの抗ヒト血清アルブミン（HSA）ISVDを含む、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドは、薬学的に許容し得る処方物中に処方される。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記処方物は、５．０～７．５の範囲のｐＨを有するクエン酸またはリン酸バッファーを含む。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記処方物は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射または腹腔内注射から選択される１または２以上などの非経口投与のために好適である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記処方物は、液体中であるか、凍結乾燥されているか、スプレー乾燥されているか、再構成された凍結乾燥または凍結形態である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドまたは本明細書において記載されるような処方物を含む容器、および使用のための説明を含む、キットまたは製品を提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなキットまたは製品を提供し、ここで、処方物は、バイアルまたは注射用シリンジ中に存在する。
本発明は、本明細書において記載されるようなキットまたは製品を提供し、ここで、処方物は、事前に充填された注射用シリンジ中に存在する。
本発明は、本明細書において記載されるようなキットまたは製品を提供し、ここで、シリンジまたはバイアルは、ガラス、プラスチック、または環状オレフィンポリマーもしくはコポリマーから選択されるポリマー材料からなる。
本発明は、ヒトに、前記ポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与することにより、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、以下：
（ａ）約０．１ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬの濃度のvWF結合剤；
（ｂ）約１％～約１５％（ｗ／ｖ）の濃度の、スクロース、グリシン、マンニトール、トレハロースまたはＮａＣｌから選択される賦形剤；
（ｃ）約０．００１％～０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のTween-80；ならびに
（ｄ）処方物のｐＨが約６．０～７．０となるような約５ｍＭ～約２００ｍＭの濃度のクエン酸バッファー、および処方物のｐＨが約６．５～７．５となるような約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度のリン酸バッファーから選択される、バッファー、
を含む処方物を提供し、ここで、前記用量の後で、５分間～８時間以内、例えば１５分間～４時間以内に第１の血漿交換（PE）を行う。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドまたは本明細書において記載されるような処方物を含む、患者、好ましくはヒト患者への非経口投与のために好適な医薬単位投与形態を提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記vWF関連疾患は、急性冠症候群（ACS）、一過性脳虚血発作、不安定もしくは安定狭心症、脳卒中、心筋梗塞または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）から選択される。
本発明は、vWF関連疾患により特徴づけられる疾患を罹患しやすいかまたはこれを診断されたヒト患者の処置のための方法を提供し、該方法は、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの有効量をヒト患者に投与することを含む。
本発明は、TTPなどのvWF関連疾患を処置または予防する方法を提供し、該方法は、ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの、１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与し、それにより、vWF関連疾患に関連する１または２以上の症状を軽減することを含む。
本発明は、本明細書において記載されるような処置を提供し、ここで、前記の本明細書において記載されるようなポリペプチドを投与した後で、５分間～８時間以内、例えば１５分間～４時間以内に、第１の血漿交換（PE）を行う。
本発明は、本明細書において記載されるような処置を提供し、ここで、本明細書において記載されるようなポリペプチドを投与する前に、前記第１のPEの３６時間以内、好ましくは３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８または１６時間以内、好ましくは約２４時間以内に、事前の血漿交換（PE）を行う。
本発明は、本明細書において記載されるような処置を提供し、ここで、前記第１のPEの後で、５分間～８時間以内、例えば１０分間～６時間または１５分間～４時間以内に、例えば８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間以内に、１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの本明細書において記載されるようなポリペプチドの第２の用量を投与し、例えばここで、前記第１のPEの１～６０分間以内、例えば３０分間以内に、前記ポリペプチドの前記第２の用量を、好ましくは皮下注射により投与する。
本発明は、さらに以下を含む本明細書において記載されるような処置を提供する：
（ｉ）PEを行い；（その後）
（ｉｉ）本明細書において記載されるようなポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を、ステップ（ｉ）の前記PEの１５分～４時間後に投与すること；ならびに、
（ｉｉｉ）任意に、前記患者の血小板カウントおよび／またはADAMTS13活性を測定すること,
ここで、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、任意に、前記患者の血小板カウントが≧１５００００／μｌとなるまで、および／またはADAMTS13活性がADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％またはさらには５０％になるまで、１日あたり１回、繰り返す。
本発明はまた、前記患者の血小板カウントが≧１５０．０００／μｌとなった後で、本明細書において記載されるようなポリペプチドの１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を、少なくとも５、１０、１５、２０、２５またはさらに３０日間にわたり、１日あたり１回投与することをさらに含む、本明細書において記載されるような処置を提供する。
本発明は、前記ヒトが寛解するまで、本明細書において記載されるようなポリペプチドの、１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を、１日あたり１回投与することをさらに含む、本明細書において記載されるような処置を提供する。
本発明は、ADAMTS13活性が、ADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％またはさらには５０％となるまで、前記ポリペプチドを投与することを含む、本明細書において記載されるような処置を提供する。
一態様において、本発明は、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患のリスクを減少させる、および／またはその急性のエピソードを予防するための方法に関し、該方法は、（ｉ）前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの、５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与すること；ここで、前記ポリペプチドの投与は、vWF関連疾患の急性のエピソードのリスクを減少させるか、および／またはこれを予防することを含むか、またはこれからなる。好ましくは、前記リスクは、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で減少する。好ましくは、前記リスクは、１０％またはそれより高く、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％たはそれより高く、例えば８０％または１００％までも、減少する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、本発明のポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回、または１０回より多く、例えば２０回、好ましくは３０回より多く、またはそれより多く、繰り返す。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、本発明のポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間、または１０日間より長く、例えば２０日間、好ましくは３０日間より長く、例えば２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、またはそれより長くにわたり、繰り返す。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、前記用量を、１日あたり１回または１日あたり２回投与する。
一態様において、本発明は、さらに以下を含む、本明細書において記載されるような方法に関する：
（ｉｉ）前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
（ｉｉｉ）前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；ならびに
（ｉｖ）前記ADAMTS13活性が前記参照ADAMTS13活性３０％より低い場合、例えば２０％、１５％または１０％である場合は、本発明のポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を繰り返すこと。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、前記患者のADAMTS13活性を、毎日、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日間毎に、好ましくは１週間に少なくとも１回、測定する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、本発明のポリペプチドを投与するステップ（ｉ）を、前記ADAMTS13活性が、前記参照ADAMTS13活性の少なくとも１０％、１５％、例えば２０％、または３０％、またはそれより高くなるまで、繰り返す。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、ステップ（ｉ）を、前記ADAMTS13活性が、少なくとも２回の継続的な測定において、前記参照ADAMTS13活性の少なくとも１０％、１５％、例えば２０％または３０％となるまで、繰り返す。好ましくは、前記の２回の継続的な測定は、少なくとも２４時間、より好ましくは４８時間離れている、例えば少なくとも３日間離れているか、またはそれより長く、例えば４、５、６もしくは７日間離れており、好ましくは１週間離れている。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、前記本発明のポリペプチドを投与するステップ（ｉ）を、前記ADAMTS13活性が、少なくとも２回の継続的な測定において、前記参照活性の少なくとも１０％または１５％、例えば２０％または３０％となった後で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間、または１０日間より長く、例えば２０日間、好ましくは３０日間より長く、またはそれより長くにわたり繰り返す。
一態様において、本発明は、さらに以下を含む、本明細書において記載されるような方法に関する：
－前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
－前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；ならびに
－前記ADAMTS13活性が、前記参照ADAMTS13活性の≧１０％である、例えば１５％より高い、または２０％もしくは３０％より高い場合は、前記本発明のポリペプチドを投与するステップ（ｉ）を、最長で３０日間、例えば最長で２０日間、または１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日間またはわずか１日間にわたり、繰り返すこと。
一態様において、本発明は、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患のリスクを減少させる、および／またはその急性のエピソードを予防するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
（ｉｉ）前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；ならびに
（ｉｉｉ）前記ADAMTS13活性が、前記参照活性の３０％、２０％、１５％または１０％より低い場合、前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの、５～４０ｍｇの用量を投与すること。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成のリスクは、１０％、２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも、減少する；
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成のリスクは、１．２、１．３、１．４、１．５、１．７５、２倍またはそれより高い倍率で、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で、減少する；
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％もの、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも、減少する；
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成は、２倍またはそれより高い倍率で、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で、減少する；
－臓器損傷マーカー、例えばLDHレベル、トロポニンＴ、トロポニンＩのレベル、および／またはクレアチニンレベルは、正常レベルの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％まで、または１００％までも回復する；
－臓器損傷マーカー、例えばLDHレベル、トロポニンＴ、トロポニンＩのレベル、および／またはクレアチニンレベルは、正常レベルの少なくとも２０％、例えば３０％またはそれより高く、例えば４０％、または少なくとも５０％もの、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも改善する。好ましくは、前記臓器損傷マーカー、例えばLDHレベル、トロポニンＴ、トロポニンＩのレベル、および／またはクレアチニンレベルは、３０日間未満の処置で、好ましくは、２０日間未満の処置で、例えば１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日間未満、または１日以内に改善する。
－血小板の数は、≧１５００００／μｌに保持される。
－増悪のリスクは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも低下する；
－増悪のリスクは、２倍またはそれより高い倍率で、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で低下する；
－前記vWF関連疾患に起因する死亡率は、１０％、２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも低下する；
－前記vWF関連疾患に起因する死亡率は、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で低下する。
一態様において、本発明は、血小板数を測定すること；ならびに前記血小板数が１５０，０００／μｌ未満である場合、本発明のポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を繰り返すことをさらに含む、本明細書において記載されるような方法に関する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、前記患者の血小板数を、毎日、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日間毎に、好ましくは少なくとも毎週測定する。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、前記血小板数が少なくとも１５０，０００／μｌとなるまで、本発明のポリペプチドを投与するステップ（ｉ）を繰り返す。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、前記血小板数が、少なくとも２回の継続的な測定において、少なくとも１５０，０００／μｌとなるまで、本発明のポリペプチドを投与するステップ（ｉ）を繰り返す。好ましくは、前記の２回の継続的な測定は、少なくとも２４時間、より好ましくは４８時間離れている、例えば少なくとも３日間離れているか、またはそれより長く、例えば４、５、６もしくは７日間離れており、好ましくは１週間離れている。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、少なくとも２回の継続的な測定において、前記血小板数が少なくとも１５０，０００／μｌとなった後で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間、または１０日間より長く、例えば２０日間、好ましくは３０日間より長く、またはそれより長く、前記本発明のポリペプチドを投与するステップ（ｉ）を繰り返す。好ましくは、前記の２回の継続的な測定は、少なくとも２４時間、より好ましくは４８時間離れている、例えば少なくとも３日間離れているか、またはそれより長く、例えば４、５、６もしくは７日間離れている、好ましくは１週間離れている。
一態様において、本発明は、前記患者の血小板数を測定すること；ならびに、前記血小板数が≧１５０，０００／μｌである場合、前記本発明のポリペプチドを投与するステップ（ｉ）を、最長で３０日間、例えば最長で２０日間、またはわずか１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日間、またはわずか１日間にわたり、繰り返すことをさらに含む、本明細書において記載されるような方法に関する。
一態様において、本発明はそれを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患のリスクを減少させること、および／またはその急性のエピソードを予防することに関し、該方法は少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）前記患者の血小板数を測定すること；ならびに
（ｉｉ）前記血小板数が１５０，０００／μｌ未満である場合、前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの５～４０ｍｇの用量を投与すること；
ここで、前記ポリペプチドの投与は、vWF関連疾患の急性のエピソードのリスクを減少させるか、および／またはこれを予防する。
一態様において、本発明は、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む；
（ｉ）前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの第１の用量を投与すること；
（ｉｉ）第１の血漿交換（PE）を、好ましくはステップ（ｉ）の５分間～８時間以内に行うこと。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、ここで、ステップ（ｉ）、すなわち前記ヒトに本発明のポリペプチドを投与する前に、好ましくはステップ（ｉｉ）、すなわち第１のPEを行った２４時間以内に、事前のPEを行う。
一態様において、本発明は、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：（ｉ）血漿交換（PE）を行うこと；（ｉｉ）前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与すること。好ましくは、前記ステップ（ｉ）、すなわちPEを行うこと、および前記ステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記本発明のポリペプチドを投与することを、１日あたり１回または２回、最長で１、２、３、４、５、６または７日間にわたり繰り返す。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、ここで、ステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記本発明のポリペプチドを投与することを、ステップ（ｉ）、すなわちPEを行った１５分間～４時間以内に行う。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、該方法は、以下をさらに含む：前記ヒトの血小板カウントを、好ましくはステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記本発明のポリペプチドを投与する後で測定すること；ならびに、前記血小板カウントが＜１５０，０００／μｌである場合、前記ステップ（ｉ）、すなわちPEを行うこと、および前記ステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記ポリペプチドを投与することを繰り返すこと。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、該方法は、以下をさらに含む：前記ヒトの血小板カウントを測定すること［好ましくはステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記本発明のポリペプチドを投与する後で］；ならびに、前記血小板数が、少なくとも２回の継続的な測定において少なくとも１５０，０００／μｌとなるまで、ステップ（ｉ）、すなわちPEを行うこと、およびステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記ポリペプチドを投与することを繰り返すこと［１日あたり１回／２回］。好ましくは、前記の２回の継続的な測定は、少なくとも２４時間、より好ましくは４８時間離れている、例えば少なくとも３日間離れているか、またはそれより長く、例えば４、５、６もしくは７日間離れており、好ましくは１週間離れている。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、該方法は、前記ヒトの血小板カウントが初めて≧１５０．０００／μｌとなった後で、少なくとも１～３０日間にわたり、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を、１日あたり１回投与することをさらに含む。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、該方法は、前記ヒトのADAMTS13活性を、好ましくはステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記ポリペプチドを投与した後で測定することをさらに含む。
一態様において、本発明は、本明細書において記載されるような、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードを処置するための方法に関し、ここで、ADAMTS13活性が、［初めて］参照ADAMTS13活性の１５％より高く、または２０％または３０％にもなるまで、ステップ（ｉ）、すなわちPEを行うこと、およびステップ（ｉｉ）、すなわち前記ヒトに前記本発明のポリペプチドを投与することを繰り返す。
一態様において、本発明は、それを必要とするヒトにおいて、［vWF関連疾患により引き起こされ得る］虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを減少させるか、および／またはこれを予防するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの、５～４０ｍｇ／日、好ましくは１０ｍｇ／日の用量を投与すること；ここで、前記ポリペプチドの投与は、１０％、２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも、虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを減少させるか、および／またはこれを予防する。好ましくは、前記ポリペプチドの投与は、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で、虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを減少させるか、および／またはこれを予防する。
一態様において、本発明は、前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７日間、またはより長く、例えば１週間、２週間、３週間、またはより長く、例えば１か月間または２か月間にもわたり繰り返す、方法に関する。
一態様において、本発明は、前記患者のADAMTS13活性を、好ましくは１週間ごとに１回測定することをさらに含む、方法に関する。
一態様において、本発明は、ADAMTS13活性が、［初めて］参照ADAMTS13活性の≧１０％、例えば１５％より高く、または２０％より高くなった場合に、前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７日間、またはより長く、例えば１週間、２週間、３週間、またはより長く、例えば１か月間または２か月間にもわたり繰り返す、方法に関する。
一態様において、本発明は、TTPなどのvWF関連疾患の症状を、前記疾患を罹患しているヒトにおいて処置する方法に関し、該方法は、前記疾患を罹患しているヒトにおいてvWF関連疾患の症状を処置するために有効な量で投与することを含む。
一態様において、本発明は、ヒトにおいてTTPなどのvWF関連疾患の発症または進行を阻害する方法に関し、その阻害は、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを、vWFに結合させることによりもたらされ、これは、ヒトに規定の間隔で前記ポリペプチドの有効阻害用量を投与することを含み、ここで、ポリペプチドの各投与は、それによりヒトにおける疾患の発症または進行を阻害するように、ヒトに、ヒトの体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～２５ｍｇを送達する。
一態様において、本発明は、ヒトがvWF関連疾患による虚血性臓器損傷を罹患する可能性を減少させる方法に関し、該方法は、ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを、規定の用量で投与することを含み、ここで、抗体の各投与は、それによりヒトが虚血性臓器損傷を罹患する可能性を減少させるように、ヒトに、ヒトの体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～２５ｍｇを送達する。
４．図面の説明
処置のフローチャート. 第１のLDHの正常化までの時間の曲線（ITT集団＝ベースラインで異常な高レベルを有する対象）。 処置企図（Intent-To-Treat）集団における、ベースラインで異常な高レベルを有する対象についての、トロポニンＴまたはＩ正常化までの時間の曲線。 処置企図集団における、ベースラインで異常な高レベルを有する対象についての、クレアチニンの正常化までの時間の曲線。
TTP患者におけるvWFレベル：モデルにより予測される、プラセボで処置された患者を含む、期間２の終了時における、日用量レベルの関数としての、遊離vWFレベルのベースラインからの減少の％。中央値、２５および７５パーセンタイルを示す。 カプラシズマブ（caplacizumab）ならびに遊離の総vWFおよび複合体化vWFのPK/PDモデル：（Ａ）期間１および期間２（毎日のPEの併用ありおよびなし）の間の毎日のｓ．ｃ．投与の後での、モデルにより予測されるカプラシズマブ濃度プロフィール。（Ｂ）毎日１０ｍｇのカプラシズマブのｓ．ｃ．投与の間、および処置期間の後の、モデルにより予測される遊離vWFレベル。（Ｃ）毎日１０ｍｇのカプラシズマブのｓ．ｃ．投与の間、および処置期間の後の、概算される複合体カプラシズマブ－vWFレベル。（Ｄ）毎日１０ｍｇのカプラシズマブのｓ．ｃ．投与の間、および処置期間の後の、モデルにより予測される総vWFレベル。中央値プロフィール、５および９５パーセンタイルを示す。
５．詳細な説明
他に示されない限り、特に詳細に記載されない全ての方法、ステップ、技術および操作は、それ自体公知の様式において行うことができ、行われたことは、当業者には明らかであろう。やはり例えば、標準的なハンドブックおよび本明細書において言及される一般的な背景技術について、およびそれらにおいて引用されるさらなる参考文献について、ならびに以下の総説について言及がなされる；Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6)：640-56；Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1)：49-57；Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45；Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43。これらは、親和性成熟などのタンパク質工学のための技術、ならびに免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性および他の所望される特性を改善するための他の技術を記載する。
本明細書において用いられる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の言及を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「試薬（a reagent）」への言及は、かかる異なる試薬の１または２以上を含み、「方法（the method）」への言及は、本明細書において記載される方法を修飾するかまたはこれを置換することができる、当業者に公知の等価なステップおよび方法への言及を含む。
他に示されない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一連のものの中の全ての要素に言及するものと理解されるべきである。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される特定の態様に対する多くの均等物を理解するか、これを確認することができる。かかる均等物は、本発明により包含されることを意図される。
用語「および／または」は、本明細書においていずれにおいて用いられる場合であっても、「および」、「または」および「前記用語により結合させる要素の全てまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
用語「約（about）」または「約（approximately）」は、本明細書において用いられる場合、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、および最も好ましくは５％以内を意味する。
本明細書およびそれに続く請求の範囲全体にわたって、文脈が他を要求しない限り、単語「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などのバリエーションは、記述された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むことを示すものと理解されるが、任意の他の整数もしくはまたは整数もしくはステップの群を排除することを示すものではない。本明細書において用いられる場合、用語「含むこと（comprising）」は、用語「含むこと（containing）」または「含むこと（including）」または時に、本明細書において用いられる場合は、用語「有すること（having）」で置換することができる。
ALX 0081などの本発明のポリペプチドのTTPのセッティングにおける潜在的治療能力は、TTP患者からの血漿を用いるフローチャンバー実験におけるin vitro 実験により実証された。これらの実験において、内皮細胞を、それらの表面上にULvWFのストリングを産生するように刺激した（例７．２を参照）。ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、血小板－vWF相互作用および特にULvWFにより媒介される血小板相互作用をin vitroで阻害することができたことが示され、また、ADAMTS13の機能に対して影響を及ぼさなかったことが示された。特に、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、活性な（すなわち、通常のサイズの多量体として、および超巨大多量体として、GPIb-IX-Vとの相互作用のために機能的である）ステージのvWFと、およびその不活性なステージ（A1ドメインの立体構造的変化の前の通常のサイズの多量体）のvWFと相互作用することができることが示された。研究は、ALX 0081などの本発明のポリペプチドを、TTP患者を処置するために用いることができるという概念の証明を示した。研究はまた、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、ADAMTS13活性を妨害しないことを証明する。
本発明は、少なくとも部分的に、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（本明細書において「本発明のポリペプチド」としてもまた言及される）の、ヒトTTP患者への投与は、応答までの時間の２日間の予想外の短縮を提供するという知見に基づく。応答までの時間は、血小板の≧１５０，０００／μＬまでの回復のために必要な時間により客観化される。加えて、本発明は、予想外に持続する長期の効果、増悪の減少、入院の減少、罹患率の減少、必要とされるPEの回数の減少、虚血の減少、臓器損傷の減少および死亡数の減少を提供する。
したがって、本発明は、血小板回復の促進により示される応答までの時間の予想外に大きな短縮により、患者においてvWF関連疾患を処置または緩和するための、本発明のポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、より低頻度のPEを提供しつつ、一方で、ヒト患者において予想外に長期間において、なお血小板回復を維持する。したがって、患者に本発明のポリペプチドを投与することにより、ヒト患者における応答までの時間を短縮するための方法が提供され、ここで、投与されるポリペプチドの量は、TTPの１または２以上の疾患マーカー、例えば血小板の数、血小板減少症、神経認知機能、ADAMTS13（トロンボスポンジンリピートを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ１３（a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin repeats 13））のレベルおよび抗ADAMTS13抗体タイター、ADAMTS13活性レベル、心臓マーカー（トロポニンＴまたはトロポニンＩ）、BNP（脳性ナトリウム利尿ペプチド）またはＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT proBNP）、ならびに脳損傷マーカー（例えばNSE（神経特異的エノラーゼ）およびSβ100（S100ベータ））、好ましくは血小板の数の増加を変化させるために有効である。
加えて、本発明のポリペプチドは、ヒトTTP患者に投与された場合に安全であったことが、安全検査マーカー、例えばRICO、vWFおよびFVIII色素原により試験された。出血のリスクの増大についての可能性は存在するが、これは完全に管理可能であった。
マーカーは、当業者に公知であり用いられる標準的な方法、例えば多様な免疫学に基づくアッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA；また酵素イムノアッセイ（EIA）としても知られる）、ラジオイムノアッセイまたは免疫酵素学的（immunoenzymetric）アッセイを用いて測定することができる。化学、比色分析および酵素に基づくアッセイもまた、好適である場合には用いることができる。
したがって、本発明は、ヒトに、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇの用量を投与することによる、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチドを提供し、ここで、前記用量の後で、１５分間～４時間以内に、第１の血漿交換（PE）を行う。
vWF関連疾患、例えばTTPを、処置または予防する（例えば、それに関連する１または２以上の症状を軽減または緩和する）ために、本発明のポリペプチドを、補助的処置として、PEの手法に対して相対的な特定の時点において投与した。
用語「処置すること」とは、統計学的に有意な程度まで、または当業者に検出可能な程度まで、疾患に関連する状態、症状もしくはパラメーターを改善するため、または疾患の進行を予防するために、有効な量、様式および／またはモードにおいて、治療を施すことを指す。治療的使用の場合、処置は、対象において疾患または状態を、改善するか、治癒させるか、維持するか、またはその期間を短縮することができる。治療的使用において、対象は、症状の部分的または完全な徴候を有していてよい。典型的な場合において。処置は、対象の疾患または状態を、医師により検出可能な程度まで改善するか、疾患または状態の悪化を予防する。例えば、表１において表されるか、またはTTP 処置のガイドラインにおいて提供されるような、TTPの急性のエピソードにおける臨床的特徴および兆候（Scully et al. 2012、上記）が改善する。例えば、処置に起因して、血小板カウントが正常化し、ADAMTS13自己抗体のタイターが低下し、および／またはADAMTS13活性 が増大する。これらは全て、当該分野において公知であり、および／または本明細書においてさらに詳述される（下記を参照）。有効量、様式またはモードは、対象に依存して変化し得、対象に合わせることができる。
本明細書において用いられる場合、用語「予防すること」とは、言及されている障害の症状を緩和することを意味する。特に、前記用語は、本発明のポリペプチドを対象に投与することの治療上の正の効果の完全な範囲を包含し、これは、vWF関連障害、例えばTTP、およびその症状の、軽減、緩和およびそれからの解放を含む。用語「予防」は、疾患の発症の予防または延期、症状の発症の予防または延期、および／または発症するであろうか、もしくは発症すると予測される症状の重篤度の軽減を含む。これらはさらに、既存の症状を寛解させること、さらなる症状を予防すること、および症状の根底の原因を寛解させるかまたは予防することを含む。
本明細書において用いられる場合、用語「対象」と「患者」とは、交換可能に用いられる。本明細書において用いられる場合、用語「対象」および「対象」は、動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）および霊長類（例えば、カニクイザル、ゴリラ、チンパンジーなどのサル、およびヒト）を含む哺乳動物を指す。「患者」は、好ましくは、ヒトを指す。前記患者は、あらゆる年齢からの高齢者、成人、青年および小児、例えば２歳～１２歳未満の範囲の小児、１２歳～１８歳未満の範囲の青年、１８歳～６５歳未満の範囲の成人、および６５歳以上の高齢者を含み得る。
処置することができるvWF関連疾患の非限定的な例として, 限定されないが、例えば急性冠症候群（ACS）、一過性脳虚血発作、不安定もしくは安定狭心症、脳卒中、心筋梗塞, 血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）およびUpshaw-Schulman症候群、好ましくはTTPが挙げられる。
例えばTTPなどのvWF関連疾患を処置するためのPEの手法は、「the Guidelines on the diagnosis and management of TTP and other thrombotic microangiopathies」（Scully et al. 2012、上記）において記載されており、これは、本明細書において明示的に参考として援用される。完全寛解は、正常な血小板カウント、すなわち≧１５０，０００／μｌ、および任意に、増悪が存在しないこととして定義される（上記Scully et al. 2012を参照）。
本明細書において用いられる場合、「応答までの時間」は、急性のTTPのエピソードを有する患者の第１の処置と、≧１５０，０００／μｌの血小板カウントとの間の時間であり、ここで、第１の処置は、PEまたは本発明のポリペプチドの投与、または両方であり、いずれが最も初期であってもよい。
用語「血漿交換」（「PE」）とは、血漿のバルク除去を通して、TTPを含む多様な疾患を処置するために用いられる治療的手法、すなわち、大容積、通常は１～１．５血漿容積の血漿を取り除き、これを補充液で置き換える手法を指す（Winters 2012 Hematology ASH Education Book 1:7-12）。血漿のバルク除去および置き換えを通して、PEは、ADAMTS13およびULvWFに対する自己抗体などの病因物質を取り除くが、また一部の血小板も取り除く。血漿は、血栓性血小板減少性紫斑病を処置する場合、ADAMTS13を置き換えるために補充液として用いられる（McLeod Best Pract Res Clin Haematol. 2006；19:157-167）。血漿のバルク除去および置き換えはまた、臨床検査のために意味を有し、患者の検査を複雑にしている。
PEは、血漿のバルク除去を伴うので、血漿中を循環するものは何でも取り除かれる。したがって、この手法は、非選択的であり、正常および病的な両方の血漿成分を取り除くが、また、PEの前に投与されたTTPを処置するための任意の医薬をも取り除く。
当業者は、血小板の数を決定することを熟知している。血小板カウントは、当該分野において公知の任意の方法により、例えば血球計数器を用いてマニュアルで、または自動化された分析器、例えば電子計数により、行うことができる。カウントはまた、血液スメア検査の間に概算することができる。顕微鏡法は、位相差顕微鏡を用いて、血球計数スライド上の血液を観察する。血小板の電子計数は、最も一般的な方法である。電圧パルスおよび電気光学計数システムの２つの型の電子計数が存在する。例えば、ADVIA血液学分析器を用いて血小板カウントを得、得られたカウントを、ライト染色された血液スメアにおいてカウントを概算することにより検証することができる。ADVIAは、光散乱の原理に基づいてフローサイトメトリーにより血小板を測定する。例えば、血小板は、それらのサイズ（＜３０ＦＬ、小角光散乱）および屈折率（ｎ＝１．３５～ｎ＝１．４０または大角（high angle）光散乱）により同定される。
多様な患者において、TTPの急性のエピソードの後で、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含む本発明のポリペプチド、例えばALX 0081を、前記患者がPE（「事前のPE」；本発明のポリペプチドの第１の用量に先行するPE）を受けた後で、投与する。事前のPEを受けた対象の群（「無作為化前の１回のPEX」としても示される）において、応答までの時間の中央値は、プラセボ群についての４．３１日間から、処置群についての２．４４日間へと、予想外に２日間減少したことが観察された：４３％減少（表５；無作為化前のPEX＝あり）。
したがって、本発明は、PE（事前のPE）を、それを必要とする患者、例えばTTPの急性のエピソードを有する患者に対して行い、その後、次のPEを、前記事前のPEの２４時間以内に行い、前記次のPEを開始する約８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間前、例えば前記次のPE（「第１のPE」）を開始する６時間～１５分間前に、本発明のポリペプチド（「第１の用量」）を投与することに関する。本発明において、用語「第１の用量」は、例えばTTPの急性のエピソードまたは全ての急性のエピソードの後での、それを必要とする患者に対する本発明のポリペプチドの第１の投与を意味する。
一態様において、本発明のポリペプチドの、好ましくは第１の用量の、患者への投与の後で、５分間～８時間以内、例えば１０分間～６時間または１５分間～４時間以内、例えば８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間以内に、PEを行う。
本発明において、用語「第１のPE」は、本発明のポリペプチドの第１の用量の患者への投与の後の（または一部の場合においてはそれと同時の）、第１のPEを意味する。
本発明のポリペプチドは、液体の形態（例えば、注射可能および注入可能な溶液）において、投与するかまたは投与のために用いることができる。かかる組成物は、非経口のモード（例えば、皮下、腹腔内または筋肉内注射）により、または吸入により投与することができる。句「非経口投与」および「非経口で投与される」とは、本明細書において用いられる場合、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与のモードを意味し、皮下（ｓ．ｃ．）または筋肉内投与、ならびに静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、表皮下、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。好ましくは、本明細書において記載される本発明のポリペプチドの第２のまたはさらなる用量は、皮下で投与される。
好ましくは、TTPの急性のエピソードの後の本発明のポリペプチドの第１の用量の投与は、静脈内ボーラス注射であり、これは、例えばポリペプチドを、静脈内ラインを通して送達し、これは、１または２分間の期間にわたり全て一度に投与される。さらにより好ましくは、TTPの急性のエピソードの後の本発明のポリペプチドの第１の用量の投与は、静脈内プッシュ注射であり、これは、例えばポリペプチドを、静脈内ラインを通して送達し、これは、約３０秒間またはそれ未満の期間にわたり全て一度に投与される。
驚くべきことに、PEの前（この時間においては、ULvWFにより媒介される血小板凝集の活性なプロセスの直接的な薬理学的ターゲティングが存在せず、前記PEがポリペプチドを取り除くと予測され得る）に投与された本発明のポリペプチドが（事前のPEなしでも）、なお応答までの時間の中央値を、プラセボ群についての４．９２日間からカプラシズマブ群についての３．００日間への２日間の予想外に大きな短縮により、短縮することができたことが見出された：３９％短縮（表５：無作為化前のPEX＝なし）。
本発明者らは、本発明のポリペプチドは、健康な志願者における先の研究およびTTP患者による本研究（例７．５．３を参照）において実証されたとおり、安全に使用されること、TTP、特にTTPの急性発作は、診断することが困難であり得ること、ならびに処置を開始する前に失われた任意の時間が不運をもたらすことを考慮し、この知見は、本発明のポリペプチドによる処置が、時宜を得て既に、患者が病院に入る前に、例えば救急車の車内などで開始されていてもよいという利益を有すると結論付けた。好ましくは、本発明のポリペプチド、例えばALX 081は、静脈内プッシュ注射により投与される。なぜならば、このことは、病院の外で容易に行うことができ、したがって価値ある時間を無駄にしないからである。
したがって、本発明は、それを必要とする患者、例えばTTPの急性のエピソード（急性発作）を有する患者に、本発明のポリペプチドを、PEを開始する約８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間前、例えばPEを開始する６時間～１５分間前に投与することに関する（「第１の用量」）。
一態様において、TTPの急性のエピソードの後の本発明のポリペプチドの第１の用量の投与の後で、PEを行う（「第１のPE」）。この第１のPEは、その前に事前のPEが行われるか否かに関わらず、その後に、本発明のポリペプチドの第２のまたはさらなる用量の投与を行う（「第２の用量」または「さらなる用量」）。好ましくは、第２の用量またはさらなる用量は、第１のPEの後、１２０、９０または６０分間以内、例えば１～６０分間以内、例えば５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２またはわずか１分間以内に投与する。いくつかの場合において、第２のまたはさらなる用量を、補充液、例えばPEの血漿と一緒に、またはこれと同時に投与することは、有利であり得る。
さらなる態様において、本発明のポリペプチドの第１の用量、第２の用量またはさらなる用量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５または４０、５０、６０、７０または８０ｍｇ、好ましくは５～４０ｍｇ、さらにより好ましくは１０ｍｇであり、これは、それを必要とする患者に、好ましくは１日あたり、投与することができる。幼年期の患者、例えば小児または青年などへの投与のために、用量は、患者の体重に対して調整することができる。特定の態様において、用量は、約０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１２、０．１４、０．１５、０．１６、１．０８、０．２、０．２２、０．２４または０．２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１４３ｍｇ／ｋｇであり、これは、７０ｋｇの成人において１０ｍｇの用量に相当する。
一態様において、本発明は、PE、例えば第１のPE、第２のPEまたはさらなるPEの手順の後、１～６０分間以内の、約５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの本発明のポリペプチド、例えばALX 0081の投与に関する。
一態様において、本発明のポリペプチド、例えばALX 0081を、１日あたり１回または１日あたり２回、それを必要とするTTP患者、好ましくは血漿１μｌあたり１００，０００未満の血小板カウントを有する患者、および／または≦１０％、例えば≦５％のADAMTS13活性を有する患者に投与する：
さらなる態様において、それを必要とするTTP患者を、以下：
（ｉ）PE；ならびに、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記PEの６０分間～１分間後に、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量、
で処置し、ここで、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、１日あたり１回または２回、前記患者の血小板カウントが、血漿１μｌあたり少なくとも５０，０００、例えば血漿１μｌあたり７５，０００、１００，０００、１２５，０００または１５０，０００にもなるまで繰り返す。
いくつかの場合において、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、完全寛解（血漿１μｌあたり≧１５０，０００の血小板カウント）の後、最低２日間にわたり繰り返すことが、有利であり得る。
一態様において、５～４０ｍｇの本発明のポリペプチドを、前記患者の血小板カウントが血漿１μｌあたり≧１５０，０００となった後、または最後のPEの後（前記患者のADAMTS13活性が≦１０％、例えば≦５％である場合は特に）、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、６０、９０または１２０日間にもわたり、毎日、または毎日２回投与する。
層別化によりデータを評価する場合（無作為化前の１回のPEX：あり＆なし）、全集団についての全ハザード比は、２．１９７まで凝集し、ｐ値＝０．０１３であった。このハザード比は、任意の時間において、本発明のポリペプチドを投与されている対象は、確認された血小板回復の一次エンドポイントを達成する比率が、プラセボを投与されている対象と比較して２倍を超えることを意味する。加えて、この血小板回復は、処置群において２日早く達成される。
したがって、ヒトTTP患者への、TTPの急性のエピソードの後の、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）の投与は、前記ポリペプチドの投与および前記PEの順序に関わらず、例えば本発明のポリペプチドの第１の用量の投与の前に行われるか、後に行われるかに関わらず、応答までの時間の予想外の短縮をもたらす。
さらに驚くべきことに、増悪の数が、プラセボ群における１１からカプラシズマブ群における３へと減少したことを見出した。したがって、プラセボ群（すなわち、PEと、本発明のポリペプチドの代わりにプラセボとを投与されているTTP患者）においては、処置群（すなわち、PEと本発明のポリペプチドとを投与されているTTP患者；カプラシズマブ群としても示される）と比較して、３倍多い増悪が存在する。用語「増悪」とは、本明細書において用いられる場合、確認された血小板応答の後の再発性の血小板減少症であって、最後のPEの後、１日以上であるが３０日以下に、毎日のPE処置の再開始を必要とするものを指す。
このことは、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、単独で、TTP（の症状）を処置および／または緩和する原因となり得ることを示す。
したがって、本発明は、ヒトに、前記ポリペプチドの、１～８０ｍｇまたは５～４０ｍｇ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０または８０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与することにより、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）に関する。
この驚くべき知見に基づいて、本発明者らは、本質的には、確認された血小板応答時間の分布は、CAP群において、プラセボ群と比較して、より短く、右（より長い応答までの時間）に傾斜しておらず、偏向してもいないというアイディアに基づいて、さらに最適化された処置プロトコルを設計した。
さらなる最適化された処置プロトコルにおいて、全ての対象を、固定されたPE 処置期間で処置し、これは、３～５日間、例えば３日間または４日間または５日間、好ましくは３日間に設定される。この場合、PE 処置期間は、血小板の回復（≧１５０，０００／μｌ）に非依存的であり得る。さらなる最適化された処置プロトコルにおいて、患者の負荷およびコストが減少する。
したがって、本発明は、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）に関し、前記使用は、（ｉ）PEを行うこと；ならびに（ｉｉ）本発明のポリペプチドの５～４０ｍｇ、例えば１０ｍｇの用量を、ステップ（ｉ）の前記PEの１５分間～４時間後に投与すること、ここで、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、３～５日間、例えば３日間、４日間または５日間、好ましくは３日間にわたり、１日あたり１回繰り返すことを含み；ならびに、その後、前記患者の血小板カウントが、初めて≧１５０．０００／μｌとなった後、５～４０ｍｇ、例えば１０ｍｇの前記ポリペプチドの用量を、少なくとも１０日間、例えば少なくとも２０日間または少なくとも３０日間にわたり、および／または少なくとも１０日間、例えば少なくとも２０日間または少なくとも３０日間にわたり、１日あたり１回投与することをさらに含む。
本研究において、１年までTTP患者を寛解について経過観察した。用語「寛解」とは、本明細書において用いられる場合、確認された血小板応答および増悪が存在しないこととして言及される。用語「確認された血小板応答」とは、本明細書において用いられる場合、応答までの処置の時間を指し、これは、≧１５０，０００／μＬの血小板の回復により定義され、その応答を、１５０，０００／μＬを超える血小板回復の最初の報告の４８時間後の時点で、≧１５０，０００／μＬの血小板の新たな測定により、および好ましくはLDH≦2 X ULNにより確認しなければならない。
本明細書において示されるとおり（例７．５．５；表８）、全体的に、プラセボ群における１８人の患者と比較して、処置群においては２９人の患者が寛解した。したがって、処置群は、プラセボ群に対して１．６倍多い完全寛解した対象を示す。
上記のとおり、血小板カウントは、寛解を評価するための主要な手段である。古典的TTPの既往歴を有する患者におけるADAMTS13活性の測定は、低いレベルが再発の予測因子であることが示されているので、重要である。しかし、現在、ADAMTS13に対する阻害抗体のタイターが重要であるか否か、すなわち、高いタイターの抗ADAMTS13抗体を有する個体が、低いタイターを有する個体よりも再発する可能性が高いか否かは、不明である（かつデータは矛盾している）。当業者は、ADAMTS13の現在の検査は、静的状態下において行われ、in vivoで起きる生理学的変化を常に正確に反映しているわけではないことを理解する（http://practical-haemostasis.com/Miscellaneous/Miscellaneous%20Tests/adamts13_assays.html）。
本発明者らは、今や、予想外に、処置、例えばALX 0081などの本発明のポリペプチドの第１の用量を投与することを開始したときに低い（すなわち１０％未満、例えば５％未満の）ベースラインADAMTS13活性を有する対象のサブグループについて、寛解がよりはっきりと表れることを観察した（例７．５．８を参照）。
したがって、本発明は、前記ヒトに、前記ヒトの血小板カウントが≧１５００００／μｌとなるまで、前記ポリペプチドの１～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの第１の用量を投与することにより、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチドに関する。好ましい側面において、前記ヒトは、前記ポリペプチドを投与するときに、１０％未満、例えば５％未満のADAMTS13活性を有する。
本研究において、１年までTTP患者を再発について経過観察した。用語「再発」とは、本明細書において用いられる場合、最後の毎日のPEの３０日後より後、例えばTTP患者が完全寛解を示した０～２日後に起こる、TTPの新たなイベントを指す。本研究において、「３０日後より後の」日は、本発明のポリペプチドの最後の投与と一致する。
本発明のポリペプチドをそれ以上投与しなかったが、カプラシズマブ群における再発の数は、プラセボ群における再発の数と同等であった（例７．５．４中の表７を参照）。
本発明者らは、いずれの処置群においても、再発は、＜１０％、例えば＜５％のベースラインADAMTS13活性を有する患者において、より顕著であることを観察したが、ADAMTS13活性は、患者のサブセットにおいてのみ利用可能であった。本発明者らは、このことは、＜１０％、例えば＜５％のベースラインADAMTS13活性を有する患者は、ALX 0081などの本発明のポリペプチドの投与を停止した場合に、より再発（または増悪）しやすいことを示し得ると仮定した
特に、データは、TTPの再発についての予測マーカーとしてのADAMTS13活性の使用および処置決定のためのその潜在能力を支持する。ADAMTS13活性は、カプラシズマブ処置を停止した後短期間に起こる再発を予測することができる。これらの再発は、症候性のTTPエピソード（持続的に低いADAMTS13活性に基づく未解消の疾患活性）の再発であるものと考えられる。カプラシズマブによる３０日間の処置期間（PE後）は、増悪の数に対して著しい影響を示した。したがって、再発のリスクがある（すなわちADAMTS13活性に基づく基礎疾患活性を有する）患者についてカプラシズマブ処置期間を延長することは、基礎疾患が適切に処置され解消するまで、カプラシズマブの保護的効果を維持するであろう。逆に、カプラシズマブによる予防的処置は、新たなTTPの急性のエピソードのリスクを減少させるであろう。
したがって、ALX 0081などの本発明のポリペプチドによる処置は、高い活性を有する患者と比較して、より長い期間にわたり継続されるべきである。本発明のポリペプチドは、再発のリスクを減少させるため、および／または再発の機会を予防するために、ADAMTS13活性が、正常な活性または参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％にもなるまで、TTP患者に投与されるべきである。
したがって、本発明は、ステップ（ｉ）：前記ヒトに、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与することを含む、それを必要とするヒトにおいて、vWF関連疾患（例えばTTP）のリスクを減少させること、および／またはその急性のエピソードを予防することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドに関する。好ましくは、前記リスクは、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い倍率、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で減少する。好ましくは、前記リスクは、１０％またはそれより高く、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％またはそれより高く、例えば８０％または１００％までも、減少する。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記ヒトに前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回、または１０回より多く、例えば２０回、好ましくは３０回より多く、またはそれより多く繰り返す。
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ヒトに前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間、または１０日間より長く、例えば２０日間、好ましくは３０日間より長く、例えば２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、またはそれより長くにわたり、繰り返す。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記用量を、１日あたり１回または１日あたり２回投与する。
したがって、本発明は、さらに以下を含む、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関する：
（ｉｉ）前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
（ｉｉｉ）前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；ならびに
（ｉｖ）前記ADAMTS13活性が、前記参照ADAMTS13活性の３０％未満、例えば２０％、１５％、１０％または５％である場合、前記ヒトに前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を繰り返すこと。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記患者のADAMTS13活性を、毎日、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０日間毎に、好ましくは１週間に少なくとも１回、測定する。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記ADAMTS13活性が、前記参照ADAMTS13活性の少なくとも５％、１０％、１５％、例えば２０％、または３０％もしくはそれより高くにすらなるまで、ステップ（ｉ）を繰り返す。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記ADAMTS13活性が、少なくとも２回の継続的な測定において、前記参照ADAMTS13活性の少なくとも５％、１０％、１５％、例えば２０％または３０％となるまで、前記ヒトに前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を繰り返す。好ましくは、前記の２回の継続的な測定は、少なくとも２４時間、より好ましくは４８時間離れている、例えば少なくとも３日間離れているか、またはそれより長く、例えば４、５、６もしくは７日間離れており、好ましくは１週間離れている。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記ADAMTS13活性が、少なくとも２回の継続的な測定において、前記参照活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、例えば２０％または少なくとも３０％となった後、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日間、または１０日間より長く、例えば２０日間、好ましくは３０日間より長く、またはそれより長くにわたり、前記ヒトに前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を繰り返す。
したがって、本発明は、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患のリスクを減少させること、および／またはその急性のエピソードを予防することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドに関し、前記使用は、ステップ（ｉ）：前記ヒトに、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与することを含み、さらに以下を含む：
－前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
－前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；ならびに
－前記ADAMTS13活性が、前記参照ADAMTS13活性の≧５％、例えば≧１０％、または≧１５％まで、または２０％より高く、または３０％である場合、前記ステップ（ｉ）を、最長で３０日間、例えば最長で２０日間、または１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日間、またはわずか１日間にわたり、繰り返す。
したがって、本発明は、それを必要とするヒトにおいて、TTPなどのvWF関連疾患のリスクを減少させること、および／またはその急性のエピソードを予防することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドに関し、該使用は、少なくとも以下のステップを含む：
（ｉ）前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
（ｉｉ）前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；ならびに
（ｉｉｉ）前記ADAMTS13活性が、前記参照活性の３０％、２０％、１５％、１０％または５％より低い場合、前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含む、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与すること。
本明細書において用いられる場合、リスクまたは発生率を減少させることは、対象について、適切な、例えば未処置の対照集団、または同じ対象において本発明による処置の前と比較して、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果の可能性または発生率を低下させることを含む。
TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果は、本明細書において用いられる場合、臓器損傷、虚血性損傷、微小血栓形成、増悪、死亡、再発を含み、TTPなどのvWF関連疾患の１または２以上の疾患マーカーは、血小板の数、血小板減少症、神経認知機能、ADAMTS13レベルおよび抗ADAMTS13抗体タイター、ADAMTS13活性レベル、心臓マーカー（トロポニンＴまたはトロポニンＩ）、BNP（脳性ナトリウム利尿ペプチド）またはＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（NT proBNP）、クレアチニン、ならびに脳損傷マーカー（例えばNSE（神経特異的エノラーゼ）およびSβ100（S100ベータ））、好ましくは臓器損傷マーカー、例えばLDHレベル、トロポニンＴおよび／もしくはトロポニンＩのレベル、ならびに／またはクレアチニンレベルを含む。
リスクまたは発生率の減少は、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果の発症を遅延させるかまたは予防することを含んでもよい。リスクまたは発生率は、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果の重篤度が臨床的関連性のないレベルまで低下する場合にも、減少し得る。すなわち、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果は、存在してもよいが、対象の生命、活動および／または福祉を脅かさないレベルである。いくつかの状況において、TTPなどのvWF関連疾患の発生は、対象が処置期間の間、および／またはその後に、TTPなどのvWF関連疾患の任意の兆候を提示しない程度まで、減少する。
ある個体について、リスクが減少したという実際の証左を得ることはできないことが理解されるであろう。なぜならば、処置が提供される場合、かかる処置の不在下において、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果が起こったであろうか否か、またはそれらがより早く起こったか否かを述べることはできないからである。したがって、リスク、リスクの増大または減少の概念は、統計値のみを指す。さらに、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果のリスクの減少は、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果の重篤度の減少において、ならびに、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果の観察の不在または観察の遅延において、反映されてもよい。
本発明のポリペプチドは、TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードのリスクを減少させるか、および／またはこれを予防することが理解されるであろう。したがって、TTPなどのvWF関連疾患の兆候、症状または結果もまた減少する。ULvWFのストリングが微小血栓の形成において血小板を消費するという後天性TTPの病態生理学を考慮すると、血小板カウントの回復は、さらなる微小血栓形成の予防の間接的な尺度である。後天性TTPに関連する罹患率および急性死亡率は、これらの微小血栓の結果である。
実際に、この推論は、臓器損傷マーカーの正常化により支持される。特に、結果は、臓器損傷マーカー、例えばトロポニンＩおよびＴ、LDHおよびクレアチニンが、本発明のポリペプチド、例えばALX 0081を投与されている対象において、プラセボを投与されている対象より早く正常レベルまで戻ることを示す（例７．５．７を参照）。
したがって、結果は、これらの臓器損傷マーカーのより迅速な正常化速度は、より良好な臨床成績、すなわち、微小血栓により引き起こされる臓器虚血に起因する臓器損傷のリスクが減少し、これらがより少なくなることに関連付けられることを示唆する。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるような方法に関し、ここで、
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成のリスクは、１０％、２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも減少する（例えばvWF関連疾患に起因する臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成の不在）；
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成のリスクは、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で減少する；
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にすら減少する；
－臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成は、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で減少する；
－臓器損傷マーカー、例えばLDHレベル、トロポニンＴ、トロポニンＩのレベル、および／またはクレアチニンレベルは、正常レベルの少なくとも４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にすら戻る；
－臓器損傷マーカー、例えばLDHレベル、トロポニンＴ、トロポニンＩのレベル、および／またはクレアチニンレベルは、正常レベルの少なくとも２０％、例えば３０％またはそれより高く、例えば４０％、または少なくとも５０％もの、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にすら改善する。好ましくは、前記臓器損傷マーカー、例えばLDHレベル、トロポニンＴ、トロポニンＩのレベル、および／またはクレアチニンレベルは、３０日間未満の処置で、好ましくは、２０日間未満の処置で、例えば１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日間未満、または１日以内に改善する。
－血小板の数は、≧１５００００／μｌに保持される。
－血小板正常化（≧１５００００／μｌ）までの時間は、少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、３９％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％も、例えば６０％、７０％、８０％も短縮される。
－増悪のリスクは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または少なくとも５０％も、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にすら低下する；
－増悪のリスクは、２倍またはそれより高い倍率で、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で低下する；
－前記vWF関連疾患に起因する死亡率は、１０％、２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％にすら低下する；
－前記vWF関連疾患に起因する死亡率は、２倍またはそれより高い倍率で、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で低下する；ならびに／あるいは
－寛解は、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で増加する。
用語「参照活性」とは、本明細書において用いられる場合、行われるアッセイにおける５個体の健康な対象の平均のADAMTS13活性を指し、これが１００％に設定される。例えば、FRETS-vWF73アッセイにおいて、正常ヒト血漿プールを用いて作成されたカリブレーション曲線において、各カリブレーション試料について回帰曲線の傾きを計算し、カリブレーション曲線を作製するために用いられる（傾向線：ｙ＝ａｘ＋ｂであり；ｘ＝ADAMTS13（％）およびｙ＝デルタRFU／デルタ時間）。次いで試料のADAMTS13活性（％）を、（ｙ－ｂ）×１／ａとして計算する。実際に、一般的に、再発した患者は、再発しなかった患者より低いADAMTS13活性を有した。
したがって、本発明は、それを必要とするヒトにおいて、例えばTTPなどのvWF関連疾患により引き起こされ得る虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを減少させるか、および／またはこれを予防するための、ポリペプチドに関し、これは、少なくとも以下のステップを含む：（ｉ）前記ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの、５～４０ｍｇ／日、好ましくは１０ｍｇ／日の用量を投与すること；ここで、前記ポリペプチドの投与は、虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを、少なくとも１０％、２０％、３０％、好ましくは少なくとも４０％、または少なくとも５０％にも、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％までも、減少させるか、および／またはこれを予防する。好ましくは、前記ポリペプチドの投与は、虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で、減少させるか、および／またはこれを予防する。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるような虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを減少させるか、および／またはこれを予防するための、ポリペプチドに関し、ここで、前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７日間、またはより長く、例えば１週間、２週間、３週間、またはより長く、例えば１か月間または２か月間にもわたり繰り返す。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるような虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを減少させるか、および／またはこれを予防するための、ポリペプチドに関し、これは、前記患者のADAMTS13活性を、好ましくは１週間ごとに１回測定することを、さらに含む。
したがって、本発明は、本明細書において記載されるような虚血性損傷、臓器損傷および／または微小血栓形成のリスクを減少させるか、および／またはこれを予防するための、ポリペプチドに関し、ここで、ADAMTS13活性が［初めて］参照ADAMTS13活性の≧５％、例えば≧１０％、または≧１５％にもなった場合、前記ポリペプチドを投与する前記ステップ（ｉ）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７日間、またはより長く、例えば１週間、２週間、３週間、またはより長く、例えば１か月間または２か月間にもわたって繰り返す。
したがって、本発明は、TTPなどのvWF関連疾患の症状を、前記疾患を罹患しているヒトにおいて処置するための、本発明のポリペプチドに関し、これは、対象に、本発明のポリペプチドを、前記疾患を罹患しているヒトにおいてvWF関連疾患の症状を処置するために有効な量で投与することを含む。
したがって、本発明は、ヒトにおいてTTPなどのvWF関連疾患の発症または進行を阻害する（その阻害は、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの、vWFへの結合によりもたらされる）ための本発明のポリペプチドに関し、これは、ヒトに、規定の間隔で、前記ポリペプチドの有効阻害用量を投与することを含み、ここで、抗体の各投与は、それによりヒトにおける疾患の発症または進行を阻害するために、ヒトに、ヒトの体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～２５ｍｇを送達する。
したがって、本発明は、ヒトがvWF関連疾患による虚血性臓器損傷を罹患する可能性を減少させるためのポリペプチドに関し、これは、ヒトに、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを、規定の用量で投与することを含み、ここで、抗体の各投与は、それによりヒトが虚血性臓器損傷を罹患する可能性を減少させるために、ヒトに、ヒトの体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ～２５ｍｇを送達する。
これらの結果に基づくモデリングは、本発明のポリペプチドを長期間にわたり投与し続けることは、急性のエピソードを予防することにおいて有効であることを示す。この有利なプロフィールは、健康の脅威の減少をもたらす。したがって、本発明のポリペプチドは再発を予防すると結論付けることができる。
したがって、本発明は、１、２、３、４、５、６、７日間、または２、４、６もしくは８週間毎に、本発明のポリペプチドを、１～８０ｍｇ、例えば５～４０ｍｇの範囲の用量において、好ましくはTTPの急性のエピソードを予防することにおいて、投与することに関する。特に有効な用量は、１０～２０ｍｇである。特定の態様において、用量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０または８０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）を含む。
一態様において、本発明は、TTP患者において再発を予防する方法に関し、該方法は、以下を含む：
（１）TTP患者からのADAMTS13活性を、直接または間接アッセイなどのアッセイにより測定すること；
（２）ステップ（１）の前記活性 を、参照値（正常値）と比較すること；ならびに
（３）ステップ（１）のADAMTS13活性が、参照値の１５％未満、例えば１０％未満および５％未満である場合、本発明のポリペプチド、例えばALX 0081を投与し、それにより再発を予防すること。
準備中の結果は、第１のPEの前の本発明のポリペプチドの第１の用量の投与が、既に血小板の数の増加をもたらすことを示唆する。
したがって、本発明は、それを必要とする患者、例えばTTPの急性のエピソードを経験している患者などにおいて、本発明のポリペプチド、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０または８０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与することに関する。
vWFに対する少なくとも１つのISVDを含む本発明のポリペプチド、例えばALX 0081は、vWF関連疾患、例えばTTPを処置または予防する（例えばそれに関連する１または２以上の症状を軽減するかまたは寛解させる）ために、対象（例えばヒト対象）に、単独で、または第２の剤、例えば、第２の治療的にまたは薬理学的に活性な剤と組み合わせて、投与することができる。
vWFに対する少なくとも１つのISVDを含む本発明のポリペプチド（例えばALX 0081）と共処方することができる剤の非限定的な例として、例えば、補助的な免疫抑制処置（例えば（メチル）プレドニゾロンまたは（メチル）－プレドニゾンなどの副腎皮質ステロイド；またはリツキシマブ）、抗血小板剤（例えばアスピリン）、赤血球輸血または葉酸補充による支持療法、ビンクリスチンまたはシクロスポリンによる処置、抗自己ADAMTS13抗体、またはADAMTS13が挙げられる。かかる併用療法は、有利に、投与される治療剤より低い用量を利用することができ、それにより、多様な単独療法に付随する起こり得る毒性または合併症を回避する。
一態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの、免疫抑制処置、特にTTP患者において再発を効率的に予防するリツキシマブと一緒の、併用療法に関する。好ましくは、併用療法は、ADAMTS13活性が、少なくとも≧５％、例えば≧１０％、≧１５％、≧２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％となるか、または正常化するまで、例えば正常な活性の≧５０％となるまで、提供される。
TTPはまだ、臨床歴、患者および血液フィルムに基づいて診断される。ADAMTS13アッセイは、診断を確認し、疾患のの経過およびさらなる処置のあり得る必要性をモニタリングすることを補助する。TTPの急性のエピソードは、表１および例えばScullyら（2012、上記）のガイドラインに従って診断することができる。

表１ TTPの急性のエピソードにおける臨床的特徴および兆候。
Figure 2022160431000001
任意の特定の本発明のポリペプチドの効力または投与レジメンは、当業者に利用可能な方法により決定することができる。簡単に述べると、臨床試験の間に、患者を医療関係者が観察してもよく、任意の判断基準の組み合わせにより疾患の状態を評価する。患者の疾患状態の改善を、これらの判断基準に基づいて多数の時点において決定し、患者集団についてのこれらの決定の組み合わせをプロットして、処置の効力を評価する。
例示的な態様において、効力の評価は、以下に記載される判断基準のいずれかまたは全てにより測定することができる：
・≧１５０，０００／μＬの血小板の回復により定義される応答までの処置の時間。この応答は、１５０，０００／μＬを超える血小板回復の最初の報告の４８時間後に、≧１５０，０００／μＬの血小板の新たな測定により、および好ましくはLDH≦2 X ULNにより確認しなければならない。
・完全寛解を有する対象の数
・TTPの増悪（を有する対象）の数およびTTPの第１の増悪までの時間。増悪は、応答の後の再発性の血小板減少症であって、最後の毎日のPEの１日以上後であるが、３０日以内の、毎日のPE処置の再開始を必要とするものとして定義される。
・最大１年にわたるTTPを再発する対象の数（最後の毎日のPEの後３０日より後に起きたTTPの新たなイベントとして定義される）、およびTTPの第１の再発までの時間。
・毎日のPE処置に関連する重篤有害作用（SAE）を含む、毎日のPEデータ。
・完全寛解時および１年間の経過観察において神経認知試験バッテリーにより測定される神経認知機能。
この試験の前にグラスゴーコーマスコアを行い、対象の意識の状態を測定する。
・臓器機能障害の改善ならびにTTPに関連する兆候および症状の改善。
・毎日のPE処置期間中の、およびその後の研究薬物処置期間（漸減を含む）中の総死亡率。
・限定されないが、ADAMTS13（トロンボスポンジンリピートを有するディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ１３（a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin repeats 13））のレベルおよび抗ADAMTS13抗体のタイターを含む、TTPのバイオマーカーの決定。
当業者は、効力を決定することに精通している。
例えば、ADAMTS13活性は、vWF多量体の電気泳動を用いて、プロテアーゼにより切断されていない超巨大多量体を検出して、評価することができる（Moake et al. (1982) The New England journal of medicine 307, 1432-1435；Furlan, et al. (1997) Blood 89, 3097-3103 7, 8）。ADAMTS13活性は、ADAMTS13により切断された場合に蛍光を放出するように化学修飾されたvWFのフラグメントであるFRETS-vWF73を使用して試験することができる。アッセイにおいて、FRETS-vWF73を、患者の血漿の試料に加え、蛍光の変化を経時的に測定して、ADAMTS13活性を決定する。阻害剤が存在する場合、それはしばしばADAMTS13に対するＩｇＧ抗体を中和し、これはELISAにより測定することができる（Kokame et al. (2005) British journal of haematology 129, 93-100）。あるいは、または加えて、ADAMTS13活性は、例えばVeselyら（2003,、上記）、Fontanaら（2004,、上記）またはRemuzziら（Blood 2002；100：778-7852002）において記載されるように決定することができる。例えば、間接的ADAMTS13活性アッセイは、全長VWF 分子、またはVWFのA2ドメイン中のADAMTS13切断部位を含むVWFフラグメントのいずれかの生成物の切断の検出を伴う。（１）コラーゲン結合アッセイ。正常な血漿または精製したVWFを、試験血漿試料と共に、BaCl2、およびVWFを変性させる1.5Mの尿素の存在下においてインキュベートする。VWFはADAMTS13により切断され、残りのVWFを、ＩＩＩ型コラーゲンへのその結合により測定する。結合したVWFは、共役抗VWF抗体によるELISAアッセイを用いて定量する。（２）リストセチン誘導型凝集。これは上記のコラーゲン結合アッセイと類似であるが、残りのVWFを、血小板血小板凝集計を用いるリストセチン誘導型血小板凝集により測定する（３）機能的ELISAアッセイ。このアッセイにおいて、組み換えVWFフラグメントを、VWF上のタグに対する抗体を用いてELISAプレート上に固定する。VWFフラグメントは、Tyr1605～Met1606におけるA2ドメインおよびADAMTS13切断部位をコードし、Ｓ－トランスフェラーゼ［GST］－ヒスチジン［GST－VWF73－His］でタグ付けされる。血漿を、固定されたGST－VWF73－Hisフラグメントに加え、ADAMTS13切断部位において固定されたフラグメントの切断が起きる。残りの、切断されたVWFフラグメントを、切断されたVWFフラグメントの実を認識し、完全なフラグメントは認識しない第２のモノクローナル抗体を用いて測定する。ADAMTS13活性は、したがって、残りの基質の濃度に反比例する。この方法は、TECHNOZYM（登録商標）ADAMTS13活性ELISAのための基礎を形成する。
当業者は、ADAMTS13に対する自己抗体を決定することに精通しており、例えば抗ADAMTS13自己抗体は、ELISA、例えばTECHNOZYM（登録商標）ADAMTS13 INH ELISA（Technoclone）により決定することができる。
当業者は、ヒト試料においてリストセチンコファクター活性を決定することに精通しており、例えば、リストセチンコファクターは、血小板凝集計PAP-8E分析器（Bio/Data corp.）上でBio/Data corp.のvW Selectにより決定することができる。
当業者は、例えばSTA-R evolution分析器（Diagnostica Stago）においてCoamatic Factor VIII（Chromogenix）を用いて、ヒト試料において第VIII因子を決定することに精通している。
当業者は、例えば免疫濁度（immunoturbidometric）アッセイ（例えばSTA Lia test vWF：Ａｇを用いて）を用いて、ヒト試料においてフォン・ヴィレブランド因子抗原を決定することに精通している。
当業者は、LDHレベルを決定することに精通している。多くの方法は、分光光度計における乳酸デヒドロゲナーゼに基づく酵素分析に基づく。便利な総説は、Medboら（2000）「Examination of four different instruments for measuring blood lactate concentration」、Scand J Clin Lab Invest 60:367-380により提供される。多様な企業が、乳酸とピルビン酸との相互転換のLDHによる触媒を測定するAbnova（カタログ番号KA1653）などのアッセイ、すなわち、NADHとカップリングされた酵素反応におけるテトラゾリウム塩MTTの還元に基づく、５６５ｎｍにおいて最大吸光度を示すMTTの還元形態に対する非放射活性比色LDHアッセイを提供する。形成された紫色の吸光度は、酵素活性に対して直接的に比例する。同様に、Sigma Aldrichのキット（MAK066-1KT）において、LDHはNADをNADHへと還元し、これは、比色（４５０ｎｍ）アッセイにより特異的に検出される。正常値を、以下の表１．１において提供する。
当業者は、トロポニンＩおよびＴを決定することに精通している。一般的に、トロポニンＴおよびＩは、イムノアッセイ法により測定され、これは、多くの異なるイムノアッセイプラットフォーム、例えばDPC Immulite、Abbott AxSYM、Bayer ACS:Centaur、Ortho Vitros、Roche Elecsys、第３世代において利用可能である。
便利な総説は、Wu et al. (1999) National Academy of Clinical Biochemistry Standards of Laboratory Practice：recommendations for the use of cardiac markers in coronary artery diseases. Clin Chem. Jul 1999;45(7):1104-21により提供される。正常値を、以下の表１．１において提供する。
当業者は、クレアチニンを決定することに精通している。便利な総説は、PeakeおよびWhiting、「Measurement of Serum Creatinine-Current Status and Future Goals」Clin Biochem Rev. 2006 Nov；27(4): 173-184により提供される。例えば、クレアチニンレベルは、Abcamのクレアチニンアッセイキット（ab65340）またはBioVisionのクレアチニンアッセイキットにより決定することができる。 アッセイにおいて、クレアチニンはクレアチニナーゼによりクレアチンへと変換され、クレアチンは、サルコシンへと変換され、これは特異的に酸化されて、赤色（λｍａｘ＝５７０ｎｍ）および蛍光（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３８／５８７ｎｍ）を発するプローブと反応する生成物を生成する。正常値を、以下の表１．１において提供する。血液中のクレアチニンの量は、筋肉の質量と共に増大するので、男性は通常、女性より高いクレアチニンレベルを有する。

表１．１：正常値
Figure 2022160431000002
 表１．１において提供される正常値は、検査室によって、男性と女性との間で、および年齢により、異なり得ることが理解されるであろう。しかしながら、当業者は、用いられるアッセイに依存して、通常は、製造者により提供される正常値を、参照としてあるいは特定のセッティングにおいて医師により評価される正常値として用いることができると考えるであろう。
本発明のポリペプチド 典型的には、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含む。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、vWFに結合し、および／またはvWFに対するアフィニティーを有する。本発明に関して、「vWF」は、限定されないが、カニクイザル、ヒヒ、ブタ、モルモット、マウス、および／またはヒトのvWF、ならびに最も好ましくはヒトvWF、すなわち、配列番号２０またはGenBankエントリー：NP_000543を含む。
好ましくは、vWFに対するISVDは、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
ａ）CDR1は、以下：
－アミノ酸配列YNPMG；または
－アミノ酸配列YNPMGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
を含むか、これらから本質的になり、
ならびに
ｂ）CDR2は、以下：
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEG；または
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
－アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
を含むか、これらから本質的になり
ならびに
ｃ）CDR3は、以下：
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；または
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
－アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列
を含むか、これらから本質的になる。
さらにより好ましくは、vWFに対するISVDは、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
ａ）CDR1はYNPMG（配列番号２０）であり；
ｂ）CDR2はAISRTGGSTYYPDSVEG（配列番号２１）であり；ならびに
ｃ）CDR3はAGVRAEDGRVRTLPSEYTF（配列番号２２）である。
さらにより好ましくは、vWFに対するISVDは、配列番号１９（12A02H1）により代表される。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、vWFに対する少なくとも２つのISVDを含むか、これらからなる。
さらにより好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号１～１８、および最も好ましくは配列番号１により定義されるvWFに対する２つのISVD（ALX 0081；INNカプラシズマブ）を含むか、これらからなる。ALX 0081は、vWFを標的とする２つの同一の一価の構成要素からなる、二価のNanobodyである。
vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド、例えば配列番号１～１９は、vWF関連疾患、特に血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）の処置において用いることができる。
用語「ポリペプチド」と「アミノ酸配列」とは、本明細書において交換可能に用いられる。
したがって、例えば、本発明における使用のために好適なポリペプチドは、表Ａ－１中の化合物、例えば配列番号１～１９もしくは２０～２２、または表Ａ－１中の化合物に対して８０％以上、より好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する化合物を含んでもよい（「配列同一性」についての定義のセクションを参照）。
好ましくは、本発明のポリペプチドにおける使用のためのvWFに対するISVDは、12A02H1様化合物である。本発明の説明の目的のために、12A02H1様化合物は、12A02H1（すなわち配列番号１９）を含む化合物、または12A02H1（配列番号１９）に対して８０％以上、より好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する化合物である。vWFに対する２つのISVDを含む特に好ましいポリペプチドは、ALX 0081（配列番号１）である。
ラクダ科のVHHドメイン、ラクダ化VHドメインまたはヒト化VHHドメインなどの免疫グロブリン単一可変ドメインは、急速に成長している治療薬のクラスを代表する。例えば、vWFに対する免疫グロブリン単一可変ドメインは、WO2004/015425、WO2004/062551、WO2006/074947、WO2006/122825、WO2009/115614およびWO2011/067160において記載されている。本発明のポリペプチドにおける使用のためのさらに好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインは、WO06/122825において記載される改善されたNanobodyを含む。
他に示されない限り、用語「免疫グロブリン配列」とは、本明細書において重鎖抗体を指すものとして用いられるか、従来の４本鎖抗体を指すものとして用いられるかに関わらず、完全なサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメインまたはフラグメント（抗原結合ドメインまたはフラグメント、例えばそれぞれVHHドメインまたはVH/VLドメインを含むが、これらに限定されない）を含むための一般的用語として用いられる。加えて、用語「配列」とは、本明細書において用いられる場合（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「VHH配列」または「タンパク質配列」のような用語において）、一般に、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列、ならびにそれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両方を含むものと理解されるべきである。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ISVD」）は、「単一可変ドメイン」と交換可能に用いられ、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、これにより形成される分子を定義する。これが、免疫グロブリン単一可変ドメインを、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来の」免疫グロブリンまたはそのフラグメントとは異なるものにする。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいては、重鎖可変ドメイン（VH）と軽鎖可変ドメイン（VL）とが相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、VHおよびVLの両方の相補性決定領域（CDR）が抗原結合部位に寄与する。すなわち、合計６個のCDRが、抗原結合部位の形成に関与する。
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のVHまたはVLドメインにより形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、わずか３つのCDRにより形成される。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、したがって、抗原結合部位の形成のために少なくとも２つの可変ドメインの相互作用を必要とする、従来の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含まない。このことはまた、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む（comprise／contain）」本発明の態様においても同じである。本発明に関して、かかる態様は、従来の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを除外する。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む（comprise／contain）」ポリペプチドまたは組成物は、例えば、１つより多くの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むコンストラクトに関していてもよい。あるいは、免疫グロブリン単一可変ドメイン以外のさらなる構成要素、例えば様々な種類の助剤、タンパク質タグ、着色料、色素などが存在していてもよい。しかし、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインにより形成される従来の免疫グロブリンのフラグメントを含まない。
一般に、単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になる、アミノ酸配列である。かかる単一可変ドメインおよびフラグメントは、折り畳まれているか、または最適な条件下において免疫グロブリンの折り畳みを形成することができる免疫グロブリンを含むようになっていることが最も好ましい。したがって、単一可変ドメインは、それが、単一の抗原結合単位を形成することができる限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えばVL配列）またはその好適なフラグメント；または重鎖可変ドメイン配列（例えばVH配列もしくはVHH配列）またはその好適なフラグメントを含んでもよい（これはすなわち、単一可変ドメインから本質的になる機能的抗原結合単位であり、これにより、機能的抗原結合単位を形成するために単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用することを必要としない；これは、例えば従来の抗体およびscFvフラグメントにおいて存在する可変ドメインの場合であり、これは、機能的抗原結合ドメインを形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がある（例えばVH/VL相互作用を通して））。
本発明の一態様において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えばVL配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えばVH配列）である；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４本鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体（例えばVHH）から誘導される重鎖可変ドメイン配列であってよい。
重鎖抗体およびその可変ドメインの一般的説明のために、とりわけ、本明細書において引用される先行技術に対して、ならびにWO 08/020079の５９頁において言及される先行技術に対して、および国際出願WO 06/040153の４１～４３頁において言及される参考文献のリストに対して参照がなされ、これらの先行技術および参考文献は、本明細書において参考として援用される。これらの参考文献において記載されるとおり、Nanobody（特にVHH配列および部分的にヒト化されたNanobody）は、フレームワーク配列の１または２以上における１または２以上の「ホールマーク（Hallmark）残基」の存在により特徴づけることができる。Nanobodyのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分またはフラグメント、誘導体または「Nanobody融合」、多価コンストラクト（リンカー配列のいくつかの非限定的な例を含む）、およびNanobodyの半減期を延長するための様々な修飾およびそれらの調製を含む、Nanobodyのさらなる説明は、例えばWO 08/101985およびWO 08/142164において見出すことができる。
例えば、単一可変ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（または免疫グロブリン単一可変ドメインとしての使用のために好適なアミノ酸配列）は、（単一）ドメイン抗体（または（単一）ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸配列）、「dAb」またはdAb（またはdAbとしての使用のために好適なアミノ酸配列）、またはNanobody（本明細書において定義されるとおりであり、限定されないがVHH配列を含む）；他の単一可変ドメイン、またはそれらのいずれか１つの任意の好適なフラグメントであってよい。（単一）ドメイン抗体の一般的説明のために、本明細書において引用される先行技術に対して、ならびにEP 0 368 684に対して、参照がなされる。用語「dAb」について、例えば、Wardら、1989年（Nature 341 (6242): 544-6）に対して、Holtら、2003年（Trends Biotechnol. 21(11): 484-490）に対して；ならびに例えばWO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388および他の公開されたDomantis Ltd.の特許出願に対して、参照がなされる。また、本発明に関しては、それらは哺乳動物由来でないのでより好ましくはないが、単一可変ドメインは、ある種のサメから誘導することができることにも注意すべきである（例えばいわゆる「IgNARドメイン」、例えばWO 05/18629を参照）。
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Nanobody（登録商標）（本明細書において定義されるとおり）またはその好適なフラグメントであってよい［注意：Nanobody（登録商標）、Nanobodies（登録商標）およびNanoclone（登録商標）は、Ablynx N.V.の登録された商標である］。Nanobodyの一般的説明のために、以下のさらなる説明に対して、ならびに本明細書において引用される先行技術（例えばWO 08/020079において記載されるものなど（１６頁））に対して、参照がなされる。
免疫グロブリン配列、特に免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列および構造は、４つのフレームワーク領域または「FR」からなると考えることができ（しかしそれらに限定されることなく）、それらは、当該分野においておよび本明細書において、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「FR1」として；「フレームワーク領域２」または「FR2」として；「フレームワーク領域３」または「FR3」として；および「フレームワーク領域４」または「FR4」として言及される；これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域または「CDR」により分断され、これは、当該分野において、それぞれ、「相補性決定領域１」または「CDR1」として；「相補性決定領域２」または「CDR2」として；および「相補性決定領域３」または「CDR3」として言及される。
免疫グロブリン単一可変ドメイン中のアミノ酸残基の合計数は、１１０～１２０個の範囲にあり、好ましくは１１２～１１５個であり、最も好ましくは１１３個である。しかし、免疫グロブリン単一可変ドメインの部分、フラグメント、アナログまたは誘導体は、かかる部分、フラグメント、アナログまたは誘導体が、本明細書において概略されるさらなる要件に合致し、およびまた好ましくは本明細書において記載される目的のために好適である限り、それらの長さおよび／またはサイズについて特に限定されないことに注意すべきである。
したがって、本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒトソース、好ましくはラクダ科から誘導されるペプチド、好ましくはラクダ重鎖抗体を含む。それらは、例えばWO 08/101985およびWO 08/142164において先に記載されているように、ヒト化されていてもよい。さらに、用語は、例えばWO 08/101985およびWO 08/142164において先に記載されているように、非ラクダ科ソース、例えばマウスまたはヒトから誘導されるポリペプチドであって、「ラクダ化」されているものを含む。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒトおよびラクダ科の免疫グロブリン配列を含む、様々な起源の免疫グロブリン配列を包含する。それはまた、完全にヒトの、ヒト化された、またはキメラの免疫グロブリン配列を含む。例えば、それは、ラクダ科免疫グロブリン配列およびヒト化されたラクダ科免疫グロブリン配列、またはラクダ化された免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばWardらにより記載されるようなラクダ化dAbを含む（例えばWO 94/04678ならびにDaviesおよびRiechmann、1994年、Febs Lett. 339: 285、および1996年、Protein Engineering 9: 531を参照）。
上述のVWFに対する全てのISVD（またはvWF結合剤）は、学術文献から周知である。これあ、それらの製造を含む（特に例えばWO2006/122825、またWO2004/062551を参照）。例えば、ALX 0081は、例えばWO2006/122825またはWO2009/115614において記載されるように調製することができる。
本発明により提供される免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは単離された形態、または本質的に単離された形態であるか、またはタンパク質もしくは本発明のポリペプチドの部分を形成し、これは、１または２以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、これから本質的になっていてもよく、およびこれは、任意に、１または２以上のさらなるアミノ酸配列（全て任意に１または２以上の好適なリンカーを介して結合していてもよい）をさらに含んでもよい。例えば、および限定することなく、１または２以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、かかるタンパク質またはポリペプチド中の結合単位として用いることができ、これは、任意に、全て本明細書において記載されるとおり、それぞれ一価、多価または多特異性の本発明のポリペプチドを提供するために、結合単位（すなわち細胞関連抗原以外の１または２以上の他の標的に対する）として役立ち得る１または２以上のさらなるアミノ酸配列を含んでもよい。かかるタンパク質またはポリペプチドはまた、単離された形態または本質的に単離された形態であってもよい。したがって、本発明により、免疫グロブリン単一可変ドメインは、上で概略されるとおり、単一のドメインの形態において２または３以上の抗原結合単位を含む、コンストラクトを含む。例えば、同じまたは異なる抗原特異性を有する２（または３以上）の免疫グロブリン単一可変ドメインを結合して、例えば二価、三価、または多価のコンストラクトを形成することができる。２または３以上の特異性の免疫グロブリン単一可変ドメインを組み合わせることにより、二特異性、三特異性などのコンストラクトを形成することができる。例えば、本発明によるポリペプチドは、標的Ａに対して向けられた２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、および標的Ｂに対して向けられた１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでもよく、これはそれをＡについて二価およびＢについて一価にする。当業者は、かかるコンストラクトおよびその修飾を容易に想起することができ、これらは全て本発明により包含される。特定の態様において、本発明は、同じ標的抗原中の異なるエピトープに向けられた少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、二重パラトピック（bi-paratopic）なコンストラクトに関する。
これらの分子はまた、「本発明のポリペプチド」としても言及され、これは、本発明の「免疫グロブリン配列」または「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と類義である。
加えて、用語「配列」とは、本明細書において用いられる場合（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「VHH配列」または「タンパク質配列」などの用語において）、一般に、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、関係するアミノ酸配列ならびにこれをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列を含むものと理解されるべきである。
本発明の一つの非限定的な態様により、免疫グロブリン配列、Nanobody（登録商標）または本発明のポリペプチドは、グリコシル化されている。本発明の別の非限定的な態様により、免疫グロブリン配列、Nanobody（登録商標）または本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていない。
上述のとおり、本発明は、典型的には、vWFに対する少なくとも１つ、例えば２つまたは３つ以上のISVD、すなわち、本明細書において定義されるような抗原、例えばフォン・ヴィレブランド因子（vWF）および好ましくはヒトvWF（配列番号２０）に結合するか、および／またはこれらに対してアフィニティーを有するISVDを含む、ポリペプチドに関する。
本発明に関して、特定の抗原「に結合するか、および／またはこれらに対してアフィニティーを有する」とは、例えば抗体およびそれらの対応する抗原に関して理解されるような、当該分野における通常の意味を有する。
本発明の特定の態様において、用語「～に結合するか、および／またはこれらに対してアフィニティーを有する」とは、免疫グロブリン配列が、抗原と特異的に相互作用することを意味し、前記抗原に「対する」免疫グロブリン配列と交換可能に用いられる。
用語「特異性」とは、特定の免疫グロブリン配列、抗原結合分子または抗原結合タンパク質（Nanobody（登録商標）または本発明のポリペプチドなど）が結合することができる抗原または抗原決定基の異なる型の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、アフィニティーおよび／またはアビディティーに基づいて決定することができる。アフィニティーは、抗原と抗原結合タンパク質との解離についての平衡定数（KD）により表され、抗原決定基と、抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度についての尺度である：KDの値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度は強い（あるいは、アフィニティーはアフィニティー定数（KA）として表すこともでき、これは１／KDである）。当業者には明らかであるが（例えば本明細書におけるさらなる開示に基づいて）、アフィニティーは、目的の特異的な抗原に依存して、それ自体公知の様式において決定することができる。アビディティーは、抗原結合分子（Nanobody（登録商標）または本発明のポリペプチドなど）と関連する抗原との間の結合の強度の尺度である。アビディティーは、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間のアフィニティー、および抗原結合分子上に存在する関連する結合部位の数の両方に関係する。
典型的には、本発明の免疫グロブリン配列（アミノ酸配列、Nanobodies（登録商標）および／または本発明のポリペプチドなど）は、それらの抗原に、１０－５～１０－１２モル／リットル未満、および好ましくは１０－７～１０－１２モル／リットル未満、およびより好ましくは１０－８～１０－１２モル／リットルの解離定数（KD）で（すなわち１０５～１０１２リットル／モル以上、および好ましくは１０７～１０１２リットル／モル以上、およびより好ましくは１０８～１０１２リットル／モルの会合定数（KA）で）結合し、および／または本明細書において定義されるような細胞関連抗原に、１０２Ｍ－１ｓ－１～約１０７Ｍ－１ｓ－１、好ましくは１０３Ｍ－１ｓ－１～１０７Ｍ－１ｓ－１、より好ましくは１０４Ｍ－１ｓ－１～１０７Ｍ－１ｓ－１、例えば１０５Ｍ－１ｓ－１～１０７Ｍ－１ｓ－１のｋｏｎ速度で結合する；および／または、本明細書において定義されるような細胞関連抗原に、１ｓ－１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）～１０－６ｓ－１（複数の日数のｔ１／２を有するほぼ不可逆的な複合体を提供する）、好ましくは１０－２ｓ－１～１０－６ｓ－１、より好ましくは１０－３ｓ－１～１０－６ｓ－１、例えば１０－４ｓ－１～１０－６ｓ－１のｋｏｆｆ速度で結合する。
１０－４Ｍより高い任意のKD値（または１０４Ｍ－１より低い任意のKA値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。
好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、所望される抗原に、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満のアフィニティーで結合するであろう。
抗原または抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析および／または競合的結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素イムノアッセイ（EIA）およびサンドイッチ競合アッセイ、および当該分野においてそれ自体公知のそれらの様々なバリアント；ならびに本明細書において言及される他の技術を含む、それ自体公知の任意の好適な様式において決定することができる。
解離定数（KD）は、実際の解離定数であっても、見かけ上の解離定数であってもよいことは、当業者には明らかであろう。解離定数を決定するための方法は、当業者にはあきらかであり、例えば、本明細書において言及される技術を含む。このことに関して、また、１０－４モル／リットルまたは１０－３モル／リットルより高い（例えば１０－２モル／リットルの）解離定数を測定することは、可能でない場合があることは、明らかであろう。任意に、これもまた当業者には明らかであるが、（実際のまたは見かけ上の）解離定数は、（実際のまたは見かけ上の）会合定数（KA）に基づいて、［KD＝１／KA］の関係により計算することができる。
アフィニティーは、分子の相互作用の強度または安定性を表す。アフィニティーは、一般に、KDまたは解離定数によるものとして示され、これはモル／リットル（またはＭ）の単位を有する。アフィニティーはまた、会合定数、KAとしても表すことができ、これは、１／KDに等しく、（モル／リットル）－１（またはＭ－１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子（例えばアミノ酸配列、免疫グロブリン配列、Nanobody（登録商標）または本発明のポリペプチドと、その意図される標的と）の間の相互作用の安定性は、主に、それらの相互作用のKD値に関して表されるであろう；KA＝１／KDの関係を考慮して、そのKD値による分子相互作用の強度を特定することを、対応するKA値を計算するために使用することもできることは、当業者には明らかであろう。KD値は、分子相互作用の強度を、熱力学的な意味においても特徴づける。なぜならば、それは、周知の関係DG＝ＲＴ．ｌｎ（KD）（同等にDG＝ＲＴ．ｌｎ（KA））による結合の自由エネルギー（DG）に関係するからであり、ここで、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは、自然対数を表す。
有意義（例えば特異的）であると考えられる生物学的相互作用、例えば本発明の免疫グロブリン配列の、本明細書において定義されるような細胞関連抗原への結合のについてのKDは、典型的には、１０－１０Ｍ（０．１ｎＭ）～１０－５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強力であるほど、そのKDは低い。
KDはまた、ｋｏｆｆとして表される複合体の解離速度定数の、ｋｏｎとして表される複合体の会合の速度に対する比としても表される（したがって、KD＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびKA＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。ｏｆｆ速度ｋｏｆｆは、単位ｓ－１を有する（ここでｓは、秒のＳＩ単位記号である）。ｏｎ速度ｋｏｎは、単位Ｍ－１ｓ－１を有する。
本発明の免疫グロブリン配列に関して、ｏｎ速度は、１０２Ｍ－１ｓ－１～約１０７Ｍ－１ｓ－１で変化し得、２分子相互作用についての拡散に制限される会合速度定数に近づく。ｏｆｆ速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係により、所与の分子相互作用の半減期に関係する。本発明の免疫グロブリン配列のｏｆｆ速度は、１０－６ｓ－１（複数の日数のｔ１／２を有するほぼ不可逆的な複合体）～１ｓ－１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）で変化し得る。
２つの分子の間の分子相互作用のアフィニティーは、それ自体公知の様々な技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（SPR）バイオセンサー技術（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照）を介して測定することができ、ここで、一方の分子をバイオセンサーチップ上に固定し、他方の分子を、流動条件下において固定された分子の上を通過させ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定を得、それによりKD（またはKA）値を得る。これは、例えば周知のBiacore装置を用いて行うことができる。
何らかの手段により、例えば一方の分子のバイオセンサーに対するコーティングに関係するアーチファクトにより、測定プロセスが示された分子の固有の結合アフィニティーに対して影響を及ぼす場合、測定されたKDを、見かけ上のKDに対応させることができることもまた、当業者には明らかであろう。また、一方の分子が、他方の分子についての１より多くの認識部位を含む場合、見かけ上のKDを測定することができる。かかる状況において、測定されたアフィニティーは、２つの分子による相互作用のアビディティーにより影響を受ける場合がある。
アフィニティーを評価するために用いることができる別のアプローチは、Friguetら（J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985）の２ステップELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）の手法である。この方法は、溶液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体上への分子のいずれかの吸着に関係する可能なアーチファクトを回避する。
しかし、KDの正確な測定は、極めて労働集約的であり、その結果として、しばしば２つの分子の結合強度を評価するために、見かけ上のKD値が決定される。全ての測定が一貫した方法において行われる（例えばアッセイ条件を不変に保つ）限り、見かけ上のKDの測定は、真のKDの近似値として用いることができることに注意すべきであり、およびしたがって、本明細書において、KDと見かけ上のKDとは、同等の重要性または適切性をもって扱われるべきである。
最終的に、多くの状況において、経験を積んだ科学者は、いくつかの参照分子に相対的に結合アフィニティーを決定することが便利であると判断する場合があることに、注意すべきである。例えば、分子ＡとＢとの間の結合強度を評価するために、例えば、Ｂに結合することが知られており、ELISAまたはFACS（蛍光活性化細胞分取）または他の形式における容易な検出のための、フルオロフォアもしくはクロモフォア基またはビオチンなどの他の化学部分（蛍光検出のためのフルオロフォア、吸光検出のための発色団、ストレプトアビジンにより媒介されるELISA検出のためのビオチン）で好適に標識されている、参照分子Ｃを用いてもよい。典型的には、参照分子Ｃは固定された濃度に維持され、Ｂの所与の濃度または量について、Ａの濃度は異なる。結果として、Ａの不在下においてＣについて測定されたシグナルが半減するＡの濃度と一致するIC50値を得る。参照分子のKDであるKD refならびに参照分子の合計濃度crefが既知であることを前提として、相互作用Ａ－Ｂについての見かけのKDは、以下の式から得ることができる：KD＝ＩＣ５０／（１＋cref／KD ref）。cref＜＜KD refである場合、KD≒ＩＣ５０であることに注意する。比較される結合剤についてのIC50の測定が一貫した方法において行われることを前提として（例えばcrefを固定し続ける）、分子相互作用の強度または安定性は、IC50により評価することができ、本文を通して、この測定は、KDに対して、または見かけ上のKDに対して、同等であると判断される。
本発明は、全て本出願人の名前におけるWO2004/015425、WO2004/062551、WO2006/074947、WO2006/122825、WO2009/115614またはWO2011/067160において記載されるか、これらにおいて開示されるような方法により得ることができる免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
本発明はまた、これらのアミノ酸配列の最適化されたバリアントを包含する。一般に、本発明によるアミノ酸配列の「最適化されたバリアント」は、１または２以上の有益な置換を含むバリアント、例えば以下：ｉ）「ヒト化」の程度、ｉｉ）化学的安定性、および／またはｉｉｉ）発現のレベルを増加させる置換であり；一方、効力（例えば、WO2006/122825の実験のパートにおいて記載されるような効力アッセイにより測定される）は、なお野生型12A02（WO2006/122825において定義されるような）に匹敵する（すなわち、１０％以内のバリエーション）か、またはバリアント12A02H1（配列番号１９）（またWO2006/122825において定義される）に匹敵する。好ましくは、12A02の野生型配列と比較して、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１のかかる置換、および好ましくは少なくとも２のかかる置換、および好ましくは少なくとも３のヒト化置換および好ましくは少なくとも１０のかかるヒト化置換を含む。
特定の側面において、本発明のアミノ酸配列は、野生型配列12A02と比較して、合計１～１５、好ましくは２～１４、例えば９～１３、例えば１０、１１または１２のアミノ酸置換を含む。言及したとおり、これらの差異は、好ましくは少なくとも１、および好ましくは少なくとも２、例えば３、４または５または１０のヒト化置換を含み、任意に、１または２以上のさらなる置換を含んでもよい（例えば、本明細書において言及されるさらなる置換（ａ）～（ｃ）のうちの任意の１つ、または任意の２もしくは３以上の任意の好適な組み合わせ）。やはり、本明細書における開示に基づいて、および任意に、限定された程度の試行錯誤の後で、当業者は、１または２以上のかかる好適なヒト化および／またはさらなる置換（の好適な組み合わせ）を選択することができる。
本発明は、本明細書において提供される具体例のうちのいずれか、または上の参考文献により定義される具体例のいずれかと高度に類似するポリペプチド配列を包含する。高度に類似するとは、少なくとも９０％、例えば９５、９７、９８または９９％のアミノ酸同一性を意味する。高度に類似するポリペプチド配列は、それらが由来する配列と同じ機能を有するであろう。すなわち、それらは、vWFに結合し、vWFにより特異的に結合し、vWFと血小板との間の相互作用を阻害するであろう。
特定の態様において、本発明は、配列番号１～１９のいずれか１つ、特に配列番号１と高度に類似する配列に関する。しかし、本発明が特に本明細書において定義されるような処方物中で安定であるバリアントまたは高度に類似する配列を指すように、各々のバリアントについて、本明細書において定義されるような処方物中での配列の安定性を評価しなければならない。
本発明のポリペプチド配列を作製する方法は、広く知られており、例えば組み換え発現または合成を含む。当業者は、好適な発現技術、例えば好適な組み換えベクターおよび宿主細胞、例えば最近または酵母宿主細胞を熟知している。当業者はまた、好適な精製技術およびプロトコルを熟知している。
本発明はまた、vWFに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド、例えばALX 0081の処方物を提供し、これは、安定であり、好ましくは、医薬（また「本発明の医薬処方物」または「本発明の処方物」とも称される）の調製を含む医薬用途のために好適である。
特定の態様において、処方物は、配列番号１～１９から選択される１または２以上のポリペプチド、好ましくは配列番号１を含む。
用語「医薬処方物」とは、活性成分（本発明のポリペプチド）の生物学的活性が有効となることを可能にする形態における調製物を指し、処方物が投与されるであろう対象にとって許容し難く毒性であるさらなる成分を含まない。かかる処方物は、無菌である。「薬学的に許容可能な」賦形剤（ビヒクル、添加物）とは、使用される活性成分の有効用量を提供するために、対象哺乳動物に合理的に投与することができるものである。
用語「賦形剤」とは、本明細書において用いられる場合、化合物のための希釈剤、ビヒクル、保存剤、凍結保護剤（lyoprotectant）、界面活性剤、結合剤、キャリアまたは安定化剤として一般的に用いられる不活性な物質であって、処方物に有益な生理学的特性を付与するものを指す。当業者は、処方物において特定の機能、例えば、凍結保護、安定化、保存などを有し得る、医薬的目的のために好適な賦形剤に精通している。
「無菌の」処方物は、無菌であるか、全ての生きた微生物およびそれらの胞子を本質的に含まない。これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
「無菌の」処方物は、その中にあるタンパク質が、保存の間にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持するものである。好ましくは、処方物は、保存の間に物理的および化学的安定性ならびにその生物学的活性を本質的に保持する。
保存期間は、一般に、意図される処方物の有効期限に基づいて選択される。タンパク質の安定性を測定するための多様な分析技術は、当該分野において利用可能であり、例えばPeptide and Protein Drug Delivery、247-301、Vincent Lee編、Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs.（1991）およびJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90（1993）において概説される。安定性は、選択された温度で、選択された期間にわたり測定することができる。ある態様において、処方物は、約４０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８週間またはそれより長くにわたり安定である。さらに、処方物は、好ましくは、処方物の以下の凍結（例えば－２０℃または－７０℃まで）および融解の後で、例えば１、２、３、４または５サイクルの凍結融解の後で、安定である。安定性は、定量的および／または定性的に、当業者に公知の多様な異なる方法において、評価することができる。安定性の研究は、ALX 0081が－２０℃で少なくとも３年間にわたり安定であることを示した。
処方物は、水性のキャリアを含む。水性のキャリアは、特にバッファーである。
本明細書において用いられる場合、「バッファー」とは、その酸－塩基共役成分の作用により、ｐＨの変化に抵抗する、緩衝化された溶液を指す。本発明の処方物は、クエン酸またはリン酸バッファーの少なくとも１つから選択されるバッファー、好ましくはクエン酸バッファーを含む。先に決定されたように、これらのバッファーは、vWF結合剤の安定性を増強する。
本発明による処方物は、クエン酸バッファーを、５～２００ｍＭの範囲の濃度、好ましくは７．５～８０ｍＭ、さらにより好ましくは１０～５０、例えば１０、１５、２０、２５または３０ｍＭ、および最も好ましくは２０ｍＭで含み、ここで、各々の値は、任意に、±５ｍＭの範囲を包含することが理解される。あるいは、本発明による処方物は、リン酸バッファーを、５～２００ｍＭの範囲の濃度、好ましくは５～８０ｍＭ、より好ましくは７．５～６０ｍＭ、さらにより好ましくは１０～４０、例えば１０、１５、２０、２５または３０ｍＭ、および最も好ましくは１０ｍＭで含み、ここで、各々の値は、任意に、±５ｍＭの範囲を包含することが理解される。より低い濃度のバッファーは、最終浸透圧に対して、および同様に添加されなければならない可能性があるさらなる溶質に対して、影響を有することが、理解されるであろう。
本発明の処方物のｐＨは５．０～７．５の範囲であり、ここで、各々の値は、±２ｍＭの範囲を包含することが理解される。最も有利なｐＨは、処方物中に含まれるバッファーに依存するであろう。したがって、本発明は、特に、リン酸バッファーを含む処方物に関し、これは、好ましくは、６．５～７．５の範囲、好ましくは６．９、７．０、７．１、例えば７．１のｐＨを有する。クエン酸バッファーを含む処方物は、保存および使用のために著しく好適であったことが示された。したがって、本発明は、クエン酸バッファーを含む処方物に関し、これは６．０～７．０、より好ましくは６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８または６．９、例えば６．５のｐＨを有し、ここで、各々の値は、任意に、±２ｍＭの範囲を包含することが理解される。
本発明の処方物は、本発明のポリペプチド、特に免疫グロブリン単一可変ドメインまたはvWFに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド、例えばALX 0081を、臨床的目的のために好適な濃度で含み、これは、患者に対する使用の前の希釈のためのストック溶液において用いられる濃度を含む。安定性の改善の他に、本発明の処方物は、高濃度のvWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド、例えばALX 0081を可能にする。
本発明の処方物中の活性剤、例えばALX 0081などのvWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチドの典型的な濃度は、０．１～１５０ｍｇ／ｍＬの範囲、例えば１～１００ｍｇ／ｍＬ、５～８０ｍｇ／ｍＬ、または１０～４０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬの濃度の非限定的な例を含み、ここで、各々の値は、任意に、±２０％の範囲を包含することが理解される（例えば、１０の値は、任意に、８～１２ｍｇ／ｍＬの範囲を包含する）。
本発明のさらなる態様において、本発明の任意の側面による処方物は、さらに、洗剤または界面活性剤を含んでもよい。
本明細書において、「界面活性剤」は、表面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤を指す。本明細書における界面活性剤の例として、ポリソルベート；ポロクサマー（例えばポロクサマー１８８）；Triton；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）；ラウリル（laurel）硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル（linoleyl）－、またはステアリル－スルホベタイン；ラウリル－、ミリスチル－、リノレイル－またはステアリル－サルコシン；リノレイル－、ミリスチル－、またはセチル－ベタイン；ラウロアミド（lauroamido）プロピル－、コカミドプロピル－、リノレアミドプロピル－、ミリストアミド（myristamido）プロピル－、パルミド（palmido）プロピル－、またはイソステアル（isostear）アミドプロピル－ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリストアミドプロピル－、パルミドプロピル－、またはイソステアルアミドプロピル－ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル－、または二ナトリウムメチルオレイル－タウレート；およびMONAQUAT（登録商標）シリーズ（Mona Industries、Inc.、Paterson、N.J.）；ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、ならびにエチレンおよびプロピレングリコールのコポリマー（例えばPluronics、PF68 etc）；などが挙げられる。一態様において、本明細書における界面活性剤は、ポリソルベート80である。本発明による使用のために好ましい好適な洗剤または界面活性剤として、限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリソルベート－２０、－４０、－６０、－６５、－８０または－８５が挙げられる。ポリソルベートについての一般的な商品名として、Alkest、CanarcelおよびTweenが挙げられる。当業者は、洗剤のさらなる非限定的な例、例えばWO2010/077422において列記されるものなどを知っている。好ましい態様において、洗剤は、非イオン性洗剤である。より具体的には、洗剤はポリソルベート－８０であり、これは本明細書において以後Tween-80とも呼ばれる。当業者は、本発明の処方物のための洗剤の好適な濃度を容易に決定することができる。典型的には、濃度は、洗剤の有益な効果（例えば、処方された本発明のポリペプチドの凝集を低下させる剪断応力（例えば撹拌）の条件下における安定化効果）を維持しつつ、可能な限り低くする。例示的な非限定的な態様において、洗剤の濃度は、０．００１～０．５％の範囲、例えば０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％または０．５％であり、好ましくは０．０１～０．０５％、より好ましくは０．０１～０．０２％、例えば０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度であってよい。
本発明の処方物は、保存剤などの賦形剤をさらに含んでもよい。
「保存剤」とは、任意に、処方物中に細菌の活性を本質的に低下させ、それにより例えば複数回の使用のための処方物の製造を容易にするために、処方物中に含まれてもよい化合物である。可能な保存剤の例として、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、および塩化ベンゼトニウムが挙げられる。他の型の保存剤として、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコールなどの芳香族アルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、クロロヘキサノール、３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールが挙げられる。一態様において、本明細書における保存剤は、ベンジルアルコールである。
本発明の処方物は、ポリオールなどの安定化剤をさらに含んでもよい。
「ポリオール」とは、複数のヒドロキシル基を有する物質であって、糖（還元糖および非還元糖を含む）、糖アルコールならびに糖酸を含む。ポリオールは、任意に、例えば安定性を改善するために、処方物中に含まれていてもよい。ある態様において、本明細書におけるポリオールは、約６００ｋＤ未満（例えば約１２０～約４００ｋＤの範囲）の分子量を有する。「還元糖」とは、ヘミアセタール基を含み、タンパク質中の金属イオンを還元するかまたはリジンおよび他のアミノ基と共有結合的に反応することができるものであり、「非還元糖」とは、糖を還元するこれらの特性を有しないものである。還元糖の例は、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトースおよびグルコースである。非還元糖として、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトースおよびラフィノースが挙げられる。マンニトール、キシリトール、エリスリトール、トレイトール、ソルビトールおよびグリセロールは、糖アルコールの例である。糖酸に関しては、これらは、Ｌ－グルコン酸およびその金属塩を含む。所望される場合、処方物は、凍結融解に対して安定であり、ポリオールは、凍結温度（例えば－２０℃）において処方物中の抗体を不安定化するようには結晶化せず、好ましい。ある態様において、スクロースおよびトレハロースなどの非還元糖は、ポリオールの例であり、トレハロースの溶液安定性にも関わらず、スクロースが好ましい。
本発明により用いられる本発明の治療用化合物は、保存のために、所望される程度の純度を有するポリペプチドを、任意の薬学的に許容し得るキャリア、賦形剤または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、Osol, A.編［1980］）と混合することにより、凍結乾燥処方物または水溶液の形態において調製する。許容し得るキャリア、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度において、レシピエントにとって非毒性である。したがって、本発明による処方物はまた、任意に、１または２以上の賦形剤を含んでもよい。
一般的に用いられる安定剤および保存剤は、当業者に周知である（例えばWO2010/077422を参照）。これらの組成物中で用いることができる薬学的に許容し得るキャリアとして、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、バッファー物質、例えばリン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸、ロウ、ゼラチン、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質；ならびにアミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン。有利な態様において、賦形剤は、ＮａＣｌ、トレハロース、スクロース、マンニトールまたはグリシンからなるリストから選択される１または２以上であってよい。
活性成分をまた、例えばコアセルベーション技術により、または界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリラート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に封入してもよい。かかる技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、Osol, A.編（1980）において開示される。
本発明のポリペプチドは、任意の薬学的に許容し得る処方物中に処方することができる。処方物は、液体であっても乾燥していてもよい。処方物は、混合、乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、または医薬組成物を処方するための任意の公知の方法を介して作成することができる。
好ましい本発明の処方物は、リン酸バッファー溶液（ｐＨ７．１）中に、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）を含む。さらにより好ましくは、本発明の処方物は、リン酸バッファー溶液（ｐＨ７．１）、グリシン（０．２Ｍ）およびポリソルベート８０（０．０２％ｖ／ｖ）中に、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）を含む。
本発明のポリペプチドは、さらに、PCT/EP14/060107において記載されるように処方することができる。
好ましい処方物は、以下を含む：
（ａ）約０．１ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬの濃度の、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（例えばALX 0081）；
（ｂ）約１％～約１５％（ｗ／ｖ）の濃度の、スクロース、グリシン、マンニトール、トレハロースまたはＮａＣｌから選択される賦形剤；
（ｃ）約０．００１％～０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のTween-80；ならびに
（ｄ）処方物のｐＨが約６．０～７．０となるような約５ｍＭ～約２００ｍＭの濃度のクエン酸バッファー。
さらなる好ましい本発明の処方物は、vWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド（ALX 0081など）を、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、クエン酸バッファーを２０ｍＭ（ｐＨ６．５）の濃度で含み、さらに７％スクロース（ｗ／ｖ）、およびTween-80を０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。
いくつかの態様において、処方物は、液体として保存される。他の態様において、処方物は、液体として調製され、次いで、例えば凍結乾燥またはスプレー乾燥により、保存の前に乾燥される。乾燥される処方物は、乾燥化合物として、例えば、エアロゾルまたは粉末として用いても、または、水、バッファーもしくは他の適切な液体を用いて、その元の濃度もしくは別の濃度まで再構成されてもよい。
本発明はまた、１２．５ｍｇのカプラシズマブおよび注射のための溶液のための賦形剤を含む凍結乾燥物が充填されたバイアルに関する。賦形剤（再構成された溶液１ｍＬあたり）：バイアルあたり０．２１ｍｇのクエン酸、５．５８ｍｇのクエン酸三ナトリウム二水和物、７０ｍｇのスクロース、０．１１ｍｇのポリソルベート－８０（ｐＨ６．５＋／－０．５）。１ｍＬの注射用水（WFI）による再構成の後で、強度は、１２．５ｍｇ／ｍＬのカプラシズマブである（１０ｍｇの投与される見かけの用量のため）。
本発明はまた、液体処方物のさらなる処理により得ることができる製品、例えば凍結、凍結乾燥またはスプレー乾燥された製品を包含する。再構成により、これらの固体の製品は、本明細書において記載されるような（しかしそれに限定されない）液体処方物となり得る。したがって、その最も広義の意味において、用語「処方物」は、液体および固体の両方の処方物を包含する。しかし、固体処方物は、液体処方物から（例えば凍結、凍結乾燥またはスプレー乾燥により）誘導可能であるものとして理解され、したがって、本明細書における液体処方物について特定される特徴により定義される多様な特徴を有する。本発明は、例えば凍結乾燥またはスプレー乾燥の前の元の組成物から誘導される組成物をもたらす再構成を除外しない。したがって、元々凍結乾燥された液体の容積と比較した、凍結乾燥物に添加される水または希釈剤の量に依存して、凍結乾燥された処方物は、再構成されて、元（すなわち凍結乾燥の前）の濃度とは異なる濃度を有する処方物を生じてもよい。好適な処方物は、抗体の完全性の１または２以上のパラメーターをアッセイすることにより、同定することができる。
好ましい態様において、本発明による処方物は、ヒトの血液に対して等張である。等張溶液は、血漿と同じ浸透圧を有し、したがって、対象の血漿の浸透圧を変化させることなく、対象に静脈内注入することができる。重量オスモル濃度により表すことができ、これは、理論上の重量オスモル濃度であっても、好ましくは実験により決定される重量オスモル濃度であってもよい。典型的には、重量オスモル濃度は、２９０±６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２９０±２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であろう。
本発明の処方物はまた、凍結乾燥の間に本発明のポリペプチドを保護するために特に有用である化合物を含んでもよい。かかる化合物は、凍結保護剤として知られ、当業者には周知である。具体例として、限定されないが、スクロース、ソルビトールまたはトレハロースなどの糖；グルタミン酸、特にグルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタイン、硫酸マグネシウム、糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびこれらの組み合わせが挙げられる。本発明を理解することにより、添加されるべきかかる化合物の必要量は、液体形態における、および凍結乾燥される場合の処方物の安定性を考慮して、当業者により容易に決定することができる。凍結乾燥のために特に好適な処方物は、さらに、増量剤（bulking agent）を含んでもよい。好適な剤は、当業者に広く知られている。スクロースを含む処方物は、例えば保存および凍結乾燥の間のvWF結合剤の物理的安定性を維持するためのみならず、凍結保護剤としても特に好適であったことが示されている。
概略されるとおり、上記の処方物の任意のものを、さらに、例えば凍結乾燥、スプレー乾燥、または凍結、例えばバルク凍結により、処理してもよい。生じる処理された製品は、上で定義されるとおり、液体の出発処方物に由来する特徴を有する。必要である場合には、例えば凍結保護剤などなどのさらなる剤を、さらなる処理のために含めてもよい。
本発明の処方物は、凍結乾燥後に、本発明のポリペプチド、特にALX 0081の化学的および物理的完全性を維持する効果を有する。すなわち、長期の、例えば上で定義されるような期間にわたる、－７０℃～＋４０℃の温度での保存の後ですら、製品の純度／不純物プロフィールは本質的に変化しない。例えば、凍結乾燥後の長期保存は、RP-HPLC、SE-HPLCまたはcIEFプロフィールに対して、顕著な効果を有しなかった。
本発明のポリペプチドは、任意の一般的に用いられる方法により生成することができる。典型例として、好適な宿主系、例えば細菌または酵母における組み換え発現が挙げられる。本発明のポリペプチドは、本発明により処方される前に、好適な精製レジメンを経る。
一般的に、本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドを生成するように遺伝子操作された生きている宿主細胞により生成される。タンパク質を精製するように細胞を遺伝子操作する方法は、当該分野において周知である。例えばAusubelら編（1990）、Current Protocols in Molecular Biology（Wiley, New York）を参照。かかる方法は、ポリペプチドをコードし、その発現を可能にする核酸を、生きた宿主細胞中に導入することを含む。これらの宿主細胞は、培養中で生育される細菌細胞、真菌細胞または動物細胞であってよい。細菌宿主細胞として、限定されないが、Escherichia coli細胞が挙げられる。好適なE. coli株の例として、HB101、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539、および外来DNAを切断することができない任意のE. coli株が挙げられる。用いることができる真菌宿主細胞として、限定されないが、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastorisおよびAspergillus細胞が挙げられる。用いることができる動物細胞株のいくつかの例は、CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、およびWI38である。当業者に周知の方法を用いて（例えば、形質転換、ウイルス感染、および／または選択により）、新たな動物細胞株を確立してもよい。任意に、ポリペプチドは、宿主細胞により培地中に分泌されてもよい。
いくつかの態様において、細菌細胞、例えば、E. coli細胞においてポリペプチドを産生させることができる。例えば、ポリペプチドが、ファージディスプレイ ベクター中の配列によりコードされており、該配列が、ディスプレイエンティティー（display entity）とバクテリオファージタンパク質（またはそのフラグメント）との間に制御可能な停止コドンを含む場合、ベクター核酸を、停止コドンを抑制できない細菌細胞中にトランスファーすることができる。この場合、ポリペプチドは、gene IIIタンパク質と融合せず、周辺質および／または培地中に分泌される。
ポリペプチドはまた、真核細胞において産生させることができる。一態様において、Pichia（例えば、Powers et al. J Immunol Methods 251:123-35 (2001)を参照）、HansenulaまたはSaccharomycesなどの酵母細胞においてポリペプチドを発現させる。
一態様において、ポリペプチドを、哺乳動物細胞において産生させる。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させるための典型的な哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（例えばKaufman and Sharp, Mol. Biol. 159:601-621 (1982)において記載されるようなDHFR 選択可能マーカーと共に用いられる、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220(1980)において記載されるdhfr-CHO細胞を含む）、リンパ球細胞株、例えばNS0ミエローマ細胞およびSP2細胞、COS細胞、ならびにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物からの細胞が挙げられる。例えば、細胞は、乳腺上皮細胞である。
ポリペプチドをコードする核酸配列に加えて、組み換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子を担持してもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第4,399,216号；同第4,634,665号；および同第5,179,017号を参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。
標準的な分子生物学技術を用いて、組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質転換させ、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、および培養培地から抗体分子を回収することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。
一態様において、本発明のポリペプチドは、WO 10/056550において記載されるように精製する。例示的な態様において、以下により、１または２以上の夾雑物からポリペプチドを精製する：ポリペプチドと夾雑物の混合物を、Protein Aベースの支持体および／またはイオン交換支持体と、ポリペプチドが支持体に結合するかまたは吸着することを可能にする条件下において、接触させること；ポリペプチドが支持体に結合したままとなる条件下において、結合した支持体を洗浄することにより、１または２以上の夾雑物を取り除き、吸着したポリペプチド分子を溶離バッファーで溶離させることにより、支持体からポリペプチドを選択的に溶離させること。
本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物により産生させることができる。例えば、米国特許第5,849,992号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現させる方法を記載する。乳汁特異的プロモーターおよび抗体分子をコードする核酸および分泌のためのシグナル配列を含むトランスジーンを構築する。かかるトランスジェニック哺乳動物のメスにより生成される乳汁は、目的の単一ドメインを、その中に分泌されたものとして含む。抗体分子を、乳汁から精製しても、いくつかの用途のためには、直接的に用いてもよい。
本発明は、本明細書において定義される処方物を製造する方法を包含する。
例えば、本発明によるバッファーを用いて本発明のポリペプチドをカラムから溶離させる場合、精製および処方のステップは同時であってもよい。あるいは、本発明の処方物は、任意の好適な手段、例えば透析、限外濾過などの当該分野において広く用いられている手段により、バッファーを交換することにより調製することができる。
いくつかの態様において、本発明の処方物を製造する方法はまた、凍結乾燥またはスプレー乾燥された処方物の、例えば水または好適なバッファー（これは任意にさらなる賦形剤を含んでもよい）の添加による再構成に関し得る。
本発明による処方物を調製するための方法は、さらなるステップ、例えば密封容器などの臨床的使用のために好適なバイアル中にそれを充填すること、および／またはそれを投与単位形態に調合することを包含してもよい。方法はまた、スプレー乾燥、凍結乾燥、または凍結、例えばバルク凍結などのさらなるステップを含んでもよい。本発明はまた、容器、投与単位形態、または本明細書において記述される方法のうちの任意のものにより得ることができる他の製品を包含する。
本発明の処方物は、本明細書において定義されるような本発明のポリペプチド、例えばvWFに対する少なくとも１つのISVDを含むポリペプチド、例えばALX 0081を、保存するために用いることができる。したがって、本発明は、本明細書において定義されるような処方物の使用により特徴づけられる、本明細書において用いられるような本発明のポリペプチドの保存の方法を包含する。より具体的には、本発明は、本発明のポリペプチドを保存のために安定化させるための方法を包含し、該方法は、例えば、本明細書において記載されるような処方物の調製を含む。保存は、任意に－７０℃～＋４０℃、例えば－７０℃、－２０℃、＋５℃、＋２５℃または＋４０℃の温度で、好ましくは－７０℃～＋２５℃の温度で、より好ましくは－２０℃～＋５℃の温度で、１～３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０または３６か月間、例えば少なくとも１２か月間であってよい。したがって、保存は、凍結、フリーズドライ（凍結乾燥）および／またはスプレー乾燥を含んでもよい。保存方法は、さらに、本明細書において定義されるようなvWF結合剤の物理的および化学的完全性の評価を含んでもよい。
本発明はまた、本明細書において定義されるようなvWF結合剤のうちの少なくとも１つを含む処方物を分析するための方法に関する。処方物は、本明細書において定義されるようなvWF結合剤化学的または物理的不安定性の任意の兆候について分析することができる。例えば、処方物を、分解生成物、例えばタンパク質分解フラグメントなどの低分子誘導体の存在について；および／または化合物誘導体、例えばピログルタミン酸バリアントについて；および／または凝集物、集塊物などの高分子誘導体について評価することができる。処方物はまた、総タンパク質含有量および／または力価について評価することができる。本明細書において言及される多様なアッセイ法の各々を、本発明の分析方法において用いることができる。
したがって、本発明はまた、例えば製造、保存および使用のうちの１または２以上の間の、処方物の質および／または安定性をモニタリングおよび／または評価するための方法に関する。本発明はまた、例えば本明細書においてさらに記載されるように処方物が製品の規格に合致することを評価するための、処方物の質の制御の方法に関する。これらの側面のうちの任意のものにおける本発明は、１または２以上の参照試料による比較、バッチまたはバッチのバリエーション、および製造プロセスの進行中のモニタリングから選択される１または２以上を含む。
本発明は、決して限定することなく、例えば本発明の処方物を含むことにより、または本発明の処方物の製造もしくは配合のために必要であることにより、本発明の処方物に関連する、任意の製品に関する。
例えば、本発明は、製品、例えば本発明による処方物の１または２以上を含む密封容器に関する。
本発明はまた、本明細書において記載される任意の態様による処方物の１または２以上を含む、医薬単位投与形態、例えば、患者、好ましくはヒト患者への、非経口（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下での）投与のために好適な投与形態に関する。
投与単位形態は、例えば、事前に充填されたシリンジ、アンプル、カートリッジまたはバイアルの形式であってよい。
また提供されるのは、本発明の処方物、および例えば医療専門家による使用のための説明を含む、キットまたは製品である。キットまたは製品は、本発明の本明細書において記載されるような処方物を含む、バイアルまたはシリンジを含む。
好ましくは、バイアルまたはシリンジは、ガラス、プラスチック、または環状オレフィンポリマーもしくはコポリマーから選択されるポリマー材料からなる。シリンジ、アンプル、カートリッジまたはバイアルは、任意の好適な材料、例えばガラスまたはプラスチックにより製造することができ、ゴム材料、例えばバイアルのためのゴム製ストッパー、ならびにシリンジおよびカートリッジのためのゴム栓およびゴム製シールを含んでもよい。本発明はまた、本発明による処方物の１または２以上を含むキットに関する。キットは、使用のための説明、および／または臨床用添付文書をさらに含んでもよい。本明細書において定義されるような製品の任意の態様において、本発明はまた、包装材、使用のための説明、および／または例えば規制面により必要とされるような臨床用添付文書の存在を包含する。
２または３以上のアミノ酸配列を比較する目的のために、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」のパーセンテージ（本明細書において「アミノ酸同一性」としても言及される）は、［第２のアミノ酸配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と同一である、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を、［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で除算し、［１００％］を乗算することにより、計算することができ、ここで、第１のアミノ酸配列と比較した、第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換または付加は、単一のアミノ酸残基（位置）における差異、すなわち本明細書において定義されるような「アミノ酸の差異」であるものとみなす。
あるいは、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度は、ヌクレオチド配列配列についての同一性の程度を決定するために上述したものなどの公知のコンピューターアルゴリズムを用いて、やはり標準的なセッティングを用いて、計算することができる。
通常、本明細書において上で概略される計算方法により、２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的のために、アミノ酸残基の最大の数を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他方のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
また、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度を決定することにおいて、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができ、これは、一般に、あるアミノ酸残基を、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性に殆どまたは本質的に全く影響を有さない類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸置換として説明することができる。かかる保存的アミノ酸置換は、例えばWO 04/037999、GB-A-3 357 768、WO 98/49185、WO 00/46383およびWO 01/09300から当該分野において周知であり；ならびにかかる置換の（好ましい）型および／または組み合わせは、WO 04/037999ならびにWO 98/49185から、ならびに本明細書において引用されるさらなる参考文献からの関連する教示に基づいて、選択することができる。かかる保存的置換は、好ましくは、以下の群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸を、同じ群内の別のアミノ酸残基により置換する置換である：（ａ）小さい脂肪族の、非極性または僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負に荷電した残基およびそれらの（荷電していない）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、以下のとおりである：Ａｌａを、Ｇｌｙに、またはＳｅｒに、；ＡｒｇをＬｙｓに；Ａｓｎを、Ｇｌｎに、またはＨｉｓに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＣｙｓをＳｅｒに；ＧｌｎをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；Ｇｌｙを、Ａｌａに、またはＰｒｏに；Ｈｉｓを、Ａｓｎに、またはＧｌｎに；Ｉｌｅを、Ｌｅｕに、またはＶａｌに；Ｌｅｕを、Ｉｌｅに、またはＶａｌに；Ｌｙｓを、Ａｒｇに、Ｇｌｎに、またはＧｌｕに；Ｍｅｔを、Ｌｅｕに、Ｔｙｒに、またはＩｌｅに；Ｐｈｅを、Ｍｅｔに、Ｌｅｕに、またはＴｙｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＴｒｐをＴｙｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；および／またはＰｈｅを、Ｖａｌに、Ｉｌｅに、またはＬｅｕに。本明細書において記載されるポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978により開発された、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度の分析に基づいていても、Chou and Fasman, Biochemistry 13：211, 1974 and Adv. Enzymol., 47：45-149, 1978により開発された構造形成電位の分析に基づいていても、ならびに、Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：140-144, 1984；Kyte & Doolittle；J Molec. Biol. 157：105-132, 1981およびGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15：321-353, 1986により開発されたタンパク質中の疎水性パターンの分析に基づいていてもよく、これらは全て、それらの全体において本明細書において参考として援用される。Nanobody（登録商標）の一次、二次および三次構造についての情報は、本明細書における説明において、および上で引用される一般的な背景技術において示される。また、この目的のために、ラマからのVHHドメインの結晶構造は、例えばDesmyter et al., Nature Structural Biology、第３巻、9, 803（1996）；Spinelli et al., Natural Structural Biology（1996）；3, 752-757；およびDecanniere et al., Structure、第７巻、4, 361（1999）において示される。従来のVHドメインにおいてVH/VL界面を形成するアミノ酸残基のうちのいくつか、およびこれらの位置における可能なラクダ化置換についてのさらなる情報は、上で引用される先行技術において見出すことができる。
本発明はまた、vWF関連疾患、例えば急性冠症候群（ACS）、一過性脳虚血発作、不安定もしくは安定狭心症、脳卒中、心筋梗塞または血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）などを処置または予防する方法に関し；前記方法は、対象に、本発明の処方物を含む医薬組成物を投与し、それにより、前記vWF関連疾患に関連する１または２以上の症状を軽減することを含む。特に、前記vWF関連疾患は、TTPである。
加えて、本発明は、vWF関連疾患により特徴づけられる疾患を罹患しやすいかまたはこれを診断されたヒト患者の処置のための方法に関し、該方法は、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドの有効量を、ヒト患者に投与することを含む。
本発明は、TTPなどのvWF関連疾患を処置または予防する方法を提供し、該方法は、ヒトに、５～４０ｍｇの用量のフォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドを投与し、それにより、前記vWF関連疾患に関連する１または２以上の症状を軽減することを含む。
本発明は、本明細書において記載されるような処置を提供し、ここで、前記の本明細書において記載されるようなポリペプチドを投与した後で、５分間～８時間以内に、第１の血漿交換（PE）を行う。
本発明は、本明細書において記載されるような処置を提供し、ここで、前記の本明細書において記載されるようなポリペプチドを投与する前に、前記第１のPEの３６時間以内、好ましくは３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８または１６時間以内、好ましくは約２４時間以内に、事前の血漿交換（PE）を行う。
本発明は、本明細書において記載されるような処置を提供し、ここで、前記第１のPEの後で、５分間～８時間以内、例えば１０分間～６時間または１５分間～４時間以内、例えば８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、３時間、１時間、４５分間、３０分間、２０分間、１５分間、１０分間またはわずか５分間以内に、本明細書において記載されるようなポリペプチドの、１～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの第２の用量を投与し、例えばここで、前記ポリペプチドの前記第２の用量を、前記第１のPE の１～６０分間、例えば３０分間以内に、好ましくは皮下注射により投与する。
本発明は、
（ｉ）PEを行い；（その後）
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記PEの１５分間～４時間後に、本明細書において記載されるようなポリペプチドの５～４０ｍｇの用量を投与すること；ならびに
（ｉｉｉ）任意に、前記患者の血小板カウントおよび／またはADAMTS13活性を測定すること、
をさらに含む、本明細書において記載されるような処置を提供し、
ここで、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、前記患者の血小板カウントが≧１５００００／μｌとなるか、および／またはADAMTS13活性が、ADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％または５０％にもなるまで、１日あたり１回繰り返す。
本発明はまた、前記患者の血小板カウントが≧１５０．０００／μｌとなった後で、本明細書において記載されるようなポリペプチドの５～４０ｍｇの用量を、１日あたり１回、少なくとも５、１０、１５、２０、２５またはさらに３０日間にわたり投与することをさらに含む、本明細書において記載されるような処置を提供する。
本発明は、前記ヒトが寛解するまで、本明細書において記載されるようなポリペプチドの５～４０ｍｇの用量を、１日あたり１回投与することをさらに含む、本明細書において記載されるような処置を提供する。
本発明は、ADAMTS13活性が、ADAMTS13参照活性の少なくとも１０％、例えば少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４５％または５０％にもなるまで、前記ポリペプチドを投与することを含む、本明細書において記載されるような処置を提供する。
本発明の別の態様において、上記のような疾患の処置のために有用な材料を含む製品が提供される。製品は、容器、ラベルおよび添付文書を含む。好適な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料のものであってよい。陽気は、状態を処置することにおいて有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿通可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１の活性剤は、ALX 0081などの本発明のポリペプチドである。容器上の、または容器に関連するラベルは、当該組成物が、選択される状態を処置するために用いられることを示す。製品は、本明細書において記載されるようなリン酸緩衝化食塩水またはクエン酸緩衝化食塩水などの薬学的に許容し得るバッファーを含む第２の容器を、さらに含んでもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、使用者または商業的立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドまたは本明細書において記載されるような処方物を含む容器、および使用のための説明を含む、キットまたは製品を提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなキットまたは製品を提供し、ここで、処方物は、バイアルまたは注射用シリンジ中に存在する。
本発明は、本明細書において記載されるようなキットまたは製品を提供し、ここで、処方物は、事前に充填された注射用シリンジ中に存在する。
本発明は、本明細書において記載されるようなキットまたは製品を提供し、ここで、シリンジまたはバイアルは、ガラス、プラスチック、または環状オレフィンポリマーもしくはコポリマーから選択されるポリマー材料からなる。
本明細書において説明され、議論される態様は、単に、本発明を製造および使用するために本発明者らに知られる最良の方法を当業者に教示することを意図する。本発明から逸脱することなく、本発明の上記の態様の改変およびバリエーションが可能であることは、上の教示を考慮して、当業者により理解される。したがって、請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内において、本発明は、具体的に記載されたものとは異なって実施することができることが理解される。
本発明は、いまや、以下の非限定的な好ましい側面、例および図面により、さらに記載されるであろう。
本願を通して引用されるすべての参考文献（学術文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願）の全内容は、本明細書において上で言及される教示については特に、本明細書により明示的に参考として援用される。
６．略号
AE 有害イベント
ACS 急性冠症候群
ADAMTS13 トロンボスポンジンリピートを有するディスインテグリン様およびメタ
ロプロテアーゼ１３（a disintegrin-like and metalloprotease with
thrombospondin repeats 13）
ALX 0081 カプラシズマブ
AMI 急性心筋梗塞
BNP 脳性ナトリウム利尿ペプチド
BMI 肥満度指数
BU ベセスダ単位
CDR 相補性決定領域
cIEF 毛管等電点電気泳動
dAb 単一ドメイン抗体
ELISA 酵素結合免疫吸着アッセイ
HR ハザード比
ISVD 免疫グロブリン単一可変ドメイン
ITT 処置企図
i.v. 静脈内
FR フレームワーク領域
KA 会合定数
KD 解離定数
LDH 乳酸デヒドロゲナーゼ
NSE 神経特異的エノラーゼ
NT proBNP Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド
PE or PEX 血漿交換
PP プロトコル毎
RICO リストセチンコファクター活性
RP-HPLC 逆相高速液体クロマトグラフィー
SAE 重篤有害イベント
s.c. 皮下
scFv 単鎖可変フラグメント
S/D 溶媒／洗剤
SE-HPLC 分子ふるい高速液体クロマトグラフィー
SPR 表面プラズモン共鳴
TnI トロポニンＩ
TnT トロポニンＴ
TRALI 輸血関連急性肺傷害
TTP 血栓性血小板減少性紫斑病
TTR 応答までの時間
ULN 正常値上限
ULvWF 超巨大vWF
VH 重鎖可変ドメイン
VHH 重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列
VL 軽鎖可変ドメイン
vWF フォン・ヴィレブランド因子
７．例
７．１ 適用可能な規制
例のセクションにおいて用いられた全てのヒト試料は、市販のソースまたはヒト志願者（全ての必要とされる同意および承認を得た後）のいずれかから得、適用可能な法的および規制要件（医学的秘密および患者のプライバシーに関するものを含む）に従って用いた。
臨床試験は、適用可能な法律および規制に従って（ヘルシンキ宣言および医学的秘密および患者のプライバシーの保護の原則を含む）、全ての必要とされる承認（関連する倫理委員会による承認を含む）ならびに同意（含まれる対象のインフォームドコンセントを含む）を得た後で行った。
本臨床研究の目的および内容ならびにその結果は、機密として扱われ、第三者に利用可能にされていない。研究に参加している職員は、守秘義務により拘束された。全ての未使用の薬物は、出願人に返却されたか、または破壊された。
７．２ 内皮細胞由来ULvWFへの血小板接着に対する、およびADAMTS13の活性に対するALX 0081の効果
ゴール：本研究のゴールは、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、ULvWFへの血小板の接着を阻害することができるか否かを評価することであった。これは、次いで、本発明のポリペプチド、例えばALX-081の、急性のエピソードにおけるTTP患者の処置のための使用のための概念証明として役立ち得る。研究はまた、ADAMTS13の活性に対するALX 0081などの本発明のポリペプチドの効果を決定する。
方法：Sixma（Sixma et al. 1998 Thromb Res 92: S43-S46）に従って、フローチャンバー試験を用いて、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、血小板とULvWFとの間の相互作用を阻害することができるか否かを試験した。簡単に述べると、内皮細胞を、カバースリップ上で培養および刺激し、それによりULvWFを分泌させた。TTP患者からの血漿に血小板を補充し、刺激された細胞の上に灌流した。ULvWFに接着する血小板のストリングを、リアルタイムビデオ顕微鏡により可視化した。実験を、存在するALX 0081などの本発明のポリペプチドの濃度を増大させながら繰り返した。ADAMTS13によるULvWFの切断に対するALX 0081などの本発明のポリペプチドの効果を決定するために、２つの型の実験を用いた。第１の実験においては、ADAMTS13による血小板ストリングの切断を、過剰なALX 0081などの本発明のポリペプチドの不在下において評価した。第２の実験においては、vWFのA1－A2－A3ドメインからなる組み換えフラグメントを用いて、ADAMTS13に対するALX 0081などの本発明のポリペプチドの阻害効果を評価した。
結果：ALX 0081は、試験された全ての濃度においてULvWFに対する血小板ストリング形成を阻害し、ADAMTS13による血小板ストリングの剥離に対しては何らの効果も有しなかった。ALX 0081などの本発明のポリペプチドはまた、ADAMTS13によるvWFの組み換えA1－A2－A3ドメインフラグメントの切断に対して、何らの効果も有しなかった。ALX 0081などの本発明のポリペプチドはまた、本実験において既に形成されたストリングから血小板を取り外すことができなかった。
結論：本研究は、TTP患者を処置するためにALX 0081などの本発明のポリペプチドを用いることができるという概念証明をもたらす。本研究はまた、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、ADAMTS13活性を妨害しないことを証明する。
7.3 適格性の基準
患者は、研究の承認のために適格であるために、以下の基準の全てを満たさなければならない：
算入基準
１．１８歳以上
２．許容し得る避妊レジメンを許容することを望む男性または女性
３．TTPの臨床的診断を有する患者
４．PEを必要としていること（研究への無作為化の前に１回の単一のPEセッションが許可される）
５．経過観察するためにアクセス可能である対象
６．取得され、サインされ、日付が記入されたインフォームドコンセント
除外基準
１．１００，０００／μＬ以上の血小板カウント
２．敗血症（陽性の血液培養有りまたは無しでの昇圧薬の必要性）により示される重篤な活発な感染
３．E. coli 0157または関連生物による腸感染の臨床的エビデンス
４．抗リン脂質症候群
５．DICの診断
６．妊娠または母乳栄養
７．造血幹細胞または骨髄移植に関連する血栓性微小血管症
８．既知の先天性TTP
９．活発な出血または出血の高リスク
１０．非管理の動脈性高血圧
１１．安全に停止することができない既知の抗凝固処置（限定されないが、ビタミンＫ拮抗薬、ヘパリンまたはLMWHを含む）、および非アセチルサリチル酸非ステロイド性抗炎症分子による慢性処置
１２．治験における参加の障害となるであろうTTP以外の重篤または生命を脅かす臨床的状態
１３．３か月未満の平均余命をもたらす悪性病変を有する対象
１４．既知または疑われる骨髄癌腫症を有する対象
１５．研究プロトコルの要件および手順に従うことができない対象
１６．研究薬の活性物質に対する、または賦形剤に対する既知の過敏症
１７．CTCAEスケールにより定義されるグレード３の重篤度に対応する重篤な肝機能障害。重要な肝臓のパラメーターについて、これは、以下のとおり定義される：
・ビリルビン＞３×ULN（溶血に起因する間接的なビリルビンの孤立した増加を区別する必要があり、これは、除外パラメーターではないが、関連疾患である）
・ALT/AST＞5×ULN
・AP＞5×ULN
・ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）＞５×ULN
１８．GFR＜３０ｍＬ／分により定義される重篤な慢性腎機能障害
７．４ 研究デザイン
本研究は、第ＩＩ相の、多施設、単盲検、並列デザインの、無作為化プラセボ対象研究としてデザインされた（Titan trial）。研究集団は、後天性TTPの急性のエピソードを有し、PEによる処置を必要とする症候性の患者であった。研究参加への適格性の確認の後で（例７．３を参照）、患者を、１：１の比において、PEに対する補助治療としてALX 0081またはプラセボのいずれかを受けるように無作為化した（図１）。患者を、PE 処置の開始の前に無作為化した。しかし、例外的な場合において（全ての必要とされるスクリーニングおよび／または行われるべきベースライン研究手順を可能にしない時間枠においてPEを開始する必要性または能力に起因する）、患者を、事前の単一のPEセッション（「事前のPE」）の後であるが、次のPEセッション（「第１のPE」）の開始の前に、無作為化した。この全体として次のPEセッションを、事前のPEセッションの終了の２４時間以内に開始し、研究上の第１のPE（「第１のPE」）とみなした。
患者を、本研究の間の異なる相において追跡した：
・入院後のスクリーニングおよびベースライン測定
・処置相
○プッシュ注射を介して投与される単一のｉ．ｖ．ボーラス研究薬
○毎日のPEの補助的なｓ．ｃ．処置相
○毎日のPE後のｓ．ｃ．処置相（適用可能である場合、PEの漸減、および最後のPEの後３０日間にわたるPE後研究薬を含む）
・経過観察相
患者は、各々の場所における研究者により、ならびにTTPの処置のためのガイドラインに従って、適切であると判断される最良の医療および処置を受けた。個々の研究参加の最大合計期間は、最大で１５か月間：９０日間までの処置相、および寛解または９０日間の処置の後最大１年間の経過観察期間のいずれか先に訪れる方であった。一般的に、患者は、最後の毎日のPEの後、少なくとも１日間入院した。
研究薬は、補助的処置として、PEの手順に対して相対的な特定の時点において投与した。研究薬は、１日１回または２回の、１０ｍｇのカプラシズマブ（「処置群」）またはプラセボ（「プラセボ群」）からなる。
７．４．１ 第１の薬物投与
患者に、第１のPEの開始の１５分間～６時間前に、プッシュ注射を介して、１０ｍｇのALX 0081またはプラセボの第１のｉ．ｖ．ボーラスを投与した。この第１のPEの後で、PEの手順の終了後３０分間以内に、１０ｍｇの 研究薬のｓ．ｃ．投与を行った。
完全なPE処置期間の間（漸減および増悪のために与えられたPEを含む）、研究薬を、ｓ．ｃ．注射を介して毎日投与した。
１日あたり１回のPEを計画した場合、PEの手順の終了後３０分間以内に、１０ｍｇの研究薬を投与した。
１日あたり２回のPEを計画した場合、各PEの手順の終了後３０分間以内に、１０ｍｇの研究薬を投与した。研究薬の最大の合計日用量は、したがって、２０ｍｇであった。
１日あたり１回よりも少ないPEを計画した場合（すなわち、漸減レジメンの間）、１０ｍｇの研究薬を、毎日投与した。PEを行う日においては、研究薬投与は、PEの手順の終了後３０分間以内であった；PEを行わない日においては、研究薬投与は、前の投与の後２４時間（±１時間）後であった。
毎日のｓ．ｃ．での１０ｍｇの研究薬投与は、最後のPE（漸減を含む）の後３０日間にわたり継続した。
７．４．２ 一次エンドポイント
この第ＩＩ相研究の一次エンドポイントは、以下の判断基準に基づく応答までの時間（TTR）であった：血小板の回復≧１５０，０００／μＬ。エンドポイントに合致すると認定するためには、応答を、１５０，０００／μＬに等しいかこれより高い血小板回復の最初の報告の４８時間後に、新たな血小板の測定≧１５０，０００／μＬ、および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）≦２×正常値上限（ULN）、すなわち「確認された血小板応答」により確認しなければならなかった。血小板カウントは、TTPを有する患者における治療意志決定のための重要な研究マーカーである。これは、ULvWFにより媒介される血小板凝集が、TTPの背後にある一般的な病態生理学敵機構であり、TTPの診断の主要な特徴である重篤な血小板減少症および微小血管症性溶血性貧血をもたらすという事実に基づく（Scully et al.、上記）。
７．４．３ ADAMTS13活性の決定
ADAMTS13の活性および機能的阻害剤の活性は、FRETS-VWF73基質を用いる蛍光発生アッセイにより測定した（Kokame et al. 2005. Br J Haematol 129(1):93-100；Kremer Hovinga et al. 2006 J Thromb Haemost 4(5):1146-8）。
簡単に述べると、FRETS-VWF73アッセイは、本質的には記載されるとおり（Kokame et al. 2005、上記）、以下の改変を用いて行った：Pefabloc SC（Boehringer, Mannheim, Germany）を、アッセイバッファー（５ｍｍｏｌのL-1 Bis-Tris、２５ｍｍｏｌのL-1 CaCl2、０．００５％のTween-20、ｐＨ６．０）に、１ｍｍｏｌのL-1の最終濃度で添加した。アッセイカリブレーションは、アッセイバッファー中で１：２５に希釈された正常ヒト血漿プール（NHP；Swiss Red Cross Blood Services, Bern, Switzerland）を用いて得た（１００％）。さらなるカリブレーション試料は、NHPの、熱不活化されたNHP（３０分間にわたり５６℃でインキュベートし、その後１５分間の１５，０００×ｇでの遠心分離を行った）中での、３：４（７５％）、１：２（５０％）、１：４（２５％）、１：１０（１０％）、１：２０（５％）、１：５０（２％）および１：１００（１％）の段階的予備希釈により得、標準曲線のより低い活性範囲における血漿マトリックス効果について補正した。これらの標準試料の全て、ならびに熱不活化されたNHP（０％のADAMTS13活性）および全ての試験試料を、その後、アッセイバッファー中で１：２５に希釈した。次に、２５μＬの各々希釈した標準または患者の試料を、３７℃で、３８４ウェルの白色プレート（NUNC, Roskilde, Denmark）中でインキュベートした。１０分後、２５μＬのアッセイバッファー中に溶解した４μｍｏｌのL-1 FRETS-VWF73ペプチド基質を、各ウェルに添加し、３４０ｎｍの励起フィルター（バンド幅３５ｎｍ）および４５０ｎｍの発光フィルター（バンド幅２５ｎｍ）を備えた蛍光マイクロプレートリーダー（GENios, Tecan, Zurich, Switzerland）において３７℃で蛍光の放出を記録した。蛍光放出は、経時的に測定した（５分間毎に４２サイクル）。５分（サイクル２）～６０分（サイクル１３）の経時的な蛍光放出の直線回帰分析（Passing-Bablok）により、反応速度を計算した。各々のカリブレーション試料について、回帰曲線の傾きを計算し、カリブレーション曲線（傾向線）を作成するために用いた：ｙ＝ａｘ＋ｂであり；ｘ＝ADAMTS13（％）およびｙ＝デルタRFU／デルタ時間）。次いで、試料のADAMTS13活性（％）を、（ｙ－ｂ）×１／ａとして計算した。
ADAMTS13の機能的阻害剤の活性は、同じ蛍光発生FRETS-VWF73法により、正常ヒト血漿の、２時間にわたる３７℃での１：１（ｖ：ｖ）インキュベーションの後の残りのADAMTS13活性の、熱不活化（５６℃で３０分間）された患者の血漿による決定により、測定した。
各分析バッチについて、アッセイバッファー中で１：２５希釈された（１００％）正常ヒト血漿プール（NHP；Swiss Red Cross Blood Services, Bern, Switzerland）を用いて、カリブレーション曲線を作成した。さらなるカリブレーション試料は、NHPの、熱不活化されたNHP中での１：２（５０％）、１：４（２５％）、１：１０（１０％）、１：２０（５％）、１：５０（２％）および１：１００（１％）の段階的予備希釈により得た。全てのカリブレーション点を１回適用した。許容基準：（１）標準曲線の最終回帰の傾きは、＞６．０でなければならない；ならびに（２）最終プロットの回帰のＲ2は、＞０．９８（またはＲ＞０．９８９９）でなければならない。そうでなければ、アッセイは拒絶される。
７．５ TTP患者における結果
７．５．１ 対象の配置および集団の分析。
第ＩＩ相研究は、７５人の患者の試料サイズを含み、これを、表２において示されるように無作為化した。
一次分析集団は処置企図（intent-to-treat：ITT）集団であり、これは、無作為化された処置の割り当てによる全ての無作為化された対象からなった。加えて、効力の分析のために、プロトコル毎の集団（per protocol population：PP）を用いた。PP集団は、ITT集団のサブセットであり、無作為化された処置の割り当てによる、全ての無作為化された対象からなり、全ての主要なプロトコルの偏差および違反を除外する。
Figure 2022160431000003
結論において、両方の処置群、すなわち、カプラシズマブを投与されている患者（処置群）およびプラセボを投与されている患者（プラセボ群）において、均一な分布が存在した。処置群は、さらに、年齢、民族／人種およびBMIについて、良好にバランスが取れていた。
多様なパラメーターのベースラインの特徴を、処置群およびプラセボ群の患者において評価した。表３において、ベースラインの血小板カウントおよびLDHを表した。LDHレベルの増大は、溶血および／または組織虚血の増加の兆候である。
Figure 2022160431000004
カプラシズマブ群について、わずかにより低い平均ベースライン血小板カウントが存在した。両方の群において、平均血小板カウントは、ベースラインにおいて非常に低く、これは、重篤な疾患のセッティングと一致するが、また、存在している全ての対象が、参入のために考慮されたこと、およびより重篤度でない血小板減少性の対象に対する偏向が存在しないことの指標でもある。LDHは、両方の処置群について比較可能である。
表４において、ベースラインvWF：ＡｇおよびADAMTS13活性を表す。
Figure 2022160431000005
 両方の処置群は、vWF:AGおよびADAMTS13活性について良好にバランスが取れていた。対象の半分より多くが、特発性TTPを有することが、＜５％のADAMTS13活性により示された。
７．５．２ 研究結果：一次エンドポイント
血液マーカーの応答までの時間を、生存セッティングにおいてモニタリングした。一次エンドポイントである血液マーカーの応答までの時間は、血小板の回復≧１５０，０００／μＬを含んだ。血小板レベルは、TTPの疾患活性についての信頼し得るサロゲートマーカーを表す。ゼロから事象まで時間の期間は、３０日に設定した。
結果を、表５において表す。
データを層別化（無作為化前の１回のPEX：あり＆なし）により評価し、これを、完全なITT集団についての２．１９７の総ハザード比に集約し、総ITT集団に対するｐ値＝０．０１３であった。ハザード比とは、任意の時点において、プラシズマブを投与されている対象が、確認された血小板回復の一次エンドポイントを達成する速度が、プラセボを投与されている対象と比較して、２倍より高いことを意味する。
確認された血小板応答（一次エンドポイント）までの時間の短縮：
－無作為化前のPEXを行わない対象の群において、プラセボ群についての４．９２日間の中央値は、カプラシズマブ群についての３．００日間まで短縮された：３９％短縮（無作為化前のPEX＝なし）。
－無作為化前の１回のPEXを受けた対象の群において、プラセボ群についての４．３１日間の中央値は、カプラシズマブ群についての２．４４日間まで短縮された：４３％短縮（無作為化前のPEX＝あり）。
２つの層のプラセボ群（無作為化前の１回のPEX：あり＆なし）についての４．３１日間および４．９２日間の時間中央値は、医学文献および研究者のデータから予測されるよりも低かった（６日間；Bandarenko et al. Journal of Clinical Apheresis 1998; 13: 133-141を参照）。このことは、歴史的データに対して改善した医療処置の標準をもってすら、カプラシズマブ処置が優れていたことを示す。
確認された血小板応答までの時間の９５％ＣＩは、カプラシズマブ群について、プラセボ群に対して２～３倍狭い。このことは、疾患の解消までの時間は、カプラシズマブ処置群において、プラセボ群よりも変動性が低いことを示す。
Figure 2022160431000006
７．５．３ 研究結果：増悪
ITT集団内において、増悪を有する対象の割合を決定した。増悪は、確認された血小板応答の後の再発性の血小板減少症であって、最後のPEの後１日以上であるが、３０日以内に毎日のPE処置の再開始を必要とするものを指す。
結果を、表６において示す。
Figure 2022160431000007
 プラセボ群においてカプラシズマブ群より３倍多い増悪が存在した。
このことは、ALX 0081などの本発明のポリペプチドが、単独で、TTP（の症状）を処置する、および／または緩和させることの原因となり得るという知見を確認する。
７．５．４ 研究結果：再発
TTPを再発する対象の数を評価した。TTPの再発は、最後の毎日のPEの３０日後より後に起きる、TTPの新たなイベントとして定義される。表７において、処置の終了後１か月以内のITT集団中の増悪および／または再発を有する対象の比率を表す。
Figure 2022160431000008
本発明者らは、カプラシズマブ群においてプラセボ（PLC）群より多くの再発を観察し、これは、合計数を均一にする。
カプラシズマブ群における再発は、しばしば、カプラシズマブ処置終了の数日以内に起きる。このことは、再発ではなく、「延長された」増悪の可能性を暗示する。したがって、カプラシズマブ（CAP）処置は、一部の対象について、期間が短すぎた可能性がある。実際に、より多い数のCAP群における早期再発は、保護効果を実証し、一部の患者におけるより長いCAP処置を正当化する。このことは、カプラシズマブ処置は長期間にわたり継続されるべきであることを示す。
ADAMTS13活性は患者のサブセットにおいてのみ利用可能であるとはいえ、両方の処置群において、再発は、＜５％のベースラインADAMTS13活性を有する患者においてより顕著であることに注目することは、興味深い。このことは、＜５％のベースラインADAMTS13活性を有する患者は、より再発（または増悪）しやすく、カプラシズマブ処置は、より高い活性を有する患者と比較してさらにより長期にわたり継続すべきであることを示し得る（例７．５．８を参照）。
７．５．５ 研究結果：完全寛解
ITT集団中の完全寛解を有する対象の数を評価した。完全寛解は。ここで、確認された血小板応答および増悪が存在しないこととして定義される。結果を、表８において表す。
Figure 2022160431000009
カプラシズマブ群は、プラセボ群よりも１．６倍多い完全寛解を有する対象を表す。完全寛解の割合がより高いことは、確認された血小板応答までの時間が早く、かつの分布が狭いことと関連し、このことは、CAP群においてPEに対する患者の応答の予測性がより高いことを支持し、PEの日数において反映される。PEの継続日数は、CAPについて（平均値±標準偏差）６．６±３．４日間であり、これに対してPLCについては８．１±６．５日間であり、漸減を含む投与された総血漿容積は、CAPについて２２．５±１５．９リットルであり、これに対してPLCについては２８．４±２１．３リットルであった。ベースラインADAMTS13活性データは、カプラシズマブ群については不完全であるとはいえ、効果は、低いベースラインのADAMTS13活性を有する対象のサブグループについて、より顕著に表れる（例７．５．８を参照）。
７．５．６ 研究結果：安全性評価
出血関連SAEおよび免疫関連SAEに注目して、有害事象（AE）および重篤有害事象（SAE）の発生を評価したSAE評価は、カテーテル挿入からの出血、敗血症、カテーテル血栓症、気胸、水分過負荷、低酸素、低血圧少、アナフィラキシー様反応およびTRALIを含んだ。重篤有害事象の数は、両方の処置群の間で類似であった：カプラシズマブ群における５７％と比較して、プラセボ群において５１％。有害事象の数もまた、処置群の間で類似であった：カプラシズマブ群における９７％と比較して、プラセボ群における１００％。出血関連AEを有する対象の数は、カプラシズマブ群（５４％）において、プラセボ群（３８％）と比較して、僅かに高かった。
現在用いられる非特異的抗血栓剤の最も顕著なリスクは、出血の素因または明らかな出血の上昇である。任意の予測されない効果の他に、出血はまた、カプラシズマブについての最も関連性の高い安全性の問題を代表する。このことに関して、カプラシズマブを、前臨床外科出血モデルにおいて検討した。この研究において、カプラシズマブを投与されている動物における外科失血は、Heparin（登録商標）で処置された動物における失血に匹敵し、Plavix（登録商標）およびReoPro（登録商標）で処置された動物におけるものよりも、それぞれ２倍および４倍低い。このことは、カプラシズマブがPlavix（登録商標）およびReoPro（登録商標）よりも、出血リスクに関して安全であり得ることの正の指標であるが、これは健康な人物において評価されたものである。上で示された通り、TTP患者は、vWFに関して多くの側面において健康な人物とは異なる。研究処置は、カプラシズマブで処置された４人の患者において、およびプラセボで処置された２人の患者において、有害事象に起因して中止した。しかし、出血傾向の増大は、良好に管理可能であった。
TTPは、潜在的に生命を脅かす。治験においては２人の死亡（５．４％）が、いずれもプラセボ群中に報告されている。プラセボ群における死亡数は、文献において記載されるもの（１０～３０％）よりも低いことに注意する。このことから、TTPの予後は、（本研究において）より有効な医療の標準に起因して改善されたことが推論され得る。
７．５．７ 研究結果：さらに最適化された処置プロトコル
さらなる最適化された処置プロトコルは、確認された血小板応答時間の分布は、CAP群において、プラセボ群と比較して、より短く、右（応答までの時間がより長い）に傾斜しておらず、偏向してもいないというアイディアに基づいて、本発明者らにより設計された。
さらに最適化された処置プロトコルにおいて、全ての対象は、本質的には、７．４、「研究デザイン」の前に適切に述べられたとおり処置されるが、以下の主要な改変を用いた：PE処置期間は、３～５日間、例えば３日間または４日間または５日間、好ましくは３日間にわたり設定する。PE処置期間は、血小板の回復（≧１５０，０００／μｌ）に非依存的である。毎日のｓ．ｃ．研究薬投与は、最後のPEの後、少なくとも１０日間、例えば２０日間または３０日間にわたり継続するが、好ましくは、血小板の回復が≧１５０，０００／μｌとなった後、少なくとも１０日間、例えば２０日間または３０日間にわたり継続する。さらに最適化された処置プロトコルを評価することにおいて、一次エンドポイントは、上で定義されるとおりの増悪の数であろう。
さらに最適化された処置プロトコルにおいて、患者の負担およびコストは低下した。
７．５．８ ADAMTS13活性
ADAMTS13活性を基礎疾患活性についてのマーカーとしてさらに評価すること、およびADAMTS13活性を処置利益を維持するために最適なカプラシズマブの処置期間をガイドするためのマーカーとして評価することを計画した。
この場合、ADAMTS13活性が＜１０％である場合に、基礎疾患活性を想定する。≧１０％のADAMTS13活性は、基礎疾患活性が存在しないと想定する。
増悪および再発は、利用可能な患者のADAMTS13活性データに関連付けられた。再発が、処置の間の継続的に低いADAMTS13（＜１０％）により先行される場合、それを、症候性のエピソードの再発とみなした。再発が、処置の間の≧１０％の≧１０％により先行される場合、それを、新たなTTPエピソードとみなした。分析から除外された患者は、（ｉ）ADAMTS13により媒介されない疾患（ベースラインにおいて≧１０％）（ｎ＝３）、および（ｉｉ）データが不十分な患者（ｎ＝１２）である。
（ｉ）増悪または再発を有しない患者：
－カプラシズマブ：１３／１６（８１％）は、処置の停止近くに≧１０％のADAMST13活性値を有した。
－プラセボ：１４／１６（８８％）は、処置の停止近くに≧１０％のADAMST13活性値を有した。
したがって、増悪または再発を有しない患者の大部分において、ADAMTS13活性は、１０％を超えるレベルまで回復し、このことは、症候性のTTPエピソードの解消を示唆する。
（ｉｉ）増悪を有する患者
－カプラシズマブ：２／３（６７％）は、その増悪の近くに＜１０％のADAMTS13活性を有した。
－プラセボ：７／８（８８％）は、その増悪の近くに＜１０％のADAMTS13活性を有した。
したがって、TTPの増悪を有する患者の大部分において、ADAMTS13活性は１０％未満であり、このことは、増悪をもたらす疾患の活性が未解消であることを示唆する。
（ｉｉｉ）症候性のTTPエピソードの再発を有する患者
－カプラシズマブ：７／７（１００％）は、処置の停止近くに＜１０％のADAMTS13活性値を有した；処置の停止後１０日以内に再発が起きた。
－プラセボ：Ｎ／Ａ－すべては「新たな」再発であった。
したがって、処置の終了のすぐ後に再発が起きているカプラシズマブ群中の全ての対象は、継続的に低いADAMTS13活性（＜１０％）を有し、このことは、進行中の疾患の指標である。
（ｉｖ）新たな再発エピソードを有する患者
－カプラシズマブ：４／４（１００％）は、処置の停止近くに≧１０％のADAMST13活性値を有した；処置の停止後≧３０日間以内に再発が起きた（範囲：３０～１６７日間）。４人の患者は全員、やはり、再発の時点において＜１０％のADAMTS13活性を有した。
－プラセボ：２／３（６７％）は、処置の停止近くに≧１０％のADAMST13活性値を有した；処置の停止後≧３０日間以内に再発が起きた（範囲：３０～１６７日間）。再発の時点の近くにおいて利用可能なデータは存在しなかった。
したがって、新たな再発エピソードを有する患者の大部分において、ADAMTS13活性は、処置の停止の近くにおいて１０％を超えるレベルまで回復し、このことは、症候性のTTPエピソードの解消を示唆している；値は、やはり再発の時点において低く（＜１０％）、このことは、新たなTTPエピソードを示している。
（ｖ）結論
データは、TTPの再発についての予測マーカーとしてのADAMTS13活性の使用および処置決定のためのその潜在能力を支持する。
ADAMTS13活性により、カプラシズマブ処置を停止したすぐ後に起きる再発を予測することができる。
これらの再発は、症候性のTTPエピソードの再発であるものと考えられる（持続的に低いADAMTS13活性に基づく、解消していない疾患の活性）。
カプラシズマブによる３０日間の処置期間（PE後）は、増悪の数に対して、著しい影響を示した。
再発のリスクがある（すなわち、ADAMTS13活性に基づく基礎疾患活性を有する）患者についてカプラシズマブ処置期間を延長することにより、基礎疾患が適切に処置されて解消するまで、カプラシズマブの保護効果が維持されるであろう。
逆に、カプラシズマブによる予防処置は、TTPの急性のエピソードのリスクを減少させるであろう。
７．５．９ 研究結果：臓器損傷マーカー
TTP患者における特徴的な微小血管閉塞は、脳、心臓を含む身体全体に、および（より低い程度まで）腎臓に、臓器虚血をもたらし得る。
急性心筋梗塞（AMI）は、AMIの臨床的診断（Patschan et al. 2006 Nephrology, dialysis, transplantation 21: p.1549-54）および剖検の知見（Hosler et al. Archives of pathology & laboratory medicine, 2003. 127(7): p.834-9）の両方に基づいて、TTPの初期の合併症として報告されている。高い血清乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）およびトロポニンＩ（TnI）の上昇に基づいて、臨床的にTTPを有することを疑われる患者は、AMIを発症するリスクが高いことが示された。上昇したトロポニンＴレベルは、死亡率および急性罹患率に関連付けられた。死亡した対象は、より高いトロポニンＴレベルを有したが、一方、正常なトロポニンＴレベルの群においては、死亡は存在しなかった。組織学により、死亡した対象において広汎性の心筋微小血管血栓症が確認された（Hughes et al. 2009 J.Thromb.Haemost. 7: p.529-536）。これらの結果は、例えばトロポニンにより測定される、症候性のTTPエピソードのさらなる微小血管性心虚血をより迅速に減少させることにより、臨床成績に対して利益を有する、例えば、脳、心臓および腎臓などの臓器損傷のリスクを減少させると期待することができることを示唆する。他の遡及的な報告は、心筋梗塞（Wahla et al. 2008 Eur. J. Haem. 81: p.311-6）、ならびに梗塞、不整脈、心原性ショックおよび心臓性突然死のような他の心臓イベント（Hawkins et al. 2008 Transfusion 48: p.382-92）を含む、TTP患者における急性および長期の心臓合併症に対して、同様の結果を見出した。
遡及的研究において、症状における高レベルのLDHは、より不良な長期予後（死亡）と関連付けられ、このことは、重篤な多臓器合併症を反映している（Benhamou, et al. 2012 Haematologica 97: p.1181-6）。したがって、溶血および虚血性臓器損傷についてのマーカーとしてのLDHの迅速な正常化はまた、長期の臨床成績のために有益であり得、臓器損傷についてのリスクを減少させる。
虚血性損傷は、急性合併症、ならびにより不良なより長期の予後をもたらし得るので、LDH、トロポニンＴまたはＩおよびクレアチニンの、特定のかつ臨床的に適切な臓器損傷バイオマーカーについて、分析を行った。心臓トロポニン（ＩまたはＴ）は、心筋損傷についての特異的マーカーであり、クレアチニンは、腎臓機能についてのバイオマーカーであり、およびLDHは、溶血のマーカー、および主にこの疾患における臓器損傷のマーカーですらあると考えた。
TTP患者において、これらのバイオマーカーのいくつかの高いベースラインレベルまたはより遅い正常化は、より不良な臨床成績（例えば死亡、難治性疾患）と関連付けられてきた。
データは、臓器損傷バイオマーカーにより測定される微小血管組織虚血をより迅速に削減することにより、臨床成績に対する利益、例えば臓器損傷のリスクの減少が期待されることを示唆する。しかし、臓器損傷マーカーの結果は、毎日の血漿交換の希薄化効果により（患者およびプラセボ群の両方において）いくらかの程度まで交絡することに注意すべきである。
（ｉ）乳酸デヒドロゲナーゼ
LDHは、非特異的組織虚血の重要なマーカーである。比率は、ITT集団中の対象の数に基づいて計算した。LDHについての値が≦２×ULNである ITT集団中の対象の数および割合を、研究の最初の５日間について計画された処置により要約した。結果の要約を、表９において提供する。研究日ごとの平均LDH／ULN比を、表１０において提供する。
第１日において、ALX 0081 処置群における１１人の対象（３０．６％）およびプラセボ群における９人の対象（２３．１％）が、LDH値≦２×ULNを有した。より高くを維持したALX 0081 処置群における対象の割合を、第２日において（それぞれ、２８人の対象［７７．８％］および２０人の対象［５１．３％］）ならびに第３日において（それぞれ、３３人の対象［９１．７％］および２９人の対象［７４．４％］）、プラセボ群と比較した。第４日および第５日において、LDHについての値≦２×ULNを有する対象の割合は、両方の群において類似した。
LDH／ULNの平均値の比は、第１日においてALX 0081とプラセボ処置群との間で比較可能であり（それぞれ３．９３および３．９８）、含められた全ての他の時点においてはプラセボ群においてより高かった。
表９：研究日ごとの≦２×正常値上限の乳酸デヒドロゲナーゼ値を有する対象の数および割合（処置企図集団）
Figure 2022160431000010
表１０：研究日ごとの平均の乳酸デヒドロゲナーゼ／正常値上限の比（処置企図集団）
Figure 2022160431000011
 計画された処置に従ったLDH値の正常化までの時間を比較するために、カプラン・メイヤー分析を行った。LDH正常化までの時間の曲線を、図２において提供する。
カプラン・メイヤー分析から、ALX 0081を投与されている対象について、プラセボを投与されている対象と比較して、LDHの正常レベルまでのより迅速な回復が示唆される。
（ｉｉ）トロポニン
計画された処置に従ったロポニンＴまたはトロポニンＩの値の正常化までの時間を比較するために、カプラン・メイヤー分析を行った。上記のとおり、TnTおよびTnIはいずれも、心臓の細胞損傷の適切なバイオマーカーである。トロポニンＴまたはＩの正常化までの時間の曲線を、図３において提供する。
カプラン・メイヤー分析から、ALX 0081を投与されている対象について、プラセボを投与されている対象と比較して、トロポニンＴまたはＩの正常レベルまでのより迅速な回復が示唆される。
（ｉｉｉ）クレアチニン
また、この場合において、計画された処置に従ったクレアチニン値の正常化までの時間を比較するために、カプラン・メイヤー分析を行った。クレアチニン正常化までの時間の曲線を、図４において提供する。
クレアチニンについて、ALX 0081を投与されている対象について、プラセボを投与されている対象と比較して、正常レベルまでのより迅速な回復が、カプラン・メイヤー分析により示唆される。
（ｉｖ）考察
ULvWFストリングが微小血栓の形成において血小板を消費する後天性TTPの病態生理学を考慮して、血小板カウントの回復は、さらなる微小血栓形成の予防の間接的な尺度であると判断した。後天性TTPに関連する罹患率および急性死亡率は、これらの微小血栓の結果である。
実際に、この判断は、臓器損傷マーカーにより支持される。特に、結果は、臓器損傷マーカートロポニンＩおよびＴ、LDHおよびクレアチニンが、ALX 0081を投与されている対象について、プラセボを投与されている対象と比較して、より迅速に正常レベルまで回復することを示す。
したがって、結果は、これらの臓器損傷マーカーのより迅速な正常化速度は、より良好な臨床成績、すなわち、微小血栓により引き起こされる臓器虚血に起因する臓器損傷のリスクが減少し、これらがより少なくなることに関連付けられることを示唆する。
７．５．１０ 用量選択の理論的根拠
カプラシズマブの薬理学は、２倍である。カプラシズマブは、vWFの官能基に影響を及ぼし、vWFが血小板に結合できなくする。カプラシズマブはまた、vWFの体内での処分に影響を及ぼし、処置の間の総vWF：Agレベルの一時的な低下をもたらす。
PK／PDモデルを用いて、シミュレーションを通して、仮想TTP患者集団における異なる用量シナリオについて、予測される暴露、ならびに総vWF、遊離vWFおよび複合体化vWFのレベルに対する、対応する効果を評価した。体重の切断分布（truncated distribution）（平均値８１．９ｋｇ±２２．６ＳＤ、範囲４７．５～１５０ｋｇ）、およびモデルにより概算されたTITAN治験のTTP集団におけるベースラインvWF、ならびに性別の分布（Ｍ：Ｆ＝４０：６０）をサンプリングすることにより、TITAN研究からの集団に基づいた特徴を有する、TTP患者の仮想集団（ｎ＝５００）を作成した。
シミュレートされたシナリオは、最初の８日間の毎日のPEの手順と、各PEの停止の１時間後の、併用のｓ．ｃ．での毎日のカプラシズマブの２．５、５、１０、２０ｍｇの用量での投与を含んだ（期間１）。その後、カプラシズマブは、同じ用量レベル／レジメンでさらなる３０日間にわたり、任意の他のPEの手順の不在下において投与されたものと仮定する（期間２）。
遊離vWFのベースラインからの％の変化は、用量に伴って増大するが、用量に比例するものより低い。主に研究開始時の標的の発現（vWF）の大きな可変性に関連する、大きな個体間可変性は、全ての用量レベルにおいて予測される。２つのより低い用量（１日１回、２．５および５ｍｇ）は、最適以下の標的阻害をもたらすが、一方、TITAN研究において試験されたもの（２０ｍｇ）より高い日用量のカプラシズマブは、シミュレートされたTTP集団全体に実質的に利益をもたらさない。図５は、モデルにより予測される、期間２の終了時における遊離vWF：Ａｇレベルのベースラインからの減少の％を、プラセボで処置された患者を含めて、用量レベルの関数として示す。
１０ｍｇの１日１回の用量についてシミュレートされた薬物の、遊離、複合体および総vWFレベルの血漿プロフィールを、図６において説明する。
標的中和についてのマーカーとしての遊離vWFのレベルの変化の次に、出血リスクについてのマーカーとしての総vWFのレベルの変化を評価した。Ｉ型フォン・ヴィレブランド病において観察される最も高いvWFレベルに関連付けられる０．４ＩＵ／ｍＬ（または１６ｎＭ）の閾値を用いた。これらのレベルのvWFにおいて、十分なFVIIIのレベルがまだ利用可能であり続けると考えられる。パネルＤは、提案された１０ｍｇの１日１回の用量についての総vWFレベルは、出血イベントのリスクについて考慮されたこの閾値よりも高くであり続けるであろうことを示す。
先のin vitro 研究の結果、ならびにモデルにより予測される効力（遊離vWF）および安全性（総vWF）についてのバイオマーカーのレベルに基づいて、本明細書において用いられる用量レジメン（５～４０ｍｇ、好ましくは１日１０ｍｇ）は、TTP患者における(UL)vWFの血小板結合能力の所望される抑制に到達するために適切であり、一方、出血イベントは、最小限であり、少なくとも制御可能であると考えられる。
７．６ 結論
研究開始時の標的の発現（vWF）には大きな可変性が存在する。しかしながら、用いられる用量は、最適な標的の阻害をもたらし、処置されるTTP集団全体に実質的に利益をもたらす。
したがって、ALX 0081は、TTPの処置への新規のアプローチを表し、効力、安全性、およびTTPを有する患者のクオリティ・オブ・ライフに関して顕著な利益を提供する。
カプラシズマブの概念の証明は、統計学的に有意であり、且つ臨床的に意義のある確認された血小板応答までの時間の短縮により、実証された。確認された血小板応答までの日数の中央値は、カプラシズマブについて３日間であり、これに対して、プラセボについては４．９日間であった。HR（カプラシズマブに対するプラセボ）＝２．２、９５％ＣＩ（１．２８、３．７８）、ｐ＝０．０１３。
増悪の数は、プラセボ群における１１からカプラシズマブ群における３に減少した。このことは、カプラシズマブ処置の保護効果を強調する。
プラセボ群における２人の死亡と比較して、カプラシズマブ群においては死亡は存在しなかった。
AEおよびSAEは、重篤な、潜在的に生命を脅かす状態と一致した。カプラシズマブ群における（６６イベント）出血イベントは、プラセボ群（３５イベント）のほぼ２倍の数であったが、カプラシズマブ群については２人の対象において５回のみのＳＡＥであり、プラセボ群については２人の対象において２回のＳＡＥであった。
全体的に、後天性TTPを有する患者のための利益リスク評価は、非常にポジティブである。
ALX 0081などの本発明のポリペプチドは、PEおよび輸血と組み合わせて用いられた場合に、ULvWFにより媒介される血小板凝集のその阻害、およびその結果として生じる抗血栓効果を通して、TTPの急性発作のより迅速な制御を可能にする。これは、臓器虚血のリスクを明らかに減少させる。血小板カウントのより迅速な正常化はまた、出血性合併症のリスクを減少させる。その使用はまた、疾患からの死亡率がなお高い続発性TTPを有する患者を含む低応答性の患者において、改善された予後をもたらす。
加えて、ALX 0081などの本発明のポリペプチドは、急性のエピソードからの回復の後の再発の予防において価値がある。
表Ａ－１：vWFに対するISVDおよびCDRを含むポリペプチドの例
Figure 2022160431000012
Figure 2022160431000013
Figure 2022160431000014
Figure 2022160431000015
Figure 2022160431000016
Figure 2022160431000017
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで：
ａ）CDR1はYNPMG（配列番号２１）であり；
ｂ）CDR2はAISRTGGSTYYPDSVEG（配列番号２２）であり；ならびに
ｃ）CDR3はAGVRAEDGRVRTLPSEYTF（配列番号２３）である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、vWFに対するISVDは、配列番号１９（12A02H1）により代表される。
本発明は、vWFに対する少なくとも２つのISVDを含むかこれらからなる、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供する。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここでvWFに対する各々のISVDが、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
ａ）CDR1はYNPMG（配列番号２１）であり；
ｂ）CDR2はAISRTGGSTYYPDSVEG（配列番号２２）であり；ならびに
ｃ）CDR3はAGVRAEDGRVRTLPSEYTF（配列番号２３）である。
本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号１～１９、好ましくは配列番号１９を含むかこれらから本質的になる。
さらにより好ましくは、vWFに対するISVDは、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
ａ）CDR1はYNPMG（配列番号２１）であり；
ｂ）CDR2はAISRTGGSTYYPDSVEG（配列番号２２）であり；ならびに
ｃ）CDR3はAGVRAEDGRVRTLPSEYTF（配列番号２３）である。
さらにより好ましくは、vWFに対するISVDは、配列番号１９（12A02H1）により代表される。

Claims (18)

  1. それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患のリスクを減少させること、および／またはその急性のエピソードを予防することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドであって、
    （ｉ）前記ヒトに、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇの用量を投与するステップ
    を含む、前記ポリペプチド。
  2. （ｉｉ）前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
    （ｉｉｉ）前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；および
    （ｉｖ）前記ADAMTS13活性が、前記参照ADAMTS13活性の３０％未満、例えば２０％、１５％、１０％または５％である場合、前記ステップ（ｉ）を繰り返すこと
    をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記TTPなどのvWF関連疾患の急性のエピソードのリスクが、少なくとも１．２倍低下する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 臓器損傷、虚血性損傷および／または微小血栓形成のリスクが、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２倍またはそれより高い、例えば３、４、５、６、７、８、９倍または１０倍もの、またはそれより高い、例えば２０、５０または１００倍もの倍率で低下する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  5. －血小板数を測定すること；および
    －前記血小板数が１５０，０００／μｌ未満である場合、前記ステップ（ｉ）を繰り返すこと
    をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドであって、前記ヒトに、５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの、前記ポリペプチドの第１の用量を投与することを含む、前記ポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドを投与した後に、５分間～８時間以内に、第１の血漿交換（PE）を行う、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドを投与する前に、好ましくは前記第１のPEの２４時間以内に、事前の血漿交換（PE）を行う、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 前記第１のPEの後に、前記第１のPEの３０分間以内に、１０ｍｇの前記ポリペプチドの第２の用量を投与する、請求項６～８に記載のポリペプチド。
  10. 前記のそれを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することが、
    （ｉ）PEを行うこと；および
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記PEの１５分間～４時間後に、１０ｍｇの前記ポリペプチドの用量を投与すること
    ここで、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）を、前記患者の血小板カウントが≧１５００００／μｌとなるまで、１日あたり１回繰り返す、
    をさらに含む、請求項６～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記患者の血小板カウントが初めて≧１５０．０００／μｌとなった後、前記ポリペプチドの１０ｍｇの用量を、１日あたり１回、少なくとも３０日間にわたり投与することをさらに含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. ADAMTS13活性が、参照ADAMTS13活性の少なくとも５％、例えば１０％または１５％にもなるまで、前記ポリペプチドを投与することを含む、請求項６～９のいずれか一項に記載のポリペプチド
  13. 請求項６に記載の、それを必要とするヒトにおいてvWF関連疾患を処置することにおける使用のための、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）に対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ISVD）を含むポリペプチドであって、少なくとも以下のステップ；
    （ｉ）血漿交換（PE）を行うこと；
    （ｉｉ）前記ヒトに、前記ポリペプチドの５～４０ｍｇ、好ましくは１０ｍｇの用量を投与すること；
    ここで、前記ステップ（ｉ）および前記ステップ（ｉｉ）を、１日あたり１回または２回繰り返す、
    を含む、前記ポリペプチド。
  14. 前記ステップ（ｉ）および前記ステップ（ｉｉ）を、１日あたり１回または２回、最長で７日間、例えば最長で６、５、４、３または２日間にわたり繰り返す、請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. （ｉｉｉ）前記患者のADAMTS13活性を測定すること；
    （ｉｖ）前記ADAMTS13活性を参照ADAMTS13活性と比較すること；および
    （ｖ）前記ADAMTS13活性が、前記参照ADAMTS13活性の３０％未満、例えば２０％、１５％、１０％または５％である場合、前記ステップ（ｉｉ）および任意にステップ（ｉ）を繰り返すこと
    をさらに含む、請求項１３または１４に記載のポリペプチド。
  16. 前記vWFに対するISVDが、４つのフレームワーク領域（それぞれFR1～FR4）および３つの相補性決定領域（それぞれCDR1～CDR3）から本質的になり、ここで：
    ａ）CDR1は、以下：
    －アミノ酸配列YNPMG；または
    －アミノ酸配列YNPMGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
    を含むか、これらから本質的になり、
    および
    ｂ）CDR2は、以下：
    －アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEG；または
    －アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
    －アミノ酸配列AISRTGGSTYYPDSVEGと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列；
    を含むか、これらから本質的になり、
    および
    ｃ）CDR3は、以下：
    －アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTF；または
    －アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
    －アミノ酸配列AGVRAEDGRVRTLPSEYTFと２または１のみのアミノ酸の差異を有するアミノ酸配列
    を含むか、これらから本質的になる、
    請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. 前記ポリペプチドが、配列番号１～１９を含むか、これらからなる、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む容器、および使用のための指示を含む、キットまたは製品。
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