JP2022127080A - Chimera receptor having mutations introduced thereto - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、変異が導入された、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）受容体とＶ２受容体のキメラ受容体に関する。 The present invention relates to a chimeric receptor of oxytocin receptor and V2 receptor into which a mutation has been introduced.
オキシトシンは、下垂体後葉から分泌される９アミノ酸からなるホルモンである。子宮筋の収縮作用による分娩の促進や出産後授乳時の射乳反射を惹起する機能があり、分娩誘発剤として臨床的に用いられている。近年では、神経伝達物質として、精神神経疾患、社会的／性的なふるまいに関与している可能性が示唆されており、精神神経疾患などのバイオマーカーとして応用が期待されている。 Oxytocin is a 9-amino acid hormone secreted from the posterior pituitary gland. It is clinically used as a labor inducing agent because it has the function of promoting labor by contraction of the uterine muscle and inducing the milk ejection reflex during breastfeeding after childbirth. In recent years, as a neurotransmitter, it has been suggested that it may be involved in neuropsychiatric disorders and social/sexual behavior, and is expected to be applied as a biomarker for neuropsychiatric disorders.
アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ : Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）は、オキシトシン同様、下垂体後葉から分泌され、腎臓における水再吸収を調節するホルモンである。９アミノ酸からなり、オキシトシンとは２アミノ酸が異なる。 Arginine vasopressin (AVP), like oxytocin, is a hormone secreted from the posterior pituitary gland and regulating water reabsorption in the kidney. It consists of 9 amino acids and differs from oxytocin by 2 amino acids.
ＡＶＰの血中濃度は血中ナトリウム濃度に応じて変動することが知られているが、その濃度は非常に低くｐｇ／ｍＬレベルである。そのためＡＶＰの測定法として、感度が非常に良いＲＩＡ法（非特許文献１）が臨床的に用いられている。 Although it is known that the blood concentration of AVP fluctuates according to the blood sodium concentration, the concentration is very low at pg/mL level. Therefore, the RIA method (Non-Patent Document 1), which has very good sensitivity, is clinically used as a method for measuring AVP.
オキシトシンの血中濃度はＡＶＰのおおよそ１０倍と見積もられているが、実際には測定法や報告により１ｐｇ／ｍＬ～１０００ｐｇ／ｍＬと大きな差がある（非特許文献２、３）。これは、正確な血中オキシトシン測定系構築の難しさを反映していると考えられる。 The blood concentration of oxytocin is estimated to be approximately 10 times that of AVP, but in fact there is a large difference between 1 pg/mL and 1000 pg/mL depending on the measurement method and reports (Non-Patent Documents 2 and 3). This is considered to reflect the difficulty of constructing an accurate blood oxytocin measuring system.
オキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）は、中枢神経、子宮、乳腺等の細胞膜上に存在するオキシトシンの受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。下垂体後葉から分泌されるオキシトシンがＯＸＴＲに結合すると、その刺激によりＧタンパク質αｑ（Ｇαｑ）を介して細胞中のホスホリパーゼＣが活性化、ホスファチジルイノシトール４，５－ビスリン酸（ＰＩＰ２）が分解され、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５－トリスリン酸（ＩＰ３）が産生される。ＩＰ３は小胞体上のカルシウムチャネルであるＩＰ３受容体に結合して細胞質内にカルシウムを流入させる。ＤＡＧはカルシウムとともにプロテインキナーゼＣを活性化、さらに下流にシグナルを伝達する。ＯＸＴＲはオキシトシンだけでなくＡＶＰにも強い親和性を有する。 Oxytocin receptor (OXTR) is a receptor for oxytocin present on cell membranes of central nerves, uterus, mammary glands, etc., and is a type of G protein-coupled receptor. When oxytocin secreted from the posterior pituitary gland binds to OXTR, its stimulation activates phospholipase C in cells via G protein αq (Gαq), decomposing phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2), Diacylglycerol (DAG) and inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) are produced. IP3 binds to the IP3 receptor, which is a calcium channel on the endoplasmic reticulum, and allows calcium to flow into the cytoplasm. DAG activates protein kinase C together with calcium and further transmits signals downstream. OXTR has a strong affinity not only for oxytocin but also for AVP.
Ｖ２受容体（Ｖ２Ｒ）は、腎集合管の細胞膜上に存在するＡＶＰ受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。下垂体後葉から分泌されるＡＶＰがＶ２Ｒに結合すると、その刺激により細胞中のＧタンパク質αｓ（Ｇαｓ）を介してアデニレートシクラーゼが活性化されて環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生され、ｃＡＭＰシグナルによるプロテインキナーゼＡ活性化を介して、腎臓における水の再吸収が行われる。ＡＶＰの受容体として、Ｖ２Ｒのほかに、Ｖ１ａ受容体（Ｖ１ａＲ）、Ｖ１ｂ受容体（Ｖ１ｂＲ）が知られているが、それぞれ発現組織が異なる。また、Ｖ２ＲはＧαｓと、Ｖ１ａＲおよびＶ１ｂＲはＧαｑと共役することが知られている。これらの受容体はオキシトシンにも弱いながらも親和性を有する。 V2 receptor (V2R) is an AVP receptor present on the cell membrane of renal collecting ducts, and is a type of G protein-coupled receptor. When AVP secreted from the posterior pituitary gland binds to V2R, its stimulation activates adenylate cyclase via G protein αs (Gαs) in cells to produce cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Water reabsorption in the kidney is mediated by protein kinase A activation by cAMP signals. Besides V2R, V1a receptor (V1aR) and V1b receptor (V1bR) are known as AVP receptors, but they are expressed in different tissues. It is also known that V2R is conjugated with Gαs, and V1aR and V1bR are conjugated with Gαq. These receptors also have a weak affinity for oxytocin.
Ｖ２ＲやＯＸＴＲに対する、オキシトシンやＡＶＰ結合部位は報告されているものの（非特許文献５、６）、結合部位の変異によるオキシトシン特異性向上については検討されておらず、何らの知見も存在しない。 Although oxytocin and AVP binding sites for V2R and OXTR have been reported (Non-Patent Documents 5 and 6), improvement of oxytocin specificity by binding site mutation has not been investigated and there is no knowledge.
オキシトシンの測定法として、質量分析（特許文献１）や、抗体を用いた免疫学的測定法であるＲＩＡ法（非特許文献１、２）、酵素免疫測定法（特許文献１、非特許文献１、２、３）、免疫生物発光測定法（特許文献２）等が知られている。 As a method for measuring oxytocin, mass spectrometry (Patent Document 1), RIA method (Non-Patent Documents 1 and 2) which is an immunological measurement method using an antibody, and enzyme immunoassay (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). , 2, 3), immunobioluminescence assay (Patent Document 2), and the like.
また、別の測定原理として、Ｇタンパク質共役受容体に対するリガンドや自己抗体活性を迅速に測定する方法の１つである、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＧタンパク質共役受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を用いてｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する方法が検討されている（特許文献３）。特許文献３には、以下の工程（ａ）～（ｃ）を行うことにより、被験者試料のＴＳＨＲに対する自己抗体活性を算定することができることが記載されている。
（ａ）ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨＲの両方が発現する動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、ＴＳＨＲ活性化レベルを算定する工程；
In addition, as another measurement principle, mammalian cells expressing both a cAMP biosensor and a G protein-coupled receptor, which is one of the methods for rapidly measuring ligands and autoantibody activity against G protein-coupled receptors, are used. A method for measuring the activation level of a cAMP biosensor is being studied (Patent Document 3). Patent Document 3 describes that autoantibody activity against TSHR in a subject sample can be calculated by performing the following steps (a) to (c).
(a) incubating animal cells expressing both a cAMP biosensor and a TSHR in the presence of a blood sample taken from a subject;
(b) after step (a), measuring the level of activation of said cAMP biosensor;
(c) comparing the activation level measured in step (b) with the activation level in the control to calculate the TSHR activation level;
本発明者らは、上記方法を応用して、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体及びｃＡＭＰバイオセンサーを用いることで、受容体の活性化シグナルを良好なＳ／Ｎ比で測定できることを見出した（特許文献４）。 By applying the above method, the present inventors have found that by using a chimeric receptor and a cAMP biosensor in which a part of the V2R extracellular domain is replaced with the OXTR extracellular domain, the activation signal of the receptor can be improved. (Patent Document 4).
Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体においては、野生型のＶ２Ｒ受容体と比較して、オキシトシンに対する特異性は１００倍程度まで向上した。しかし、本発明者らの検討の中で、当該キメラ受容体のオキシトシンに対する特異性に、さらなる改善の余地があることが見いだされた。 In the chimeric receptor in which a part of the V2R extracellular domain was replaced with the OXTR extracellular domain, the specificity for oxytocin was improved by about 100-fold compared to the wild-type V2R receptor. However, in the study of the present inventors, it was found that there is room for further improvement in the specificity of the chimeric receptor for oxytocin.
具体的には、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体においては、オキシトシンを１００ｐｇ／ｍＬ含む試料と、ＡＶＰを１００ｐｇ／ｍＬ含む試料とで反応性（Ｓ／Ｎ比）を比較した場合、ＡＶＰ試料に対するＳ／Ｎ比は、オキシトシン試料に対するＳ／Ｎ比の１０倍程度であった。臨床的なオキシトシン測定に利用するためには、オキシトシンに対する特異性が高い方が、より好ましい。 Specifically, in a chimeric receptor in which a part of the extracellular domain of V2R is replaced with the extracellular domain of OXTR, reactivity (S /N ratio), the S/N ratio for the AVP sample was about 10 times the S/N ratio for the oxytocin sample. High specificity to oxytocin is more preferable for use in clinical oxytocin measurement.
本発明は、上記の問題を解決するため、オキシトシンに対する特異性が向上したキメラ受容体を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a chimeric receptor with improved specificity for oxytocin in order to solve the above problems.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体に、適切な変異を導入することによって、オキシトシン特異性を向上させることが可能であることを見出した。さらに、検討を進めることにより、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a chimeric receptor in which a part of the V2R extracellular domain is replaced with the OXTR extracellular domain by introducing an appropriate mutation can produce an oxytocin-specific receptor. We have found that it is possible to improve the Furthermore, the present invention was completed by proceeding with the study.
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］（１）に記載されたアミノ酸のうち少なくとも１つか、もしくは（２）に記載する領域に、変異を有することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体。
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）
［２］変異が前記（１）に記載されたアミノ酸における点変異であることを特徴とする、［１］に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体。
［３］（３）に記載された点変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を有することを特徴とする、［１］又は［２］に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体；
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異
［４］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］から［３］のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体；
Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃ，Ａ２９５Ｖ
［５］Ｖ２受容体の第一細胞外領域配列がオキシトシン受容体の第一細胞外領域配列へと置換されていることを特徴とする、［１］から［４］のいずれか１項に記載のキメラ受容体。［６］Ｖ２受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列がオキシトシン受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列へとそれぞれ置換されていることを特徴とする、［１］から［５］のいずれか１項に記載のキメラ受容体。
［７］［１］から［６］のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。
［８］［１］から［６］のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体を発現する動物細胞。
［９］［８］に記載の動物細胞を含有する、オキシトシン測定キット。
［１０］前記動物細胞がｃＡＭＰバイオセンサーを発現することを特徴とする、［９］に記載のオキシトシン測定キット。
［１１］（１）に記載されたアミノ酸のうち少なくとも１つか、もしくは（２）に記載する領域に変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性向上方法；
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）
［１２］（３）に記載された点変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法；
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異
［１３］［１１］または［１２］に記載の変異に加え、以下のアミノ酸に変異を導入することを特徴とする、キメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法；
Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａ
That is, the present invention is as follows.
[1] Part of the extracellular region of V2R, characterized by having a mutation in at least one of the amino acids described in (1) or in the region described in (2), is replaced with the extracellular region of OXTR Chimeric receptors substituted with
(1) V90, M122, Y126, A295
(2) (210) ALMVF (214)
[2] Chimera in which a part of the extracellular region of V2R is replaced with the extracellular region of OXTR according to [1], wherein the mutation is a point mutation in the amino acid described in (1) above. receptor.
[3] The extracellular region of V2R according to [1] or [2], characterized by having at least one of the point mutations described in (3) or the mutation described in (4). a chimeric receptor in which a portion of is replaced with the extracellular region of OXTR;
(3) V90A, M122A, M122V, M122I, M122T, M122L, M122G, M122W, M122P, M122S, M122N, M122Q, M122E, M122R, M122K, M122H, M122F, M122Y, M122D, M122C, Y12V9, Y126F, Y126F
(4) (210) ALMVF (214) to (210) TLAVY (214) mutation [4] characterized by having at least one of the point mutations described below [1] to [3 ], a chimeric receptor in which a part of the extracellular region of V2R is replaced with the extracellular region of OXTR;
M122A, M122V, M122T, M122L, M122G, M122S, M122C, A295V
[5] Any one of [1] to [4], wherein the first extracellular domain sequence of the V2 receptor is replaced with the first extracellular domain sequence of the oxytocin receptor. chimeric receptor of. [6] characterized in that the first, second and third extracellular domain sequences of the V2 receptor are replaced with the first, second and third extracellular domain sequences of the oxytocin receptor, respectively, [ The chimeric receptor according to any one of 1] to [5].
[7] A polynucleotide encoding the chimeric receptor according to any one of [1] to [6], wherein a part of the V2R extracellular domain is replaced with the OXTR extracellular domain.
[8] An animal cell expressing the chimeric receptor of any one of [1] to [6], wherein a part of the V2R extracellular domain is replaced with the OXTR extracellular domain.
[9] An oxytocin measurement kit containing the animal cells of [8].
[10] The oxytocin measurement kit of [9], wherein the animal cells express a cAMP biosensor.
[11] Part of the extracellular region of V2R is replaced with the extracellular region of OXTR, characterized by introducing mutations into at least one of the amino acids described in (1) or the region described in (2). Method for improving oxytocin specificity of chimeric receptors substituted with;
(1) V90, M122, Y126, A295
(2) (210) ALMVF (214)
[12] Part of the extracellular region of V2R into the extracellular region of OXTR, characterized by introducing at least one of the point mutations described in (3) or the mutation described in (4) Methods for improving oxytocin specificity and improving oxytocin responsiveness of substituted chimeric receptors;
(3) V90A, M122A, M122V, M122I, M122T, M122L, M122G, M122W, M122P, M122S, M122N, M122Q, M122E, M122R, M122K, M122H, M122F, M122Y, M122D, M122C, Y12V9, Y126F, Y126F
(4) (210) Mutation from ALMVF (214) to (210) TLAVY (214) In addition to the mutation described in [13] [11] or [12], the following amino acids are mutated: a method of improving oxytocin specificity and improving oxytocin responsiveness of a chimeric receptor;
A167L, L177V, A216I, A285T, L306A
本発明の変異導入キメラ受容体は、変異導入前のキメラ受容体と比べ、オキシトシンに対する特異性が向上している。この特性により、オキシトシン特異的な測定に好適に用いることができる。 The mutated chimeric receptor of the present invention has improved specificity for oxytocin compared to the chimeric receptor before mutation. Due to this property, it can be suitably used for oxytocin-specific measurements.
本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。特に限定されないが、例えばＡｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）を含む。上記アミノ酸はそれぞれ括弧内の英字１文字で表記されることもある。 As used herein, "amino acid" is a general term for organic compounds having an amino group and a carboxyl group. Although not particularly limited, for example Ala (A), Arg (R), Asn (N), Asp (D), Cys (C), Gln (Q), Glu (E), Gly (G), His (H) , Ile (I), Leu (L), Lys (K), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) , Val(V). Each of the above amino acids may be represented by a single alphabetic character in parentheses.
本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの由来はヒトに限定されないが、由来について特に記載のない場合、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒはヒト由来であることを意味する。本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＯＸＴＲおよびＶ２Ｒアミノ酸配列であることとする。ヒト由来ＯＸＴＲ配列を配列番号１に、ヒト由来Ｖ２Ｒ配列を配列番号２に記載する。 In the present specification, the origin of OXTR and V2R is not limited to human, but unless otherwise stated, it means that OXTR and V2R are of human origin. As used herein, the OXTR and V2R amino acid sequences are those registered in the database of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). The human-derived OXTR sequence is shown in SEQ ID NO:1, and the human-derived V2R sequence is shown in SEQ ID NO:2.
本明細書において、「Ｖ２Ｒの配列の一部がＯＸＴＲの配列へと置換される」とは、Ｖ２Ｒの２以上連続するアミノ酸配列が、対応するＯＸＴＲのアミノ酸配列に置換されていることを意味する。本明細書において、配列の一部がＯＸＴＲの配列へと置換されたＶ２Ｒのことを、単に「キメラ受容体」と表記することがある。 As used herein, "part of the V2R sequence is replaced with the OXTR sequence" means that two or more consecutive amino acid sequences of V2R are replaced with the corresponding OXTR amino acid sequence. . In this specification, V2R in which a part of the sequence is replaced with the sequence of OXTR is sometimes simply referred to as "chimeric receptor".
本明細書において、「Ｖ２Ｒの細胞外領域配列」とは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の１，３，５，７番目であることとする。ただし、Ｖ２Ｒの２番目の細胞膜貫通領域は、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒのアラインメントの結果、８９番目のＡｌａまでとした。 As used herein, the term “V2R extracellular domain sequence” refers to OXTR and V2R transmembrane domains registered in the database of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Let it be the 1st, 3rd, 5th, and 7th amino acid sequence partitions to be divided. However, the second cell transmembrane domain of V2R was set to Ala at position 89 as a result of alignment of OXTR and V2R.
本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の１番目、すなわちＮ末端から１番目の細胞外領域を、Ｅ１と表記することがある。同様に、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の３番目、すなわちＮ末端から２番目の細胞外領域をＥ２、細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の５番目をＥ３と表記することがある。 In the present specification, the first amino acid sequence block separated by the transmembrane regions of OXTR and V2R, ie, the first extracellular region from the N-terminus, is sometimes referred to as E1. Similarly, the third amino acid sequence segment divided by the transmembrane region of OXTR and V2R, that is, the second extracellular region from the N-terminus is E2, and the fifth amino acid sequence segment divided by the transmembrane region is E3. may be indicated.
本明細書において、Ｖ２ＲのＥ１配列をＯＸＴＲのＥ１配列へと置換したキメラ受容体を、ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒと表記することがある。同様に、Ｖ２ＲのＥ１、Ｅ２、Ｅ３配列をそれぞれＯＸＴＲのＥ１、Ｅ２、Ｅ３配列へと置換したキメラ受容体を、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒと表記することがある。また、本明細書において、細胞外領域のＯＸＴＲ配列への置換以外に変異を有していないキメラ受容体のことを、「野生型キメラ受容体」と表記することがある。本明細書において、野生型キメラ受容体はＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒに限定されないが、配列の置換箇所について特に記載のない場合、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒであることを意味する。ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒのアミノ酸配列を、配列番号３に示す。 In this specification, the chimeric receptor in which the V2R E1 sequence is replaced with the OXTR E1 sequence is sometimes referred to as OXTR(E1)-V2R. Similarly, a chimeric receptor in which the E1, E2 and E3 sequences of V2R are replaced with the E1, E2 and E3 sequences of OXTR, respectively, is sometimes referred to as OXTR(E123)-V2R. In the present specification, a chimeric receptor that has no mutations other than the replacement of the extracellular region with the OXTR sequence is sometimes referred to as a "wild-type chimeric receptor." In the present specification, the wild-type chimeric receptor is not limited to OXTR(E123)-V2R, but OXTR(E123)-V2R is meant when there is no particular description about the substitution site of the sequence. The amino acid sequence of OXTR(E123)-V2R is shown in SEQ ID NO:3.
本明細書において、「変異を有する」とは、配列番号２に示すＶ２Ｒ受容体のアミノ酸配列が、アミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加により、異なる配列となることを意味する。変異導入前後の配列を、当該技術分野で公知の方法に従って相同性が最も高くなるように整列させたとき、変異導入前後でアミノ酸配列が異なる部分を、変異箇所と定義する。アミノ酸配列を整列させるコンピュータプログラムとしてはＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴが例示される。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのＡｌｇｏｒｉｔｈｍには、Ｂｌａｓｔｐが例示される。本明細書において、配列の一部がＯＸＴＲの配列へと置換されている以外の変異を有するキメラ受容体を、「変異型キメラ受容体」と表記することがある。 As used herein, "has a mutation" means that the amino acid sequence of the V2R receptor shown in SEQ ID NO: 2 has a different sequence due to deletion, substitution, insertion or addition of amino acids. When the sequences before and after mutagenesis are aligned according to a method known in the art so as to maximize homology, the portion where the amino acid sequence differs before and after mutagenesis is defined as the mutation site. BLAST of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) is exemplified as a computer program for aligning amino acid sequences. Blastp is exemplified as an algorithm for comparing amino acid sequences by BLAST. In the present specification, a chimeric receptor having a mutation other than a partial substitution of the OXTR sequence is sometimes referred to as a "mutant chimeric receptor."
本明細書において、アミノ酸配列に変異を有する箇所を、「Ｍ１２２」のようなアルファベット１文字、数字２文字ないし３文字の組み合わせで表記することがある。左端のアルファベット１文字は、変異導入箇所におけるアミノ酸残基を示す。数字２文字ないし３文字は、変異が導入されたキメラ受容体における当該アミノ酸残基の番号を示す。「Ｍ１２２」であれば、１２２番目のメチオニンに変異が導入されていることを表す。 In this specification, sites with mutations in amino acid sequences are sometimes indicated by a combination of one alphabetic character and two or three numerals such as "M122". One letter of the alphabet at the left end indicates the amino acid residue at the site of mutation introduction. A two-letter or three-letter number indicates the amino acid residue number in the mutated chimeric receptor. If it is "M122", it represents that mutation is introduced at the 122nd methionine.
本明細書において、点変異したアミノ酸を、「Ｍ１２２Ｖ」のようなアルファベット１文字、数字２文字ないし３文字、アルファベット１文字の組み合わせで表記することがある。左端のアルファベット１文字は、変異導入箇所におけるアミノ酸残基を示す。中央の数字２文字ないし３文字は、変異が導入されたキメラ受容体における当該アミノ酸残基の番号を示す。右端のアルファベット１文字は変異した後のアミノ酸残基を示す。「Ｍ１２２Ｖ」であれば、１２２番目のメチオニンがバリンへと点変異していることを表す。 In the present specification, a point-mutated amino acid may be represented by a combination of one alphabetical letter such as "M122V", two or three numbers, or one alphabetical letter. One letter of the alphabet at the left end indicates the amino acid residue at the site of mutation introduction. Two or three numbers in the center indicate the number of the amino acid residue in the mutated chimeric receptor. One letter of the alphabet at the right end indicates the amino acid residue after mutation. If it is "M122V", it represents that the 122nd methionine is point-mutated to valine.
本明細書において、複数のアミノ酸配列を、「（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）」のように、括弧内の数字、アルファベット文字列、括弧内の数字の組み合わせで表記することがある。このとき、左端の括弧内の数字は配列が開始するアミノ酸残基の番号を示す。アルファベット文字列は、当該配列のアミノ酸残基を示す。右端の括弧内の数字は配列が終了するアミノ酸残基の番号を示す。「（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）」であれば、２１０番目のアラニンで始まり、２１４番目のフェニルアラニンで終わる、アミノ酸配列ＡＬＭＶＦを示す。 In this specification, multiple amino acid sequences may be represented by a combination of numbers in parentheses, alphabetical strings, and numbers in parentheses, such as "(210)ALMVF(214)". At this time, the numbers in parentheses on the left end indicate the number of the amino acid residue at which the sequence starts. Alphabetical strings indicate the amino acid residues of the sequence. The numbers in parentheses on the right end indicate the amino acid residue number at which the sequence ends. "(210) ALMVF (214)" indicates the amino acid sequence ALMVF starting with the 210th alanine and ending with the 214th phenylalanine.
本明細書において、アミノ酸配列（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）を（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）と置換する変異を、「Ｍ１」ないし「Ｍ１変異」と表記することがある。なお、該当する部分の文脈から理解可能ではあるが、本明細書中で「Ｍ１」を「１番目のメチオニン」という意味で用いることはない。 In this specification, the mutation that replaces the amino acid sequence (210)ALMVF(214) with (210)TLAVY(214) is sometimes referred to as "M1" or "M1 mutation". Although it can be understood from the context of the relevant part, "M1" is not used in this specification to mean "first methionine".
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基を含む。上記の等価物は、例えばＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。
「ＤＮＡ鎖」とは、ＤＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「ＲＮＡ鎖」とは、ＲＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
As used herein, the term "polynucleotide" includes those composed of a plurality of linked nucleotides or bases, or equivalents thereof. Nucleotides and bases include DNA bases or RNA bases. Equivalents of the above include, for example, DNA or RNA bases that have undergone chemical modifications, such as methylation, or nucleotide analogues. Nucleotide analogues include non-naturally occurring nucleotides.
A "DNA strand" represents a form in which two or more DNA bases or equivalents thereof are linked.
"RNA strand" refers to a form in which two or more RNA bases or equivalents thereof are linked.
本明細書において「ベクター」は、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＥＴ－Ｂｌｕｅ－２）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１－１１、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。 As used herein, "vector" includes, for example, Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pUC12, pET-Blue-2), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), animal Cellular expression plasmids (eg, pA1-11, pcDNAI/Neo), bacteriophages such as phage λ, vectors derived from viruses such as adenoviruses, retroviruses, baculoviruses, and the like can be used. These vectors may contain components necessary for protein expression, such as promoters, origins of replication, or antibiotic resistance genes. A vector may be an expression vector.
本明細書において、「ｃＡＭＰレベル」とは、各種野生型あるいは変異型キメラ受容体に起因して哺乳動物細胞内で産生されるｃＡＭＰ量を意味し、以下に記載の方法で測定した際のＲＬＵと定義する。 As used herein, "cAMP level" means the amount of cAMP produced in mammalian cells due to various wild-type or mutant chimeric receptors, and RLU when measured by the method described below. defined as
［使用動物細胞］ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）。 [Animal cells used] Human embryonic kidney cell-derived cell line (HEK293 cells) (obtained from ECACC [European Collection of Authenticated Cell Cultures], Cat no. 85120602).
［使用ベクター］GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSensor-22F、Promega社製）と、野生型ヒトＶ２Ｒを発現するベクターpYS_CMV_V2R_Puro。なお、以下に記載の方法において、pYS_CMV_V2R_Puroの代わりに、適宜キメラ受容体が発現するpYS_CMVベクターを用いることもある。 [Vector used] GloSensor cAMP, that is, amino acid residues 359 to 544 of firefly luciferase, the cAMP binding region of the regulatory subunit of protein kinase A (PKA), and 4 to 355 of firefly luciferase. A plasmid vector (pGloSensor-22F, manufactured by Promega) expressing a protein containing amino acid residues and a vector pYS_CMV_V2R_Puro expressing wild-type human V2R. In the method described below, a pYS_CMV vector that expresses a chimeric receptor may be used instead of pYS_CMV_V2R_Puro.
[細胞調製法]
〔１〕１．５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地に播種し、２４時間培養する。
〔２〕pGloSenso-22FとpYS_CMV_OXTR(E123)-V2R_Puroを、PEI MAX（Polyscience社製）を用いて１：４の比率で混合、２０分静置した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加してトランスフェクションする。
〔３〕トランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、受容体刺激物質（例えばオキシトシンやオキシトシンを含む検体）の添加により発光強度の増加が見られるものを選抜する。
[Cell preparation method]
[1] 1.5×10 4 HEK293 cells are seeded in D-MEM medium containing 10% FBS and cultured for 24 hours.
[2] pGloSenso-22F and pYS_CMV_OXTR(E123)-V2R_Puro are mixed at a ratio of 1:4 using PEI MAX (manufactured by Polyscience), allowed to stand for 20 minutes, and then added to HEK293 cells for transfection.
[3] After culturing the transfected cells for 24 hours, select those that show an increase in luminescence intensity upon addition of a receptor-stimulating substance (for example, oxytocin or a specimen containing oxytocin).
[活性測定条件]
〔１〕細胞を２４時間培養した後、細胞を回収、インキュベート用液に６．０×１０５cells/mLとなるよう置換し、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（Corning社製）に２６μＬずつ分注する。８ｍＭ D-Luciferin（OZBIOSCIENCES社製、１０ｍＭ HEPES-KOH, ｐＨ７．５で溶解）を１０μLずつ加え、室温で２時間平衡化処理を行う。
〔２〕オキシトシンを添加し、２０分間インキュベーションした後、ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定する。測定されたＲＬＵを、ｃＡＭＰレベルと定義する。
[Activity measurement conditions]
[1] After culturing the cells for 24 hours, the cells were recovered, replaced with an incubation solution at 6.0×10 5 cells/mL, and dispensed into 96-well half area white plates (manufactured by Corning) at 26 μL each. do. 8 mM D-Luciferin (manufactured by OZBIOSCIENCES, dissolved in 10 mM HEPES-KOH, pH 7.5) is added in 10 µL portions and equilibrated at room temperature for 2 hours.
[2] After adding oxytocin and incubating for 20 minutes, RLU is measured using a luminometer. Measured RLU is defined as cAMP level.
なお、本明細書におけるｃＡＭＰレベルの測定法は、上記測定法と同等性が担保される範囲内で、適宜改変することもできる。 The method for measuring the cAMP level in the present specification can be modified as appropriate within the scope of ensuring equivalence with the above method.
本明細書において、「受容体活性化レベル」とは、オキシトシンやＡＶＰに対する野生型あるいは変異型キメラ受容体の応答性を意味し、哺乳動物細胞中のオキシトシンやＡＶＰ非添加条件のＲＬＵに対する、オキシトシンやＡＶＰ存在下におけるｃＡＭＰレベルの比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）によって定義される。 As used herein, the term "receptor activation level" means the responsiveness of a wild-type or mutant chimeric receptor to oxytocin or AVP, and oxytocin in mammalian cells to RLU in the absence of oxytocin or AVP. or the ratio of cAMP levels in the presence of AVP (Fold change).
本明細書において、「シグナル／ノイズ比」及び「Ｓ／Ｎ比」、「Ｓ／Ｎ ｒａｔｉｏ」とは、前記ｃＡＭＰレベル測定法に従い野生型あるいは変異型キメラ受容体を一過性発現する株において、オキシトシンやＡＶＰを添加したときの、受容体活性化レベルを意味する。ある濃度Ｘ（ｐｇ／ｍＬ）のオキシトシンやＡＶＰを添加したときの受容体活性化レベルをＸ（ｐｇ／ｍＬ）におけるＳ／Ｎ比と定義する。 As used herein, the terms "signal/noise ratio", "S/N ratio", and "S/N ratio" refer to strains that transiently express wild-type or mutant chimeric receptor according to the cAMP level measurement method. , means the level of receptor activation when oxytocin or AVP is added. The receptor activation level when a certain concentration X (pg/mL) of oxytocin or AVP is added is defined as the S/N ratio at X (pg/mL).
本明細書において、特定濃度におけるオキシトシン又はＡＶＰに対するＳ／Ｎ比を表す文言として、「反応性」を用いることがある。「反応性」という文言を用いるときに、オキシトシン又はＡＶＰの濃度について特に言及がない場合、オキシトシン又はＡＶＰ １００（ｐｇ／ｍＬ）における反応性を意味する。本明細書において、「反応性が向上する」とは、Ｓ／Ｎ比値が増大することを意味する。 In this specification, the term "reactivity" may be used as a term representing the S/N ratio to oxytocin or AVP at a specific concentration. When the term "reactivity" is used, it means reactivity at 100 (pg/mL) of oxytocin or AVP, unless the concentration of oxytocin or AVP is specifically mentioned. As used herein, "improved reactivity" means an increase in the S/N ratio value.
本明細書において、受容体の「特異性」又は「オキシトシン特異性」とは、特定濃度のオキシトシンに対する反応性と、同一濃度のＡＶＰに対する反応性の商（（ＯＸＴに対するＳ／Ｎ比）／（ＡＶＰに対するＳ／Ｎ比）；ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ；ＯＸＴ／ＡＶＰ比）を意味する。オキシトシン又はＡＶＰの濃度について特に言及がない場合、オキシトシン又はＡＶＰ １００（ｐｇ／ｍＬ）における特異性を意味する。「特異性が向上する」とは、当該数値が増大することを意味する。 As used herein, the "specificity" or "oxytocin specificity" of a receptor refers to the quotient of reactivity to a specific concentration of oxytocin and reactivity to the same concentration of AVP ((S/N ratio to OXT)/( OXT/AVP ratio; OXT/AVP ratio). Specificity at oxytocin or AVP 100 (pg/mL) is meant when no specific mention is made of the concentration of oxytocin or AVP. "Improved specificity" means that the numerical value is increased.
本明細書において「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。 As used herein, the term “cAMP biosensor” refers to a self-derived index (e.g., enzymatic activity levels, color development levels, luminescence [fluorescence] levels). The cAMP biosensor usually has a cAMP-binding region, and when cAMP binds to the cAMP-binding region, the conformation of the cAMP biosensor changes, resulting in a change from an inactivated state to an activated state, or a non-activated state. It has an allosteric effect such as a change from visualized state to visualized state.
本発明の一態様は、（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５の少なくとも１つか、（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）に変異を有することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体である。 One aspect of the present invention is a part of the extracellular region of V2R, characterized by having a mutation in (1) at least one of V90, M122, Y126, A295, or (2) (210) ALMVF (214) is a chimeric receptor in which the extracellular region of OXTR is substituted for .
本発明の変異型キメラ受容体は、ＯＸＴ／ＡＶＰ比が向上している。当該変異型キメラ受容体は、オキシトシン特異的に受容体活性化レベルを測定できるため、好適にオキシトシンの測定に用いることができる。 The mutant chimeric receptors of the invention have an improved OXT/AVP ratio. Since the mutant chimeric receptor can measure the receptor activation level specifically for oxytocin, it can be suitably used for measuring oxytocin.
本発明に係る変異は、オキシトシンの測定に利用できる限りにおいて、アミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加のいずれでも良い。受容体の機能保持の観点から、前記（１）の変異は１～１０アミノ酸からなるアミノ酸配列との置換が好ましく、１～５アミノ酸からなるアミノ酸配列との置換がより好ましく、１アミノ酸置換（点変異）であることがより好ましい。前記（２）の変異も、同じアミノ酸数である５アミノ酸置換が好ましい。また、本発明に係る変異は、オキシトシンの測定に利用できる限りにおいて、複数個所に変異が導入されていてもよい。 The mutation according to the present invention may be deletion, substitution, insertion or addition of an amino acid as long as it can be used for measuring oxytocin. From the viewpoint of maintaining receptor function, the mutation in (1) is preferably a substitution with an amino acid sequence consisting of 1 to 10 amino acids, more preferably a substitution with an amino acid sequence consisting of 1 to 5 amino acids, and one amino acid substitution (point Mutation) is more preferred. The mutation (2) is also preferably 5 amino acid substitutions with the same number of amino acids. In addition, the mutation according to the present invention may be mutated at multiple sites as long as it can be used for measuring oxytocin.
本発明のキメラ受容体は、ＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．２（野生型キメラ受容体の２倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖのうち少なくとも１つの点変異か、もしくは（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異のうち、少なくとも１つの変異を有していることがより好ましい。但し、上記に記載した特定の変異以外の、同一箇所の変異であっても、キメラ受容体の特異性が向上する蓋然性が高いことは、後述の実施例３によって示唆されている。 The chimeric receptor of the present invention has been demonstrated in the Examples below to improve the OXT/AVP ratio to 0.2 (twice that of the wild-type chimeric receptor) or more, (3) V90A, at least one of M122A, M122V, M122I, M122T, M122L, M122G, M122W, M122P, M122S, M122N, M122Q, M122E, M122R, M122K, M122H, M122F, M122Y, M122D, M122C, Y126F, Y126L or (4) mutation from (210) ALMVF (214) to (210) TLAVY (214). However, Example 3, which will be described later, suggests that even mutations at the same site, other than the specific mutations described above, have a high probability of improving the specificity of the chimeric receptor.
中でも、ＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．５（野生型キメラ受容体の５倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｌのうち少なくとも１つの点変異を有していることがより好ましい。ＯＸＴ／ＡＶＰ比が１．０（野生型キメラ受容体の１０倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｌのうち少なくとも１つの点変異を有していることがより好ましい。ＯＸＴ／ＡＶＰ比が２．０（野生型キメラ受容体の２０倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｌのうち少なくとも１つの点変異を有していることがより好ましい。 Among them, it has been demonstrated in Examples described later that the OXT/AVP ratio is improved to 0.5 (5 times that of the wild-type chimeric receptor) or more. , M122P, M122S, M122N, M122Q, M122E, M122R, M122K, M122H, M122F, M122Y, M122D, M122C, and Y126L. Since it has been demonstrated in Examples described later that the OXT/AVP ratio is improved to 1.0 (10 times that of the wild-type chimeric receptor) or more, M122A, M122T, M122G, M122P, M122S, M122N, and M122E , M122Y, M122C and Y126L. Since it has been demonstrated in Examples described later that the OXT/AVP ratio is improved to 2.0 (20 times that of the wild-type chimeric receptor) or more, M122A, M122G, M122P, M122S, M122N, M122C, Y126L It is more preferable to have at least one point mutation among
本発明のキメラ受容体は、変異型キメラ受容体のＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．２（野生型キメラ受容体の２倍）以上に向上し、かつ、オキシトシン反応性が野生型キメラ受容体と比較して向上している（具体的には、オキシトシン１００（ｐｇ／ｍＬ）におけるＳ／Ｎ比が野生型キメラ受容体の１．２倍以上に向上している）ことが実証されているという点から、少なくともＭ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃ，Ａ２９５Ｖのうちいずれか１つの点変異を有していることがより好ましい。 In the chimeric receptor of the present invention, the OXT/AVP ratio of the mutant chimeric receptor is improved to 0.2 (twice that of the wild-type chimeric receptor) or more, and the oxytocin reactivity is compared to that of the wild-type chimeric receptor. It has been demonstrated that the Therefore, it is more preferable to have at least one point mutation among M122A, M122V, M122T, M122L, M122G, M122S, M122C and A295V.
さらに、本発明のキメラ受容体は、野生型キメラ受容体よりも高いオキシトシン反応性（具体的にはオキシトシン１００（ｐｇ／ｍＬ）におけるＳ／Ｎ比が野生型キメラ受容体の５．０倍以上）で、かつＯＸＴ／ＡＶＰ比が向上している（具体的にはＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．５以上に向上している）ことが実証されているという点から、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｃのいずれかの点変異を有することがより好ましい。中でも、野生型キメラ受容体よりも非常に高いオキシトシン反応性（具体的にはＳ／Ｎ比が７．０倍以上）を有し、かつＡＶＰよりもオキシトシン優位な反応性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが１．５以上）を有することが実証されているという点から、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔのいずれかの点変異を有することがより好ましい。 Furthermore, the chimeric receptor of the present invention has higher oxytocin reactivity than the wild-type chimeric receptor (specifically, the S/N ratio at oxytocin 100 (pg/mL) is 5.0 times or more that of the wild-type chimeric receptor. ), and the OXT/AVP ratio is improved (specifically, the OXT/AVP ratio is improved to 0.5 or more). , M122C. Among them, it has a much higher oxytocin reactivity than the wild-type chimeric receptor (specifically, the S/N ratio is 7.0 times or more), and a reactivity that is superior to AVP for oxytocin (OXT/AVP ratio is 1.5 or more), it is more preferable to have any one of M122A, M122V, and M122T point mutations.
本発明に用いることができるＯＸＴＲおよびＶ２Ｒは、オキシトシンなどの測定対象に反応を示す限りにおいて、その由来に制限はない。動物細胞にて発現した際にヒトのＯＸＴＲおよびＶ２Ｒと近い反応性を示すことから、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができる。中でも、生体内のオキシトシンなどのリガンドに対する受容体活性を比較的よく反映できる点から、ヒトＯＸＴＲ及びヒトＶ２Ｒであることがより好ましい。 OXTR and V2R that can be used in the present invention are not limited in origin as long as they show a response to a measurement target such as oxytocin. Since it shows reactivity close to human OXTR and V2R when expressed in animal cells, it can be used in rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, lagomorphs such as rabbits, pigs, cattle, goats, horses and sheep. Examples include cells derived from ungulates such as ungulates, felines such as dogs and cats, and primates such as humans, monkeys, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, marmosets, orangutans, and chimpanzees. Among them, human OXTR and human V2R are more preferable because they can relatively well reflect receptor activity for ligands such as oxytocin in vivo.
本発明の変異型キメラ受容体は、これまで記載した変異の他に、ＯＸＴＲ活性の顕著な低下やＳ／Ｎ比の顕著な低下を引き起こさない範囲内で、さらにアミノ酸配列を欠失、置換、挿入もしくは付加する変異を有していても良い。一般に、特に活性と直接的に関与しない部位において、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、又は他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持しうる(Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)ことが知られている。 In addition to the mutations described above, the mutant chimeric receptor of the present invention further comprises deletions, substitutions, and substitutions of amino acid sequences within a range that does not cause a significant decrease in OXTR activity or a significant decrease in S/N ratio. It may have insertion or addition mutations. In general, a polypeptide that has one or several amino acid residues deleted, added, inserted, or substituted with other amino acids, particularly at sites not directly involved in the activity, retains its biological activity. (Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666., Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500. Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.).
本発明の変異型キメラ受容体は、Ａ１６７，Ｌ１７７，Ａ２１６，Ａ２８５，Ｌ３０６に変異を有していてもよく、中でもＡ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａの点変異を有していてもよい。後述の実施例２の結果より、上記の変異により、本発明のキメラ受容体におけるオキシトシン反応性が向上することが期待される。実施例４の結果より、これらの変異を導入しても、本発明のキメラ受容体におけるオキシトシン特異性向上効果は悪影響を受けない蓋然性が高いことが示唆されている。 The mutant chimeric receptor of the present invention may have mutations at A167, L177, A216, A285 and L306, and may have point mutations at A167L, L177V, A216I, A285T and L306A. Based on the results of Example 2 described later, it is expected that the above mutations improve the oxytocin reactivity of the chimeric receptor of the present invention. The results of Example 4 suggest that introduction of these mutations is highly likely not to adversely affect the oxytocin specificity-enhancing effect of the chimeric receptor of the present invention.
本発明の実施形態に係る変異型キメラ受容体は、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係るキメラ受容体は、特定のアミノ酸配列を含むといえる。一般的に、タンパク質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばＮ末端修飾（例えば、アセチル化 、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、又は側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。 Any amino acid in the amino acid sequence of the mutant chimeric receptor according to the embodiment of the present invention may be chemically modified. In such cases, chimeric receptors according to embodiments of the invention are still said to comprise a particular amino acid sequence. In general, chemical modifications that amino acids contained in proteins undergo in vivo include, for example, N-terminal modifications (e.g., acetylation, myristoylation, etc.), C-terminal modifications (e.g., amidation, glycosylphosphatidylinositol addition, etc.), Alternatively, side chain modifications (for example, phosphorylation, sugar chain addition, etc.) are known.
本発明の一態様は、前記キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドである。本発明の一態様は、前記変異型キメラ受容体を発現する、動物細胞である。 One aspect of the invention is a polynucleotide encoding said chimeric receptor. One aspect of the present invention is an animal cell that expresses the mutant chimeric receptor.
本発明の一態様であるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成可能である。その他、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明の変異型キメラ受容体のアミノ酸配列と、遺伝暗号表から、適宜設計することができる。 A polynucleotide that is one aspect of the present invention can be synthesized using a DNA/RNA synthesizer. In addition, they can also be purchased from contract companies for DNA base or RNA base synthesis (for example, Invitrogen, Takara Bio, etc.). The polynucleotide sequence of the present invention can be appropriately designed from the amino acid sequence of the mutant chimeric receptor of the present invention and the genetic code table.
前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、一般に知られている分子生物学的手法によって調製することができ、その調製方法として、例えばＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法、ライゲーション法、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング法、アッセンブリ―法等が例示される。 A vector containing the polynucleotide can be prepared by a generally known molecular biological technique, and examples of the preparation method include TA cloning method, blunt-end cloning method, ligation method, In-fusion cloning method, Gateway Cloning method, assembly method and the like are exemplified.
本発明の一態様である動物細胞は、前記ベクターの導入により、前記変異型キメラ受容体が一過的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）又は安定的（ｓｔａｂｌｅ）に発現する動物細胞であればよい。使用される細胞株に特に限定は無いが、購入や実験のし易さの点から、ヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］、ヒト骨肉腫細胞株［Ｕ２ＯＳ細胞］が好ましく、中でも遺伝子導入効率や安定増殖の点からヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］がより好ましい。 The animal cell, which is one aspect of the present invention, may be any animal cell that transiently or stably expresses the mutant chimeric receptor upon introduction of the vector. The cell lines used are not particularly limited, but human embryonic kidney cell-derived cell lines [HEK293 cells, HEK293T cells, etc.], Chinese hamster ovary-derived cell lines [CHO cells], Human osteosarcoma cell lines [U2OS cells] are preferable, and human embryonic kidney cell-derived cell lines [HEK293 cells, HEK293T cells, etc.] and Chinese hamster ovary-derived cell lines [CHO cells] are more preferable in terms of gene transfer efficiency and stable growth. preferable.
本発明の動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］のＩＥ［immediate early］遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０［Simian virus 40］の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているＴＳＨ受容体をコードする遺伝子を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。リガンドの測定に用いられるために、適宜キメラ受容体をコードする遺伝子以外の遺伝子が導入されていても良く、例えばｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子が導入されていても良い。 Animal cells of the present invention can be produced by genetic engineering techniques commonly used in this field. For example, promoters (e.g., cytomegalovirus [CMV] IE [immediate early] gene promoter, SV40 [Simian virus 40] early promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SRα promoter, NFAT promoter, HIF promoter) and a vector (e.g., pcDNA3.1(+), pcDM8, pAGE107, pAS3-3, pCDM8) containing a gene encoding a TSH receptor operably linked downstream of such promoter is electroposited. It can be obtained by introduction (transfection) into mammalian cells using methods such as the poration method, the calcium phosphate method, the lipofection method, the DEAE (Diethylaminoethyl) dextran method, and the virus infection method. For use in ligand measurement, genes other than genes encoding chimeric receptors may be appropriately introduced, for example, genes encoding cAMP biosensors may be introduced.
本発明に用いることのできるｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（文献「Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.」参照）を挙げることができ、本実施例において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。 Examples of cAMP biosensors that can be used in the present invention include reporter proteins containing a cAMP-binding region (e.g., cAMP-binding region derived from the regulatory subunit of protein kinase A [PKA], cAMP-binding region derived from Epac1) (e.g. , HRP [horseradish peroxidase]; alkaline phosphatase; β-D-galactosidase; luciferases such as green luciferase [SLG], orange luciferase [SLO], red luciferase [SLR]; [DsRed], cyan fluorescent protein [CFP] and other fluorescent proteins), and specifically, GloSensor cAMP (manufactured by Promega), which is a luciferase containing a cAMP-binding region derived from the regulatory subunit of PKA, and , Pink Flamindo (Pink Fluorescent cAMP indicator), a red fluorescent protein containing a cAMP-binding domain derived from Epac1 (Reference "Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038 /s41598-017-07820-6.”), and GloSensor cAMP (manufactured by Promega) is preferable because its effect is demonstrated in this example.
本発明の一態様は、前記変異型キメラ受容体を発現する動物細胞を含む、オキシトシンの測定キットである。 One aspect of the present invention is an oxytocin assay kit comprising animal cells expressing the mutant chimeric receptor.
本発明の一態様であるオキシトシン測定キットは、常用されている試薬を適宜用いることができる。一例として、動物細胞液、発光基質液、反応プレート、標準液、希釈液のようなキット構成が考えられる。 The oxytocin measurement kit that is one embodiment of the present invention can appropriately use commonly used reagents. As an example, a kit configuration such as an animal cell solution, a luminescent substrate solution, a reaction plate, a standard solution, and a diluent can be considered.
本発明の一態様は、（１）に記載されたアミノ酸のうち少なくとも１つか、もしくは（２）に記載する領域に変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性向上方法である。
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）
One aspect of the present invention is characterized in that at least one of the amino acids described in (1) or the region described in (2) is mutated, and a portion of the extracellular region of V2R is replaced with OXTR. is a method for improving the oxytocin specificity of a chimeric receptor substituted with the extracellular domain of
(1) V90, M122, Y126, A295
(2) (210) ALMVF (214)
本発明の一態様は、（３）に記載された点変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法である。
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異
One aspect of the present invention is characterized by introducing at least one of the point mutations described in (3) or the mutation described in (4), wherein a part of the extracellular region of V2R is replaced with OXTR A method for improving the oxytocin specificity and oxytocin reactivity of a chimeric receptor substituted in the extracellular domain.
(3) V90A, M122A, M122V, M122I, M122T, M122L, M122G, M122W, M122P, M122S, M122N, M122Q, M122E, M122R, M122K, M122H, M122F, M122Y, M122D, M122C, Y12V9, Y126F, Y126F
(4) Mutation from (210) ALMVF (214) to (210) TLAVY (214)
本発明の一態様は、前記（１）～（４）に記載の変異のいずれかに加え、Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａのいずれかの点変異を導入することを特徴とする、キメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法である。 In one aspect of the present invention, in addition to any of the mutations described in (1) to (4) above, a chimera characterized by introducing a point mutation of any of A167L, L177V, A216I, A285T, and L306A A method for improving the oxytocin specificity of a receptor and improving the oxytocin reactivity.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
実施例１．変異型キメラ受容体の調製
以下に示す方法に従い、野生型キメラ受容体を元に、変異型キメラ受容体を調製した。
Example 1. Preparation of Mutant Chimeric Receptor Based on the wild-type chimeric receptor, a mutant chimeric receptor was prepared according to the method shown below.
１－１．点変異の設計
Ｖ２Ｒの細胞外領域をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒに対して、以下の変異導入検討を実施した。
1-1. Design of Point Mutations The chimeric receptor OXTR(E123)-V2R in which the extracellular domain of V2R was replaced with the extracellular domain of OXTR was examined for the introduction of the following mutations.
野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒのタンパク質構造を、図１に模式的に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列について、配列番号３及び図２に示す。図２において、下線部で示すアミノ酸配列はＯＸＴＲ由来の配列を、特に下線部のない配列はＶ２Ｒ由来の配列を表している。 The protein structure of the wild-type chimeric receptor OXTR(E123)-V2R is shown schematically in FIG. The amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 3 and FIG. In FIG. 2, the underlined amino acid sequences represent OXTR-derived sequences, and the sequences without underline represent V2R-derived sequences.
キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒへ導入した変異の箇所を、図３に示す。網掛けが変異点の位置を表す。なお、（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）の変異は、後述するようにキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）配列を（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）配列に置換したものである。上記以外の変異点については、いずれも点変異であり、連続する２アミノ酸以上を置換等した変異は含まれない。変異後のアミノ酸については、後述の表１－１～表１－３に記載する。 FIG. 3 shows the sites of mutations introduced into the chimeric receptor OXTR(E123)-V2R. Shading indicates positions of mutation points. The (210) ALMVF (214) mutation is obtained by replacing the (210) ALMVF (214) sequence of the chimeric receptor OXTR (E123)-V2R with the (210) TLAVY (214) sequence, as described later. . Mutation points other than those described above are all point mutations and do not include mutations such as substitution of two or more consecutive amino acids. Amino acids after mutation are described in Tables 1-1 to 1-3 below.
１－２．変異キメラ受容体の発現ベクター調製
１－１．及び後述の表１－１～表１－３に記載した変異に対応するよう、変異点に相当するヌクレオチドを挟んで３’側と５’側に２０～３０ｍｅｒの人工プライマーを設計し、キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの３’側プライマーと変異導入するための１～５塩基を追加した５’側プライマーと、キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒを発現するベクターpYS_CMV_OXTR(E123)-V2R_Puro用いて、東洋紡社ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ＳＭＫ－１０１）によるｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法で、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒ配列への点変異導入を行った。点変異導入プラスミドを形質転換した大腸菌シングルコロニーからプラスミドを精製、シーケンス解析により点変異の導入を確認した。
1-2. Preparation of Mutant Chimeric Receptor Expression Vector 1-1. And to correspond to the mutations described in Tables 1-1 to 1-3 below, design artificial primers of 20 to 30 mers on the 3' side and 5' side of the nucleotide corresponding to the mutation point, and accept the chimera OXTR (E123)-V2R 3'-side primer and 5'-side primer with 1 to 5 bases added for mutagenesis, and vector pYS_CMV_OXTR (E123)-V2R_Puro expressing chimeric receptor OXTR (E123)-V2R Point mutation was introduced into the OXTR(E123)-V2R sequence by the inverse PCR method using Toyobo KOD-plus-Mutagenesis Kit (Code No. SMK-101). Plasmids were purified from single colonies of Escherichia coli transformed with point mutation-introduced plasmids, and introduction of point mutations was confirmed by sequence analysis.
１－３．キメラ受容体一過性発現細胞株の取得
１．５×１０４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地とともに６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
１－２．にて取得した変異型キメラ受容体ベクター０.５μｇと、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSensor-22F、Promega社製）１．５μｇを、PEI MAX（Polyscience社製）と１：４の比率で混合、２０分静置した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加してトランスフェクションした。上記操作によって、キメラ受容体を一過性発現する、ＨＥＫ２９３細胞を取得した。
1-3. Obtaining Cell Lines Transiently Expressing Chimeric Receptors 1.5×10 4 human embryonic kidney cell-derived cell lines (HEK293 cells) (obtained from ECACC [European Collection of Authenticated Cell Cultures], Cat no. 85120602) were The cells were seeded in a 6-well multiplate together with D-MEM medium containing 10% FBS and cultured for 24 hours.
1-2. 0.5 μg of the mutant chimeric receptor vector obtained in , the 359th to 544th amino acid residues of firefly luciferase, the cAMP binding region of the regulatory subunit of protein kinase A (PKA), and firefly luciferase 1.5 μg of a plasmid vector (pGloSensor-22F, manufactured by Promega) expressing a protein containing amino acid residues 4 to 355 of and mixed with PEI MAX (manufactured by Polyscience) at a ratio of 1: 4, 20 minutes After allowing to stand, they were added to HEK293 cells for transfection. HEK293 cells transiently expressing the chimeric receptor were obtained by the above operation.
変異型キメラ受容体の一過性発現株に対する対照として用いるため、１－２記載の野生型キメラ受容体の発現ベクターにより、野生型キメラ受容体一過性発現株も取得した。 A wild-type chimeric receptor transient expression strain was also obtained using the wild-type chimeric receptor expression vector described in 1-2 as a control for the mutant chimeric receptor transient expression strain.
実施例２．変異型キメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰに対する活性測定
実施例１にて得られた、pGloSensor-22Fと、変異型キメラ受容体あるいは野生型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、オキシトシンあるいはＡＶＰを添加して、各変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比を測定した。
Example 2. Measurement of activity of mutant chimeric receptors against oxytocin and AVP Oxytocin or AVP was added to HEK293 cells transiently expressing pGloSensor-22F obtained in Example 1 and mutant chimeric receptors or wild-type chimeric receptors. was added to measure the S/N ratio of each mutant chimeric receptor.
測定法は以下の通りである。
[測定条件]
pGloSensor-22Fと、野生型キメラ受容体あるいは変異型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞を２４時間培養後、細胞を回収、インキュベート用液に６．０×１０５cells/mLとなるよう置換し、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（Corning社製）に２６μLずつ分注した。８ｍＭ D-Luciferin（OZBIOACIENCE社製、１０ｍＭ HEPES-KOH, ｐＨ７．５で溶解）を１０μＬずつ加え、遮光して室温で２時間静置した。２時間後、オキシトシンあるいはＡＶＰを０、０．１、１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｐｇ／ｍＬとなるよう添加、２０分間インキュベーションした後のＲＬＵ値を９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）で測定した。
The measuring method is as follows.
[Measurement condition]
HEK293 cells transiently expressing pGloSensor -22F and wild-type chimeric receptor or mutant chimeric receptor were cultured for 24 hours. 26 μL each was dispensed onto a 96-well half area white plate (manufactured by Corning). 10 μL of 8 mM D-Luciferin (manufactured by OZBIOACIENCE, dissolved in 10 mM HEPES-KOH, pH 7.5) was added, and the mixture was shielded from light and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After 2 hours, oxytocin or AVP was added to 0, 0.1, 1, 10, 100, 1000, 10000 and 100000 pg/mL, and after incubation for 20 minutes, the RLU value was measured using a 96-well multiplate luminometer (Promega). (manufactured).
表１－１～表１－３に、野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒに導入した変異、各キメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰの各濃度におけるＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）、オキシトシン１００ｐｇ／ｍＬにおける野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２ＲのＳ／Ｎ比に対する変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比の比率（／ＷＴ ｒａｔｉｏ）、各キメラ受容体のＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおけるＳ／Ｎ比に対するオキシトシン１００ｐｇ／ｍＬにおけるＳ／Ｎ比の比率（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）を示す。 Tables 1-1 to 1-3 show the mutations introduced into the wild-type chimeric receptor OXTR (E123)-V2R, the S/N ratio (Fold change) at each concentration of oxytocin and AVP of each chimeric receptor, and oxytocin 100 pg. S/N ratio of mutant chimeric receptor to wild-type chimeric receptor OXTR(E123)-V2R in /mL (/WT ratio), S/N at AVP 100 pg/mL of each chimeric receptor The ratio of the S/N ratio at 100 pg/mL oxytocin to the ratio (OXT/AVP ratio) is shown.
Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ｍ１，Ａ２９５Ｖの変異を有する変異型キメラ受容体では、１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．２０以上となった。野生型キメラ受容体（表中ＷＴ）の１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏは０．１０であるため、上記変異型キメラ受容体のＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏは、野生型キメラ受容体と比較して明確に高い値を示している。 The mutant chimeric receptor having the mutations V90A, M122V, Y126F, Y126L, M1, and A295V had an OXT/AVP ratio of 0.20 or more at 100 pg/mL. Since the OXT/AVP ratio at 100 pg/mL of the wild-type chimeric receptor (WT in the table) is 0.10, the OXT/AVP ratio of the mutant chimeric receptor is clear compared to the wild-type chimeric receptor. shows a high value for
上記ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上した変異型キメラ受容体の中でも、Ｍ１２２Ｖ，Ｙ１２６Ｆの変異を有する変異型キメラ受容体では、１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．５以上となった。 Among the mutant chimeric receptors with improved OXT/AVP ratio, the mutant chimeric receptor having M122V and Y126F mutations had an OXT/AVP ratio of 0.5 or more at 100 pg/mL.
ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ ０．２０以上変異型キメラ受容体の内、Ｍ１２２Ｖ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖの変異を有する変異型キメラ受容体において、オキシトシン反応性が野生型と同等以上であった。特に、Ａ２９５Ｖ変異型キメラ受容体は野生型キメラ受容体と比較してオキシトシン反応性が約４．４倍、Ｍ１２２Ｖ変異型キメラ受容体はオキシトシン反応性が約１０．６倍に向上していた。 OXT/AVP ratio 0.20 or more Among the mutant chimeric receptors, the mutant chimeric receptors having the M122V, Y126F, Y126L, and A295V mutations had an oxytocin reactivity equal to or higher than that of the wild type. In particular, the A295V mutant chimeric receptor had an oxytocin reactivity about 4.4 times higher than the wild-type chimeric receptor, and the M122V mutant chimeric receptor had an oxytocin reactivity about 10.6 times higher.
Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａの変異を有するキメラ受容体は、１００ｐｇ／ｍＬにおけるオキシトシン特異性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）は野生型キメラ受容体（表中ＷＴ）と同等程度だったものの、１００ｐｇ／ｍＬにおけるオキシトシン反応性は野生型キメラ受容体（表中ＷＴ）の１．１倍以上であった。特にＡ２８５Ｔに変異を有するキメラ受容体は、オキシトシンに対する反応性が２．３２倍に向上していた。 Chimeric receptors with A167L, L177V, A216I, A285T, and L306A mutations had oxytocin specificity (OXT/AVP ratio) at 100 pg/mL comparable to that of the wild-type chimeric receptor (WT in the table), but at 100 pg/mL The oxytocin reactivity in /mL was 1.1 times or more that of the wild-type chimeric receptor (WT in the table). In particular, the chimeric receptor with the A285T mutation had a 2.32-fold increase in reactivity to oxytocin.
Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌに変異を有するキメラ受容体は、ともに１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上していた。それぞれの変異アミノ酸に注目すると、Ｙ１２６Ｆでは１２６番目のＴｙｒ（Ｙ）がＰｈｅ（Ｆ）に、Ｙ１２６Ｌでは１２６番目のＴｙｒ（Ｙ）がＬｅｕ（Ｌ）に置換されている。Ｐｈｅ（Ｆ）は芳香族含有側鎖を有するのに対し、Ｌｅｕ（Ｌ）は脂肪族側鎖を有することから、これら変異後のアミノ酸は性質を異にする。一方で、どちらの変異型キメラ受容体においてもＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上していることから、本実施例においてＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏの向上が確認された変異点においては、変異後のアミノ酸の種類に関わらず、ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上する可能性が示唆された。 Both chimeric receptors having mutations in Y126F and Y126L had an improved OXT/AVP ratio at 100 pg/mL. Focusing on each mutated amino acid, Tyr (Y) at position 126 in Y126F is substituted with Phe (F), and Tyr (Y) at position 126 in Y126L is substituted with Leu (L). Since Phe (F) has an aromatic-containing side chain, while Leu (L) has an aliphatic side chain, these mutated amino acids have different properties. On the other hand, the OXT/AVP ratio is improved in both mutant chimeric receptors. Regardless, it was suggested that the OXT/AVP ratio may improve.
実施例３．Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰに対する活性測定
実施例２で、Ｙ１２６に点変異を有する２種類のキメラ受容体が、ともにオキシトシン特異性が向上していたことを受け、変異後のアミノ酸の種類による、オキシトシン特異性向上効果への影響を検討した。
Example 3. Activity measurement for oxytocin and AVP of M122 site mutant chimeric receptor In Example 2, two types of chimeric receptors having a point mutation at Y126 both had improved oxytocin specificity. We examined the effect of the type of oxytocin on the effect of improving oxytocin specificity.
本実施例では、実施例２の結果より産業上有用であると思われたＭ１２２部位変異型キメラ受容体について、バリン以外のアミノ酸への置換による影響を検討した。具体的には、pGloSensor-22Fと、Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体あるいは野生型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、オキシトシンあるいはＡＶＰを添加して、各Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比を測定した。 In this example, the effect of substituting an amino acid other than valine on the M122-site mutant chimeric receptor, which was considered to be industrially useful from the results of Example 2, was examined. Specifically, oxytocin or AVP was added to HEK293 cells transiently expressing pGloSensor-22F and M122 site mutant chimeric receptor or wild-type chimeric receptor, and each M122 site mutant chimeric receptor The S/N ratio was measured.
測定法は、Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体を用いる以外は実施例２と同様に行った。 The measurement method was the same as in Example 2, except that the M122 site mutant chimeric receptor was used.
野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの、オキシトシンおよびＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおける反応比（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）を、表２－１～表２－２に示す。 Tables 2-1 and 2-2 show the response ratio (OXT/AVP ratio) of the wild-type chimeric receptor OXTR(E123)-V2R at 100 pg/mL of oxytocin and AVP.
上記Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒにおいては、驚くべきことに、全ての変異型キメラ受容体において、ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．２０以上であり、オキシトシン特異性が向上することが見いだされた。 Surprisingly, in the M122 site mutant chimeric receptor OXTR(E123)-V2R, all the mutant chimeric receptors have an OXT/AVP ratio of 0.20 or more, and oxytocin specificity is improved. was found.
また、変異型キメラ受容体におけるオキシトシン反応性を測定したところ、Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃでオキシトシン反応性が野生型キメラ受容体の１．２倍以上に向上していた。特に、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｃは／ＷＴ ｒａｔｉｏが５．０倍以上の高いオキシトシン反応性、かつ高いオキシトシン特異性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．５以上）を有していた。中でも、Ｍ１２２Ａ、Ｍ１２２Ｔは／ＷＴ ｒａｔｉｏが７．０倍以上の高いオキシトシン反応性、かつＡＶＰよりもオキシトシン優位な反応性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが１．５以上）を有していた。 In addition, when the oxytocin reactivity of the mutant chimeric receptors was measured, M122V, M122A, M122L, M122T, M122G, M122S, and M122C showed that the oxytocin reactivity was improved by more than 1.2 times that of the wild-type chimeric receptor. . In particular, M122A, M122V, M122T, M122L, and M122C had high oxytocin reactivity with a /WT ratio of 5.0 times or more and high oxytocin specificity (OXT/AVP ratio of 0.5 or more). Among them, M122A and M122T had a high oxytocin reactivity with a /WT ratio of 7.0 times or more and a reactivity that is superior to AVP with oxytocin (OXT/AVP ratio of 1.5 or more).
Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの全てにおいて、野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒよりもオキシトシン特異性が向上するという本実施例の結果からは、生体内のＶ２Ｒにおいて、オキシトシン及び／又はＡＶＰとの結合性に関与するいくつかの重要なアミノ酸では、ＡＶＰ受容体はＡＶＰに対する特異性を高めるために分子進化し、オキシトシンに対する反応性を抑制するために最適化されている可能性が示唆される。本仮説に従えば、実施例２でオキシトシン特異性が向上した変異点については、いずれのアミノ酸変異であっても、オキシトシン特異性が向上する可能性が示唆される。 From the result of this example that all of the M122 site mutant chimeric receptors OXTR(E123)-V2R have improved oxytocin specificity compared to the wild-type chimeric receptor OXTR(E123)-V2R, in vivo V2R , with several key amino acids involved in binding to oxytocin and/or AVP, AVP receptors have been molecularly evolved to increase specificity for AVP and optimized to suppress reactivity to oxytocin. It is suggested that there may be According to this hypothesis, it is suggested that any amino acid mutation at which the oxytocin specificity was improved in Example 2 may improve the oxytocin specificity.
実施例４．二重の変異を導入したキメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰに対する活性測定
実施例２でオキシトシン反応性向上に有効と思われた変異型キメラ受容体Ａ２８５Ｔ、特異性向上に有効と思われた変異型キメラ受容体Ｙ１２６Ｆについて、二重変異型キメラ受容体（Ｙ１２６Ｆ／Ａ２８５Ｔ）を作製し、二重の変異を導入することによる影響を検討した。
Example 4. Measurement of activity against oxytocin and AVP of chimeric receptors introduced with double mutation Mutant chimeric receptor A285T considered effective in improving oxytocin responsiveness in Example 2, Mutant chimeric receptor thought effective in improving specificity For the receptor Y126F, a double mutant chimeric receptor (Y126F/A285T) was prepared and the effects of introducing double mutations were examined.
具体的には、pGloSensor-22Fと、各変異型キメラ受容体あるいは野生型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、オキシトシンあるいはＡＶＰを添加して、各変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比を測定した。 Specifically, oxytocin or AVP was added to HEK293 cells transiently expressing pGloSensor-22F and each mutant chimeric receptor or wild-type chimeric receptor, and the S/N ratio of each mutant chimeric receptor was determined. ratio was measured.
測定法は、単独変異Ｙ１２６Ｆの変異型キメラ受容体、Ａ２８５Ｔの変異型キメラ受容体、二重変異型キメラ受容体（Ｙ１２６Ｆ／Ａ２８５Ｔ）の各変異型キメラ受容体を用いる以外は実施例２と同様に行った。 The measurement method is the same as in Example 2 except that each mutant chimeric receptor of a single mutant Y126F mutant, A285T mutant chimeric receptor, and double mutant chimeric receptor (Y126F/A285T) is used. went to
野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの、オキシトシンおよびＡＶＰの各濃度におけるＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に対する、各変異型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの比率（／ＷＴ ｒａｔｉｏ）と、オキシトシンおよびＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおける反応比（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）を、表３に示す。 The ratio (/WT ratio) of each mutant chimeric receptor OXTR (E123)-V2R to the S/N ratio (Fold change) of the wild-type chimeric receptor OXTR (E123)-V2R at each concentration of oxytocin and AVP , oxytocin and AVP at 100 pg/mL (OXT/AVP ratio) are shown in Table 3.
二重変異（Ｙ１２６Ｆ／Ａ２８５Ｔ）のキメラ受容体は、Ｙ１２６Ｆのオキシトシン特異性向上と、Ａ２８５Ｔのオキシトシン反応性向上の、両特性を有していた。 The double-mutated (Y126F/A285T) chimeric receptor possessed both Y126F enhanced oxytocin specificity and A285T enhanced oxytocin reactivity.
本実施例の結果からは、異なる２種類の変異（例えば、オキシトシン特異性を向上させる変異と、オキシトシン反応性を向上させる変異）を組み合わせた場合、二重変異株においては、それぞれの変異によって奏される効果を併せ持つ（上記の例であればオキシトシン特異性とオキシトシン反応性がともに高い変異型受容体が取得される）蓋然性が高いことが示唆された。このことから、本発明のうち、オキシトシン特異性を高めるがオキシトシン反応性を高めない変異についても、オキシトシン反応性を高める変異と組み合わせることにより、オキシトシン特異性とオキシトシン反応性のどちらも高いキメラ受容体を取得できることが予想され、産業上有用であると考えられた。 From the results of this example, when two different types of mutations (e.g., a mutation that improves oxytocin specificity and a mutation that improves oxytocin reactivity) are combined, the double mutant strains show the effect of each mutation. It was suggested that there is a high probability that both oxytocin-specific and oxytocin-reactive mutant receptors are obtained in the above example. From this, it can be concluded that among the present invention, mutations that enhance oxytocin specificity but do not enhance oxytocin reactivity can be combined with mutations that enhance oxytocin reactivity to create chimeric receptors with both high oxytocin specificity and oxytocin reactivity. can be obtained, and it is considered industrially useful.
本発明は、オキシトシンの特異的な測定に資するものである。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention contributes to specific measurement of oxytocin.
Claims (13)
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４） Part of the extracellular region of V2R is replaced with the extracellular region of OXTR, characterized by having a mutation in at least one of the amino acids described in (1) or in the region described in (2). chimeric receptor.
(1) V90, M122, Y126, A295
(2) (210) ALMVF (214)
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異 Part of the extracellular region of V2R according to claim 1 or 2, characterized by having at least one of the point mutations described in (3) or the mutation described in (4). a chimeric receptor substituted for the extracellular region of OXTR;
(3) V90A, M122A, M122V, M122I, M122T, M122L, M122G, M122W, M122P, M122S, M122N, M122Q, M122E, M122R, M122K, M122H, M122F, M122Y, M122D, M122C, Y12V9, Y126F, Y126F
(4) Mutation from (210) ALMVF (214) to (210) TLAVY (214)
Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃ，Ａ２９５Ｖ A part of the extracellular region of V2R according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it has at least one of the following point mutations: a chimeric receptor substituted with;
M122A, M122V, M122T, M122L, M122G, M122S, M122C, A295V
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４） Part of the extracellular region of V2R is replaced with the extracellular region of OXTR, characterized by introducing mutations into at least one of the amino acids described in (1) or the region described in (2). Method for improving oxytocin specificity of chimeric receptor;
(1) V90, M122, Y126, A295
(2) (210) ALMVF (214)
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異 A chimera in which a part of the extracellular region of V2R is replaced with the extracellular region of OXTR, characterized by introducing at least one of the point mutations described in (3) or the mutation described in (4) A method for increasing oxytocin specificity of a receptor and increasing oxytocin responsiveness;
(3) V90A, M122A, M122V, M122I, M122T, M122L, M122G, M122W, M122P, M122S, M122N, M122Q, M122E, M122R, M122K, M122H, M122F, M122Y, M122D, M122C, Y12V9, Y126F, Y126F
(4) Mutation from (210) ALMVF (214) to (210) TLAVY (214)
Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａ A method for improving oxytocin specificity and improving oxytocin reactivity of a chimeric receptor, characterized by introducing mutations to the following amino acids in addition to the mutations according to claim 11 or claim 12;
A167L, L177V, A216I, A285T, L306A
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