JP2022129999A - Methods for analyzing intracellular kinetics of fatty acid transporter, and utilization of fatty acid transporter modified proteins - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析方法に関する。本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター及びそれを含む組換え細胞に関する。本発明は、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析用試薬に関する。本発明は、被検物質のスクリーニング方法に関する。本発明は、受容体の分析方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing intracellular dynamics of fatty acid transporters. The present invention relates to vectors containing polynucleotides encoding fatty acid transporter modified proteins and recombinant cells containing the same. The present invention relates to reagents for analyzing intracellular dynamics of fatty acid transporters. The present invention relates to a method for screening test substances. The present invention relates to a method for analyzing receptors.
脂肪酸トランスポーターは、細胞外から細胞内への脂肪酸の輸送に関わるタンパク質分子である。脂肪酸トランスポーターは、膜貫通型タンパク質であるが、細胞表面には常時存在しておらず、刺激依存的に細胞内から細胞膜に移行する。例えば、脂肪酸トランスポーターであるFatty acid transport protein 1(FATP1)タンパク質は、細胞がインスリンで刺激されることによって、細胞膜へ移行する(非特許文献１)。 Fatty acid transporters are protein molecules involved in the transport of fatty acids from the extracellular to the intracellular. Although fatty acid transporters are transmembrane proteins, they are not always present on the cell surface, and translocate from the intracellular to the cell membrane in a stimulus-dependent manner. For example, Fatty acid transport protein 1 (FATP1) protein, which is a fatty acid transporter, translocates to the cell membrane when cells are stimulated with insulin (Non-Patent Document 1).
非特許文献１に記載されたような、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態及び細胞内シグナル伝達機構には未解明な部分が多い。本発明は、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析を可能にする手段を提供することを目的とする。
The intracellular dynamics and intracellular signal transduction mechanism of fatty acid transporters as described in
本発明者らは、鋭意検討した結果、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を細胞で発現させ、発現細胞に刺激を与えることによって、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態を分析できることを見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を発現した細胞を刺激して改変タンパク質を細胞膜に移行させる工程と、細胞膜に移行した改変タンパク質を測定する工程とを含み、改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含む、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析方法を提供する。 As a result of intensive studies, the present inventors found that the intracellular dynamics of fatty acid transporters can be analyzed by expressing a modified fatty acid transporter protein in cells and stimulating the expressing cells, and completed the present invention. That is, the present invention comprises a step of stimulating a cell expressing a fatty acid transporter modified protein to translocate the modified protein to the cell membrane, and a step of measuring the translocated modified protein to the cell membrane, wherein the modified protein is a fatty acid transporter. comprising a tag protein moiety in the intracellular region of and at least one tag peptide in the extracellular region.
本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質と、改変タンパク質の細胞内領域に標識タンパク質部分を、細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含むタンパク質からなる、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。 The present invention includes a polynucleotide encoding a fatty acid transporter variant protein consisting of a fatty acid transporter variant protein and a protein comprising a labeled protein moiety in the intracellular region of the variant protein and at least one tag peptide in the extracellular region. Provide a vector.
本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質と、改変タンパク質の細胞内領域に標識タンパク質部分を、細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含むタンパク質からなる、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された組換え細胞を提供する。 The present invention includes a polynucleotide encoding a fatty acid transporter variant protein consisting of a fatty acid transporter variant protein and a protein comprising a labeled protein moiety in the intracellular region of the variant protein and at least one tag peptide in the extracellular region. A recombinant cell into which the vector has been introduced is provided.
本発明は、脂肪酸トランスポーター、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に存在する標識タンパク質部分、及び脂肪酸トランスポーターの細胞外領域に存在する少なくとも１つのタグペプチドからなる脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を有する組換え細胞を提供する。 The present invention provides a recombinant cell having a modified fatty acid transporter protein consisting of a fatty acid transporter, a tag protein moiety present in the intracellular domain of the fatty acid transporter, and at least one tag peptide present in the extracellular domain of the fatty acid transporter. I will provide a.
本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質と、改変タンパク質の細胞内領域に標識タンパク質部分を、細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含むタンパク質からなる、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、リガンドとを含む、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析用試薬を提供する。 The present invention includes a polynucleotide encoding a fatty acid transporter variant protein consisting of a fatty acid transporter variant protein and a protein comprising a labeled protein moiety in the intracellular region of the variant protein and at least one tag peptide in the extracellular region. Provided are reagents for analyzing intracellular dynamics of fatty acid transporters, including vectors and ligands.
本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を発現した細胞に被検物質を添加する工程と、細胞における改変タンパク質のタグペプチドを測定する工程と、測定工程においてタグペプチドが検出された場合、被検物質が脂肪酸トランスポーターを細胞膜に移行させるリガンドであると判定する工程とを含み、改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含む、被検物質のスクリーニング方法を提供する。 The present invention comprises the steps of: adding a test substance to cells expressing a modified fatty acid transporter protein; measuring a tag peptide of the modified protein in the cells; is a ligand that translocates the fatty acid transporter to the cell membrane, wherein the modified protein comprises a tag protein moiety in the intracellular domain of the fatty acid transporter and at least one tag peptide in the extracellular domain. , provides methods for screening analytes.
本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を発現した細胞に被検物質を添加する工程と、細胞を刺激する工程と、細胞における改変タンパク質のタグペプチドを測定する工程と、測定工程においてタグペプチドが検出された場合、刺激によって細胞膜の状態が変化することで被検物質が受容体と結合し、脂肪酸トランスポーターが細胞膜へと移行したと判定する工程とを含み、改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含む、被検物質のスクリーニング方法を提供する。 The present invention comprises the steps of adding a test substance to cells expressing a modified fatty acid transporter protein, stimulating the cells, measuring a tag peptide of the modified protein in the cells, and detecting the tag peptide in the measuring step. and determining that the test substance binds to the receptor and the fatty acid transporter translocates to the cell membrane due to a change in the state of the cell membrane due to the stimulus, wherein the modified protein is a fatty acid transporter cell A method of screening an analyte is provided that includes a labeling protein moiety in the inner region and at least one tag peptide in the extracellular region.
本発明は、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を発現した細胞にリガンドを添加する工程と、細胞における改変タンパク質のタグペプチドを測定する工程とを含み、改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含み、測定工程における測定値によって、細胞の受容体を評価することを含む、受容体の分析方法を提供する。 The present invention comprises the steps of adding a ligand to a cell expressing a fatty acid transporter modified protein, and measuring a tag peptide of the modified protein in the cell, wherein the modified protein is a labeled protein in the intracellular region of the fatty acid transporter. A method for analyzing a receptor comprising a portion and at least one tag peptide in the extracellular region, comprising evaluating the receptor in a cell by the measured value in the measuring step.
本発明によれば、簡便な脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析方法が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a simple method for analyzing the intracellular dynamics of fatty acid transporters is provided.
(脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析方法)
本発明の脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析方法(以下、単に「方法」ともいう)では、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を発現した細胞を刺激して脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を細胞膜に移行させ、移行した改変タンパク質を測定する。なお、本明細書において、「測定」には、定性(検出)及び定量の両方の測定が含まれ得る。例えば、刺激による脂肪酸トランスポーター改変タンパク質の細胞膜への移行を測定することで、脂肪酸トランスポーターの細胞膜移行についての定性的情報を得られる。定性的情報とは、脂肪酸トランスポーター改変タンパク質の細胞膜への移行の有無を示す情報である。移行の有無を示す情報は、光学的な情報であってもよいし、測定機器によって得られる数値情報(測定値)であってもよい。定量的情報とは、測定機器によって得られる数値情報(測定値)、該測定値から算出される値などの数値情報である。光学的な情報としては、例えば、発光、蛍光、吸光、濁りなどが挙げられる。数値情報としては、例えば、光学的な情報をもとに、測定機器によって数値化された情報などが挙げられる。そのような数値としては、例えば、発光又は蛍光によるシグナル強度、吸光度、濁度などが挙げられる。これらの情報に基づき、当業者は細胞内の脂肪酸トランスポーターの働きや、刺激に対する反応(細胞内動態)を分析することができる。
(Method for analyzing intracellular dynamics of fatty acid transporters)
In the method for analyzing the intracellular dynamics of fatty acid transporters of the present invention (hereinafter also simply referred to as the "method"), cells expressing the fatty acid transporter modified protein are stimulated to translocate the fatty acid transporter modified protein to the cell membrane, Measure the modified protein. As used herein, "measurement" may include both qualitative (detection) and quantitative measurements. For example, qualitative information about the translocation of fatty acid transporters to the cell membrane can be obtained by measuring the translocation of a fatty acid transporter-modified protein to the cell membrane upon stimulation. Qualitative information is information indicating whether or not the fatty acid transporter-modified protein translocates to the cell membrane. Information indicating the presence or absence of migration may be optical information or numerical information (measurement values) obtained by a measuring instrument. Quantitative information is numerical information such as numerical information (measured value) obtained by a measuring instrument and a value calculated from the measured value. Optical information includes, for example, luminescence, fluorescence, absorption, turbidity, and the like. Numerical information includes, for example, information digitized by a measuring device based on optical information. Such numerical values include, for example, luminescence or fluorescence signal intensity, absorbance, turbidity, and the like. Based on this information, those skilled in the art can analyze the function of intracellular fatty acid transporters and the response to stimuli (intracellular dynamics).
(脂肪酸トランスポーター改変タンパク質)
脂肪酸トランスポーター改変タンパク質(以下、「改変タンパク質」とも呼ぶ)は、脂肪酸トランスポーターに標識タンパク質部分とタグペプチドが融合した組換えタンパク質である。改変タンパク質のベースとなる脂肪酸トランスポーターには、細胞膜へ移行した際に細胞外に露出する領域(細胞外領域)と、細胞内にとどまる領域(細胞内領域)とが存在する。脂肪酸トランスポーターは、2回膜貫通型タンパク質でもよいし、1回膜貫通型タンパク質であってもよい。2回膜貫通型タンパク質としては、例えばCD36が挙げられる。1回膜貫通型タンパク質としては、例えばFATP1が挙げられる。図１に改変タンパク質の概略図を示す。図１を参照して、標識タンパク質部分は、改変タンパク質の細胞内領域に存在する。また、図１を参照して、タグペプチドは、改変タンパク質の細胞外領域に存在する。
(fatty acid transporter modified protein)
A fatty acid transporter modified protein (hereinafter also referred to as "modified protein") is a recombinant protein in which a labeled protein portion and a tag peptide are fused to a fatty acid transporter. Fatty acid transporters on which modified proteins are based have a region that is exposed outside the cell when translocated to the cell membrane (extracellular region) and a region that remains inside the cell (intracellular region). A fatty acid transporter may be a double transmembrane protein or a single transmembrane protein. Double transmembrane proteins include, for example, CD36. Single-pass transmembrane proteins include, for example, FATP1. FIG. 1 shows a schematic diagram of the modified protein. Referring to FIG. 1, the labeled protein portion is present in the intracellular region of the variant protein. Also, referring to FIG. 1, the tag peptide is present in the extracellular region of the modified protein.
改変タンパク質に用いられる脂肪酸トランスポーターは、CD36タンパク質、FATP1タンパク質、又はCD36若しくはFATP1タンパク質のアミノ酸配列において１以上20以下のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたタンパク質であることが好ましい。ここでいう、アミノ酸残基の欠失、置換及び付加は、改変タンパク質に融合される標識タンパク質部分とタグペプチドとは別であり、脂肪酸トランスポーターそのもののアミノ酸配列に対する欠失、置換及び付加を指す。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸残基の数は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20であってもよい。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸残基の数は、1以上20以下であり、好ましくは1以上15以下であり、より好ましくは1以上10以下であり、より好ましくは1以上7以下であり、より好ましくは1以上5以下であり、より好ましくは1以上3以下である。置換は保存的置換が好ましい。保存的置換とは、元のアミノ酸残基と置換後のアミノ酸残基との間で、酸性、塩基性などの性質が実質的に変化しない置換のことを指す。具体的には、F, W, Y間での置換、L, I, V間での置換、K, R, H間での置換、D, E間での置換、S, T間での置換を指す。 The fatty acid transporter used in the modified protein is preferably CD36 protein, FATP1 protein, or a protein in which 1 to 20 amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of CD36 or FATP1 protein. The deletion, substitution, and addition of amino acid residues herein refer to deletion, substitution, and addition to the amino acid sequence of the fatty acid transporter itself, which are separate from the tag protein portion and the tag peptide fused to the modified protein. . The number of amino acid residues to be deleted, substituted or added is, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19 or 20. The number of amino acid residues to be deleted, substituted or added is 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7. , more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less. Substitutions are preferably conservative substitutions. A conservative substitution refers to a substitution that does not substantially change properties such as acidity and basicity between the original amino acid residue and the amino acid residue after substitution. Specifically, substitutions between F, W, Y; substitutions between L, I, V; substitutions between K, R, H; substitutions between D, E; substitutions between S, T point to
(細胞)
改変タンパク質を発現させる細胞は、生体から分離された細胞でもよいし、ヒトを除く生体を構成している細胞でもよい。細胞が由来する生物種は、特に限定されるものではなく、動物、植物、昆虫又は微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。細胞の種類は特に限定されず、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞等が挙げられる。体細胞としてはとくに限定されないが、筋細胞又は脂肪細胞であることが好ましい。細胞は、生体から採取した細胞を用いてもよいし、培養細胞を用いてもよい。これらの細胞は、由来する生物種と同じ遺伝配列を有する細胞でもよいし、癌細胞などの変異細胞や遺伝情報を改変した組換え細胞であってもよい。細胞は、改変タンパク質に対応する内因性の脂肪酸トランスポーターを発現していてもよいし、発現していなくてもよい。また、細胞は後述するリガンドに対する受容体を有していることが好ましい。
(cell)
Cells in which the modified protein is expressed may be cells isolated from living organisms, or cells constituting living organisms other than humans. The biological species from which the cells are derived is not particularly limited, and may be animals, plants, insects, microorganisms, or the like, preferably animals, more preferably mammals. Examples of mammals include humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, and the like. The cell type is not particularly limited, and examples thereof include somatic cells, germ cells, stem cells and the like. Somatic cells are not particularly limited, but are preferably muscle cells or fat cells. As the cells, cells collected from a living body may be used, or cultured cells may be used. These cells may be cells having the same genetic sequence as the originating species, mutant cells such as cancer cells, or recombinant cells with altered genetic information. The cell may or may not express the endogenous fatty acid transporter corresponding to the engineered protein. Also, the cells preferably have receptors for the ligands described below.
本実施形態の方法は、細胞に改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することによって、改変タンパク質を細胞で発現させてもよい。発現ベクターを導入する方法は特に限定されず、インフェクションでもトランスフェクションでもよいが、トランスフェクションであることが好ましい。インフェクションとしては、特に限定されず、当業者にとって公知の方法で行うことができる。例えば、アデノウイルスやレンチウイルスを用いた遺伝子導入法やアグロバクテリウム法などが挙げられる。トランスフェクションとしては、特に限定されず、当業者にとって公知の方法で行うことができる。例えば、リポフェクション法、電気穿孔法(エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、又はパーティクルガンを用いる方法などが挙げられるが、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法が好ましい。改変タンパク質の導入は、細胞に対して行ってもよいし、生体組織等に対して行ってもよいし、ヒトを除く生体に直接導入してもよい。発現ベクターは、一過性発現のものであっても、安定発現ができるものであってもよい。改変タンパク質の一過性発現細胞であっても、安定発現細胞であっても、本発明の方法に用いることができる。 In the method of this embodiment, the modified protein may be expressed in the cell by introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding the modified protein into the cell. The method of introducing the expression vector is not particularly limited, and may be either infection or transfection, but transfection is preferred. Infection is not particularly limited, and can be carried out by methods known to those skilled in the art. For example, gene transfer methods using adenoviruses or lentiviruses, Agrobacterium methods, and the like can be mentioned. Transfection is not particularly limited, and can be performed by a method known to those skilled in the art. For example, the lipofection method, the electroporation method, the calcium phosphate coprecipitation method, the DEAE-dextran method, or the method using a particle gun can be mentioned, and the lipofection method or the electroporation method is preferable. Modified proteins may be introduced into cells, biological tissues, etc., or may be directly introduced into living organisms other than humans. Expression vectors may be those capable of transient expression or those capable of stable expression. Either cells that transiently express modified proteins or cells that stably express modified proteins can be used in the methods of the present invention.
本発明の改変タンパク質は、刺激によって細胞内から細胞膜へと移行する。刺激としては、改変タンパク質に用いた脂肪酸トランスポーターを細胞膜に移行させることができるのであれば特に限定されない。刺激としては、例えば、リガンドによる刺激、酸又は塩基による刺激、温度による刺激、栄養の過剰又は欠乏による刺激、抗生物質による刺激又は電気による刺激等が挙げられる。リガンドは、細胞表面の受容体に結合する物質であり、例えば、分子量1000以下の低分子化合物、核酸、オリゴ糖、リポ多糖、ペプチド、糖ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、抗体等が挙げられる。タンパク質のリガンドとしては細胞外シグナル分子が好ましく、例えばインスリン、グルカゴン、アドレナリンなどのホルモン、インターフェロンなどのサイトカイン、EGFなどの細胞増殖因子、Gタンパク質が挙げられる。 The modified protein of the present invention translocates from the inside of the cell to the cell membrane upon stimulation. The stimulus is not particularly limited as long as it can translocate the fatty acid transporter used in the modified protein to the cell membrane. Examples of stimulation include ligand stimulation, acid or base stimulation, temperature stimulation, nutrient excess or deficiency stimulation, antibiotic stimulation, electrical stimulation, and the like. Ligands are substances that bind to cell surface receptors, and include, for example, low-molecular-weight compounds with a molecular weight of 1000 or less, nucleic acids, oligosaccharides, lipopolysaccharides, peptides, glycopeptides, proteins, glycoproteins, antibodies and the like. Preferred protein ligands are extracellular signaling molecules, such as hormones such as insulin, glucagon and adrenaline, cytokines such as interferon, cell growth factors such as EGF, and G proteins.
タグペプチドは、特異的に検出可能なポリペプチドであれば特に限定されない。タグペプチドとしては、例えば、Mycタグ(EQKLISEEDL : 配列番号１)、HAタグ(YPYDVPDYA : 配列番号２)、PAタグ(GVAMPGAEDDVV : 配列番号３)、V5タグ(GKPIPNPLLGLDST : 配列番号４)、Sタグ(KETAAAKFERQHMDS : 配列番号５)、Eタグ(GAPVPYPDPLEPR : 配列番号６)、T7タグ(MASMTGGQQMG : 配列番号７)、VSV-Gタグ(YTDIEMNRLGK : 配列番号８)、Glu-Gluタグ(EEEEYMPME : 配列番号９)、Strep-tag IIタグ(WSHPQFEK : 配列番号１０)、HSVタグ(QPELAPEDPED : 配列番号１１)、6×Hisタグ(HHHHHH : 配列番号１２)、又はDYKDDDDKタグ(DYKDDDDK : 配列番号１３)等が挙げられる。改変タンパク質中のタグペプチドは、一種類でもよいし、複数種類が付加されていてもよい。 The tag peptide is not particularly limited as long as it is a specifically detectable polypeptide. Examples of tag peptides include Myc tag (EQKLISEEDL: SEQ ID NO: 1), HA tag (YPYDVPDYA: SEQ ID NO: 2), PA tag (GVAMPGAEDDVV: SEQ ID NO: 3), V5 tag (GKPIPNPLLGLDST: SEQ ID NO: 4), S tag ( KETAAAKFERQHMDS: SEQ ID NO: 5), E tag (GAPVPYPDPLEPR: SEQ ID NO: 6), T7 tag (MASMTGGQQMG: SEQ ID NO: 7), VSV-G tag (YTDIEMNRLGK: SEQ ID NO: 8), Glu-Glu tag (EEEEYMPME: SEQ ID NO: 9) , Strep-tag II tag (WSHPQFEK: SEQ ID NO: 10), HSV tag (QPELAPEDPED: SEQ ID NO: 11), 6×His tag (HHHHHH: SEQ ID NO: 12), or DYKDDDDK tag (DYKDDDDK: SEQ ID NO: 13), etc. . The tag peptide in the modified protein may be of one type, or multiple types may be added.
１つの改変タンパク質中に、同じタグペプチドが2つ以上繰り返し融合されていてもよい。改変タンパク質中に融合されるタグペプチドの数は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10であってもよく、6つ以上9つ以下含まれていることが好ましい。同じタグペプチドが複数含まれることで、タグペプチドを標的とする免疫染色を行った際のシグナル強度を向上させることができる。 Two or more of the same tag peptides may be repeatedly fused in one modified protein. The number of tag peptides fused into the modified protein may be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, including 6 or more and 9 or less. preferably. Inclusion of a plurality of the same tag peptides can improve the signal intensity when immunostaining targeting the tag peptides is performed.
脂肪酸トランスポーターがCD36である場合、タグペプチドは、CD36のアミノ酸配列の358番目～364番目の間に置換又は挿入されていることが好ましく、360番目と361番目の間に挿入されていることがより好ましい。脂肪酸トランスポーターがCD36タンパク質のアミノ酸配列において、１以上20以下のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたタンパク質である場合、タグペプチドは、欠失、置換若しくは付加される前のCD36タンパク質のアミノ酸配列を参照して358番目～364番目に対応する領域において置換又は挿入されていることが好ましく、360番目と361番目の間に挿入されていることがより好ましい。また、脂肪酸トランスポーターがFATP1である場合、タグペプチドは、FATP1タンパク質のアミノ酸配列のN末端に付加されていることが好ましい。脂肪酸トランスポーターがFATP1タンパク質のアミノ酸配列において、１以上20以下のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたタンパク質である場合、タグペプチドは、FATP1タンパク質のアミノ酸配列において、１以上20以下のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたタンパク質のアミノ酸配列のN末端に付加されていることが好ましい。 When the fatty acid transporter is CD36, the tag peptide is preferably substituted or inserted between positions 358 and 364 of the amino acid sequence of CD36, and preferably inserted between positions 360 and 361. more preferred. When the fatty acid transporter is a protein in which 1 or more and 20 or less amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the CD36 protein, the tag peptide is that of the CD36 protein before deletion, substitution or addition. Referring to the amino acid sequence, it is preferably substituted or inserted in the region corresponding to 358th to 364th, more preferably between 360th and 361st. Moreover, when the fatty acid transporter is FATP1, the tag peptide is preferably added to the N-terminus of the amino acid sequence of the FATP1 protein. When the fatty acid transporter is a protein in which 1 to 20 amino acid residues have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the FATP1 protein, the tag peptide has 1 to 20 amino acids in the amino acid sequence of the FATP1 protein. It is preferred that residues are added to the N-terminus of the amino acid sequence of the deleted, substituted or added protein.
標識タンパク質部分は、特に限定されないが、好ましくは蛍光タンパク質である、例えば、GFPタンパク質、BFPタンパク質、CFPタンパク質、YFPタンパク質、EYFPタンパク質、PA-GFPタンパク質、mCherryタンパク質などが挙げられる。 The labeling protein portion is not particularly limited, but is preferably a fluorescent protein, such as GFP protein, BFP protein, CFP protein, YFP protein, EYFP protein, PA-GFP protein, mCherry protein, and the like.
本実施形態の方法では、細胞膜に移行した改変タンパク質を測定する。改変タンパク質の測定は、タグペプチドに特異的に結合する抗体を用いて測定してもよい。タグペプチドに特異的に結合する抗体は、市販の抗体であってもよいし、当該技術において公知の方法により作製した抗体であってもよい。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びそれらの断片(例えばFab、F(ab')2、Fab'など)のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。 In the method of this embodiment, the modified protein translocated to the cell membrane is measured. Altered proteins may be measured using an antibody that specifically binds to the tag peptide. Antibodies that specifically bind to tag peptides may be commercially available antibodies or antibodies produced by methods known in the art. Antibodies may be monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and fragments thereof (eg, Fab, F(ab') 2 , Fab', etc.), but are preferably monoclonal antibodies.
細胞膜に移行した改変タンパク質を測定する工程は、免疫染色であることが好ましい。抗体と融合した標識タンパク質部分を測定することで、細胞膜に移行した改変タンパク質についての情報を得ることができる。免疫染色は、タグペプチドに結合する抗体(一次抗体)が標識されている直接法であっても、一次抗体に、一次抗体に結合する標識された抗体(二次抗体)を更に結合させて測定する間接法であってもよい。以下に、免疫染色による改変タンパク質の測定について説明する。 The step of measuring the modified protein translocated to the cell membrane is preferably immunostaining. By measuring the labeled protein portion fused with the antibody, information on the modified protein translocated to the cell membrane can be obtained. Immunostaining is a direct method in which the antibody (primary antibody) that binds to the tag peptide is labeled, but the primary antibody is further bound with a labeled antibody (secondary antibody) that binds to the primary antibody. It may be an indirect method. Measurement of modified proteins by immunostaining is described below.
測定工程では、免疫染色の前に、細胞を固定する工程を含んでいることが好ましい。細胞の固定方法は、特に限定されず、当業者にとって公知の方法によって行うことができる。固定に用いる固定液としては、例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド(PFA)、4%(v/v) PFA/PBS、グルタルアルデヒド、アセトン、メタノール、エタノールなどが挙げられ、これらを適宜組み合わせて用いることができる。 The measurement step preferably includes a step of fixing cells before immunostaining. A method for fixing cells is not particularly limited, and a method known to those skilled in the art can be used. Fixatives used for fixation include, for example, formaldehyde, paraformaldehyde (PFA), 4% (v/v) PFA/PBS, glutaraldehyde, acetone, methanol, and ethanol, and these can be used in appropriate combinations. can.
固定した細胞に、タグペプチドに特異的に結合する一次抗体を添加する。直接法であれば、一次抗体は標識されたものを用いる。改変タンパク質に特異的に結合する一次抗体を添加することで、細胞と一次抗体との第１の複合体を形成できる。細胞と一次抗体の混合時の温度及び時間の条件は、特に限定されない。例えば、抗体を添加した細胞を4～40℃、5分間～24時間の条件でインキュベーションしてもよい。インキュベーションの間、抗体を添加した細胞は静置してもよいし、攪拌又は振とうしてもよい。 A primary antibody that specifically binds to the tag peptide is added to the fixed cells. In the direct method, a labeled primary antibody is used. A first complex between the cells and the primary antibody can be formed by adding a primary antibody that specifically binds to the variant protein. The temperature and time conditions for mixing the cells and the primary antibody are not particularly limited. For example, antibody-added cells may be incubated at 4 to 40° C. for 5 minutes to 24 hours. During the incubation, the antibody-loaded cells may be allowed to stand, agitated, or shaken.
抗体の標識としては、蛍光物質、酵素、放射性同位元素などが挙げられる。このうち、蛍光物質が特に好ましい。蛍光物質としては、例えば、CF(登録商標) 543 Dye、CF(登録商標) 647 Dye、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサスレッド(Texas Red) (登録商標)、フィコエリトリン(PE)、Cy(登録商標)、DyLight(登録商標)、ATTO(商標)、TRITC又はAlexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、Qdot(登録商標)などの量子ドットなどが挙げられる。また、抗体に付与する標識としては、前述した標識タンパク質部分に用いることができる標識タンパク質を用いてもよいが、その際は改変タンパク質に付与された標識タンパク質部分とは異なることが望ましい。放射性同位元素としては、125I、14C、32Pなどが挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。 Antibody labels include fluorescent substances, enzymes, radioisotopes, and the like. Among these, fluorescent substances are particularly preferred. Examples of fluorescent substances include CF (registered trademark) 543 Dye, CF (registered trademark) 647 Dye, fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, Texas Red (registered trademark), phycoerythrin (PE), Cy ( registered trademark), DyLight (registered trademark), ATTO (registered trademark), fluorescent dyes such as TRITC or Alexa Fluor (registered trademark), and quantum dots such as Qdot (registered trademark). As the label to be attached to the antibody, a labeling protein that can be used for the labeling protein moiety described above may be used, but in that case, it is desirable that the labeling protein moiety is different from the labeling protein moiety attached to the modified protein. Radioisotopes include 125 I, 14 C, 32 P, and the like. Enzymes include, for example, alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, glucose oxidase, tyrosinase, acid phosphatase, luciferase, and the like.
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択することができる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質としては、ルミノール及びその誘導体などの化学発光基質、2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)(ABTS)、1, 2-フェニレンジアミン(OPD)、3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などの発色基質が挙げられる。また、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としては、CDP-Star(登録商標)( 2-クロロ-5-(4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2’-(5-クロロトリシクロ[3.3.1.13.7]デカン])-4-イル]-1-フェニルリン酸二ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。 The enzyme substrate can be appropriately selected from known substrates depending on the type of enzyme. For example, when peroxidase is used as the enzyme, the substrates include chemiluminescent substrates such as luminol and derivatives thereof, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate ammonium) (ABTS), 1,2- chromogenic substrates such as phenylenediamine (OPD), 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB); When alkaline phosphatase is used as the enzyme, CDP-Star (registered trademark) (2-chloro-5-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'-(5-chlorotri cyclo[3.3.1.13.7]decane])-4-yl]-1-phenylphosphate disodium), CSPD® (3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2- chemiluminescent substrates such as (5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan]-4-yl)phenylphosphate disodium), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chromogenic substrates such as acid (BCIP), disodium 5-bromo-6-chloro-indolyl phosphate, p-nitrophenyl phosphate.
抗体の標識として、ビオチンを用いてもよい。ビオチン標識抗体が結合した改変タンパク質に、蛍光物質又は酵素が結合したアビジン(又はストレプトアビジン)を加える事で、改変タンパク質を測定することができる。アビジン(又はストレプトアビジン)に結合させる蛍光物質又は酵素については上述の通りである。 Biotin may be used as an antibody label. The modified protein can be measured by adding fluorescent substance- or enzyme-conjugated avidin (or streptavidin) to the modified protein to which the biotin-labeled antibody is bound. The fluorescent substance or enzyme that binds to avidin (or streptavidin) is described above.
標識として蛍光物質を用いた場合は共焦点レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、分光蛍光光度計又は蛍光プレートリーダーなどの公知の測定装置を用いて、蛍光によるシグナル強度を測定できる。シグナル強度は、例えば、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞の画像を取得し、画像中の蛍光を、共焦点レーザー顕微鏡やコンピューターにダウンロードされた画像処理プログラムや画像解析ソフトによって処理することで得ることができる。画像解析ソフトとしては、例えば、Image Jが挙げられる。または、分光蛍光光度計のように装置内で蛍光を処理して測定値として算出してもよい。得られた測定値を基に、細胞膜上の改変タンパク質の量を計算することができる。励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質に応じて適宜決定できる。測定装置の光源は特に限定されず、蛍光物質の励起に好適な波長の光源を適宜選択できる。光源としては、例えば、水銀アークランプ、キセノンランプ、LEDランプや、これらに光学フィルターを組み合わせたものなどを用いることができる。標識が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。標識が酵素である場合は、例えば、酵素に対する上記記載の基質を添加して、基質の反応を測定することによって測定することができる。基質の反応の測定は、例えば、市販の測定キットを用いてもよいし、吸光度計などで基質または酵素の反応物に固有な波長を測定するなど、用いる酵素と基質に合わせて、当該技術において公知の方法を用いて測定できる。 When a fluorescent substance is used as a label, the signal intensity of fluorescence can be measured using a known measurement device such as a confocal laser microscope, fluorescence microscope, spectrofluorophotometer, or fluorescence plate reader. Signal intensity is obtained by, for example, obtaining an image of cells using a confocal laser microscope and processing the fluorescence in the image with an image processing program or image analysis software downloaded to a confocal laser microscope or computer. can be done. Image analysis software includes, for example, Image J. Alternatively, the fluorescence may be processed in the apparatus like a spectrofluorophotometer and calculated as a measured value. Based on the measurements obtained, the amount of modified protein on the cell membrane can be calculated. The excitation wavelength and fluorescence wavelength can be appropriately determined according to the fluorescent substance used. The light source of the measurement device is not particularly limited, and a light source with a wavelength suitable for exciting fluorescent substances can be selected as appropriate. As the light source, for example, a mercury arc lamp, a xenon lamp, an LED lamp, or a combination of these with an optical filter can be used. When the label is a radioactive isotope, radiation as a signal can be measured using a known device such as a scintillation counter. When the label is an enzyme, it can be measured, for example, by adding the substrate described above to the enzyme and measuring the reaction of the substrate. Measurement of the reaction of the substrate, for example, may be performed using a commercially available measurement kit, or by measuring the wavelength specific to the substrate or the reactant of the enzyme with an absorbance meter, etc., according to the enzyme and substrate used, in the art It can be measured using a known method.
免疫染色が間接法である場合、第１の複合体と、一次抗体に結合する標識された二次抗体とを混合する。これによって、第１の複合体と、二次抗体とが結合した第２の複合体を得ることができる。第１の複合体と、二次抗体の混合時温度及び時間の条件は、特に限定されない。例えば、抗体を添加した細胞を4～40℃、5分間～24時間インキュベーションしてもよい。インキュベーションの間、抗体を添加した細胞は静置してもよいし、攪拌又は振とうしてもよい。 If the immunostaining is an indirect method, the first complex is mixed with a labeled secondary antibody that binds to the primary antibody. As a result, a second complex in which the first complex and the secondary antibody are bound can be obtained. The temperature and time conditions for mixing the first complex and the secondary antibody are not particularly limited. For example, antibody-loaded cells may be incubated at 4-40° C. for 5 minutes to 24 hours. During the incubation, the antibody-loaded cells may be allowed to stand, agitated, or shaken.
(洗浄及びブロッキング)
細胞の固定後や、第１又は第２の複合体の形成後に、細胞の洗浄を行ってもよい。洗浄によって、固定液や未反応の抗体を除去することができる。洗浄には、適切な水性媒体を用いる。そのような水性媒体としては、例えば、生理食塩水、PBS、Tris-HCl、グッドバッファーなどが挙げられる。また、抗体の添加前に、細胞のブロッキングを行ってもよい。ブロッキングには、公知のブロッキング剤を用いる。そのようなブロッキング剤としては、例えば、正常ヤギ血清(NGS)、BSA、カゼイン等の溶液が挙げられる。
(washing and blocking)
After fixing the cells or after forming the first or second complexes, the cells may be washed. Washing can remove fixatives and unreacted antibodies. Suitable aqueous media are used for washing. Such aqueous media include, for example, physiological saline, PBS, Tris-HCl, Good's buffer and the like. Also, cells may be blocked prior to the addition of the antibody. A known blocking agent is used for blocking. Such blocking agents include, for example, solutions of normal goat serum (NGS), BSA, casein, and the like.
(標識タンパク質部分の測定)
本実施形態の方法は、標識タンパク質部分の測定を含んでもよい。発現した改変タンパク質中の標識タンパク質部分を測定することで、細胞内での改変タンパク質の発現を確認することができる。改変タンパク質の標識タンパク質部分と、抗体に付与された蛍光物質の蛍光波長は、異なることが好ましい。
(Measurement of labeled protein portion)
The method of this embodiment may comprise measuring the labeled protein moiety. Expression of the modified protein in cells can be confirmed by measuring the labeled protein portion in the expressed modified protein. The fluorescence wavelength of the labeled protein portion of the modified protein and the fluorescent substance attached to the antibody are preferably different.
標識タンパク質部分の測定は、標識タンパク質部分が蛍光タンパク質であれば、蛍光顕微鏡、分光蛍光光度計又は蛍光プレートリーダーなどの公知の測定装置を用いて蛍光を測定することによって行うことができる。蛍光は、蛍光顕微鏡などを介した目視によって確認してもよい。また、蛍光による光学的な情報を基に、シグナル強度を取得することができる。シグナル強度の取得については、上述の通りである。得られた測定値を基に、細胞が含む改変タンパク質の量を計算することができる。 If the labeled protein portion is a fluorescent protein, the labeled protein portion can be measured by measuring fluorescence using a known measurement device such as a fluorescence microscope, a spectrofluorophotometer, or a fluorescence plate reader. Fluorescence may be confirmed visually through a fluorescence microscope or the like. Also, signal intensity can be obtained based on optical information from fluorescence. Acquisition of signal intensity is as described above. Based on the measurements obtained, the amount of modified protein that the cells contain can be calculated.
改変タンパク質中の標識タンパク質部分の測定と、免疫染色による改変タンパク質中のタグペプチドの測定との両方を行ってもよい。免疫染色の測定に加えて標識タンパク質部分の測定を行うことで、細胞が含む改変タンパク質の量と、細胞膜に移行した改変タンパク質の量の両方についての値を得ることができる。これにより、改変タンパク質の細胞膜への移行を評価することができる。例えば、細胞が含む改変タンパク質の量で、細胞膜に移行した改変タンパク質の量を除算することで、細胞内の改変タンパク質のうち、どれだけの量が細胞膜に移行したのかを示す比を算出することができる。 Both measurement of the labeled protein portion in the modified protein and measurement of the tag peptide in the modified protein by immunostaining may be performed. By measuring the labeled protein portion in addition to the measurement of immunostaining, it is possible to obtain values for both the amount of the modified protein contained in the cells and the amount of the modified protein translocated to the cell membrane. This allows evaluation of translocation of the modified protein to the cell membrane. For example, by dividing the amount of the modified protein translocated to the cell membrane by the amount of the modified protein contained in the cell, a ratio indicating how much of the intracellular modified protein translocated to the cell membrane can be calculated. can be done.
細胞をフローサイトメータに供してもよい。フローサイトメータを用いることで、細胞集団中の個々の細胞それぞれから光学的な情報を得ることができる。フローサイトメータとしては、例えば、フローサイトメータ、イメージングフローサイトメータなどが挙げられる。イメージングフローサイトメータは、CCDカメラなどの撮像部を備えたフローサイトメータであり、液中を流れる細胞の画像を取得可能な装置である。より具体的には、イメージングフローサイトメータは、数秒から数分の短時間に、数千個から数百万個の細胞のそれぞれから蛍光による光学的な情報や蛍光画像を取得できる。取得した画像を処理することにより、１つ１つの細胞の情報を抽出したり、定量的な情報を取得したりできる。フローサイトメータの光源としては、特に限定されず、蛍光物質の励起に好適な波長の光源を適宜選択できる。例えば、青色半導体レーザー、赤色半導体レーザー、アルゴンレーザー、He-Neレーザー、水銀アークランプなどが用いられる。 Cells may be subjected to a flow cytometer. Optical information can be obtained from each individual cell in a cell population using a flow cytometer. Flow cytometers include, for example, flow cytometers and imaging flow cytometers. An imaging flow cytometer is a flow cytometer equipped with an imaging unit such as a CCD camera, and is a device capable of acquiring images of cells flowing in liquid. More specifically, the imaging flow cytometer can acquire fluorescent optical information and fluorescent images from each of thousands to millions of cells in a short period of time from several seconds to several minutes. By processing the acquired images, it is possible to extract information on individual cells or obtain quantitative information. The light source for the flow cytometer is not particularly limited, and a light source with a wavelength suitable for exciting fluorescent substances can be selected as appropriate. For example, blue semiconductor lasers, red semiconductor lasers, argon lasers, He-Ne lasers, mercury arc lamps and the like are used.
フローサイトメータを用いる際は、細胞は固定せずに免疫染色を行ってもよい。細胞を固定せずにフローサイトメータに供すことで、細胞にダメージを与えずに、生きた細胞の情報を取得することができる。 When using a flow cytometer, immunostaining may be performed without fixing the cells. By subjecting the cells to the flow cytometer without fixing them, information on living cells can be obtained without damaging the cells.
本実施形態の方法によって、脂肪酸トランスポーターの細胞内移行に関わる分子についての情報を取得することができる。例えば、脂肪酸トランスポーターがCD36である改変タンパク質のトランスフェクション時に、CD36の細胞内移行に関わる分子を加える事によって、該分子による細胞内移行への影響を測定することができる。分子がタンパク質であれば、改変タンパク質のトランスフェクション時に、そのタンパク質を発現できるベクターも共にトランスフェクションすることで、２つのタンパク質を細胞内で同時に発現させることで、改変タンパク質の細胞内移行についての影響を測定することができる。 The method of the present embodiment makes it possible to obtain information on molecules involved in intracellular translocation of fatty acid transporters. For example, by adding a molecule involved in intracellular translocation of CD36 at the time of transfection of a modified protein whose fatty acid transporter is CD36, the influence of the molecule on intracellular translocation can be measured. If the molecule is a protein, by simultaneously transfecting a vector capable of expressing the protein at the time of transfection of the modified protein, the two proteins are simultaneously expressed in the cell, and the influence on the intracellular translocation of the modified protein. can be measured.
(改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター)
別の実施形態は、改変タンパク質をコードするベクターである。ベクターとしては、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み込むことができる公知の核酸ベクターであれば特に限定されない。ベクターは、導入する細胞種に応じて、細胞内でタンパク質が発現するようにプロモーターなどを適切に設計したタンパク質発現用ベクターであってもよいし、単なるキャリアーとしてのベクターであってもよい。改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むタンパク質発現用ベクターを細胞に導入することで、細胞内で改変タンパク質を発現させ、上記方法に用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド又は人工染色体ベクターなどが挙げられる。ベクターには、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチド以外にも、例えば複製起点や、薬剤耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドなど、改変タンパク質以外のタンパク質がコードされてもよい。
(Vector Containing Polynucleotide Encoding Modified Protein)
Another embodiment is a vector encoding the variant protein. The vector is not particularly limited as long as it is a known nucleic acid vector into which a polynucleotide encoding a modified protein can be incorporated. The vector may be a protein expression vector in which a promoter or the like is appropriately designed so that the protein is expressed in cells, or a simple carrier vector, depending on the type of cell to be introduced. By introducing a protein expression vector containing a polynucleotide encoding a modified protein into a cell, the modified protein can be expressed in the cell and used in the above method. Vectors include, for example, plasmids, cosmids, phagemids, artificial chromosome vectors, and the like. Vectors may encode proteins other than modified proteins, such as polynucleotides encoding replication origins and drug resistance genes, in addition to polynucleotides that encode modified proteins.
改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当業者において公知の技術によって取得することができる。例えば、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを直接合成して得てもよいし、脂肪酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドに、タグペプチドをコードするポリヌクレオチドと標識タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドを組み込むことでも取得することができる。脂肪酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドに、タグペプチドをコードするポリヌクレオチドと標識タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドとを組み込む方法は、当業者において公知のDNA組み換え技術を用いて行うことができる。公知のDNA組み換え技術としては、例えば、サブクローニング法やシームレスクローニング法によって行うことができる。シームレスクローニング法は、繋ぎたいDNA断片同士のそれぞれの末端に、15塩基程度のDNA相同領域を持たせることで、DNA断片を接続する技術である。 Polynucleotides encoding variant proteins can be obtained by techniques known to those skilled in the art. For example, a polynucleotide encoding a modified protein may be obtained by direct synthesis, or a polynucleotide encoding a tag peptide and a polynucleotide encoding a labeled protein portion may be incorporated into a polynucleotide encoding a fatty acid transporter. can be obtained. A method for incorporating a polynucleotide encoding a tag peptide and a polynucleotide encoding a labeling protein portion into a polynucleotide encoding a fatty acid transporter can be performed using DNA recombination techniques known to those skilled in the art. Examples of known DNA recombination techniques include subcloning and seamless cloning. The seamless cloning method is a technique for connecting DNA fragments by providing a DNA homologous region of about 15 bases at each end of the DNA fragments to be connected.
細胞以外にも、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、例えば大腸菌、酵母、放線菌、藻類、乳酸菌、枯草菌等の微生物に導入されていてもよい。例えば、ベクターが、導入する微生物内で複製可能なプラスミドであれば、大腸菌や酵母に導入することで、上記ベクターを簡便に製造することができる。 Besides cells, vectors containing polynucleotides encoding modified proteins may be introduced into microorganisms such as Escherichia coli, yeast, actinomycetes, algae, lactic acid bacteria, and Bacillus subtilis. For example, if the vector is a plasmid that can be replicated in the microorganism to be introduced, the vector can be easily produced by introducing it into Escherichia coli or yeast.
(改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞)
別の実施形態は、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞である。宿主となる細胞は特に限定されず、上記の細胞を用いることができる。宿主となる細胞は、改変タンパク質に対応する脂肪酸トランスポーターを欠損している、あるいは極めて発現量が弱い細胞であることが好ましい。
(Cells Containing a Vector Containing a Polynucleotide Encoding a Modified Protein)
Another embodiment is a cell containing a vector comprising a polynucleotide encoding a variant protein. The host cells are not particularly limited, and the above cells can be used. The host cell is preferably a cell that lacks the fatty acid transporter corresponding to the modified protein, or that expresses the fatty acid transporter at an extremely low level.
(脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析用試薬)
別の実施形態は、脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析用試薬である。分析用試薬は、改変タンパク質をコードするベクターと、リガンドとを少なくとも含む。改変タンパク質をコードするベクターとリガンドについては上述の通りである。改変タンパク質をコードするベクターやリガンドは、溶液の状態であってもよいし、乾燥状態であってもよい。分析用試薬には、改変タンパク質をコードするベクターやリガンドなどを懸濁、希釈するための溶媒が別途含まれていてもよい。そのような溶媒としては、例えば、水、生理食塩水、PBS、Tris-HCl、グッドバッファーなどの水性媒体が挙げられる。本実施形態の分析用試薬は、通常、容器に収容されてユーザに提供される。試薬を収容した容器は、箱又は袋に入れられてユーザに提供されてもよい。箱又は袋には、試薬の使用方法などを記載した添付文書を同梱してもよい。
(Reagent for analysis of intracellular dynamics of fatty acid transporters)
Another embodiment is a reagent for the analysis of intracellular dynamics of fatty acid transporters. The analytical reagent contains at least a vector encoding a modified protein and a ligand. Vectors encoding modified proteins and ligands are described above. A vector encoding a modified protein and a ligand may be in a solution state or in a dry state. The analytical reagent may separately contain a solvent for suspending and diluting the vector encoding the modified protein, the ligand, and the like. Such solvents include, for example, aqueous media such as water, saline, PBS, Tris-HCl, Good's buffer and the like. The analytical reagent of the present embodiment is usually provided to the user in a container. The container containing the reagent may be provided to the user in a box or bag. The box or bag may include a package insert describing how to use the reagent.
本実施形態の分析用試薬は、トランスフェクション試薬をさらに含んでいてもよい。トランスフェクション法については、上述の通りであり、それぞれ用いるトランスフェクション法に応じて、適切な試薬が分析用試薬に含まれていてもよい。例えば、トランスフェクション法が、リポフェクション法であれば、分析用試薬にDOTAP(N-[1-(2,3-ジオレオイロキシ)プロピル]-N,N,N,-トリメチルアンモニウムメチルサルフェート)などのカチオン性脂質が含まれていてもよく、リン酸カルシウム共沈法であれば、分析用試薬に塩化カルシウムが含まれていてもよく、DEAE-デキストラン法であれば、分析用試薬にジエチルアミノエチル-デキストランが含まれていてもよい。 The analytical reagent of this embodiment may further contain a transfection reagent. The transfection method is as described above, and suitable reagents may be included in the analytical reagents depending on the transfection method used. For example, if the transfection method is the lipofection method, the analytical reagent is a cationic compound such as DOTAP (N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N,-trimethylammonium methylsulfate). Lipids may be included, calcium chloride may be included in the analytical reagent for the calcium phosphate coprecipitation method, and diethylaminoethyl-dextran may be included in the analytical reagent for the DEAE-dextran method. may be
本実施形態の分析用試薬は、改変タンパク質のタグペプチドを捕捉する抗体を含んでもよい。また、抗体は標識されていてもよい。抗体については上述の通りである。抗体の形態は特に限定されず、固体(例えば粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。抗体と標識は、一体化していてもよいし、別々であってもよい。別々であるなら、抗体と標識とを結合させる試薬を更に含んでいてもよい。抗体は、改変タンパク質のタグペプチドを捕捉する１次抗体のみであってもよいし、１次抗体を捕捉する二次抗体を含んでもよい。また、抗体を結合させた後の未結合の抗体を除去するための洗浄液を含んでもよい。洗浄液としては、例えば、生理食塩水、PBS、Tris-HCl、グッドバッファーなどが挙げられる。 The analytical reagent of this embodiment may contain an antibody that captures the tag peptide of the modified protein. Also, the antibody may be labeled. Antibodies are described above. The form of the antibody is not particularly limited, and may be solid (eg, powder, crystal, freeze-dried product, etc.) or liquid (eg, solution, suspension, emulsion, etc.). The antibody and label may be integrated or separate. If separate, it may further comprise a reagent that binds the antibody and the label. The antibody may be only a primary antibody that captures the tag peptide of the modified protein, or may contain a secondary antibody that captures the primary antibody. It may also contain a washing solution for removing unbound antibody after antibody binding. Washing solutions include, for example, physiological saline, PBS, Tris-HCl, Good's buffer and the like.
本実施形態の分析用試薬は、細胞を固定するための固定液が含まれていてもよい。細胞を固定することにより、刺激後の細胞の状態を保持することができる。固定液については、上述の通りである。 The analysis reagent of this embodiment may contain a fixative for fixing cells. By fixing the cells, the state of the cells after stimulation can be maintained. The fixative is as described above.
(被検物質のスクリーニング方法)
別の実施形態は、改変タンパク質を用いる被検物質のスクリーニング方法である。本実施形態の改変タンパク質は、刺激によって、細胞膜へと移行する。この性質を利用して、改変タンパク質を発現した細胞に被験物質を加え、改変タンパク質が細胞膜へと移行するかどうかを、改変タンパク質のタグペプチドを測定することによって確認することができる。例えば、測定によってタグペプチドが検出された場合、被検物質が脂肪酸トランスポーターを細胞膜に移行させるリガンドであると判定することができる。別の例では、被検物質と共に刺激を加える事で、測定によってタグペプチドが検出された場合、刺激によって細胞膜の状態が変化することで被検物質が受容体と結合し、脂肪酸トランスポーターが細胞膜へと移行したと判定することができる。また、測定によってタグペプチドが検出されなかった場合、被検物質が脂肪酸トランスポーターを細胞膜に移行させるリガンドではない、又は該細胞はリガンドに対する受容体が存在しないと判定することができる。改変タンパク質や該改変タンパク質の測定、刺激については、上述のとおりである。
(Screening method for test substance)
Another embodiment is a method of screening an analyte using a modified protein. The modified protein of this embodiment translocates to the cell membrane upon stimulation. Using this property, a test substance can be added to cells expressing the modified protein, and whether or not the modified protein translocates to the cell membrane can be confirmed by measuring the tag peptide of the modified protein. For example, when a tag peptide is detected by measurement, it can be determined that the test substance is a ligand that translocates the fatty acid transporter to the cell membrane. In another example, by adding a stimulus together with the test substance, when the tag peptide is detected by measurement, the test substance binds to the receptor due to the change in the state of the cell membrane due to the stimulus, and the fatty acid transporter is activated in the cell membrane. It can be determined that the transition to Moreover, when the tag peptide is not detected by the measurement, it can be determined that the test substance is not a ligand that translocates the fatty acid transporter to the cell membrane, or that the cell does not have a receptor for the ligand. The modified protein and the measurement and stimulation of the modified protein are as described above.
被験物質としては、例えば、アミノ酸、糖、核酸、金属イオン、ペプチド、神経伝達物質又はホルモンなどの生理活性物質などが挙げられるが特に限定されない。 Examples of test substances include, but are not limited to, physiologically active substances such as amino acids, sugars, nucleic acids, metal ions, peptides, neurotransmitters, and hormones.
(受容体の分析方法)
別の実施形態は、改変タンパク質を用いる受容体の分析方法である。本実施形態の改変タンパク質は、リガンドによる細胞刺激によって、細胞膜へと移行する。この性質を利用して、細胞の受容体について評価することができる。例えば、ある受容体(受容体Aとする)に特異的に結合することで、脂肪酸トランスポーターを細胞膜に移行させることが予め分かっているリガンドを準備して、その受容体Aについて調べたい細胞で改変タンパク質を発現させ、リガンドを添加する。リガンドを添加した後の細胞のタグペプチドを測定し、タグペプチドを検出できれば、その細胞は受容体Aを有していることがわかる。逆に、タグペプチドを検出できなければ、その細胞は受容体Aを有していないことが分かる。
(Receptor analysis method)
Another embodiment is a method of analyzing receptors using modified proteins. The modified protein of this embodiment translocates to the cell membrane by cell stimulation with a ligand. This property can be used to evaluate cellular receptors. For example, by preparing a ligand that is known to translocate a fatty acid transporter to the cell membrane by specifically binding to a certain receptor (receptor A), you want to examine the receptor A in the cell. The modified protein is expressed and ligand is added. If the tag peptide is measured in the cell after addition of the ligand and the tag peptide is detected, the cell is found to have the receptor A. Conversely, if the tag peptide cannot be detected, the cell does not have receptor A.
別の例では、受容体Aを有した細胞の受容体Aを欠損させる実験を行った後、その細胞に対して改変タンパク質を発現させ、リガンドを添加する。リガンドを添加した後の細胞のタグペプチドを測定することで、細胞の受容体Aが欠損したかどうかを確認することができる。 In another example, after performing an experiment in which receptor A is deleted in a cell having receptor A, the modified protein is expressed in the cell and a ligand is added. By measuring the tag peptide of the cells after addition of the ligand, it is possible to confirm whether or not the receptor A of the cells is deficient.
さらに別の例では、受容体Aを有し、改変タンパク質を発現させた細胞において、リガンドと共に被検物質を添加する。被検物質の添加によって、リガンドのみを加えたときに比べて改変タンパク質の細胞膜移行量が低下した場合、被検物質はリガンドと受容体の結合に対して競合阻害を起こしたことが分かる。
このように、本発明の改変タンパク質を用いることで、対応する受容体について評価することができる。
In yet another example, the test substance is added along with the ligand in cells that have receptor A and have expressed the modified protein. When the addition of the test substance reduces the amount of translocation of the modified protein to the cell membrane compared to the addition of the ligand alone, it is found that the test substance competitively inhibits the binding of the ligand and the receptor.
Thus, the corresponding receptor can be evaluated using the modified protein of the present invention.
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明はなんら制限されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited in any way.
実施例１ 改変タンパク質の発現確認
以下の実験では、改変タンパク質を発現させるためのベクターを作製して細胞に導入し、改変タンパク質が細胞内で発現するかどうかを確認した。
Example 1 Confirmation of Expression of Modified Protein In the following experiment, a vector for expressing the modified protein was prepared and introduced into cells to confirm whether or not the modified protein was expressed in the cells.
(1)脂肪酸トランスポーター改変タンパク質発現ベクターの作製1
シームレスクローニング法を用い、複数のDNA断片を組み合わせてクローニングし、改変タンパク質を細胞内で発現させるためのベクターを作製した。用いたDNA断片としては、pCAGGSベクター(配列番号１４)を制限酵素XhoIで処理したpCAGGSベクター断片と、インサート断片としてCD36断片(1-360)(CD36の1～360番目の塩基配列部分：配列番号１５)、Myc配列を9つ連続してつなげた9-Myc断片(配列番号１６)、CD36断片(361-472)(CD36の361～472番目の塩基配列部分：配列番号１７)及びGFPタンパク質を改変したEGFP断片(配列番号１８)を用いた。各インサート断片は、pCAGGSベクター断片に、各インサート断片が図２Ａのように組み込まれるようにDNA相同領域を調整した。以下の表１の量の各DNA断片と、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社)とを用いて、シームレスクローニング法を行い、脂肪酸トランスポーターであるCD36を用いた改変タンパク質発現ベクターpCAGGS-CD36-9myc-EGFPを作製した。作製したpCAGGS-CD36-9myc-EGFPは、コンピテントセル(E.coli DH5α)へと導入して保存した。
(1) Preparation of fatty acid transporter modified
Using the seamless cloning method, multiple DNA fragments were combined and cloned to construct a vector for intracellular expression of the modified protein. The DNA fragments used were a pCAGGS vector fragment obtained by treating the pCAGGS vector (SEQ ID NO: 14) with a restriction enzyme XhoI, and a CD36 fragment (1-360) as an insert fragment (1-360th base sequence of CD36: SEQ ID NO: 15), a 9-Myc fragment (SEQ ID NO: 16) in which 9 Myc sequences are continuously connected, a CD36 fragment (361-472) (the 361st to 472nd nucleotide sequence of CD36: SEQ ID NO: 17), and a GFP protein. A modified EGFP fragment (SEQ ID NO: 18) was used. The DNA homologous region of each insert fragment was adjusted so that each insert fragment was incorporated into the pCAGGS vector fragment as shown in FIG. 2A. A seamless cloning method was performed using each DNA fragment in the amount shown in Table 1 below and an In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.), and a modified protein expression vector pCAGGS-CD36 using the fatty acid transporter CD36 was obtained. -9myc-EGFP was produced. The prepared pCAGGS-CD36-9myc-EGFP was introduced into competent cells (E. coli DH5α) and stored.
(2)改変タンパク質発現ベクターの作製2
(1)のCD36の代わりに、脂肪酸トランスポーターであるFATP1を用いた改変タンパク質発現ベクターを作製した。用いたDNA断片としては、pCAGGSベクター断片と、インサート断片としてMyc配列を7つ連続してつなげた7-Myc断片(配列番号１９)、FATP1断片(配列番号２０)、及びEGFP断片を用いた。各インサート断片は、pCAGGSベクター断片に、図２Ｂのように組み込まれるように調整した。以下の表２の量の各DNA断片と、In-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社)とを用いて、シームレスクローニング法を行い、脂肪酸トランスポーターであるCD36を用いた改変タンパク質発現ベクターpCAGGS-7myc-FATP1-EGFPを作製した。作製したpCAGGS-7myc-FATP1-EGFPは、コンピテントセル(E.coli DH5α)へと導入して保存した。
(2) Production of modified
In place of CD36 in (1), we constructed a modified protein expression vector using FATP1, a fatty acid transporter. The DNA fragments used were a pCAGGS vector fragment, and as an insert fragment, a 7-Myc fragment (SEQ ID NO: 19) in which 7 Myc sequences were continuously linked, a FATP1 fragment (SEQ ID NO: 20), and an EGFP fragment. Each insert fragment was adjusted to be incorporated into the pCAGGS vector fragment as shown in FIG. 2B. A seamless cloning method was performed using each DNA fragment in the amount shown in Table 2 below and an In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.), and a modified protein expression vector pCAGGS-7myc using the fatty acid transporter CD36 was obtained. -FATP1-EGFP was generated. The prepared pCAGGS-7myc-FATP1-EGFP was introduced into competent cells (E. coli DH5α) and stored.
(3) ラット由来筋芽培養細胞L6細胞での改変タンパク質の発現確認
作製した上記改変タンパク質発現ベクターを細胞に導入し、細胞内で発現するかどうかを確認した。細胞としては、ラット由来筋芽培養細胞L6細胞(以下L6細胞とも呼ぶ)を用いた。L6細胞は、DMEM(+/+)培地(富士フイルム和光純薬社)、5%CO2存在下、37℃の条件で培養した。L6細胞を24ウェルプレートに播種し、一晩培養した。
(3) Confirmation of Modified Protein Expression in Rat-derived Myoblast Cultured L6 Cells The modified protein expression vector prepared above was introduced into cells, and it was confirmed whether or not it was expressed in the cells. Rat-derived myoblast cultured cell L6 cells (hereinafter also referred to as L6 cells) were used as cells. L6 cells were cultured in DMEM(+/+) medium (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in the presence of 5% CO 2 at 37°C. L6 cells were seeded in 24-well plates and cultured overnight.
血清及び抗生物質を含まないOPTI-MEM培地(Thermo Fisher Scientific社)に、0.5μgのpCAGGS-CD36-9myc-EGFP又はpCAGGS-7myc-FATP1-EGFPを加え、更に、Lipofectamine 3000(Thermo Fishere Scientific社)をメーカーの手順書に従い加え、トランスフェクション試薬とした。 0.5 μg of pCAGGS-CD36-9myc-EGFP or pCAGGS-7myc-FATP1-EGFP was added to serum- and antibiotic-free OPTI-MEM medium (Thermo Fisher Scientific), and Lipofectamine 3000 (Thermo Fishere Scientific). was added according to the manufacturer's protocol to serve as the transfection reagent.
L6細胞を培養後の上記24ウェルプレートから培地を除去し、1×PBSで洗浄後、上記2種のトランスフェクション試薬のどちらかを添加し、5%CO2存在下、37℃にて48時間インキュベーションした。 Remove the medium from the 24-well plate after culturing L6 cells, wash with 1×PBS, add either of the above two transfection reagents, and perform at 37°C for 48 hours in the presence of 5% CO 2 . incubated.
トランスフェクション後のL6細胞を1×PBSで2回洗浄した後、4%(v/v) PFA/PBSにて、5分間処理しL6細胞を固定した。固定後、1×PBSでL6細胞を3回洗浄し、50%(v/v) glycerol/1×PBSを用いて封入した。細胞の観察は蛍光顕微鏡BZ-8100（キーエンス）を用いて行い、EGFPの蛍光を測定した。 After the L6 cells after transfection were washed twice with 1×PBS, they were treated with 4% (v/v) PFA/PBS for 5 minutes to fix the L6 cells. After fixation, the L6 cells were washed three times with 1×PBS and mounted using 50% (v/v) glycerol/1×PBS. Cells were observed using a fluorescence microscope BZ-8100 (Keyence) to measure EGFP fluorescence.
pCAGGS-CD36-9myc-EGFPをトランスフェクションしたL6細胞を観察した結果を図３Ａに、pCAGGS-7myc-FATP1-EGFPをトランスフェクションしたL6細胞を観察した結果を図３Ｂにそれぞれ示した。図３Ａ及び図３Ｂ中の「未処理」はトランスフェクションを行っていないL6細胞を観察したものである。図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、作製したベクターにより、改変タンパク質を細胞で発現できることが示された。 The results of observing L6 cells transfected with pCAGGS-CD36-9myc-EGFP are shown in FIG. 3A, and the results of observing L6 cells transfected with pCAGGS-7myc-FATP1-EGFP are shown in FIG. 3B. "Untreated" in FIGS. 3A and 3B is the observation of L6 cells without transfection. As shown in Figures 3A and 3B, the engineered vectors were shown to be capable of expressing the modified proteins in cells.
(4) 3T3-L1成熟脂肪細胞への改変タンパク質発現ベクターの導入
上記L6細胞とは別に、導入する細胞を3T3-L1成熟脂肪細胞(以下、3T3-L1細胞とも呼ぶ)に変え、上記(3)と同様に作製した上記改変タンパク質発現ベクターpCAGGS-CD36-9myc-EGFPを細胞に導入した。特に限定がなければ、DMEM(+/+)培地、5%CO2存在下、37℃の条件で培養した。2×105個の3T3-L1細胞をOPTI-MEMで懸濁し、細胞懸濁液へpCAGGS-CD36-9myc-EGFPを300μg添加し、混合した。この混合溶液をキュベット電極へ移したのち、下記表３の条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、混合溶液に10%ウシ胎児血清含有DMEM培地を加え、72時間インキュベーションし、pCAGGS-CD36-9myc-EGFPをトランスフェクションした3T3-L1細胞を作製した。
(4) Introduction of modified protein expression vector into 3T3-L1 mature adipocytes Separately from the L6 cells, the cells to be introduced are changed to 3T3-L1 mature adipocytes (hereinafter also referred to as 3T3-L1 cells), and the above (3 ) was introduced into cells with the modified protein expression vector pCAGGS-CD36-9myc-EGFP. Unless otherwise specified, the cells were cultured at 37°C in the presence of DMEM(+/+) medium and 5% CO 2 . 2×10 5 3T3-L1 cells were suspended in OPTI-MEM, and 300 μg of pCAGGS-CD36-9myc-EGFP was added to the cell suspension and mixed. After transferring this mixed solution to a cuvette electrode, electroporation was performed under the conditions shown in Table 3 below. After electroporation, DMEM medium containing 10% fetal bovine serum was added to the mixed solution and incubated for 72 hours to prepare 3T3-L1 cells transfected with pCAGGS-CD36-9myc-EGFP.
実施例２ 改変タンパク質の細胞膜移行の検討
作製した4種のトランスフェクション細胞を用い、インスリン刺激による改変タンパク質の細胞膜移行について検討した。細胞膜移行の確認は、免疫染色法を用いて行った。
Example 2 Examination of Translocation of Modified Protein to Cell Membrane Using four types of transfected cells prepared, translocation of modified protein to cell membrane by insulin stimulation was examined. Confirmation of cell membrane translocation was performed using an immunostaining method.
(インスリン刺激)
細胞を1×PBSで2回洗浄後、血清、抗生物質を含まないDMEMで5時間培養し、細胞を飢餓状態とした。培地を除去し、100 nMのインスリンを添加した血清、抗生物質を含まないDMEM培地を加え、45分間インキュベーションした。
(insulin stimulation)
After washing the cells twice with 1×PBS, the cells were starved by culturing in serum- and antibiotic-free DMEM for 5 hours. The medium was removed and serum, antibiotic-free DMEM medium supplemented with 100 nM insulin was added and incubated for 45 minutes.
(免疫染色)
インキュベーション後、細胞を1×PBSで2回洗浄した。洗浄後の細胞に4%(v/v) PFA/PBSを添加し、室温で15分間置いて細胞を固定した。固定後、細胞を1×PBSで3回洗浄した。洗浄後の細胞に2%(v/v) 正常ヤギ血清(NGS)/1×PBSを添加し、室温で30分間ブロッキングした。ブロッキング後、2%(v/v) NGS/1×PBSを除去し、細胞に500倍希釈した抗Myc抗体(マウス由来モノクローナル抗体、クローン4A6 : Merck Millipore社)を加え、4℃で一晩反応させた。反応後、細胞を1×PBSで3回洗浄し、1,000倍希釈した二次抗体(CF(登録商標)543 Dye標識抗マウスIgG抗体 : Biotium社)を加え、遮光下で室温、1時間反応させた。その後、細胞を1×PBSTで3回洗浄し、50%(v/v) glycerol/1×PBSで封入した。細胞の観察は蛍光顕微鏡BZ-8100を用いて行った。
(immunostaining)
After incubation, cells were washed twice with 1×PBS. 4% (v/v) PFA/PBS was added to the washed cells and left at room temperature for 15 minutes to fix the cells. After fixation, cells were washed three times with 1×PBS. 2% (v/v) normal goat serum (NGS)/1×PBS was added to the washed cells and blocked at room temperature for 30 minutes. After blocking, remove 2% (v/v) NGS/1×PBS, add 500-fold diluted anti-Myc antibody (mouse-derived monoclonal antibody, clone 4A6: Merck Millipore) to the cells, and react overnight at 4°C. let me After the reaction, the cells were washed three times with 1×PBS, a 1,000-fold diluted secondary antibody (CF (registered trademark) 543 Dye-labeled anti-mouse IgG antibody: Biotium) was added, and the reaction was allowed to proceed for 1 hour at room temperature in the dark. rice field. Cells were then washed three times with 1×PBST and mounted with 50% (v/v) glycerol/1×PBS. Cells were observed using a fluorescence microscope BZ-8100.
(画像解析)
細胞膜に移行した改変タンパク質と細胞内の全改変タンパク質のシグナル強度の比(Myc/GFP)を、画像解析ソフトImage Jを用いて評価した。Mycタグのシグナル強度の値は、細胞膜の改変タンパク質の量を示し、GFPのシグナル強度の値は、細胞内の全改変タンパク質の量を示す。統計学的解析のため、6個の細胞の値を用いてt検定を行った。
(image analysis)
The signal intensity ratio (Myc/GFP) of the modified protein translocated to the cell membrane and the total intracellular modified protein was evaluated using image analysis software Image J. The Myc tag signal intensity value indicates the amount of the modified protein in the cell membrane, and the GFP signal intensity value indicates the amount of all intracellular modified proteins. For statistical analysis, a t-test was performed using values from 6 cells.
トランスフェクションしたL6細胞に対してインスリン刺激を行った結果を図４Ａ及び図５Ａに示した。さらに、画像解析によって細胞膜に移行した改変タンパク質と細胞内の全改変タンパク質のシグナル強度の比を測定した結果を図４Ｂ及び図５Ｂに示した。図４Ａ及び図４ＢはpCAGGS-CD36-9myc-EGFPを導入したL6細胞、図５Ａ及び図５ＢはpCAGGS-7myc-FATP1-EGFPを導入したL6細胞をそれぞれ示している。図４Ａ及び図５Ａより、インスリン刺激により、改変タンパク質が細胞表面に移行したことが確認された。図４Ｂ及び図５Ｂより、取得した画像のGFPとMycタグのシグナル強度の比から、改変タンパク質の細胞膜への移行が定量的に評価でき、インスリン刺激後の細胞とインスリン未刺激の細胞と比べると、細胞膜への改変タンパク質の移行量の間に有意な差があることが示された。 The results of insulin stimulation of transfected L6 cells are shown in FIGS. 4A and 5A. Furthermore, FIG. 4B and FIG. 5B show the results of measuring the signal intensity ratio of the modified protein transferred to the cell membrane and the total intracellular modified protein by image analysis. Figures 4A and 4B show pCAGGS-CD36-9myc-EGFP-introduced L6 cells, and Figures 5A and 5B show pCAGGS-7myc-FATP1-EGFP-introduced L6 cells, respectively. From FIGS. 4A and 5A, it was confirmed that the modified protein translocated to the cell surface by insulin stimulation. From FIGS. 4B and 5B, the transfer of the modified protein to the cell membrane can be quantitatively evaluated from the ratio of the signal intensity of the GFP and Myc tags in the acquired images. , indicated that there was a significant difference between the amount of translocation of the modified protein to the cell membrane.
トランスフェクションした3T3-L1細胞についても、L6細胞に対して行ったのと同様のインスリン刺激試験を行った結果を図６Ａ、及び図６Ｂにそれぞれ示した(画像解析に用いた細胞数は10個)。図６Ａ及び図６ＢはpCAGGS-CD36-9myc-EGFPを導入した3T3-L1細胞を示している。これらの結果より、3T3-L1細胞についてもL6細胞と同様にインスリン刺激により、改変タンパク質が細胞表面に移行したことが確認され、取得した画像のGFPとMycタグのシグナル強度の比から、改変タンパク質の細胞膜への移行が定量的に評価でき、インスリン刺激後の細胞とインスリン未刺激の細胞と比べると、細胞膜への改変タンパク質の移行量の間に有意な差があることが示された。 The transfected 3T3-L1 cells were also subjected to the same insulin stimulation test as the L6 cells, and the results are shown in FIGS. 6A and 6B (10 cells were used for image analysis. ). Figures 6A and 6B show 3T3-L1 cells transfected with pCAGGS-CD36-9myc-EGFP. From these results, it was confirmed that the modified protein was translocated to the cell surface by insulin stimulation in 3T3-L1 cells as well as in L6 cells. translocation to the cell membrane could be quantitatively evaluated, and it was shown that there was a significant difference in the amount of translocation of the modified protein to the cell membrane when compared with insulin-stimulated cells and non-insulin-stimulated cells.
実施例３ 改変タンパク質の生体組織への導入
作製した2種の改変タンパク質発現ベクターを生体組織へと導入した。マウスと、生体導入用溶液(pCAGGS-CD36-9myc-EGFP又はpCAGGS-7myc-FATP1-EGFPを80μg含む生理食塩水) mlを準備し、マウスの皮下脂肪組織に生体導入用溶液を注入した(図７参照)。注入後、生体導入用溶液を注入した皮下脂肪組織部分に電流が流れるように端子を取り付け(図８参照)、以下の表４の条件でエレクトロポレーションを行い、マウスの皮下脂肪組織中の白色脂肪細胞に改変タンパク質発現ベクターを導入した。
Example 3 Introduction of Modified Proteins into Biological Tissues The two prepared modified protein expression vectors were introduced into biological tissues. Mice and a solution for bioinduction (physiological saline containing 80 μg of pCAGGS-CD36-9myc-EGFP or pCAGGS-7myc-FATP1-EGFP) were prepared, and the solution for bioinduction was injected into the subcutaneous adipose tissue of the mouse (Fig. 7). After the injection, a terminal was attached so that a current could flow through the subcutaneous fat tissue into which the solution for bioinduction was injected (see FIG. 8), and electroporation was performed under the conditions shown in Table 4 below. A modified protein expression vector was introduced into adipocytes.
エレクトロポレーション後のマウスに対して通常の飼育を５日間行った後、12時間マウスを絶食させた。絶食後、マウスを安楽殺し、改変タンパク質発現ベクターを導入した皮下脂肪組織中の白色脂肪細胞の一部を切除し、インスリン未刺激細胞とした。一方、絶食後、マウスの尾静脈に、インスリン溶液(インスリンを35.1 μg/kg (1 U/kg)を含む生理食塩水)を投与し、45分間インスリン刺激を行ったマウスから改変タンパク質発現ベクターを導入した皮下脂肪組織中の白色脂肪細胞の一部を切除し、インスリン刺激細胞とした。 After the electroporated mice were fed normally for 5 days, the mice were fasted for 12 hours. After fasting, the mice were euthanized, and white adipocytes in the subcutaneous adipose tissue into which the modified protein expression vector had been introduced were excised and used as non-insulin-stimulated cells. On the other hand, after fasting, an insulin solution (physiological saline containing 35.1 μg/kg (1 U/kg) of insulin) was administered to the tail vein of the mouse, and the modified protein expression vector was produced from the mice that were stimulated with insulin for 45 minutes. A portion of white adipocytes in the introduced subcutaneous adipose tissue was excised and used as insulin-stimulated cells.
これらのインスリン未刺激細胞及びインスリン刺激細胞を小片に裁断した後、実施例２と同様に免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡(オリンパス社)を用いて観察し、改変タンパク質の細胞膜表面への移行を観察した。 These insulin-unstimulated cells and insulin-stimulated cells were cut into small pieces, immunostained in the same manner as in Example 2, and observed using a confocal laser microscope (Olympus) to determine the migration of the modified protein to the cell membrane surface. observed.
2種の改変タンパク質発現ベクターを導入したマウスの結果をそれぞれ図９及び図１０に示した。図９はpCAGGS-CD36-9myc-EGFPを導入したマウスの結果を、図１０はpCAGGS-7myc-FATP1-EGFPを導入したマウスの結果をそれぞれ示した。図９及び図１０より、インスリン刺激により細胞表面に蛍光が観察され、インスリン刺激によって改変タンパク質が細胞膜へと移行したことが示された。 The results of mice into which two types of modified protein expression vectors were introduced are shown in FIGS. 9 and 10, respectively. FIG. 9 shows the results of pCAGGS-CD36-9myc-EGFP-introduced mice, and FIG. 10 shows the results of pCAGGS-7myc-FATP1-EGFP-introduced mice. 9 and 10, it was shown that fluorescence was observed on the cell surface upon insulin stimulation, and that the modified protein translocated to the cell membrane upon insulin stimulation.
Claims (25)
前記細胞膜に移行した改変タンパク質を測定する工程と
を含み、前記改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含む、
脂肪酸トランスポーターの細胞内動態の分析方法。 a step of stimulating a cell expressing a fatty acid transporter modified protein to translocate the modified protein to the cell membrane;
and measuring the modified protein translocated to the cell membrane, wherein the modified protein comprises a labeled protein moiety in the intracellular domain of the fatty acid transporter and at least one tag peptide in the extracellular domain.
A method for analyzing intracellular dynamics of fatty acid transporters.
前記細胞を固定する工程と、
前記固定した細胞を、タグペプチドと結合する抗体を用いて免疫染色する工程と
を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。 The measuring step includes
fixing the cells;
and immunostaining the fixed cells with an antibody that binds to the tag peptide.
前記脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に存在する標識タンパク質部分、及び
前記脂肪酸トランスポーターの細胞外領域に存在する少なくとも１つのタグペプチド
からなる脂肪酸トランスポーター改変タンパク質を有する組換え細胞。 fatty acid transporter,
A recombinant cell having a modified fatty acid transporter protein consisting of a tag protein moiety present in the intracellular domain of said fatty acid transporter and at least one tag peptide present in the extracellular domain of said fatty acid transporter.
前記細胞における改変タンパク質のタグペプチドを測定する工程と、
前記測定工程においてタグペプチドが検出された場合、前記被検物質が脂肪酸トランスポーターを細胞膜に移行させるリガンドであると判定する工程と
を含み、
前記改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含む、被検物質のスクリーニング方法。 adding a test substance to cells expressing a modified fatty acid transporter protein;
measuring the tag peptide of the modified protein in the cell;
determining that the test substance is a ligand that translocates the fatty acid transporter to the cell membrane when the tag peptide is detected in the measuring step;
A method of screening a test substance, wherein the modified protein contains a labeling protein portion in the intracellular domain of the fatty acid transporter and at least one tag peptide in the extracellular domain.
前記細胞を刺激する工程と、
前記細胞における改変タンパク質のタグペプチドを測定する工程と、
前記測定工程においてタグペプチドが検出された場合、刺激によって細胞膜の状態が変化することで被検物質が受容体と結合し、脂肪酸トランスポーターが細胞膜へと移行したと判定する工程と
を含み、
前記改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含む、被検物質のスクリーニング方法。 adding a test substance to cells expressing a modified fatty acid transporter protein;
stimulating the cells;
measuring the tag peptide of the modified protein in the cell;
Determining that when the tag peptide is detected in the measuring step, the test substance binds to the receptor due to the change in the state of the cell membrane due to the stimulation, and the fatty acid transporter is transferred to the cell membrane;
A method of screening a test substance, wherein the modified protein contains a labeling protein portion in the intracellular domain of the fatty acid transporter and at least one tag peptide in the extracellular domain.
前記細胞における改変タンパク質のタグペプチドを測定する工程と、
を含み、
前記改変タンパク質が、脂肪酸トランスポーターの細胞内領域に標識タンパク質部分を含み、かつ細胞外領域に少なくとも１つのタグペプチドを含み、
前記測定工程における測定値によって、前記細胞の受容体を評価することを含む、受容体の分析方法。 adding a ligand to the cell expressing the fatty acid transporter-modified protein;
measuring the tag peptide of the modified protein in the cell;
including
said engineered protein comprises a tag protein moiety in the intracellular domain of the fatty acid transporter and at least one tag peptide in the extracellular domain;
A method of analyzing a receptor, comprising evaluating the receptor of the cell based on the values measured in the measuring step.
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