JP2022103708A

JP2022103708A - Methods for purifying antigen binding molecules, nucleic acid compositions, vector compositions, cells and bacteroides dorei

Info

Publication number: JP2022103708A
Application number: JP2020218501A
Authority: JP
Inventors: 学中藤; Gaku NAKATO; 浄井上; Kiyoshi Inoue; ひかる井上; Hikaru Inoue; 真嗣福田; Shinji Fukuda
Original assignee: Keio University; Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology
Current assignee: Keio University; Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-07-08

Abstract

To make Bacteroides dorei separable.SOLUTION: The present invention is an antigen-binding molecule that binds to Bacteroides dorei.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、抗原結合分子、核酸組成物、ベクター組成物、細胞およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｏｒｅｉの精製方法に関する。 The present invention relates to antigen-binding molecules, nucleic acid compositions, vector compositions, cells and methods for purifying Bacteroides doriei.

ヒトの腸管、主に大腸には約１０００種類、４０兆個にも及ぶ腸内細菌（腸内細菌叢（そう）や腸内フローラとよばれる）が生息しているといわれている。ヒトの腸内細菌は、互いに密接な関係を持ちながら複雑にバランスをとっており、個人によって極めて多様で異なり、更に食事・在住国などの要因によっても異なることが知られている。 It is said that about 1000 types of intestinal bacteria (called intestinal flora (so) and intestinal flora) inhabit the human intestine, mainly the large intestine, as many as 40 trillion. It is known that human intestinal bacteria are closely related to each other and are intricately balanced, and are extremely diverse and different depending on the individual, and also differ depending on factors such as diet and country of residence.

ヒトの下部消化管に存在する腸内細菌として、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属が知られている。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に対する抗原結合分子として、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎに対する抗体（例えば、非特許文献１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓの構成成分に対する抗体作製報告例がある（例えば、非特許文献２）。 The genus Bacteroides is known as an intestinal bacterium present in the lower gastrointestinal tract of humans. As an antigen-binding molecule for the genus Bacteroides, for example, there are an antibody against Bacteroides thetaiotaomicron (for example, Non-Patent Document 1) and an example of producing an antibody against a component of Bacteroides fragilis (for example, Non-Patent Document 2).

インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎａｋｏｓｈｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／１３２３５８＞Internet <URL: https: // www. funakoshi. co. jp / contents / 132358> ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８４Ｓｅｐ；２０（３）：５１９－５２４．，ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１７；１２（３）：ｅ０１７３１２８．J Clin Microbiol. 1984 Sep; 20 (3): 519-524. , PLoS One. 2017; 12 (3): e0173128.

Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属を含む細菌集団から、標的とする所定のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種を分離することが望まれている。 It is desired to isolate a given Bacteroides species of interest from a bacterial population containing the genus Bacteroides.

本発明の目的は、Ｂ．ｄｏｒｅｉを分離可能とすることである。 An object of the present invention is B.I. It is to make dorei separable.

上記課題を解決するための本発明の主たる発明は、抗原結合分子であって、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｏｒｅｉに結合する。 The main invention of the present invention for solving the above-mentioned problems is an antigen-binding molecule, which binds to Bacteroides doriei.

その他本願が開示する課題やその解決方法については、発明の実施形態の欄および図面により明らかにされる。 Other problems disclosed in the present application and solutions thereof will be clarified by the columns and drawings of the embodiments of the invention.

本発明によれば、Ｂ．ｄｏｒｅｉのみが分離可能となる。 According to the present invention, B.I. Only dorei can be separated.

本抗原結合分子の交差性の有無を検討した、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の、他の種類の細菌を示す図である。It is a figure which shows the other kind of bacteria of the genus Bacteroides which examined the presence or absence of the crossing of this antigen-binding molecule. 本抗原結合分子の、他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属との交差性の有無を検討した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having examined whether or not this antigen-binding molecule has crossing with other Bacteroides genus. 本抗原結合分子の交差性の有無を検討した、グラム陰性菌、グラム陽性菌を示す図である。It is a figure which shows the gram-negative bacterium and the gram-positive bacterium which examined the presence or absence of the crossing of this antigen-binding molecule. 本抗原結合分子の、他のグラム陰性菌、グラム陽性菌との交差性の有無を検討した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having examined whether or not this antigen-binding molecule is crossed with other Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria. 本抗原結合分子を用いて、Ｂ．ｄｏｒｅｉの単離を行う検討をする際に用いた、腸内細菌基準株を示す図である。Using this antigen-binding molecule, B. It is a figure which shows the gut microbiota reference strain used in the examination to perform the isolation of dorei. 本抗原結合分子を用いて、ＭＡＣＳ（登録商標）によりＢ．ｄｏｒｅｉの単離を行った結果を示す図である。Using this antigen-binding molecule, according to MACS®, B.I. It is a figure which shows the result of having performed the isolation of dorei. ＭＡＣＳ（登録商標）によりＢ．ｄｏｒｅｉが単離できているかを調べるためのＲＴ－ＰＣＲに用いた、核酸増幅用のプライマーの塩基配列を示す図である。B. by MACS®. It is a figure which shows the base sequence of the primer for nucleic acid amplification used for RT-PCR for investigating whether the dorei was isolated. ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。It is a figure which shows the result of RT-PCR. ＭＡＣＳにより単離したＢ．ｄｏｒｅｉを培養した結果を示す図である。B. isolated by MACS. It is a figure which shows the result of culturing dorei.

本発明の実施形態の内容を列記して説明する。本発明は、以下のような構成を備える。
［項目１］
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｏｒｅｉに結合することを特徴とする、抗原結合分子。
［項目２］
他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属する細菌に結合しないこと、
を特徴とする、項目１に記載の抗原結合分子。
［項目３］
前記他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｖｕｌｇａｔｕｓであること、
を特徴とする、項目２に記載の抗原結合分子。
［項目４］
前記抗原結合分子は、抗体、抗体断片またはペプチドであり、
アミノ酸配列として、配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
を含むことを特徴とする、項目１から３のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
［項目５］
前記抗原結合分子は、抗体または抗体断片であり、
重鎖のアミノ酸配列として配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸、または配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
軽鎖のアミノ酸配列として配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
を含むことを特徴とする、項目４に記載の抗原結合分子。
［項目６］
配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域と、
配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域と、
配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域と、
配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域と、
配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域と、
配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域と、
を含むことを特徴とする、項目５に記載の抗原結合分子。
［項目７］
項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合分子をコードする核酸配列、または複数の核酸配列を含むことを特徴とする核酸組成物。
［項目８］
項目７に記載の核酸配列、または複数の核酸配列を含むベクター組成物、または複数のベクターを含むことを特徴とするベクター組成物。
［項目９］
項目８に記載のベクター組成物を含むことを特徴とする細胞。
［項目１０］
項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合分子を用いて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｏｒｅｉを含む試料からＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｏｒｅｉを単離する、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｏｒｅｉの精製方法。 The contents of the embodiments of the present invention will be described in a list. The present invention has the following configurations.
[Item 1]
An antigen-binding molecule characterized by binding to Bacteroides dorei.
[Item 2]
Do not bind to other bacteria belonging to the genus Bacteroides,
1. The antigen-binding molecule according to item 1.
[Item 3]
The other Bacteroides genus is Bacteroides ovatus, Bacteroides stercoris, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides bulgats.
2. The antigen-binding molecule according to item 2.
[Item 4]
The antigen-binding molecule is an antibody, antibody fragment or peptide.
As the amino acid sequence, the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 8 or the amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 8.
The antigen-binding molecule according to any one of items 1 to 3, wherein the antigen-binding molecule comprises.
[Item 5]
The antigen-binding molecule is an antibody or antibody fragment.
An amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 or the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 as the amino acid sequence of the heavy chain.
An amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 6 to 8 or the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 6 to 8 as the amino acid sequence of the light chain.
4. The antigen-binding molecule according to item 4, which comprises.
[Item 6]
A VHCDR1 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
A VHCDR2 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A VHCDR3 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A VLCDR1 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
A VLCDR2 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
A VLCDR3 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
5. The antigen-binding molecule according to item 5, which comprises.
[Item 7]
A nucleic acid composition comprising a nucleic acid sequence encoding the antigen-binding molecule according to any one of items 1 to 6, or a plurality of nucleic acid sequences.
[Item 8]
The nucleic acid sequence according to item 7, or a vector composition containing a plurality of nucleic acid sequences, or a vector composition comprising a plurality of vectors.
[Item 9]
A cell comprising the vector composition according to item 8.
[Item 10]
A method for purifying Bacteroides dorei, which isolates Bacteroides doriei from a sample containing Bacteroides doriei using the antigen-binding molecule according to any one of items 1 to 6.

＜実施の形態の詳細＞
本実施形態に係る抗原結合分子は、例えば、特定の抗原と強く特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片から形成される多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科抗体、キメラ抗体、短鎖Ｆｖ、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ‘）２断片、抗体断片ジスルフィド結合Ｆｖ、および抗イディオタイプ抗体、細胞内抗体、抗体断片、並びに、上記のいずれかのエピトープ結合断片を包含し、また、ポリペプチド、ペプチド、核酸、合成低分子、合成高分子などが挙げられる。 <Details of the embodiment>
The antigen-binding molecule according to the present embodiment is, for example, a monoclonal antibody that strongly and specifically binds to a specific antigen, a polyclonal antibody, and a multispecific antibody formed from at least two different epitope-binding fragments (for example, bispecificity). Antibody), human antibody, humanized antibody, camel family antibody, chimeric antibody, short chain Fv, single chain antibody, single domain antibody, domain antibody, Fab fragment, F (ab') 2 fragment, antibody fragment disulfide-bound Fv , And anti-idiotype antibodies, intracellular antibodies, antibody fragments, and any of the above epitope-binding fragments, including polypeptides, peptides, nucleic acids, synthetic small molecules, synthetic polymers and the like.

本実施形態では、抗原結合分子の一例として、モノクローナル抗体について図面を参照しながら説明する。 In this embodiment, as an example of an antigen-binding molecule, a monoclonal antibody will be described with reference to the drawings.

本実施形態に係る抗原結合分子としてのモノクローナル抗体（以下、本抗体と記す）は、Ｂ．ｄｏｒｅｉに対して特異性の高いものである。このため、本実施形態に係る抗原結合分子を用いることで、Ｂ．ｄｏｒｅｉを含む試料から、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。 The monoclonal antibody (hereinafter referred to as the present antibody) as the antigen-binding molecule according to the present embodiment is referred to as B.I. It is highly specific to dorei. Therefore, by using the antigen-binding molecule according to the present embodiment, B.I. From the sample containing dorei, B. It is possible to isolate or concentrate dorei.

本実施形態において、本抗体は、他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に結合しないことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。 In this embodiment, it is preferable that the antibody does not bind to other Bacteroides genera. As a result, B. From samples such as feces containing bacteria other than dorei, B. It is possible to isolate or concentrate dorei.

本実施形態において、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属としては、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｖｕｌｇａｔｕｓであること、が挙げられる。 In this embodiment, B.I. Examples of the genus Bacteroides other than dorie include, for example, Bacteroides ovatus, Bacteroides stercoris, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, and Bacteroides bulgates.

本実施形態において、本抗体は、グラム陽性菌、グラム陰性菌に対して交差性がないことが好ましい。これにより、本抗体を用いることで、他の細菌が多く含まれる糞便などから、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離、濃縮することが可能である。 In the present embodiment, it is preferable that the antibody has no crossing property with Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria. As a result, by using this antibody, feces containing a large amount of other bacteria can be used. It is possible to isolate and concentrate dorei.

また、本実施形態において、本抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＹ）、またはこれらのサブアイソタイプ、またはアロタイプのものでもあってもよい。 Also, in this embodiment, the antibody may be of any isotype (eg, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, and IgY), or a subisotype or allotype thereof.

更に、本実施形態において、本抗体は、任意の哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、ウマ、ラット、イヌ、ネコ、マウス、ヒツジ、ラクダなど、または他の動物、例えば鳥類（例えばニワトリ）に由来するものであってもよい。 Further, in the present embodiment, the antibody is used in any mammal, such as, but not limited to, humans, monkeys, rabbits, pigs, horses, rats, dogs, cats, mice, sheep, camels, and the like. Alternatively, it may be derived from another animal, such as a bird (eg, a chicken).

本実施形態では、本抗体のアミノ酸配列の一部を以下に開示する。本実施形態において、以下に開示するアミノ酸配列と、７０％の相同性を有することが好ましく、７５％の相同性を有することがより好ましく、更に８０％の相同性を有することが好ましく、更に８５％の相同性を有することが好ましく、更に９０％の相同性を有することが好ましく、更に９５％の相同性を有することが好ましく、１００％同一である方が好ましい機能を発揮する。 In this embodiment, a part of the amino acid sequence of this antibody is disclosed below. In this embodiment, it is preferable to have 70% homology with the amino acid sequence disclosed below, more preferably 75% homology, further preferably 80% homology, and further 85. It is preferable to have a homology of%, a homology of 90% is preferable, a homology of 95% is preferable, and a homology of 100% is preferable.

以下に本抗体のアミノ酸配列の一部を示す。式１は配列番号１であり、式２は配列番号２であり、式３は配列番号３であり、式４は配列番号４であり、式５は配列番号５であり、式６は配列番号６であり、式７は配列番号７であり、式８は配列番号８である。なお、別途配列表に記載した、配列番号１に示すのは本抗体の重鎖アミノ酸配列であり、配列番号２に示すのは本抗体の軽鎖アミノ酸配列である。
［式１］
ＧｌｎＩｌｅＧｌｎＬｅｕＶａｌＧｌｎＳｅｒＧｌｙＰｒｏＧｌｕＬｅｕＬｙｓＬｙｓＰｒｏＧｌｙＧｌｕＴｈｒＶａｌＬｙｓＩｌｅＳｅｒＣｙｓＬｙｓＳｅｒＳｅｒＧｌｙＴｙｒＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｓｐＣｙｓＳｅｒＭｅｔＨｉｓＴｒｐＶａｌＧｌｎＧｌｎＡｌａＰｒｏＧｌｙＬｙｓＧｌｙＬｅｕＬｙｓＴｒｐＭｅｔＧｌｙＴｒｐＩｌｅＡｓｎＴｈｒＧｌｕＴｈｒＡｓｐＧｌｕＰｒｏＴｈｒＴｙｒＡｌａＡｓｐＡｓｐＰｈｅＧｌｎＧｌｙＡｒｇＰｈｅＡｌａＰｈｅＳｅｒＬｅｕＧｌｕＴｈｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＡｌａＴｙｒＬｅｕＧｌｎＩｌｅＡｓｎＡｓｎＬｅｕＬｙｓＡｓｎＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＴｈｒＴｙｒＰｈｅＣｙｓＡｌａＡｒｇＣｙｓＬｙｓＴｙｒＭｅｔＡｓｐＴｙｒＴｒｐＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＳｅｒＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ
［式２］
ＡｓｐＶａｌＶａｌＶａｌＴｈｒＧｌｎＴｈｒＰｒｏＬｅｕＳｅｒＬｅｕＰｒｏＶａｌＳｅｒＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｎＡｌａＳｅｒＩｌｅＳｅｒＣｙｓＡｒｇＳｅｒＳｅｒＧｌｎＳｅｒＬｅｕＶａｌＨｉｓＳｅｒＡｓｎＧｌｙＩｌｅＴｈｒＴｙｒＬｅｕＧｌｎＴｒｐＴｙｒＬｅｕＧｌｎＬｙｓＰｒｏＧｌｙＧｌｎＳｅｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＬｅｕＩｌｅＴｙｒＬｙｓＶａｌＳｅｒＴｈｒＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＶａｌＰｒｏＡｓｐＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｓｐＰｈｅＴｈｒＬｅｕＡｒｇＩｌｅＳｅｒＡｒｇＶａｌＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｙＶａｌＴｙｒＰｈｅＣｙｓＳｅｒＧｌｎＳｅｒＴｈｒＨｉｓＩｌｅＰｒｏＴｒｐＴｈｒＰｈｅＧｌｙＧｌｙＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅＬｙｓ
［式３］
ＧｌｙＴｙｒＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｓｐＣｙｓＳｅｒＭｅｔＨｉｓ
［式４］
ＴｒｐＩｌｅＡｓｎＴｈｒＧｌｕＴｈｒＡｓｐＧｌｕＰｒｏＴｈｒＴｙｒＡｌａＡｓｐＡｓｐＰｈｅＧｌｎＧｌｙ
［式５］
ＣｙｓＬｙｓＴｙｒＭｅｔＡｓｐＴｙｒ
［式６］
ＡｒｇＳｅｒＳｅｒＧｌｎＳｅｒＬｅｕＶａｌＨｉｓＳｅｒＡｓｎＧｌｙＩｌｅＴｈｒＴｙｒＬｅｕＧｌｎ
［式７］
ＬｙｓＶａｌＳｅｒＴｈｒＡｒｇＰｈｅＳｅｒ
［式８］
ＳｅｒＧｌｎＳｅｒＴｈｒＨｉｓＩｌｅＰｒｏＴｒｐＴｈｒ A part of the amino acid sequence of this antibody is shown below. Equation 1 is SEQ ID NO: 1, Equation 2 is SEQ ID NO: 2, Equation 3 is SEQ ID NO: 3, Equation 4 is SEQ ID NO: 4, Equation 5 is SEQ ID NO: 5, and Equation 6 is SEQ ID NO: 6, formula 7 is SEQ ID NO: 7, and formula 8 is SEQ ID NO: 8. In addition, the heavy chain amino acid sequence of this antibody is shown in SEQ ID NO: 1 and the light chain amino acid sequence of this antibody is shown in SEQ ID NO: 2, which are separately described in the sequence listing.
[Equation 1]
ＧｌｎＩｌｅＧｌｎＬｅｕＶａｌＧｌｎＳｅｒＧｌｙＰｒｏＧｌｕＬｅｕＬｙｓＬｙｓＰｒｏＧｌｙＧｌｕＴｈｒＶａｌＬｙｓＩｌｅＳｅｒＣｙｓＬｙｓＳｅｒＳｅｒＧｌｙＴｙｒＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｓｐＣｙｓＳｅｒＭｅｔＨｉｓＴｒｐＶａｌＧｌｎＧｌｎＡｌａＰｒｏＧｌｙＬｙｓＧｌｙＬｅｕＬｙｓＴｒｐＭｅｔＧｌｙＴｒｐＩｌｅＡｓｎＴｈｒＧｌｕＴｈｒＡｓｐＧｌｕＰｒｏＴｈｒＴｙｒＡｌａＡｓｐＡｓｐＰｈｅＧｌｎＧｌｙＡｒｇＰｈｅＡｌａＰｈｅＳｅｒＬｅｕＧｌｕＴｈｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＴｈｒＡｌａＴｙｒＬｅｕＧｌｎＩｌｅＡｓｎＡｓｎＬｅｕＬｙｓＡｓｎＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＴｈｒＴｙｒＰｈｅＣｙｓＡｌａＡｒｇＣｙｓＬｙｓ Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
[Equation 2]
ＡｓｐＶａｌＶａｌＶａｌＴｈｒＧｌｎＴｈｒＰｒｏＬｅｕＳｅｒＬｅｕＰｒｏＶａｌＳｅｒＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｎＡｌａＳｅｒＩｌｅＳｅｒＣｙｓＡｒｇＳｅｒＳｅｒＧｌｎＳｅｒＬｅｕＶａｌＨｉｓＳｅｒＡｓｎＧｌｙＩｌｅＴｈｒＴｙｒＬｅｕＧｌｎＴｒｐＴｙｒＬｅｕＧｌｎＬｙｓＰｒｏＧｌｙＧｌｎＳｅｒＰｒｏＬｙｓＬｅｕＬｅｕＩｌｅＴｙｒＬｙｓＶａｌＳｅｒＴｈｒＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＶａｌＰｒｏＡｓｐＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｓｐＰｈｅＴｈｒＬｅｕＡｒｇＩｌｅＳｅｒＡｒｇＶａｌＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｙＶａｌＴｙｒＰｈｅＣｙｓＳｅｒＧｌｎＳｅｒＴｈｒＨｉｓＩｌｅＰｒｏ Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
[Equation 3]
Gly Tyr Thr Ph The Thr Asp Cys Ser Met His
[Equation 4]
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Asp Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp The Gln Gly
[Equation 5]
Cys Lys Tyr Met Asp Tyr
[Equation 6]
Arg Ser Ser Grn Ser Leu Val His Ser Asn Gly Ile Thr Thr Leu Grn
[Equation 7]
Lys Val Ser Thr Arg The Ser
[Equation 8]
Ser Grn Ser Thr His Ile Pro Trp Thr

すなわち、本実施形態において、本抗体はアミノ酸配列として、配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号３から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。なお、本抗体は、好ましくはアミノ酸配列として、配列番号１、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。 That is, in the present embodiment, the amino acid sequence of the present antibody is 90% or more homologous to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 8 or the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 8. It preferably contains an amino acid sequence having sex. The present antibody preferably contains, as the amino acid sequence, an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. As a result, B. From samples such as feces containing bacteria other than dorei, B. It is possible to isolate or concentrate dorei.

本実施形態において、本抗体は、重鎖のアミノ酸配列として配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸、または配列番号３から５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号６から８のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列とを含むことが好ましい。なお、本抗体は、好ましくはアミノ酸配列として、配列番号１、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。 In the present embodiment, the antibody has 90% or more homology with respect to the amino acid set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 or the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 as the amino acid sequence of the heavy chain. 90% or more homology between the amino acid sequence having sex and the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 6 to 8 as the amino acid sequence of the light chain, or the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 6 to 8. It is preferable to include an amino acid sequence having. The present antibody preferably contains, as the amino acid sequence, an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. As a result, B. From samples such as feces containing bacteria other than dorei, B. It is possible to isolate or concentrate dorei.

本実施形態において、本抗体は、
配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域と、
配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域と、
配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域と、
配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域と、
配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域と、
配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域と、を含むことが好ましい。なお、本抗体は、好ましくはアミノ酸配列として、配列番号１、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。 In this embodiment, the antibody is
A VHCDR1 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
A VHCDR2 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A VHCDR3 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A VLCDR1 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
A VLCDR2 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
It preferably comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or a VLCDR3 region containing an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. The present antibody preferably contains, as the amino acid sequence, an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. As a result, B. From samples such as feces containing bacteria other than dorei, B. It is possible to isolate or concentrate dorei.

本抗体は、Ｂ．ｄｏｒｅｉの表面抗原に結合し得るが、他のポリペプチドに特異的に結合しないことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。 This antibody is described in B.I. It can bind to the surface antigen of dorei, but preferably does not specifically bind to other polypeptides. As a result, B. From samples such as feces containing bacteria other than dorei, B. It is possible to isolate or concentrate dorei.

本実施形態では、本抗体のアミノ酸配列の一部をコードする塩基配列を以下に開示する。本実施形態において、以下に開示する塩基配列と、７０％の相同性を有することが好ましく、７５％の相同性を有することがより好ましく、更に８０％の相同性を有することが好ましく、更に８５％の相同性を有することが好ましく、更に９０％の相同性を有することが好ましく、更に９５％の相同性を有することが好ましく、１００％同一である方が好ましい機能を発揮する。 In this embodiment, the base sequence encoding a part of the amino acid sequence of the present antibody is disclosed below. In this embodiment, it is preferable to have 70% homology with the base sequence disclosed below, more preferably 75% homology, further preferably 80% homology, and further 85. It is preferable to have a homology of%, a homology of 90% is preferable, a homology of 95% is preferable, and a homology of 100% is preferable.

以下に本抗体の塩基配列の一部を示す。式９は配列番号９であり、式１０は配列番号１０であり、式１１は配列番号１１であり、式１２は配列番号１２であり、式１３は配列番号１３であり、式１４は配列番号１４であり、式１５は配列番号１５であり、式１６は配列番号１６である。なお、配列表に記載した、配列番号９に示すのは本抗体の重鎖アミノ酸配列の全長をコードする塩基配列であり、配列番号１０に示すのは軽鎖アミノ酸配列の全長をコードする塩基配列である。
［式９］
ＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
［式１０］
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
［式１１］
ＧＧＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣ
［式１２］
ＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡ
［式１３］
ＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣ
［式１４］
ＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧ
［式１５］
ＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴ
［式１６］
ＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧ A part of the base sequence of this antibody is shown below. Equation 9 is SEQ ID NO: 9, Equation 10 is SEQ ID NO: 10, Equation 11 is SEQ ID NO: 11, Equation 12 is SEQ ID NO: 12, Equation 13 is SEQ ID NO: 13, and Equation 14 is SEQ ID NO. 14, formula 15 is SEQ ID NO: 15, and formula 16 is SEQ ID NO: 16. The base sequence shown in SEQ ID NO: 9 is the base sequence encoding the full length of the heavy chain amino acid sequence of this antibody, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the base sequence encoding the full length of the light chain amino acid sequence. Is.
[Equation 9]
ＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＡＣＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
[Equation 10]
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
[Equation 11]
GGTTATACCTTCAGACTGTTCAATGCAC
[Equation 12]
TGGATAAAACTGAGACTGATGACCAACATATGCAGAATGACTTCCAGGGA
[Equation 13]
TGTAAAATATGGACTAC
[Equation 14]
AGATTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAAGGAATCACTATTTACAG
[Equation 15]
AAAGTCTCCACCGATTTTCT
[Equation 16]
TCTCAAAgTACACATATTCCGTGGAGCG

すなわち、本実施形態において、本抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列として、配列番号１１から１６のいずれかに記載のアミノ酸配列、または配列番号１１から１６のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の相同性を有する塩基配列を含むことが好ましい。これにより、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、または濃縮することが可能となる。 That is, in the present embodiment, as the base sequence encoding the amino acid sequence of the present antibody, with respect to the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 11 to 16 or the base sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 11 to 16. It preferably contains a base sequence having 90% or more homology. As a result, B. From samples such as feces containing bacteria other than dorei, B. It is possible to isolate or concentrate dorei.

本実施形態において、核酸組成物とは、本実施形態に係る抗原結合分子をコードする核酸配列、または複数の核酸配列を含む核酸組成物も含む。また、本実施形態では、前記核酸配列、または複数の核酸配列を含むベクター組成物、または複数のベクター組成物も含む。更に、本実施形態では、前記ベクターをも含む。本実施形態において、ベクターとは、連結している別の核酸を運搬する核酸分子を意味する。ベクターの１例としてプラスミドがある。前記プラスミドは、その中に別のＤＮＡ断片をライゲーションすることでできる、環状の二本鎖ＤＮＡである。また、ベクターの１例として、ウイルスベクターがある。前記ウイルスベクターは、別のＤＮＡ断片をウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある種のベクターは、導入される宿主細胞の中で、自律的に複製することができる。なお、一例として、宿主細胞のゲノム中に組み込むことができるベクターもある。当該ゲノム中に組み込むことができるベクターは、宿主のゲノムと一緒に複製される。 In the present embodiment, the nucleic acid composition also includes a nucleic acid sequence encoding an antigen-binding molecule according to the present embodiment, or a nucleic acid composition containing a plurality of nucleic acid sequences. The present embodiment also includes the nucleic acid sequence, a vector composition containing a plurality of nucleic acid sequences, or a plurality of vector compositions. Further, in this embodiment, the vector is also included. In this embodiment, the vector means a nucleic acid molecule that carries another linked nucleic acid. One example of a vector is a plasmid. The plasmid is a circular double-stranded DNA formed by ligating another DNA fragment therein. Moreover, as an example of a vector, there is a virus vector. The viral vector can ligate another DNA fragment into the viral genome. Certain vectors can replicate autonomously within the host cell into which they are introduced. As an example, there is also a vector that can be integrated into the genome of a host cell. Vectors that can be integrated into the genome are replicated with the host's genome.

本実施形態において、細胞とは、その中に発現ベクターが導入されている細胞を意味する。宿主細胞としては、細菌細胞、微生物細胞、植物細胞、または動物細胞があげられる。 In the present embodiment, the cell means a cell into which an expression vector is introduced. Host cells include bacterial cells, microbial cells, plant cells, or animal cells.

本実施形態において、抗体は以下の手法を用いて取得した。野生型マウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ）に免疫増強剤と抗原を混合したもので免疫し、そのマウスの脾臓を免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ－１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ）に移植する。移植した免疫不全マウスに追加免疫を行った後、血清内における標的抗体の抗体価の上昇が観察されたマウスの脾臓を摘出しミエローマ細胞と融合することで樹立したハイブリドーマ由来の抗体である。 In this embodiment, the antibody was obtained using the following method. Wild-type mice (BALB / cA) are immunized with a mixture of immunopotentiator and antigen, and the spleen of the mice is transplanted into immunodeficient mice (CB-17 / Icr-scid / scid Jcl). It is a hybridoma-derived antibody established by performing booster immunization on transplanted immunodeficient mice and then fusing the spleen of the mouse in which an increase in the antibody titer of the target antibody in serum was observed with myeloma cells.

－８０℃で保存していた、健常者から単離したＢ．ｄｏｒｅｉ（以下、Ｂ．ｄｏｒｅｉ単離株）のグリセロールストックから、２０μＬを５ｍＬのＧＡＭ液体培地に添加し、アネロパック（登録商標）ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて３７℃で２４時間培養する。次に、嫌気性チャンバーＢＡＣＴＲＯＮ３００（ＳＨＥＬＬＡＢ社製）内にて２００ｍＬのＧＡＭ液体培地２本に対し、培養液をそれぞれ２ｍＬ添加し、更に２４時間培養する。合計４００ｍＬの培養液を、７５００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離し、上清を除く。ペレットに滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと記する）を加え洗浄を行う。菌体の洗浄は合計３回行う。回収した菌体の一部を、ＶＤ－８００Ｒ凍結乾燥機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２４時間乾燥し、乾燥重量と菌体重量の比率を求める。菌体／ＰＢＳが１００μｇ／１００μＬになるように滅菌済みＰＢＳで希釈し、以下、抗原として使用する。 B. isolated from healthy subjects stored at -80 ° C. From the glycerol stock of dorei (hereinafter, B. dorei isolated strain), 20 μL is added to 5 mL of GAM liquid medium, and the cells are cultured at 37 ° C. for 24 hours using Aneropack (registered trademark) Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.). .. Next, in an anaerobic chamber BACTRON 300 (manufactured by SHEL LAB), 2 mL of the culture solution is added to each of two 200 mL GAM liquid media, and the cells are further cultured for 24 hours. Centrifuge a total of 400 mL of culture medium at 7500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. Sterile phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) is added to the pellets for washing. Wash the cells 3 times in total. A part of the recovered cells is dried for 24 hours using a VD-800R freeze-dryer (manufactured by TAITEC), and the ratio of the dry weight to the cell weight is determined. Dilute with sterile PBS so that the cell / PBS becomes 100 μg / 100 μL, and use it as an antigen below.

次に、調整した前記抗原を用いて免疫を行う。前記抗原に、免疫増強剤であるＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍＡｄｊｕｖａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を等量加えた（以下、腹腔内投与用抗原と記す）のちに、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与をする。尾微静脈投与（ｉ．ｖ．）の際には、前記抗原のみを、マウスに追加投与する。ＢＡＬＢ／ｃＡマウスに、当該腹腔内投与用抗原を、隔週２回のｉ．ｐ．投与をする。免疫したＢＡＬＢ／ｃＡマウスから脾臓を摘出し、免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ－１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ）へと移植を行う。 Next, immunization is performed using the prepared antigen. An equal amount of the immunopotentiator ImmunoAdjuvant (manufactured by Invitrogen) is added to the antigen (hereinafter referred to as an antigen for intraperitoneal administration), and then the mouse is intraperitoneally (ip) administered. At the time of tail venule administration (iv), only the above-mentioned antigen is additionally administered to mice. BALB / cA mice were given the antigen for intraperitoneal administration twice a week i. p. Administer. The spleen is removed from the immunized BALB / cA mouse and transplanted into an immunodeficient mouse (CB-17 / Icr-sid / scid Jcl).

脾臓を移植した免疫不全マウスに追加免疫および最終免疫をｉ．ｖ．経路にて実施した後、脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合することにより、ハイブリドーマの作製を行う。得られたハイブリドーマの中から、抗原に対し特異的反応を示し、かつ他の細菌への交差性の低い抗体を産生する能力を持つものを、フローサイトメトリーにより選抜する。 Addition and final immunization to immunodeficient mice transplanted with spleen i. v. After carrying out by the route, the spleen is removed and fused with myeloma cells to prepare a hybridoma. From the obtained hybridomas, those that show a specific reaction to the antigen and have the ability to produce an antibody having low cross-reactivity to other bacteria are selected by flow cytometry.

以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustration purposes only and do not limit the technical scope of the present invention.

本実施形態の一例であるモノクローナル抗体の作製にあたり、まず抗原であるＢ．ｄｏｒｅｉの調整を行った。 In preparing the monoclonal antibody, which is an example of the present embodiment, first, the antigen B. The dorei was adjusted.

－８０℃で保存していた、健常者から単離したＢ．ｄｏｒｅｉ単離株のグリセロールストックから、２０μＬを５ｍＬのＧＡＭ液体培地（日水製薬株式会社製）に添加し、アネロパック（登録商標）ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて３７℃で２４時間培養した。次に、嫌気性チャンバーＢＡＣＴＲＯＮ３００（ＳＨＥＬＬＡＢ社製）内にて２００ｍＬのＧＡＭ液体培地２本に対し、培養液をそれぞれ２ｍＬ添加し、更に２４時間培養した。合計４００ｍＬの培養液を、７５００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離し、上清を除いた。残ったペレットに滅菌ＰＢＳを加え洗浄を行った。菌体の洗浄は合計３回行った。回収した菌体の一部を、ＶＤ－８００Ｒ凍結乾燥機（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて２４時間乾燥し、乾燥重量と菌体重量の比率を求めた。菌体／ＰＢＳが１００μｇ／１００μＬになるように滅菌済みＰＢＳで希釈し、以下、抗原として使用した。 B. isolated from healthy subjects stored at -80 ° C. From the glycerol stock of the dorei isolated strain, 20 μL was added to 5 mL of GAM liquid medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and cultured at 37 ° C. for 24 hours using Aneropack (registered trademark) Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.). did. Next, 2 mL of the culture solution was added to each of two 200 mL GAM liquid media in the anaerobic chamber BACTRON 300 (manufactured by SHEL LAB), and the cells were further cultured for 24 hours. A total of 400 mL of culture broth was centrifuged at 7500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant. Sterile PBS was added to the remaining pellets for washing. The cells were washed 3 times in total. A part of the recovered cells was dried for 24 hours using a VD-800R freeze-dryer (manufactured by TAITEC), and the ratio of the dry weight to the cell weight was determined. The cells / PBS were diluted with sterile PBS so as to be 100 μg / 100 μL, and used as an antigen below.

次に、調整した前記抗原を用いて免疫を行った。前記抗原に、免疫増強剤であるＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍＡｄｊｕｖａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を等量加えた（以下、調整済抗原と記す）のちに、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を行った。尾微静脈（ｉ．ｖ．）投与の際には、前記抗原のみを、マウスに追加投与した。ＢＡＬＢマウス５匹に、当該調整済抗原を、隔週２回のｉ．ｐ．投与をした。抗原を免疫したＢＡＬＢ／ｃＡマウス２匹より脾臓を摘出し、免疫不全マウス（Ｃ．Ｂ－１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ）４匹に移植を行った。 Next, immunization was performed using the prepared antigen. An equivalent amount of an immunopotentiator, ImmunoAdjuvant (manufactured by Invitrogen) was added to the antigen (hereinafter referred to as adjusted antigen), and then intraperitoneal (ip) administration of mice was performed. At the time of administration of the tail venule (iv), only the above-mentioned antigen was additionally administered to the mice. The adjusted antigen was applied to 5 BALB mice twice a week i. p. It was administered. The spleen was removed from two BALB / cA mice immunized with the antigen, and transplanted into four immunodeficient mice (CB-17 / Icr-scid / scid Jcl).

移植した免疫不全マウスに、６回の追加免疫・最終免疫をｉ．ｖ．経路にて実施したあと、脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合することにより、ハイブリドーマの作製を行った。 The transplanted immunodeficient mice were given 6 boosters and final immunizations. v. After performing the procedure, hybridomas were prepared by removing the spleen and fusing it with myeloma cells.

次に、作製したハイブリドーマの中から、抗原に対し特異的反応を示す抗体を産生する能力を持つものをフローサイトメトリーにより選抜した。 Next, from the produced hybridomas, those having the ability to produce an antibody showing a specific reaction to the antigen were selected by flow cytometry.

前記選抜した、いくつかのハイブリドーマが産生する抗体に関して、Ｂ．ｄｏｒｅｉへの特異性と、他の細菌への交差性を検討した。前記抗原として使用した、健常者から単離したＢ．ｄｏｒｅｉ単離株に加え、他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属細菌として、理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室（ＪＣＭ）より購入した細菌種（図１）を、第１試験細菌群として検討対象とした。 With respect to the antibodies produced by some of the selected hybridomas, B. The specificity for dorei and the cross-sectionality to other bacteria were examined. B. isolated from healthy subjects used as the antigen. In addition to the dorei isolated strain, a bacterial species (Fig. 1) purchased from the Japan Collection of Microorganisms (JCM) of the RIKEN BioResource Center as another Bacteroides genus was used as the first test bacterial group.

第１試験細菌群の培養条件（以下、試験用培養条件１と記す）は以下の通りである。ＧＡＭ液体培地（日水製薬株式会社製）５ｍＬに対して、各細菌のグリセロールストックより２０μＬを添加し、嫌気性チャンバーＢＡＣＴＲＯＮ３００（ＳＨＥＬＬＡＢ社製）内にて２４時間培養した。 The culture conditions of the first test bacterial group (hereinafter referred to as test culture condition 1) are as follows. To 5 mL of GAM liquid medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 20 μL was added from the glycerol stock of each bacterium, and the cells were cultured in an anaerobic chamber BACTRON 300 (manufactured by SHEL LAB) for 24 hours.

第１試験細菌群は、以下に示すグラム染色法を用いて、培養後に単一細菌であることを確認した。５μＬの前記菌培養液をスライドガラスに塗布し、火炎固定した。クリスタル紫を各スポットあたり１００μＬずつ作用させ、１分間染色したのち水洗した。次に、ヨウ素を１００μＬ作用させ、３０秒染色したのち水洗した。ヨウ素液染色をもう一度繰り返した。エタノール／アセトン混合脱色液を各スポットあたり１００μＬずつ作用させ、水洗し乾燥した。最後に、パイフェル溶液を１００μＬ作用させ、１分間染色したのち水洗した。乾燥後、光学顕微鏡下で観察しＴｏｕｐＶｉｅｗ（ＴｏｕｐＴｅｋＰｈｏｔｏｎｉｃｓ社製）を用いて画像を取得した。 The first test bacterial group was confirmed to be a single bacterium after culturing using the Gram stain method shown below. 5 μL of the bacterial culture solution was applied to a slide glass and fixed by flame. 100 μL of crystal violet was applied to each spot, stained for 1 minute, and then washed with water. Next, 100 μL of iodine was allowed to act, the cells were stained for 30 seconds, and then washed with water. Iodine staining was repeated once more. An ethanol / acetone mixed decolorizing solution was allowed to act in an amount of 100 μL per spot, washed with water and dried. Finally, 100 μL of the Paifel solution was allowed to act, the cells were stained for 1 minute, and then washed with water. After drying, it was observed under an optical microscope and an image was acquired using ToupView (manufactured by ToupTek Photonics).

特異性と交差性の検討のため、以下の方法により、抗体を含むハイブリドーマ細胞培養上清（以下、ＧＳ１培養上清）を調整した。５０ｍＬの細胞培養培地が含まれたフラスコに２×１０^６Ｃｅｌｌｓの前記ハイブリドーマ細胞を添加し、３７℃ ５％ＣＯ_２環境下で一週間培養した。フラスコ内の溶液を５０ｍＬチューブに移し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して上清を取得した。更に夾雑物を除くために上清を、０．２２μｍフィルターに通し、５０ｍＬチューブに回収した。最終濃度０．０５％になるようにＮａＮ_３を加え、使用まで４℃で保管した。 In order to examine the specificity and cross-reactivity, the hybridoma cell culture supernatant containing the antibody (hereinafter referred to as GS1 culture supernatant) was prepared by the following method. The hybridoma cells of 2 × 10 ⁶ Cells were added to a flask containing 50 mL of cell culture medium and cultured in a 37 ° C. 5% CO ₂ environment for one week. The solution in the flask was transferred to a 50 mL tube and centrifuged at 1000 rpm, 5 min, and 4 ° C. to obtain a supernatant. Further, the supernatant was passed through a 0.22 μm filter to remove impurities and collected in a 50 mL tube. NaN ₃ was added to a final concentration of 0.05% and stored at 4 ° C. until use.

ＧＳ１培養上清に含まれる抗体の特異性と交差性の測定にはフローサイトメーターＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓ（ＢＤ社製）を用いた。前記試験用培養条件１に従い、対象の細菌種を培養し、当該培養液を８０００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、培養上清を除いた。その後、ＰＢＳにて二回洗浄した後、菌体ペレットをＰＢＳで再懸濁した。分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）２０００Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でＯＤ値（光学濃度）を測定し、大腸菌における菌体数変換式である１ＯＤ_６６０＝８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに基づき、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅまたは１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅに希釈した。希釈後、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して上清を除き、残ったペレットにＧＳ１培養上清を１００μＬ加えて懸濁し、３０ｍｉｎ、４℃で静置しＧＳ１培養上清に含まれる抗体と反応させた。また、第１試験細菌群と反応性をもたないＩｇＧ１ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）をネガティブコントロールとし、同様に第１試験細菌群と反応させた。その後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え洗浄し、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、ＧＳ１培養上清又はＩｇＧ１ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌを除去した。この過程を二回繰り返した後、二次抗体を１００μＬずつ添加し、３０ｍｉｎ、４℃で静置し、検討に使用した。なお、二次抗体はＧｏａｔａｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－ＡｄｓｏｒｂｅｄＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００倍希釈したものを用いた。更に、ＦＡＣＳ測定の直前に、死細菌と区別するため、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１μＬずつ添加した。ＦＡＣＳ測定により取得されたＦＣＳファイルは、ＦｌｏｗＪｏｖｅｒｓｉｏｎ１０．５．３（ＦｌｏｗＪｏＬＬＣ）にて解析した。なお、本段落に記載した方法を、以下ＦＡＣＳ測定法という。 A flow cytometer Accuri C6 plus (manufactured by BD) was used to measure the specificity and cross-reactivity of the antibody contained in the GS1 culture supernatant. According to the above-mentioned test culture condition 1, the target bacterial species was cultured, the culture solution was centrifuged at 8000 × g, 5 min, and 4 ° C., and the culture supernatant was removed. Then, after washing twice with PBS, the cell pellet was resuspended with PBS. The OD value (optical concentration) was measured with a spectrophotometer Nanodrop (registered trademark) 2000 C (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and based on 1OD ₆₆₀ = 8 × 10 ⁸ cells / mL, which is a cell number conversion formula in Escherichia coli. Diluted to 1 × 10 ⁷ cells / tube or 1 × 10 ⁸ cells / tube with PBS containing 2% BSA. After dilution, centrifuge at 17,800 xg, 5 min, 4 ° C to remove the supernatant, add 100 μL of GS1 culture supernatant to the remaining pellets, suspend, and allow to stand at 4 ° C for 30 min to leave the GS1 culture supernatant. Was reacted with the antibody contained in. In addition, IgG1 Isotype Control (manufactured by SIGMA), which has no reactivity with the first test bacterial group, was used as a negative control and was similarly reacted with the first test bacterial group. Then, 1 mL of sterilized PBS was added and washed, and the mixture was centrifuged at 17,800 × g, 5 min and 4 ° C. to remove the GS1 culture supernatant or the IgG1 Isotype Control. After repeating this process twice, 100 μL of the secondary antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes and used for the study. The secondary antibody is Goat anti-mouse IgG (H + L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor (registered trademark) 488 (Thermo Fisher Scientific) diluted 500 times with PBS containing 2% BSA. board. Further, immediately before the FACS measurement, 1 μL of Propidium iodide (PI: manufactured by Invitrogen) was added to distinguish from dead bacteria. The FCS file obtained by FACS measurement was analyzed by FlowJo version 10.5.3 (FlowJo LLC). The method described in this paragraph is hereinafter referred to as a FACS measurement method.

図２に、ＧＳ１培養上清を用いた、前記ＦＡＣＳ測定の結果を示す。当該結果は、ＧＳ１培養上清に含まれる抗体（以下、ＧＳ１抗体と記す）は、Ｂ．ｄｏｒｅｉには結合するが、図１に示した他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属には結合しないことを示した。 FIG. 2 shows the results of the FACS measurement using the GS1 culture supernatant. The result is that the antibody contained in the GS1 culture supernatant (hereinafter referred to as GS1 antibody) is described in B.I. It was shown to bind to dorei but not to the other Bacteroides genera shown in FIG.

次に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属以外のグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する交差反応性を検討するため、ＪＣＭより購入した細菌種（図３に示す。以下、第２試験細菌群と記す）とＧＳ１培養上清の反応性を調べた。各細菌の培養条件は前記試験用培養条件１と同様であり、培養上清は前記ＧＳ１培養上清と同様であり、ＦＡＣＳの手法は前記ＦＡＣＳ測定法を用いた。 Next, in order to examine the cross-reactivity with Gram-positive and Gram-negative bacteria other than the genus Bacteroides, the bacterial species purchased from JCM (shown in FIG. 3, hereinafter referred to as the second test bacterial group) and the GS1 culture supernatant. The reactivity of was investigated. The culture conditions of each bacterium were the same as those of the test culture condition 1, the culture supernatant was the same as that of the GS1 culture supernatant, and the FACS method used the FACS measurement method.

図４に、第２試験細菌群に対し、ＧＳ１培養上清を反応させたＦＡＣＳの結果を示す。当該結果は、ＧＳ１培養上清は第２試験細菌群には反応しないことを示した。これにより、ＧＳ１抗体はＢ．ｄｏｒｅｉに対して特異性が高く、他の細菌に対して交差性が低い抗体であることが証明された。 FIG. 4 shows the results of FACS in which the GS1 culture supernatant was reacted with the second test bacterial group. The results showed that the GS1 culture supernatant did not react with the second test bacterial group. As a result, the GS1 antibody is B. It proved to be an antibody with high specificity for dorei and low crossing with other bacteria.

次に、ＧＳ１抗体の有用性を示すため、Ｂ．ｄｏｒｅｉおよび図５に記載した計５種類の腸内細菌基準株を混合した腸内細菌基準株混合溶液から、Ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ、登録商標）を用いて、Ｂ．ｄｏｒｅｉを単離、濃縮できるかどうかの検討を行った。 Next, in order to show the usefulness of the GS1 antibody, B.I. From a mixed solution of gut microbiota, which is a mixture of dorei and a total of five gut microbiota reference strains shown in FIG. 5, using Magnetic-active cell sorting (MACS, registered trademark), B.I. We investigated whether dorei could be isolated and concentrated.

前記試験用培養条件１に従い培養した、Ｂ．ｄｏｒｅｉおよび図５に記載した計５種類の腸内細菌基準株を８０００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、培養上清を除いた。その後、ＰＢＳにて二回洗浄した後、菌体ペレットをＰＢＳで再懸濁した。分光光度計Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）２０００Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）でＯＤ値（光学濃度）を測定し、大腸菌における菌体数変換式である１ＯＤ_６６０＝８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍＬに基づき、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した。それぞれの培養溶液を１００ｕｌずつ混合した腸内細菌基準株混合溶液を作成した後、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離して上清を除き、残ったペレットにＧＳ１培養上清を１００μＬ加えて懸濁し、３０ｍｉｎ、４℃で静置しＧＳ１培養上清に含まれる抗体と反応させた。また、比較対象としてＩｇＧ１ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）をネガティブコントロールとし、同様に腸内細菌基準株混合溶液と反応させた。これらのサンプルを２本ずつ（ＧＳ１抗体反応サンプル２本、ＩｇＧ１ｉｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ抗体反応サンプル２本、合計４本）用意した。その後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え洗浄し、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、ＧＳ１培養上清又はＩｇＧ１ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌを除去した。この過程を二回繰り返した後、二次抗体を１００μＬずつ添加し、３０ｍｉｎ、４℃で静置し、検討に使用した。なお、二次抗体はＧｏａｔａｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－ＡｄｓｏｒｂｅｄＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を２％ＢＳＡを含むＰＢＳで５００倍希釈したものを用いた。その後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え洗浄し、１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、未反応の二次抗体を除去した。この過程を二回繰り返した後、ＧＳ抗体反応サンプル１本とＩｇＧ１ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ反応サンプルの１本は５００ｕｌの２％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁し、分離前サンプルとして測定まで遮光しながら４℃で保管した。残り２本のサンプルに関しては１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０倍希釈したＡｎｔｉ－ＦＩＴＣ標識ＭＡＣＳ（登録商標）ｂｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）を、２００μＬずつ添加し、１５ｍｉｎ、４℃で反応させた。反応後、滅菌済みＰＢＳを１ｍＬ加え懸濁し、１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し上清を除去した。この洗浄工程を合計３回行った後、ＭＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（２ｍＭＥＤＴＡ含有））５００μＬで懸濁した。この懸濁液をＭＡＣＳ（登録商標）ｍｉｄｉｃｏｌｕｍｎ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製）を用いて分離した。ＭＡＣＳ用マグネットにカラムをセットし、カラム内を５００ｕＬのＭＡＣＳバッファーにて洗浄した。次にその他の分画（ＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈ）を回収するためのチューブをカラムの下にセットし、サンプル５００ｕｌを添加した。カラムから出てきた溶液を回収した。カラムに１ｍｌのＭＡＣＳバッファーを加え、出てきた溶液はＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈチューブに回収（ＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈサンプルＡとする）した。この工程をさらに二回繰り返した。洗浄工程を終えたカラムはマグネットから外し、標的分画（Ｅｌｕｔｉｏｎ）回収用チューブ上に設置し、５００ｕｌのＭＡＣＳバッファーを添加し、プランジャーにて押し出すことにより回収（ＥｌｕｔｉｏｎサンプルＢとする）した。これらの分離した溶液を８，０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ４００μＬに懸濁した。ＡｃｃｕｒｉＣ６ｐｌｕｓ（ＢＤ社製）を用いてＭＡＣＳ（登録商標）による分離前と分離後における各種細菌懸濁液、ＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈとＥｌｕｔｉｏｎと、ＧＳ１抗体およびＩｇＧ１ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏとの反応性を解析した。ＦＡＣＳ測定により取得されたＦＣＳファイルは、解析ソフトＦｌｏｗＪｏｖｅｒｓｉｏｎ１０．５．３（ＦｌｏｗＪｏＬＬＣ）で解析した。またＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈとＥｌｕｔｉｏｎの一部は１４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃で菌体ペレットを回収し、使用まで－８０℃にて保管した。 B. cultivated according to the above-mentioned test culture condition 1. A total of 5 types of gut microbiota reference strains shown in dorei and FIG. 5 were centrifuged at 8000 × g, 5 min, and 4 ° C., and the culture supernatant was removed. Then, after washing twice with PBS, the cell pellet was resuspended with PBS. The OD value (optical concentration) was measured with a spectrophotometer Nanodrop (registered trademark) 2000 C (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and based on 1OD ₆₆₀ = 8 × 10 ⁸ cells / mL, which is a cell number conversion formula in Escherichia coli. It was diluted to 1 × 10 ⁸ cells / ml with PBS containing 2% BSA. After preparing a mixed solution of the gut microbiota reference strain in which 100 ul of each culture solution was mixed, centrifuge at 17,800 × g, 5 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant, and add the GS1 culture supernatant to the remaining pellets. 100 μL was added and suspended, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes to react with the antibody contained in the GS1 culture supernatant. For comparison, IgG1 Isotype Control (manufactured by SIGMA) was used as a negative control, and the mixture was similarly reacted with a mixed solution of an intestinal bacterial reference strain. Two of these samples were prepared (two GS1 antibody reaction samples and two IgG1 isotype control antibody reaction samples, for a total of four). Then, 1 mL of sterilized PBS was added and washed, and the mixture was centrifuged at 17,800 × g, 5 min and 4 ° C. to remove the GS1 culture supernatant or the IgG1 Isotype Control. After repeating this process twice, 100 μL of the secondary antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes and used for the study. As the secondary antibody, Goat anti-mouse IgG (H + L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC (manufactured by Thermo Fisher Scientific) diluted 500-fold with PBS containing 2% BSA was used. Then, 1 mL of sterilized PBS was added and washed, and the mixture was centrifuged at 17,800 × g, 5 min and 4 ° C. to remove unreacted secondary antibody. After repeating this process twice, one GS antibody reaction sample and one IgG1 Isotype Control reaction sample were resuspended in PBS containing 500 ul of 2% BSA and used as a pre-separation sample at 4 ° C. without shading until measurement. I kept it. For the remaining two samples, 200 μL of Anti-FITC-labeled MACS® beads (manufactured by Miltenyi Biotec) diluted 20-fold with PBS containing 1% BSA was added and reacted at 4 ° C. for 15 min. After the reaction, 1 mL of sterilized PBS was added, suspended, and centrifuged at 14000 rpm, 5 min, and 4 ° C. to remove the supernatant. After performing this washing step three times in total, the cells were suspended in 500 μL of MACS buffer (PBS containing 0.5% BSA (containing 2 mM EDTA)). This suspension was separated using MACS® midi volume (manufactured by Miltenyi Biotec). The column was set on the MACS magnet, and the inside of the column was washed with 500 uL MACS buffer. Next, a tube for collecting the other fraction (Flow Through) was set under the column, and 500 ul of a sample was added. The solution that came out of the column was recovered. 1 ml of MACS buffer was added to the column, and the resulting solution was collected in a Flow Through tube (referred to as Flow Through sample A). This process was repeated twice more. The column after the washing step was removed from the magnet, placed on a target fraction recovery tube, 500 ul of MACS buffer was added, and the column was recovered by extruding with a plunger (referred to as Elution sample B). These separated solutions were centrifuged at 8,000 xg for 15 min at 4 ° C and suspended in 400 μL of PBS containing 2% BSA. Using Accuri C6 plus (manufactured by BD), the reactivity of various bacterial suspensions, Flow Through and Elution, with GS1 antibody and IgG1 Isotype Control before and after separation by MACS® was analyzed. The FCS file obtained by FACS measurement was analyzed by the analysis software FlowJo version 10.5.3 (FlowJo LLC). In addition, some of Flow Through and Elution collected cell pellets at 14000 rpm, 10 min, and 4 ° C, and stored at −80 ° C until use.

図６に、ＭＡＣＳ（登録商標）の検討結果を示す。ＧＳ１抗体に反応せず流れ出たＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈと、ＧＳ１抗体に反応した後、抗体からはがしたＥｌｕｔｉｏｎには、流れ出たものに差があることが判明した。 FIG. 6 shows the examination results of MACS (registered trademark). It was found that there was a difference between the Flow Through that flowed out without reacting with the GS1 antibody and the Elution that flowed out from the antibody after reacting with the GS1 antibody.

次に、ＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈとＥｌｕｔｉｏｎに含まれる菌体の種類について、ＲＴ（ＲｅａｌＴｉｍｅ）－ＰＣＲを用いて確認をした。 Next, the types of bacterial cells contained in Flow Time and Elution were confirmed using RT (Real Time) -PCR.

－８０℃で保存したＦｌｏｗＴｈｒｏｕｇｈサンプルＡとＥｌｕｔｉｏｎサンプルＢの菌体に対して、４００μＬのＴＥ１０バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ，１０ｍＭＥＤＴＡ）を加え溶解し、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（３００ｍｇ／ｍＬ）（ＷＡＫＯ社製）を２０μＬ加え、ローテーションしながら３７℃、８時間反応させた。その後、精製されたＡｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（登録商標）（２００００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）（ＷＡＫＯ社製）を１２μＬ加えて混合し、更にローテーションしながら３７℃、８時間反応させた。その後、５０μＬの１０％ＳＤＳ（ｐＨ７．２）を加えて混合し、更にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２５ｍｇ／ｍＬ）（ＭＥＲＣＫ社製）を１２μＬ加え、５５℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、５００μＬのＰｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１）を加え、ＭｉｃｒｏＭｉｘｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて最大速度で３ｍｉｎ撹拌したのち、１７，８００×ｇ、１０ｍｉｎ、２０℃で遠心分離し、上清を採取した。上清に、再度５００μＬのＰｈｅｎｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／Ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌを加え、同様に撹拌し遠心分離した後に上清を採取した。回収した上清に４０μＬの３ＭＳｏｄｉｕｍＡｃｅｔａｔｅを加え混合し、１ｍＬの冷やした１００％Ｅｔｈａｎｏｌを加え、ボルテックスで撹拌した後に－８０℃で１時間静置した。その後、１７，８００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心分離し上清を捨て、７０％Ｅｔｈａｎｏｌを５００μＬ加え、転倒混和した。１７，８００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心分離し上清を捨て、遠心エバポレーターでチューブ内の水分を蒸発させた。残った沈殿は精製された核酸であり、当該沈殿に、ＴＥ１０を１００μＬ加え、ＭｉｃｒｏＭｉｘｅｒを用いて最大速度で１ｍｉｎ撹拌後、８０μＬを別チューブに移し、ＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）を１μＬ加え、３７℃、一晩インキュベートした。 400 μL of TE10 buffer (10 mM Tris, 10 mM EDTA) was added to the cells of Flow Time Sample A and Elution Sample B stored at -80 ° C to dissolve them, and Lysozyme (300 mg / mL) (manufactured by WAKO). Was added in an amount of 20 μL, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 8 hours while rotating. Then, 12 μL of purified Achromoptidase (registered trademark) (20000units / mL) (manufactured by WAKO) was added and mixed, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 8 hours while rotating. Then, 50 μL of 10% SDS (pH 7.2) was added and mixed, and then 12 μL of Proteinase K (25 mg / mL) (manufactured by MERCK) was added and incubated overnight at 55 ° C. After incubation, 500 μL of Phenol / Chloroform / Isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added, and the mixture was stirred at a maximum speed of 3 min using a Micro Mixer (manufactured by TAITEC), and then centrifuged at 17,800 × g, 10 min, and 20 ° C. Separation was performed and the supernatant was collected. To the supernatant, 500 μL of Phenol / Chloroform / Isoamyl alcohol was added again, and the supernatant was collected after stirring and centrifuging in the same manner. 40 μL of 3M Sodium Acatete was added to the collected supernatant, mixed, 1 mL of chilled 100% Ethanol was added, and the mixture was stirred with vortex and allowed to stand at −80 ° C. for 1 hour. Then, the mixture was centrifuged at 17,800 × g, 10 min, and 4 ° C., the supernatant was discarded, 500 μL of 70% ethanol was added, and the mixture was inverted and mixed. Centrifugation at 17,800 × g, 10 min, 4 ° C. was performed, the supernatant was discarded, and the water content in the tube was evaporated by a centrifugal evaporator. The remaining precipitate is purified nucleic acid. To the precipitate, 100 μL of TE10 is added, and after stirring for 1 min at the maximum speed using a Micro Mixer, 80 μL is transferred to another tube, 1 μL of RNaseA (10 mg / mL) is added, and 37 Incubated overnight at ° C.

前記取得した核酸を用いて、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）２０００Ｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によりＤＮＡ濃度を測定し、ＰｕｒｅＷａｔｅｒ（Ｗａｋｏ社製）を用いて１０ｎｇ／ｕｌになるように調整した。希釈したＤＮＡ１ｕＬを鋳型とし、ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ２（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は初期変性９５℃、３０ｓｅｃ→（９６℃、３０ｓｅｃ、５５℃、４５ｓｅｃ、７２℃、１ｍｉｎ）×４０サイクル、で実施した。使用したプライマーを図７に示す。解析方法は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍを標的とし１６ＳｒＲＮＡ配列特異的プライマーにより増幅された遺伝子発現量を基準に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌特異的プライマーもしくはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）特異的プライマーにより増幅された遺伝子発現量を比較Ｃｔ法により解析した。 Using the obtained nucleic acid, the DNA concentration was measured by Nanodrop® 2000 C (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and adjusted to 10 ng / ul using Pure Water (manufactured by Wako). RT-PCR was performed using diluted DNA1uL as a template and SYBR® Premix Ex Taq2 (manufactured by TaKaRa). The PCR conditions were initial denaturation 95 ° C., 30 sec → (96 ° C., 30 sec, 55 ° C., 45 sec, 72 ° C., 1 min) × 40 cycles. The primers used are shown in FIG. The analysis method is based on the gene expression level amplified by the 16S rRNA sequence-specific primer targeting Eubacterium, and the gene expression level amplified by the Bacteroides genus-specific primer or the Akkermansia muciniphila (A. muciniphila) -specific primer. It was analyzed by the comparative Ct method.

図８にＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌特異的プライマーを用いた結果は、ＭＡＣＳ（登録商標）を行う前のサンプルに比べ、標的分画中にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌の割合が増加していることが判明した。なお、もともとのサンプルにＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌としてはＢ．ｄｏｒｅｉのみが含まれていることから、Ｅｌｕｔｉｏｎ中にＢ．ｄｏｒｅｉが含まれていることとなる。一方でＧＳ１抗体が結合しないと考えられるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ量は、ＭＡＣＳ（登録証商標）前に比べ、標的分画で減少していた。これにより、ＧＳ１抗体を用いて、Ｂ．ｄｏｒｅｉを特異的に単離、濃縮できることが判明した。 FIG. 8 shows the results of RT-PCR. As a result of using the Bacteroides spp. Specific primer, it was found that the proportion of Bacteroides spp. In the target fraction was increased as compared with the sample before MACS (registered trademark). In the original sample, Bacteroides spp. Since only dorei is included, B. Dorei will be included. On the other hand, it is considered that the GS1 antibody does not bind to A. The amount of mucinipila was decreased in the target fraction as compared with that before MACS (registered trademark). As a result, using the GS1 antibody, B. It was found that dorei can be specifically isolated and concentrated.

更に、単離、濃縮したＢ．ｄｏｒｅｉが、培養可能かどうかを検討した。 Further isolated and concentrated B. It was examined whether dorei could be cultivated.

段落００５１に記載の手法でＭＡＣＳ分離前の培養液、ＭＡＣＳ分離後の標的分画の各溶液を１７，８００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで４００μＬに懸濁した。当該懸濁した溶液を５０μＬ、滅菌済みコンラージ棒を用いて菌液をＧＡＭ寒天培地に撒き、Ｂａｃｔｒｏｎ３００（ＳＨＥＬＬＡＢ）内において３７℃嫌気環境下（Ｎ_２ガスをベースに５．０２％ＣＯ_２、４．９５％Ｈ_２を添加した混合ガス）で培養した。２４時間培養した後、プレート上に形成されたコロニーを撮影した。 Centrifugate each solution of the culture solution before MACS separation and the target fraction after MACS separation at 17,800 × g, 5 min at 4 ° C. by the method described in paragraph 0051, and suspend over 400 μL with PBS containing 2% BSA. It became cloudy. 50 μL of the suspended solution, the bacterial solution was sprinkled on a GAM agar medium using a sterilized spreader, and in a Bactron300 (SHEL LAB) under a 37 ° C. anaerobic environment (5.02% CO 2 based on _N2 gas, 5.02% CO ₂ ). It was cultured in a mixed gas containing _4.95 % H2). After culturing for 24 hours, the colonies formed on the plate were photographed.

図９に単離、濃縮したＢ．ｄｏｒｅｉの培養試験の結果を示す。ＭＡＣＳ分離前の培養液ではコロニーが形成された。また、前記ＲＴ－ＰＣＲの結果からＢ．ｄｏｒｅｉが単離されている標的分画でもコロニーの形成が見られた。この結果はＧＳ１抗体が結合した菌も増殖可能であることを示すものであった。 B. isolated and concentrated in FIG. The results of the culture test of dorei are shown. Colonies were formed in the culture medium before MACS separation. In addition, from the results of the RT-PCR, B. Colony formation was also seen in the target fraction from which dorei was isolated. This result showed that the bacterium to which the GS1 antibody was bound could also grow.

ＧＳ１抗体を産生するハイブリドーマの維持は以下のように行った。ハイブリドーマが保存された凍結バイアルチューブを３７℃で急速解凍した。１ｍＬのハイブリドーマ細胞溶液に１０ｍＬの細胞培養培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／１％ピルビン酸ナトリウム溶液／１Ｘｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ－グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製））を添加し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬの培地で再懸濁したのちに、１４ｍＬの培地が入った培養フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。飽和状態に達する直前に培養細胞液１ｍＬを１３ｍＬの培地を含んだ培養フラスコに移し、培養することで維持した。 The maintenance of the hybridoma that produces the GS1 antibody was performed as follows. Frozen vial tubes containing hybridomas were rapidly thawed at 37 ° C. Add 10 mL of cell culture medium (RPMI / 10% FCS / 1% sodium pyruvate solution / 1X penicillin-streptomycin-glutamine solution (manufactured by GIBCO)) to 1 mL of hybridoma cell solution, and centrifuge at 1000 rpm, 5 min, 4 ° C. separated. After removing the supernatant and resuspending in 1 mL of medium, the cells were transferred to a culture flask containing 14 mL of medium and cultured at 37 ° C. in a 5% CO ₂ environment. Immediately before reaching saturation, 1 mL of the cultured cell solution was transferred to a culture flask containing 13 mL of medium and maintained by culturing.

更に、シークエンス解析のために、以下のようにＧＳ１抗体産生ハイブリドーマ細胞の調整を行った。培養したハイブリドーマを回収し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離した。上清を除き、１０ｍＬの滅菌ＰＢＳに細胞を再懸濁した。１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、滅菌ＰＢＳを加え、血球計算版を用いて細胞数を数えた。細胞を２×１０^７Ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整し、１００μＬの細胞溶液を新しいチューブ分取し、そこにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を９００μＬ加え懸濁し、４℃で一晩インキュベートし、当該サンプルをＤＮＡシークエンス解析に用いた。 Furthermore, for sequence analysis, GS1 antibody-producing hybridoma cells were prepared as follows. The cultured hybridoma was collected and centrifuged at 1000 rpm, 5 min, and 4 ° C. The supernatant was removed and the cells were resuspended in 10 mL sterile PBS. Centrifugation was performed at 1000 rpm, 5 min, and 4 ° C., sterile PBS was added, and the number of cells was counted using a hemocytometer. The cells were adjusted to 2 × 10 ⁷ Cells / mL, 100 μL of the cell solution was dispensed into a new tube, 900 μL of RNA later (Invitrogen) was added and suspended, and the sample was incubated overnight at 4 ° C. Was used for DNA sequence analysis.

以上示したように、得られた抗体は、Ｂ．ｄｏｒｅｉに対して高い特異性を有し、Ｂ．ｄｏｒｅｉを特異的に精製することができる。このため、本抗体は、Ｂ．ｄｏｒｅｉ以外の細菌も含む糞便などの試料から、より精度よくＢ．ｄｏｒｅｉを単離し、更には濃縮することができるため、医薬、ヘルスケア等の分野において貢献することができる。また、本実施形態により、腸内細菌叢を構成する腸内細菌の中の一つであるＢ．ｄｏｒｅｉに対し高い特異性を持つ抗原結合分子と、当該抗原結合分子を用いてＢ．ｄｏｒｅｉを含む細菌集団から、標的とするＢ．ｄｏｒｅｉのみを効率よく単離、濃縮することができる。 As shown above, the obtained antibody was obtained from B.I. It has a high specificity for dorei, and B. Dorei can be specifically purified. Therefore, this antibody is based on B.I. From samples such as feces containing bacteria other than dorei, B. Since dorei can be isolated and further concentrated, it can contribute to the fields of medicine, healthcare and the like. In addition, according to the present embodiment, B. is one of the intestinal bacteria constituting the intestinal flora. Using an antigen-binding molecule having high specificity for dorei and the antigen-binding molecule, B.I. From a bacterial population containing dorei, target B. Only dorei can be efficiently isolated and concentrated.

特定の腸内細菌を標的とする特異的性の高い抗体は作製例も少なく、便検体など多種の腸内細菌が存在する中から標的細菌を分離・濃縮するためには選択培地を使用し、形成されたコロニーを単離、核酸を抽出したのちにシークエンスにより配列を確認する必要があった。本実施形態による抗体はＢ．ｄｏｒｅｉに対する特異性が高く、他の細菌種への交差反応がほとんどないため、抗体が結合した菌はほぼ標的細菌となる。そのため従来の手法よりも簡便に効率よく標的の菌を単離・濃縮することが可能となる。便試料などＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属を多く含むような検体からも本抗体を用いることでＢ．ｄｏｒｅｉを効率よく単離できることが期待される。また本抗体を用いて、腸内細菌叢の中におけるＢ．ｄｏｒｅｉの割合を評価する方法を構築することで小児一型糖尿病などの非侵襲診断に応用できる可能性がある。 There are few examples of highly specific antibodies that target specific intestinal bacteria, and a selective medium is used to isolate and concentrate the target bacteria from the presence of various intestinal bacteria such as stool samples. It was necessary to isolate the formed colonies, extract the nucleic acid, and then confirm the sequence by sequencing. The antibody according to this embodiment is B.I. Since it has high specificity for dorei and there is almost no cross-reactivity with other bacterial species, the bacterium to which the antibody is bound is almost the target bacterium. Therefore, it becomes possible to isolate and concentrate the target bacteria more easily and efficiently than the conventional method. By using this antibody from a sample containing a large amount of Bacteroides, such as a stool sample, B. It is expected that dorei can be efficiently isolated. In addition, using this antibody, B. in the intestinal flora. By constructing a method for evaluating the proportion of dorei, it may be applicable to non-invasive diagnosis such as pediatric type 1 diabetes.

これまで腸内細菌のゲノム配列は個人ごとに異なることが知られており、同じ腸内細菌でも発現する因子や機能が異なることが知られている。そのため、他者の腸内細菌を摂取しても殆ど定着しないことがある。Ｂ．ｄｏｒｅｉは有用菌の一つであり、腸内細菌由来のリポ多糖を減少させることでアテローム性動脈硬化症の抑制に寄与することが報告されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１８Ｎｏｖ２７；１３８（２２）：２４８６－２４９８．）。そのため、適正数のＢ．ｄｏｒｅｉを保持し続けることは健康維持に重要である。本申請で作製したＢ．ｄｏｒｅｉ特異的抗体を用いることで、個人固有のＢ．ｄｏｒｅｉを効率よく単離、再培養する手法を確立し、宿主に戻すことによりＢ．ｄｏｒｅｉの存在割合を意のままに調整し、かつ長期的な定着させることできる可能性がある。一方で、Ｂ．ｄｏｒｅｉは疾患とも関連しており、小児一型糖尿病の発症前に増加することが報告されている（ＦｒｏｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４；５：６７８）。本抗体を利用し、便中Ｂ．ｄｏｒｅｉの割合を適切に評価することで、これらの疾患の診断薬として応用できる可能性もある。 It has been known that the genome sequence of intestinal bacteria differs from individual to individual, and it is known that the factors and functions expressed by the same intestinal bacteria differ. Therefore, even if the intestinal bacteria of another person are ingested, they may hardly be established. B. Dorei is one of the useful bacteria, and it has been reported that it contributes to the suppression of atherosclerosis by reducing lipopolysaccharide derived from intestinal bacteria (Circulation. 2018 Nov 27; 138 (22) :. 2486-2498.). Therefore, an appropriate number of B.I. Maintaining dorei is important for maintaining good health. B. made in this application. By using a dorei-specific antibody, an individual-specific B. By establishing a method for efficiently isolating and reculturing dorei and returning it to the host, B. There is a possibility that the abundance ratio of dorei can be adjusted at will and can be established for a long period of time. On the other hand, B. Dorei is also associated with disease and has been reported to increase before the onset of childhood type 1 diabetes (Front Microbiol. 2014; 5: 678). Using this antibody, in stool B. Appropriate evaluation of the proportion of dorei may be applicable as a diagnostic agent for these diseases.

上述した実施形態は、本発明の理解を容易にするための例示に過ぎず、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良することができると共に、本発明にはその均等物が含まれることは言うまでもない。 The above-described embodiments are merely examples for facilitating the understanding of the present invention, and are not intended to limit the interpretation of the present invention. It goes without saying that the present invention can be modified and improved without departing from the spirit thereof, and the present invention includes its equivalents.

Claims

An antigen-binding molecule characterized by binding to Bacteroides dorei.

Do not bind to other bacteria belonging to the genus Bacteroides,
The antigen-binding molecule according to claim 1.

The other Bacteroides genus is Bacteroides ovatus, Bacteroides stercoris, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides bulgats.
2. The antigen-binding molecule according to claim 2.

The antigen-binding molecule is an antibody, antibody fragment or peptide.
As the amino acid sequence, the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 8 or the amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 8.
The antigen-binding molecule according to any one of claims 1 to 3, wherein the antigen-binding molecule comprises.

The antigen-binding molecule is an antibody or antibody fragment.
An amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 or the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3 to 5 as the amino acid sequence of the heavy chain.
An amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 6 to 8 or the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 6 to 8 as the amino acid sequence of the light chain.
The antigen-binding molecule according to claim 4, wherein the antigen-binding molecule comprises.

A VHCDR1 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
A VHCDR2 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A VHCDR3 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A VLCDR1 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
A VLCDR2 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7.
A VLCDR3 region containing an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
5. The antigen-binding molecule according to claim 5.

A nucleic acid composition comprising the nucleic acid sequence encoding the antigen-binding molecule according to any one of claims 1 to 6, or a plurality of nucleic acid sequences.

A vector composition comprising the nucleic acid sequence according to claim 7, a vector composition containing a plurality of nucleic acid sequences, or a plurality of vectors.

A cell comprising the vector composition according to claim 8.

A method for purifying Bacteroides dorei, which isolates Bacteroides doriei from a sample containing Bacteroides doriei using the antigen-binding molecule according to any one of claims 1 to 6.