JP2022136035A

JP2022136035A - 化合物、該化合物を用いた金属ナノ粒子複合体、及び標的分子の検出方法

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Publication number: JP2022136035A
Application number: JP2022033108A
Authority: JP
Inventors: 香里櫻井; Kaori Sakurai
Original assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2022-09-15

Abstract

【課題】本開示はアフィニティーラベル機能を示す金属ナノ粒子複合体、該複合体を構成する金属ナノ粒子修飾能に優れる新規化合物、金属ナノ粒子複合体を用いた標的分子の検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】例えば、下記式で表される化合物である。実施形態の金属ナノ粒子複合体は、金属ナノ粒子と、前記化合物と、リガンドを有する化合物との複合体であり、前記化合物と、前記リガンドを有する化合物とが前記金属ナノ粒子に結合している。TIFF2022136035000038.tif2599【選択図】なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り１．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ－ｉｍｇ／ｃｓｊ１０１ｓｔ／Ｐ０１－３ｐｍ－１９／ｐｕｂｌｉｃ／ｐｄｆ？ｔｙｐｅ＝ｉｎ掲載日：令和３年３月４日２．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｃｓｊ１０１ｓｔ／ｓｕｂｊｅｃｔ／Ｐ０１－３ｐｍ－１９／ａｄｖａｎｃｅｄ掲載日：令和３年３月２１日３．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ－ｆｉｌｅｓ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｖｉｅｗ／ｂｉｏｓｙｍｐｏ２０２１／ａｂｓｔｒａｃｔ．ｐｄｆ掲載日：令和３年９月１日４．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｂｉｏｓｙｍｐｏ２０２１／ｓｕｂｊｅｃｔ／１Ｐ４８－７０－１９／ａｄｖａｎｃｅｄ掲載日：令和３年９月８日５．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓ０２ｗｅｂ．ｚｏｏｍ．ｕｓ／ｊ／８８５８８０２１８６６？ｐｗｄ＝ｄ２１ＦＳＥｈＧＹｍｇ２ＴＣｔ２Ｍｎｈ３Ｎｚｋ３ｃ０ＱｒＵＴ０９掲載日：令和３年１０月８日６．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０２１０４３４７ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０２１０４３４７掲載日：令和３年６月１日７．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ａｎｇｅ．２０２１０４３４７ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｇｅ．２０２１０４３４７掲載日：令和３年６月１日８．掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｅｕｒｏｐｅ．ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０２１００３８８ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０２１００３８８掲載日：令和３年９月６日

本開示は、化合物、該化合物を用いた金属ナノ粒子複合体、及び標的分子の検出方法に関する。

リポ酸にポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとも記す）を結合した、ＰＥＧリポ酸誘導化合物は、高い水溶性や優れた金属表面修飾能を有し、金属ナノ粒子安定化作用を有することが知られている。このため、ＰＥＧリポ酸誘導化合物は、金属ナノ粒子の修飾剤、被覆材として用いられている（例えば、非特許文献１及び特許文献１参照）。

ＰＥＧリポ酸誘導化合物は、適当な金属ナノ粒子合成反応またはリガンド交換反応により、金属ナノ粒子表面に共有結合を介して結合させることが可能であり、その製造条件に応じて、ＰＥＧリポ酸誘導化合物が単層膜上に高密度で修飾した金属ナノ粒子修飾体を得ることが可能である（例えば、非特許文献２～４参照）。

近年、ＰＥＧリポ酸誘導化合物のＰＥＧ末端部位にさらに適当な官能基（例えばタンパク質反応基）を導入することで、タンパク質で修飾された金属ナノ粒子修飾体を得る方法が開発されている（例えば、非特許文献５参照）。特定のタンパク質を修飾したナノ粒子は、検出試薬、診断薬、医薬品候補等としての応用が期待されている（例えば、非特許文献６参照）。

金属ナノ粒子上に導入されるタンパク質反応基の主な例としては、アミノ基、カルボキシル基、アルキン基、アジド基が挙げられる(例えば、非特許文献７～９、特許文献２参照)。これらのタンパク質反応基はいずれも、タンパク質との反応を起こすための活性化剤などの反応試薬の添加を必要とする。また、アミノ基、カルボキシル基は一般的に基質選択性や位置選択性を示さない。

米国特許第９，４４６，１５２号明細書（Ｂ２）米国特許第８，３７８，０７５号明細書（Ｂ２）

Karakoti et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 1980-1994 Susumu et al. Nat. Prot. 2009, 4, 412-423 Sakurai et al. Chem. Sci., 2016,7, 702-706 Sakurai et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 2018 Karakoti et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 1980-1994. Saha et al. Chem. Rev. 2012, 112, 5, 2739-2779. Brennan et al. Bioconj. Chem. 2006, 17,1373; Zhang, et al. Langmuir 2010, 26, 10171 Narita et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2019, 29, 126768 G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques 2nd Ed. Academic Press. 2008.

従来の技術では金属ナノ粒子複合体を用いて、特定のアミノ酸残基を修飾部位として選択することや、タンパク質の混合溶液中で特定のタンパク質を選択的に修飾することはできていなかった。すなわち、特定のタンパク質との共有結合形成による架橋反応を起こすことが可能な、アフィニティーラベル機能を持つ、金属ナノ粒子複合体は知られていなかった。

本開示はアフィニティーラベル機能を示す金属ナノ粒子複合体、該複合体を構成する金属ナノ粒子修飾能に優れる新規化合物、金属ナノ粒子複合体を用いた標的分子の検出方法を提供することを目的とする。

本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、特定の化合物と、リガンドを有する化合物とが金属ナノ粒子に結合した金属ナノ粒子複合体は、アフィニティーラベル機能を示すことを見出した。

本実施形態の態様例は、以下の通りに記載される。

（１）下記一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物。

（一般式（１）において、Ｘ^１はＯ又はＮＨであり、Ｙ^１はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^１は下記式（６）～（１４）及び（２０）～（５１）から選ばれる基である）

（一般式（２）において、Ｘ^２はＯ又はＮＨであり、Ｙ^２はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^２は下記式（８）～（１９）及び（２１）～（５１）から選ばれる基である）

（一般式（３）において、ｎは１、２、４、５及び７～１２から選ばれる整数であり、Ｘ^３はＯ又はＮＨであり、Ｙ^３はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^３は求電子基である）

（式（４）及び（５）において、ａは、Ｒ^１、Ｒ^２又はＲ^３との結合部位を示し、ｂは、ＣＨ_２との結合部位を示す。式（５）において、ｘは１～１０の整数である）

（式（１０）においてｍは１～１７の整数であり、式（１１）、（３４）、（３９）及び（４０）においてｑは０～１４の整数であり、式（２９）及び（３０）においてｒは１～９の整数である）

（２）前記Ｒ^３が式（６）～（５１）から選ばれる基である、（１）に記載の化合物。（３）前記ｎが８～１２である、（１）又は（２）に記載の化合物。
（４）金属ナノ粒子と、（１）～（３）のいずれかに記載の化合物と、リガンドを有する化合物との複合体であり、
前記（１）～（３）のいずれかに記載の化合物と、前記リガンドを有する化合物とが前記金属ナノ粒子に結合している、金属ナノ粒子複合体。
（５）（４）に記載の金属ナノ粒子複合体と試料とを接触させることにより、試料中の標的分子と、金属ナノ粒子複合体との、架橋複合体を形成する工程を有する、標的分子の検出方法。
（６）（５）に記載の標的分子の検出方法を、ハイスループットスクリーニング方法の一部として行う、ハイスループットスクリーニング方法。

本開示の方法によれば、アフィニティーラベル機能を示す金属ナノ粒子複合体、該複合体を構成する金属ナノ粒子修飾能に優れる新規化合物、金属ナノ粒子複合体を用いた標的分子の検出方法を提供することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

＜化合物＞
本実施形態に係る化合物は、下記一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物である。本実施形態に係る化合物は、後述の金属ナノ粒子複合体を構成する化合物であり、これらの化合物を用いることにより、後述の金属ナノ粒子複合体は、アフィニティーラベル機能を示すことができる。一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物は、ジスルフィドを有する５員環構造を有しており、ジスルフィドが開裂することにより、金属ナノ粒子と結合することができる。

（一般式（１）において、Ｘ^１はＯ又はＮＨであり、Ｙ^１はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^１は下記式（６）～（１４）及び（２０）～（５１）から選ばれる基である）
なお、一般式（１）においては、Ｒ^１は下記式（６）～（１４）及び（２０）～（４７）から選ばれる基であることが、好ましい態様の一つである。

（一般式（２）において、Ｘ^２はＯ又はＮＨであり、Ｙ^２はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^２は下記式（８）～（１９）及び（２１）～（５１）から選ばれる基である）
なお、一般式（２）においては、Ｒ^２は下記式（８）～（１９）及び（２１）～（４７）から選ばれる基であることが、好ましい態様の一つである。

一般式（３）において、前記Ｒ^３は求電子基であり、具体的には式（６）～（５１）から選ばれる基であることが好ましい態様の一つであり、式（６）～（４７）から選ばれる基であることが別の好ましい態様の一つである。これらの基は合成容易の観点、アフィニティーラベル機能を好適に示す観点から好ましい。

一般式（１）のＲ^１、一般式（２）のＲ^２、及び一般式（３）のＲ^３は、それぞれ求電子基であり、求電子基を有することにより、金属ナノ粒子複合体がアフィニティーラベル機能を示すことができる。Ｒ^２及びＲ^３としては、（８）、（９）、（１５）、（１９）、（２５）、（５０）及び（５１）から選ばれる基であることが好ましい態様の一つである。また、Ｒ^１としては、（８）、（９）、（２５）、（５０）及び（５１）から選ばれる基であることが好ましい態様の一つである。

一般式（３）において、前記ｎは１、２、４、５及び７～１２から選ばれる整数であり、８～１２であることが好ましい。一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物の中でも、ｎが８～１２である一般式（３）で表される化合物は、分散性、水溶性が高い傾向にあり、結果的に金属ナノ粒子複合体の分散性を向上させることが可能であるため好ましい。

一般式（１）のＸ^１、一般式（２）のＸ^２、及び一般式（３）のＸ^３は、Ｏ又はＮＨである。合成方法によっても異なるが、ＮＨであることが合成容易の観点から好ましい。

一般式（１）のＹ^１、一般式（２）のＹ^２、及び一般式（３）のＹ^３は、Ｏ、ＮＨ、式（４）で表される基、又は式（５）で表される基である。合成方法によっても異なるが、ＮＨ、式（４）で表される基、又は式（５）で表される基であることが合成容易の観点から好ましい。

式（４）及び（５）において、ａは、Ｒ^１、Ｒ^２又はＲ^３との結合部位を示し、ｂは、ＣＨ_２との結合部位を示す。式（５）において、ｘは１～１０の整数である。該範囲は分散性、水溶性及び回転自由度が高いため好ましい。

式（１０）においてｍは１～１７の整数であり、１～８であることが好ましい。式（１１）、（３４）、（３９）及び（４０）においてｑは０～１４の整数であり、１～９であることが好ましい。式（２９）及び（３０）においてｒは１～９の整数である。これらの範囲は分散性、水溶性及び回転自由度が高いため好ましい。

一般式（１）の－Ｙ^１－Ｒ^１、一般式（２）の－Ｙ^２－Ｒ^２、及び一般式（３）の－Ｙ^３－Ｒ^３の構造（組み合わせ）としては、例えば以下に示す群（（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ａ－３）或いは、（Ａ－１）及び（Ａ－２））から選ばれる構造が挙げられる。以下に示す構造は、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３が、式（４）で表される基又は式（５）で表される基である。一般式（１）の－Ｙ^１－Ｒ^１としては、Ｒ^１が式（６）～（１４）及び（２０）～（５１）から選ばれる基でない構造は除かれ、一般式（２）の－Ｙ^２－Ｒ^２としては、Ｒ^２が式（８）～（１９）及び（２１）～（５１）から選ばれる基でない構造は除かれる。

（Ａ－２）における、ｘは式（５）におけるｘと同義であり、ｑは式（１１）、（３４）、（３９）及び（４０）におけるｑと同義である。

前述の群（（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ａ－３））で表される構造は、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３が、式（４）で表される基又は式（５）で表される基であるが、群（（Ａ－１）、（Ａ－２）及び（Ａ－３））において、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３をＮＨに置き換えた構造も、一般式（１）の－Ｙ^１－Ｒ^１、一般式（２）の－Ｙ^２－Ｒ^２、及び一般式（３）の－Ｙ^３－Ｒ^３の構造（組み合わせ）の好ましい態様である。

一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物の合成方法としては特に制限はなく、公知の有機合成方法等に基づき合成することができる。例えば、α－リポ酸のカルボキシ基とポリエチレングリコールのヒドロキシ基とを反応させ、ＰＥＧが結合されたリポ酸を得て、ＰＥＧが有するヒドロキシ基と、所望の求電子基を有する化合物とを反応させる方法により、一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物を合成することができる。別の例としては、α－リポ酸のカルボキシ基と、少なくとも片方の末端がアミノ基となるように変性されたポリエチレングリコールのアミノ基とを反応させ、ＰＥＧが結合されたリポ酸を得て、ＰＥＧが有するアミノ基又はヒドロキシ基と、所望の求電子基を有する化合物とを反応させる方法により、一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物を合成することができる。なお、後述の実施例において、一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物の詳細な合成方法の具体例を示す。

＜金属ナノ粒子複合体＞
本実施形態に係る金属ナノ粒子複合体は、前述の化合物（前述の＜化合物＞の項で記載した化合物）と、リガンドを有する化合物との複合体であり、前述の化合物と、前記リガンドを有する化合物とが前記金属ナノ粒子に結合している、金属ナノ粒子複合体である。本実施形態に係る金属ナノ粒子複合体は、アフィニティーラベル機能を有するため、標的分子の検出方法への使用が可能である。金属ナノ粒子複合体が、アフィニティーラベル機能を有する理由は、リガンドが標的分子に結合、例えば通常は共有結合によらない水素結合等の結合を形成し、更に前述の化合物のＲ^１、Ｒ^２、又はＲ^３が、標的分子と共有結合を形成し、標的分子と、金属ナノ粒子複合体との架橋複合体を形成することが可能であるためと推測される。

金属ナノ粒子複合体において、金属ナノ粒子に結合する前述の化合物の量としては、特に制限はないが、金属ナノ粒子の面積を金属ナノ粒子に結合する前述の化合物の分子数で除した値が、例えば０．２４ｎｍ^２／分子以上であることが好ましい。

金属ナノ粒子複合体において、金属ナノ粒子に結合するリガンドを有する化合物の量としては、特に制限はないが、金属ナノ粒子の面積を金属ナノ粒子に結合するリガンドを有する化合物の分子数で除した値が、例えば０．２４ｎｍ^２／分子以上であることが好ましい。

（金属ナノ粒子）
金属ナノ粒子としては、例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、銅ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、及びこれら金属の合金ナノ粒子並びに量子ドットが挙げられる。金属ナノ粒子としてはコロイド状態の物を使用してもよい。金属ナノ粒子としては、比重の高い粒子、例えば金ナノ粒子を用いることが好ましい。比重が高い粒子を用いることにより、架橋複合体を、遠心分離等の容易な操作で回収することができるため好ましい。

金属ナノ粒子のメジアン径（Ｄ５０）は、例えば、５ｎｍ以上５０ｎｍ以下であり、１０ｎｍ以上３０ｎｍ以下であることが好ましい。金属ナノ粒子のメジアン径（Ｄ５０）は、動的光散乱法（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によって測定した積算分布曲線の５０％積算値を示す粒子径である。

量子ドットとしては、特に制限はなく、例えば、II－VI族化合物、III－V族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II－VI族量子ドット」、「III－V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）を用いることができる。

量子ドットの具体例としては、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＰｂＳ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記具体例で記載した量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、シェルを有する量子ドットの表記法としては、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。シェルを有する量子ドットとしては、例えば、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ_２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ_２、Ｇｅ／ＺｎＳ等を用いることができるが、これらに限定されない。

金属ナノ粒子としては、必要に応じて、有機化合物等により表面処理が施されているものを用いてもよい。

（リガンドを有する化合物）
リガンドを有する化合物としては、リガンドを有しており、且つ金属ナノ粒子に結合可能な化合物であればよく、特に制限はない。

リガンドとしては、試料中の標的分子（特定の生理活性物質）と特異的に複合化することができればよく、特に制限はない。なお、本実施形態において、生理活性物質とは、生理機能をもつ分子（例えば生体分子）全般を指し示す用語である。

標的分子としては、例えば、標的タンパク質が挙げられる。リガンドとしては標的分子と特異的に複合化する構造であればよい。リガンドとしては、例えば、低分子量の生理活性物質を用いることができる。標的分子とリガンドとの組み合わせとしては、例えば、以下の表１を示すことができる。

また、標的分子とリガンドとの組み合わせとしては、リガンドとして特定のリガンドを採用し、該リガンドと特異的に複合化する物質を、標的分子として規定することもできる。

リガンドを有する化合物としては、金属ナノ粒子に結合するための官能基を有することが好ましい。官能基としては、チオール（例えばアルカンチオール）、ジスルフィドを有することが好ましい。

（金属ナノ粒子複合体の製造方法）
金属ナノ粒子複合体の製造方法としては特に制限はなく、金属ナノ粒子に前述の化合物（前述の＜化合物＞の項で記載した化合物）と、リガンドを有する化合物とを結合すればよい。

金属ナノ粒子に結合させる化合物の順番としては特に制限はなく、前述の化合物を結合した後に、リガンドを有する化合物を結合してもよく、リガンドを有する化合物を結合した後に、前述の化合物を結合してもよく、前述の化合物と、リガンドを有する化合物とを同時に結合してもよい。

一般にチオールやジスルフィドは、金属ナノ粒子、特に金ナノ粒子に対して容易に結合することが知られているため、前述の化合物は容易に金属ナノ粒子に結合可能であり、リガンドを有する化合物がチオールやジスルフィドを有する場合には、リガンドを有する化合物も容易に金属ナノ粒子に結合可能である。

金属ナノ粒子が前述の化合物、リガンドを有する化合物と結合を形成しづらい場合には、予め金属ナノ粒子の表面処理を行い、結合を形成しやすくすることも好ましい態様の一つである。

金属ナノ粒子複合体の製造方法の例としては、前述の化合物と、リガンドを有する化合物とをあらかじめ混合し、得られた混合物を、金属ナノ粒子を含む溶液（分散液）に添加することにより、金属ナノ粒子複合体を得る方法、前述の化合物を、金属ナノ粒子を含む溶液（分散液）に添加し、次いでリガンドを有する化合物を添加することにより金属ナノ粒子複合体を得る方法、及び、リガンドを有する化合物を、金属ナノ粒子を含む溶液（分散液）に添加し、次いで前述の化合物を添加することにより金属ナノ粒子複合体を得る方法が挙げられる。金属ナノ粒子複合体の製造方法の具体例としては、実施例に記載の方法が挙げられる。

＜標的分子の検出方法＞
本実施形態に係る標的分子の検出方法は、前述の金属ナノ粒子複合体と試料とを接触させることにより、試料中の標的分子と、金属ナノ粒子複合体との、架橋複合体を形成する工程を有する、標的分子の検出方法である。なお、金属ナノ粒子複合体と試料とを接触させることにより、試料中の標的分子と、金属ナノ粒子複合体との、架橋複合体を形成する工程を、架橋複合体形成工程とも記す。

試料としては特に制限はないが、通常は標的分子を含む試料、標的分子を含むことが期待される試料、標的分子を含むか含まないかを判断することが望まれる試料である。標的分子は、通常は特定の生理活性物質であり、例えば標的タンパク質である。架橋複合体形成工程を行う際には、試料としては、液体（溶液、分散液、懸濁液等を含む）であることが好ましい。試料としては、ヒト由来の試料であってもよく、ヒト以外の生物由来の試料であってもよい。ヒト以外の生物としては、哺乳類（ヒトを除く）、哺乳類以外の生物、例えば鳥類、魚類、昆虫、植物、藻類、菌類が挙げられる。哺乳類（ヒトを除く）としては、例えばマウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシが挙げられる。また、試料としては生物以外に由来する試料であってもよい。例えば、標的分子が合成タンパク質である場合には、人工的に合成された合成タンパク質を含む試料であってもよい。また、試料としては、複数の物が混合された混合試料であってもよい。

試料としては、初めから液体の試料、例えば、血液、尿、汗、涙等の体液であってもよく、体液以外、例えば細胞（例えば動物細胞、細菌類細胞、植物細胞）に由来する試料であってもよい。

試料は架橋複合体形成工程を容易に行うための前処理が行われた試料であってもよい。例えば試料が細胞である場合には、予め前処理により、細胞抽出液を調製し、該細胞抽出液を試料として用いてもよい。

架橋複合体形成工程は、通常は、試料に金属ナノ粒子複合体、あるいは金属ナノ粒子複合体の分散液を添加することにより行われる。添加される金属ナノ粒子複合体の量としては、特に制限はないが、試料中に含まれると予想される標的物質量よりも、過剰量の金属ナノ粒子複合体を添加することにより、好適に架橋複合体を形成することができる。

架橋複合体形成工程は通常４～３７℃で行われる。また、前記工程は通常は大気下で行われるが、窒素等の不活性ガス雰囲気下で行ってもよい。さらに前記工程は通常は常圧下で行われるが、減圧下で行ってもよく、加圧下で行ってもよい。また、前記工程は、通常は添加後１～２４時間行われる。

架橋複合体形成工程を行った後に、任意の工程を行うことにより標的分子の検出を容易に行うことができる。任意の工程としては、例えば、架橋複合体形成工程が行われた試料から架橋複合体を分離する工程、架橋複合体から金属ナノ粒子を除去する工程、標的分子を検出する工程が挙げられる。なお、各工程の間等で適宜洗浄を行ってもよい。

洗浄は、例えば洗浄バッファを用いて行うことができる。洗浄バッファとしては例えば、界面活性剤や、ＰＥＧを含む、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidの緩衝液）が挙げられる。

架橋複合体形成工程が行われた試料から架橋複合体を分離する工程としては、例えば、遠心分離を行い、金属ナノ粒子の比重が高いために沈殿した架橋複合体と、その上澄みとを分離する工程が挙げられる。

架橋複合体から金属ナノ粒子を除去する工程としては、例えば還元剤を含むバッファ（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、ＨＥＰＥＳ緩衝液）を用いて、金属ナノ粒子とリポ酸に由来する構造との、結合部位（Ｍ－Ｓ）を切断する工程が挙げられる。還元剤としては、例えば、ジチオトレイトール、β-メルカプトエタノールが挙げられる。この工程では、還元剤を、架橋複合体に添加した後、温度を例えば２５～１００℃とすることにより、結合部位が切断される効率を向上させることができる。

標的分子を検出する工程は、例えば回収された標的分子をマススペクトルにより解析したり、ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）により解析したりすることにより、標的分子の存在や量を確認する工程が挙げられる。

＜ハイスループットスクリーニング方法＞
本実施形態に係るハイスループットスクリーニング方法は、前述の標的分子の検出方法を、ハイスループットスクリーニング方法の一部として行う、ハイスループットスクリーニング方法である。

前述の標的分子の検出方法は、試料中の標的分子と、金属ナノ粒子複合体との、架橋複合体を形成する工程を有するが、該工程における最適な条件を迅速に決定するために、ハイスループットスクリーニング方法の一部として、前述の標的分子の検出方法を行うことが好ましい。ハイスループットスクリーニング方法では、架橋複合体の形成速度及び形成量の少なくとも一方を評価することが好ましい。

ハイスループットスクリーニング方法においては、例えば試料をマルチウェルプレート（例えば、９６穴マルチウェルプレート、３８６穴マルチウェルプレート）に固定化し、各ウェルに金属ナノ粒子複合体の分散液を添加する方法が上げられる。この際に、ウェルに固定化する試料の種類や量、添加する金属ナノ粒子複合体の分散液における金属ナノ粒子複合体の種類や量（分散液中の濃度）或いは分散液の量、温度、反応時間等を適宜変化させることにより、標的分子を効果的に検出する条件、好ましくは最適な検出条件を決定することができる。なお、ハイスループットスクリーニング方法においては、温度は、５０℃以下、例えば前述の４～３７℃で行うことができる。

ハイスループットスクリーニング方法では、架橋複合体形成工程を行った後、適宜洗浄等を行った後に、架橋複合体（例えば架橋複合体を構成する金属ナノ粒子複合体）に特異的に結合するタグを有する化合物で、標識することにより、容易に架橋複合体の形成を確認することができる。タグとしては、例えば蛍光発光性の基、化学発光酵素、色素等が挙げられ、タグを有する化合物は、さらに架橋複合体（例えば架橋複合体を構成する金属ナノ粒子複合体）と特異的に結合する部分を有していればよい。架橋複合体（例えば架橋複合体を構成する金属ナノ粒子複合体）と特異的に結合する部分としては、抗体、アビジン、レクチン等が挙げられる。一例としては、金属ナノ粒子複合体にビオチンを予め修飾しておくことにより、タグを有する化合物としてＨＲＰ（ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ）－アビジンを使用することができる。タグを有する化合物は、金属ナノ粒子複合体を構成する、リガンドの種類等に応じて適宜選択することができる。タグの種類に応じた蛍光解析、比色解析等の分析を行うことにより、架橋複合体の存在の有無或いは存在量を評価することができる。

以下、実施例を挙げて本実施形態を説明するが、本開示はこれらの例によって限定されるものではない。

［合成例１］
アジド－ＰＥＧ（３）リポ酸アミド（下記式（Ｉ））を以下の方法で合成した。

α－リポ酸（１３４ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）（１．５ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）（１０３μｌ、０．５９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート）（２４７ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール）（４０．８ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この混合物に、乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（１０３μｌ、０．５９ｍｍｏｌ）に溶解した１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（１２８ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を添加した。

反応混合物を室温で１９時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で希釈し、１ＭＨＣｌ水溶液、ＭｉｌｌｉＱ水、５％ＮａＨＣＯ_３水溶液および食塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ＝１００／０／０～９７／３／０．１）により精製して、アジド－ＰＥＧ（３）リポ酸アミド（式（Ｉ））（２０９ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、７８％）を黄色液体として得た。

^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＨＣｌ_３）：δ６．０９（ｓ，１Ｈ），３．６８－３．６２（ｍ，１０Ｈ），３．５４（ｔ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，２Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．２１－３．０６（ｍ，２Ｈ），２．５０－２．３９（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９３－１．８４（ｍ，１Ｈ），１．７２－１．６１（ｍ，５Ｈ），１．５３－１．３９（ｍ，２Ｈ）、^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１７２．９，７０．５，７０．４（×２），７０．０，６９．９（×２），５６．５，５０．５，４０．１，３９．０，３８．４，３６．２，３４．５，２８．８，２５．３．；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_１６Ｈ_３０Ｎ_４ＮａＯ_４Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：４２９．１６０６実測値４２９．１５８９．

［合成例２］
アミノ－ＰＥＧ（３）リポ酸アミド（下記式（ＩＩ））を以下の方法で合成した。

テトラヒドロフラン（６．６ｍＬ）に溶解したアジド－ＰＥＧ（３）リポ酸アミド（２０９ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）に、トリフェニルホスフィン（２６２ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。Ｈ_２Ｏ（０．１３ｍＬ）を添加し、反応混合物を１７時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮して、アミノ－ＰＥＧ（３）リポ酸アミド（式（ＩＩ））を得た。

ＬＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ），Ｃ_１６Ｈ_３２Ｎ_２ＮａＯ_４Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：計算値４０３．１７０１；実測値４０３．１５５６．

［合成例３］
３－フルオロスルホニル安息香酸ＮＨＳエステル（下記式（ＩＩＩ））を以下の方法で合成した。

３－フルオロスルホニル安息香酸（１０．０ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（６．２０ｍｇ，０．０５４ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０μＬ）に溶解し、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（１１ｍｇ，０．０５９ｍｍｏｌ）を０℃で加え、反応混合物を室温で１時間攪拌した。溶液をＥｔＯＡｃで希釈後、Ｈ_２Ｏ、１０％ＮＨ_４Ｃｌ水溶液、食塩水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ濾過し、減圧下で濃縮して３－フルオロスフホニル安息香酸ＮＨＳエステルの粗生成物（式（ＩＩＩ））を得た。

［実施例１］
化合物１（下記式（ＩＶ））を以下の方法で合成した。

アミノ－ＰＥＧ（３）リポ酸アミド（１１．２ｍｇ, ０．０２９ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ溶液（１５０μＬ）に、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（８μＬ，０．０２９ｍｍｏｌ）および３－フルオロスルホニル安息香酸ＮＨＳエステル（１０．５ｍｇ）を室温で添加した。

溶液を室温で３時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ＝１００／０ｔｏ９５／５）により精製して、化合物１（１１．０ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ，収率６６％）を白色固体として得た。

^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ８．４８（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｓ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），３．７０－３．６２（ｍ，１２Ｈ），３．５５－３．５１（ｍ，２Ｈ），３．４１－３．３７（ｍ，２Ｈ），３．２０－３．０７（ｍ，２Ｈ），２．４９－２．４１（ｓ，１Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９３－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．７０－１．５８（ｍ，５Ｈ），１．５０－１．４１（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ １７３．０，１６４．８，１３６．５，１３４．８，１３３．３，１３０．９，１３０．２，１２７．０，７０．７，７０．６，７０．４，７０．３，７０．２，６９．８，５６．５，４０．３，４０．３，３８．６，３８．５，３６．５，３４．７，２９．０，２５．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_２３Ｈ_３５ＦＮ_２ＮａＯ_７Ｓ_３（Ｍ＋Ｎａ）^＋：５８９．１４８８，実測値５８９．１５１０．

［実施例２］
化合物２（下記式Ｖ）を以下の方法で合成した。

アミノ－ＰＥＧ（３）リポ酸アミド（１９.０ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ），１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ）（９．３ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）と４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．４ｍｇ，３．４μｍｏｌ）を乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（２４３μｌ）に溶かし、フマル酸モノメチルエステル（７．６ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間攪拌した。溶液をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、食塩水で洗浄後、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製（ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ＝１００／０ｔｏ９５／５）し、化合物２（４．９ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ，収率２０％）を得た．

^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．０２－６．８１（ｍ，３Ｈ），６．４（ｓ，１Ｈ），３．９６－３．４５（ｍ，２０Ｈ），３．１５－３．１１（ｍ，２Ｈ），２．４６（ｍ，１Ｈ），２．２２－２．２０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．９４－１．９１（ｍ，４Ｈ），１．６７（ｍ，４Ｈ），１．４６（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ １７３．０，１６５．５，１６３．８，１３０．０，７０．５（×２），７０．１（×２），６９．７（×２），５６．５，５２．２，４０．４，４０．３，３９．２，３８．６，３４．７，２９．０，２５．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_２１Ｈ_３６Ｎ_２Ｏ_７Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：５１５．６３９５；実測値５１５．６３４０．

［実施例３］
上述の合成例、実施例と、原料を変更した以外は同様に行い、以下の化合物を合成した。実施例１、２で製造した化合物と共に、合成した化合物を下記表２に示す。

実施例３で合成した化合物３～１２の同定データを以下に示す。
化合物３： ^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．０１（ｓ，１Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），４．０６－４．０２（ｍ，２Ｈ），３．３６－３．４４（ｍ，１７Ｈ），３．２０－３．０７（ｍ，２Ｈ），２．５１－２．４１（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．９８－１．８７（ｍ，１Ｈ），１．７０－１．６６（ｍ，４Ｈ），１．５０－１．４５（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ １７３．０，１６６．６，７０．６（×２），７０．１（×２），６９．５（×２），５６．５，４２．８，４０．３，３９．７，３９．２，３８．６，３６．５，３４．８，２９．０，２５．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_１８Ｈ_３３ＣｌＮ_２Ｏ_５Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：４７９．１５２０；実測値４７９．１５５８．

化合物４：^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．０５（ｓ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），３．８８（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，２Ｈ），３．７２－３．５６（ｍ，１２Ｈ），３．５６－３．４２（ｍ，２Ｈ），３．４０－３．３８（ｍ，２Ｈ），３．２６－３．０７（ｍ，２Ｈ），２．５１－２．４３（ｍ，１Ｈ），２．２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．８９（ｍ，１Ｈ），１．７１－１．６０（ｍ，５Ｈ），１．４９－１．４１（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ １７２．９，１６６．１，７０．６，７０．５，７０．３，７０．１，６９．９，６９．５，５６．６，４２．７，４０．３，３９．６，３９．２，３８．６，３６．５，３４．７，２９．０，２５．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_１８Ｈ_３３ＢｒＮ_２ＮａＯ_５Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：５２３．０９１２；実測値５２３．０９０５．

化合物５：^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ６．２７（ｓ，１Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），４．４１－４．３７（ｍ，１Ｈ），３．９０－３．８５（ｍ，１Ｈ），３．６０－３．５１（１２Ｈ），３．４３－３．３９（ｍ，４Ｈ），３．１９－３．０４（ｍ，３Ｈ），２．８２－２．８０（ｔ，Ｊ＝４．４，１Ｈ），２．６３－２．６１（ｄｄ，Ｊ＝２．６，１Ｈ），２．４６－２．３８（ｍ，３Ｈ），２．２４－２．１４（ｍ，４Ｈ），１．９７－１．８６（ｍ，３Ｈ），１．７１－１．５８（ｍ，５Ｈ），１．４８－１．３７（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１７３．１，１７２．９，１４７．０，１２２．１，７０．６（×２），７０．３（×２），７０．０，６９．７，６５．０，５６．５，５０．２，４９．４，４４．７，４０．３，３９．２，３８．５，３６．４，３４．７，３３．３，２９．０，２５．０，２４．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_２４Ｈ_４２Ｎ_２ＮａＯ_１３Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：５７３．２２８０；実測値５７３．２２８９．

化合物６：^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ６．４０（ｓ，１Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），４．４０－４．３６（ｍ，１Ｈ），３．９１－３．８６（ｄｄ，Ｊ＝６．４，１Ｈ），３．６２－３．６０（ｍ，４０Ｈ），３．５５－３．５０（ｍ，４Ｈ），３．４２－３．３９（ｍ，４Ｈ），３．１９－３．０４（ｍ，３Ｈ），２．８２－２．８０（ｔ，Ｊ＝４．３５，１Ｈ），２．６３－２．６１（ｍ，１Ｈ），２．４６－２．３７（ｍ，３Ｈ），２．２３－２．１４（ｍ，４Ｈ），１．９７－１．８３（ｍ，３Ｈ），１．７３－１．５５（ｍ，５Ｈ），１．５０－１．３６（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１７２．９，１７２．２，７０．６，７０．３，７０．０，６４．９，５６．５，４９．４，４４．８，４０．３，３９．３，３８．５，３６．４，３５．３，３４．７，３３．２，２９．０，２５．５，２０．９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_４０Ｈ_７４Ｎ_２ＮａＯ_１６Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：９２５．４３７７；実測値９２５．４３２９．

化合物７：^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．５０－７．４７（ｄ，１Ｈ），６．１７（ｓ，１Ｈ），４．５１－４．４８（ｔ，Ｊ＝５．０４，２Ｈ），４．４３－４．３９（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１Ｈ），３．９２－３．８４（ｍ，３Ｈ），３．６０－３．５１（ｍ，１２Ｈ），３．４５－３．４１（ｍ，２Ｈ），３．２１－３．０６（ｍ，３Ｈ），２．８４－２．８２（ｔ，Ｊ＝４．４，１Ｈ），２．７８－２．７４（ｔ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），２．６４－２．６３（ｄｄ，Ｊ＝２．８，１Ｈ），２．４８－２．４１（ｍ，１Ｈ），２．１９－２．１６（ｔ，Ｊ＝７．３，２Ｈ），２．０５－１．９８（ｍ，２Ｈ），１．９３－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．７１－１．６０（ｍ，５Ｈ），１．５２－１．３９（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１７３．１，１７２．９，１４７．０，１２２．２，７０．６，７０．３，７０．１，７０．０，６５．０，５６．７，５０．２，４９．５，４４．８，４０．４，３９．２，３８．６，３６．５，３４．８，３３．４，２９．０，２５．５，２５．０，２４．７；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_２５Ｈ_４２Ｎ_４ＮａＯ_７Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：５９７．２３９３実測値：５９７．２３５６．

化合物８：^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．４７（ｄ，１Ｈ），６．３６（ｓ，１Ｈ），４．４８－４．４６（ｍ，２Ｈ），４．３９－４．３６（ｄｄ，Ｊ＝５．０，１Ｈ），３．９０－３．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．４１，１Ｈ），３．８３－３．８１（ｍ，２Ｈ），３．６２－３．５７（ｍ，４４Ｈ），３．４２－３．３８（ｍ，２Ｈ），３．１９－３．０４（ｍ，３Ｈ），２．８２－２．７９（ｔ，Ｊ＝４．６，１Ｈ），２．７５－２．７２（ｔ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），２．７２－２．６０（ｍ，１Ｈ），２．４６－２．３８（ｍ，１Ｈ），２．１７－２．１３（ｔ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），２．０３－１．９５（ｍ，２Ｈ），１．９１－１．８３（ｍ，１Ｈ），１．７２－１．５５（ｍ，５Ｈ），１．４９－１．３７（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１７３．０，１７２．９，１４６．９，１２２．２，７０．６，７０．２，７０．０，６９．６，６４．９，５６．５，５０．２，４９．４，４４．７，４０．３，３９．２，３８．５，３６．３，３４．７，３３．３，２９．０，２５．４，２５．０，２４．６；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_４１Ｈ_７４Ｎ_４ＮａＯ_１５Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：９４９．４４９０実測値：９４９．４５２４．

化合物９：^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．７８－７．７６（ｄ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），４．７３－４．６５（ｍ，Ｊ＝１２．４），４．５５－４．５２（ｔ，Ｊ＝５．０），３．８９－３．８３（ｍ，３Ｈ），３．６２－３．５２（ｍ，１０Ｈ）３．４６－３．４１（ｍ，３Ｈ），３．２１－３．０６（ｍ，３Ｈ），２．８０－２．７８（ｍ，１Ｈ），２．６２－２．６０（ｄｄ，Ｊ＝２．７５，２．２９，１Ｈ），２．４８－２．４０（ｍ，１Ｈ），２．１９－２．１５（ｔ，Ｊ＝７．３，２Ｈ），１．９３－１．８５（ｍ，１Ｈ），１．７５－１．６０（ｍ，５Ｈ），１．５０－１．４１（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１７２．９，１４４．７，１２４．０，７１．２，７０．６４，７０．５８，７０．５，７０．３，７０．０，６９．５，５６．５，５０．８，５０．３，４４．３，３９．２，４０．３，３８．６，３６．４，３４．７，２９．０，２５．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_２２Ｈ_３８Ｎ_４ＮａＯ_６Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：５４１．２１３０実測値：５４１．２１１６．

化合物１０：^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ７．４７（ｓ，１Ｈ），６．３６（ｓ，１Ｈ），４．７２－４．６３（ｍ，２Ｈ），４．５４－４．５１（ｔ，Ｊ＝４．９９，２Ｈ），３．８６－３．８０（ｍ，３Ｈ），３．６４－３．５２（ｍ，４２Ｈ），３．４７－３．４０（ｍ，１Ｈ），３．２０－３．０５（ｍ，３Ｈ），２．７９－２．７６（ｔ，Ｊ＝４．５，１Ｈ），２．６１－２．５９（ｄｄ，Ｊ＝２．４，２．８，１Ｈ），２．４９－２．３９（ｍ，１Ｈ），２．１９－２．１４（ｔ，Ｊ＝７．４，２Ｈ），１．９４－１．８３（ｍ，３Ｈ），１．７２－１．５８（ｍ，５Ｈ），１．５１－１．３９（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ１７２．９，１４４．６，１２４．０，７１．２，７０．６，７０．３，７０．０，６９．５，６４．７，５６．５，５０．８，５０．３，４４．３，４０．３，３９．２，３８．６，３６．４，３４．８，２９．０，２５．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_３８Ｈ_７０Ｎ_４ＮａＯ_１４Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：８９３．４２２８実測値：８９３．４２５８．

化合物１１：^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．３０－８．２４（ｍ，４Ｈ），８．１１－８．０８（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，３Ｈ），６．３３－６．３１（ｍ，１Ｈ），４．７９－４．７４（ｍ，２Ｈ），４．５９－４．５３（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８４（ｍ，２Ｈ），３．７２－３．５９（ｍ，４４Ｈ），３．２２－３．０５（ｍ，２Ｈ），２．５１－２．３７（ｍ，１Ｈ），２．２４－２．１４（ｍ，２Ｈ），１．９０（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７４－１．６０（ｍ，５Ｈ），１．５１－１．３９（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１７２．９，１６６．０，１６５．６，１４４．３，１３８．８，１３５．２，１３０．９，１２９．１（×２），１２７．２，１２６．９，１２３．８，１１９．７，７０．６，７０．３，７０．０，６９．５，５６．５，５０．４，４０．３，３９．３，３８．６，３６．４，３４．８，２９．０，２５．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_４９Ｈ_７５Ｎ_９ＮａＯ_１３Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：１０６４．４８２３；実測値：１０６４．４７７５．

化合物１２：^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ８．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），８．２０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），８．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．６１－７．５１（ｍ，３Ｈ），６．２６（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．５３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．８７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．６３－３．５９（ｍ，４４Ｈ），３．５５（ｓ，２Ｈ），２．４７－２．３９（ｍ，１Ｈ），２．１７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．０１－１．８３（ｍ，２Ｈ），１．７５－１．６０（ｍ，５Ｈ），１．４９－１．４０（ｍ，２Ｈ）；^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）１７２．９，１６６．０，１６５．６，１４４．３，１３８．８，１３５．２，１３０．９，１２９．１（×２），１２７．２，１２６．９，１２３．８，１１９．７，７０．６，７０．３，７０．０，６９．５，５６．５，５０．４，４０．３，３９．３，３８．６，３６．４，３５．８，２９．０，２５．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）計算値Ｃ_４９Ｈ_７５Ｎ_９ＮａＯ_１３Ｓ_２（Ｍ＋Ｎａ）^＋：１０４８．４３２３；実測値：１０４８．４３１７．

［実施例４］
金属ナノ粒子アフィニティープローブ（金属ナノ粒子複合体）を以下の方法で合成した。

ＢＳＰＰ（Bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine dihydrate dipotassium salt；ビス（ｐ－スルホナトフェニル）フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩）（０．５ｍｇ）をクエン酸安定化ＡｕＮＰｓ(金ナノ粒子)（１２ｎｍ、１８ｎＭ、１ｍＬ）の溶液に添加し、混合物をプレートシェーカー上で、５０℃で１時間撹拌した。
得られた混合物を１８，０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離し、上清を注意深く除去した。ＢＳＰＰ安定化ＡｕＮＰｓをＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄し、ＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）で希釈した。

化合物１のＭｅＯＨ溶液（１０ｍＭ）及びラクトースのリポ酸誘導体（リガンドを有する化合物）のＭｅＯＨ溶液（１０ｍＭ）を、１：２の比率で混合し原液（化合物１及びラクトースのリポ酸誘導体量：合計１８ｎｍｏｌ）を調製した。

原液をＢＳＰＰ安定化ＡｕＮＰｓ（１８ｐｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液に添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。得られた官能化ＡｕＮＰｓ（金属ナノ粒子アフィニティープローブ）をＭｅＯＨ／ＭｉｌｌｉＱ水（１／１）で２回、次いでＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄した。ＡｕＮＰの官能化を、ＵＶ－Ｖｉｓ、アガロースゲル電気泳動およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳの分析によって確認した。官能化ＡｕＮＰｓは、化合物１と、リガンドを有する化合物とが、ＡｕＮＰｓに結合している金属ナノ粒子複合体である。

ＵＶ－ＶＩＳ：官能化ＡｕＮＰｓはλｍａｘ＝５２１ｎｍであった。クエン酸安定化ＡｕＮＰのλｍａｘ＝５１８ｎｍと比してわずかに高波長シフトを示したことから、官能化されたことを確認した。また、Ｈａｉｓｓらの方法（Haiss. W; Thanh. N. T. K; Aveyard. J and Fernig. D. G, Anal. Chem., 2007, 79, 4215-4221.）に基づいて、４５０ｎｍの吸光度と極大吸収波長の吸光度の比から濃度を算出した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ：（化合物１）［Ｍ＋Ｎａ］^＋計算値５８９．１５，実測値５８９．１４．（リガンドを有する化合物）［Ｍ＋Ｎａ］^＋計算値６７６．２２，実測値６７６．２１．
電気泳動解析：０．５％アガロースゲルを用いた解析において、官能化ＡｕＮＰはＢＳＰＰ安定化ＡｕＮＰと比して泳動度が小さくなったことから、ＢＳＰＰより分子量の大きい化合物１やリガンドを有する化合物の官能化により金ナノ粒子表面の被覆状態が変化したことが示唆された。

［実施例５］
２ｐｍｏｌの実施例４で得られた官能化ＡｕＮＰｓ（金属ナノ粒子アフィニティープローブ）を標的分子であるラクトース結合タンパク質ＰＮＡ（Peanut agglutinin：ピーナッツ凝集素）を４ｐｍｏｌ）を含む試料のＨＥＰＥＳバッファ溶液（４０μＬ）と混合し、４℃で２時間インキュベートした。インキュベート後の標的分子と金属ナノ粒子アフィニティープローブとの架橋複合体を含む混合物を、２％ＳＤＳを含むＰＢＳバッファで希釈後、１８，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を注意深く除去した。次いでＰＢＳバッファで洗浄し、１０％β-メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉバッファを添加して９５℃で５分間加熱し、標的分子と化合物の架橋物を金属ナノ粒子から切断して溶出させた。溶出した標的分子を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び蛍光イメージングで分析し、標的分子が金属ナノ粒子アフィニティープローブと共有結合で架橋された結果、濃縮精製されたことを確認した。

なお、前記実施例４において、化合物１を、前記化合物２～１０に変更しても、同様に官能化ＡｕＮＰｓを得ることができた。

［実施例６］
５種類の官能化ＡｕＮＰｓ（化合物１～５を使用して調製した官能化ＡｕＮＰｓ）（金属ナノ粒子アフィニティープローブ）のそれぞれを２ｐｍｏｌ含む試料の１０％Ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｅｅｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ－ＰＢＳバッファ溶液（５０μＬ）を標的分子であるラクトース結合タンパク質ＰＮＡ、ＥＣＡ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ：デイゴマメレクチン）、及びＲＣＡ（ＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：トウゴマレクチン）をそれぞれ１０μｇ／ｗｅｌｌで固定化した９６穴マルチウェルプレートへ添加し、４℃で一定時間（１，２，４，６，２０時間）インキュベートした。インキュベート後の標的分子と金属ナノ粒子アフィニティープローブとの架橋複合体を含む混合物を、遊離のラクトース（終濃度０．５Ｍ）を含む１０％Ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｅｅｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ－ＰＢＳバッファ（３００μＬ）で３回洗浄後、１０％Ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｅｅｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ－ＰＢＳバッファ（３００μＬ）で３回洗浄した。次いで２０μｇ／ｍＬのＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識ＰＮＡを含む１０％Ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｅｅｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ－ＰＢＳバッファ溶液（５０μＬ）を２５℃で１時間インキュベートし、１０％Ｐｒｏｔｅｉｎｆｒｅｅｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ－ＰＢＳバッファ溶液（５０μＬ）で洗浄した。ＨＲＰの基質である３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）と過酸化水素水の１：１混合溶液（５０μＬ）を添加し、５分後に２Ｎ硫酸水溶液（５０μＬ）を加えて酵素反応を停止し、プレートリーダーを用いた４５０ｎｍにおける吸光度測定により架橋複合体量を定量した。これにより、各反応条件下での各プローブにおける反応効率を解析し、反応効率を最大化する反応条件を決定した。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

以上、本実施形態を詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限定されるものではなく、本開示の要旨を逸脱しない範囲における設計変更があっても、それらは本開示に含まれるものである。

Claims

下記一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物。

（一般式（１）において、Ｘ^１はＯ又はＮＨであり、Ｙ^１はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^１は下記式（６）～（１４）及び（２０）～（５１）から選ばれる基である）

（一般式（２）において、Ｘ^２はＯ又はＮＨであり、Ｙ^２はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^２は下記式（８）～（１９）及び（２１）～（５１）から選ばれる基である）

（一般式（３）において、ｎは１、２、４、５及び７～１２から選ばれる整数であり、Ｘ^３はＯ又はＮＨであり、Ｙ^３はＯ、ＮＨ、下記式（４）で表される基、又は下記式（５）で表される基であり、Ｒ^３は求電子基である）

（式（４）及び（５）において、ａは、Ｒ^１、Ｒ^２又はＲ^３との結合部位を示し、ｂは、ＣＨ_２との結合部位を示す。式（５）において、ｘは１～１０の整数である）

（式（１０）においてｍは１～１７の整数であり、式（１１）、（３４）、（３９）及び（４０）においてｑは０～１４の整数であり、式（２９）及び（３０）においてｒは１～９の整数である）
前記Ｒ^３が式（６）～（５１）から選ばれる基である、請求項１に記載の化合物。
前記ｎが８～１２である、請求項１又は２に記載の化合物。
金属ナノ粒子と、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物と、リガンドを有する化合物との複合体であり、
前記請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物と、前記リガンドを有する化合物とが前記金属ナノ粒子に結合している、金属ナノ粒子複合体。
請求項４に記載の金属ナノ粒子複合体と試料とを接触させることにより、試料中の標的分子と、金属ナノ粒子複合体との、架橋複合体を形成する工程を有する、標的分子の検出方法。
請求項５に記載の標的分子の検出方法を、ハイスループットスクリーニング方法の一部として行う、ハイスループットスクリーニング方法。