JP2022132961A - Vector for gene therapy of rheumatoid arthritis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、疾病の遺伝子治療用ウイルスベクター、ならびにそれを含む疾病治療用医薬組成物に関する。詳細には、該ベクターは、抗CD81抗体遺伝子を含む、疾病の遺伝子治療用のウイルスベクターである。より詳細には、該ベクターは、関節リウマチ(RA)の遺伝子治療用である。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to viral vectors for gene therapy of diseases and pharmaceutical compositions for disease therapy containing the same. Specifically, the vector is a viral vector for gene therapy of disease comprising an anti-CD81 antibody gene. More particularly, the vector is for gene therapy of rheumatoid arthritis (RA).
RAの治療には、主に薬物療法、手術療法、およびリハビリテーションが用いられている。RAの薬物療法には、ステロイド、非ステロイド系抗炎症薬、抗リウマチ薬、および生物学的製剤が用いられている。生物学的製剤としては、炎症性サイトカインや炎症細胞を標的とするものが多い。近年、炎症性サイトカインや炎症細胞が関与するRAの病理学的プロセスを阻害するための遺伝子治療が考案され、研究が続けられている。 Drug therapy, surgical therapy, and rehabilitation are mainly used for the treatment of RA. Steroids, non-steroidal anti-inflammatory drugs, anti-rheumatic drugs, and biologics have been used in the pharmacotherapy of RA. Many biological agents target inflammatory cytokines and inflammatory cells. In recent years, gene therapy for inhibiting the pathological process of RA involving inflammatory cytokines and inflammatory cells has been devised and research continues.
RAの原因物質の1つとしてシノビオリンがある。シノビオリンの発現調節にはテトラスパニンの1つであるCD81が関与している。そこで、CD81を標的としたCD81siRNAや抗CD81モノクローナル抗体を用いるRA治療が提案されている(非特許文献1~3)。しかし、CD81を標的とした遺伝子治療は行われていない。
Synoviolin is one of the causative agents of RA. CD81, one of the tetraspanins, is involved in the regulation of synoviolin expression. Therefore, RA therapy using CD81 siRNA or anti-CD81 monoclonal antibody targeting CD81 has been proposed (
一方で、遺伝子治療には、副作用を含む安全性の問題や発現持続性が低い、遺伝子デリイバリー効率が低いといった問題がある。 On the other hand, gene therapy has problems such as safety problems including side effects, low persistence of expression, and low gene delivery efficiency.
CD81を標的とした効果的かつ安全性の高いRAの遺伝子治療が望まれている。 An effective and highly safe gene therapy for RA targeting CD81 is desired.
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、センダイウイルスをベースとしたウイルスベクターに抗CD81抗体をコードする遺伝子を組み込んだものを動物のRAの遺伝子治療に用いたところ、優れた治療効果を得ることができ、動物に対する安全性も確認できたことから、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and have found that a virus vector based on Sendai virus in which a gene encoding an anti-CD81 antibody is incorporated is used for gene therapy of RA in animals. The present inventors have completed the present invention based on the fact that a therapeutic effect can be obtained and the safety to animals has also been confirmed.
すなわち、本発明は以下のものを提供する:
(1)抗CD81抗体をコードする遺伝子を含む、マイナス鎖RNAウイルスをベースにした関節リウマチ治療用ベクター。
(2)パラミクソウイルス科に属するウイルスをベースにしたものである、(1)記載のベクター。
(3)パラミクソウイルス科に属するウイルスがセンダイウイルスである、(2)記載のベクター。
(4)ステルス型である、(1)~(3)のいずれか記載のベクター。
(5)抗CD81抗体がCD81のLEL(large extracellular loop)に結合するものである、(1)~(4)のいずれか記載のベクター。
(6)抗CD81抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、(1)~(5)のいずれか記載のベクター
(7)(1)~(6)のいずれか記載のベクターを含む、RA治療用医薬組成物。
Thus, the present invention provides:
(1) A rheumatoid arthritis therapeutic vector based on a minus-strand RNA virus, containing a gene encoding an anti-CD81 antibody.
(2) The vector according to (1), which is based on a virus belonging to the Paramyxoviridae family.
(3) The vector according to (2), wherein the virus belonging to Paramyxoviridae is Sendai virus.
(4) The vector according to any one of (1) to (3), which is a stealth type.
(5) The vector according to any one of (1) to (4), wherein the anti-CD81 antibody binds to the LEL (large extracellular loop) of CD81.
(6) The vector according to any one of (1) to (5), wherein the anti-CD81 antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody (7) The vector according to any one of (1) to (6) A pharmaceutical composition for treating RA, comprising:
本発明によれば、効果的かつ安全性の高いRA治療用ベクターが提供される。具体的には、本発明のRA治療用ベクターは、細胞質に留まり、宿主染色体に影響を及ぼさないため、安全性が高い。さらに本発明のRA治療用ベクターは、宿主のベクターに対する免疫反応が抑制され、長期にわたり治療効果が安定して持続する。本発明のRA治療用ベクターは、有効成分である抗CD81抗体の発現効率も高い。 According to the present invention, an effective and highly safe RA therapeutic vector is provided. Specifically, the RA therapeutic vector of the present invention remains in the cytoplasm and does not affect host chromosomes, and is highly safe. Furthermore, the RA therapeutic vector of the present invention suppresses the host's immune reaction to the vector and stably maintains its therapeutic effect over a long period of time. The RA therapeutic vector of the present invention also has a high expression efficiency of the anti-CD81 antibody, which is an active ingredient.
本発明は、疾病の遺伝子治療用ウイルスベクター、ならびにそれを含む疾病治療用医薬組成物に関する。詳細には、該ベクターは、抗CD81抗体遺伝子を含む、疾病の遺伝子治療用のウイルスベクターである。より詳細には、該ベクターは、関節リウマチ(RA)の遺伝子治療用である。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to viral vectors for gene therapy of diseases and pharmaceutical compositions for disease therapy containing the same. Specifically, the vector is a viral vector for gene therapy of disease comprising an anti-CD81 antibody gene. More particularly, the vector is for gene therapy of rheumatoid arthritis (RA).
本発明のベクターはいずれのウイルスをベースにしたものであってもよい。好ましくは、本発明のベクターは、RNAウイルス、より好ましくはマイナス鎖RNAウイルスをベースにしたものである。 The vectors of the invention can be based on any virus. Preferably, the vectors of the invention are based on RNA viruses, more preferably negative-strand RNA viruses.
したがって、本発明は、1の態様において、抗CD81抗体をコードする遺伝子を含む、マイナス鎖RNAウイルスをベースにしたRA治療用ベクターを提供する。 Accordingly, in one aspect, the present invention provides a negative-strand RNA virus-based RA therapeutic vector comprising a gene encoding an anti-CD81 antibody.
マイナス鎖RNAウイルスをベースにしたベクターは細胞質型RNAウイルスベクターである。細胞質型RNAウイルスベクターは、それに組み込まれた遺伝子の発現が細胞質で行われるため、宿主染色体に影響を与えることがない。したがって、マイナス鎖RNAウイルスをベースにした本発明のウイルスベクターは、安全性が極めて高いものである。また、本発明の好ましいウイルスベクターは遺伝子導入効率および遺伝子発現効率が高く、発現が長期にわたるという特徴を有している。パラミクソウイルス、特にセンダイウイルスをベースにした本発明のウイルスベクターは、上記特徴が顕著である。 Vectors based on negative-strand RNA viruses are cytoplasmic RNA viral vectors. Cytoplasmic RNA viral vectors do not affect host chromosomes because the expression of the gene incorporated therein takes place in the cytoplasm. Therefore, the viral vector of the present invention, which is based on a minus-strand RNA virus, is extremely safe. In addition, preferred viral vectors of the present invention are characterized by high efficiency of gene transfer and gene expression, and long-term expression. The viral vector of the present invention based on Paramyxovirus, particularly Sendai virus, has the above characteristics.
上述のごとく、本発明のウイルスベクターのベースとなるウイスルはマイナス鎖RNAウイルスである。マイナス鎖RNAウイルスとしては、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科などが挙げられる。パラミクソウイルス科はパラミクソウイルス亜科およびニューモウイルス亜科を含む。パラミクソウイルス亜科には、パラミクソウイルス属(センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス1型、ヒトパラインフルエンザウイルス3型など)、モルビリウイルス属(麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルスなど)、およびルブラウイルス属(ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス2型、ニューカッスル病ウイルス、サルパラインフルエンザウイルスなど)が含まれる。ニューモウイルス亜科にはニューモウイルス属(RSウイルス、マウス肺炎ウイルス、ウシRSウイルスなど)が含まれる。
As described above, the virus on which the viral vector of the present invention is based is a minus-strand RNA virus. Minus-strand RNA viruses include Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, and the like. The Paramyxoviridae family includes the subfamilies Paramyxovirinae and Pneumovirinae. The Paramyxovirinae include the genus Paramyxoviridae (Sendai virus, human
本発明において、いずれのマイナス鎖ウイスルをベースにしたベクターを用いてもよい。本発明において、好ましいのはパラミクソウイルス科のウイルスをベースにしたウイルスベクターである。本発明において、より好ましいのはセンダイウイルスをベースにしたウイルスベクターである。センダイウイルスは持続感染が可能であり、宿主における抗CD81抗体の発現も持続的なものとなるので都合がよい。 Any minus-strand virus-based vector may be used in the present invention. Preferred in the present invention are viral vectors based on viruses of the family Paramyxoviridae. In the present invention, more preferred are Sendai virus-based viral vectors. Sendai virus is capable of persistent infection, which is convenient because it results in persistent expression of anti-CD81 antibody in the host.
本明細書において、ウイルスをベースにしたベクターは、当該ウイルスのゲノムの全部または一部を含むベクターをいい、そのゲノムは改変されていてもよい。安全性の向上、発現効率の向上、導入できる遺伝子のサイズの拡大、宿主免疫惹起の抑制などの目的に応じてウイルスゲノムを改変してもよい。改変は人為的になされたものであってもよく、自然変異によるものであってもよい。ウイルスゲノムの改変は公知の手段、方法を用いて行うことができる。例えば、センダイウイルスの場合であれば、F、HN、Mの各遺伝子をすべて欠損させることにより、ウイルス抗原の細胞外への放出を最小限に抑えて安全性を確保してもよい。目的に応じてウイルスゲノムのコドンを最適化してもよい。 As used herein, a virus-based vector refers to a vector containing all or part of the genome of the virus, which genome may be modified. The viral genome may be modified according to purposes such as improvement of safety, improvement of expression efficiency, expansion of gene size that can be introduced, suppression of host immunity induction, and the like. Modification may be artificial or may be due to natural mutation. Modification of the viral genome can be performed using known means and methods. For example, in the case of Sendai virus, the F, HN, and M genes may all be deleted to minimize extracellular release of viral antigens and ensure safety. Codons of the viral genome may be optimized according to the purpose.
ウイルスベクターは、導入遺伝子の発現をチェックするためのマーカー遺伝子(例えば薬剤耐性遺伝子やGFP遺伝子等)等を適宜含んでいてもよい。 The viral vector may appropriately contain a marker gene (for example, drug resistance gene, GFP gene, etc.) for checking the expression of the introduced gene.
本発明において、ステルス型のウイルスベクターを用いてもよい。ステルス型のウイルスベクターは、宿主の自然免疫機構に認識され難い、あるいは認識されないベクターであり、宿主免疫の惹起を抑制または無くすことができるベクターである。ウイルスベクターのステルス化の方法は公知であり、例えば、ウイルスゲノム中のPAMP構造を改変または除去する、自然免疫機構を抑制する因子をウイルスゲノムに追加する等の方法が挙げられる。センダイウイルスをベースとしたステルス型のベクターの例としては、限定するものではないが、SRVTMベクター(ときわバイオ株式会社製)が挙げられる。 In the present invention, a stealth virus vector may be used. A stealth viral vector is a vector that is difficult or not recognized by the host's innate immune system, and is a vector that can suppress or eliminate the induction of host immunity. Methods for stealthing viral vectors are known, and include, for example, modifying or removing the PAMP structure in the viral genome, adding a factor that suppresses the innate immune system to the viral genome, and the like. Examples of Sendai virus-based stealth vectors include, but are not limited to, the SRV TM vector (manufactured by Tokiwa-Bio Co., Ltd.).
CD81は、RAの原因物質であるシノビオリンの発現調節に関与している。そのため、CD81を標的としたRA治療が提案されている。しかしながら、CD81を標的としたRAの遺伝子治療は行われていなかった。かかる状況かにおいて、本発明によって、抗CD81抗体をコードする遺伝子を含む、マイナス鎖RNAウイルスをベースにしたRA治療用ベクターが提供され、効果的かつ安全性の高いRAの遺伝子治療が可能となる。 CD81 is involved in regulation of the expression of synoviolin, the causative agent of RA. Therefore, RA therapy targeting CD81 has been proposed. However, gene therapy for RA targeting CD81 has not been performed. Under such circumstances, the present invention provides a negative-strand RNA virus-based therapeutic vector for RA containing a gene encoding an anti-CD81 antibody, which enables effective and highly safe gene therapy for RA. .
本明細書において、抗CD81抗体は、CD81を特異的に認識し、結合して、CD81の活性を抑制または消失させる抗体である。抗CD81抗体は、CD81の全体または一部を認識する。CD81は細胞外ループを有しており、そのうちの1つはLEL(large extracellular loop)と呼ばれている。抗CD81抗体はCD81のLELを認識し、結合するものであってもよい。 As used herein, an anti-CD81 antibody is an antibody that specifically recognizes CD81, binds to it, and suppresses or eliminates the activity of CD81. Anti-CD81 antibodies recognize all or part of CD81. CD81 has extracellular loops, one of which is called LEL (large extracellular loop). The anti-CD81 antibody may recognize and bind the LEL of CD81.
抗CD81抗体はポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。以下において、抗CD81抗体という場合は、抗CD81モノクローナル抗体をいうものとする。 The anti-CD81 antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody. Hereinafter, the term "anti-CD81 antibody" refers to an anti-CD81 monoclonal antibody.
本発明で用いる抗CD81抗体は、CD81の全体または一部のアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として用いて得ることができる。CD81のアミノ酸配列は公知であるので、当業者は公知の遺伝子工学的手法および/または合成化学的手法を用いてCD81の部分ペプチドを作成することができる。 The anti-CD81 antibody used in the present invention can be obtained using a peptide having the amino acid sequence of all or part of CD81 as an immunogen. Since the amino acid sequence of CD81 is known, those skilled in the art can prepare partial peptides of CD81 using known genetic engineering techniques and/or synthetic chemical techniques.
本発明で用いられる抗CD81抗体の作成方法について説明する。先ず、CD81またはその部分ペプチドを動物に投与して免疫を行う。動物への免疫方法、手段は当業者に公知である。動物への免疫は、例えば皮下注射、皮内注射、静脈注射、脾臓への直接注射などの公知の経路によってCD81またはその部分ペプチドを投与して行う。動物としては、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、サル、などが例示されるが、これらに限定されない。CD81またはその部分ペプチドを動物に投与する際にフロイントの完全または不完全アジュバント等のアジュバントを用いることが好ましい。アジュバントの種類や用法についても公知である。 A method for preparing the anti-CD81 antibody used in the present invention will be described. First, CD81 or a partial peptide thereof is administered to an animal for immunization. Methods and means for immunizing animals are known to those skilled in the art. Animals are immunized by administering CD81 or partial peptides thereof by known routes such as subcutaneous injection, intradermal injection, intravenous injection, and direct injection into the spleen. Examples of animals include, but are not limited to, rats, mice, guinea pigs, rabbits, monkeys, and the like. When administering CD81 or a partial peptide thereof to an animal, it is preferable to use an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant. The types and usage of adjuvants are also known.
次いで、免疫された動物から脾臓細胞を取り出し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得る。ハイブリドーマの取得方法は当業者に公知である。細胞融合法も公知であり、例えばポリエチレングリコールを用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合法などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、ハイブリドーマのクローン化を行う。ハイブリドーマの選択方法、抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング方法は当業者に公知である。抗体活性の測定方法についても、目的とする抗体の特性に応じて当業者が適宜選択することができる。ハイブリドーマのクローン化方法も公知である。上記の方法以外にも、所望のモノクローナル抗体を作成する方法が知られており、例えばファージディスプレイ法を用いてもよい。 Spleen cells are then removed from the immunized animal and fused with myeloma cells to obtain hybridomas. Methods for obtaining hybridomas are known to those skilled in the art. Cell fusion methods are also known, and include, but are not limited to, methods using polyethylene glycol, methods using Sendai virus, and electrofusion methods. Hybridomas producing the antibody of interest are screened and cloned. Methods for selecting hybridomas and screening methods for antibody-producing hybridomas are known to those skilled in the art. A method for measuring antibody activity can also be appropriately selected by those skilled in the art according to the properties of the antibody of interest. Methods for cloning hybridomas are also known. In addition to the methods described above, methods for preparing desired monoclonal antibodies are known, and for example, phage display methods may be used.
抗CD81抗体の例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号NITE P-02092を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、および独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号NITE P-02093を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。 Examples of anti-CD81 antibodies include a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center and assigned accession number NITE P-02092, and an independent administrative agency Product Evaluation Technology Platform Organization Examples include, but are not limited to, a monoclonal antibody produced by a hybridoma deposited with the Patent Microorganisms Depository and assigned accession number NITE P-02093.
本明細書において、特に断らない限り、抗CD81抗体という場合は、その変異体、改変体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、およびフラグメント(例えばFv、scFv、dsFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体など)等を包含するものとする。 As used herein, unless otherwise specified, references to anti-CD81 antibodies include variants, variants, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, and fragments thereof (e.g., Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', F(ab′) 2 , single chain antibodies, etc.) and the like.
抗体の変異体、改変体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、およびフラグメントは公知であり、公知の方法を用いて、これらを得ることができる。 Antibody variants, variants, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, and fragments are known and can be obtained using known methods.
抗CD81抗体の変異体、改変体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、およびフラグメントは、元の抗CD81抗体の特徴を維持しているものである。これらは、例えば、元の抗CD81抗体と同程度またはそれ以上の強さでRAを治療することができるものであることが好ましい。これらは、元の抗CD81抗体と同じエピトープを認識するものであってもよく、異なるエピトープを認識するものであってもよい。変異体や改変体の重鎖の3つの相補性決定領域(重鎖のCDR1、CDR2、CDR3)および軽鎖の3つの相補性決定領域(軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3)のアミノ酸配列が、元の抗CD81抗体の重鎖の重鎖のCDR1、CDR2、CDR3および軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列と同じであってもよく、異なっていてもよい。相補性決定領域のアミノ酸配列の相違は各CDRあたり1残基、2残基または3残基が好ましい。また、そのような相違は同族アミノ酸間の置換であってもよい。同族アミノ酸は当業者に公知である。同族アミノ酸の例を以下の「」に示す(アミノ酸標記は3文字法による):「Gly,Ala」、「Lys,Arg,His」、「Asp,Glu」、「Asn,Gln」、「Ser,Thr」、「Cys,Met」、「Phe,Trp,Tyr」、「Val,Leu,Ile」。 Mutants, variants, chimeric antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, and fragments of anti-CD81 antibodies are those that retain characteristics of the original anti-CD81 antibody. These are preferably, for example, those capable of treating RA as or more potently as the original anti-CD81 antibody. These may recognize the same epitope as the original anti-CD81 antibody, or may recognize a different epitope. The amino acid sequences of the three complementarity determining regions of the heavy chain (heavy chain CDR1, CDR2, CDR3) and the three complementarity determining regions of the light chain (light chain CDR1, CDR2, CDR3) of the mutant or variant are The amino acid sequences of the heavy chain CDR1, CDR2, CDR3 and the light chain CDR1, CDR2, CDR3 of the heavy chain of the original anti-CD81 antibody may be the same or different. The difference in the amino acid sequences of the complementarity determining regions is preferably 1, 2 or 3 residues per CDR. Such differences may also be substitutions between cognate amino acids. Cognate amino acids are known to those of skill in the art. Examples of cognate amino acids are shown below (amino acid designations are in three letter system): "Gly, Ala", "Lys, Arg, His", "Asp, Glu", "Asn, Gln", "Ser, Thr", "Cys, Met", "Phe, Trp, Tyr", "Val, Leu, Ile".
抗CD81抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列の決定は当業者が容易に行いうる。抗CD81抗体をコードする遺伝子をウイルスベクターに組み込んで、本発明のウイルスベクターを得ることができる。ウイルスベクターへの遺伝子の組み込みは公知の方法にて行うことができる。組み込まれる遺伝子のサイズや配列、使用するウイルスベクターのゲノム構造やベースとなるウイルスの種類等に応じて、組み込み位置や組み込み遺伝子数などを決定することができる。発現された抗CD81抗体がRA治療効果を有する限り、抗CD81抗体の全体をコードする遺伝子をウイルスベクターに組み込んでもよく、その一部をウイルスベクターに組み込んでもよい。例えば、抗CD81抗体のH鎖全体とL鎖全体をコードする遺伝子をタンデムにウイルスベクターに組み込んでもよい。 A person skilled in the art can easily determine the amino acid sequence of the anti-CD81 antibody and the base sequence of the gene encoding it. The viral vector of the present invention can be obtained by inserting a gene encoding an anti-CD81 antibody into a viral vector. Gene integration into a viral vector can be performed by a known method. Depending on the size and sequence of the gene to be integrated, the genome structure of the viral vector to be used, the type of base virus, etc., the location of integration and the number of genes to be integrated can be determined. A gene encoding the entire anti-CD81 antibody may be incorporated into the viral vector, or a portion thereof may be incorporated into the viral vector, as long as the expressed anti-CD81 antibody has a therapeutic effect on RA. For example, genes encoding the entire H chain and the entire L chain of an anti-CD81 antibody may be tandemly incorporated into a viral vector.
かくして得られたウイルスベクターをRAの治療に用いることができる。本発明のウイルスベクターはヒトに投与されるが、ヒト以外の動物に投与してもよい。投与する動物に適合した抗CD81抗体遺伝子を選択することができる。本発明のウイルスベクターをヒトに投与する場合、キメラ、ヒト化、または完全ヒト化抗CD81抗体が発現されることが好ましい。 The viral vector thus obtained can be used for the treatment of RA. Although the viral vector of the present invention is administered to humans, it may also be administered to animals other than humans. An anti-CD81 antibody gene suitable for the animal to be administered can be selected. When administering the viral vectors of the invention to humans, chimeric, humanized, or fully humanized anti-CD81 antibodies are preferably expressed.
本発明は、もう1つの態様において、本発明のベクターを含む、RA治療用医薬組成物を提供する。 In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating RA, comprising the vector of the present invention.
本発明の医薬組成物の投与は局所投与(例えば患部関節への注射、パッチ、ゲル、軟膏等の適用)であってもよく、全身投与(例えば輸液等)であってもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物を患部関節への注射により投与する。 Administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be local administration (eg, injection into the affected joint, application of patch, gel, ointment, etc.) or systemic administration (eg, infusion, etc.). Preferably, the pharmaceutical compositions of the invention are administered by injection into the affected joint.
本発明の医薬組成物の剤形は、投与経路に合わせて選択することができ、例えば注射剤とすることができる。各剤形の製造方法は公知である。例えば、注射剤の製造方法は以下の工程:成分の計量、担体との混合・溶解、濾過滅菌、容器への充填、溶封、異物検査、および包装・表示を含むものであってもよい。担体の例としては、注射用水、生理食塩水などが挙げられるが、これらに限定されない。注射剤は、バイアル、アンプル、プレフィルドシリンジの形態であってもよい。注射剤は、溶液、懸濁液の形態であってもよく、あるいは成分を凍結乾燥した固形注射剤の形態であってもよい。注射剤は、緩衝剤、等張化剤、安定剤、保存剤などの添加剤を含んでいてもよい。 The dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be selected according to the route of administration, and can be, for example, an injection. Methods for manufacturing each dosage form are known. For example, a method for producing an injection may include the following steps: weighing of components, mixing/dissolving with a carrier, filter sterilization, filling into a container, heat-sealing, foreign matter inspection, and packaging/labeling. Examples of carriers include, but are not limited to, water for injection, saline, and the like. Injectables may be in the form of vials, ampoules, prefilled syringes. The injection may be in the form of a solution, a suspension, or a solid injection obtained by freeze-drying the ingredients. Injections may contain additives such as buffers, tonicity agents, stabilizers and preservatives.
本発明の医薬組成物の1回の投与量は、典型的には、約1ml~約5ml(7.0 × 108 CIU/mLのベクターを含有する液剤の場合)であるが、患者の年齢、体重、症状の重さ、受けている他の治療等を考慮して、医師が適宜決定、変更することができる。本発明の医薬組成物を数週間に1回~数回、あるいは数ヶ月に1回~数回投与してもよい。本発明の医薬組成物の投与間隔もまた、医師が適宜決定、変更することができる。 A single dose of the pharmaceutical composition of the present invention is typically about 1 ml to about 5 ml (for a solution containing 7.0×10 8 CIU/ml vector), but the patient's age, weight, , the severity of symptoms, other treatments received, etc., can be determined and changed as appropriate by the doctor. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered once to several times every few weeks, or once to several times every few months. The administration interval of the pharmaceutical composition of the present invention can also be appropriately determined and changed by a physician.
本発明は、さらなる態様において、以下のものを提供する:
抗CD81抗体をコードする遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスをベースにしたベクターを関節リウマチ患者に投与することを含む、該患者における関節リウマチの治療方法、
関節リウマチの治療薬の製造のための、抗CD81抗体をコードする遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスをベースにしたベクターの使用、ならびに
関節リウマチの治療に用いられる、抗CD81抗体をコードする遺伝子を含むマイナス鎖RNAウイルスをベースにしたベクター。
The present invention, in further aspects, provides:
A method of treating rheumatoid arthritis in a patient comprising administering to the patient a negative-strand RNA virus-based vector containing a gene encoding an anti-CD81 antibody;
Use of a negative-strand RNA virus-based vector containing a gene encoding an anti-CD81 antibody for the manufacture of a therapeutic agent for rheumatoid arthritis and for the treatment of rheumatoid arthritis containing a gene encoding an anti-CD81 antibody A vector based on a negative-strand RNA virus.
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。 The present invention will be described in greater detail and specificity with reference to the following examples, but the examples should not be construed as limiting the scope of the present invention.
実施例1.RA治療用ベクターの構築
(a)コントロールベクター(SeVdp-control vector: 図1の上段のベクター)
以下の実験において、SRVTM control Vector(ときわバイオ株式会社)をコントロールベクターとして使用した。
Example 1. Construction of RA therapeutic vector (a) Control vector (SeVdp-control vector: the vector in the upper part of Fig. 1)
In the following experiments, SRV ™ control Vector (Tokiwa Bio Co., Ltd.) was used as a control vector.
(b)抗CD81抗体遺伝子を導入したRA治療用マイナス鎖RNAウイスルベクター(SeVdp-antiCD81 vector: 図1の下段のベクター)
(1)キメラ抗CD81抗体
キメラ抗CD81抗体はT. Yamasaki et al., Journal of Hard Tissue Biology 28(3) (2019) 239-244(参照により本明細書に一体化させる)に記載された手順に従って得られたものであった。キメラ抗CD81抗体は、マウス由来の可変領域にラット由来の定常領域を組み合わせたものであった。
(b) Anti-CD81 antibody gene-introduced negative-strand RNA virus vector for RA treatment (SeVdp-antiCD81 vector: vector in the lower part of FIG. 1)
(1) Chimeric anti-CD81 antibody The chimeric anti-CD81 antibody was prepared using the procedure described in T. Yamasaki et al., Journal of Hard Tissue Biology 28(3) (2019) 239-244 (incorporated herein by reference). It was obtained according to The chimeric anti-CD81 antibody combined a mouse-derived variable region with a rat-derived constant region.
(2)キメラ抗CD81抗体遺伝子のベクターへの組み込み
上記コントロールベクターのEGFP遺伝子とPuroP遺伝子の間のXma1部位およびNot1部位の間に、キメラ抗CD81抗体のH鎖遺伝子とL鎖遺伝子をタンデムに挿入することにより、RA治療用マイナス鎖RNAウイスルベクター(SeVdp-antiCD81 vector)を得た。図1の下段のEGFP遺伝子、キメラ抗CD81抗体のH鎖遺伝子、キメラ抗CD81抗体のL鎖遺伝子、およびPuroP遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号:1に示す。なお、SeVdp-control vectorおよびSeVdp-antiCD81 vectorは、センダイウイルスをベースにしたステルス型RNAベクターである。
(2) Incorporation of the chimeric anti-CD81 antibody gene into the vector Insert the H chain gene and L chain gene of the chimeric anti-CD81 antibody in tandem between the Xma1 site and the Not1 site between the EGFP gene and the PuroP gene of the control vector By doing so, a minus-strand RNA virus vector for RA treatment (SeVdp-antiCD81 vector) was obtained. SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of the region containing the EGFP gene, chimeric anti-CD81 antibody H chain gene, chimeric anti-CD81 antibody L chain gene, and PuroP gene in the lower part of FIG. The SeVdp-control vector and SeVdp-antiCD81 vector are Sendai virus-based stealth RNA vectors.
実施例2.動物の関節における抗CD81抗体の発現
(1)リウマチモデルラットの作成
Type II collagen (CII; Collagen Research Center, Tokyo, Japan)とFreund incomplete adjuvant (FIA; Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)を1:1で混合して乳化させ200μLを尾基部に皮内注射して作成した。
Example 2. Expression of anti-CD81 antibody in animal joints (1) Creation of rheumatoid arthritis model rats
Type II collagen (CII; Collagen Research Center, Tokyo, Japan) and Freund incomplete adjuvant (FIA; Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) were mixed at a ratio of 1:1, emulsified, and 200 μL was injected intradermally at the base of the tail. created by
(2)ベクターの投与
先ず、SeVdp-control vectorをリウマチモデルラットの関節腔に注射し、48時間後に実際に関節の滑膜組織にウイルスが感染して緑色蛍光が出ることを確認した。
(2) Administration of Vector First, the SeVdp-control vector was injected into the joint cavity of a rheumatoid arthritis model rat, and 48 hours later, it was confirmed that the synovial tissue of the joint was actually infected with the virus and green fluorescence was emitted.
コラーゲン投与によりリウマチモデルラットを作製した。コラーゲン投与直後にSeVdp-antiCD81 vector(7.0 × 106 CIU)またはSeVdp-control vector(7.0 × 106 CIU)をリウマチモデルラットの関節腔に注射し、ベクター投与から28日目に関節滑膜組織を採取し、抗CD81抗体の発現についてELISAにて調べた。 Rheumatoid arthritis model rats were prepared by administration of collagen. Immediately after administration of collagen, SeVdp-antiCD81 vector (7.0 × 10 6 CIU) or SeVdp-control vector (7.0 × 10 6 CIU) was injected into the joint cavity of rheumatoid arthritis model rats. They were harvested and examined by ELISA for the expression of anti-CD81 antibodies.
CD81のLELでコートした96ウェルプレートにサンプルを添加し、ELISA POD基質TMBキット(ナカライテスク)およびVarioskan LUX(サーモフィッシャー・サイエンティフィック)を用いて450nmの吸光度を測定した。結果を図2に示す。SeVdp-antiCD81 vectorを注射したラットの関節洗浄液中の抗CD81抗体量が、SeVdp-control vectorを注射したラットの関節洗浄液をサンプルとした場合と比較して450nmの吸光度が高かったことから、実際にラットの関節において抗CD81抗体が発現したことが確認された。 Samples were added to CD81 LEL-coated 96-well plates and absorbance at 450 nm was measured using ELISA POD substrate TMB kit (Nacalai Tesque) and Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific). The results are shown in FIG. The amount of anti-CD81 antibody in the joint lavage fluid of rats injected with SeVdp-antiCD81 vector showed a higher absorbance at 450 nm than the joint lavage fluid of rats injected with SeVdp-control vector. It was confirmed that anti-CD81 antibodies were expressed in rat joints.
実施例3.リウマチモデル動物における治療効果
実施例2と同様にして、SeVdp-antiCD81 vectorまたはSeVdp-control vectorをリウマチモデルラットの関節腔に注射し、体重変動および関節の腫れの程度(足の体積)、および臨床スコアを経時的に調べた。それぞれ図3、図4、および図5に結果を示す。ベクター投与から15日目および28日目に足の様子を拡大鏡およびX線で観察した。結果を図6に示す。ベクター投与から28日目に足の関節組織を採取し、切片をヘマトキシリン・エオシン染色およびサフラニンO染色した。結果を図7に示す。ベクター投与から28日目に採取した足の関節組織のヘマトキシリン・エオシン染色およびサフラニンO染色から組織学的スコアをつけた。結果を図8に示す。
Example 3. Therapeutic effect in rheumatoid arthritis model animals In the same manner as in Example 2, SeVdp-antiCD81 vector or SeVdp-control vector was injected into the joint cavity of rheumatoid arthritis model rats, body weight change and degree of joint swelling (leg volume), and clinical Scores were examined over time. The results are shown in Figures 3, 4 and 5, respectively. On the 15th and 28th days after vector administration, the paws were observed with a magnifying glass and X-ray. The results are shown in FIG. Twenty-eight days after vector administration, foot joint tissues were collected, and the sections were stained with hematoxylin-eosin and safranin-O. The results are shown in FIG. Histological scores were obtained from hematoxylin and eosin staining and Safranin O staining of leg joint tissue taken 28 days after vector administration. The results are shown in FIG.
図3からわかるように、正常ラットと比較して、ベクター(コントロールベクターおよび本発明のCD81抗体遺伝子を含むベクター)を注射したラットにおいて若干の体重増加抑制または体重減少が見られたが、それらは大きな変化ではなかった。実験後半では、ベクターを注射したラットの体重は増加傾向を示した。これらの結果から、本発明のベクターの安全性が確認された。図4に示すように、本発明のベクターを注射することにより、足の腫れが大幅に抑制された。図5に示すように、本発明のベクターを注射することにより、臨床スコアが大幅に低下した。これらの効果はほぼ10日間持続していた。図6に示すように、本発明のベクターを注射したラットの足の様子は正常群と殆ど変わらなかったのに対し、コントロールベクターを投与したラットでは足の腫れが顕著であった(day15)。実験後半(day28)では、本発明のベクターを注射したラットの足に腫れが見られた。図7に示すように、本発明のベクターを注射したラットの組織像は正常群と殆ど変わらなかったのに対し、コントロールベクターを投与したラットの組織では炎症による組織損傷が見られた。これらの結果は、組織学的スコアに反映されていた(図8)。 As can be seen from FIG. 3, compared with normal rats, rats injected with vectors (control vectors and vectors containing the CD81 antibody gene of the present invention) showed slight weight gain suppression or weight loss. It wasn't a big change. In the latter half of the experiment, vector-injected rats tended to gain weight. These results confirmed the safety of the vector of the present invention. As shown in FIG. 4, injection of the vector of the present invention significantly suppressed paw swelling. As shown in Figure 5, injection of the vector of the present invention significantly reduced clinical scores. These effects persisted for approximately 10 days. As shown in FIG. 6, the paws of the rats injected with the vector of the present invention did not differ from those of the normal group, whereas the rats injected with the control vector showed marked swelling of the paws (day 15). In the latter half of the experiment (day 28), swelling was observed in the paws of the rats injected with the vector of the present invention. As shown in FIG. 7, the histological appearance of rats injected with the vector of the present invention was almost the same as that of the normal group, whereas tissue damage due to inflammation was observed in the tissues of rats injected with the control vector. These results were reflected in histological scores (Fig. 8).
以上より、本発明の抗CD81抗体遺伝子を含むウイルスベクターを用いる遺伝子治療の有効性および安全性が示された。 From the above, the efficacy and safety of gene therapy using a viral vector containing the anti-CD81 antibody gene of the present invention were demonstrated.
本発明は、医薬品や研究用試薬の製造等において有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in the production of pharmaceuticals and research reagents.
配列番号:1は、本発明の関節リウマチ治療用ベクターに挿入された、EGFP遺伝子、キメラ抗CD81抗体のH鎖遺伝子、キメラ抗CD81抗体のL鎖遺伝子、およびPuroP遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号:1中、塩基1-10は転写開始シグナル、塩基49-768はEGFP遺伝子、塩基810-819は転写終結シグナル、塩基823-832は転写開始シグナル、塩基872-2263はキメラ抗CD81抗体のH鎖遺伝子、塩基2299-2308は転写終結シグナル、塩基2312-2321は転写開始シグナル、塩基2360-3079はキメラ抗CD81抗体のL鎖遺伝子、塩基3121-3130は転写終結シグナル、塩基3134-3143は転写開始シグナル、塩基3182-3781はPuroR遺伝子、塩基3817-3826は転写終結シグナルである。 SEQ ID NO: 1 represents the base sequence of the region containing the EGFP gene, chimeric anti-CD81 antibody H chain gene, chimeric anti-CD81 antibody L chain gene, and PuroP gene inserted into the rheumatoid arthritis therapeutic vector of the present invention. show. In SEQ ID NO: 1, bases 1-10 are the transcription initiation signal, bases 49-768 are the EGFP gene, bases 810-819 are the transcription termination signal, bases 823-832 are the transcription initiation signal, bases 872-2263 are the chimeric anti-CD81 antibody. bases 2299-2308 are transcription termination signals, bases 2312-2321 are transcription initiation signals, bases 2360-3079 are chimeric anti-CD81 antibody light chain genes, bases 3121-3130 are transcription termination signals, bases 3134-3143 is the transcription initiation signal, bases 3182-3781 are the PuroR gene, and bases 3817-3826 are the transcription termination signal.
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