JP2022127433A - Media used for direct transdifferentiation of macrophages into neurons and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、マクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地及びその使用に関する。具体的には、本発明は、マクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地、並びに、前記培地を用いた神経細胞の製造方法及びマクロファージを神経細胞に直接分化転換する方法に関する。 The present invention relates to media and uses thereof for direct transdifferentiation of macrophages into nerve cells. Specifically, the present invention relates to a medium used for directly transdifferentiating macrophages into nerve cells, a method for producing nerve cells using the medium, and a method for directly transdifferentiating macrophages into nerve cells.
体細胞を、多能性幹細胞を経ずに特定の分化細胞に直接転換することを「ダイレクトリプログラミング」と呼び、近年、このダイレクトリプログラミングは、基礎研究、創薬及び再生医療における新たな潮流として研究開発が盛んに行われている。 Direct conversion of somatic cells into specific differentiated cells without going through pluripotent stem cells is called "direct reprogramming", and in recent years this direct reprogramming has become a new trend in basic research, drug discovery and regenerative medicine. Research and development is actively carried out as
例えば、非特許文献１～３には、アストロサイトや線維芽細胞等の体細胞から神経細胞へ直接分化転換したことが報告されている。
For example, Non-Patent
一方、マクロファージは遊走作用を有する。当該作用により、例えば、脳梗塞急性期等において、マクロファージは病巣へと集積する。この集積したマクロファージを生体内で神経細胞へダイレクトリプログラミングすることができれば、新しい神経再生医療の可能性が拡がる。 On the other hand, macrophages have a migratory action. Due to this action, macrophages accumulate in lesions, for example, in the acute phase of cerebral infarction. If these accumulated macrophages can be directly reprogrammed into nerve cells in vivo, the possibility of new nerve regenerative medicine will expand.
しかしながら、マクロファージから神経細胞へ直接分化転換した報告はこれまでにない。 However, there have been no reports of direct transdifferentiation from macrophages to neurons.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、マクロファージを神経細胞に直接分化転換するための培地、並びに、前記培地を用いた神経細胞の製造方法及びマクロファージを神経細胞に直接分化転換する方法を提供する。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a medium for directly transdifferentiating macrophages into nerve cells, a method for producing nerve cells using the medium, and direct transdifferentiation of macrophages into nerve cells. provide a way to
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） マクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地であって、
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤を含む、培地。
（２） 前記ＰＵ．１阻害剤がＤＢ２３１３である、（１）に記載の培地。
（３） 前記ＰＵ．１阻害剤の含有量が培地の総容積に対して０．１μｍｏｌ／Ｌ超１μｍｏｌ／Ｌ未満である、（１）又は（２）に記載の培地。
（４） 前記神経分化誘導因子がＩＳＸ－９である、（１）～（３）のいずれか一つに記載の培地。
（５） 前記培地は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤を更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載の培地。
（６） グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤を含む培地を用いて、マクロファージを培養して神経細胞に直接分化転換する分化転換工程を含む、神経細胞の製造方法。
（７） マクロファージを神経細胞に直接分化転換する方法であって、
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤を含む培地を用いて、マクロファージを培養して神経細胞に直接分化転換する分化転換工程を含む、方法。
That is, the present invention includes the following aspects.
(1) A medium used to directly transdifferentiate macrophages into nerve cells, comprising:
(2) the PU. (1), wherein the A.1 inhibitor is DB2313.
(3) the PU. The medium according to (1) or (2), wherein the content of 1 inhibitor is more than 0.1 μmol/L and less than 1 μmol/L relative to the total volume of the medium.
(4) The medium according to any one of (1) to (3), wherein the neuronal differentiation-inducing factor is ISX-9.
(5) The medium according to any one of (1) to (3), further comprising an AMP-activated protein kinase inhibitor.
(6)
(7) A method for directly transdifferentiating macrophages into nerve cells, comprising:
上記態様の培地によれば、マクロファージを神経細胞に直接分化転換するための培地を提供することができる。上記態様の製造方法によれば、マクロファージから直接分化転換した神経細胞を製造することができる。上記態様の方法によれば、マクロファージを神経細胞に直接分化転換することができる。 According to the medium of the above aspect, it is possible to provide a medium for directly transdifferentiating macrophages into nerve cells. According to the production method of the above aspect, nerve cells directly transdifferentiated from macrophages can be produced. According to the method of the above aspect, macrophages can be directly transdifferentiated into nerve cells.
＜マクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地＞
本実施形態のマクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地（以下、単に「本実施形態の培地」と称する）は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤（ＧＳＫ３阻害剤）、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤を含む。
<Medium used for direct transdifferentiation of macrophages into nerve cells>
The medium used for directly transdifferentiating the macrophages of the present embodiment into nerve cells (hereinafter simply referred to as "the medium of the present embodiment") contains
本実施形態の培地は、上記構成を有することで、マクロファージを神経細胞に直接分化転換することができる。
なお、本明細書において、「直接分化転換する」とは、体細胞を、多能性幹細胞を経ずに特定の分化細胞に直接転換することを意味し、「ダイレクトリプログラミングする」と同義で用いられる。
The culture medium of the present embodiment can directly transdifferentiate macrophages into nerve cells by having the above structure.
As used herein, the term "direct transdifferentiation" means that somatic cells are directly converted into specific differentiated cells without passing through pluripotent stem cells, and is synonymous with "direct reprogramming." Used.
これまでの報告から、線維芽細胞やアストロサイトを、特定の組成を有する培地を用いて培養することで、化学的に神経細胞へとダイレクトリプログラミングすることは可能であった。しかしながら、これら細胞で用いられている培地をそのままマクロファージに適用しても、神経細胞へとダイレクトリプログラミングすることはできなかった。これは、化学的にダイレクトリプログラミングするために求められる成分又は因子は、原料となる体細胞の種類によって大きく異なり、マクロファージから神経細胞へとダイレクトリプログラミングするために適切な成分又は因子がこれまで判明していなかったためであると考えられる。 From previous reports, it was possible to chemically reprogram fibroblasts and astrocytes directly into neurons by culturing them in a medium with a specific composition. However, even if the medium used for these cells was directly applied to macrophages, direct reprogramming into nerve cells was not possible. This is because the components or factors required for chemical direct reprogramming vary greatly depending on the type of somatic cells used as raw materials, and there have been no suitable components or factors for direct reprogramming from macrophages to neurons. This is probably because it was not clear.
これに対して、発明者らは、マクロファージの数ある特性及びマーカー遺伝子の中から、転写因子であるＰＵ．１に着目し、ＰＵ．１阻害剤を用いることでマクロファージが本来有する特性の発現を抑制でき、当該特性の発現を抑制することが、効率的にマクロファージを神経細胞へと直接分化転換するために有効であることを見出した。さらに、マクロファージが神経細胞へと直接分化転換するために有効な最小限の成分として、ＰＵ．１阻害剤に加えて、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、及び神経分化誘導因子の組み合わせが有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
In contrast, the inventors identified the transcription factor PU. 1, PU. 1 inhibitor can suppress the expression of the properties that macrophages inherently have, and that suppressing the expression of the properties is effective for efficiently transdifferentiating macrophages directly into nerve cells. . Furthermore, PU. 1 inhibitor, a
以下、本実施形態の培地に含まれる各成分について詳細を説明する。 Each component contained in the medium of the present embodiment will be described in detail below.
［ＰＵ．１阻害剤］
ＰＵ．１は、顆粒球、単球及びＢリンパ球において発現しており、これら細胞系列の分化に必須の転写因子であることが知られている。そのため、マクロファージにおけるＰＵ．１の発現又は機能を抑制することで、マクロファージが本来有する特性が発揮されることを抑制することができる。これにより、効率的にマクロファージを神経細胞へと直接分化転換することができる。
[PU. 1 inhibitor]
PU. 1 is expressed in granulocytes, monocytes and B lymphocytes, and is known to be a transcription factor essential for the differentiation of these cell lineages. Therefore, PU. By suppressing the expression or function of 1, it is possible to suppress the manifestation of the properties originally possessed by macrophages. This allows efficient direct transdifferentiation of macrophages into nerve cells.
すなわち、ＰＵ．１阻害剤としては、ＰＵ．１の発現又は機能を阻害できるものであれば特に限定されない。ＰＵ．１阻害剤として具体的には、例えば、低分子化合物、ＰＵ．１発現阻害剤、ＰＵ．１特異的結合物質等が挙げられる。中でも、ＰＵ．１阻害剤としては、低分子化合物であることが好ましい。 That is, PU. 1 inhibitors include PU. It is not particularly limited as long as it can inhibit the expression or function of 1. PU. 1 inhibitors include, for example, low-molecular-weight compounds, PU. 1 expression inhibitor, PU. 1 specific binding substance and the like. Among them, PU. 1 inhibitor is preferably a low-molecular-weight compound.
ＰＵ．１阻害剤である低分子化合物としては、例えば、ＤＢ１９７６（ＣＡＳ番号：２３６９６６３－９３－２）、ＤＢ２１１５（ＣＡＳ番号：１３６６２３１－７０－０）、ＤＢ２３１３（ＣＡＳ番号：２１７０６０６－７４－１）が挙げられる。中でも、ＤＢ２３１３が好ましい。 PU. Examples of low-molecular-weight compounds that are 1 inhibitors include DB1976 (CAS number: 2369663-93-2), DB2115 (CAS number: 1366231-70-0), and DB2313 (CAS number: 2170606-74-1). be done. Among them, DB2313 is preferable.
ＰＵ．１発現阻害剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸等が挙げられる。これらのＰＵ．１発現阻害剤を投与することにより、ＰＵ．１の発現量を低下させて、マクロファージが本来有する特性が発揮されることを抑制することができる。その結果、効率的にマクロファージを神経細胞へと直接分化転換することができる。 PU. 1 expression inhibitors include, for example, siRNA, shRNA, miRNA, ribozymes, antisense nucleic acids and the like. These PU. By administering an inhibitor of PU.1 expression, PU. By reducing the expression level of 1, it is possible to suppress the manifestation of the inherent properties of macrophages. As a result, macrophages can be efficiently transdifferentiated directly into nerve cells.
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１塩基対以上２３塩基対以下の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。 siRNA (small interfering RNA) is a small double-stranded RNA of 21 to 23 base pairs used for gene silencing by RNA interference. siRNAs introduced into cells bind to the RNA-induced silencing complex (RISC). This complex binds and cleaves mRNA having a sequence complementary to the siRNA. This suppresses gene expression in a sequence-specific manner.
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、９０℃以上９５℃以下程度で約１分程度変性させた後、３０℃以上７０℃以下程度で約１時間以上８時間以下アニーリングさせることにより調製することができる。 siRNA is prepared by synthesizing sense strand and antisense strand oligonucleotides with an automatic DNA/RNA synthesizer, and denaturing them in an appropriate annealing buffer at 90° C. or higher and 95° C. or lower for about 1 minute. C. to 70.degree. C. for about 1 hour to 8 hours.
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。 siRNAs, shRNAs, miRNAs, ribozymes and antisense nucleic acids may contain various chemical modifications to improve their stability and activity. For example, phosphate residues may be substituted with chemically modified phosphate residues such as phosphorothioates (PS), methylphosphonates, phosphorodithionates, etc., to prevent degradation by hydrolases such as nucleases. Moreover, at least a part thereof may be composed of a nucleic acid analogue such as a peptide nucleic acid (PNA).
ＰＵ．１特異的結合物質としては、ＰＵ．１に特異的に結合してＰＵ．１の機能を阻害するものが挙げられ、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に、ＰＵ．１タンパク質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。或いは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、市販の抗体であってもよい。 PU. As one specific binding substance, PU. 1 by binding specifically to PU. 1, such as antibodies, antibody fragments, aptamers, and the like. Antibodies can be administered, for example, to animals such as mice, PU. 1 protein or a fragment thereof as an antigen. Alternatively, it can be generated, for example, by screening a phage library. Antibody fragments include Fv, Fab, scFv and the like. Preferably, said antibody is a monoclonal antibody. Alternatively, it may be a commercially available antibody.
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。 An aptamer is a substance that has specific binding ability to a target substance. Aptamers include nucleic acid aptamers, peptide aptamers, and the like. Nucleic acid aptamers having specific binding ability to target peptides can be selected by, for example, the systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method. Peptide aptamers having specific binding ability to the target peptide can be selected by, for example, the two-hybrid method using yeast.
培地中のＰＵ．１阻害剤の濃度は、培地の総容積に対して、０．１μｍｏｌ／Ｌ超１μｍｏｌ／Ｌ（以下、「ｍｏｌ／Ｌ」をＭと略記する）未満であることが好ましく、０．１５μＭ以上０．９５μＭ以下であることがより好ましく、０．２μＭ以上０．９μＭ以下であることがさらに好ましく、０．３μＭ以上０．７μＭ以下であることが特に好ましく、０．３５μＭ以上０．６５μＭ以下であることが最も好ましい。
培地中のＰＵ．１阻害剤の濃度が上記下限値以上であることで、より効果的にＰＵ．１の発現又は機能を抑制することができる。一方で、上記上限値以下であることで、ＰＵ．１阻害剤の細胞に対する毒性をより抑えて、細胞生存率をより向上させることができる。
PU. The concentration of 1 inhibitor is preferably more than 0.1 µmol/L and less than 1 µmol/L (hereinafter, "mol/L" is abbreviated as M) relative to the total volume of the medium, and 0.15 µM or more and 0 It is more preferably 0.95 μM or less, further preferably 0.2 μM or more and 0.9 μM or less, particularly preferably 0.3 μM or more and 0.7 μM or less, and 0.35 μM or more and 0.65 μM or less. is most preferred.
PU. 1 inhibitor concentration is at least the above lower limit, the PU. 1 expression or function can be suppressed. On the other hand, being equal to or less than the upper limit, PU. The cell viability can be further improved by suppressing the toxicity of the 1 inhibitor to the cells.
［ＧＳＫ３阻害剤］
ＧＳＫ３阻害剤を用いることで、Ｗｎｔシグナル伝達を促進することができ、その結果、神経細胞への分化転換を促進することができる。
[GSK3 inhibitor]
By using a GSK3 inhibitor, Wnt signaling can be promoted, and as a result, transdifferentiation into nerve cells can be promoted.
ＧＳＫ３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ番号：１４２２７３－２０－９）、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ、ＣＡＳ番号：６６７４６３－６２－９）等が挙げられる。中でも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。 GSK3 inhibitors include CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9), Kenpaullone (CAS number: 142273-20-9), 6-bromoindirubin-3'-oxime (BIO, CAS number: 667463-62-9) etc. Among them, CHIR99021 is preferable.
培地中のＧＳＫ３阻害剤の濃度は、培地の総容積に対して、通常、０．１μＭ以上１０μＭ以下であり、０．５μＭ以上７μＭ以下であることが好ましく、１μＭ以上５μＭ以下であることがより好ましく、２μＭ以上４μＭ以下であることがさらに好ましい。
培地中のＧＳＫ３阻害剤の濃度が上記下限値以上であることで、ＧＳＫ３阻害剤が奏する効果をより発揮することができる。一方で、上記上限値以下であることで、ＧＳＫ３阻害剤の細胞に対する毒性をより抑えて、細胞生存率をより向上させることができる。
The concentration of the GSK3 inhibitor in the medium is usually 0.1 μM or more and 10 μM or less, preferably 0.5 μM or more and 7 μM or less, more preferably 1 μM or more and 5 μM or less, relative to the total volume of the medium. It is preferably 2 μM or more and 4 μM or less, more preferably.
When the concentration of the GSK3 inhibitor in the medium is equal to or higher than the above lower limit, the effects of the GSK3 inhibitor can be exhibited more effectively. On the other hand, when it is equal to or less than the above upper limit, the toxicity of the GSK3 inhibitor to cells can be further suppressed, and the cell viability can be further improved.
［アデニル酸シクラーゼ活性化剤］
アデニル酸シクラーゼ活性化剤は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤とも呼ばれる。
アデニル酸シクラーゼ活性化剤を用いることで、ＡＭＰの細胞内濃度を高めて、アデニル酸シクラーゼを活性化することができ、その結果、神経細胞への分化転換を促進することができる。
[Adenylate cyclase activator]
Adenylate cyclase activators are also called MAP kinase inhibitors.
By using an adenylate cyclase activator, the intracellular concentration of AMP can be increased to activate adenylate cyclase, and as a result, transdifferentiation into nerve cells can be promoted.
アデニル酸シクラーゼ活性化剤としては、例えば、フォルスコリン（ＣＡＳ番号：６６５７５－２９－９）等が挙げられる。 Adenylate cyclase activators include, for example, forskolin (CAS number: 66575-29-9) and the like.
培地中のアデニル酸シクラーゼ活性化剤の濃度は、培地の総容積に対して、通常、０．１μＭ以上１００μＭ以下であり、１μＭ以上５０μＭ以下であることが好ましく、５μＭ以上１５μＭ以下であることがより好ましく、８μＭ以上１２μＭ以下であることがさらに好ましい。
培地中のアデニル酸シクラーゼ活性化剤の濃度が上記下限値以上であることで、アデニル酸シクラーゼ活性化剤が奏する効果をより発揮することができる。一方で、上記上限値以下であることで、アデニル酸シクラーゼ活性化剤の細胞に対する毒性をより抑えて、細胞生存率をより向上させることができる。
The concentration of the adenylate cyclase activator in the medium is usually 0.1 μM or more and 100 μM or less, preferably 1 μM or more and 50 μM or less, and 5 μM or more and 15 μM or less, relative to the total volume of the medium. More preferably, it is 8 μM or more and 12 μM or less.
When the concentration of the adenylate cyclase activator in the medium is equal to or higher than the above lower limit, the effects of the adenylate cyclase activator can be exhibited more effectively. On the other hand, when it is equal to or less than the above upper limit, the toxicity of the adenylate cyclase activator to cells can be further suppressed, and the cell viability can be further improved.
［ＲＯＣＫ阻害剤］
ＲＯＣＫ阻害剤を用いることで、細胞のアポトーシスを抑制し、細胞生存率を高く保つことができる。
[ROCK inhibitor]
By using a ROCK inhibitor, cell apoptosis can be suppressed and a high cell viability can be maintained.
ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１４６９８６－５０－７）、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｙ３９９８３（ＣＡＳ番号：２０３９１１－２６－６）、Ｗｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、ＳＬｘ－２１１９（ＣＡＳ番号：９１１４１７－８７－３）、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン（Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ）（ＣＡＳ番号：８５０６６４－２１－０）、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ（ＣＡＳ番号：８７２５４３－０７－６）、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤（ＲＯＫα ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンーカルボキシアミド（４－（１－ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ）、Ｒｈｏスタチン（Ｒｈｏｓｔａｉｎ）、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、ＶＡＳ－０１２等が挙げられる。中でも、Ｙ－２７６３２が好ましい。 Examples of ROCK inhibitors include Y-27632 (CAS number: 146986-50-7), Fasudil (CAS number: 105628-07-7), Y39983 (CAS number: 203911-26-6), Wf -536 (CAS Number: 539857-64-2), SLx-2119 (CAS Number: 911417-87-3), Azabenzimidazole-aminofurazans (CAS Number: 850664-21-0), DE- 104, H-1152P (CAS number: 872543-07-6), Rho kinase α inhibitor (ROKα inhibitor), XD-4000, HMN-1152, 4-(1-aminoalkyl)-N-(4-pyridyl) Cyclohexane-carboxamides (4-(1-aminoalkyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexane-carboxamides), Rho statin (Rhostain), BA-210, BA-207, Ki-23095, VAS-012, etc. . Among them, Y-27632 is preferable.
培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、培地の総容積に対して、通常、０．１μＭ以上１００μＭ以下であり、１μＭ以上５０μＭ以下であることが好ましく、５μＭ以上１５μＭ以下であることがより好ましく、８μＭ以上１２μＭ以下であることがさらに好ましい。
培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度が上記下限値以上であることで、ＲＯＣＫ阻害剤が奏する効果をより発揮することができる。一方で、上記上限値以下であることで、ＲＯＣＫ阻害剤の細胞に対する毒性をより抑えて、細胞生存率をより向上させることができる。
The concentration of the ROCK inhibitor in the medium is usually 0.1 μM or more and 100 μM or less, preferably 1 μM or more and 50 μM or less, more preferably 5 μM or more and 15 μM or less, relative to the total volume of the medium. More preferably, it is 8 μM or more and 12 μM or less.
When the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is equal to or higher than the above lower limit, the effects of the ROCK inhibitor can be exhibited more effectively. On the other hand, when it is equal to or less than the above upper limit, the toxicity of the ROCK inhibitor to cells can be further suppressed, and the cell viability can be further improved.
［神経分化誘導因子］
神経分化誘導因子を用いることで、電位依存性カルシウムチャネルやＮＭＤＡ受容体に作用し、カルシウムの流入を促進させ、ｎｅｕｒｏＤ遺伝子の発現を亢進することで、神経分化を促進することができる。
[Neural differentiation inducer]
By using a neuronal differentiation-inducing factor, it is possible to promote neuronal differentiation by acting on voltage-gated calcium channels and NMDA receptors, promoting calcium influx, and enhancing expression of the neuroD gene.
神経分化誘導因子としては、例えば、イソキサゾール９（ＩＳＸ－９）（ＣＡＳ番号：８３２１１５－６２－５）等が挙げられる。 Examples of neuronal differentiation inducers include isoxazole 9 (ISX-9) (CAS number: 832115-62-5) and the like.
培地中の神経分化誘導因子の濃度は、培地の総容積に対して、通常、０．１μＭ以上１０μＭ未満であり、１μＭ以上９μＭ以下であることが好ましく、２．５μＭ以上７．５μＭ以下であることがより好ましく、２．７μＭ以上５μＭ以下であることがさらに好ましい。
培地中の神経分化誘導因子の濃度が上記下限値以上であることで、神経分化誘導因子が奏する効果をより発揮することができる。一方で、上記上限値以下であることで、神経分化誘導因子の細胞に対する毒性をより抑えて、細胞生存率をより向上させることができる。
The concentration of the neuronal differentiation-inducing factor in the medium is usually 0.1 μM or more and less than 10 μM, preferably 1 μM or more and 9 μM or less, and 2.5 μM or more and 7.5 μM or less, relative to the total volume of the medium. more preferably 2.7 μM or more and 5 μM or less.
When the concentration of the neuronal differentiation-inducing factor in the medium is equal to or higher than the above lower limit, the effect of the neuronal differentiation-inducing factor can be exhibited more effectively. On the other hand, when it is equal to or less than the above upper limit, the toxicity of the neuronal differentiation-inducing factor to cells can be further suppressed, and the cell viability can be further improved.
［ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤］
本実施形態の培地は、上記成分に加えて、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤を更に含むことが好ましい。本実施形態の培地は、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤を更に含むことで、より効率的にマクロファージを神経細胞に直接分化転換することができる。
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤は、ＢＭＰ経路阻害剤とも呼ばれる。
[AMP-activated protein kinase inhibitor]
The medium of the present embodiment preferably further contains an AMP-activated protein kinase inhibitor in addition to the above components. By further containing an AMP-activated protein kinase inhibitor, the medium of the present embodiment can more efficiently transdifferentiate macrophages directly into nerve cells.
AMP-activated protein kinase inhibitors are also called BMP pathway inhibitors.
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤としては、例えば、ドルソモルフィン（ＣＡＳ番号：８６６４０５－６４－３）、コーディン（ヒトにおけるＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１２９１４０１．１、ＮＰ＿００１２９１４０２．１、ＮＰ＿００１２９１４０３．１、ＮＰ＿００３７３２．２等）、ノギン（ヒトにおけるＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００５４４１．１等）、フォリスタチン（ヒトにおけるＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００６３４１．１、ＮＰ＿０３７５４１．１等）、（６－［４－（２－ピペリジン－１－イル－エトキシ）フェニル］－３－ピリジン－４－イル－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン）、ＤＭＨ１（４－［６－（４－イソプロポキシフェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン、４－［６－［４－（１－メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］－キノリン）、ＬＤＮ１９３１８９、（４－（６－（４－（ピペリジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン）が挙げられる。中でも、ドルソモルフィンが好ましい。 Examples of AMP-activated protein kinase inhibitors include dorsomorphin (CAS number: 866405-64-3), chordin (human Genbank accession number: NP_001291401.1, NP_001291402.1, NP_001291403.1, NP_003732.2, etc.). ), Noggin (Genbank Accession Number in Human: NP_005441.1 etc.), Follistatin (Genbank Accession Number in Human: NP_006341.1, NP_037541.1 etc.), (6-[4-(2-piperidine-1- yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine), DMH1 (4-[6-(4-isopropoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine- 3-yl]quinoline, 4-[6-[4-(1-methylethoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline), LDN193189, (4-(6-(4 -(piperidin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline). Among them, Dorsomorphin is preferred.
培地中のＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤の濃度は、培地の総容積に対して、通常、０．５μＭ以上１０μＭ以下であり、０．７５μＭ以上５μＭ以下であることが好ましく、１μＭ以上３μＭ以下であることがより好ましい。 The concentration of the AMP-activated protein kinase inhibitor in the medium is usually 0.5 μM or more and 10 μM or less, preferably 0.75 μM or more and 5 μM or less, and 1 μM or more and 3 μM or less, relative to the total volume of the medium. It is more preferable to have
［その他成分］
本実施形態の培地は、成長因子、神経生物系サプリメント、培地サプリメント、血清、血清代替物、抗菌剤、並びにインスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質等をさらに含有することができる。培地中のこれら成分の濃度は、公知の文献等を参酌して、当業者が適宜設定することができる。
[Other ingredients]
The medium of this embodiment can further contain growth factors, neurobiological supplements, medium supplements, serum, serum substitutes, antibacterial agents, serum-derived proteins such as insulin and albumin, and the like. The concentrations of these components in the medium can be appropriately determined by those skilled in the art by referring to known literature.
成長因子としては、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトフィン４／５等のニュートロフィンファミリー；グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等が挙げられる。
Growth factors include, for example, nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin 3 (NT3), neurotrophin family such as
神経生物系サプリメントとしては、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インシュリン及びトランスフェリンを含むＢ２７サプリメント（サーモフィッシャー社製品名）；並びにヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、プロゲステロン、プトレシン、及び亜セレン酸ナトリウムを含むＮ２サプリメント等が挙げられる。 Neurobiological supplements include biotin, cholesterol, linoleic acid, linolenic acid, progesterone, putrescine, retinol, retinyl acetate, sodium selenite, triiodothyronine (T3), DL-α-tocopherol (vitamin E), albumin. , B27 supplement (Thermo Fisher product name) containing insulin and transferrin; and N2 supplement containing human transferrin, bovine insulin, progesterone, putrescine, and sodium selenite.
培地サプリメントとしては、例えば、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン酸から得たジペプチドを含有する「ＧｌｕｔａＭａｘシリーズ」（サーモフィッシャー社製品名）等のグルタミン酸含有サプリメント、「ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（サーモフィッシャー社製品名）等のアミノ酸水溶液、２－メルカプトエタノール等が挙げられる。 Examples of medium supplements include L-glutamic acid, glutamic acid-containing supplements such as "GlutaMax series" (Thermo Fisher's product name) containing dipeptides obtained from L-glutamic acid, and "MEM Non-Essential Amino Acids Solution" (Thermo Fisher company product name), 2-mercaptoethanol, and the like.
抗菌剤としては、例えば、ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ニューキノロン系抗生物質等が挙げられる。 Antibacterial agents include, for example, penicillin antibiotics, cephem antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, fosfomycin antibiotics, aminoglycoside antibiotics, new quinolone antibiotics, and the like.
なお、本実施形態の培地は、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェニルアセチル－Ｌ―アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシン ｔｅｒｔ－ブチルエステル（ＤＡＰＴ）（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）等のγ－セクレターゼ阻害剤、及び、ＲｅｐＳｏｘ（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）等のＴＧＦ－β受容体阻害剤を含まないことが好ましい。
従来、これら成分は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の各種幹細胞の神経細胞への分化誘導を促進するのに有効な成分であると報告されている。しかしながら、本実施形態の培地は、これら成分を含まないことで、より効率的にマクロファージを神経細胞に直接分化転換することができる。
The medium of the present embodiment contains N-[N-(3,5-difluorophenylacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine tert-butyl ester (DAPT) (CAS number: 208255-80-5). It preferably does not contain γ-secretase inhibitors such as TGF-β receptor inhibitors such as RepSox (CAS number: 446859-33-2).
Conventionally, these components have been reported to be effective components for promoting differentiation induction of various stem cells such as ES cells and iPS cells into nerve cells. However, since the medium of the present embodiment does not contain these components, it is possible to directly transdifferentiate macrophages into nerve cells more efficiently.
［基礎培地］
本実施形態の培地は、上述した成分を基礎培地に添加して調製することができる。
[basal medium]
The medium of this embodiment can be prepared by adding the components described above to the basal medium.
基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ １５無血清リンパ球培地（Ｌｏｎｚａ社製）、及びＮｅｕｒｏＢａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社製）；これらの混合培地の培地；これらの培地から神経分化に関する成分を低減した培地等が挙げられる。 Examples of basal media include BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, αMEM medium, DMEM medium, F-12. Medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, X-VIVO ™ 15 serum-free lymphocyte medium (manufactured by Lonza), and NeuroBasal Medium (manufactured by Gibco); medium of the mixed medium of the above; and medium in which components related to neuronal differentiation are reduced from these medium.
＜神経細胞の製造方法＞
本実施形態の神経細胞の製造方法（以下、単に「本実施形態の製造方法」と称する）は、ＧＲＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤を含む培地を用いて、マクロファージを培養して神経細胞に直接分化転換する分化転換工程を含む。
<Method for producing nerve cells>
The method for producing nerve cells of the present embodiment (hereinafter simply referred to as the “production method of the present embodiment”) comprises the steps of using a GRK3 inhibitor, an adenylate cyclase activator, a ROCK inhibitor, a neuronal differentiation-inducing factor, and PU. It includes a transdifferentiation step in which macrophages are cultured and transdifferentiated directly into neural cells using medium containing the No. 1 inhibitor.
本実施形態の製造方法によれば、マクロファージから直接分化転換した神経細胞を製造することができる。すなわち、本実施形態の製造方法は、マクロファージを神経細胞に直接分化転換（ダイレクトリプログラミング）する方法ということもできる。 According to the production method of the present embodiment, nerve cells directly transdifferentiated from macrophages can be produced. That is, the production method of this embodiment can also be said to be a method of directly transdifferentiating macrophages into nerve cells (direct reprogramming).
本実施形態の製造方法を構成する工程について以下に詳細を説明する。 Details of the steps constituting the manufacturing method of the present embodiment will be described below.
［分化転換工程］
分化転換工程では、上述した成分を含む培地を用いて、マクロファージを培養して神経細胞に直接分化転換する。
[Transdifferentiation step]
In the transdifferentiation step, macrophages are cultured and directly transdifferentiated into nerve cells using a medium containing the components described above.
培地の組成については、上記「マクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地」に記載のとおりである。 The composition of the medium is as described above in "Medium used for direct transdifferentiation of macrophages into nerve cells".
培養期間は、通常、１日間以上であり、３日間以上１４日間以下であるが好ましく、５日間以上９日間以下であることがより好ましい。 The culture period is usually 1 day or more, preferably 3 days or more and 14 days or less, more preferably 5 days or more and 9 days or less.
培養温度は、通常、３０℃以上５０℃以下であり、３２℃以上４５℃以下であることが好ましく、３４℃以上４０℃以下であることがより好ましい。 The culture temperature is usually 30° C. or higher and 50° C. or lower, preferably 32° C. or higher and 45° C. or lower, and more preferably 34° C. or higher and 40° C. or lower.
培養容器内の二酸化炭素の含有割合は、通常、１体積％以上１５体積％以下であり、２体積％以上１０体積％以下であることが好ましく、３体積％以上７体積％以下であることがより好ましい。 The content of carbon dioxide in the culture vessel is usually 1% to 15% by volume, preferably 2% to 10% by volume, and 3% to 7% by volume. more preferred.
培養容器の形態としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、スタックプレート、スピナーフラスコ、カバーガラス等の公知のものが挙げられる。 The form of the culture vessel is not particularly limited, but examples include flasks, tissue culture flasks, culture dishes (dish), tissue culture dishes, multidishes, microplates, microwell plates, multiplates, multiwell plates, and chambers. Well-known materials such as slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, microcarriers, stack plates, spinner flasks, and cover glasses can be used.
分化転換工程で用いられるマクロファージの由来となる動物種は特に限定されないが、例えば、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、霊長類等の哺乳類動物が挙げられる。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。霊長類は、霊長目に属する哺乳動物をいい、霊長類としては、キツネザル、ロリス、ツバイ等の原猿亜目と、サル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が挙げられる。中でも、ヒトであることが好ましい。 Animal species from which macrophages used in the transdifferentiation step are derived are not particularly limited, and examples thereof include mammals such as rodents, ungulates, cats, and primates. Rodents include mice, rats, hamsters, guinea pigs, and the like. Hoofed animals include pigs, cows, goats, horses, sheep, and the like. The Felida includes dogs, cats, and the like. A primate refers to a mammal belonging to the order Primate, and examples of primates include the order Prosaidea, such as lemurs, lorises, and tsubai, and the order Thypsides, such as monkeys, anthropoids, and humans. Among them, it is preferably human.
分化転換工程で用いられるマクロファージは、公知の株化細胞であってもよく、単球から分化誘導させたものとであってもよい。また、マクロファージのフェノタイプは、Ｍ１型であってもよく、Ｍ２型であってもよい。 Macrophages used in the transdifferentiation step may be a known established cell line, or may be those induced to differentiate from monocytes. In addition, the phenotype of macrophages may be M1 type or M2 type.
［その他の工程］
単球由来のマクロファージを用いる場合には、分化転換工程の前に、単球をＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）又はＭ－ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）を含む培地で培養して、単球をＭ１型又はＭ２型のフェノタイプであるマクロファージに分化誘導する（以下、「分化誘導工程」又は「マクロファージ製造工程」ともいう）。
[Other processes]
When monocyte-derived macrophages are used, the monocytes are cultured in a medium containing GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor) or M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor) before the transdifferentiation step, Monocytes are induced to differentiate into macrophages of the M1-type or M2-type phenotype (hereinafter also referred to as "differentiation-inducing step" or "macrophage-producing step").
なお、発明者らは、上記組成の培地を用いて、単球から神経細胞を直接分化転換することも試みたが、上記組成の内、特にＰＵ．１阻害剤が単球に対して高い毒性を示すことから、上記組成の培地を用いて、単球から神経細胞を直接分化転換することができないことを確認している。そのため、単球をマクロファージに分化誘導させた後に、上記組成の培地を用いて、マクロファージから神経細胞を直接分化転換する。 The inventors also attempted to directly transdifferentiate monocytes into neurons using the medium with the above composition, but among the above compositions, PU. 1 inhibitor exhibits high toxicity to monocytes, it has been confirmed that the culture medium having the above composition cannot directly transdifferentiate monocytes into nerve cells. Therefore, after inducing the differentiation of monocytes into macrophages, the medium having the above composition is used to directly transdifferentiate the macrophages into nerve cells.
分化誘導工程における培養期間、培養温度、培養容器内の二酸化炭素の含有割合、及び培養容器の形態は、上記「分化転換工程」におけるそれらと同じである。 The culturing period, culturing temperature, content of carbon dioxide in the culture vessel, and form of the culture vessel in the differentiation-inducing step are the same as those in the “transdifferentiation step” above.
単球としては、株化細胞であってもよく、動物の血液等の生体試料から単離されたものであってもよい。 Monocytes may be established cell lines, or may be those isolated from biological samples such as animal blood.
単球の培養に用いられる培地は、ＧＭ－ＣＳＦ又はＭ－ＣＳＦを基礎培地に添加することで調製するができる。基礎培地としては、上記「分化転換工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。 A medium used for culturing monocytes can be prepared by adding GM-CSF or M-CSF to a basal medium. Examples of the basal medium include those exemplified in the above “transdifferentiation step”.
単球の培養に用いられる培地は、ＧＭ－ＣＳＦ又はＭ－ＣＳＦの他に、培地サプリメント、血清、血清代替物、抗菌剤、並びにインスリン及びアルブミン等の血清由来のタンパク質等をさらに含有することができる。培地サプリメント及び抗菌剤としては、上記「分化転換工程」において例示されたものと同様のものが挙げられる。 In addition to GM-CSF or M-CSF, the medium used for culturing monocytes may further contain medium supplements, serum, serum substitutes, antibacterial agents, serum-derived proteins such as insulin and albumin, and the like. can. Examples of medium supplements and antibacterial agents include those exemplified in the above "transdifferentiation step".
また、分化転換工程の後に、得られた細胞が神経細胞であるか否かを確認するために、得られた細胞を評価してもよい（以下、「評価工程」ともいう）。 In addition, after the transdifferentiation step, the obtained cells may be evaluated in order to confirm whether the obtained cells are nerve cells (hereinafter also referred to as “evaluation step”).
評価方法としては、例えば、細胞の形態観察や、神経細胞のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現を確認すること、細胞の活動電位を測定すること等が挙げられる。 Evaluation methods include, for example, observation of cell morphology, confirmation of expression of neuronal marker genes or marker proteins, measurement of cell action potentials, and the like.
細胞の形態観察は、肉眼であってもよく、光学顕微鏡等を用いた方法であってもよい。得られた細胞が樹状突起様の構造を有する場合には、神経細胞が得られたと評価することができる。 Morphological observation of cells may be performed with the naked eye or by a method using an optical microscope or the like. When the obtained cells have a dendrite-like structure, it can be evaluated that nerve cells have been obtained.
神経細胞のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質としては、例えば、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ ３（ＴＵＪ１）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １－Ｌｉｋｅ（ＭＹＴ１Ｌ）、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １（ＡＳＣＬ１）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １（ＮｅｕｒｏＤ１）、神経特異的ＰＯＵ転写調節因子（ＢＲＮ）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ－２（ＮＧＮ２）、Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｕｃｌｅｉ（ＮＥＵＮ）等が挙げられる。マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等により評価することができる。
これら神経細胞のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現が、マクロファージにおける発現量よりも上昇している、又は、神経細胞における発現量と同程度である場合には、神経細胞が得られたと評価することができる。
Examples of neuronal marker genes or proteins include β-Tubulin 3 (TUJ1), microtubule-associated protein 2 (MAP2), doublecortin (DCX), Myelin Transcription Factor 1-Like (MYT1L), and Achaete-
If the expression of these neuronal marker genes or marker proteins is higher than the expression level in macrophages, or if the expression level is comparable to that in neurons, it can be evaluated that neurons have been obtained. can.
また、マクロファージのマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現をさらに確認してもよい。マクロファージのマーカー遺伝子又はマーカータンパク質としては、例えば、インテグリンαＭ（ＣＤ１１ｂ）、Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｉｂａ１）等が挙げられる。これらの発現の評価方法としては、神経細胞のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の評価方法と同じ方法が適用される。
これらマクロファージのマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現がマクロファージにおける発現量よりも減少している場合に、マクロファージの特性が完全に失われており、上記神経細胞のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現の結果と合わせることで、マクロファージから神経細胞へ分化転換されたと評価することができる。
In addition, the expression of a macrophage marker gene or marker protein may be further confirmed. Macrophage marker genes or marker proteins include, for example, integrin αM (CD11b), ionized calcium binding adapter protein 1 (Iba1), and the like. As a method for evaluating the expression of these, the same methods as those for evaluating neuronal marker genes or marker proteins are applied.
When the expression of these macrophage marker genes or marker proteins is lower than the expression level in macrophages, the characteristics of macrophages are completely lost, and the results are combined with the expression of the neuronal marker genes or marker proteins. Thus, transdifferentiation from macrophages to nerve cells can be evaluated.
＜その他実施形態＞
上記実施形態における培地、及び、上記実施形態における神経細胞の製造方法により得られた神経細胞は、例えば、脳梗塞や神経変性疾患等の脳神経疾患の再生医療への応用が期待される。
すなわち、一実施形態において、本発明は、上記実施形態における培地又は上記実施形態における製造方法で得られた神経細胞の有効量を、脳神経疾患の患者又は患畜に投与する、脳神経疾患の治療方法を提供する。
<Other embodiments>
The media in the above embodiments and the nerve cells obtained by the method for producing nerve cells in the above embodiments are expected to be applied to regenerative medicine for brain nerve diseases such as cerebral infarction and neurodegenerative diseases.
That is, in one embodiment, the present invention provides a method for treating cranial nerve disease, comprising administering an effective amount of nerve cells obtained by the culture medium of the above embodiment or the production method of the above embodiment to a patient or animal suffering from a cranial nerve disease. offer.
対象となる脳神経疾患としては、例えば、脳梗塞；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病等の神経変性疾患等が挙げられる。患者又は患畜としては、上記「培地」において例示された動物種が挙げられる。
神経細胞の有効量としては、対象となる脳神経疾患の治療に有効な量であって、当該疾患の種類や進行具合、患者又は患畜の体重や年齢、患者又は患畜の症状、病変部の大きさ等に応じて適宜設定することができる。
Cranial nerve diseases to be treated include, for example, cerebral infarction; neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Parkinson's disease, and Alzheimer's disease. Patients or affected animals include the animal species exemplified in the above "culture medium".
The effective amount of nerve cells is an amount that is effective for the treatment of the target cranial nerve disease, depending on the type and progress of the disease, the patient's or patient's body weight and age, the patient's or patient's symptoms, and the size of the lesion. It can be set as appropriate according to, for example.
また、脳神経疾患の病変部に集積した内在性マクロファージに対して、上記実施形態における培地に含まれる成分、具体的には、ＧＳＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤（好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、神経分化誘導因子、ＰＵ．１阻害剤、及びＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤）を直接脳神経疾患の患者又は患畜に投与することで、生体内でマクロファージから神経細胞への分化転換を誘発させる、新規の再生医療法を提供することができる。
すなわち、一実施形態において、本発明は、ＧＳＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤のそれぞれ有効量を、脳神経疾患の患者又は患畜に投与する、脳神経疾患の治療方法を提供する。
好ましくは、一実施形態において、本発明は、ＧＳＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、神経分化誘導因子、ＰＵ．１阻害剤、及びＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤のそれぞれ有効量を、脳神経疾患の患者又は患畜に投与する、脳神経疾患の治療方法を提供する。
より好ましくは、一実施形態において、本発明は、ＣＨＩＲ９９０２１、フォルスコリン、Ｙ－２７６３２、ＩＳＸ－９、ＩＳＸ－９、及びドルソモルフィンのそれぞれ有効量を、脳神経疾患の患者又は患畜に投与する、脳神経疾患の治療方法を提供する。
In addition, components contained in the medium in the above embodiment, specifically, GSK3 inhibitors, adenylate cyclase activators, ROCK inhibitors, and neuronal differentiation induction against endogenous macrophages accumulated in lesions of cranial nerve diseases factor, and PU. 1 inhibitors (preferably GSK3 inhibitors, adenylate cyclase activators, ROCK inhibitors, neuronal differentiation inducers, PU.1 inhibitors, and AMP-activated protein kinase inhibitors) directly to patients or animals with cranial nerve disease A novel regenerative medicine method that induces transdifferentiation from macrophages to nerve cells in vivo can be provided.
That is, in one embodiment, the present invention provides a GSK3 inhibitor, an adenylate cyclase activator, a ROCK inhibitor, a neuronal differentiation inducer, and PU. A therapeutic method for cranial nerve disease is provided, comprising administering an effective amount of each inhibitor to a patient or animal suffering from cranial nerve disease.
Preferably, in one embodiment, the present invention provides a GSK3 inhibitor, an adenylate cyclase activator, a ROCK inhibitor, a neuronal differentiation inducer, PU. 1 inhibitor and an AMP-activated protein kinase inhibitor in effective amounts to a patient or animal suffering from a cranial nerve disease.
More preferably, in one embodiment, the present invention provides an effective amount of each of CHIR99021, forskolin, Y-27632, ISX-9, ISX-9, and dorsomorphin to patients or animals with cranial nerve disease. A method of treating a disease is provided.
上記化合物を組み合わせたセットは、脳神経疾患の治療剤セットということもできる。
或いは、上記５種類の（好ましくは、６種類の）化合物単独又はそれら混合物を含む組成物は、脳神経疾患の治療用医薬組成物ということもできる。以降、上記５種類の（好ましくは、６種類の）化合物単独又はそれら混合物を、総称して、「脳神経疾患の治療剤」と称する場合がある。
A set in which the above compounds are combined can also be referred to as a set of therapeutic agents for cranial nerve diseases.
Alternatively, a composition containing the above five (preferably, six) compounds alone or a mixture thereof can also be called a pharmaceutical composition for treating cranial nerve diseases. Hereinafter, the above five (preferably six) compounds alone or a mixture thereof may be collectively referred to as "therapeutic agent for cranial nerve disease".
上記医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよいが、非経口的に使用される剤型が好ましい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられる。 The pharmaceutical composition may be in a dosage form for oral use or a dosage form for parenteral use, but a dosage form for parenteral use is preferred. Dosage forms for oral use include, for example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like. Dosage forms for parenteral use include, for example, injections, ointments, patches and the like.
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。 As the pharmaceutically acceptable carrier, those that are usually used for formulation of pharmaceutical compositions can be used without particular limitation. More specifically, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, and gum arabic; excipients such as starch and crystalline cellulose; swelling agents such as alginic acid; solvents for injections such as water, ethanol, and glycerin; Adhesives such as rubber-based adhesives and silicone-based adhesives are included.
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。 The pharmaceutical composition may contain additives. Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; buffers such as salts and sodium acetate; solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives and the like.
医薬組成物は、上記５種類の（好ましくは、６種類の）化合物をそれぞれ単独又はそれら混合物と、上記薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。 A pharmaceutical composition is prepared by appropriately combining any of the above five (preferably six) types of compounds alone or a mixture thereof with the above-described pharmaceutically acceptable carriers and additives, and conforming to generally accepted pharmaceutical practices. It can be formulated by compounding in unit dose form.
医薬組成物は、他の疾患の治療薬と組合せて、使用してもよい。例えば、上記脳神経疾患の治療剤を、その他の脳神経疾患の治療薬等と組み合わせて使用することで、特定の脳神経疾患の症状を改善しながら、当該脳神経疾患を治療することができる。
上記脳神経疾患の治療剤と他の薬剤とは、同一の製剤にしてもよいし、別々の製剤にしてもよい。また、各製剤は、同一の投与経路で投与してもよいし、別々の投与経路で投与してもよい。更に、各製剤は、同時に投与してもよいし、逐次的に投与してもよいし、一定の時間乃至期間を空けて別々に投与してもよい。一実施態様において、上記脳神経疾患の治療剤と他の薬剤とは、これらを包含するセット（脳神経疾患の治療剤セット）としてもよい。
Pharmaceutical compositions may be used in combination with therapeutic agents for other diseases. For example, by using the therapeutic agents for cranial nerve diseases in combination with other therapeutic agents for cranial nerve diseases, it is possible to treat specific cranial nerve diseases while improving the symptoms of the cranial nerve diseases.
The therapeutic agent for cranial nerve disease and the other drug may be prepared in the same formulation or in separate formulations. In addition, each formulation may be administered via the same administration route or via separate administration routes. Furthermore, each formulation may be administered simultaneously, sequentially, or separately with a certain time or period of time between them. In one embodiment, the therapeutic agent for cranial nerve disease and the other drug may be a set (therapeutic agent set for cranial nerve disease) including them.
患者への投与は、例えば、髄腔内注射、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行うことができる。 Administration to a patient is by methods known to those skilled in the art, for example, intrathecal injection, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intranasal, transbronchial, intramuscular, transdermal, or oral. It can be done by
各化合物の有効量としては、対象となる脳神経疾患の治療に有効な量であって、当該疾患の種類や進行具合、患者又は患畜の体重や年齢、患者又は患畜の症状、投与方法等に応じて適宜設定することができる。 The effective amount of each compound is an amount effective for the treatment of the target cranial nerve disease, depending on the type and progress of the disease, the patient's or patient's body weight and age, the patient's or patient's symptoms, the administration method, etc. can be set as appropriate.
また、一実施形態において、本発明は、上記実施形態における培地又は上記実施形態における製造方法で得られた神経細胞を被験物質と接触させる工程（以下、「工程Ｘ」ともいう）と、被験物質が神経細胞に及ぼす影響を検定する工程（以下、「工程Ｙ」ともいう）と、を有する、被験物質の薬効評価方法を提供する。 In one embodiment, the present invention includes a step of contacting the nerve cells obtained by the culture medium of the above embodiment or the production method of the above embodiment with a test substance (hereinafter also referred to as “step X”); and a step of assaying the effect of on nerve cells (hereinafter also referred to as “step Y”).
工程Ｘにおいて、被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。被験物質としては、新薬を用いることができる。 In step X, test substances include, for example, natural compound libraries, synthetic compound libraries, existing drug libraries, metabolite libraries, and the like. A new drug can be used as a test substance.
工程Ｙにおいて、被験物質が神経細胞に及ぼす影響は、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等により検定することができる。 In step Y, the effect of the test substance on nerve cells can be assayed by, for example, Western blotting, ELISA, immunostaining, and the like.
さらに、工程Ｘの前に、神経細胞を哺乳動物の脳に移植する工程（以下、「工程ｘ」ともいう）を有することができる。神経細胞が、アルツハイマー病様の病態等、特定の疾患様の病態を呈する場合に、工程ｘを有することで、より特定の疾患を罹患した生体に近い環境で被験物質の薬効を評価することができる。 Furthermore, before step X, a step of transplanting nerve cells into the brain of a mammal (hereinafter also referred to as "step x") can be included. When nerve cells exhibit a specific disease-like condition such as Alzheimer's disease-like condition, having the step x makes it possible to evaluate the efficacy of the test substance in an environment more similar to that of a living body suffering from a specific disease. can.
また、一実施形態において、本発明は、上記実施形態における培地に含まれる各成分、すなわち、ＧＳＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤（好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、神経分化誘導因子、ＰＵ．１阻害剤、及びＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ阻害剤）を備える、マクロファージを神経細胞に直接分化転換（ダイレクトリプログラミング）するための培地用サプリメント（又は、神経細胞製造用培地サプリメント）を提供する。
上記サプリメントと、上述した基礎培地と、必要に応じて、上述したその他成分と、を、マクロファージを神経細胞に直接分化転換（ダイレクトリプログラミング）するための培地キット（又は、神経細胞製造用培地キット）とすることもできる。
Further, in one embodiment, the present invention provides each component contained in the medium in the above embodiments, that is, a GSK3 inhibitor, an adenylate cyclase activator, a ROCK inhibitor, a neuronal differentiation inducer, and PU. 1 inhibitor (preferably a GSK3 inhibitor, an adenylate cyclase activator, a ROCK inhibitor, a neuronal differentiation inducer, a PU.1 inhibitor, and an AMP-activated protein kinase inhibitor), macrophages into neurons A medium supplement for direct transdifferentiation (direct reprogramming) (or a medium supplement for nerve cell production) is provided.
A medium kit for directly transdifferentiating macrophages into nerve cells (direct reprogramming) (or a medium kit for producing nerve cells) ).
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］
（単球由来マクロファージを神経細胞に直接分化転換する培地成分の検討）
健常ヒトから承諾を得て採取した血液試料から分離したヒト単核球を５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるようにカバーガラス（松浪硝子工業社製、丸カバーグラス １８丸、商品コード：Ｃ０１８００１）上に播種し、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、Ｃ－２８０５１）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で１時間培養した。次いで、培地中の浮遊細胞を培地と共に除去した後、カバーガラス上の接着細胞（単球）について、培地の総体積に対して１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）を含む培地（組成：１０ｗ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ １５無血清リンパ球培地（Ｌｏｎｚａ社製、０４－４１８Ｑ））で、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養して、Ｍ１型のフェノタイプを有するマクロファージ（以下、「Ｍφ」と略記する場合がある）を得た。Ｍφが得られたことは、定量ＰＣＲ法により、Ｍφのマーカー遺伝子であるＣＤ１１ｂ遺伝子及びＩｂａ１遺伝子の発現亢進を検出することで確かめた。
[Example 1]
(Investigation of medium components that directly transdifferentiate monocyte-derived macrophages into nerve cells)
Human mononuclear cells isolated from blood samples collected with consent from healthy humans were covered with a cover glass (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd., round
次いで、得られたヒト単球由来Ｍ１型Ｍφについて以下に示す組成の培地を用いて、さらに３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養した。 Subsequently, the obtained human monocyte-derived M1 type Mφ was further cultured for 7 days at 37° C. under a 5 vol % CO 2 environment using a medium having the composition shown below.
上記Ｎｏ．１～Ｎｏ．３の各培地を用いて、７日間培養した後の細胞を微分干渉顕微鏡（倍率：４００倍（上の画像）及び２００倍（下の画像）、オリンパス社製、ＩＸ８３）で撮像した際の微分干渉顕微鏡像（スケールバーは５０μｍである）を図１に示す。 No. above. 1 to No. Cells cultured for 7 days using each medium of 3 were imaged with a differential interference contrast microscope (magnification: 400x (upper image) and 200x (lower image), Olympus, IX83). An interference microscope image (scale bar is 50 μm) is shown in FIG.
図１から、培地Ｎｏ．１及びＮｏ．２を用いて培養した細胞は、神経細胞様の樹状突起を有する形態が観察された。一方、培地Ｎｏ．３を用いて培養した細胞では、神経細胞様の細胞への変化は観察されなかった。
これらのことから、Ｍφを神経細胞に直接分化転換するための培地成分としては、マクロファージを神経細胞に直接分化転換するために用いられる培地であって、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤が最小必須成分であることが明らかとなった。
From FIG. 1, medium no. 1 and no. Cells cultured using 2 were observed to have a morphology having neuron-like dendrites. On the other hand, medium No. No change to neuron-like cells was observed in the cells cultured with 3.
Based on these facts, the medium components for direct transdifferentiation of Mφ into nerve cells include a medium used for direct transdifferentiation of macrophages into nerve cells, which includes a
次いで、培地Ｎｏ．２を用いて、０、１、及び７日間培養した細胞について、Ｔａｋａｒａ社製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ Ｐｌｕｓ（７４０９８４－５０）を用いて全ＲＮＡを回収し、多能性マーカー遺伝子であるＰＡＸ６遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子の発現をＴａｋａｒａ社製のＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＲＴ－ＰＣＲ法により確認した。結果を図２に示す。なお、図２において、「ＮＳ」とは“ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ”の略であり、非有意であることを意味する。 Then, medium no. For cells cultured for 0, 1, and 7 days using 2, total RNA was collected using Takara's NucleoSpin (registered trademark) RNA Plus (740984-50), and the pluripotency marker gene PAX6 was collected. Expression of the gene and SOX2 gene was confirmed by RT-PCR method using Thermal Cycler Dice Real Time System manufactured by Takara. The results are shown in FIG. In FIG. 2, "NS" is an abbreviation for "not significant" and means non-significant.
図２から、培地Ｎｏ．２を用いて、７日間培養した細胞において、多能性マーカー遺伝子であるＰＡＸ６遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子の発現はいずれも陰性であった。すなわち、培地Ｎｏ．２を用いたＭφから神経細胞への分化転換は、多能性幹細胞を経由していないダイレクトリプログラミングであることを確かめられた。 From FIG. 2, medium no. 2, the expression of PAX6 gene and SOX2 gene, which are pluripotent marker genes, was negative in cells cultured for 7 days. That is, medium no. It was confirmed that transdifferentiation from Mφ to neurons using 2 was direct reprogramming not via pluripotent stem cells.
また、培地Ｎｏ．２を用いて、７日間培養した細胞について、神経細胞のマーカーであるβ－Ｔｕｂｕｌｉｎ ３（ＴＵＪ１）に対する特異的抗体（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、８０１２０１）、並びに、多能性マーカーであるＰＡＸ６に対する特異的抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ社製、ＰＲＢ－２７８Ｐ）及びＳＯＸ２に対する特異的抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ＡＦ２０１８）を用いて蛍光染色を行った。また、当該細胞について４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ｈ－２０００－１０）を用いて核染色した。細胞を蛍光顕微鏡（４００倍、Ｃａｒｌ ｚｅｉｓｓ社製、ＬＳＭ７１０）を用いて観察した。結果を図３（上：ＴＵＪ１／ＰＡＸ６／ＤＡＰＩ、下：ＴＵＪ１／ＳＯＸ２／ＤＡＰＩ）に示す。なお、図３において、スケールバーは５０μｍである。また、図３の上下の蛍光染色像において、左側の画像は、抗ＴＵＪ１抗体、抗ＰＡＸ６抗体又は抗ＳＯＸ２抗体、及びＤＡＰＩの３種による検出像をＭｅｒｇｅした画像である。真ん中の画像は、抗ＴＵＪ１抗体による蛍光染色像であり、右側の画像は、抗ＰＡＸ６抗体又は抗ＳＯＸ２抗体による蛍光染色像である。 In addition, medium no. 2 for cells cultured for 7 days, a specific antibody against the neuronal marker β-Tubulin 3 (TUJ1) (manufactured by Biolegend, 801201) and a specific antibody against the pluripotency marker PAX6 (Covance, PRB-278P) and a specific antibody against SOX2 (R&D, AF2018) were used for fluorescence staining. In addition, the cells were subjected to nuclear staining using 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) (manufactured by Vector Laboratories, H-2000-10). Cells were observed using a fluorescence microscope (400x, Carl zeiss, LSM710). The results are shown in FIG. 3 (top: TUJ1/PAX6/DAPI, bottom: TUJ1/SOX2/DAPI). Note that the scale bar in FIG. 3 is 50 μm. In addition, in the upper and lower fluorescence-stained images in FIG. 3, the image on the left is an image obtained by merging detection images by three types of anti-TUJ1 antibody, anti-PAX6 antibody or anti-SOX2 antibody, and DAPI. The image in the middle is an image of fluorescence staining with an anti-TUJ1 antibody, and the image on the right is an image of fluorescence staining with an anti-PAX6 antibody or an anti-SOX2 antibody.
図３に示すように、培地Ｎｏ．２を用いて、７日間培養した細胞において、神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１の発現は確認されたが、多能性マーカーであるＰＡＸ６及びＳＯＸ２の発現は確認されなかった。
このことから、図２の結果と同様に、培地Ｎｏ．２を用いたＭφから神経細胞への分化転換は、多能性幹細胞を経由していないダイレクトリプログラミングであることを確かめられた。
As shown in FIG. 2, the expression of the neuronal cell marker TUJ1 was confirmed, but the expression of the pluripotent markers PAX6 and SOX2 was not confirmed.
From this, it can be concluded that medium No. It was confirmed that transdifferentiation from Mφ to neurons using 2 was direct reprogramming not via pluripotent stem cells.
次に、培地Ｎｏ．２を用いて、０、３、及び７日間培養した細胞について、Ｔａｋａｒａ社製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ Ｐｌｕｓ（７４０９８４－５０）を用いて全ＲＮＡを回収し、神経細胞のマーカー遺伝子７種（ＴＵＪ１遺伝子、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）遺伝子、ダブルコルチン（ＤＣＸ）遺伝子、Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １－Ｌｉｋｅ（ＭＹＴ１Ｌ）遺伝子、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇ １（ＡＳＣＬ１）遺伝子、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １（ＮｅｕｒｏＤ１）遺伝子、神経特異的ＰＯＵ転写調節因子（ＢＲＮ）遺伝子、及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ－２（ＮＧＮ２）遺伝子）、並びに、マクロファージのマーカー遺伝子２種（インテグリンαＭ（ＣＤ１１ｂ）遺伝子及びＩｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｉｂａ１遺伝子））の発現をＴａｋａｒａ社製のＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＲＴ－ＰＣＲ法により確認した。結果を図４に示す。図４において、「ＮＳ」とは“ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ”の略であり、非有意であることを意味する。また、「＊」は、Ｐ＜０．０５、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を意味する。 Next, medium no. 2 for cells cultured for 0, 3, and 7 days, total RNA was collected using Takara's NucleoSpin (registered trademark) RNA Plus (740984-50), and 7 types of neuronal marker genes ( TUJ1 gene, Microtubule-associated protein 2 (MAP2) gene, Doublecortin (DCX) gene, Myelin Transcription Factor 1-Like (MYT1L) gene, Achaete-scute homolog 1 (ASCL1) gene, Neurogenic Differentiation 1 (NeuroD1) gene, Neuro-specific Expression of POU transcriptional regulator (BRN) gene and Neurogenin-2 (NGN2) gene) and two types of macrophage marker genes (integrin αM (CD11b) gene and ionized calcium binding adapter protein 1 (Iba1 gene)) It was confirmed by RT-PCR method using Thermal Cycler Dice Real Time System manufactured by Takara. The results are shown in FIG. In FIG. 4, "NS" is an abbreviation for "not significant" and means non-significant. "*" means P<0.05, "**" means P<0.01, and "***" means P<0.001.
図４に示すように、培養日数が進むにつれて、神経細胞のマーカー遺伝子の発現が上昇し、一方で、Ｍφのマーカー遺伝子の発現が減少することが確かめられた。 As shown in FIG. 4, it was confirmed that the expression of the neuronal marker gene increased and the expression of the Mφ marker gene decreased as the number of culture days progressed.
次いで、培地Ｎｏ．２を用いて、７日間培養した細胞について、神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対する特異的抗体（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、８０１２０１）及びＮｅｕｒｏｎａｌ ｎｕｃｌｅｉ（ＮＥＵＮ）に対する特異的抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＡＢＮ７８）を用いて蛍光染色を行った。また、当該細胞についてＤＡＰＩを用いて核染色した。細胞を蛍光顕微鏡（４００倍、Ｃａｒｌ ｚｅｉｓｓ社製、ＬＳＭ７１０）を用いて観察した。結果を図５（左：微分干渉顕微鏡像、右：蛍光染色像）に示す。なお、図５において、スケールバーは５０μｍである。また、図５の右側の蛍光染色像において、左上の画像は、抗ＮＥＵＮ抗体、抗ＴＵＪ１抗体、及びＤＡＰＩの３種による検出像をＭｅｒｇｅした画像であり、右上の画像は、抗ＴＵＪ１抗体による蛍光染色像であり、左下の画像は、抗ＮＥＵＮ抗体による蛍光染色像である。 Then, medium no. 2, the cells were cultured for 7 days using a specific antibody against TUJ1, a neuronal cell marker (manufactured by biolegend, 801201) and a specific antibody against Neuronal nuclei (NEUN) (manufactured by Millipore, ABN78). Fluorescent staining was performed. In addition, the cells were nuclear stained using DAPI. Cells were observed using a fluorescence microscope (400x, Carl zeiss, LSM710). The results are shown in FIG. 5 (left: differential interference microscope image, right: fluorescence staining image). Note that the scale bar in FIG. 5 is 50 μm. In addition, in the fluorescent staining image on the right side of FIG. 5, the upper left image is an image obtained by merging the detection images by three types of anti-NEUN antibody, anti-TUJ1 antibody, and DAPI, and the upper right image is the fluorescence by anti-TUJ1 antibody. It is a stained image, and the lower left image is a fluorescent stained image with an anti-NEUN antibody.
図５に示すように、培地Ｎｏ．２を用いて、７日間培養した細胞において、神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１及びＮＥＵＮのタンパク質レベルでの発現が確認された。 As shown in FIG. 2, expression at the protein level of neuronal cell markers TUJ1 and NEUN was confirmed in cells cultured for 7 days.
［実施例２］
（単球由来Ｍ２型Ｍφを用いた神経細胞へのダイレクトリプログラミングの検討）
次に、培地Ｎｏ．２を用いて、フェノタイプの異なるＭφ（単球由来Ｍ２型Ｍφ）についても同様に神経細胞へのダイレクトリプログラミングが達成できるかどうかについて検討した。
[Example 2]
(Examination of direct reprogramming to nerve cells using monocyte-derived M2 type Mφ)
Next, medium no. 2, it was examined whether direct reprogramming to nerve cells could similarly be achieved for Mφs of different phenotypes (monocyte-derived M2-type Mφs).
健常ヒトから承諾を得て採取した血液試料から分離したヒト単核球を５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるようにカバーガラス（松浪硝子工業社製、丸カバーグラス １８丸、商品コード：Ｃ０１８００１）上に播種し、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、Ｃ－２８０５１）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で１時間培養した。次いで、培地中の浮遊細胞を培地と共に除去した後、カバーガラス上の接着細胞（単球）について、培地の総体積に対して５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）を含む培地（組成：１０ｗ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ １５無血清リンパ球培地（Ｌｏｎｚａ社製、０４－４１８Ｑ））で、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養して、Ｍ２型のフェノタイプを有するＭφを得た。Ｍφが得られたことは、定量ＰＣＲ法により、Ｍφのマーカー遺伝子であるＣＤ１１ｂ遺伝子及びＩｂａ１遺伝子の発現亢進を検出することで確かめた。
Human mononuclear cells isolated from blood samples collected with consent from healthy humans were covered with a cover glass (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd., round
次いで、得られたヒト単球由来Ｍ２型Ｍφについて上記培地Ｎｏ．２（組成は、上記表１参照）を用いて、さらに３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養した。 Next, the obtained human monocyte-derived M2 type Mφ was treated with the medium No. 2 (see Table 1 for the composition), and further cultured for 7 days at 37° C. in a 5 vol % CO 2 environment.
次いで、培地Ｎｏ．２を用いて、７日間培養した細胞について、神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対する特異的抗体（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、８０１２０１）を用いて蛍光染色を行った。細胞を蛍光顕微鏡（４００倍、Ｃａｒｌ ｚｅｉｓｓ社製、ＬＳＭ７１０）を用いて観察した。結果を図６に示す。なお、図６において、スケールバーは５０μｍである。 Then, medium no. 2, the cells were cultured for 7 days and subjected to fluorescence staining using a specific antibody against TUJ1, a neuronal cell marker (manufactured by Biolegend, 801201). Cells were observed using a fluorescence microscope (400x, Carl zeiss, LSM710). The results are shown in FIG. Note that the scale bar in FIG. 6 is 50 μm.
図６に示すように、培地Ｎｏ．２を用いて、７日間培養した細胞において、神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１のタンパク質レベルでの発現が確認された。
以上のことから、単球由来Ｍ２型Ｍφについても、単球由来Ｍ１型Ｍφと同様に、特定の成分を組み合わせて含有する培地を用いることで、神経細胞へのダイレクトリプログラミングが達成できることが確かめられた。
As shown in FIG. 2, expression of TUJ1, a neuronal cell marker, at the protein level was confirmed in cells cultured for 7 days.
From the above, it was confirmed that direct reprogramming of nerve cells can be achieved for monocyte-derived M2 type Mφ as well as for monocyte-derived M1 type Mφ by using a medium containing a combination of specific components. was taken.
［実施例３］
（培地中のＰＵ．１阻害剤の至適濃度の検討）
次いで、培地に含まれるＰＵ．１阻害剤の至適濃度を検討した。
[Example 3]
(Investigation of optimal concentration of PU.1 inhibitor in medium)
Then, the PU. The optimal concentration of 1 inhibitor was examined.
健常ヒトから承諾を得て採取した血液試料から分離したヒト単核球を５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるようにカバーガラス（松浪硝子工業社製、丸カバーグラス １８丸、商品コード：Ｃ０１８００１）上に播種し、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、Ｃ－２８０５１）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で１時間培養した。次いで、培地中の浮遊細胞を培地と共に除去した後、カバーガラス上の接着細胞（単球）について、培地の総体積に対して１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含む培地（組成：１０ｗ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ １５無血清リンパ球培地（Ｌｏｎｚａ社製、０４－４１８Ｑ））で、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養して、Ｍ１型のフェノタイプを有するＭφを得た。Ｍφが得られたことは、定量ＰＣＲ法により、Ｍφのマーカー遺伝子であるＣＤ１１ｂ遺伝子及びＩｂａ１遺伝子の発現亢進を検出することで確かめた。
Human mononuclear cells isolated from blood samples collected with consent from healthy humans were covered with a cover glass (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd., round
次いで、得られたヒト単球由来Ｍ１型Ｍφについて、上記表１に示す培地Ｎｏ．２中のＤＢ２３１３の濃度を０．１、０．３、０．５又は０．９μＭにふり、それ以外の成分は培地Ｎｏ．２と同じである培地４種類を調製し、当該４種類の培地を用いて、さらに３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養した。 Subsequently, the obtained human monocyte-derived M1 type Mφ was cultured with medium No. 1 shown in Table 1 above. The concentration of DB2313 in medium No. 2 was adjusted to 0.1, 0.3, 0.5 or 0.9 μM, and the other components were adjusted to medium No. 2. Four types of the same medium as in 2 were prepared, and the four types of medium were further cultured at 37° C. under a 5 vol % CO 2 environment for 7 days.
次いで、各培地を用いて、７日間培養した細胞について、当該培地による培養開始時の細胞数に対する、培養後の細胞数の割合の百分率を細胞生存率として算出した。また、当該培地による培養開始時の細胞数に対する、神経細胞に転換した細胞の割合の百分率を分化転換効率として算出した。なお、神経細胞に転換したことは、目視での形態変化（樹状突起様構造の発現）及び免疫蛍光染色で神経マーカーであるＴＵＪ１陽性であることによって確認した。図７は、培地中のＤＢ２３１３濃度と、細胞生存率及び分化転換効率との関係を示すグラフである。 Next, for cells cultured for 7 days using each medium, the ratio of the number of cells after culture to the number of cells at the start of culture in the medium was calculated as the cell survival rate. In addition, the percentage of cells converted to nerve cells with respect to the number of cells at the start of culture in the medium was calculated as the transdifferentiation efficiency. Transformation into nerve cells was confirmed by visual morphological changes (development of dendrite-like structures) and immunofluorescence staining by positive TUJ1, a nerve marker. FIG. 7 is a graph showing the relationship between the DB2313 concentration in the medium and the cell viability and transdifferentiation efficiency.
図７に示すように、培地中のＤＢ２３１３濃度が上昇するほど、分化転換効率がより上昇する傾向がみられ、一方で、培地中のＤＢ２３１３濃度が減少するほど、細胞生存率がより上昇する傾向がみられた。
培地中のＤＢ２３１３濃度が０．３μＭ以上０．７μＭ以下である場合に、細胞生存率及び分化転換効率がいずれも５０％を超えて、特に良好であることが明らかとなった。
As shown in FIG. 7, the transdifferentiation efficiency tends to increase as the DB2313 concentration in the medium increases, while the cell viability tends to increase as the DB2313 concentration in the medium decreases. was seen.
It was found that when the DB2313 concentration in the medium was 0.3 μM or more and 0.7 μM or less, both the cell viability and the transdifferentiation efficiency exceeded 50% and were particularly favorable.
［実施例４］
（培地中の神経分化誘導因子の至適濃度の検討）
次いで、培地に含まれる神経分化誘導因子の至適濃度を検討した。
[Example 4]
(Investigation of optimal concentration of neuronal differentiation-inducing factor in culture medium)
Next, the optimal concentration of the neuronal differentiation-inducing factor contained in the medium was examined.
健常ヒトから承諾を得て採取した血液試料から分離したヒト単核球を５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるようにカバーガラス（松浪硝子工業社製、丸カバーグラス １８丸、商品コード：Ｃ０１８００１）上に播種し、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、Ｃ－２８０５１）を用いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で１時間培養した。次いで、培地中の浮遊細胞を培地と共に除去した後、カバーガラス上の接着細胞（単球）について、培地の総体積に対して１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含む培地（組成：１０ｗ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｘ－ＶＩＶＯＴＭ １５無血清リンパ球培地（Ｌｏｎｚａ社製、０４－４１８Ｑ）で、３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養して、Ｍ１型のフェノタイプを有するＭφを得た。Ｍφが得られたことは、定量ＰＣＲ法により、Ｍφのマーカー遺伝子であるＣＤ１１ｂ遺伝子及びＩｂａ１遺伝子の発現亢進を検出することで確かめた。
Human mononuclear cells isolated from blood samples collected with consent from healthy humans were covered with a cover glass (manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd., round
次いで、得られたヒト単球由来Ｍ１型Ｍφについて、上記表１に示す培地Ｎｏ．２中のＩＳＸ－９の濃度を１、３、５又は１０μＭにふり、それ以外の成分は培地Ｎｏ．２と同じである培地４種類を調製し、当該４種類の培地を用いて、さらに３７℃、５体積％ＣＯ２環境下で７日間培養した。 Subsequently, the obtained human monocyte-derived M1 type Mφ was cultured with medium No. 1 shown in Table 1 above. The concentration of ISX-9 in medium No. 2 was changed to 1, 3, 5 or 10 μM, and other components were added to medium No. 2. Four types of the same medium as in 2 were prepared, and the four types of medium were further cultured at 37° C. under a 5 vol % CO 2 environment for 7 days.
次いで、各培地を用いて、７日間培養した細胞について、当該培地による培養開始時の細胞数に対する、培養後の細胞数の割合の百分率を細胞生存率として算出した。また、当該培地による培養開始時の細胞数に対する、神経細胞に転換した細胞の割合の百分率を分化転換効率として算出した。なお、神経細胞に転換したことは、目視での形態変化（樹状突起様構造の発現）及び免疫蛍光染色で神経マーカーであるＴＵＪ１陽性であることによって確認した。図８は、培地中のＩＳＸ－９濃度と、細胞生存率及び分化転換効率との関係を示すグラフである。 Next, for cells cultured for 7 days using each medium, the ratio of the number of cells after culture to the number of cells at the start of culture in the medium was calculated as the cell survival rate. In addition, the percentage of cells converted to nerve cells with respect to the number of cells at the start of culture in the medium was calculated as the transdifferentiation efficiency. Transformation into nerve cells was confirmed by visual morphological changes (development of dendrite-like structures) and immunofluorescence staining by positive TUJ1, a nerve marker. FIG. 8 is a graph showing the relationship between ISX-9 concentration in the medium and cell viability and transdifferentiation efficiency.
図７に示すように、培地中のＩＳＸ－９濃度が上昇するほど、分化転換効率がより上昇する傾向がみられ、一方で、培地中のＩＳＸ－９濃度が減少するほど、細胞生存率がより上昇する傾向がみられた。
培地中のＩＳＸ－９濃度が２．５μＭ以上７．５μＭ以下である場合に、細胞生存率及び分化転換効率がいずれも５０％を超えて、特に良好であることが明らかとなった。
As shown in FIG. 7, the higher the ISX-9 concentration in the medium, the higher the transdifferentiation efficiency, while the lower the ISX-9 concentration in the medium, the lower the cell viability. A tendency to increase was observed.
It was found that when the ISX-9 concentration in the medium is 2.5 μM or more and 7.5 μM or less, both the cell viability and the transdifferentiation efficiency exceed 50%, which is particularly good.
以上のことから、特定の成分を組み合わせて含有する培地を用いることで、マクロファージを神経細胞へと化学的にダイレクトリプログラミングできることが明らかとなった。 From the above, it was clarified that macrophages can be chemically reprogrammed directly into nerve cells by using a medium containing a combination of specific components.
本実施形態の培地によれば、マクロファージを神経細胞に直接分化転換するための培地を提供することができる。本実施形態の製造方法によれば、マクロファージから直接分化転換した神経細胞を製造することができる。本実施形態の方法によれば、マクロファージを神経細胞に直接分化転換することができる。 According to the medium of this embodiment, it is possible to provide a medium for directly transdifferentiating macrophages into nerve cells. According to the production method of the present embodiment, nerve cells directly transdifferentiated from macrophages can be produced. According to the method of this embodiment, macrophages can be directly transdifferentiated into nerve cells.
Claims (7)
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤を含む、培地。 A medium used to directly transdifferentiate macrophages into nerve cells, comprising:
glycogen synthase kinase 3 inhibitor, adenylate cyclase activator, Rho kinase inhibitor, neuronal differentiation inducer, and PU. 1 inhibitor.
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３阻害剤、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、神経分化誘導因子、及びＰＵ．１阻害剤を含む培地を用いて、マクロファージを培養して神経細胞に直接分化転換する分化転換工程を含む、方法。 A method of directly transdifferentiating macrophages into neural cells, comprising:
glycogen synthase kinase 3 inhibitor, adenylate cyclase activator, Rho kinase inhibitor, neuronal differentiation inducer, and PU. 1. A method comprising a transdifferentiation step of culturing macrophages and transdifferentiating directly into neural cells using a medium containing a No. 1 inhibitor.
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