JP2022091405A - Recombinant microorganism, and production method of 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using the microorganism - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、組換え微生物および当該微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a recombinant microorganism and a method for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using the microorganism.
２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸は、抗菌剤および抗腫瘍剤として利用される鉄錯体又は白金錯体の配位子、麻薬鎮痛剤の中間体などとして、様々な用途に用いられる。 2,4,5-Trihydroxybenzoic acid is used for various purposes as a ligand of an iron complex or a platinum complex used as an antibacterial agent and an antitumor agent, an intermediate of a narcotic analgesic, and the like.
２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を化学的に製造する方法としては、例えば、安息香酸あるいはサリチル酸から鉄（ＩＩ）と過酸化水素とを用いて、ヒドロキシ基を付加する方法がある（非特許文献１）。 As a method for chemically producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid, for example, there is a method of adding a hydroxy group from benzoic acid or salicylic acid using iron (II) and hydrogen peroxide (non-). Patent Document 1).
また、微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法としては、天然由来のシュードモナス・エアルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｔ１の粗精製酵素を用いることにより、試験管内でプロトカテク酸を酸化させることにより２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生成できることが報告されている（非特許文献２）。 In addition, as a method for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using a microorganism, protocatechuic acid is oxidized in vitro by using a crude enzyme of naturally-derived Pseudomonas aeruginosa T1. It has been reported that 2,4,5-trihydroxybenzoic acid can be produced thereby (Non-Patent Document 2).
２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を化学的に製造する上述の方法では、選択的なヒドロキシ基の付加が困難であり、収率は数％と低い。また、この方法は、将来的な枯渇が懸念される石油を原料とする点に課題がある。 In the above-mentioned method for chemically producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid, it is difficult to selectively add a hydroxy group, and the yield is as low as several percent. In addition, this method has a problem in that it uses petroleum as a raw material, which may be depleted in the future.
また、組換え微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の醗酵製造法は未だ確立されていない。特に、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法は現状、天然の菌体由来の粗精製酵素を用いたプロトカテク酸からの製造のみに限られることから、効率的ではなく、工業的規模の生産には適さない。なお、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸と構造の類似する、没食子酸および１，２，３，４－テトラヒドロキシベンゼンについては、組換え微生物を用いた製造方法が提案されている（特許文献１、２および３）。 In addition, a method for fermenting 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using recombinant microorganisms has not yet been established. In particular, the method for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid is currently limited to production from protocatechuic acid using a crude enzyme derived from natural cells, so that it is not efficient and is on an industrial scale. Not suitable for production. For gallic acid and 1,2,3,4-tetrahydroxybenzene, which have similar structures to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid, a production method using recombinant microorganisms has been proposed (Patent). Documents 1, 2 and 3).
これまでシュードモナス・エアルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の酵素のみがプロトカテク酸の６位の酸化活性を有することが知られていたが、その他の菌由来の酵素は見いだされていない。本発明の課題は、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の工業的に効率的な製造方法を提供することにある。 Until now, it has been known that only the enzyme derived from Pseudomonas aeruginosa has the oxidative activity at the 6-position of protocatechuic acid, but no enzyme derived from other fungi has been found. An object of the present invention is to provide an industrially efficient method for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、シュードモナス・エアルギノーサ由来の酵素以外の、３－ヒドロキシ安息香酸の６位を酸化させる酵素、特に、シュードモナス・エアルギノーサ由来の酵素よりも工業的に有利なプロトカテク酸６位酸化酵素活性を有する特定の酵素を見出した。すなわち、以下で示す配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する酵素、および、これらのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素は、シュードモナス・エアルギノーサ由来の酵素よりも優れたプロトカテク酸６位酸化酵素活性を有する。 The present inventors have conducted diligent research to solve the above-mentioned problems, and compared with the enzyme that oxidizes the 6-position of 3-hydroxybenzoic acid other than the enzyme derived from Pseudomonas arginosa, particularly the enzyme derived from Pseudomonas arginosa. We have found a specific enzyme with industrially advantageous protocatechuic acid 6-position oxidase activity. That is, the enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 shown below, and the enzyme having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with these amino acid sequences are pseudomonas. -Has a protocatechuic acid 6-position oxidase activity superior to that of the enzyme derived from Earginosa.
すなわち、本発明は以下のとおりである：
［１］プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
前記蛋白質が、配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物；
［２］プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する組換え微生物であって、
当該組換え微生物には：
（ａ）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
（ｆ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
が導入されている、組換え微生物；
［３］前記蛋白質が、Ｃｇｌ、ＲｊｏおよびＰｎａからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子によってコードされる蛋白質である、［１］または［２］に記載の組換え微生物；
［４］前記組換え微生物が、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス型細菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、枯草菌またはポラロモナス型細菌である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換え組成物；
［５］前記組換え微生物が、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する、［１］～［４］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［６］［１］～［５］のいずれか１項に記載の組換え微生物を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法；
［７］以下の蛋白質からなる群より選択される少なくとも一つの蛋白質を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
That is, the present invention is as follows:
[1] A recombinant microorganism that expresses a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid.
A recombinant microorganism in which the protein has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
[2] A recombinant microorganism that expresses a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid.
For the recombinant microorganism:
(A) DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
(B) DNA having a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13.
(C) Hybridize under constriction conditions with DNA having a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13 and. DNA encoding a protein with enzymatic activity that oxidizes the 6th position of protocatechuic acid,
(D) Consists of a polynucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13, and of protocatechuic acid. DNA encoding a protein with enzymatic activity that oxidizes the 6th position,
(E) 1 to 10 amino acids are deleted from the amino acid sequence of the protein encoded by the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13. A DNA encoding a protein consisting of a substituted, inserted and / or added amino acid sequence, which encodes a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid, or (f) SEQ ID NOs: 5, 6 and DNA consisting of degenerate isomers of the polynucleotide sequence represented by 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13.
Has been introduced into recombinant microorganisms;
[3] The recombinant microorganism according to [1] or [2], wherein the protein is a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of Cgl, Rjo and Pna;
[4] Described in any one of [1] to [3], wherein the recombinant microorganism is Escherichia coli, Corine type bacterium, Pseudomonas type bacterium, actinomycete, yeast, lactic acid bacterium, Bacillus subtilis or Polaromonas type bacterium. Recombinant composition of
[5] The recombinant microorganisms include Eschericia, Corynebacterium, Pseudomonas, Streptomyces, Rhodococcus, Rhodococcus, and Saccus. The recombinant microorganism according to any one of [1] to [4], which belongs to the genus Lactococcus, the genus Lactobacillus, the genus Bacillus or the genus Polaromonas;
[6] 2,4,5, which comprises converting protocatechuic acid to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using the recombinant microorganism according to any one of [1] to [5]. -Method for producing trihydroxybenzoic acid;
[7] 2,4,5-Trihydroxybenzoic acid comprising converting protocatechuic acid to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using at least one protein selected from the group consisting of the following proteins. How to make acid:
(1) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(2) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(4) A protein having an amino acid sequence having an amino acid sequence identity of 80% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(5) A protein having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(6) A protein having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(7) A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(8) A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (9) SEQ ID NO: A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to a protein having an amino acid sequence represented by 3.
本発明によれば、組換え微生物を用いた、醗酵による２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の工業的に効率的な製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an industrially efficient method for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid by fermentation using a recombinant microorganism.
以下に本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
本発明にかかる組換え微生物は、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現するよう改変が行われた遺伝子組換え微生物である。プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質は、以下に示すとおり、プロトカテク酸の６位を酸化することによって、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換する。本発明において、組換え微生物に関して、「プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する」とは、組換え微生物が当該蛋白質を生成する能力を有していることを意味し、本来当該蛋白質を発現する能力を有する宿主微生物に対して、さらに当該蛋白質を発現するような改変が行われている場合、および、本来は当該蛋白質を発現する能力を有さない宿主微生物に対して、当該蛋白質を発現するような改変が行われている場合の両方を含むものとする。本明細書では、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を、「プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質」とも称し、また、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を、「プロトカテク酸６位酸化酵素活性」とも称する。
Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail.
The recombinant microorganism according to the present invention is a genetically modified microorganism modified to express a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid. A protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid converts protocatechuic acid into 2,4,5-trihydroxybenzoic acid by oxidizing the 6-position of protocatechuic acid as shown below. In the present invention, with respect to the recombinant microorganism, "expressing a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid" means that the recombinant microorganism has an ability to produce the protein. For host microorganisms that originally have the ability to express the protein, when further modifications have been made to express the protein, and for host microorganisms that do not originally have the ability to express the protein. , Both when modified to express the protein are included. In the present specification, a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid is also referred to as "protocatechuic acid 6-position oxidase protein", and an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid is referred to as "protocatechuic acid 6". Also referred to as "position oxidase activity".
宿主微生物が、本来プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現する能力を有する宿主微生物である場合、組換え微生物に関して、「プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質を発現する」とは、宿主微生物と比較して、プロトカテク酸６位酸化酵素活性が少なくとも維持されているか、または、当該活性が増強されていることをいい、好ましくは、宿主微生物と比較して、プロトカテク酸６位酸化酵素活性が増強されていることをいう。すなわち、本明細書において、当該蛋白質に関して、「発現」の語には、当該蛋白質の「活性の維持」および「活性の増強」が含まれるものとする。本来プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現する能力を有する宿主微生物、および、本来は当該蛋白質を発現する能力を有さない宿主微生物については、後述する。 When the host microorganism is a host microorganism originally capable of expressing the 6-position protocatechuic acid oxidase protein, the term "expressing a protein having an enzymatic activity to oxidize the 6-position of protocatechuic acid" with respect to the recombinant microorganism means. It means that the protocatechuic acid 6-position oxidase activity is at least maintained or enhanced as compared with the host microorganism, preferably the protocatechuic acid 6-position oxidase as compared with the host microorganism. It means that the activity is enhanced. That is, in the present specification, with respect to the protein, the term "expression" shall include "maintenance of activity" and "enhancement of activity" of the protein. A host microorganism originally capable of expressing the protocatechuic acid 6-position oxidase protein and a host microorganism originally not capable of expressing the protein will be described later.
ここで、プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質には、当該蛋白質のアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質であって、当該酵素蛋白質と機能的に同等な蛋白質も含まれる。ここで「機能的に同等な蛋白質」とは、その酵素蛋白質の活性と同等の活性を備えた蛋白質であり、「機能的に同等な蛋白質」には、その酵素蛋白質のアミノ酸配列と、例えば８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の配列同一性を有する蛋白質が含まれる。 Here, the protocatechuic acid 6-position oxidase protein is a protein containing an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of the protein, and the enzyme. It also contains proteins that are functionally equivalent to proteins. Here, the "functionally equivalent protein" is a protein having the same activity as that of the enzyme protein, and the "functionally equivalent protein" includes the amino acid sequence of the enzyme protein and, for example, 80. % Or more, 83% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more , 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5 % Or higher, 99.6% or higher, 99.7% or higher, 99.8% or higher, or 99.9% or higher containing proteins having sequence identity.
したがって、「プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質」の語には、下記で特定する配列番号に示されるアミノ酸配列と８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、プロトカテク酸６位酸化酵素活性を有する蛋白質を包含する。 Therefore, the term "protocatechuic acid 6-position oxidase protein" includes the amino acid sequence shown in the sequence number specified below and 80% or more, 83% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88%. 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more or It includes a protein having an amino acid sequence having 99.9% or more sequence identity and having protocatechuic acid 6-position oxidase activity.
ここで、プロトカテク酸６位酸化酵素活性は、当業者によって周知の方法によって評価することができ、例えば、本発明にかかる組換え微生物を培養した後、培地の上清中の２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸濃度を高速液体クロマトグラフィーで定量する方法が挙げられる。 Here, the activity of the 6-position oxidase of protocatechuic acid can be evaluated by a method well known to those skilled in the art. For example, after culturing the recombinant microorganism according to the present invention, 2, 4, 5 in the supernatant of the medium. -A method of quantifying the trihydroxybenzoic acid concentration by high performance liquid chromatography can be mentioned.
アミノ酸配列に関し、「配列同一性」は、公知の方法によって決定することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）にて使用することのできるアライメントサーチツールを用いて得られる。ポリヌクレオチド配列の「配列同一性」についても同様に、公知の方法によって決定することができる。 With respect to the amino acid sequence, "sequence identity" can be determined by known methods, for example in BLAST (Basic Local Alginnment Search Tool: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Obtained using an alignment search tool that can be used with. Similarly, the "sequence identity" of a polynucleotide sequence can be determined by a known method.
プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質としては、例えば、
・配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
・配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、および
・配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
が挙げられる。
Examples of the protocatechuic acid 6-position oxidase protein include, for example.
-A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
-A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 can be mentioned.
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の蛋白質Ｃｇｌである。配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）由来の蛋白質Ｒｊｏである。配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来の蛋白質Ｐｎａである。 The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the protein Cgl derived from Corynebacterium glutamicum. The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the protein Rjo derived from Rhodococcus josti. The protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the protein Pna derived from Polaromonas naphthalenivolans.
本発明にかかる組換え微生物は、上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡが導入された組換え微生物であってよく、あるいは、上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで形質転換した微生物であってもよい。 The recombinant microorganism according to the present invention may be a recombinant microorganism into which the DNA encoding the above-mentioned protocatechuic acid 6-position oxidase protein has been introduced, or the DNA encoding the above-mentioned protocatechuic acid 6-position oxidase protein may be used. It may be a microorganism transformed with the recombinant DNA contained therein.
プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子は、
（ａ）上記で特定する配列番号で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１つまたは複数個（例えば１～１０個、好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個もしくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、および
（ｆ）下記で特定する配列番号で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
を包含する。
The gene encoding the 6-position oxidase protein of protocatechuic acid is
(A) DNA encoding a protein having an amino acid sequence represented by the above-specified SEQ ID NO:
(B) DNA having a polynucleotide sequence represented by the SEQ ID NO: specified below,
(C) A protein that hybridizes under constriction conditions with a DNA having a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence represented by the SEQ ID NO: specified below, and has an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid. DNA, which encodes
(D) 80% or more, 83% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91 with the polynucleotide sequence represented by the SEQ ID NO: specified below. % Or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2 % Or higher, 99.3% or higher, 99.4% or higher, 99.5% or higher, 99.6% or higher, 99.7% or higher, 99.8% or higher, or 99.9% or higher having sequence identity. A DNA consisting of a polynucleotide sequence and encoding a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid,
(E) One or more (for example, 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1) with respect to the amino acid sequence of the protein encoded by the polynucleotide sequence represented by the SEQ ID NO: specified below. A DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which ~ 5, more preferably 1-3, even more preferably 1-2 or 1) amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added. , DNA encoding a protein having enzymatic activity to oxidize the 6-position of protocatechuic acid, and (f) DNA consisting of degenerate isomers of the polynucleotide sequence represented by the SEQ ID NO: specified below.
Including.
ここで、「緊縮条件」とは、例えば、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」程度の条件である。 Here, the "austerity condition" is, for example, a condition of about "1xSSC, 0.1% SDS, 60 ° C.", and a stricter condition is about "0.1xSSC, 0.1% SDS, 60 ° C.". The more severe condition is "0.1xSSC, 0.1% SDS, 68 ° C.".
プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
・配列番号５、８または１１で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
・配列番号６、９または１２で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、および
・配列番号７、１０または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
が挙げられる。配列番号５～１３の各々については後述する。
As the DNA encoding the protocatechuic acid 6-position oxidase protein, for example,
DNA having the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 8 or 11.
DNA having a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, 9 or 12, and DNA having a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7, 10 or 13.
Can be mentioned. Each of SEQ ID NOs: 5 to 13 will be described later.
一態様において、プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＣｇｌ（配列番号８）、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）由来のＲｊｏ（配列番号９）およびポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のＰｎａ（配列番号１０）からなる群より選択される。 In one embodiment, the DNA encoding the protocatechuic acid 6-position oxidase protein is Cgl (SEQ ID NO: 8) derived from Corynebacterium glutamicum and Rjo (SEQ ID NO: 9) derived from Rhodococcus josti. And Pna (SEQ ID NO: 10) from Polaromonas naphthalenivorans.
本発明で用いられる微生物は、上記のポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ種をベクターＤＮＡに連結することで組換え体ＤＮＡを作製し、当該組換え体ＤＮＡを用いて宿主の菌株を形質転換することにより取得することができる。ただし、これらのＤＮＡ種に限定されるものではなく、その目的を達成できるＤＮＡ種であればすべて使用できる。 The microorganism used in the present invention prepares a recombinant DNA by ligating a DNA species having the above polynucleotide sequence to a vector DNA, and transforms a host strain using the recombinant DNA. Can be obtained. However, the present invention is not limited to these DNA species, and any DNA species that can achieve the purpose can be used.
本発明で用いられる微生物は、上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現可能な組換え微生物であれば特に制限はなく、例えば、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス型細菌、放線菌、酵母菌、乳酸菌、枯草菌またはポラロモナス型細菌である。本発明で用いられる微生物は、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する。本発明に係る組換え微生物は、これらの微生物株を変異処理することにより、得られる。微生物の親株はアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、必要に応じてＡＴＣＣと略記する）、独立行政法人製品基盤技術基盤機構・生物遺伝資源部門（以下、必要に応じてＮＢＲＣと略記する）、独立行政法人 理化学研究所 筑波研究所 バイオリソースセンター等から入手することができる。 The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a recombinant microorganism capable of expressing the above-mentioned protocatechuic acid 6-position oxidase protein. It is a lactic acid bacterium, Bacillus subtilis or Polaromonas type bacterium. The microorganisms used in the present invention are preferably genus Eschericia, genus Corynebacterium, genus Pseudomonas, genus Streptomyces, genus Rhodococcus, genus Rhodococcus. , Lactococcus, Lactococcus, Bacillus or Polaromonas. The recombinant microorganism according to the present invention can be obtained by mutating these microbial strains. The parent strains of microorganisms are the American Type Culture Collection (hereinafter abbreviated as ATCC as necessary), Incorporated Administrative Agency Product Infrastructure Technology Infrastructure Organization / Biological Genetic Resources Division (hereinafter abbreviated as NBRC as necessary), It can be obtained from the BioResource Center, RIKEN, Tsukuba Institute, Incorporated Administrative Agency.
本発明で宿主微生物として用いられる微生物は、本来はプロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有さない微生物であってよい。「本来はプロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有さない微生物」には、例えば、当該酵素のアミノ酸配列と配列同一性７０％以下のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する微生物が含まれる。「本来はプロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有さない微生物」としては、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のラクトバシルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ならびに、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）が挙げられる。ただし、本発明に使用することのできる菌株は上記菌株に限定されるものではなく、その目的を達成できる菌株であればすべて使用できる。 The microorganism used as the host microorganism in the present invention may be a microorganism that does not originally have the ability to express protocatechuic acid 6-position oxidase. The "microorganism that originally does not have the ability to express the 6-position protocatechuic acid oxidase" includes, for example, a microorganism that expresses a protein having an amino acid sequence having an amino acid sequence identity of 70% or less with the amino acid sequence of the enzyme. Examples of "microorganisms that do not originally have the ability to express the 6-position protocatechuic acid oxidase" include Escherichia coli of the genus Pseudomonas and Corinebacterium of the genus Corynebacterium.アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属のシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ cerevisiae), Lactococcus plantarum of the genus Lactococcus, Lactococcus lactis and lactobacillus lactis of the genus Lactococcus, and Bacillus bacillus bacillus (Bacillus) Bacteria (Bacillus subtilis natto) can be mentioned. However, the strains that can be used in the present invention are not limited to the above strains, and any strain that can achieve the purpose can be used.
本発明で宿主微生物として用いられる微生物は、本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物であってもよい。「本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物」としては、コリネ型細菌、ロドコッカス属、ポラロモナス型細菌等に属する微生物を挙げることができ、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属のロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）、および、ポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属のポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）が挙げられる。 The microorganism used as the host microorganism in the present invention may be a microorganism originally capable of expressing protocatechuic acid 6-position oxidase. Examples of "microorganisms originally capable of expressing the 6-position oxidase of protocatechuic acid" include microorganisms belonging to Coryneform bacteria, Rhodococcus genus, Polaromonas type bacteria and the like, and examples thereof include Corynebacterium corynebacterium. Bacteria Corynebacterium glutamicum, Rhodococcus hosti, and Polaromonas Polaronanas polaronas.
これらの本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物を用いる場合には、当該酵素の発現強化に適切なプロモーター、エンハンサー等の発現機構を好ましく選択することができる。コリネ型細菌、ロドコッカス属、ポラロモナス型細菌の当該蛋白質の遺伝子発現を増強することが可能なプロモーターは、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。 When a microorganism having the ability to express these protocatechuic acid 6-position oxidases is used, it is possible to preferably select an expression mechanism such as a promoter or enhancer suitable for enhancing the expression of the enzyme. The promoter capable of enhancing the gene expression of the protein of the coryneform bacterium, Rhodococcus genus, and polaromonas type bacterium may be any promoter as long as it can be expressed in the host cell.
本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物において、当該酵素遺伝子の発現を強化するには、例えば、コリネ型細菌には、Ｋｍプロモーター、ｂｅｎプロモーター、ｖａｎプロモーター等を使用することができ、ロドコッカス属細菌には、ｔｉｐＡプロモーター等を使用することができ、ポラロモナス型細菌には、ｎａｇプロモーター等を用いることができる。 In order to enhance the expression of the enzyme gene in a microorganism originally capable of expressing the 6-position protocatechuic acid oxidase, for example, a Km promoter, a ben promoter, a van promoter or the like can be used for a coryneform bacterium. , A tipA promoter or the like can be used for the bacterium belonging to the genus Rodococcus, and a nag promoter or the like can be used for the polaromonas type bacterium.
以下に、ＤＮＡのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。 The method of cloning DNA and producing a transformant will be described in detail below.
目的とするプロトカテク酸６位酸化酵素のＤＮＡは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、又はポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属の細菌由来のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子（以下、「プロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子」とも称する。）、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）、又はポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のプロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子の塩基配列に基づいて設計する。 The DNA of the target protocatechuic acid 6-position oxidase is a gene encoding a protocatechuic acid 6-position oxidase protein derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, Rhodococcus, or Polaromonas (hereinafter referred to as the gene. , Also referred to as "protocatechuic acid 6-position oxidase gene"), preferably Corynebacterium glutamicum, Rhodococcus josti, or Polaromonas naphthalenibolanth catepholance (Polaromonas). Designed based on the base sequence of the 6-position corynebacterium gene.
目的とするプロトカテク酸６位酸化酵素のＤＮＡは、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）ＲＨＡ１、又はポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）ＣＪ２のプロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子の塩基配列、すなわち配列番号８、９又は１０で表される塩基配列に基づいて設計することができる。 The DNA of the target protocatechuic acid 6-position oxidase is specifically Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Rhodococcus josti RHA1, or Polaromonas naphthalenivorans. It can be designed based on the base sequence of the protocatechuic acid 6-position oxidase gene, that is, the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, 9 or 10.
上記のプロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子のＤＮＡを連結するベクターとしては、エスケリキア・コリＢＬ２１株等において自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能である。このようなベクターとしては、具体的には、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）等を用いることができる。 As the vector for linking the DNA of the above-mentioned protocatechuic acid 6-position oxidase gene, a plasmid vector, a phage vector, or the like can be used as long as it is a vector capable of self-replicating in the Esquerikia coli BL21 strain or the like. Specifically, as such a vector, pET-15b, pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC18, pBR322, pHelix1 (manufactured by Roche Diagnostics), ZAP Express (manufactured by Stratagene) and the like are used. be able to.
上記のようにして、ベクターにＤＮＡを連結して得られた組換え体ＤＮＡの宿主としては、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物を用いることができる。ベクターにＤＮＡを連結して得られた組換え体ＤＮＡの宿主としては、好ましくは、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を用いることができる。エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物としては、例えば、エスケリキア・コリが挙げられ、エスケリキア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＤＨ５α、エスケリキア・コリＪＭ１０５、エスケリキア・コリＢＬ２１等を挙げることができる。 As the host of the recombinant DNA obtained by ligating the DNA to the vector as described above, for example, the genus Escherichia, the genus Corynebacterium, the genus Pseudomonas, and Streptomyces. The genus (Streptomyces), the genus Rhodococcus, the genus Saccharomyces, the genus Lactococcus, the genus Lactococcus, the genus Lactobacillus, the genus Bacillus, and the genus Coryne. As the host of the recombinant DNA obtained by ligating the DNA to the vector, a microorganism belonging to the genus Escherichia or the genus Corynebacterium can be preferably used. Examples of the microorganism belonging to the genus Escherichia include Escherichia coli, and any microorganism belonging to the genus Escherichia can be used. Specific examples thereof include Escherichia coli DH5α, Escherichia coli JM105, and Escherichia coli BL21.
エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、またはポラロモナス(Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ)属に属する微生物の中に、プロトカテク酸６位酸化酵素遺伝子を導入する場合、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、当該微生物のいずれかとエスケリキア・コリＢＬ２１株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換え体ＤＮＡを宿主となる当該微生物に導入することができる。 Eschericia, Corynebacterium, Pseudomonas, Streptomyces, Rhodococcus, Lactococcus, Lactococcus, Lactococcus, Lactococcus, Lactococcus, Lactococcus, Lactococcus, Lactococcus, Lactococcus When introducing the protocatechuic acid 6-position oxidase gene into a genus, a genus Bacillus, or a genus Corynebacterium, a vector capable of self-replication is used in these microorganisms. Preferably, recombinant DNA can be introduced into the host microorganism using a shuttle vector capable of self-replicating in both one of the microorganisms and the microorganism of the Escherikia coli BL21 strain.
宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主へＤＮＡを導入することのできる方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ６９, ２１１０ （１９７２）〕、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., １６, ６１２７ （１９８８）〕、市販のコンピテント・セルを用いる方法等を挙げることができる。 As a method for introducing recombinant DNA into a host, any method that can introduce DNA into the host can be used. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], a method using a commercially available competent cell, and the like can be mentioned.
上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等の既存のＤＮＡ合成装置を用いて化学合成することによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。 Based on the DNA base sequence determined above, the desired DNA can also be prepared by chemical synthesis using an existing DNA synthesizer such as the 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems. can.
上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のＤＮＡを宿主で発現させることによって得られる。 A transformant expressing the above-mentioned protocatechuic acid 6-position oxidase protein is obtained by expressing the above-mentioned DNA in a host using the following method.
上記のプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質をコードするＤＮＡを用いる際には、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、当該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、当該蛋白質の生産率を向上させることもできる。本発明のＤＮＡを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製し、当該組換え体ＤＮＡを、当該発現ベクターに適合した宿主に導入することにより取得することができる。形質転換体を得るためのこれらの方法は、単独で行ってもよく、複数を組み合わせて行ってもよい。 When the DNA encoding the above-mentioned protocatechuic acid 6-position oxidase protein is used, a DNA fragment having an appropriate length including a portion encoding the protein of the present invention can be prepared, if necessary. Further, the production rate of the protein can be improved by substituting the base sequence of the portion encoding the protein so as to be the optimum codon for the expression of the host. The transformant expressing the DNA of the present invention prepares a recombinant DNA by inserting the above DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector, and the recombinant DNA is adapted to the expression vector. It can be obtained by introducing it into the host. These methods for obtaining a transformant may be carried out alone or in combination of two or more.
例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＣｇｌの塩基配列（配列番号８）、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ）由来のＲｊｏの塩基配列（配列番号９）、およびポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）由来のＰｎａの塩基配列（配列番号１０）について、大腸菌における発現に最適なコドンとなるよう塩基の置換を行ったものを、それぞれ、配列番号５、配列番号６および配列番号７として下記表に示す。 For example, the base sequence of Cgl from Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 8), the base sequence of Rjo from Rhodococcus josti (SEQ ID NO: 9), and Polaromonas naphthalenivolance (SEQ ID NO: 9). The nucleotide sequence of Pna (SEQ ID NO: 10) derived from Polaromonas naphthalenivorans) was substituted with a base so as to be the optimum codon for expression in Escherichia coli, and the nucleotide sequences were substituted as SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively, as described below. Shown in the table.
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含むものが用いられる。 As the expression vector, a vector that can independently replicate in the above host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡおよび転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。当該組換え体ＤＮＡには、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 When a prokaryote such as a bacterium is used as a host cell, the recombinant DNA containing the DNA of the present invention can independently replicate in the prokaryote, and at the same time, the promoter, the ribosome binding sequence, the DNA of the present invention and the transcription termination sequence. It is preferably a recombinant DNA composed of. The recombinant DNA may contain a gene that controls a promoter.
ここで使用されるプロモーターは、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。プロモーターとしては、例えば以下のものが挙げられる：
（１） ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）およびｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）等の大腸菌に由来するプロモーター、
（２） ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターおよびＴ７プロモーター等の、ファージに由来するプロモーター、
（３） ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターとを融合したｔａｃプロモーター、および、ｌａｃプロモーターとＴ７プロモーターとを融合したｌａｃＴ７プロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーター、
（４） Ｋｍプロモーター（例えばｐＨＳＧ２９８のカナマイシン耐性遺伝子のプロモーター）、
（５） ｂｅｎプロモーター等の、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する安息香酸代謝系のプロモーター、
（６） ｖａｎプロモーター等の、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来するバニリン酸代謝系のプロモーター、
（７） ｔｉｐＡプロモーター等の、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に由来するチオストレプトン誘導型のプロモーター、ならびに、
（８） ｎａｇプロモーター等の、ポラロモナス・ナフタレニボランスに由来するナフタレン代謝系のプロモーター。
上記プロモーターは、単独でまたは２種以上組み合わせて使用可能である。
The promoter used here may be any promoter as long as it can be expressed in a host cell. Promoters include, for example:
(1) Promoters derived from Escherichia coli such as trp promoter (Ptrp) and lac promoter (Plac),
(2) Phage-derived promoters such as PL promoter, PR promoter and T7 promoter,
(3) Artificially designed and modified promoters such as a tac promoter in which a trp promoter and a lac promoter are fused, and a lacT7 promoter in which a lac promoter and a T7 promoter are fused.
(4) Km promoter (for example, promoter of kanamycin resistance gene of pHSG298),
(5) Promoters of the benzoic acid metabolism system derived from Corynebacterium glutamicum, such as the ben promoter,
(6) A promoter of a vanillic acid metabolism system derived from Corynebacterium glutamicum, such as a van promoter,
(7) Thiostrepton-induced promoters derived from the genus Streptomyces, such as the tipA promoter, and
(8) A promoter of a naphthalene metabolism system derived from polaromonas naphthalene borane, such as a nag promoter.
The promoters can be used alone or in combination of two or more.
上記プロモーターは、「本来プロトカテク酸６位酸化酵素を発現する能力を有する微生物」においても単独でまたは２種以上組み合わせて使用可能であり、なかでも、（４）～（８）のプロモーターは、コリネ型細菌等の発現強化に、単独でまたは２種以上を組み合わせて、更には、（１）～（３）のプロモーターと組み合わせて、好ましく使用できる。 The above promoters can be used alone or in combination of two or more in "microorganisms originally capable of expressing protocatechuic acid 6-position oxidase", and among them, the promoters (4) to (8) are corine. It can be preferably used alone or in combination of two or more for enhancing the expression of type bacteria and the like, and further in combination with the promoters (1) to (3).
本発明の別の側面は、上記組換え微生物を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。本製造方法において、本発明の組換え微生物によって発現するプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質が、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換する。 Another aspect of the present invention relates to a method for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using the above-mentioned recombinant microorganism. In the present production method, the protocatechuic acid 6-position oxidase protein expressed by the recombinant microorganism of the present invention converts protocatechuic acid into 2,4,5-trihydroxybenzoic acid.
上記のようにして得られる本発明の組換え微生物を、好ましくは１ｍＭ～１Ｍのプロトカテク酸を含む培地で培養することで、培養物中に２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を製造することができる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。ここで、本発明の組換え微生物が生成するプロトカテク酸には、生成した後も当該微生物の菌体内に保持されるものと、生成した後、菌体から培地へと放出されるものとが含まれる。本発明の組換え微生物によって生成されたプロトカテク酸を「本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸」とも称する。前記菌体内に保持されるプロトカテク酸は、その一部または全部が、菌体内でプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質によって２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換されることもある。本明細書で使用される「プロトカテク酸を含む培地」の語に関し、「プロトカテク酸」には、本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸（すなわち、本発明の組換え微生物によって生成されて菌体内に保持されるプロトカテク酸、および、本発明の組換え微生物によって生成されて菌体から培地へと放出されるプロトカテク酸）を含まないものとし、外部から培地に添加されたプロトカテク酸のみを意味するものとする。微生物の培養に用いられる「１ｍＭ～１Ｍのプロトカテク酸を含む培地」は、対象となる微生物に適した培地に、終濃度が１ｍＭ～１Ｍとなる量のプロトカテク酸を添加することで調製することができる。 To produce 2,4,5-trihydroxybenzoic acid in a culture by culturing the recombinant microorganism of the present invention obtained as described above in a medium containing preferably 1 mM to 1 M of protocatechuic acid. Can be done. The method for culturing the microorganism of the present invention in the medium can be carried out according to the usual method used for culturing the microorganism. Here, the protocatechuic acid produced by the recombinant microorganism of the present invention includes those that are retained in the cells of the microorganism even after being produced and those that are released from the cells to the medium after being produced. Is done. The protocatechuic acid produced by the recombinant microorganism of the present invention is also referred to as "protocatechuic acid derived from the recombinant microorganism of the present invention". Part or all of the protocatechuic acid retained in the cells may be converted to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid in the cells by the protocatechuic acid 6-position oxidase protein. Regarding the term "medium containing protocatechuic acid" as used herein, "protocatechuic acid" refers to protocatechuic acid derived from the recombinant microorganism of the present invention (that is, produced by the recombinant microorganism of the present invention in cells. It is free from protocatechuic acid retained in and protocatechuic acid produced by the recombinant microorganism of the present invention and released from the cells to the medium), and means only protocatechuic acid added to the medium from the outside. It shall be. The "medium containing 1 mM to 1 M of protocatechuic acid" used for culturing microorganisms can be prepared by adding an amount of protocatechuic acid having a final concentration of 1 mM to 1 M to a medium suitable for the target microorganism. can.
本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生産するための原料であるプロトカテク酸としては、外部から培地に添加したプロトカテク酸、および／または、上記成分を含む培地で本発明にかかる組換え微生物によって生成されたプロトカテク酸、すなわち、本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸、を利用することができる。 The microorganism of the present invention can be cultured in a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, various vitamins and the like, and the carbon source includes, for example, saccharides such as glucose, sucrose and fructose, ethanol, and the like. Alcohols such as methanol, organic acids such as citric acid, malic acid and succinic acid, waste sugar honey and the like are used. As the nitrogen source, for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea and the like are used alone or in combination. Further, as the inorganic salt, for example, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and the like are used. In addition, nutrients such as peptone, meat extract, yeast extract, corn stay liquor, casamino acid, biotin and other various vitamins can be added to the medium. As protocatechuic acid, which is a raw material for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid, protocatechuic acid added to the medium from the outside and / or a medium containing the above-mentioned components by the recombinant microorganism according to the present invention can be used. The produced protocatechuic acid, that is, the protocatechuic acid derived from the recombinant microorganism of the present invention, can be utilized.
培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明の微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。 Culturing is usually carried out under aerobic conditions such as aeration and stirring and shaking. The culture temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which the microorganism of the present invention can grow, and the pH during culture is not particularly limited as long as it is a pH at which the microorganism of the present invention can grow. The pH adjustment during culturing can be performed by adding an acid or an alkali.
本発明にかかる２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法は、その製造方法のいずれかの段階で、本発明の組換え微生物を用いるものである。上記のとおり、本発明の組換え微生物を、プロトカテク酸を含む培地で培養することで培養物中に２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生成させることができるが、この方法に代えて、またはこの方法に加えて、本発明の組換微生物を培養した後、プロトカテク酸を含む水性媒体中に、当該微生物の培養物もしくは当該培養物の処理物を加えることにより、当該媒体中に２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を生成させることもできる。すなわち、プロトカテク酸から２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸への変換は水性媒体中で行われる。本明細書において「プロトカテク酸を含む水性媒体」の語に関し、「プロトカテク酸」は、本発明の組換え微生物由来のプロトカテク酸を含まず、外部から水性媒体に添加されたプロトカテク酸を意味するものとする。 The method for producing 2,4,5-trihydroxybenzoic acid according to the present invention uses the recombinant microorganism of the present invention at any stage of the production method. As described above, by culturing the recombinant microorganism of the present invention in a medium containing protocatechuic acid, 2,4,5-trihydroxybenzoic acid can be produced in the culture, but instead of this method, Alternatively, in addition to this method, after culturing the recombinant microorganism of the present invention, a culture of the microorganism or a processed product of the culture is added to an aqueous medium containing protocatechuic acid, whereby 2, 4,5-Trihydroxybenzoic acid can also be produced. That is, the conversion of protocatechuic acid to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid takes place in an aqueous medium. As used herein, with respect to the term "aqueous medium containing protocatechuic acid," "protocatechuic acid" means protocatechuic acid that does not contain protocatechuic acid derived from the recombinant microorganism of the present invention and is externally added to the aqueous medium. And.
当該培養物の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えばｐＨ６～１０の０．０２～０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液等で洗浄された菌体を使用することができる。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾、界面活性剤による細胞壁の溶解等の手段で破砕して得られる破砕物、当該破砕物を水等で抽出して得られるプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を含む抽出物、当該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られるプロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質の部分精製成分等を担体に固定化したものも、本発明の２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造に使用することができる。プロトカテク酸６位酸化酵素蛋白質を担体に固定化したものは、例えば、バイオリアクター内での反応に用いることができる。 As a processed product of the culture, a product in which the microorganism of the present invention is immobilized on a carrier may be used. In that case, cells that have been recovered from the culture or washed with an appropriate buffer solution, for example, a phosphate buffer solution having a pH of 6 to 10 and having a pH of about 0.02 to 0.2 M can be used. .. In addition, a crushed product obtained by crushing the bacterial cells recovered from the culture by means such as ultrasonic wave, squeezing, and dissolution of the cell wall with a surfactant, and protocatechuic acid obtained by extracting the crushed product with water or the like. Extracts containing the 6-position oxidase protein, and protocatechuic acid partially purified components of the 6-position oxidase protein obtained by further performing treatments such as sulfur salt analysis and column chromatography are immobilized on a carrier. , 2,4,5-Trihydroxybenzoic acid of the present invention can be used for the production. Protocatechuic acid 6-position oxidase protein immobilized on a carrier can be used, for example, for a reaction in a bioreactor.
これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。 Immobilization of these cells, disrupted cells, extracts or purified enzymes is carried out according to a commonly used method known per se, and the cells and the like are immobilized on a suitable carrier such as acrylamide monomer, alginic acid, or carrageenan. It can be done by the method of making it.
反応に用いる水性媒体は、プロトカテク酸を含む水溶液または適当な緩衝液、例えばｐＨ３～１０の０．０２～０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液とすることができる。この水性媒体には、さらに菌体の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を０．０５～２％（ｗ/ｖ）添加することもできる。反応に用いる水性媒体は、対象となる微生物に応じて選択された培地であってもよい。水性媒体が培地の場合、水性媒体は、液体培地、リン酸緩衝液、蛋白質安定剤などを含んでもよい。 The aqueous medium used for the reaction can be an aqueous solution containing protocatechuic acid or an appropriate buffer solution, for example, a phosphate buffer solution having a pH of 3 to 10 and having a pH of about 0.02 to 0.2 M. Toluene, xylene, nonionic surfactant and the like can be added to this aqueous medium in an amount of 0.05 to 2% (w / v) when it is necessary to further increase the substance permeability of the cell membrane of the cells. .. The aqueous medium used for the reaction may be a medium selected according to the target microorganism. When the aqueous medium is a medium, the aqueous medium may include a liquid medium, a phosphate buffer, a protein stabilizer, and the like.
反応原料となるプロトカテク酸の水性媒体中の濃度は、０．１ｍＭ～１Ｍ程度が適当である。上記の水性媒体における酵素反応温度およびｐＨは特に限定されないが、通常１０～６０℃、好ましくは１５～５０℃が適当であり、反応液中のｐＨは５～１０、好ましくは６～９付近とすることができる。また、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発明で使用する酵素は、菌体抽出液をそのまま又はそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水又は緩衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得られた酵素をプロトカテク酸および水の存在下、反応させるが、反応液中のプロトカテク酸の濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くすることが有利である。反応は静置、攪拌および振盪からなる群より選択されるいずれか１以上の方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、プロトカテク酸を含む溶液を流す方法を、先述した方法に加えて、又は、単独で行ってもよい。反応温度は、通常１０～６０℃、好ましくは１５～５０℃であり、反応液中のｐＨは５～１０、好ましくは６～９付近である。 The appropriate concentration of protocatechuic acid as a reaction raw material in the aqueous medium is about 0.1 mM to 1 M. The enzyme reaction temperature and pH in the above aqueous medium are not particularly limited, but are usually 10 to 60 ° C, preferably 15 to 50 ° C, and the pH in the reaction solution is 5 to 10, preferably around 6 to 9. can do. Further, the pH can be adjusted by adding an acid or an alkali. The enzyme used in the present invention can be obtained by collecting the bacterial cell extract as it is or by centrifugation, filtration or the like, and suspending it in water or a buffer solution. The enzyme thus obtained is reacted in the presence of protocatechuic acid and water, and it is advantageous that the concentration of protocatechuic acid in the reaction solution is as high as possible without inhibiting the activity of the enzyme. The reaction may be carried out by any one or more methods selected from the group consisting of standing, stirring and shaking. Further, the method of immobilizing the enzyme on an appropriate support, filling the column, and flowing a solution containing protocatechuic acid may be performed in addition to the above-mentioned method or alone. The reaction temperature is usually 10 to 60 ° C., preferably 15 to 50 ° C., and the pH in the reaction solution is 5 to 10, preferably around 6 to 9.
なお、上記水性媒体に、反応時に抗酸化剤を添加すると、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の生成収率が一層向上する場合がある。抗酸化剤としては、アスコルビン酸等が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常は０．１～５０ｍＭ、好ましくは０．２～１０ｍＭである。 If an antioxidant is added to the aqueous medium during the reaction, the yield of 2,4,5-trihydroxybenzoic acid may be further improved. Examples of the antioxidant include ascorbic acid and the like. The concentration of addition varies depending on the type of oxidizing agent, but it is desirable to add it at a concentration that does not inhibit the production of 2,4,5-trihydroxybenzoic acid, usually 0.1 to 50 mM, preferably 0.2 to 10 mM. be.
本発明のさらに別の側面は、以下の蛋白質からなる群より選択される少なくとも一つの蛋白質を用いて、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸に変換することを含む、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上または９９．９％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個、１～７個、１～５個、１～３個、１～２個もしくは１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
Yet another aspect of the invention comprises converting protocatechuic acid to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using at least one protein selected from the group consisting of the following proteins: 2,4 , 5- Regarding the method for producing trihydroxybenzoic acid:
(1) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(2) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(4) Sequence identity 80% or more, 83% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99. Has an amino acid sequence of 2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more or 99.9% or more. protein,
(5) Sequence identity 80% or more, 83% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99. Has an amino acid sequence of 2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more or 99.9% or more. protein,
(6) Sequence identity 80% or more, 83% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99. Has an amino acid sequence of 2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more or 99.9% or more. protein,
(7) For a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 1 to 10 amino acids, 1 to 7 amino acids, 1 to 5 amino acids, 1 to 3 amino acids, 1 to 2 or 1 amino acid are missing. A protein consisting of an amino acid sequence lost, substituted, inserted and / or added,
(8) 1 to 10 amino acids, 1 to 7 amino acids, 1 to 5 amino acids, 1 to 3 amino acids, 1 to 2 or 1 amino acid are missing from the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5 for a protein consisting of an amino acid sequence lost, substituted, inserted and / or added, and (9) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. A protein consisting of an amino acid sequence in which 1, 1 to 3, 1 to 2 or 1 amino acid is deleted, substituted, inserted and / or added.
本発明に係る製造方法において、プロトカテク酸から２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸への変換は、先述の水性媒体中の他、バイオリアクター中で行ってもよい。この場合には、バイオリアクター内では例えば、上記蛋白質を、容器内に収容される水性媒体もしくは固形媒体に浮遊させるか、または、担体に固定し、プロトカテク酸を２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸へ変換する。 In the production method according to the present invention, the conversion of protocatechuic acid to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid may be carried out in a bioreactor in addition to the above-mentioned aqueous medium. In this case, in the bioreactor, for example, the protein is suspended in an aqueous medium or a solid medium contained in a container, or fixed on a carrier, and protocatechuic acid is added to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid. Convert to acid.
上記のとおり、本発明は、組換え微生物を用いた、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の醗酵製造法を提案するものである。本発明の組換え微生物を用いることにより、当該微生物の醗酵によって２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸が生産されるため、効率的に目的物質を得ることができ、さらに、工業的規模で生産への応用も期待される。 As described above, the present invention proposes a method for fermenting 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using a recombinant microorganism. By using the recombinant microorganism of the present invention, 2,4,5-trihydroxybenzoic acid is produced by fermentation of the microorganism, so that the target substance can be efficiently obtained and further produced on an industrial scale. It is also expected to be applied to.
以上、本発明を実施するための形態を例示したが、上記実施形態はあくまでも例として示されるものであり、発明の範囲を限定することを意図するものではない。上記実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置換、変更を行うことができる。 Although the embodiments for carrying out the present invention have been illustrated above, the above-described embodiments are shown as examples only, and are not intended to limit the scope of the invention. The above embodiment can be implemented in various other embodiments, and various omissions, substitutions, and changes can be made without departing from the gist of the invention.
なお、本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。 In the present specification, the numerical range indicated by using "-" indicates a range including the numerical values before and after "-" as the minimum value and the maximum value, respectively. Within the numerical range described stepwise herein, the upper or lower limit of the numerical range at one stage may be optionally combined with the upper or lower limit of the numerical range at another stage.
以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the method of the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
［実施例１］
プロトカテク酸を原料とする大腸菌による２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の生産を下記のようにして行った。
[Example 1]
Production of 2,4,5-trihydroxybenzoic acid by Escherichia coli using protocatechuic acid as a raw material was carried out as follows.
（１）３－ヒドロキシ安息香酸６位酸化酵素蛋白質のデータベース検索
３－ヒドロキシ安息香酸の６位を酸化させる酵素群であるＣＤ１．１４．１２．２４の酵素群の中から、シュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素の配列とアミノ酸配列同一性が７５％未満であり、大腸菌での発現実績があり、かつ、サブユニット数の異なる蛋白質として、３種類を選定した（下記表３参照）。配列同一性は、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ；以下、ＧＢと略記する）データベースから、配列番号４に示すシュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素のアミノ酸配列を問い合わせ配列としてＢＬＡＳＴ相同性解析法を用いて算出した。それぞれの蛋白質の略号とシュードモナス・エルギノーサＴ１由来のプロトカテク酸６位酸化酵素との配列同一性（％）を表３に示した。
(1) Search database of 3-hydroxybenzoic acid 6-position oxidase protein Derived from Pseudomonas erginosa T1 from the enzyme group of CD1.14.12.24, which is an enzyme group that oxidizes the 6-position of 3-hydroxybenzoic acid. Protocatechuic acid 6-position oxidase and amino acid sequence identity of less than 75%, have been expressed in Escherichia coli, and have different numbers of subunits. Three types of proteins were selected (see Table 3 below). .. The sequence identity is derived from Pseudomonas erginosa T1 shown in SEQ ID NO: 4 from the GenBank (hereinafter abbreviated as GB) database of the National Center for Biotechnology Information (hereinafter abbreviated as NCBI). The amino acid sequence of the 6-position protocatechuic acid oxidase was used as a query sequence and calculated using the BLAST homology analysis method. Table 3 shows the sequence identity (%) between the abbreviations of each protein and the protocatechuic acid 6-position oxidase derived from Pseudomonas aeruginosa T1.
（２）ＤＮＡの配列デザインとＤＮＡの取得
表３記載の３種類の蛋白質をコードするＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法（タカラバイオ社）によりベクターｐＥＴ－１５ｂに組み込むため、当該ベクターを制限酵素ＮｄｅＩで切断した断片の末端１５塩基の配列と同一になるように、当該ＤＮＡの両末端に配列を追加してデザインした。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のアミノ酸配列は配列番号１１、ロドコッカス・ジョスティＲＨＡ１のアミノ酸配列は配列番号１２、ポラロモナス・ナフタレニボランスＣＪ２のアミノ酸配列は配列番号１３に示す通りにデザインした。上記の配列デザインを行ったＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡの状態でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社に依頼して取得した。
(2) DNA sequence design and acquisition of DNA In order to incorporate the DNA encoding the three proteins shown in Table 3 into the vector pET-15b by the In-Fusion method (Takara Bio Co., Ltd.), the vector was cleaved with the restriction enzyme NdeI. The DNA was designed by adding sequences to both ends of the DNA so that it would be the same as the sequence of the 15 bases at the end of the fragment. Specifically, the amino acid sequence of Corinebacterium glutamicum ATCC13032 is designed as shown in SEQ ID NO: 11, the amino acid sequence of Rhodococcus josty RHA1 is designed as shown in SEQ ID NO: 12, and the amino acid sequence of Polaromonas naphthalenivolance CJ2 is designed as shown in SEQ ID NO: 13. did. The DNA for which the above sequence design was performed was obtained by requesting Integrated DNA Technology Co., Ltd. in the state of double-stranded DNA.
（３）Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法によるベクタープラスミドへの挿入
ｐＥＴ－１５ｂに対して制限酵素ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理を行った後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて上記の配列デザインを行ったＤＮＡを導入し、それぞれの遺伝子を発現するプラスミドｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。
(3) Insertion into a vector plasmid by the In-Fusion method After treating pET-15b with a restriction enzyme NdeI (manufactured by New England Biolabs), an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio) was used. The DNA having the above sequence design was introduced to prepare plasmids pET-15b_Cgl, pET-15b_Rjo and pET-15b_Pna expressing the respective genes.
（４）ＤＮＡ導入ベクターの増幅・抽出
上記（３）で作製したプラスミドをそれぞれ、増幅に適する菌株であるエスケリキア・コリＤＨ５αのコンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入することにより、形質転換株ＤＨ５α＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＤＨ５α_ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＤＨ５α＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。上記形質転換株を、カルベニシリンが終濃度５０μＭになるように添加したＬＢ倍地で培養した後、プラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）で精製・抽出を行い、１００～１５０ｎｇ／μＬのｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを得た。
(4) Amplification / extraction of DNA transfer vector Transformant DH5α_pET by introducing each of the plasmids prepared in (3) above into competent cells (manufactured by Nippon Gene) of Escherichia coli DH5α, which is a strain suitable for amplification. -15b_Cgl, DH5α_pET-15b_Rjo and DH5α_pET-15b_Pna were prepared. The above transformant was cultured in LB culture medium to which carbenicillin was added to a final concentration of 50 μM, and then purified and extracted with a plasmid mini kit (manufactured by Nippon Genetics Co., Ltd.) to obtain 100 to 150 ng / μL of pET-. 15b_Cgl, pET-15b_Rjo and pET-15b_Pna were obtained.
（５）醗酵生産に用いる形質転換株の作製
上記（４）で作製したプラスミドｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａをそれぞれ、エスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセル（ニッポンジーン社製）に導入することにより、形質転換株ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａを作製した。
(5) Preparation of Transformant Strain Used for Fermentation Production Competent cells of Escherichia coli BL21 (DE3) (manufactured by Nippon Gene) using the plasmids pET-15b_Cgl, pET-15b_Rjo and pET-15b_Pna prepared in (4) above, respectively. By introducing into, transformants BL21_pET-15b_Cgl, BL21_pET-15b_Rjo and BL21_pET-15b_Pna were prepared.
（６）上記形質転換株を用いた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸の製造
上記（５）で得られた３種類の形質転換体を４ｍＬのＬＢ培地で一晩培養した。プラスミドを維持するために、カルベニシリンが終濃度５０μＭになるようにＬＢ培地に添加した。一晩培養後、４ｍＬのＴＢ培地に１／１００容量接種し、３７℃で培養し対数増殖期にＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－１－ｔｈｉｏ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度４００μＭになるように添加し、蛋白誘導を行った。ＩＰＴＧ添加と同時に終濃度１０ｍＭのプロトカテク酸を添加し、２５℃で培養した。プロトカテク酸添加後２４時間、４８時間の培養液を採取し、冷却遠心機（久保田製作所製、Ｍｏｄｅｌ ６０００）で４℃、１０分、３０００ｒｐｍで遠心分離を行い、培養上清を得た。
(6) Production of 2,4,5-Trihydroxybenzoic Acid Using the Transformant The three types of transformants obtained in (5) above were cultured overnight in 4 mL of LB medium. To maintain the plasmid, carbenicillin was added to LB medium to a final concentration of 50 μM. After culturing overnight, inoculate 1/100 volume in 4 mL of TB medium, incubate at 37 ° C., and add IPTG (isoprotein-1-thio-β-D-galactopylanoside) to a final concentration of 400 μM during the logarithmic growth phase. , Protein induction was performed. At the same time as the addition of IPTG, protocatechuic acid having a final concentration of 10 mM was added, and the cells were cultured at 25 ° C. The culture broth was collected for 24 hours and 48 hours after the addition of protocatechuic acid, and centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes at 3000 rpm in a cooling centrifuge (Made by Kubota Seisakusho, Model 6000) to obtain a culture supernatant.
上記培養上清をバイアルに移し、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）を用い、移動相にｐＨ２．５リン酸緩衝液、カラムにＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（ＣＯＳＭＯＳＩＬ社製）を用いて２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸を検出した。結果、培養時間２４時間の時点で、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａについてそれぞれ、０．６ｍＭ、０．１ｍＭおよび１．６ｍＭの２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸が観察された。 Transfer the above culture supernatant to a vial and use high performance liquid chromatography (manufactured by Shimadzu Corporation), pH 2.5 phosphate buffer as the mobile phase, and COSMOSIL 5C 18 -MS-II (manufactured by COSMOSIL) as the column. , 4,5-Trihydroxybenzoic acid was detected. As a result, at 24 hours of culture time, 0.6 mM, 0.1 mM and 1.6 mM 2,4,5-trihydroxybenzoic acid were observed for BL21_pET-15b_Cgl, BL21_pET-15b_Rjo and BL21_pET-15b_Pna, respectively. ..
また培養時間４８時間の時点で、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｃｇｌ、ＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿ＲｊｏおよびＢＬ２１＿ｐＥＴ－１５ｂ＿Ｐｎａについてそれぞれ、０．８ｍＭ、０．２ｍＭおよび１．８ｍＭの２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸が観察された。消費されたプロトカテク酸はそれぞれ、１．４ｍＭ、０．３ｍＭおよび３．４ｍＭであり、得られた２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸のモル収率はそれぞれ、６１％、５０％および５３％であった。なお、シュードモナス・エアルギノーサ由来の遺伝子を導入した大腸菌をプロトカテク酸存在下で培養しても、２，４，５－トリヒドロキシ安息香酸は確認されなかった。 At 48 hours of culture time, 0.8 mM, 0.2 mM and 1.8 mM 2,4,5-trihydroxybenzoic acid were observed for BL21_pET-15b_Cgl, BL21_pET-15b_Rjo and BL21_pET-15b_Pna, respectively. The consumed protocatechuic acid was 1.4 mM, 0.3 mM and 3.4 mM, respectively, and the molar yields of the obtained 2,4,5-trihydroxybenzoic acid were 61%, 50% and 53%, respectively. Met. Even when Escherichia coli into which a gene derived from Pseudomonas earginosa was introduced was cultured in the presence of protocatechuic acid, 2,4,5-trihydroxybenzoic acid was not confirmed.
Claims (7)
前記蛋白質が、配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、組換え微生物。 A recombinant microorganism that expresses a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid.
A recombinant microorganism in which the protein has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
当該組換え微生物には：
（ａ）配列番号１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズし、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列と８０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、プロトカテク酸の６位を酸化する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または
（ｆ）配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３で表されるポリヌクレオチド配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
が導入されている、組換え微生物。 A recombinant microorganism that expresses a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid.
For the recombinant microorganism:
(A) DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
(B) DNA having a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13.
(C) Hybridize under constriction conditions with DNA having a polynucleotide sequence complementary to the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13 and. DNA encoding a protein with enzymatic activity that oxidizes the 6th position of protocatechuic acid,
(D) Consists of a polynucleotide sequence having 80% or more sequence identity with the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13, and of protocatechuic acid. DNA encoding a protein with enzymatic activity that oxidizes the 6th position,
(E) 1 to 10 amino acids are deleted from the amino acid sequence of the protein encoded by the polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13. A DNA encoding a protein consisting of a substituted, inserted and / or added amino acid sequence, which encodes a protein having an enzymatic activity that oxidizes the 6-position of protocatechuic acid, or (f) SEQ ID NOs: 5, 6 and DNA consisting of degenerate isomers of the polynucleotide sequence represented by 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13.
Has been introduced into recombinant microorganisms.
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（５）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（６）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して配列同一性８０％以上のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（８）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（９）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。 Production of 2,4,5-trihydroxybenzoic acid comprising converting protocatechuic acid to 2,4,5-trihydroxybenzoic acid using at least one protein selected from the group consisting of the following proteins: Method:
(1) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(2) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(4) A protein having an amino acid sequence having an amino acid sequence identity of 80% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(5) A protein having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(6) A protein having an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(7) A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
(8) A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and (9) SEQ ID NO: A protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to a protein having an amino acid sequence represented by 3.
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