JP2022096815A - Antigen polypeptide - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、抗原ポリペプチド及びその応用技術等に関する。 The present disclosure relates to an antigen polypeptide and its applied technology and the like.
歯周病は、歯周病原菌が歯周組織に感染することによって発症する炎症性疾患である。一般に、歯周病の診断は、歯周ポケット検査、触診・出血検査、動揺度検査、Ｘ線写真検査等の結果を総合して行われているが、これらの検査手法は歯科医師等の経験・技能等に基づいて行われるため、検査結果及び診断結果に差異が生じる可能性があり、客観性に欠くという問題がある。そのため、客観的に歯周病の診断を行う手法の開発が望まれている。 Periodontal disease is an inflammatory disease caused by infection of periodontal tissue by periodontal pathogens. Generally, the diagnosis of periodontal disease is performed by integrating the results of periodontal pocket examination, palpation / bleeding examination, agitation degree examination, X-ray examination, etc., but these examination methods are experienced by dentists and the like. -Since it is performed based on skill, etc., there is a possibility that the test result and the diagnosis result may differ, and there is a problem that it lacks objectiveness. Therefore, it is desired to develop a method for objectively diagnosing periodontal disease.
客観的に歯周病の診断を行う手法としては、例えば、歯周病原菌に対する血清中のＩｇＧ抗体価を歯周病の感染度又は重篤度の指標とする方法が報告されており、本発明者らが開発した手法では、歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離された特定の１次構造を有するポリペプチド又はその改変ポリペプチド（歯周病原菌抗原ポリペプチド）を用いることにより、多様な免疫型を有する広範囲の患者の歯周病を高い精度で検査することができ、かつ自動化された機器等により高速処理を行うことが可能となる（特許文献１）。 As a method for objectively diagnosing periodontal disease, for example, a method in which the IgG antibody titer in serum against a periodontal pathogen is used as an index of the degree of infection or the severity of periodontal disease has been reported. In the method developed by them, a polypeptide having a specific primary structure isolated from the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis or a modified polypeptide thereof (periodontal pathogen antigen polypeptide) is used. By using it, periodontal disease of a wide range of patients having various immune types can be inspected with high accuracy, and high-speed processing can be performed by an automated device or the like (Patent Document 1).
本開示は、歯周病原菌に対する抗体との反応性の高い歯周病原菌抗原ポリペプチドを提供することを課題とする。 It is an object of the present disclosure to provide a periodontopathogen antigen polypeptide having high reactivity with an antibody against a periodontopathogen.
本発明者らは、歯周病原菌抗原ポリペプチドのＮ末端にタグを付加することによって歯周病原菌に対する抗体との反応性が向上することを見出し、さらに改良を重ねた。 The present inventors have found that the reactivity with an antibody against a periodontal pathogen is improved by adding a tag to the N-terminal of the periodontal pathogen antigen polypeptide, and further improvements have been made.
本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項２．
下記の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項３．
下記の（Ｅ）又は（Ｆ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項４．
下記の（Ｇ）又は（Ｈ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項５．
下記の（Ｉ）又は（Ｊ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項６．
下記の（Ｋ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項７．
下記の（Ｌ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項８．
項１～７のいずれかに記載のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬。
項９．
項８に記載の歯周病原菌抗体価測定用試薬を含む歯周病原菌抗体価測定用キット。
項１０．
生体試料を項１～７のいずれかに記載のポリペプチドと接触させることを含む、
生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法。
The present disclosure includes, for example, the subjects described in the following sections.
A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (A) or (B).
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And the polypeptide item having antigenicity 2.
A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (C) or (D).
(C) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (D) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And the polypeptide item having antigenicity 3.
A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (E) or (F).
(E) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (F) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And the polypeptide item having antigenicity 4.
A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (G) or (H).
(G) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (H) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And the polypeptide item having antigenicity 5.
A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (I) or (J).
(I) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (J) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And the polypeptide item having antigenicity 6.
A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (K).
(K) Peptide item having the amino acid sequence of positions 580 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having antigenicity.
A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (L).
(L) Peptide item having the amino acid sequence of positions 698 to 718 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having antigenicity.
A reagent for measuring an antibody titer of a periodontal pathogen containing the polypeptide according to any one of
Item 4. A kit for measuring a periodontal pathogen antibody titer, which comprises the reagent for measuring a periodontal pathogen antibody titer according to Item 8.
Including contacting a biological sample with the polypeptide according to any one of
A method for measuring an antibody titer against periodontal pathogens in a biological sample.
歯周病原菌に対する抗体との反応性の高い歯周病原菌抗原ポリペプチドが提供される。 A periodontopathogen antigen polypeptide having high reactivity with an antibody against a periodontopathogen is provided.
以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。 Hereinafter, each embodiment included in the present disclosure will be described in more detail.
本開示は、（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ａ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure includes (A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (A)".
また、本開示は、（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｂ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure also includes polypeptides having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in (B) SEQ ID NO: 1. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (B)".
また、本開示は、（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｃ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２２７～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
The present disclosure also includes (C) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (C)".
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence of positions 227 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
また、本開示は、（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｄ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure also includes polypeptides having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in (D) SEQ ID NO: 2. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (D)".
また、本開示は、（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｅ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の５８０～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
The present disclosure also includes (E) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (E)".
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 corresponds to the amino acid sequence of positions 580 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
また、本開示は、（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｆ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure also includes polypeptides having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in (F) SEQ ID NO: 3. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (F)".
また、本開示は、（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｇ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の４０４～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
The present disclosure also includes a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in (G) SEQ ID NO: 4. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (G)".
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 corresponds to the amino acid sequence of positions 404 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
また、本開示は、（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｈ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure also includes polypeptides having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in (H) SEQ ID NO: 4. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (H)".
また、本開示は、（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｉ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号５に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２４～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
The present disclosure also includes (I) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (I)".
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 corresponds to the amino acid sequence of positions 24 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
また、本開示は、（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｊ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure also includes polypeptides having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in (J) SEQ ID NO: 5. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (J)".
また、本開示は、（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｋ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure also includes polypeptides having the amino acid sequences of positions 580 to 860 of the amino acid sequence shown in (K) SEQ ID NO: 1. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (K)".
また、本開示は、（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｌ）のポリペプチド」と表記することがある。 The present disclosure also includes polypeptides having the amino acid sequences of positions 698 to 718 of the amino acid sequence shown in (L) SEQ ID NO: 1. In the present specification, the polypeptide may be referred to as "polypeptide of (L)".
（Ｂ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号１に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。 The polypeptide (B) is a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the upper limit of the number of deleted, substituted or added amino acids is, for example, 250, 200, 150, 100, 50, 45, 40, 35. , 30, 25, 20, 19, 18, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 13, 12, 11, 10, 10, 9, 8, 7, 6, 6 It may be 5, 4, 3, or 2.
アミノ酸の欠失、置換、又は付加などの変異を特定のアミノ酸配列に加える技術は当該技術分野において公知であり、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法、ランダム突然変異導入法等を利用して行うことができる。 Techniques for adding mutations such as amino acid deletions, substitutions, or additions to a particular amino acid sequence are known in the art and can be performed using any technique. For example, it can be performed by using restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., a position-designated mutagenesis method, a random mutagenesis method, or the like.
（Ｂ）のポリペプチドは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。 The polypeptide (B) may be, for example, a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The identity may be 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
アミノ酸配列の同一性は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルトのパラメータを用いることにより、算出することができる。 For amino acid sequence identity, use the default parameters in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Can be calculated by
（Ｄ）のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号２に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。 The polypeptide (D) is a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the upper limit of the number of deleted, substituted or added amino acids is, for example, 250, 200, 150, 100, 50, 45, 40, 35. , 30, 25, 20, 19, 18, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 13, 12, 11, 10, 10, 9, 8, 7, 6, 6 It may be 5, 4, 3, or 2.
（Ｄ）のポリペプチドは、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。 The polypeptide (D) may be, for example, a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. The identity may be 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
また、（Ｄ）のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端側に２２６個以上のアミノ酸の付加を有しないポリペプチドであってもよい。換言すれば、（Ｄ）のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端側にアミノ酸の付加を有する場合、当該付加されたアミノ酸の個数が１～２２５個のポリペプチドであってもよい。当該アミノ酸の個数の上限又は下限は、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、又は２２０個であってもよい。より具体的には、例えば、２～２２０個であってもよい。 Further, the polypeptide (D) may be a polypeptide having no addition of 226 or more amino acids to the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In other words, when the polypeptide (D) has an amino acid addition on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, even if the number of the added amino acids is 1 to 225. good. The upper or lower limit of the number of amino acids is, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50. , 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, or It may be 220 pieces. More specifically, for example, the number may be 2 to 220.
（Ｆ）のポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号３に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。 The polypeptide (F) is a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the upper limit of the number of deleted, substituted or added amino acids is, for example, 250, 200, 150, 100, 50, 45, 40, 35. , 30, 25, 20, 19, 18, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 13, 12, 11, 10, 10, 9, 8, 7, 6, 6 It may be 5, 4, 3, or 2.
（Ｆ）のポリペプチドは、例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。 The polypeptide (F) may be, for example, a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. The identity may be 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
（Ｈ）のポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号４に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。 The polypeptide (H) is a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, the upper limit of the number of deleted, substituted or added amino acids is, for example, 250, 200, 150, 100, 50, 45, 40, 35. , 30, 25, 20, 19, 18, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 13, 12, 11, 10, 10, 9, 8, 7, 6, 6 It may be 5, 4, 3, or 2.
（Ｈ）のポリペプチドは、例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。 The polypeptide (H) may be, for example, a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. The identity may be 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号５に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。 The polypeptide (J) is a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the upper limit of the number of deleted, substituted or added amino acids is, for example, 250, 200, 150, 100, 50, 45, 40, 35. , 30, 25, 20, 19, 18, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 13, 12, 11, 10, 10, 9, 8, 7, 6, 6 It may be 5, 4, 3, or 2.
（Ｊ）のポリペプチドは、例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。 The polypeptide (J) may be, for example, a polypeptide consisting of an amino acid sequence showing 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. The identity may be 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
また、（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列のＮ末端側に２３個以上のアミノ酸の付加を有しないポリペプチドであってもよい。換言すれば、（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列のＮ末端側にアミノ酸の付加を有する場合、当該付加されたアミノ酸の個数が１～２２個のポリペプチドであってもよい。当該アミノ酸の個数の上限又は下限は、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２１個であってもよい。より具体的には、例えば、２～２１個であってもよい。 Further, the polypeptide (J) may be a polypeptide having no addition of 23 or more amino acids to the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. In other words, when the polypeptide (J) has an amino acid addition on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, even if the number of the added amino acids is 1 to 22. good. The upper or lower limit of the number of amino acids is, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 14. , 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 may be used. More specifically, for example, the number may be 2 to 21.
（Ｋ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。（Ｋ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列のＮ末端側、又はＣ末端側に１個若しくは２個以上のアミノ酸が付加されていてもよい。付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、６００個、５５０個、５００個、４５０個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。 The polypeptide (K) is a polypeptide having an amino acid sequence at positions 580 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The polypeptide (K) may have one or more amino acids added to the N-terminal side or the C-terminal side of the amino acid sequence at positions 580 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. good. The upper limit of the number of added amino acids is, for example, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 45. , 40, 35, 30, 25, 20, 19, 19, 18, 17, 16, 16, 15, 14, 13, 12, 12, 11, 10, 9, 8 It may be 7, 7, 5, 5, 4, 3, or 2.
（Ｌ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。（Ｌ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列のＮ末端側、又はＣ末端側に１個若しくは２個以上のアミノ酸が付加されていてもよい。付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、７００個、６５０個、６００個、５５０個、５００個、４５０個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。 The polypeptide (L) is a polypeptide having an amino acid sequence at positions 698 to 718 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The polypeptide (L) has one or more amino acids added to the N-terminal side or the C-terminal side of the amino acid sequence at positions 698 to 718 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. good. The upper limit of the number of added amino acids is, for example, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100. , 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 13, 12, 11, 10 It may be 9, 9, 7, 6, 5, 5, 4, 3, or 2.
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位に相当するアミノ酸配列における、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数が、０～５０個のポリペプチドであることが好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、又は４９個であってもよい。より具体的には、例えば、１～４９個であってもよい。また、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位に相当するアミノ酸配列が保存されていてもよい。 The polypeptides of (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), and (J) are shown in SEQ ID NO: 1. It is preferable that the number of deleted, substituted or added amino acids in the amino acid sequence corresponding to the 580th to 860th positions of the amino acid sequence is 0 to 50 in the polypeptide. The upper or lower limit of the range is, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 14. 15 pieces, 16 pieces, 17 pieces, 18 pieces, 19 pieces, 20 pieces, 21 pieces, 22 pieces, 23 pieces, 24 pieces, 25 pieces, 26 pieces, 27 pieces, 28 pieces, 29 pieces, 30 pieces, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, or 49. More specifically, for example, the number may be 1 to 49. Further, the polypeptides of (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), and (J) are designated by SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence corresponding to the 580th to 860th positions of the amino acid sequence shown in 1 may be conserved.
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位に相当するアミノ酸配列における、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数が、０～９個のポリペプチドであることが好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個であってもよい。より具体的には、例えば、１～８個であってもよい。また、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位に相当するアミノ酸配列が保存されていてもよい。 The polypeptides of (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), and (J) are shown in SEQ ID NO: 1. It is preferable that the number of deleted, substituted or added amino acids in the amino acid sequence corresponding to the 698th to 718th positions of the amino acid sequence is 0 to 9 polypeptides. The upper limit or the lower limit of the range may be, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8. More specifically, for example, the number may be 1 to 8. Further, the polypeptides of (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), and (J) are designated by SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence corresponding to the 698th to 718th positions of the amino acid sequence shown in 1 may be conserved.
本開示のポリペプチドは、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）及び（Ｌ）のポリペプチドのＮ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチドである。本明細書において、これらのポリペプチドを総称して、「本開示のポリペプチド」と表記することがある。 The polypeptides of the present disclosure are (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), (J), (K). And (L) is a polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side. In the present specification, these polypeptides may be collectively referred to as "the polypeptides of the present disclosure".
タグを付加する方法としては、特に限定されず、慣用の方法および反応条件を採用することができる。 The method of adding the tag is not particularly limited, and a conventional method and reaction conditions can be adopted.
（Ｂ）のポリペプチド、（Ｄ）のポリペプチド、（Ｆ）のポリペプチド、（Ｈ）のポリペプチド、（Ｊ）のポリペプチド、（Ｋ）及び（Ｌ）のポリペプチドは、抗原性を有することが好ましい。 The polypeptide (B), the polypeptide (D), the polypeptide (F), the polypeptide (H), the polypeptide (J), and the polypeptides (K) and (L) are antigenic. It is preferable to have.
本明細書において、「抗原性を有する」とは、歯周病原菌に対する抗体と、抗原抗体反応することを意味する。抗体としては、例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体等のイムノグロブリン抗体が挙げられ、イムノグロブリン抗体のいずれかと抗原抗体反応すればよい。中でもＩｇＧ抗体が好ましい。 As used herein, "having antigenicity" means an antigen-antibody reaction with an antibody against a periodontal pathogen. Examples of the antibody include an immunoglobulin antibody such as an IgG antibody, an IgM antibody, and an IgA antibody, and an antigen-antibody reaction may be performed with any of the immunoglobulin antibodies. Among them, IgG antibody is preferable.
抗原性は、ＥＬＩＳＡ法により評価することができる。より具体的には、後述する実施例に示すように、抗原性を評価するポリペプチドを抗原、歯周病原菌に対する抗体を含む歯周病患者の陽性血清を１次抗体として、これらの抗原抗体反応がＥＬＩＳＡ法により検出された場合には、当該ポリペプチドは抗原性を有すると判断される。 Antigenicity can be evaluated by the ELISA method. More specifically, as shown in Examples described later, these antigen-antibody reactions are performed by using a polypeptide for evaluating antigenicity as an antigen and a positive serum of a periodontal disease patient containing an antibody against a periodontal pathogen as a primary antibody. If is detected by the ELISA method, the polypeptide is determined to be antigenic.
本開示のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、又は５に示すアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することができる。また、上述したポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。 The polypeptides of the present disclosure use common protein chemical synthesis methods (eg, liquid phase and solid phase methods) based on the amino acid sequence information set forth in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, or 5. Can be manufactured. In addition, the above-mentioned polypeptide can be produced by a genetic engineering technique using the polynucleotide encoding the polypeptide.
本開示のポリペプチドは、さらに、標識物質を有していてもよい。標識物質としては、例えば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ビオチン、金コロイド、ラテックスビーズなどが挙げられる。 The polypeptides of the present disclosure may further carry a labeling substance. Examples of the labeling substance include horseradish peroxidase-derived peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), β-D-galactosidase, biotin, colloidal gold, and latex beads.
本開示は、本開示のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬をも包含する。本明細書において、当該試薬を、「本開示の試薬」と表記することがある。 The present disclosure also includes reagents for measuring periodontal pathogen antibody titers containing the polypeptides of the present disclosure. In the present specification, the reagent may be referred to as "reagent of the present disclosure".
本開示の試薬は、本開示のポリペプチドの他、他の成分を含有してもよい。他の成分としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどの溶媒；カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤；亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤などが挙げられる。 The reagents of the present disclosure may contain other components in addition to the polypeptides of the present disclosure. Other ingredients include solvents such as physiological saline, PBS, phosphate buffer, Tris buffer, borate buffer, Good Buffer; casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin, blood protein or plant protein. Active ingredient, normal animal blood component such as mouse, rabbit, goat, bovine fetus, protein component stabilizer such as normal human serum component; various preservatives; surfactant; metal salt such as zinc and magnesium Examples thereof include activators of enzymes such as.
本開示は、本開示のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬を含む歯周病原菌抗体価測定キットをも包含する。本明細書において、当該キットを、「本開示のキット」と表記することがある。 The present disclosure also includes a periodontal pathogen antibody titer measuring kit containing a reagent for measuring a periodontal pathogen antibody titer containing the polypeptide of the present disclosure. In the present specification, the kit may be referred to as "the kit of the present disclosure".
当該キットには、本開示の試薬の他、必要に応じてその他の試薬、器具等が含まれていてもよい。例えば、ブロッキング液、洗浄液、標識物質を含む抗体、基質液（発色・蛍光・発光）などが挙げられる。また、当該キットは、本開示の試薬の他、ブロッキング液、洗浄液、標識物質を含む抗体、基質液（発色・蛍光・発光）などを含む部材（メンブレン等）等を含むものであってもよい。 In addition to the reagents disclosed in the present disclosure, the kit may contain other reagents, instruments and the like, if necessary. For example, a blocking liquid, a cleaning liquid, an antibody containing a labeling substance, a substrate liquid (color development / fluorescence / emission) and the like can be mentioned. In addition to the reagents disclosed in the present disclosure, the kit may include a blocking solution, a washing solution, an antibody containing a labeling substance, a member (membrane, etc.) containing a substrate solution (color development, fluorescence, luminescence), and the like. ..
本開示は、生体試料を本開示のポリペプチドと接触させることを含む、該生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法をも包含する。本明細書において、当該測定方法を、「本開示の測定方法」と表記することがある。 The present disclosure also includes a method of measuring an antibody titer against a periodontal pathogen in a biological sample, which comprises contacting the biological sample with the polypeptide of the present disclosure. In the present specification, the measuring method may be referred to as "the measuring method of the present disclosure".
生体試料としては、特に限定されず、例えば、歯周病原菌に対する抗体（例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体等）を含み得る試料が挙げられる。採取の容易さ、取扱い易さ等の観点からは、生体試料としては、血液、唾液、歯肉溝滲出液、糞便、涙液、鼻腔ぬぐい液、又は羊水が好ましい。また、歯周病原菌に対する抗体を含み得る試料としては、肝臓などの臓器を用いることもできる。
血液を生体試料として用いる場合には、血漿又は血清がより好ましく、血清がさらにより好ましい。血漿を生体試料として用いる場合には、ろ紙や血漿分離機等により分離された血漿であってもよい。なお、対象から採取した生体試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。
The biological sample is not particularly limited, and examples thereof include a sample that can contain an antibody against a periodontal pathogen (for example, IgG antibody, IgA antibody, IgM antibody, etc.). From the viewpoint of ease of collection, ease of handling, and the like, the biological sample is preferably blood, saliva, gingival crevicular fluid, feces, tears, nasal swab, or amniotic fluid. Further, as a sample that can contain an antibody against a periodontal pathogen, an organ such as a liver can also be used.
When blood is used as a biological sample, plasma or serum is more preferred, and serum is even more preferred. When plasma is used as a biological sample, it may be plasma separated by a filter paper, a plasma separator, or the like. The method, conditions, etc. for storing the biological sample collected from the subject are not particularly limited, and the method can be performed according to a conventional method.
生体試料を採取される対象としては、ヒトのみならず、歯周病原菌の感染が起こり得る生体であれば特に制限されず、非ヒト哺乳動物であってもよい。ヒトとしては特に制限されず、健常者であってもよく、歯周病に罹患したヒト（歯周病患者）であってもよく、歯周病の罹患が疑われるヒトであってもよい。歯周病または歯周病原菌との関連性のある疾患（例えば、関節リウマチ、心疾患、動脈硬化性疾患、糖尿病、認知症、非アルコール性脂肪肝（NASH/NAFLD）、肥満、早産など）を有するヒトやその疑いがあるヒトであってもよい。また、非ヒト哺乳動物としては、ペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物が例示される。例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。 The target for which the biological sample is collected is not limited to humans, but may be a non-human mammal as long as it is a living body in which infection with a periodontal pathogen can occur. The human is not particularly limited, and may be a healthy person, a person suffering from periodontal disease (periodontal disease patient), or a person suspected of having periodontal disease. Diseases associated with periodontal disease or periodontal pathogens (eg, rheumatoid arthritis, heart disease, arteriosclerotic disease, diabetes, dementia, non-alcoholic fatty liver (NASH / NAFLD), obesity, premature birth, etc.) It may be a person who has or is suspected of having it. Moreover, as a non-human mammal, a mammal bred as a pet, a domestic animal, an experimental animal and the like is exemplified. For example, dogs, cats, monkeys, cows, horses, sheep, goats, pigs, rabbits, mice, rats, camels, llamas and the like can be mentioned.
対象から生体試料を採取する方法としては特に制限されず、常法に従って行えばよい。また、採取した生体試料は、そのまま用いてもよく、凍結乾燥等して保存した後、当該凍結乾燥物を後述する適当な溶媒に溶解して用いてもよく、また、採取した生体試料を、そのまま冷凍保存した後、あるいは後述する適当な溶媒に溶解する等して冷凍保存した後、使用時に解凍して用いてもよい。 The method of collecting a biological sample from the subject is not particularly limited, and the method may be performed according to a conventional method. Further, the collected biological sample may be used as it is, or may be used by dissolving the freeze-dried product in an appropriate solvent described later after storage by freeze-drying or the like, or the collected biological sample may be used. It may be frozen and stored as it is, or it may be thawed and used at the time of use after being frozen and stored by dissolving it in an appropriate solvent described later.
生体試料を溶解させる溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどが挙げられる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤；亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤などを含むものであってもよい。 Examples of the solvent for dissolving the biological sample include physiological saline, PBS, phosphate buffer, Tris buffer, boric acid buffer, Good Buffer and the like. These solvents include casein, skim milk, bovine serum albumin (BSA), gelatin, blood protein or plant protein as an active ingredient, normal animal blood components such as mice, rabbits, goats, and bovine fetuses, normal human serum components, and the like. Protein component stabilizer; various preservatives; surfactant; may contain an activator of an enzyme such as a salt of a metal such as zinc or magnesium.
本開示の測定方法によれば、本開示のポリペプチドと生体試料とを接触させることにより、生体試料中に存在する歯周病原菌に対する抗体（例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体等）を、本開示のポリペプチドとの抗原抗体反応を利用して検出することができる。 According to the measurement method of the present disclosure, by contacting the polypeptide of the present disclosure with a biological sample, an antibody against a periodontal pathogen existing in the biological sample (for example, IgG antibody, IgA antibody, IgM antibody, etc.) can be obtained. It can be detected by utilizing an antigen-antibody reaction with the polypeptide of the present disclosure.
本開示の測定方法は、さらに、生体試料を本開示のポリペプチドと接触させることにより生じる生体試料中に存在する歯周病原菌に対する抗体と本開示のポリペプチドとの抗原抗体反応物（抗体及び本開示のポリペプチドを含む複合体）を検出する工程を含んでいてもよい。 The measurement method of the present disclosure further comprises an antigen-antibody reaction product (antibody and present) of an antibody against a periodontal pathogen present in the biological sample generated by contacting the biological sample with the polypeptide of the present disclosure and the polypeptide of the present disclosure. It may include a step of detecting a complex containing the disclosed polypeptide).
抗原抗体反応物を検出する方法は、特に限定されず、慣用の方法および反応条件を採用することができる。例えば、当該抗原抗体反応物に、標識物質を含む抗イムノグロブリン抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体等）を接触させ当該標識物質を検出する方法や、本開示のポリペプチドが標識物質を含む場合、当該標識物質を検出する方法などが挙げられる。 The method for detecting the antigen-antibody reaction product is not particularly limited, and conventional methods and reaction conditions can be adopted. For example, a method of contacting an anti-immunoglobulin antibody containing a labeling substance (for example, an anti-IgG antibody) with the antigen-antibody reaction product to detect the labeling substance, or when the polypeptide of the present disclosure contains a labeling substance, the present invention is used. Examples include a method for detecting a labeling substance.
本開示の測定方法は、必要に応じて、例えば、抗原の固相への固定化工程、洗浄工程、ブロッキング工程、基質反応工程などを含んでいてもよい。これらは、慣用の方法および反応条件を採用することができる。 The measuring method of the present disclosure may include, for example, an immobilization step of an antigen on a solid phase, a washing step, a blocking step, a substrate reaction step, and the like, if necessary. These can employ conventional methods and reaction conditions.
本開示の測定方法は、ＥＬＩＳＡ法やドットブロット法、イムノクロマト法などの免疫学的手法が好ましく用いられる。 As the measuring method of the present disclosure, an immunological method such as an ELISA method, a dot blotting method, or an immunochromatography method is preferably used.
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。 In addition, in this specification, "includes" also includes "consisting essentially" and "consisting of" (The term "comprising" includes "consisting essentially of" and "consisting of."). In addition, the present disclosure includes all combinations of the constituent elements described herein.
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。 In addition, the various characteristics (property, structure, function, etc.) described for each embodiment of the present disclosure described above may be combined in any way in specifying the subject matter included in the present disclosure. That is, the present disclosure includes all subjects consisting of any combination of each of the combinable properties described herein.
本開示の内容を以下の実験例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「重量％」を意味する。 The contents of the present disclosure will be specifically described with reference to the following experimental examples. However, this disclosure is not limited to these. In the following, the experiments are conducted under atmospheric pressure and normal temperature conditions, unless otherwise specified. Also, unless otherwise specified, "%" means "% by weight".
実験例１：SDS-PAGEとウェスタンブロット
N末端側あるいはC末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質（配列番号１）をSDS-PAGEに付した。タグの付加場所が異なる二つのタンパク質を同じ濃度に調整し、熱変性させた後、2枚のポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行なった。メンブレンに転写し、それぞれ抗GST抗体と陽性血清でウエスタンブロットを行った。転写したメンブレンを5%スキムミルクを含むTBSにてブロッキングした。3%スキムミルクを含むTBS によって2,500－5,000倍に希釈した抗体溶液（抗GSTポリクロ―ナル抗体（Bethyl社）または陽性血清（歯周病患者の血清））を添加し、室温にて2時間反応させた。0.05%(v/v) Tween20を含むTBSにて3回洗浄した後、3%スキムミルクを含むTBS によって5,000倍に希釈したHRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体反応液（MILLIPORE）またはHRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液を添加し、室温で1時間反応させた。3回洗浄した後、4-Methyl-1 Naphtol 発色溶液を加え、室温で30分間反応させた。ImageQuant LAS4000 mini(GEヘルスケア)を用いてメンブレンの画像をスキャンし、各バンドのシグナル値を求めた。それぞれ、N末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質のバンド強度を100としたときの相対値を図１に示す。
Experimental Example 1: SDS-PAGE and Western blotting
A 35N protein (SEQ ID NO: 1) with a GST tag on the N-terminal side or C-terminal side was attached to SDS-PAGE. Two proteins with different tag attachment locations were adjusted to the same concentration, heat-denatured, and then SDS-PAGE was performed using two polyacrylamide gels. Transcription was performed on the membrane and Western blotting was performed with anti-GST antibody and positive serum, respectively. The transferred membrane was blocked with TBS containing 5% skim milk. Add an antibody solution diluted 2,500-5,000 times with TBS containing 3% skim milk (anti-GST polyclonal antibody (Bethyl) or positive serum (serum of periodontal disease patients)) and allow to react at room temperature for 2 hours. rice field. HRP-bound goat anti-rabbit IgG antibody reaction (MILLIPORE) or HRP-bound goat anti-human IgG diluted 5,000-fold with TBS containing 3% skim milk after washing 3 times with TBS containing 0.05% (v / v)
図１に示す通り、抗GST抗体を用いた場合の反応性は同程度であるにもかかわらず、陽性血清（歯周病患者の血清）を用いた場合には、C末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質と比較して、N末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質は反応性が高いことが分かった。 As shown in FIG. 1, although the reactivity when the anti-GST antibody is used is the same, when the positive serum (serum of a periodontal disease patient) is used, the GST tag is on the C-terminal side. It was found that the 35N protein with the GST tag on the N-terminal side was more reactive than the attached 35N protein.
実験例２：ドットブロット
N末端にHisタグあるいはGSTタグのついた35Nタンパク質をドットブロットに付した。35N（GSTタグ）のタンパク質の量は50ngとし、35N（Hisタグ）のタンパク質は同等のモル数となるよう調製した。ドットブロットした後、ブロッキング溶液（Takara Western BloT blocking buffer）で振とうした後、Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで振とうした。5,000倍に希釈した陽性血清（歯周病患者の血清）あるいは陰性血清（健常者の血清）を添加し、4℃で一晩振とうした。Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで洗浄した後、80,000倍に希釈した、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液（MILLIPORE）を添加し室温で1時間反応させた。Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで洗浄した後、HRP検出試薬のPierce ECL substrate (Thermo Fisher)を添加した。ImageQuant LAS4000 mini(GEヘルスケア)を用いてメンブレンの画像をスキャンし、ドットのシグナル値を求めた。なお、陽性血清及び陰性血清については、由来の異なる２種の血清を用いた。バンド強度を図２に示す。
Experimental example 2: Dot blot
A 35N protein with a His tag or GST tag at the N-terminus was attached to a dot blot. The amount of 35N (GST tag) protein was 50 ng, and the 35N (His tag) protein was prepared to have the same number of moles. After dot blotting, it was shaken with a blocking solution (Takara Western BloT blocking buffer) and then shaken with TBS containing Tween20 (0.05% (v / v)). Positive serum (serum of patients with periodontal disease) or negative serum (serum of healthy subjects) diluted 5,000 times was added, and the mixture was shaken overnight at 4 ° C. After washing with TBS containing Tween20 (0.05% (v / v)), HRP-bound goat anti-human IgG antibody reaction solution (MILLIPORE) diluted 80,000 times was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing with TBS containing Tween20 (0.05% (v / v)), the HRP detection reagent Pierce ECL substrate (Thermo Fisher) was added. Membrane images were scanned using ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare) to determine dot signal values. As for the positive serum and the negative serum, two types of sera having different origins were used. The band strength is shown in FIG.
図２に示す通り、いずれの陽性血清を用いた場合でも、Hisタグを用いた場合と比較して、GSTタグを用いた場合に、反応性が高いことが分かった。 As shown in FIG. 2, it was found that the reactivity was higher when the GST tag was used than when the His tag was used, regardless of which positive serum was used.
実験例３：ELISA
以下の4種の抗原タンパク質をELISAに付した。なお、抗原タンパク質としては、各配列番号に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドについて、Ｎ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないもの（No.9、11、13、15）及びＮ末端側にＧＳＴタグを有し、かつＣ末端側にＳＢＰタグを有するもの（No.10、12、14、16）を使用した。
No. 9、10（配列番号２）（35Nにおける227～860番目のアミノ酸に相当）
No. 11、12（配列番号３）（35Nにおける580～860番目のアミノ酸に相当）
No. 13、14（配列番号４）（35Nにおける404～860番目のアミノ酸に相当）
No. 15、16（配列番号５）（35Nにおける24～860番目のアミノ酸に相当）
Experimental example 3: ELISA
The following four antigenic proteins were attached to ELISA. As the antigen protein, the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in each SEQ ID NO: has a GST tag on the N-terminal side and does not contain a tag on the C-terminal side (No. 9, 11, 13, 15). ) And those having a GST tag on the N-terminal side and an SBP tag on the C-terminal side (No. 10, 12, 14, 16) were used.
No. 9 and 10 (SEQ ID NO: 2) (corresponding to amino acids 227 to 860 in 35N)
No. 11 and 12 (SEQ ID NO: 3) (corresponding to amino acids 580 to 860 in 35N)
No. 13 and 14 (SEQ ID NO: 4) (corresponding to amino acids 404 to 860 in 35N)
No. 15 and 16 (SEQ ID NO: 5) (corresponding to amino acids 24 to 860 in 35N)
抗原タンパク質の量は35Nを0.5ng/100μlに調製した場合と同等のモル数となるように調製した。 The amount of antigen protein was adjusted so that the number of moles was equivalent to that when 35N was prepared to 0.5 ng / 100 μl.
Glutathione を固相した96wellプレートをTween20（0.1%(v/v)）を含むPBSにて3回洗浄した後、調製したタンパク溶液100μlを添加し室温で1時間反応させた。Tween20（0.1%）を含むPBSにて3回洗浄した後、620倍に希釈した陽性血清を100μl添加し室温で1時間反応させた。Tween20（0.1%(v/v)）を含むPBSにて3回洗浄した後、2000倍に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、HRP）結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液（MILLIPORE）を100ｍμl添加し室温で反応させた。Tween20（0.1%(v/v)）を含むPBSにて3回洗浄した後、発色基質のABTS150μlを添加し、室温で反応させた後、プレートリーダーを用いて405nmの吸光度を測定した。結果を図３に示す。 A 96-well plate solid-phased with Glutathione was washed 3 times with PBS containing Tween20 (0.1% (v / v)), 100 μl of the prepared protein solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with PBS containing Tween20 (0.1%), 100 μl of 620-fold diluted positive serum was added and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with PBS containing Tween20 (0.1% (v / v)), 100 mL of horseradish peroxidase (HRP) -bound goat anti-human IgG antibody reaction solution (MILLIPORE) diluted 2000-fold was added. The reaction was carried out at room temperature. After washing 3 times with PBS containing Tween20 (0.1% (v / v)), 150 μl of ABTS as a color-developing substrate was added, reacted at room temperature, and then the absorbance at 405 nm was measured using a plate reader. The results are shown in FIG.
図３に示す通り、いずれの抗原タンパク質を用いた場合でも、Ｎ末端側にＧＳＴタグを有し、かつＣ末端側にＳＢＰタグを有するものと比較して、Ｎ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないものを用いた場合に、陽性血清との反応性が高いことが分かった。 As shown in FIG. 3, whichever antigen protein is used, it has a GST tag on the N-terminal side as compared with a GST tag on the N-terminal side and an SBP tag on the C-terminal side. , It was found that the reactivity with the positive serum was high when the one containing no tag on the C-terminal side was used.
実験例４：ELISA
実験例３と同様の方法により、以下の3種の抗原タンパク質をELISAに付した。なお、いずれの抗原タンパク質もＮ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないものを使用した。
35N（配列番号１）
No. 4（配列番号６）（35Nにおける31～697番目のアミノ酸に相当）
No. 18（配列番号７）（35Nにおける719～860番目のアミノ酸に相当）
また、陽性血清（歯周病患者の血清）に代えて、陰性血清（健常者の血清）を用いて、同様にELISAに供し、吸光度を測定した。結果を図４に示す。
Experimental example 4: ELISA
The following three antigenic proteins were attached to ELISA by the same method as in Experimental Example 3. In addition, all the antigen proteins had a GST tag on the N-terminal side and did not contain a tag on the C-terminal side.
35N (SEQ ID NO: 1)
No. 4 (SEQ ID NO: 6) (corresponds to the 31st to 697th amino acids in 35N)
No. 18 (SEQ ID NO: 7) (corresponding to amino acids 719 to 860 in 35N)
Further, instead of the positive serum (serum of a patient with periodontal disease), a negative serum (serum of a healthy person) was used in the same way for ELISA, and the absorbance was measured. The results are shown in FIG.
No. 4（配列番号６）のタンパク質は、陽性血清との反応性が低く、No. 18（配列番号７）のタンパク質は、陰性血清とも反応していることが示唆された。以上のことから、No. 7、No. 8のタンパク質に共通する配列（35N（配列番号１）における580～860）の中でも、特に35Nにおける698～718配列にエピトープが含まれることが示唆された。 It was suggested that the protein of No. 4 (SEQ ID NO: 6) had low reactivity with positive serum, and the protein of No. 18 (SEQ ID NO: 7) also reacted with negative serum. From the above, it was suggested that among the sequences common to the proteins of No. 7 and No. 8 (580 to 860 in 35N (SEQ ID NO: 1)), the epitope is contained in the 698 to 718 sequence in 35N. ..
Claims (10)
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (A) or (B).
(A) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And an antigenic polypeptide
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (C) or (D).
(C) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (D) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And an antigenic polypeptide
（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (E) or (F).
(E) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (F) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And an antigenic polypeptide
（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (G) or (H).
(G) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (H) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, one or more amino acids have an amino acid sequence deleted, substituted, or added. And an antigenic polypeptide
（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (I) or (J).
(I) Polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (J) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or added. And an antigenic polypeptide
（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (K).
(K) A polypeptide having the amino acid sequence at positions 580 to 860 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having antigenicity.
（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド A polypeptide having a structure in which a GST tag is added to the N-terminal side and no tag is added to the C-terminal side of the following polypeptide (L).
(L) A polypeptide having the amino acid sequences of positions 698 to 718 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having antigenicity.
該生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法。 Includes contacting a biological sample with the polypeptide according to any one of claims 1-7.
A method for measuring an antibody titer against a periodontal pathogen in a biological sample.
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