JP2022120578A - Ｃｃａａｔ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤、ｉｌ－１関与炎症性疾患の治療薬、及び、ｉｌ－１又はｉｌ－１７関与炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＩＶＩＧ不応川崎病患者に対する新規治療薬の実現。【解決手段】本発明のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤は、イタコン酸又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する。【選択図】図９

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ・刊行物名「Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ７５，Ｉｓｓｕｅ ８，ｐ．２１０２－２１０５」 発行日 令和２年３月１８日

本発明は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬、及び、ＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法に関する。

小児に特有の病因不明な血管炎である川崎病は、患者数が年々増加しており、２０１８年の新規患者数は１７，０００名を超えた。標準治療薬である免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩＧ）は８０％の患者に有効であるのに対し、２０％の患者はＩＶＩＧ不応で心後遺症（冠動脈瘤）の発生リスクが高いことが知られている。

ＩＶＩＧ製剤は川崎病を含めた様々な免疫疾患の治療に用いられており、数千人の健常成人血漿から精製された多価ＩｇＧを含む生物学的製剤である。そのため本製剤には「他の医薬品にはないユニークな特徴」として、多彩な標的細胞及び標的分子を介して臨床効果を発揮できる利点がある。一方でこの構造・作用標的の多様性は、本製剤の作用機序の検証解明を困難にしており、何故８割の川崎病患者に有効であるのか、そのメカニズムについては仮説の域を出なかった。また、ＩＶＩＧ不応メカニズムも不明である。

ＩＶＩＧ製剤は生物学的製剤であるため、安全性及び安定した供給に対する懸念が残されている。原料を献血に依存しているため製造供給量に制限がある一方で、ＩＶＩＧ製剤を標準治療とする川崎病患者は増え続けている。また近年、成人領域疾患への適応拡大に伴うＩＶＩＧ製剤の使用量が増加している。したがって、将来的には患者数に見合ったＩＶＩＧ製剤の供給が困難になる懸念も予測されている。

非特許文献１には、臨床データを用いたＩＶＩＧ不応予測リスクスコアが実臨床の現場で活用されており、８０％程度の感度又は特異度で治療前に川崎病患者のＩＶＩＧ不応を予測できるようになったことが記載されている。

一方、ＩＶＩＧ不応と予測された川崎病患者に対しても非特許文献２の治療ガイドラインに基づいて、安全面に懸念のあるＩＶＩＧ治療をせざるを得ないという倫理面においても課題があった。

非特許文献３～８には、川崎病のＩＶＩＧ不応には炎症性サイトカインＩＬ－１β又はＩＬ－１７Ａが重要な因子として関与していることが記載されている。また、本発明者らはこれまでに、川崎病の病態形成の場である冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）の培養系をin vitroの川崎病モデルとして用い、ＩＶＩＧ製剤の分子特異的な抗炎症機序を明らかにしている（非特許文献９）。

Kobayashi T. et al. Prediction of intravenous immunoglobulin unresponsiveness in patients with Kawasaki disease. Circulation 2006;113:2606-2612 川崎病急性期治療のガイドライン（平成２４年改訂版） Fury W., et al. Transcript abundance patterns in Kawasaki disease patients with intravenous immunoglobulin resistance. Hum Immunol. 2010;71:865-873 Weng K.P., et al. IL-1B polymorphism in association with initial intravenous immunoglobulin treatment failure in Taiwanese children with Kawasaki disease. Circ J. 2010;74:544-551 Alphonse M.P., et al. Inositol-triphosphate 3-kinase C mediates inflammasome activation and treatment response in Kawasaki disease. J Immunol. 2016;197:3481-3489 Burns J.C., et al. Found in translation: international initiatives pursuing interleukin-1 blockade for treatment of acute Kawasaki disease. Arthritis Rheumatol. 2017;69:268-276 Guo M.M., et al. Th17- and Treg-related cytokine and mRNA expression are associated with acute and resolving Kawasaki disease. Allergy 2015;70:310-318 Gia S., et al. The T helper type 17/regulatory T cell imbalance in patients with acute Kawasaki disease. Clin Exp Immunol. 2010;162:131-137 Matsuda A., et al. Anti-inflammatory effects of high-dose IgG on TNF-alpha-activated human coronary artery endothelial cells. Eur J Immunol. 2012;42(8):2121-2131

ＩＶＩＧ不応川崎病患者に対して、ＩＶＩＧ製剤に替わる有効な治療薬が存在せず、その開発が急務となっている。

本発明は、ＩＶＩＧ不応川崎病患者に対する新規治療薬を実現することを目的とする。

本発明者らは、上述の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、川崎病のＩＶＩＧ不応性への関与が指摘されている炎症性サイトカインＩＬ－１β及びＩＬ－１７Ａを用いてＩＶＩＧ不応川崎病モデルを確立した。また、ＩＶＩＧ不応性獲得に転写因子Ｃ／ＥＢＰの活性化が必須であることを明らかにした。

本発明者らはさらに、上記確立したＩＶＩＧ不応川崎病モデルを用いて、川崎病治療薬の候補となり得る、ＩＬ－１β又はＩＬ－１７Ａにより誘導される炎症応答をＣ／ＥＢＰ活性制御を介して抑制する物質の探索を行った。その結果、目的の活性を持つ有力な新規治療薬候補としてイタコン酸誘導体を見出し、本発明を完成するに至った。

上記の課題を解決するために、本発明は、以下に示す態様を含む。
＜１＞イタコン酸又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤。
＜２＞イタコン酸又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬。
＜３＞前記イタコン酸又はその塩若しくはエステルは、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質の発現を抑制する、＜２＞に記載の治療薬。
＜４＞前記ＩＬ－１関与炎症性疾患が川崎病である、＜２＞又は＜３＞に記載の治療薬。
＜５＞前記ＩＬ－１関与炎症性疾患が免疫グロブリンによる治療に対して不応である、＜２＞～＜４＞の何れかに記載の治療薬。
＜６＞ＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、ＩＬ－１又はＩＬ－１７による刺激下にある細胞に対して被験物質を接触させる被験物質接触工程と、前記細胞のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質の発現量に基づいて、被験物質をＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬の候補として選択する選択工程とを含む、スクリーニング方法。
＜７＞前記細胞がヒト初代冠動脈血管内皮細胞である、＜６＞に記載のスクリーニング方法。
＜８＞ＩＬ－１刺激に起因する、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質の発現を抑制する、＜１＞に記載のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤。

本発明の一態様によれば、ＩＶＩＧ不応川崎病患者に対する新規治療薬を実現できる。

評価例１の結果を示す図である。 評価例２の結果を示す図である。 評価例３の結果を示す図である。 ＩＶＩＧ不応川崎病に対する新規治療薬探索戦略の模式図である。 ＩＶＩＧ不応川崎病に対する新規治療薬の一次スクリーニングのプロトコールを示す図である。 イタコン酸又はジメチルイタコン酸の化学式を示す図である。 想定されるイタコン酸の抗炎症メカニズムを示す模式図である。 評価例５の結果を示す図である。 評価例６の結果を示す図である。 評価例７の結果を示す図である。 評価例８の結果を示す図である。 評価例９の結果を示す図である。

〔１．ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤〕
本発明に係るＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤は、イタコン酸又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する。ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質は以下、「Ｃ／ＥＢＰ」と略記する場合がある。

イタコン酸（メチレンコハク酸）は、食品添加剤（酸味料及びｐＨ調整剤）又は農薬（植物成長調整剤）として使用されている化合物である。イタコン酸塩の例として、イタコン酸ナトリウム、イタコン酸カリウム、イタコン酸アンモニウム、イタコン酸マグネシウム、イタコン酸カルシウム、イタコン酸ストロンチウム、イタコン酸亜鉛、イタコン酸ジルコニウム、イタコン酸アルミニウム等の、イタコンの金属塩が挙げられる。イタコン酸エステルの例として、モノメチルイタコン酸、モノエチルイタコン酸、モノプロピルイタコン酸、モノブチルイタコン酸、モノドデシルイタコン酸、ジメチルイタコン酸、ジエチルイタコン酸、ジブチルイタコン酸、ジオクチルイタコン酸、等が挙げられる。イタコン酸及びイタコン酸エステルの一例であるジメチルイタコン酸の構造式を図６に示す、イタコン酸、イタコン酸塩及びイタコン酸エステルは市販のものであってもよいし、公知の手法によって合成してもよい。または、公知の発酵技術によってイタコン酸又はイタコン酸エステルを製造してもよい。

本発明に係るＣ／ＥＢＰ発現抑制剤は、Ｃ／ＥＢＰの発現を抑制するイタコン酸又はイタコン酸エステルを有効成分とする。本明細書において、「Ｃ／ＥＢＰの発現を抑制する」とは、例えば、Ｃ／ＥＢＰをコードするｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳を抑制することが意図される。

Ｃ／ＥＢＰは、炎症性サイトカインであるＴＮＦ（腫瘍壊死因子；tumor necrosis factor）－α、ＩＬ（インターロイキン；interleukin）－１（例えば、ＩＬ－１α若しくはＩＬ－１β）、又はＩＬ－１７（例えば、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｃ、ＩＬ－１７Ｄ、ＩＬ－１７Ｅ若しくはＩＬ－１７Ｆ）によって活性化される（発現が誘導される）、タンパク質である。Ｃ／ＥＢＰによって、ＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子；granulocyte colony-stimulating factor）等のサイトカインの発現が誘導された結果、炎症反応が生じる。

Ｃ／ＥＢＰファミリーには、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰε及びＣ／ＥＢＰζ等のアイソフォームが存在する。

実施例に示すとおり、イタコン酸の誘導体であるジメチルイタコン酸処理によって、ＴＮＦ－α又はＩＬ－１β刺激によるＣ／ＥＢＰδの発現誘導が阻害された。そして、Ｃ／ＥＢＰの下流であるＩＬ－６及びＧ－ＳＣＦの発現誘導が阻害された。したがって、本発明のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤は、ＩＬ－１刺激に起因するＣ／ＥＢＰの発現を抑制することができ、後述するＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬として使用することができる。

また、イタコン酸又はその塩若しくはエステルは、HMOX-1/HO-1（Heme Oxygenase 1）という抗酸化ストレス応答に重要なタンパク質を強力に誘導できることが分かった。よって、イタコン酸又はその塩若しくはエステルは、優れた抗酸化作用を介して細胞の老化予防（抑制）効果が期待される。したがって、本発明のＣ／ＥＢＰ発現抑制剤は、Ｃ／ＥＢＰ発現抑制作用（ＩＬ－１関連性炎症抑制作用）に加え、老化予防（抑制）作用を有することが期待される。

また、本発明のＣ／ＥＢＰ発現抑制剤は、Ｃ／ＥＢＰ発現抑制作用（ＩＬ－１関連性炎症抑制作用）を有し、ＩＬ－１関与炎症性疾患の予防又は治療に効果的な食品として使用することができる。当該食品として例えば、特定保健用食品及び栄養機能食品等の保健機能食品；栄養補助食品及び健康補助食品等のサプリメント；等が挙げられる。

〔２．ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬〕
本発明のＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬（以下、「本発明の治療薬」と略記する場合がある）は、イタコン酸またはその塩若しくはエステルを有効成分として含有する。

本明細書において、ＩＬ－１関与炎症性疾患とは、ＩＬ－１によって炎症が誘導されることに起因する疾患を示す。ＩＬ－１関与炎症性疾患の例として、関節リウマチ、アルツハイマー病、動脈硬化、糖尿病、関節炎、ウイルス性炎症、貧血、腎炎、乾癬、膵炎、多発性骨髄腫、潰瘍性大腸炎、クローン病、COVID-19、川崎病、等が挙げられる。

川崎病は免疫グロブリン療法（ＩＶＩＧ；intravenous immunoglobulin）が標準治療法となっている。一方、一部の川崎病患者はＩＶＩＧに不応であることが知られている。川崎病において「ＩＶＩＧに不応である」とは、例えば、ＩＶＩＧ治療終了後２４時間以内に解熱しない（体温が３７．５℃未満にならない）状態、または、ＩＶＩＧ治療終了後２解熱しても（体温が３７．５℃未満になっても）再発熱する状態を示す。

図３に示すように、ＩＶＩＧ不応細胞において、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１βによって誘導されるＩＬ－６およびＧ－ＣＳＦ発現が、Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδのｓｉＲＮＡ導入により有意に抑制された。また、図９に示す通り、本発明者らによって、イタコン酸の誘導体であるジメチルイタコン酸処理によって、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７Ａ及び／又はＩＬ－１βによって誘導されるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδの発現が抑制された。したがって、本発明の治療薬は、ＩＶＩＧ不応であるＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬としての使用が好適であり、ＩＶＩＧ不応である川崎病の治療薬としての使用が特に好適である。

（ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬のその他の成分及び剤形）
本発明の治療薬は、上述のＣ／ＥＢＰ発現抑制剤以外の他の成分をさらに含んでいてもよい。当該他の成分は特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、及び粘度調整剤等が挙げられる。また、必要に応じて、公知のＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬を、本発明の治療薬の一構成として加えて複合剤を構成してもよい。

上記薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、担体であって、公知のＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬と同時投与された場合にＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の機能（ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療）を阻害せず、かつ、投与対象となるヒト又は動物に対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。

上記担体としては、この分野で既報のものを広く使用でき、具体的には、例えば、水、各種塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドン等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。担体の種類は、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の剤形、及び投与方法等に応じて、適宜選択すればよい。

ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の剤形も特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、及び注射剤等が挙げられ、好ましくは注射剤又は経口投与用の剤形である。例えば、携帯性及び投与の容易さ等の観点では、錠剤等の経口投与の剤形が好ましく、所定のタイミングでＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の血中濃度を所定の範囲内に制御することがより容易という観点では注射剤が好ましい。

（治療対象）
治療対象は、ヒト又は動物であり、より具体的には、ヒトを含む哺乳類からなる群より選択される何れかである。中でも、哺乳類に対して特に好適に本発明の治療方法が適用される。治療対象となる哺乳類の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ及びネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等の家畜；ヒト；が挙げられ、好ましくは家畜又はヒトであり、特に好ましくはヒトである。

〔３．ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療方法〕
（投与方法・用量）
本発明に係るＩＬ－１関与炎症性疾患の治療方法は、上述のＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬を、ヒト又は動物に対して、治療有効量投与する工程を含む。ここで、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬は、当該ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬のみを単独で投与してもよく、又は、投与の目的に適した薬学的組成物の一構成成分として投与してもよい。

上記ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の投与方法は特に限定されず、経口投与、静脈内又は動脈内への血管内投与、腸内投与といった手法によって全身投与されてもよく、経皮投与、舌下投与といった手法によって局所投与されてもよい。好ましい一つの投与態様では、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬は、静脈内投与又は動脈内投与によって全身投与される。好ましい他の投与態様では、投与の容易さ等の観点で優れるため、経口投与される。

上記ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の投与量（治療有効量）は、投与対象となる上記ヒト又は動物の年齢、性別、体重、症状、投与経路、投与回数、及び投与期間等に応じて適宜設定すればよい。また、必要であれば、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬を用いたインビボアッセイを事前に行い、過度の実験を要することなく上記投与量を決定することができる。

上記ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の投与回数及び投与タイミングも治療効果が得られる限り特に限定されず、例えば、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の種類、上記投与量、投与経路、症状、ヒト又は動物の年齢、性別、体重等に応じて適宜設定すればよい。

また、必要に応じてインビボアッセイ等を行うことによって、ヒト又は動物における上記ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の血中濃度、より具体的には、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬の投与量、投与タイミング及びその血中濃度の関係も、当業者であれば容易に把握することができる。

（併用療法）
本発明に係るＩＬ－１関与炎症性疾患の治療方法において、本発明に係るＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬以外の公知のＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬と組み合せてもよい（併用療法）。本発明に係るＩＬ－１関与炎症性疾患の治療方法は、従来のＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬とは異なるメカニズムを利用した新規な治療方法である。それゆえ、本併用療法を採用すれば、従来治療法との間で相乗的な治療効果を示し、治療成績が飛躍的に向上することが期待される。

〔４．ＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法〕
本発明に係るＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法は、被験物質接触工程と選択工程を含む。以下、各工程について説明する。本明細書において、ＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患とは、ＩＬ－１又はＩＬ－１７によって炎症が誘導されることに起因する疾患を示す。

（１）被験物質接触工程
被験物質接触工程においては、ＩＬ－１又はＩＬ－１７による刺激下にある細胞に対して被験物質を接触させる。細胞が、ＩＬ－１又はＩＬ－１７による刺激下にあるとは、１）細胞が現にＩＬ－１又はＩＬ－１７と接触している場合の他、２）細胞がＩＬ－１又はＩＬ－１７と接触した後に（現に接触しているかは問わない）、細胞がこの接触の影響下にある状態でもよい。なお、ＩＬ－１又はＩＬ－１７と、被験物質とを、細胞に接触させる順番は任意であり、同時に接触させてもよく、被験物質を先に接触させてもよく、被験物質を後に接触させてもよい。ＩＬ－１又はＩＬ－１７による細胞の刺激は、例えば、後述する「（２）刺激工程」に記載のように行えばよい。

細胞としては、ＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患のモデルと成りうる細胞、すなわち、ＩＬ－１又はＩＬ－１７の受容体を発現する細胞を用いることが好ましい。ＩＬ－１又はＩＬ－１７の受容体を発現する細胞としては、冠動脈血管内皮細胞等の血管内皮細胞、線維芽細胞等の間葉系細胞、等が挙げられる。ＩＬ－１又はＩＬ－１７の受容体を発現する細胞は市販されている細胞を使用してもよい。また、生体から採取された細胞をそのまま用いてもよいし、培養細胞（初代培養細胞又は細胞株）を用いてもよい。ＩＬ－１又はＩＬ－１７の受容体を発現する細胞の培養に使用する培地、添加剤及び培養皿のコーティング剤等は、特に限定されず、公知の材料を使用することができる。また、培養温度等の培養条件も公知の手法を参考にして適宜設定できる。

細胞への被験物質の接触は、例えば、培地に被験物質を添加することによって行うことができる。細胞への被験物質の接触期間（被験物質を含む培地による細胞の培養期間）は、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上が挙げられる。また、当該培養期間は、１０日以下、９日以下、８日以下、７日以下、又は６日以下が挙げられる。

被験物質は低分子化合物又は高分子化合物であってもよい。また、被験物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖、又は、これらの複合体であってもよい。細胞に接触させる被験物質の濃度は特に限定されず、適宜選択することができる。

（２）刺激工程
刺激工程においては、細胞にＩＬ－１又はＩＬ－１７を接触させる。刺激工程は、被験物質接触工程前に行ってもよいし、被験物質接触工程と同時に行ってもよい。

細胞へのＩＬ－１又はＩＬ－１７の接触は、例えば、培地にＩＬ－１又はＩＬ－１７を添加することによって行うことができる。細胞へのＩＬ－１又はＩＬ－１７の接触期間（ＩＬ－１又はＩＬ－１７を含む培地による細胞の培養期間）は、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上が挙げられる。また、当該培養期間は、１０日以下、９日以下、８日以下、７日以下、又は６日以下が挙げられる。また、細胞に接触させるＩＬ－１又はＩＬ－１７の濃度は特に限定されず、適宜選択することができる。例えば、ＩＬ－１又はＩＬ－１７の濃度として、０．１ｎｇ／ｍｌ以上１００ｎｇ／ｍｌ以下が挙げられる。

（３）選択工程
選択工程においては、被験物質接触工程後の、細胞におけるＣ／ＥＢＰの発現量に基づいて、前記被験物質をＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬の候補として選択する。

選択工程において、被験物質を接触させない場合と比較して、ＩＬ－１又はＩＬ－１７刺激によるＣ／ＥＢＰの発現量が減るものを、ＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬の候補として選択してもよい。Ｃ／ＥＢＰの発現量は例えば、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay）、免疫組織化学、又は、免疫蛍光抗体法などの周知の方法が挙げられる。ＰＣＲ法（polymerase chain reaction）、ノーザンブロッティング法、又は、in situ hybridization法等の周知の方法によって、Ｃ／ＥＢＰのｍＲＮＡの発現量を測定することによって、Ｃ／ＥＢＰの発現量を評価してもよい。

以下の実施例中、特に記載がない限り、％は質量％を表す。評価例１～４において使用した材料及び方法を以下に示す。

〔材料及び方法〕
（試薬）
組換えヒトＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７Ａは、PeproTech社（Rochy Hill, NJ, USA）から購入した。ヒトイムノグロブリン調製物（ヴェノグロブリンＩＨ）は一般社団法人日本血液製剤機構（ＪＢ）から入手した。

（細胞培養と処理）
ヒト初代冠動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）をLonza社（Walkersville, MD, USA）から購入した。ＨＣＡＥＣを３７℃において湿潤５％ＣＯ_２雰囲気下にて培養した。培地として、初代血管内皮細胞専用培地EGM-2MV Bullet kit（Lonza社）を用いた。ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲ用のサンプルは、ＨＣＡＥＣを２４ウェル細胞培養プレート（24-well cell culture plate）に５×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種した。核抽出物調製用のサンプルは、Ｔ－２５フラスコに１×１０^６細胞／フラスコの濃度で播種した。

１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（ヴェノグロブリンＩＨ）の存在又は不存在下において、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７を単独又は組み合わせて細胞を４８時間刺激した。個別のドナーから３つの異なるロットであるＨＣＡＥＣを用い、本実施例のすべてのデータは異なるロットにおいて再現できた。

（ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）トランスフェクション）
以下に示すSilencer（商標）Select Pre-designed small interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）をThermo Fisher Scientific社から購入した：ヒトＣ／ＥＢＰβ（sirna_id: S2891）；ヒトＣ／ＥＢＰδ（sirna_id: S2895）。コントロールｓｉＲＮＡ（control siRNA; Silencer（商標）Select Negative Control #1 siRNA）及びＩκＢζ特異的ｓｉＲＮＡもThermo Fisher Scientific社から購入した。

ＨＣＡＥＣを２４ウェル細胞培養プレートに１×１０^５細胞／ウェルの濃度で播種し、一晩インキュベートした。Lipofectamin（商標）RNAiMAX Transfection Reagent（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、メーカーの添付文書の操作法に従って、細胞に目的のｓｉＲＮＡを最終濃度５ｎＭでトランスフェクションした。トランスフェクトした細胞を２４時間さらに培養し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７を単独又は組み合わせて細胞を４８時間刺激した。

（定量ＰＣＲ）
総ＲＮＡ（total RNA）抽出、ｃＤＮＡ合成及び定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、Shoda T et al., J Dermatol Sci 2014; 76: 90-5に記載の方法に従って行った。すなわち、総ＲＮＡはQIAGEN社のRNeasy Mini Kitを用いて細胞から回収した。ｃＤＮＡは、iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad社）を用いて合成した。

以下の７種類のプライマーペアをFasmac社に依頼し合成した。
（１）ＩκＢζ
センス：5'- TGG AGT CCC GGT CGA GAG-3'（配列番号１）
アンチセンス：5'- ATA TGG GGC TCA ACT GGC TG-3'（配列番号２）
（２）Ｇ－ＣＳＦ
センス：5'-TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC-3'（配列番号３）
アンチセンス：5'-GCA CAC TCA CTC ACC AGC TTC T-3'（配列番号４）
（３）ＩＬ－６
センス：5'-CAA TAA CCA CCC CTG ACC CA-3'（配列番号５）
アンチセンス：5'-GCG CAG AAT GAG ATG AGT TGT C-3'（配列番号６）
（４）ＩＬ－１β
センス：5'-AAC TGA AAG CTC TCC ACC TCC AG-3'（配列番号７）
アンチセンス：5'-CCC AAG GCC ACA GGT ATT TTG-3'（配列番号８）
（５）Ｃ／ＥＢＰβ
センス：5'-TCC AAA CCA ACC GCA CAT G-3'（配列番号９）
アンチセンス; 5'-GAG GGA GAA GCA GAG AGT TTA TCA TT-3'（配列番号１０）
（６）Ｃ／ＥＢＰδ
センス：5'-GGT GCC CGC TGC AGT TT-3'（配列番号１１）
アンチセンス：5'-CTC GCA GTT TAG TGG TGG TAA GTC-3'（配列番号１２）
（７）β－アクチン
センス：5'-CCC AGC CAT GTA CGT TGC TAT-3'（配列番号１３）
アンチセンス：5'-TCA CCG GAG TCC ATC ACG AT-3'（配列番号１４）

ｑＰＣＲはThunderbird SYBR qPCR Mix（TOYOBO社）を用いてBio-Rad CFX96 qPCRシステムを用いて測定した。各ｑＰＣＲにおいて、総ＲＮＡ量が２ｎｇに相当するｃＤＮＡアリコートを使用した。ｍＲＮＡ発現レベルは、各サンプル中の内部標準遺伝子（β－アクチン）の相対発現量で補正した。

（ＥＬＩＳＡ）
培養液中に産生されたＧ－ＣＳＦ及びＩＬ－６蛋白量をそれぞれのＥＬＩＳＡ（R&DSystems社）により、メーカーの添付文書の操作法に従って定量した。

（核抽出物の調製）
細胞の核分画はNE-PER（登録商標）Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いて、メーカーの添付文書の操作法に従って抽出した。蛋白濃度はBCA（商標）Protein Assay Reagent Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。

（ウエスタンブロット（ＷＢ）解析）
各サンプルにつき２μｇの蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（５～１５％のReady Gels, Bio-Rad社）を用いて電気泳動分離後、電気泳動分離後、ＰＶＤＦ膜（Trans-Blot（登録商標）Turbo（商標）Transfer Pack, Bio-Rad社）に蛋白質を転写した。ウエスタンブロットは、以下の抗体を用い、それぞれの添付文書の操作法に従って行った：ＮＦ－κＢ（Cell Signaling Technology社）、Ｃ／ＥＢＰβ（Ｃ－１９；Santa Cruz Biotechnology社）、Ｃ／ＥＢＰδ（Ｍ－１７；Santa Cruz Biotechnology社）、ＩκＢζ（Cell Signaling Technology社）、ＨＤＡＣ２（Cell Signaling Technology社）。２次抗体として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合抗ウサギＩｇＧ（horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG；Cell Signaling Technology社）を使用した。

（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
Ｃ／ＥＢＰのパリンドロームコンセンサス配列（5'-TGC AGA TTG CGC AAT CTG CA-3'；配列番号１５）を含む３’－ビオチン標識オリゴヌクレオチドをFasmac社に依頼し合成後、アニールして二本鎖プローブを作製した。ＥＭＳＡは、LightShift Chemiluminescent EMSA kit（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、メーカーの添付文書の操作法に従って抽出した。具体的には、５μｇの核抽出物を室温において２０分、２０ｆｍｏｌのＣ／ＥＢＰプローブと共にインキュベートした。核抽出物は１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧの存在又は不存在下において、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７を単独又は組み合わせて４８時間刺激された細胞から調製した。反応後直ちに、ＤＮＡ－Ｃ／ＥＢＰ蛋白質複合体を７．５％のMini-PROTEAN（登録商標）TGX（商標）Precast Gel（Bio-Rad社）で分離し、ナイロン膜（Biodyne B, Thermo Fisher Scientific社）に転写した。転写後の膜をすぐに、ＵＶクロスリンカー（TL-2000 Ultraviolet Translinker; Adelaide, Australia）で３０秒間架橋させた。化学発光による検出は、メーカーの添付文書の操作法に従って行った。

（統計解析）
ＩＶＩＧ（ＩｇＧ処理）の抗炎症効果を判断するために、ＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの蛋白質産生量及びｍＲＮＡ発現量に関し、ＩＶＩＧ未処理群に対するＩＶＩＧ処理群の割合を算出した。割合がゼロに近づくほど、ＩＶＩＧの抗炎症効果が高いことを示すと仮定した。ＩＬ－１β又はＩＬ－１７Ａの添加量の違いに関する統計上有意性を検定するために分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した。統計上有意性がある場合は、ボンフェローニ検定（Bonferroni test）を用いた事後比較を行った。ｐ＜０．０５のときに統計上有意性があるとみなした。

〔評価例１〕ＩＬ－１β又はＩＬ－１７ＡによるＩＶＩＧ抗炎症効果の解除（ＩＶＩＧ不応性獲得）
Matsuda A et al., Eur J Immunol. 2012;42(8):2121-2131において、ＨＣＡＥＣの培養系をin vitroの川崎病モデルとして用い、炎症性サイトカインＴＮＦ－αが誘導する炎症応答をＩｇＧ処理（ＩＶＩＧ）によって分子特異的かつ完全に抑制することが報告されている。そこで、ＩＶＩＧ不応因子として報告されているＩＬ－１β又はＩＬ－１７ＡをＴＮＦ－αに加えたときに、ＩＶＩＧ不応性を獲得するか否かを検証した。ＴＮＦ－α及びＩＬ－１β又はＩＬ－１７Ａで細胞を刺激したときの、ＩＬ－６又はＧ－ＣＳＦの産生量をＥＬＩＳＡによって測定した。測定結果を図１に示す。

図１において、各カラムの左側の棒はＩｇＧ未処理（－ＩＶＩＧ）の結果を示す。右側の棒はＩｇＧ処理（＋ＩＶＩＧ）の結果を示す。図１に示すように、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αに対し、０．１ｎｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１β又は１０ｎｇ／ｍＬ以上のＩＬ－１７を添加すると、ＩＶＩＧによるＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの産生抑制が解除された。以上より、臨床で起きている事象を再現するin vitroＩＶＩＧ不応川崎病モデルを確立できることが分かった。

〔評価例２〕ＩＬ－１β又はＩＬ－１７Ａによる、Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδの発現及び活性化を介したＩＶＩＧ不応性獲得
次に、評価例１で確立したin vitroＩＶＩＧ不応川崎病モデルを用いて、ＨＣＡＥＣにおけるＩＶＩＧ不応性獲得時の、転写因子であるＣ／ＥＢＰβ又はＣ／ＥＢＰδの発現の変化についてＷＢ及びＥＭＳＡを用いて測定した。測定結果を図２に示す。

図２中、上段の３つのレーンはＷＢの結果、下段はＥＭＳＡの結果である。「ＩＶＩＧ －」はＩＶＩＧ未処理を示し、「ＩＶＩＧ ＋」はＩＶＩＧ処理を示す。図２のＷＢの結果に示すように、ＩＶＩＧ処理によって、ＴＮＦ－α刺激によって誘導されるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδの核発現及びＤＮＡ結合活性が完全に抑制されたことが分かった。逆に、ＩＬ－１β単独又はＴＮＦ－αとＩＬ－１７Ａとの組合せによって細胞を刺激したときは、ＩＶＩＧ処理してもＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδの核発現及びＤＮＡ結合活性は抑制されなかった。図２の結果より、ＩＬ－１β又はＩＬ－１７Ａによって誘発されるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδの活性は、ＨＣＡＥＣにおけるＩＶＩＧの抗炎症効果の減衰（不応活性化）に重要であることが強く示唆された。

〔評価例３〕サイトカイン誘導によるＨＣＡＥＣからのＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦ産生に対する、Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδのジーンサイレンシングの効果
ＨＣＡＥＣにおける、サイトカイン誘導によるＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの発現でのＣ／ＥＢＰの関与を確認するために、Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδを標的とするｓｉＲＮＡをＨＣＡＥＣにトランスフェクトした。そして、トランスフェクトしたＨＣＡＥＣにおけるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδのｍＲＮＡの発現量並びにＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの産生量を測定した。測定結果を図３に示す。

図３中、上の４つのグラフはｑＰＣＲの測定結果を示し、縦軸は各目的遺伝子（Ｃ／ＥＢＰβ又はＣ／ＥＢＰδ）のｍＲＮＡ発現量（目的遺伝子のコピー数／β－アクチンの発現量）を示す。下の４つのグラフはＥＬＩＳＡの測定結果を示し、縦軸は各目的タンパク質（ＩＬ－６又はＧ－ＣＳＦ）の発現量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。各カラムの４つのバーは左から、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした結果（Negative Cont）、Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡをトランスフェクションした結果（Ｃ／ＥＢＰβ）、Ｃ／ＥＢＰδｓｉＲＮＡをトランスフェクションした結果（Ｃ／ＥＢＰδ）、Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡ及びＣ／ＥＢＰδをトランスフェクションした結果（Ｃ／ＥＢＰβ＋Ｃ／ＥＢＰδ）を示す。各グラフの横軸は細胞を刺激したサイトカインを示す。Ｃｏｎｔ．は、サイトカイン未処理を示す。

図３に示すように、トランスフェクションによって、標的のｍＲＮＡの発現が８０％以上抑制された。また、Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡ又ははＣ／ＥＢＰδｓｉＲＮＡをトランスフェクションした結果、ＨＣＡＥＣによるＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの産生が抑制された。さらに、Ｃ／ＥＢＰβｓｉＲＮＡ及びＣ／ＥＢＰδｓｉＲＮＡを共トランスフェクションした結果（Ｃ／ＥＢＰβ＋Ｃ／ＥＢＰδ）、それぞれ単独でトランスフェクションしたときよりもさらに、ＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの産生（特に、ＩＬ－１β刺激によるＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの産生）が抑制され、相乗効果が発揮されたことが示唆された。以上の結果から、Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδはＨＣＡＥＣにおける、サイトカイン誘導によるＩＬ－６及びＧ－ＣＳＦの産生に必要であることが示唆された。

〔評価例４〕ＩＶＩＧ不応性川崎病に対する新規治療薬の探索
ＩＬ－１、又は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１７により誘導されるＩＶＩＧ不応炎症応答をＣ／ＥＢＰ活性制御を介して抑制する物質が、ＩＶＩＧ不応川崎病患者に対する新規治療薬候補となると戦略を立てた。そして、評価例１で確立したin vitroＩＶＩＧ不応川崎病モデルを用いることで、新規治療薬候補をスクリーニングできるという戦略を立てた。当該戦略を示す模式図を図４に示す。

図４に示すように、ＩＶＩＧ応答性経路（IVIG-responsive pathway）においては、ＩＶＩＧによって、ＴＮＦ－αによるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδ活性化が阻害される。その結果、ＩＬ－６及びＧ－ＳＣＦ等のＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδ標的遺伝子の発現が抑制され、冠動脈血管内皮細胞（coronary artery endothelial cell）における炎症が抑制される。ＩＬ－６及びＧ－ＳＣＦは川崎病に関与するサイトカインとして知られている。

一方、ＩＶＩＧ不応性経路（IVIG-resistant pathway）においては、ＩＬ－１、又は、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１７により誘導されるＣ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδ活性化を、ＩＶＩＧは抑制することができない。その結果、Ｃ／ＥＢＰβ及びＣ／ＥＢＰδ活性化によって、ＩＬ－６及びＧ－ＳＣＦ等の発現が誘導されて、冠動脈血管内皮細胞において炎症が起こる。

評価例１で確立したin vitroＩＶＩＧ不応川崎病モデルを用いてＩＶＩＧ不応川崎病患者に対する新規治療薬候補のスクリーニングを行った。一次スクリーニングのプロトコールを図５に示す。

〔評価例５〕ジメチルイタコン酸（ＤＩ）によるＧ－ＣＳＦの産生抑制
次に、解糖系のクエン酸回路（ＴＣＡ回路）の中間代謝物であるイタコン酸をＩＶＩＧ不応川崎病患者に対する新規治療薬候補として評価を行った。細胞透過性を高めるために実験で使用されることが多い、イタコン酸の誘導体であるジメチルイタコン酸を用いて、イタコン酸の抗炎症効果に関する評価を行った。イタコン酸及びジメチルイタコン酸の構造を図６に示す。

イタコン酸はマクロファージ又は樹状細胞の機能調節因子として抗炎症機能を有する内因性因子であることが以下に示す文献で報告されている。これらの報告から想定される、イタコン酸の抗炎症メカニズムを図７に示す。

＜イタコン酸の抗炎症機能に関する報告が記載されている文献＞
Michelucci A., et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production. PNAS 2013;110:7820-7825
Lampropoulou V., et al. Itaconate links inhibition of succinate dehydrogenase with macrophage metabolic remodeling and regulation of inflammation. Cell Metab. 2016;24:158-166
Cordes T., et al. Immunoresponsive gene 1 and itaconate inhibit succinate dehydrogenase to modulate intracellular succinate levels. J Biol Chem. 2016;291:14274-14284
Mills E.L., et al. Itaconate is an anti-inflammatory metabolite that activates Nrf2 via alkylation of KEAP1. Nature 2018;556(7699):113-117
Bambouskova M., et al. Electrophilic properties of itaconate and derivatives regulate the IκBζ-ATF3 inflammatory axis. Nature 2018;556(7702):501-504
Mogilenko D.A., et al. Metabolic and innate immune cues merge into a specific inflammatory response via the UPR. Cell 2019;177:1201-1216

ＬＰＳ又は炎症性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－１β刺激によりマクロファージで大量のイタコン酸が産生される。イタコン酸による主な抗炎症機序として、（１）コハク酸蓄積を介した経路（抗酸化ストレス応答）、（２）酸化ストレスセンサーであるＫｅａｐ１のアルキル化を介した、Ｎｒｆ２依存経路（抗酸化ストレス応答）、（３）ＡＴＦ３活性化による転写調節因子ＩκＢζ合成抑制を介した抗炎症経路、等がある。いずれの経路も、最終的にはＩＬ－１β及びＩＬ－６の抑制が導かれる。

また、イタコン酸はＩＬ－１７Ａが関与する炎症を、ＩκＢζ合成抑制を介して改善することが報告されている（Mogilenko D.A., et al）。評価例１～４から、ＩＬ－１７ＡはＨＣＡＥＣにおけるＩＶＩＧ不応獲得に重要な因子であることが分かった。イタコン酸の抗炎症機序によりＩＬ－１βの抑制が導かれることから、「イタコン酸はＩＬ－１β又はＩＬ－１７ＡによるＨＣＡＥＣのＩＶＩＧ不応性を解除して抗炎症効果を発揮している」という仮説を立てて、以下の評価を行った。

これまでに、ＩＬ－１βと同じＩＬ－１ファミリーであるＩＬ－１α刺激によっても、ＨＣＡＥＣにおいてＩＶＩＧ不応性炎症応答を惹起することが本発明者らによって見出されている（Inoue T., et al. Functional benefits of corticosteroid and IVIG combination therapy in a coronary artery endothelail cell model of Kawasaki disease. Pediatr Rheumtol. 2020 Accepted）。そこで、ＩＬ－１α又はＩＬ－１β刺激によるＨＣＡＥＣ細胞からのＧ－ＳＣＦの産生をＤＩ処理によって抑制されるか否かを検証した。

ＨＣＡＥＣを２４ウェル細胞培養プレート（24-well cell culture plate）に５×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種し、２４時間培養した。培地は、初代血管内皮細胞専用培地EGM-2MV Bullet kit（Lonza社）を用いた。２４時間後に、ハイドロコルチゾンのみを抜いたＥＧＭ－２ＭＶ（以後、「－ＨＣ培地」と示す）に入れ替えて３時間培養した。次に、５００μＭのジメチルイタコン酸（ＤＩ）又は１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（ヴェノグロブリンＩＨ）を含む－ＨＣ培地に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１α又はＩＬ－１βを加えた培地に交換し、４８時間培養した。培養後の上清を回収し、４８時間培養中に培養液中に産生されたＧ－ＣＳＦ蛋白量をＥＬＩＳＡ（R&DSystems社）により定量した。定量結果を図８に示す。

図８中、グラフの縦軸はＧ－ＣＳＦの産生量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。（－）はコントロール、＋ＩＶＩＧはＩｇＧを加えた培地の結果、＋ＤＩはジメチルイタコン酸を加えた培地の結果を示す。

図８に示すように、ＩｇＧ処理によってＧ－ＣＳＦの産生は抑制されなかった一方、ＤＩ処理によってＧ－ＣＳＦの産生が顕著に抑制されることが分かった。なお、ＤＩ処理時に細胞障害は全く観察されなかった（図示せず）。

〔評価例６〕ＤＩ処理によるＣ／ＥＢＰδ及びＩκＢζの抑制
次に、ＤＩによって、Ｃ／ＥＢＰδ及びＩκＢζの発現が抑制されるか否かを検証した。ＨＣＡＥＣをＴ－７５細胞培養プレート（T-75 cell culture plate）に５×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種し、２４時間培養した。その後－ＨＣ培地に入れ替えてさらに２４時間培養した。次に、５００μＭのＤＩ又は１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含む－ＨＣ培地に１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－α又ははＩＬ－１βを加えた培地に交換し、４８時間培養した。培養後の細胞をトリプシン処理して回収し、NE-PERTM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Thermo Fisher Scientific社）を用いて核抽出液を調製した。各抽出液の蛋白量をBCA（商標）Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社）を用いて定量した。そして、各サンプルにつき２μｇの蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～２０％のMini-PROTEAN TGX Gels, Bio-Rad社）を用いて電気泳動分離後、ＰＶＤＦ膜（Trans-Blot（登録商標）Turbo（商標）Transfer Pack, Bio-Rad社）に蛋白質を転写した。ウエスタンブロットは、以下の抗体を用い、それぞれの添付文書の操作法に従って行った：ＮＦ－κＢ（Cell Signaling Technology社）、Ｃ／ＥＢＰδ（Santa Cruz Biotechnology社）、ＩκＢζ（Cell Signaling Technology社）。ウエスタンブロットの結果を図９に示す。

図９中、ＩＶＩＧはＩｇＧ処理を示す。図９に示すように、ＩＶＩＧ処理によってＩＬ－１β刺激によるＣ／ＥＢＰδ発現は抑制されなかった。一方、ＤＩ処理によって、ＴＮＦ－α又はＩＬ－１β刺激によるＮＦκβ、Ｃ／ＥＢＰδ及びＩκＢζの発現が顕著に抑制された。ＤＩ処理によるＩκＢζの発現抑制は、上記のイタコン酸の抗炎症機能に関する報告が記載されている文献の記載と一致した。この結果から、ＤＩは図４に示すＩＶＩＧ不応川崎病に対する新規治療薬探索のストラテジーのコンセプトを概ね満たす物質であることが分かった。

ＮＦκβ、Ｃ／ＥＢＰδ及びＩκＢζは、ＩＶＩＧによる抗炎症作用が観察されるＴＮＦ－α刺激よりも、ＩＶＩＧ不応性が認められるＩＬ－１β刺激によって強く発現が誘導される。ＩＶＩＧ処理ではＮＦκβ、Ｃ／ＥＢＰδ及びＩκＢζの発現が抑制されなかった。ＤＩ処理によって、ＩＶＩＧ処理によって発現が抑制されなかったＩκＢζを含めた転写因子複合体（ＩκＢζ－Ｃ／ＥＢＰ－ＮＦκβ複合体）の機能的抑制を介して、優れた抗炎症効果が発揮されたことが示唆された。

〔評価例７〕ＩκＢζ ｓｉＲＮＡによるノックダウン及びジメチルイタコン酸処理の効果の比較
刺激に応じて発現誘導される遺伝子には、迅速に発現誘導される一次応答遺伝子（ＴＮＦ－α、ＩκＢζ等）と、一次応答遺伝子産物に依存してやや遅れて発現される二次応答遺伝子（ＩＬ－６、ＩＬ－１２等）とが存在することが知られている。また、一次応答遺伝子はＮＦ－κＢの活性化のみで活性化されることが知られている。さらに、ＩκＢζの標的遺伝子である二次応答遺伝子は、ＮＦ－κＢと、ＩκＢζ及びＣ／ＥＢＰ等とによる転写因子複合体によって活性化されることが知られている（牟田達史、医学のあゆみ、234(5):372-378, 2010）。

図９に示すように、ＩＬ－１β刺激よりもＴＮＦ－α刺激において、ＤＩ処理によるＮＫ－κＢの発現がより抑制された。これは、ＤＩの作用点が、ＮＫ－κＢよりも、Ｃ／ＥＢＰ又はＩκＢζの方が上位であることを示唆している。また、図２及び９に示すように、Ｃ／ＥＢＰ発現については、ＩＶＩＧ製剤が効果的に抑制するＩＶＩＧ応答性経路（ＴＮＦ－α刺激）においても顕著に誘導された。一方、ＩκＢζ発現はＩＶＩＧ不応を示すＩＬ－１β刺激で顕著に誘導された。これらの結果から、イタコン酸のプライマリー作用標的分子の有力候補はＩκＢζであると仮説を立てた。また、ＩκＢζを標的とすることによって、ＩＶＩＧでは抑制できない転写因子複合体（ＩκＢζ－Ｃ／ＥＢＰ－ＮＦκβ複合体）の機能的抑制を介して優れた抗炎症効果が発揮されていると仮説を立てた。

そこで、ＩκＢζ遺伝子をノックダウンした場合と、ＤＩ処理した場合の、炎症分子（ＩκＢζ、ＩＬ－１β、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｇ－ＣＳＦ及びＩＬ－６）のｍＲＮＡの発現動態（キネティクス）を比較した。

ＨＣＡＥＣを２４ウェル細胞培養プレートに５×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種し、２４時間培養した。その後－ＨＣ培地に入れ替え、コントロールｓｉＲＮＡ（Negative control siRNA）又はＩκＢζ特異的ｓｉＲＮＡ（いずれもThermo Fisher Scientific社）を最終濃度５ｎＭ、Lipofectamin RNAiMAX Reagent（Thermo Fisher Scientific社）を１ウェルあたり１μＬ用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、５００μＭのＤＩを含む又はＤＩを含まない－ＨＣ培地に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βを加えた培地に交換し、４８時間まで培養した。培養後１．５時間、８時間、２４時間、４８時間の時点で細胞からQIAGEN社のRNeasy Mini Kitを用いて総ＲＮＡ（total RNA）を回収し、iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad社）を用いてｃＤＮＡを合成した。

定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）はThunderbird SYBR qPCR Mix（TOYOBO社）を用いてBio-Rad CFX96 qPCRシステムを用いて測定した。サンプル中の遺伝子（IＩκＢζ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、β－アクチン）の正確なコピー数を算出するため、コピー数が既に分かっている精製したＰＣＲ産物を段階希釈し、検量線として用いた。目的遺伝子（ＩκＢζ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδ）のｍＲＮＡ発現レベルは、各サンプル中の内部標準遺伝子（β－アクチン）の相対発現量で補正した。各目的遺伝子のｍＲＮＡ発現量を図１０に示す。

図１０の縦軸は、各目的遺伝子のｍＲＮＡ発現量（目的遺伝子のコピー数／β－アクチンの発現量）を示す。横軸は、ＩＬ－１βによって細胞を刺激してからの経過時間を示す。ＮＣ ｓｉＲＮＡは、ネガティブコントロール用のｓｉＲＮＡをトランスフェクション処理した結果である。また、ＮＣ ｓｉＲＮＡ及びＩκＢζ ｓｉＲＮＡは、トランスフェクションから２４時間後に、ＤＩ処理を行っていない。ＮＣ ｓｉＲＮＡ＋ＤＩ及びＩκＢζ ｓｉＲＮＡ＋ＤＩは、トランスフェクションから２４時間後にＤＩ処理した結果である。

図１０に示すように、ＩκＢζのノックダウン処理（ＩκＢζ ｓｉＲＮＡ）とＤＩ処理（ＮＣ ｓｉＲＮＡ＋ＤＩ）による各目的遺伝子のｍＲＮＡ発現キネティクスは、ほぼ一致していた。独立した処理であるにもかかわらずｍＲＮＡ発現キネティクスがほぼ一致していたことから、ＤＩは核内因子ＩκＢζを標的として優れた抗炎症効果を発揮している可能性がさらに強く示唆された。

〔評価例８］ＩκＢζ ｓｉＲＮＡによるノックダウン及びジメチルイタコン酸の効果の比較
評価例７で使用したサンプルで、ＩＬ－１β刺激後２４時間、４８時間における培養上清を回収した。培養液中に産生されたＧ－ＣＳＦ及びＩＬ－６蛋白量をそれぞれのＥＬＩＳＡ（R&DSystems社）により定量した。定量結果を図１１に示す。

図１１に示すように、ＩＬ－１β刺激によるＧ－ＣＳＦ及びＩＬ－６産生も、ＩκＢζのノックダウン処理（ＩκＢζ ｓｉＲＮＡ）又はＤＩ処理（ＮＣ ｓｉＲＮＡ＋ＤＩ）によって顕著に抑制された。ＩκＢζのノックダウン処理及びＤＩ処理を行ったときに（ＩκＢζ ｓｉＲＮＡ＋ＤＩ）、Ｇ－ＣＳＦ及びＩＬ－６産生がもっとも顕著に抑制された。

〔評価例９〕ＤＩ処理による遺伝子発現変化の解析
ＤＩ処理による全遺伝子発現変化を網羅的に解析するために、マイクロアレイ解析を行った。ＨＣＡＥＣを２４ウェル細胞培養プレートに１０×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種し、２４時間培養した。その後－ＨＣ培地に入れ替えて３時間培養後、５００μＭのＤＩ又は１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含む－ＨＣ培地に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βを加えた培地に交換し、２４時間培養した。QIAGEN社のRNeasy Mini Kitを用いて総ＲＮＡを回収した。遺伝子発現アレイにかけるため、SurePrint G3 Human GE Microarray 8 x 60 K Kit ver, 3（Agilent社）に総ＲＮＡをアプライし、メーカーの添付文書の操作法に従って実施した。マイクロアレイの解析結果を図１２に示す。

図１２中、Controlはコントロール（ＩＬ－１β未処理）の結果、ＩＬ－１β＋ＤＩはＩＬ－１β及びＤＩ処理の結果、ＩＬ－１βはＩＬ－１β処理のみの結果、ＩＬ－１β＋ＩＶＩＧはＩＬ－１β及びＩｇＧ処理の結果を示す。

図１２に示すように、ＩＬ－１β処理のみ（ＩＬ－１β）とＩＬ－１β及びＩｇＧ処理（ＩＬ－１β＋ＩＶＩＧ）との結果はほぼ完全に一致していた。この結果から、ＩＬ－１β処理（刺激）によってＩＶＩＧ不応性が誘導されることが再確認された。

一方、ＩＬ－１β及びＤＩ処理（ＩＬ－１β）＋ＤＩの結果は、ＩＬ－１β未処理（Control）の結果とほぼ同様であった。この結果から、ＤＩはＩＬ－１β炎症応答の根底部分に働きかけて抗炎症作用を発揮していることが示唆された。

〔実施例のまとめ〕
イタコン酸又はその誘導体は、ＩＶＩＧ製剤では抑制できなかった転写因子Ｃ／ＥＢＰの活性化（ＩＬ－１β又はＩＬ－１７Ａを起点とする）を完全に抑制することによって、優れた抗炎症効果を発揮することが分かった。したがって、ＩＶＩＧ不応性によって冠動脈炎症が持続し、心障害後遺症のリスクが高い重症川崎病患者に対する新規治療薬候補として、イタコン酸又はその誘導体が非常に有望であることが分かった。

イタコン酸は植物成長調整剤として普段からヒトが経口摂取している物質である。また、イタコン酸は食品衛生法に基づいて食品安全委員会がヒトの健康を損なうおそれのないことが明らかであることが認められている物質である（対象外物質評価書 イタコン酸、２０１５年３月、食品安全委員会農薬専門調査会）。さらに、イタコン酸は低分子量かつ水溶性であり、細胞内の代謝過程で産生される物質である。したがって、実臨床へのハードルが低いことが予想され、イタコン酸による自然治癒の仕組みを利用した安全かつ新規の治療法の開発が期待できる。

ＴＣＡ回路はすべての細胞に備わっているエネルギー産生メカニズムの１つである。よって、イタコン酸又はその誘導体は、ＩＶＩＧ不応川崎病に対する治療薬としての使用に加え、ＩＬ－１が関与する他の免疫疾患に対する治療薬の候補となり得ることが示唆された。

また、代謝と炎症（イムノメタボリズム）の観点で、未だ不明な川崎病の病因を研究する上でイタコン酸は大きなヒントになる可能性を秘めていると考えられる。

本発明のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤は、川崎病等のＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬として利用することができる。

Claims (8)

1. イタコン酸又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤。
2. イタコン酸又はその塩若しくはエステルを有効成分として含有する、ＩＬ－１関与炎症性疾患の治療薬。
3. 前記イタコン酸又はその塩若しくはエステルは、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質の発現を抑制する、請求項２に記載の治療薬。
4. 前記ＩＬ－１関与炎症性疾患が川崎病である、請求項２又は３に記載の治療薬。
5. 前記ＩＬ－１関与炎症性疾患が免疫グロブリンによる治療に対して不応である、請求項２～４の何れか一項に記載の治療薬。
6. ＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、
   ＩＬ－１又はＩＬ－１７による刺激下にある細胞に対して被験物質を接触させる被験物質接触工程と、
   前記細胞のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質の発現量に基づいて、被験物質をＩＬ－１又はＩＬ－１７関与炎症性疾患の治療薬の候補として選択する選択工程とを含む、スクリーニング方法。
7. 前記細胞がヒト初代冠動脈血管内皮細胞である、請求項６に記載のスクリーニング方法。
8. ＩＬ－１刺激に起因する、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質の発現を抑制する、請求項１に記載のＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質発現抑制剤。

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