JP2022086783A - Promoter for filamentous fungi and use thereof - Google Patents
Promoter for filamentous fungi and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022086783A JP2022086783A JP2020198980A JP2020198980A JP2022086783A JP 2022086783 A JP2022086783 A JP 2022086783A JP 2020198980 A JP2020198980 A JP 2020198980A JP 2020198980 A JP2020198980 A JP 2020198980A JP 2022086783 A JP2022086783 A JP 2022086783A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- sequence
- polynucleotide
- seq
- filamentous fungi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 88
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 101150073906 gpdA gene Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 101150095733 gpsA gene Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 66
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 29
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 description 38
- 101150067366 adh gene Proteins 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 19
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 11
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 10
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 240000001009 Aspergillus oryzae RIB40 Species 0.000 description 4
- 235000013023 Aspergillus oryzae RIB40 Nutrition 0.000 description 4
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 4
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- 241001540751 Talaromyces ruber Species 0.000 description 3
- JAWMENYCRQKKJY-UHFFFAOYSA-N [3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-ylmethyl)-1-oxa-2,8-diazaspiro[4.5]dec-2-en-8-yl]-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]methanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CC1=NOC2(C1)CCN(CC2)C(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F JAWMENYCRQKKJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 3
- -1 phosphoripase Proteins 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101710098554 Lipase B Proteins 0.000 description 2
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 2
- 241000228347 Monascus <ascomycete fungus> Species 0.000 description 2
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 2
- DVDUMIQZEUTAGK-UHFFFAOYSA-N p-nitrophenyl butyrate Chemical compound CCCC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 DVDUMIQZEUTAGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 101100425074 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) thiA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228251 Aspergillus phoenicis Species 0.000 description 1
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 241001112078 Aspergillus usamii Species 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150015836 ENO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 244000113306 Monascus purpureus Species 0.000 description 1
- 235000002322 Monascus purpureus Nutrition 0.000 description 1
- 241001558145 Mucor sp. Species 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000228147 Penicillium camemberti Species 0.000 description 1
- 235000002245 Penicillium camembertii Nutrition 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 241000095431 Penicillium multicolor Species 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 101150033625 enoA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940057059 monascus purpureus Drugs 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 101150060364 ptrA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
本発明は糸状菌用プロモーターおよびその利用に関する。 The present invention relates to a promoter for filamentous fungi and its use.
従来遺伝子組換えによるタンパク質生産の宿主として、糸状菌を採用する技術が知られている。この技術においては、タンパク質を高発現させるために、種々の有用なプロモーターが探求されている。例えば、特許文献１には、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）のプロモーターが開示されている。また、特許文献２には、アスペルギルス・オリゼ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）のプロモーターが開示されている。
Conventionally, a technique of adopting filamentous fungi as a host for protein production by genetic recombination is known. In this technique, various useful promoters are sought for high expression of proteins. For example,
しかし、上記のような従来技術には、タンパク質の発現効率をさらに高める余地が残されていた。 However, in the above-mentioned prior art, there is still room for further increasing the expression efficiency of the protein.
そこで、本発明の一態様は、従来技術よりもタンパク質の発現効率が高い糸状菌用プロモーターを提供することを目的とする。 Therefore, one aspect of the present invention is to provide a promoter for filamentous fungi, which has higher protein expression efficiency than the prior art.
本発明者らは鋭意検討した結果、ｇｐｄＡプロモーター由来配列中の特定の配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列中の特定の配列をこの順番で配置したプロモーターが、従来使用されている強力なプロモーターよりも遥かに強力なプロモーター活性を有していることを見出した。すなわち、本発明は以下の構成を含む。
＜１＞
糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する糸状菌用プロモーターであって、
ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順序で連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
上記ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかであり、
上記ａｄｈプロモーター由来配列は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかであることを特徴とする、糸状菌用プロモーター：
（Ａ１）配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ａ２）上記（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および下記（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ３）上記（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ４）上記（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ１）配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ｂ２）上記（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ３）上記（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ４）上記（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
＜２＞
上記エンハンサー配列が、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである、＜１＞に記載の糸状菌用プロモーター。
＜３＞
＜１＞または＜２＞に記載の糸状菌用プロモーターを含む、ベクター。
＜４＞
＜３＞に記載のベクターに含まれる糸状菌用プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されたベクターで、糸状菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法。
＜５＞
＜４＞に記載の形質転換方法により取得された形質転換体。
＜６＞
＜５＞に記載の形質転換体を培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
As a result of diligent studies, the present inventors have found that a promoter in which a specific sequence in the gpdA promoter-derived sequence, an enhancer sequence, and a specific sequence in the adh promoter-derived sequence are arranged in this order is a strong promoter conventionally used. It was found to have much stronger promoter activity than. That is, the present invention includes the following configurations.
<1>
A promoter for filamentous fungi having promoter activity in the filamentous fungus cell.
It contains a polynucleotide consisting of a gpdA promoter-derived sequence, an enhancer sequence, and an adh promoter-derived sequence linked in this order.
The above-mentioned gpdA promoter-derived sequence is one of the following (A1) to (A4).
The sequence derived from the adh promoter is one of the following (B1) to (B4), and the promoter for filamentous fungi:
(A1) Of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, a polynucleotide containing at least
(A2) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (A1) above, and the polynucleotide, enhancer sequence, and polynucleotide of the following (B1). A polynucleotide having promoter activity in filamentous fungal cells when linked in this order;
(A3) A polynucleotide in which one or more bases are substituted, deleted or added in the base sequence shown in (A1) above, and has promoter activity under the same conditions as in (A2) above;
(A4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (A1) above, and having promoter activity under the same conditions as in (A2) above;
(B1) Of the base sequences shown in SEQ ID NO: 2, a polynucleotide containing at least positions 831 to 907;
(B2) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (B1) above, and the polynucleotide, enhancer sequence, and said polynucleotide of (A1) above. A polynucleotide having promoter activity in filamentous fungal cells when linked in this order;
(B3) Of the base sequences shown in (B1) above, a polynucleotide in which one or more bases are substituted, deleted or added, and has promoter activity under the same conditions as in (B2) above. ;
(B4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (B1) above, and having promoter activity under the same conditions as in (B2) above.
<2>
The promoter for filamentous fungi according to <1>, wherein the enhancer sequence is a polynucleotide containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
<3>
A vector comprising the promoter for filamentous fungi according to <1> or <2>.
<4>
A transformation method comprising transforming a filamentous fungus with a vector in which a gene encoding a target protein is linked downstream of a promoter for filamentous fungi contained in the vector according to <3>.
<5>
A transformant obtained by the transformation method according to <4>.
<6>
A method for producing a protein, which comprises the step of culturing the transformant according to <5>.
本発明の一態様によれば、従来技術よりもタンパク質の発現効率が高い糸状菌用プロモーターが提供される。 According to one aspect of the present invention, there is provided a promoter for filamentous fungi having a higher protein expression efficiency than the prior art.
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明は以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例も、本発明の技術的範囲に含まれる。本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。 An embodiment of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the configurations described below, and various modifications can be made within the scope of the claims. The technical scope of the present invention also includes embodiments and examples obtained by appropriately combining the technical means disclosed in the different embodiments and examples. All academic and patent documents described herein are incorporated herein by reference. Unless otherwise specified in the present specification, "AB" representing a numerical range is intended to be "A or more and B or less".
本明細書では、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合に基づいて説明する。なお、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合には、以下の説明において「Ｔ（チミン）」を「Ｕ（ウラシル）」に読み替えればよい。 This specification will be described based on the case where the polynucleotide is DNA. When the polynucleotide is RNA, "T (thymine)" may be read as "U (uracil)" in the following description.
本明細書では、注目するＤＮＡ鎖の５’末端側を「上流」、３’末端側を「下流」と表現している場合がある。例えば、「配列Ａの上流に」とは、「配列Ａの５’末端側に」を意味する。「配列Ａの下流に」とは、「配列Ａの３’末端側に」を意味する。「上流から下流に」とは、「５’末端側から３’末端側に」を意味する。 In the present specification, the 5'end side of the DNA strand of interest may be referred to as "upstream" and the 3'end side may be referred to as "downstream". For example, "upstream of sequence A" means "on the 5'end side of sequence A". "Downstream of sequence A" means "on the 3'end side of sequence A". "From upstream to downstream" means "from the 5'end side to the 3'end side".
本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれる。ＲＮＡの形態であるポリヌクレオチドの例としては、ｍＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡの形態であるポリヌクレオチドの例としては、種々のＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられる。ＲＮＡおよびＤＮＡは、任意の構造を取りうる（二本鎖または一本鎖など）。 As used herein, "polynucleotide" includes RNA and DNA. Examples of polynucleotides in the form of RNA include mRNA. Examples of polynucleotides in the form of DNA include various DNA fragments, cDNAs, genomic DNAs. RNA and DNA can take any structure (such as double or single strand).
〔１．糸状菌用プロモーター〕
図１は、本発明の一態様に係る糸状菌用プロモーター１０を含むポリヌクレオチドの構造を模式的に示した図である。糸状菌用プロモーター１０は、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１、エンハンサー配列５、およびａｄｈプロモーター由来配列２を有している。これらの配列は、上流から下流に、上記の順番で配置されている。
[1. Promoter for filamentous fungi]
FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a polynucleotide containing the
糸状菌用プロモーター１０は、目的タンパク質をコードする配列７にコードされているタンパク質の発現を、従来のプロモーターよりも遥かに高める。目的タンパク質をコードする配列７は、糸状菌用プロモーター１０の下流に配置されている。なお、図１に表されているポリヌクレオチドは、細胞内に存在していてもよいし（形質転換体など）、細胞外に存在していてもよい（ベクターなど）。図１のポリヌクレオチドがベクターを表している場合、当該ベクターを糸状菌に導入して形質転換させることにより、形質転換体が得られる。
The promoter for
ｇｐｄＡプロモーター由来配列１は、配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含んでいる配列（またはそのバリアント）である。配列番号１は、ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンよりも１つだけ上流の塩基を「第－１位」として、第－１０００位～第－１位に該当する塩基配列である。それゆえ、配列番号１に基づく塩基の位置から１００１を引くと、ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンを基準とした塩基の位置に換算される。したがって、「配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位の塩基」とは、「ｇｐｄＡ遺伝子の翻訳開始コドンを基準として、第－１０００位～第－４０２位の塩基」に該当する。
The gpdA promoter-derived
ａｄｈプロモーター由来配列２は、配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含んでいる配列（またはそのバリアント）である。配列番号２は、ａｄｈ遺伝子の翻訳開始コドンよりも１つだけ上流の塩基を「第－１位」として、第－１０００位～第－１位に該当する塩基配列である。それゆえ、配列番号２に基づく塩基の位置から１００１を引くと、ａｄｈ遺伝子の翻訳開始コドンを基準とした塩基の位置に換算される。したがって、「配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位の塩基」とは、「ａｄｈの翻訳開始コドンを基準として、第－１７０位～第－９４位の塩基」に該当する。
The adh promoter-derived
なお、本明細書では特記しない限り、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１に関連する塩基の位置は、配列番号１に基づく塩基の位置を記載する。また、ａｄｈプロモーター由来配列２に関連する塩基の位置は、配列番号２に基づく塩基の位置を記載する。
Unless otherwise specified in the present specification, the position of the base related to the gpdA promoter-derived
［１．１．ｇｐｄＡプロモーター由来配列］
ｇｐｄＡプロモーター由来配列１は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ａ１）
配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ａ２）
（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ３）
（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ａ４）
（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
[1.1. gpdA promoter-derived sequence]
The gpdA promoter-derived
(A1)
A polynucleotide containing at
(A2)
A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (A1), and the polynucleotide, enhancer sequence, and polynucleotide (B1) are linked in this order. In such cases, a polynucleotide having promoter activity in filamentous fungal cells.
(A3)
A polynucleotide in which one or more bases are substituted, deleted or added in the base sequence shown in (A1), and has promoter activity under the same conditions as in (A2).
(A4)
A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (A1) and having promoter activity under the same conditions as in (A2) above.
上記のポリヌクレオチドにおいて、（Ａ２）～（Ａ４）は、（Ａ１）のバリアントに該当する。以下、（Ａ１）～（Ａ４）で使用されている表現について、個別に説明する。 In the above polynucleotide, (A2) to (A4) correspond to the variant of (A1). Hereinafter, the expressions used in (A1) to (A4) will be described individually.
「配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位を少なくとも含む」
ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、配列番号１に示される塩基配列のうち第１位～第５９９位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ａ１）の長さは、６５０ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ａ１）の塩基配列は、配列番号１の第１位～第５９９位の塩基配列を含み、かつ、配列番号１の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ａ１）の終点は、配列番号１の、第５９９位～第６２５位の範囲、第５９９位～第６５０位の範囲、第５９９位～第７００位の範囲、第５９９位～第８００位の範囲、第５９９位～第９００位の範囲、または、第５９９位～第１０００位の範囲に存在しうる。
"Contains at least the 1st to 599th positions of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1"
The entire sequence of the polynucleotide (A1) is not particularly limited as long as it contains at least the 1st to 599th positions of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the polynucleotide (A1) contains only the 1st to 599th positions of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the polynucleotide (A1) comprises an additional base sequence. In this case, the length of the polynucleotide (A1) can be 650 bp or less, 700 bp or less, 800 bp or less, 900 bp or less, or 1000 bp or less. In one embodiment, the nucleotide sequence of the polynucleotide (A1) is a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence at
ベクターを構築する上での利便性を考慮すると、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１（ポリヌクレオチド（Ａ１）～（Ａ４））の全長は、８００ｂｐ以下または９００ｂｐ以下が好ましい。 Considering the convenience in constructing the vector, the total length of the gpdA promoter-derived sequence 1 (polynucleotides (A1) to (A4)) is preferably 800 bp or less or 900 bp or less.
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、６×ＳＳＣの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、５０～６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣの塩濃度の溶液中で洗浄した後に、ハイブリダイズする条件を言う。ここで、１×ＳＳＣの組成は、塩化ナトリウム：１５０ｍＭ、クエン酸ナトリウム：１５ｍＭである。
"Hybridize under stringent conditions"
In the present specification, "hybridizing under stringent conditions" means that hybridization is performed at 50 to 60 ° C. for 16 hours in a hybridization solution having a salt concentration of 6 × SSC, and a salt of 0.1 × SSC is used. The condition for hybridization after washing in a solution of concentration. Here, the composition of 1 × SSC is sodium chloride: 150 mM and sodium citrate: 15 mM.
「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」
本明細書において、「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」とは、糸状菌細胞内における特定のタンパク質の発現量を、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量よりも高めることを意味する。例えば、糸状菌用プロモーター１０によるタンパク質の発現量は、ｅｎｏＡ１４２プロモーターによる当該タンパク質の発現量の、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２．０倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上または２．５倍以上でありうる。タンパク質の発現量は、タンパク質の種類に応じた適当な公知の手段により、測定できる。なお、ｅｎｏＡ１４２プロモーターに関しては、［Biosci. Biotechnol. Biochem., 69(1),206-208, 2005］を参照（当該文献中で、ｅｎｏＡ１４２プロモーターは、「P-enoA142f」と表記されている）。
"Has promoter activity in filamentous fungal cells"
As used herein, "having promoter activity in filamentous fungal cells" means that the expression level of a specific protein in filamentous fungal cells is higher than the expression level of the protein by the enoA142 promoter. For example, the expression level of the protein by the promoter for
（Ａ３）および（Ａ４）における、「（Ａ２）と同条件」とは、「（Ａ３）または（Ａ４）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」との条件である。 In (A3) and (A4), "the same conditions as (A2)" means "when the polynucleotide (A3) or (A4), the enhancer sequence, and the polynucleotide (B1) are linked in this order. In the above, it has a promoter activity in filamentous fungal cells. "
「複数個の塩基（Ａ３）」
ポリヌクレオチド（Ａ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、６０個、５５個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
"Multiple bases (A3)"
With respect to the polynucleotide (A3), the "plurality of bases" are, for example, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 18 With 17, 16, 15, 14, 13, 13, 12, 11, 10, 9, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 bases be.
「配列同一性」
本明細書において、「配列同一性」とは、同一の塩基数の割合を意味する。配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
"Array identity"
As used herein, "sequence identity" means the proportion of the same number of bases. The sequence identity may be 91% or higher, 92% or higher, 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, or 99% or higher.
塩基配列の配列同一性は、例えば、BLASTNを利用して決定することができる（Altschul SF (1990) "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, Vol.215 (Issue 3), pp.403-410）。BLASTNによって塩基配列を解析する際のパラメーターは、例えば、score＝100, wordlength＝12を採用できる。これらの解析方法の具体的な手法は周知である。比較対象となる塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失を許容してもよい。 The sequence identity of the base sequence can be determined using, for example, BLASTN (Altschul SF (1990) "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, Vol.215 (Issue 3), pp.403). -410). For example, score = 100 and wordlength = 12 can be adopted as the parameters when analyzing the base sequence by BLASTN. Specific methods of these analysis methods are well known. Additions or deletions may be allowed in order to optimally align the base sequence to be compared.
［１．２．ａｄｈプロモーター由来配列］
ａｄｈプロモーター由来配列２は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかに示されるポリヌクレオチドである。
（Ｂ１）
配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド。
（Ｂ２）
（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ３）
（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
（Ｂ４）
（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
[1.2. sequence derived from adh promoter]
The adh promoter-derived
(B1)
A polynucleotide containing at least positions 831 to 907 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B2)
It is a polynucleotide that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown in (B1) under stringent conditions, and the polynucleotide (A1), the enhancer sequence, and the polynucleotide are linked in this order. In such cases, a polynucleotide having promoter activity in filamentous fungal cells.
(B3)
A polynucleotide in which one or more of the base sequences shown in (B1) are substituted, deleted or added, and has promoter activity under the same conditions as in (B2).
(B4)
A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (B1) and having a promoter activity under the same conditions as in (B2).
上記のポリヌクレオチドにおいて、（Ｂ２）～（Ｂ４）は、（Ｂ１）のバリアントに該当する。以下、（Ｂ１）～（Ｂ４）で使用されている表現について、個別に説明する。 In the above polynucleotide, (B2) to (B4) correspond to the variant of (B1). Hereinafter, the expressions used in (B1) to (B4) will be described individually.
「配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位を少なくとも含む」
ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位を少なくとも含んでいれば、全体の配列は特に限定されない。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、配列番号２に示される塩基配列のうち第８３１位～第９０７位のみを含む。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）は、さらなる塩基配列を含む。この場合、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の長さは、１００ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以下でありうる。一実施形態において、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の塩基配列は、配列番号２の第８３１位～第９０７位の塩基配列を含み、かつ、配列番号２の一部である塩基配列である。このとき、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の始点は、配列番号２の、第１位～第８３１位、第１０１位～第８３１位、第２０１位～第８３１位、第３０１位～第８３１位、第４０１位～第８３１位、第５０１位～第８３１位、第６０１位～第８３１位、第７０１位～第８３１位、第７８１位～第８３１位、または、第８０１位～第８３１位の範囲に存在しうる。また、ポリヌクレオチド（Ｂ１）の終点は、配列番号２の、第９０７位～第９２０位、第９０７位～第９４０位、第９０７位～第９６０位、第９０７位～第９８０位、または、第９０７位～第１０００位の範囲に存在しうる。
"The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 includes at least positions 831 to 907".
As long as the polynucleotide (B1) contains at least positions 831 to 907 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, the entire sequence is not particularly limited. In one embodiment, the polynucleotide (B1) contains only positions 831 to 907 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the polynucleotide (B1) comprises an additional base sequence. In this case, the length of the polynucleotide (B1) can be 100 bp or less, 150 bp or less, 200 bp or less, 300 bp or less, 400 bp or less, 500 bp or less, 600 bp or less, 700 bp or less, 800 bp or less, 900 bp or less or 1000 bp or less. In one embodiment, the nucleotide sequence of the polynucleotide (B1) is a nucleotide sequence containing the nucleotide sequence at positions 831 to 907 of SEQ ID NO: 2 and which is a part of SEQ ID NO: 2. At this time, the starting points of the polynucleotide (B1) are the 1st to 831st positions, the 101st to 831st positions, the 201st to 831st positions, the 301st to 831st positions, and the 1st position of SEQ ID NO: 2. The range of 401st to 831st, 501st to 831st, 601st to 831st, 701st to 831st, 781th to 831st, or 801st to 831st. Can exist in. Further, the end point of the polynucleotide (B1) is the 907th to 920th position, the 907th to 940th position, the 907th to 960th position, the 907th to 980th position, or the 907th to 980th positions of SEQ ID NO: 2. It may exist in the range of 907th to 1000th.
ベクターを構築する上での利便性を考慮すると、ａｄｈプロモーター由来配列２（ポリヌクレオチド（Ｂ１）～（Ｂ４））の全長は、５００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下または７００ｂｐ以下が好ましい。 Considering the convenience in constructing the vector, the total length of the adh promoter-derived sequences 2 (polynucleotides (B1) to (B4)) is preferably 500 bp or less, 600 bp or less, or 700 bp or less.
「複数個の塩基（Ｂ３）」
ポリヌクレオチド（Ｂ３）に関して、「複数の塩基」とは、例えば、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個の塩基である。
"Multiple bases (B3)"
With respect to the polynucleotide (B3), the "plurality of bases" is, for example, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 bases.
「（Ｂ２）と同条件」
（Ｂ３）および（Ｂ４）における、「（Ｂ２）と同条件」とは、「（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および（Ｂ３）または（Ｂ４）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」との条件である。
"Same conditions as (B2)"
In (B3) and (B4), "the same conditions as (B2)" means "when the polynucleotide of (A1), the enhancer sequence, and the polynucleotide of (B3) or (B4) are linked in this order". In the above, it has a promoter activity in filamentous fungal cells. "
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」、「糸状菌細胞内でプロモーター活性を有する」および「配列同一性」に関する説明は、［１．１．］節の説明が援用される。 The description of "hybridizing under stringent conditions", "having promoter activity in filamentous fungal cells" and "sequence identity" is described in [1.1. ] The explanation in the section is used.
［１．３．エンハンサー配列］
本明細書において「エンハンサー配列」とは、タンパク質の発現を正に調節する塩基配列を意味する。エンハンサー配列５をｇｐｄＡプロモーター由来配列１とａｄｈプロモーター由来配列２との間に配置することにより、目的タンパク質をコードする配列７の転写活性が上昇し、結果として目的タンパク質が高発現するようになる。
[1.3. Enhancer array]
As used herein, the term "enhancer sequence" means a base sequence that positively regulates protein expression. By arranging the
エンハンサー配列５の具体的な配列は、特に限定されない。エンハンサー配列５の例としては、［化学と生物(2019) Vol.57, No.9, pp.532-540］に記載の配列が挙げられる。より具体的には、ＣＧＧＮ8ＣＧＧ、ＣＣＧＮ2ＣＣＮ6ＧＧ、ＣＧＧＮ8ＣＣＧ、ＣＧＧＮ11ＣＣＧ、ＣＧＧＮＴＡＡＷ、ＴＴＡＧＳＣＴＡＡ、ＧＧＣＴＡＲ、ＧＧＣＷＷＷ、ＧＧＮＴＡＡＡ、ＣＧＧＤＴＡＡＷが挙げられる。
The specific sequence of the
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号３に示される塩基配列（５’－ＣＧＧＮＮＡＴＴＴＡ－３’；Ｎは任意の塩基を表す）を含む。一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号３に示される塩基配列からなる。一実施形態において、配列番号３中の「ＮＮ」は、「ＧＣ」である。
In one embodiment, the
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号４に示されている塩基配列（５’－ＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＴ－３’）を含む。一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号４に示される塩基配列からなる。
In one embodiment, the
一実施形態において、エンハンサー配列５は、上流から順に、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列とが配置されてなる塩基配列である。一実施形態において、エンハンサー配列５は、上流から順に、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列とが、交互に複数回配置されてなる配列である。配列番号３および配列番号４に示される塩基配列は、合計で、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上、配置されていてもよい。また、配列番号３に示される塩基配列と、配列番号４に示される塩基配列との間には、任意構成のスペーサー配列が挿入されていてもよい。スペーサー配列の長さは、例えば、８０ｂｐ以下、７０ｂｐ以下、６０ｂｐ以下または５０ｂｐ以下とすることができる。以上を総合すると、一実施形態において、エンハンサー配列５は、下記の構造を取る。
５’－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）・・・－（配列番号３）－（任意構成のスペーサー配列）－（配列番号４）－３’。
In one embodiment, the
5'-(SEQ ID NO: 3)-(arbitrary configuration spacer sequence)-(SEQ ID NO: 4)-(arbitrary configuration spacer sequence)-(SEQ ID NO: 3)-(arbitrary configuration spacer sequence)-(SEQ ID NO: 4) ...- (SEQ ID NO: 3)-(arbitrary configuration spacer array)-(SEQ ID NO: 4) -3'.
一実施形態において、エンハンサー配列５は、配列番号５に示される塩基配列である。配列番号５に示される塩基配列は、配列番号３および配列番号４に示される塩基配列を、それぞれ１２個ずつ含んでいる。本明細書では、配列番号５に示されるエンハンサー配列を、「ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ」と称する。
In one embodiment, the
図１では、エンハンサー配列５は１個のみ描かれている。しかし、２個以上のエンハンサー配列５を、ｇｐｄＡプロモーター由来配列１とａｄｈプロモーター由来配列２との間に配置してもよい。この場合、同じ配列のエンハンサー配列５を採用してもよいし、異なる配列のエンハンサー配列５を組合せて採用してもよい。また、上記に例示したエンハンサー配列は、逆位に挿入してもよい。すなわち、上記に例示したエンハンサー配列の、５’末端と３’末端を入れ替えた配列をエンハンサー配列５として採用してもよい。
In FIG. 1, only one
［１．４．糸状菌］
糸状菌用プロモーター１０を適用する糸状菌は、特に限定されない。すなわち、本発明の一態様に係る形質転換方法を適用する糸状菌、および、本発明の一態様に係る形質転換体の宿主となる糸状菌は、特に限定されない。
[1.4. Filamentous fungus]
The filamentous fungus to which the promoter for
糸状菌の例としては、アスペルギルス属糸状菌、ペニシリウム属糸状菌、トリコデルマ属糸状菌、リゾプス属糸状菌、ムコール属糸状菌、モナスカス属糸状菌、フザリウム属糸状菌が挙げられる。中でも、糸状菌用プロモーター１０は、アスペルギルス属糸状菌において奏効しうる。これは、糸状菌用プロモーター１０が、アスペルギルス・オリゼ由来の塩基配列から構成されているためである。
Examples of filamentous fungi include Aspergillus filamentous fungi, Penicillium filamentous fungi, Trichoderma filamentous fungi, Risops filamentous fungi, Mucor filamentous fungi, Monascus filamentous fungi, and Fuzarium filamentous fungi. Among them, the
アスペルギルス属糸状菌の例としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・フォエニシス（Aspergillus phoenicis）が挙げられる。 Examples of Aspergillus filamentous fungi include Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus usamii, Aspergillus kawachi (Aspergillus kawachi) -Soya (Aspergillus sojae), Aspergillus nidulans, Aspergillus aculeatus, Aspergillus terreus, Aspergillus phoenicis.
ペニシリウム属糸状菌の例としては、ペニシリウム・カマンベルチ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・ノタトウム（Penicillium notatum）、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）、ペニシリウム・パルロゼナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）が挙げられる。 Examples of Penicillium filamentous fungi include Penicillium camemberti, Penicillium notatum, Penicillium multicolor, Penicillium purpurogenum, Penicillium purpurogenum, and Penicillium purpurogenum. Can be mentioned.
トリコデルマ属糸状菌の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）が挙げられる。 Examples of Trichoderma filamentous fungi include Trichoderma reesei and Trichoderma viride.
リゾプス属糸状菌の例としては、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、リゾプス・ジャポニカス（Rhizopus japonicus）が挙げられる。 Examples of Rhizopus filamentous fungi include Rhizopus oryzae and Rhizopus japonicus.
ムコール属糸状菌の例としては、ムコール・エスピー（Mucor sp.）が挙げられる。 An example of a fungus of the genus Mucor is Mucor sp.
モナスカス属糸状菌の例としては、モナスカス・パープレウス（Monascus purpureus）が挙げられる。 Examples of Monascus filamentous fungi include Monascus purpureus.
フザリウム属糸状菌の例としては、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）が挙げられる。 Examples of Fusarium filamentous fungi include Fusarium oxysporum.
〔２．ベクター〕
本発明の一態様に係るベクターは、糸状菌用プロモーター１０を含んでいる。このベクターは、糸状菌用プロモーター１０の下流側に、目的タンパク質をコードする遺伝子７を有していてもよい（図１を参照）。目的タンパク質をコードする遺伝子７がベクターに含まれる場合、当該ベクターで糸状菌を組換えることにより、目的タンパク質を高発現する形質転換体が得られる。
[2. vector〕
The vector according to one aspect of the present invention contains a
本発明の一実施形態に係るベクターの具体的な形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドが挙げられる。プラスミドベクターの形状は、環状であってもよいし、鎖状であってもよい。 The specific form of the vector according to the embodiment of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a plasmid. The shape of the plasmid vector may be circular or chain.
本発明の一実施形態に係るベクターを構成するポリヌクレオチドの由来は、特に限定されない。例えば、本発明を食品などに応用する場合には、セルフクローニングを行うことが好ましいといえる。セルフクローニングを行う場合、ベクターを構成する各ポリヌクレオチドは、当該ベクターが導入される宿主と同一（同種）の生物由来である。糸状菌用プロモーター１０はアスペルギルス・オリゼ由来であるため、上述の場合には、ベクターを構成するポリヌクレオチドは、アスペルギルス属糸状菌由来であることが好ましく、アスペルギルス・オリゼ由来であることがより好ましい。
The origin of the polynucleotide constituting the vector according to the embodiment of the present invention is not particularly limited. For example, when the present invention is applied to foods and the like, it can be said that self-cloning is preferable. When self-cloning is performed, each polynucleotide constituting the vector is derived from the same (same species) organism as the host into which the vector is introduced. Since the
本発明の一実施形態に係るベクターを構成する、それぞれのポリヌクレオチドは、公知の技術によって取得できる。例えば、公知の配列情報に基づいて、ＰＣＲなどのＤＮＡ増幅手段を用いて、目的の配列を取得できる。あるいは、糸状菌の染色体ＤＮＡライブラリーからのクローニングによっても取得できる。 Each polynucleotide constituting the vector according to the embodiment of the present invention can be obtained by a known technique. For example, a target sequence can be obtained by using a DNA amplification means such as PCR based on known sequence information. Alternatively, it can also be obtained by cloning from the chromosomal DNA library of filamentous fungi.
［２．１．目的タンパク質］
目的タンパク質の種類は、特に限定されない。目的タンパク質の例としては、糸状菌由来の細胞内タンパク質、分泌タンパク質、原核生物由来タンパク質、真核生物由来タンパク質が挙げられる。より具体的な例としては、酵素（α－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ヌクレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなど）、リボソーム構成タンパク質、トランスポーター、シャペロン、転写調節因子が挙げられる。機能未知のタンパク質を、目的タンパク質としてもよい。また、レポーターを目的タンパク質としてもよい。
[2.1. Target protein]
The type of the target protein is not particularly limited. Examples of the target protein include intracellular proteins derived from filamentous fungi, secretory proteins, prokaryotic proteins, and eukaryotic proteins. More specific examples include enzymes (α-amylase, glucoamylase, α-glucosidase, β-galactosidase, cellulase, chitinase, protease, aminopeptidase, carboxypeptidase, lipase, phosphoripase, phytase, nuclease, catalase, glucose oxidase, etc. Glucose dehydrogenase, etc.), ribosome constituent proteins, transporters, chapelons, transcriptional regulators. A protein of unknown function may be used as the target protein. Further, the reporter may be used as the target protein.
本発明の一実施形態に係るベクターは、宿主糸状菌細胞内で目的タンパク質を発現させるための発現単位を１つ以上含んでいる。発現単位には、プロモーター領域（糸状菌用プロモーター１０など）、目的タンパク質をコードする遺伝子７のオープンリーディングフレーム、ターミネーター領域が含まれる。
The vector according to one embodiment of the present invention contains one or more expression units for expressing the target protein in host filamentous fungal cells. The expression unit includes a promoter region (
［２．２．その他の配列］
本発明の一実施形態に係るベクターは、本技術分野で公知の、ターミネーター、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点、目的遺伝子を導入する際に使用する制限酵素認識配列などを付加することができる。また、目的タンパク質をコードする遺伝子７と、その他のタンパク質（グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡなど）をコードする遺伝子とを連結してもよい。このような構成とすれば、目的タンパク質と上記その他のタンパク質との融合タンパク質を発現させることができる。このような融合タンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断することによって、それぞれのタンパク質に分離できる。
[2.2. Other arrays]
The vector according to the embodiment of the present invention is added with a terminator, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an origin of replication, a restriction enzyme recognition sequence used when introducing a gene of interest, and the like, which are known in the present art. can do. Further, the
本発明の一実施形態に係るベクターは、１個以上の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーとしては、糸状菌形質転換体の選択に一般的に使用されているマーカーを利用できる。具体例としては、ｎｉａＤ、ｓＣ、ａｒｇＢ、ａｄｅＡ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧが挙げられる。また、大腸菌などの細菌培養用の薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子など）を選択マーカーとしてもよい。選択マーカーを利用して、上記ベクターが宿主細胞に導入されたか否かを確認できる。 The vector according to one embodiment of the present invention may contain one or more selectable markers. As the selectable marker, a marker generally used for selecting a filamentous fungus transformant can be used. Specific examples include niaD, sC, argB, adeA, ptrA, and pyrG. Further, a drug resistance gene for bacterial culture such as Escherichia coli (tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, etc.) may be used as a selection marker. A selectable marker can be used to confirm whether or not the above vector has been introduced into a host cell.
目的タンパク質を、選択マーカーとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を選択マーカーとして用い、目的タンパク質をＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。 The protein of interest may be expressed as a fusion polypeptide with a selectable marker. For example, green fluorescent protein (GFP) derived from Aequorea coeruleus may be used as a selectable marker, and the target protein may be expressed as a GFP fusion polypeptide.
本発明の一実施形態に係るベクターは、制限酵素認識配列を含んでいてもよい。ベクター内に１箇所のみ存在し、かつ標的配列の内部に存在しない制限酵素認識配列は、当該標的配列をベクター内に導入する際に利用できる。ベクターの汎用性を考慮すると、制限酵素認識配列は、認識部位の出現頻度が少ない６塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることが好ましく、８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列とすることがより好ましい。６塩基を認識する制限酵素の認識配列の例としては、ＧＧＧＣＣＣ（ＡｐａＩ）、ＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ）、ＡＴＣＧＡＴ（ＣｌａＩ）、ＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、ＣＣＡＴＧＧ（ＮｃｏＩ）、ＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩ）、ＣＡＣＧＴＧ（ＰｍｌＩ）、ＧＣＡＴＧＣ（ＳｐｈＩ）、ＴＣＴＡＧＡ（ＸｂａＩ）、ＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ）が挙げられる。８塩基以上を認識する制限酵素の認識配列の例としては、ＧＧＣＧＣＧＣＣ（ＡｓｃＩ）、ＧＣＧＡＴＣＧＣ（ＡｓｉＳＩ）、ＧＧＣＣＧＧＣＣ（ＦｓｅＩ）、ＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ）、ＴＴＡＡＴＴＡＡ（ＰａｃＩ）、ＧＴＴＴＡＡＡＣ（ＰｍｅＩ）、ＣＣＴＧＣＡＧＧ（ＳｂｆＩ）、ＧＣＣＣＧＧＧＣ（ＳｒｆＩ）、ＡＴＴＴＡＡＡＴ（ＳｗａＩ）が挙げられる。 The vector according to one embodiment of the present invention may contain a restriction enzyme recognition sequence. A restriction enzyme recognition sequence that exists only at one location in the vector and does not exist inside the target sequence can be used when introducing the target sequence into the vector. Considering the versatility of the vector, the restriction enzyme recognition sequence is preferably a restriction enzyme recognition sequence that recognizes 6 or more bases in which the recognition site appears infrequently, and a restriction enzyme recognition sequence that recognizes 8 or more bases. It is more preferable to do. Examples of recognition sequences for restriction enzymes that recognize 6 bases include GGGCCC (ApaI), GGATCC (BamHI), ATCGAT (ClaI), AAGCTT (HindIII), CCATGG (NcoI), CATATG (NdeI), CACGTG (PmlI), Examples thereof include GCATGC (SphI), TCTAGA (XbaI), and CTCGAG (XhoI). Examples of recognition sequences for restriction enzymes that recognize 8 or more bases are GGCGCGCC (AscI), GCGATCGC (AsiSI), GGCCGGCC (FseI), GCGGCCGC (NotI), TTAATTAA (PacI), GTTTAAAC (PmeI), CCTGCAG. , GCCCGGGC (SrfI), ATTTAAAT (SwaI).
本発明の一実施形態に係るベクターは、相同組換えを行わせるために必要な宿主糸状菌由来のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。宿主糸状菌由来のポリヌクレオチドの長さは、特に限定されない。相同組換えの効率を考えると、２００ｂｐ～２００００ｂｐであることが好ましく、５００ｂｐ～１００００ｂｐであることがより好ましい。２００ｂｐ以上の長さがあれば、相同組換えを効率よく生じさせられる。２００００ｂｐ以下の長さであれば、ベクターを宿主糸状菌の細胞内に効率よく取込ませることができる。 The vector according to one embodiment of the present invention may contain a polynucleotide derived from a host filamentous fungus necessary for performing homologous recombination. The length of the polynucleotide derived from the host filamentous fungus is not particularly limited. Considering the efficiency of homologous recombination, it is preferably 200 bp to 20000 bp, and more preferably 500 bp to 10000 bp. If the length is 200 bp or more, homologous recombination can be efficiently generated. If the length is 20000 bp or less, the vector can be efficiently incorporated into the cells of the host filamentous fungus.
〔３．形質転換方法、形質転換体およびタンパク質の生産方法〕
本発明の一態様に係る形質転換方法は、〔２〕節で説明したベクターで、糸状菌を形質転換する。このベクターは、上流から順に、糸状菌用プロモーター１０と、目的タンパク質をコードする遺伝子７とを含んでいる。この形質転換方法によって、本発明の一態様に係る形質転換体が得られる。また、この形質転換体を培養することによって、本発明の一態様に係るタンパク質の生産方法が実施できる。これらの実施形態によれば、目的タンパク質を高効率で生産できる。
[3. Transformation method, transformant and protein production method]
The transformation method according to one aspect of the present invention transforms filamentous fungi with the vector described in Section [2]. This vector contains a promoter for
本発明の一実施形態に係る形質転換方法において、糸状菌を形質転換する方法には、公知の方法が適宜採用される。具体例としては、カルシウム－ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法が挙げられる。 In the transformation method according to the embodiment of the present invention, a known method is appropriately adopted as the method for transforming filamentous fungi. Specific examples include a calcium-PEG method and an electroporation method.
本発明の一実施形態に係る形質転換体において、宿主となる糸状菌の例としては、上述した糸状菌が挙げられる。 In the transformant according to the embodiment of the present invention, examples of the filamentous fungus as a host include the above-mentioned filamentous fungus.
本発明の一実施形態に係るタンパク質の生産方法において、形質転換体を培養する方法は、糸状菌の培養方法に通常用いられる培地、培養条件を適宜選択すればよい。形質転換体の培養は、固体培養であっても液体培養であってもよい。培養に用いる培地の例としては、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、Czapek-dox培地（０．２％ ＮａＮＯ３、０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％ ＦｅＳＯ４、３％ グルコースまたは３％ デンプン、ｐＨ５．５）、フスマ培地（小麦フスマ、水分含量４０％）が挙げられる。培養温度は、形質転換体が生育できる範囲内の適当な温度を採用できる。培養温度の一例を挙げると、２０～３７℃である。 In the method for producing a protein according to an embodiment of the present invention, as a method for culturing a transformant, a medium and culture conditions usually used for a method for culturing filamentous fungi may be appropriately selected. The culture of the transformant may be a solid culture or a liquid culture. Examples of media used for culturing include dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% Л4.7H 2 O ), Czapek-dox medium (0. 2% NaNO 3 , 0.1% K 2 HPO 4 , 0.05% ו 4 , 0.05% KCl, 0.001% FeSO 4 , 3% glucose or 3% starch, pH 5.5), Fusuma medium (pH 5.5) Wheat bran, water content 40%). As the culture temperature, an appropriate temperature within the range in which the transformant can grow can be adopted. An example of the culture temperature is 20 to 37 ° C.
本発明の一実施形態に係る形質転換体の培養物には、目的タンパク質が含まれている。必要に応じて、目的タンパク質を定性分析または定量分析してもよい。あるいは、培養物から目的タンパク質を単離または精製してもよい。 The culture of the transformant according to one embodiment of the present invention contains the target protein. If necessary, the protein of interest may be analyzed qualitatively or quantitatively. Alternatively, the protein of interest may be isolated or purified from the culture.
形質転換体を液体培養しており、目的タンパク質が菌体外に分泌されている場合には、菌体培養液そのものを回収して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。形質転換体を固体培養しており、目的タンパク質が菌体外に分泌されている場合には、適当な緩衝液を用いて培養物から目的タンパク質を含む溶液を抽出して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。菌体内に目的タンパク質が蓄積されている場合には、菌体を公知の手段で破砕し、適当な緩衝液を用いて目的タンパク質を抽出して、当該目的タンパク質の分析、単離または精製に供することができる。糸状菌を用いたタンパク質生産系の場合、目的タンパク質は分泌される場合が多い。 When the transformant is liquid-cultured and the target protein is secreted outside the cells, the cell culture solution itself can be recovered and used for analysis, isolation or purification of the target protein. .. If the transformant is solid-cultured and the target protein is secreted outside the cells, a solution containing the target protein is extracted from the culture using an appropriate buffer solution, and the target protein is analyzed. Can be used for isolation or purification. If the target protein is accumulated in the cells, the cells are disrupted by a known means, the target protein is extracted using an appropriate buffer solution, and the target protein is analyzed, isolated or purified. be able to. In the case of a protein production system using filamentous fungi, the target protein is often secreted.
上記のようにして回収した目的タンパク質をさらに精製する場合は、例えば、タンパク質を含む溶液を公知の方法によって精製すればよい。このような方法の例としては、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーが挙げられる。タンパク質の精製には、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が好ましく採用される。 When the target protein recovered as described above is further purified, for example, a solution containing the protein may be purified by a known method. Examples of such methods include ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, lectin chromatograph. Chromatography can be mentioned. High performance liquid chromatography (“HPLC”) is preferably employed for protein purification.
［コントロールベクターの構築］
本実施例では、コントロールベクターとして、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を使用した。このベクターは、既知の強力な改良プロモーターであるｅｎｏＡ１４２プロモーターを有しており、目的遺伝子を高発現できる。ｐＳＥＮＳＵ２５１２の構築手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ（Takaya, T. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90: 1171.）を、ＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ／ＸｂａＩ－ＳｍａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にて２－５－１２ターミネーター（Ｔ－２５１２；日本国特許第５，６８６，９７４号を参照）を増幅させた。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にＸｂａＩサイト、当該断片の３’末端側にＳｍａＩサイト、当該断片の両端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号６および配列番号７に示した。
３．Ｔ－２５１２の断片をＸｂａＩ－ＳｍａＩで消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵのＸｂａＩ－ＳｍａＩサイトにライゲーションすることにより、ｐＳＥＮＳＵ２５１２を構築した。
[Construction of control vector]
In this example, pSENSU2512 was used as the control vector. This vector has the well-known potent improved promoter, the enoA142 promoter, and is capable of highly expressing the gene of interest. The procedure for constructing pSENSU2512 is as follows (see also FIG. 2).
1. 1. pSENSU (Takaya, T. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 90: 1171.) Was digested with XbaI-SmaI. The pSENSU / XbaI-SmaI digest was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
2. 2. Using genomic DNA extracted from Aspergillus oryzae RIB40 (purchased from National Institute of Technology and Evaluation) as a template, 2-5-12 terminator (T-2512; Japanese Patent No. 5,686) by PCR method. (See No. 974) was amplified. The primer used at this time was designed so that the XbaI site was arranged on the 5'end side of the fragment to be amplified, the SmaI site was arranged on the 3'end side of the fragment, and GGG was arranged at both ends of the fragment. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
3. 3. Fragments of T-2512 were digested with XbaI-SmaI and then purified. The pSENSU2512 was constructed by ligating the purified product to the XbaI-SmaI site of pSENSU.
〔実施例１：ＣＡＬＢ活性の比較〕
実施例１では、Candida antarctica由来リパーゼＢ（ＣＡＬＢ）をレポータータンパク質として、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
[Example 1: Comparison of CALB activity]
In Example 1, using Candida antarctica-derived lipase B (CALB) as a reporter protein, the effect of improving the expression of the protein by the promoter for filamentous fungi according to the embodiment of the present invention was examined.
［ＣＡＬＢ発現コントロールベクターの構築］
ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化することにより、ｈｓｐ１２の５’ＵＴＲとターミネーターとの間に、レポーター遺伝子としてＣＡＬＢを導入した。具体的な手順は、以下の通りである（図２も参照）。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．合成したＣＡＬＢ遺伝子（塩基配列は配列番号８）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＣＡＬＢ遺伝子断片を増幅させた。この鋳型は、ＣＡＬＢの分泌シグナルを、αアミラーゼの分泌シグナルに置換したものである。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトを配置し、当該断片の３’末端にＧＧＧが付加されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号９および配列番号１０に示した。
３．得られたＣＡＬＢ遺伝子断片をＸｂａＩ消化した後、精製した。精製物をｐＳＥＮＳＵ２５１２のＰｍｌＩ－ＸｂａＩサイトにライゲーションすることにより、ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを構築した。
[Construction of CALB expression control vector]
By digesting pSENSU2512 with PmlI-XbaI, CALB was introduced as a reporter gene between the 5'UTR of hsp12 and the terminator. The specific procedure is as follows (see also FIG. 2).
1. 1. pSENSU2512 was digested with PmlI-XbaI. The pSENSU2512 / PmlI-XbaI digest was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
2. 2. Using the synthesized CALB gene (base sequence is SEQ ID NO: 8) as a template, the CALB gene fragment was amplified by the PCR method. This template replaces the CALB secretory signal with the α-amylase secretory signal. The primer used at this time had the full length of the 5'UTR of hsp12 by including TCGCAAAC on the 5'end side of the fragment to be amplified, and the XbaI site was placed on the 3'end side of the fragment. It was designed so that GGG was added to the 3'end. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
3. 3. The obtained CALB gene fragment was XbaI digested and then purified. A CALB expression control vector was constructed by ligating the purified product to the PmlI-XbaI site of pSENSU2512.
［ＣＡＬＢ発現ベクターの構築］
Aspergillus oryzae RIB40由来のグリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）および／またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）のプロモーター由来配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｐＵＣ１１８部分配列ならびにｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を含む、複数の塩基配列（配列番号１１～２１）を合成した。以下では、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下にｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）を配置されたＣＡＬＢ発現ベクターの構築方法を説明する（図３も参照）。
１．合成した遺伝子配列を鋳型として、ｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片（全長の塩基配列は配列番号１１）をＰＣＲ法により増幅させた。具体的なプライマーの配列は、配列番号２２および配列番号２３に示した。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、増幅した断片を単離および精製した。
２．精製したｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
３．ＣＡＬＢ発現コントロールベクターを鋳型として、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣからなる断片を、インバースＰＣＲ法により増幅させた。次に、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動させ、単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２４および配列番号２５に示した。
４．２で得たｐＵＣ１１８部分配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、ｇｐｄＡプロモーター由来配列（配列番号１の全長）およびｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列を有する遺伝子断片と、３で得たｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とをライゲーションした。これにより、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩの直下に配列番号１の全長が配置されたＣＡＬＢ発現ベクター（比較例１－１）を構築した。
また、同様の手順によって、以下のプロモーター配列を有するＣＡＬＢ発現ベクターを構築した。具体的には、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１２～１８に変更したベクターが、それぞれ、比較例１－２～１－８に係るベクターである。また、ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ部分配列－ＣＡＬＢ－Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ断片とライゲーションする遺伝子断片の配列を、配列番号１９～２１に変更したベクターが、それぞれ、実施例１－１～１－３に係るベクターである。なお、以下の配列は、配置順が上流から下流になるように記載している。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の全長（比較例１－２）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第１０００位（比較例１－３）。
・ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第１０００位（比較例１－４）。
・配列番号１の第１位～第２９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第３００位～第１０００位（比較例１－５）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号１の第６００位～第８２５位（比較例１－６）。
・配列番号２の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－７）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第８３０位（比較例１－８）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－１）。
・配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第７８１位～第９０７位（実施例１－２）。
・配列番号１の第１位～第６２５位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位（実施例１－３）。
[Construction of CALB expression vector]
Multiple nucleotide sequences, including promoter-derived sequences of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (gpdA) and / or alcohol dehydrogenase gene (adh) from Aspergillus oryzae RIB40, Region III, pUC118 partial sequence and hsp125'UTR partial sequence. (SEQ ID NOs: 11-21) were synthesized. In the following, a method for constructing a CALB expression vector in which a gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) is arranged directly under Region III will be described (see also FIG. 3).
1. 1. Using the synthesized gene sequence as a template, a gene fragment having a pUC118 partial sequence, RegionIII, gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) and hsp125'UTR partial sequence (full-length base sequence is SEQ ID NO: 11) is obtained by PCR. Amplified. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23. The PCR product was then subjected to agarose gel electrophoresis and the amplified fragments were isolated and purified.
2. 2. A gene fragment having the purified pUC118 partial sequence, RegionIII, gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) and hsp125'UTR partial sequence was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
3. 3. Using the CALB expression control vector as a template, a fragment consisting of hsp125'UTR partial sequence-CALB-T-2512-sC-pUC was amplified by the inverse PCR method. The PCR product was then subjected to agarose gel electrophoresis, isolated and purified. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25.
A gene fragment having the pUC118 partial sequence, Region III, gpdA promoter-derived sequence (full length of SEQ ID NO: 1) and hsp12 5'UTR partial sequence obtained in 4.2, and the hsp12 5'UTR partial sequence-CALB-T obtained in 3. It was ligated with the -2512-sC-pUC fragment. As a result, a CALB expression vector (Comparative Example 1-1) in which the full length of SEQ ID NO: 1 was arranged immediately under Region III was constructed.
In addition, a CALB expression vector having the following promoter sequence was constructed by the same procedure. Specifically, the vectors in which the sequence of the gene fragment ligating with the hsp125'UTR partial sequence-CALB-T-2512-sC-pUC fragment was changed to SEQ ID NOs: 12-18 are the vectors of Comparative Examples 1-2 to 1, respectively. It is a vector according to 1-8. Further, the vectors in which the sequence of the gene fragment ligating to the hsp12 5'UTR partial sequence-CALB-T-2512-sC-pUC fragment was changed to SEQ ID NOs: 19 to 21 are the vectors of Examples 1-1 to 1-3, respectively. It is a vector according to. In addition, the following sequences are described so that the arrangement order is from upstream to downstream.
-Region III, total length of SEQ ID NO: 2 (Comparative Example 1-2).
-Region III, positions 600 to 1000 of SEQ ID NO: 1 (Comparative Example 1-3).
-Region III, positions 600 to 1000 of SEQ ID NO: 2 (Comparative Example 1-4).
1st to 299th positions of SEQ ID NO: 1, Region III, 300th to 1000th positions of SEQ ID NO: 1 (Comparative Example 1-5).
1st to 599th positions of SEQ ID NO: 1, Region III, 600th to 825th positions of SEQ ID NO: 1 (Comparative Example 1-6).
1st to 599th positions of SEQ ID NO: 2, Region III, 600th to 830th positions of SEQ ID NO: 2 (Comparative Example 1-7).
1st to 599th positions of SEQ ID NO: 1, Region III, 600th to 830th positions of SEQ ID NO: 2 (Comparative Example 1-8).
1st to 599th positions of SEQ ID NO: 1, Region III, 600th to 907th positions of SEQ ID NO: 2 (Example 1-1).
1st to 599th positions of SEQ ID NO: 1, Region III, 781th to 907th positions of SEQ ID NO: 2 (Example 1-2).
1st to 625th positions of SEQ ID NO: 1, Region III, 600th to 907th positions of SEQ ID NO: 2 (Example 1-3).
本項目で作製したＣＡＬＢ発現ベクターは、ＣＡＬＢ発現コントロールベクターと比較すると、プロモーター配列のみが置換されていることになる。 When the CALB expression vector prepared in this item is compared with the CALB expression control vector, only the promoter sequence is substituted.
［形質転換体の作製］
作製したベクターを用いて、Aspergillus oryzae NS4株（変異処理により取得した、ｎｉａＤおよびｓＣの二重欠損株）を、プロトプラスト－ＰＥＧ法にて形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
[Preparation of transformant]
Using the prepared vector, Aspergillus oryzae NS4 strain (double-deficient strain of niaD and sC obtained by mutation treatment) was transformed by the protoplast-PEG method. From this, a transformant in which only one copy of the vector was introduced into the sC locus of the chromosome was selected by the PCR method. The selected transformants were cultured in dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% Л4.7H 2 O) for 3 days, and the culture supernatant was obtained. Was used as a crude enzyme solution.
［ＣＡＬＢ活性の測定］
２５０μＬの１００％エタノールに５μＬｐ－ニトロフェニルブチレートを加え、ピペットで懸濁させた。この懸濁液を、蒸留水で５０ｍＬにメスアップすることにより、ＰＮＰＢ溶液を得た。次に、１５０μＬのＰＮＰＢ溶液と、５０μＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、基質溶液を得た。得られた基質溶液に、適宜稀釈した２μＬの粗酵素液を加え、反応を開始させた。反応温度は３７℃、反応時間は３分間とした。４００ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより、ＣＡＬＢ活性を測定した。その結果を表１に示す。なお、表１では、ｅｎｏＡ１４２プロモーターを有するコントロールベクターの活性に対する相対活性として、ＣＡＬＢ活性を表記している。ｅｎｏＡ１４２プロモーターとは、エノラーゼ遺伝子（ｅｎｏＡ）のプロモーターを制限酵素処理し、その間にＲｅｇｉｏｎＩＩＩを挿入したプロモーターである。
[Measurement of CALB activity]
5 μLp-nitrophenyl butyrate was added to 250 μL of 100% ethanol and suspended with a pipette. The suspension was made up to 50 mL with distilled water to give a PNPB solution. Next, 150 μL of PNPB solution and 50 μL of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) were mixed to obtain a substrate solution. To the obtained substrate solution, 2 μL of a crude enzyme solution diluted appropriately was added, and the reaction was started. The reaction temperature was 37 ° C. and the reaction time was 3 minutes. CALB activity was measured by measuring the increase in absorbance at 400 nm. The results are shown in Table 1. In Table 1, CALB activity is shown as a relative activity with respect to the activity of the control vector having the enoA142 promoter. The enoA142 promoter is a promoter in which the promoter of the enolase gene (enoA) is treated with a restriction enzyme and Region III is inserted between them.
（結果）
実施例１－１～１－３に係るプロモーターは、コントロール（ｅｎｏＡ１４２プロモーター）よりも、ＣＡＬＢ活性を大幅に向上させることが判った。このことから、ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順で配置されている、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＣＡＬＢの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
(result)
It was found that the promoters according to Examples 1-1 to 1-3 significantly improved CALB activity as compared with the control (enoA142 promoter). From this, the promoter for filamentous fungi according to one embodiment of the present invention, in which the gpdA promoter-derived sequence, the enhancer sequence, and the adh promoter-derived sequence are arranged in this order, can significantly increase the expression level of CALB. It is suggested.
ｇｐｄＡプロモーター由来配列とＲｅｇｉｏｎＩＩＩとの組合せを検討した比較例１－１、１－３、１－５、１－６において、発現効率は最大でコントロールの１．１倍であった。また、ａｄｈプロモーター由来配列とＲｅｇｉｏｎＩＩＩとの組合せを検討した比較例１－２、１－４、１－７において、発現効率は最大でコントロールの１．３倍であった。これに対して、ｇｐｄＡプロモーター由来配列、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩおよびａｄｈプロモーター由来配列の組合せを検討した実施例１－１～１－３では、発現効率は最大でコントロールの２．５倍に達した。 In Comparative Examples 1-1, 1-3, 1-5, and 1-6 in which the combination of the gpdA promoter-derived sequence and Region III was examined, the expression efficiency was up to 1.1 times that of the control. Moreover, in Comparative Examples 1-2, 1-4, and 1-7 in which the combination of the adh promoter-derived sequence and Region III was examined, the expression efficiency was 1.3 times that of the control at the maximum. On the other hand, in Examples 1-1 to 1-3 in which the combination of the gpdA promoter-derived sequence, Region III and the adh promoter-derived sequence was examined, the expression efficiency reached 2.5 times that of the control at the maximum.
実施例１－１と実施例１－３とを比較すると、ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、少なくとも第１位～第５９９位を含んでいれば、発現効率を高める機能を有していることが示唆される。また、実施例１－１と比較例１－８とを比較すると、ａｄｈプロモーター由来配列は、少なくとも第８３１位～第９０７位を含んでいれば、発現効率を高める機能を有していることが示唆される。これは、実施例１－１の領域には機能に必須の領域が含まれており、比較例１－８の領域には機能に必須の領域が含まれていないと考えられるためである。
Comparing Example 1-1 and Example 1-3, it is suggested that the gpdA promoter-derived sequence has a function of increasing expression efficiency if it contains at
〔実施例２：ＧＵＳ活性の比較〕
実施例２では、大腸菌由来β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
[Example 2: Comparison of GUS activity]
In Example 2, Escherichia coli-derived β-glucuronidase (GUS) was used as a reporter protein, and the effect of improving the expression of the protein by the promoter for filamentous fungi according to the embodiment of the present invention was examined.
［ＧＵＳ発現コントロールベクターの構築］
ＧＵＳを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２をＰｍｌＩ－ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、ＧＵＳ遺伝子断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号２６および配列番号２７に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物とＧＵＳ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションすることにより、ＧＵＳ発現コントロールベクターを構築した。
[Construction of GUS expression control vector]
The control vector expressing GUS was constructed by the following procedure.
1. 1. pSENSU2512 was digested with PmlI-XbaI. The pSENSU2512 / PmlI-XbaI digest was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
2. 2. The GUS gene was amplified by the PCR method using pBI221 (Clontech) as a template. The GUS gene fragment was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis. The primer used at this time had the full length of the 5'UTR of hsp12 by including TCGCAAAC on the 5'end side of the fragment to be amplified, and the XbaI site was placed on the 3'end side of the GUS gene fragment. It was designed so that the GGG is placed at the 3'end of the. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27.
3. 3. The purified GUS gene fragment was digested with XbaI. The GUS / XbaI digest was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
4. A GUS expression control vector was constructed by ligating the pSENSU2512 / PmlI-XbaI digest and the GUS / XbaI digest.
［ＧＵＳ発現ベクターの構築］
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．ｐＢＩ２２１（Clontech社）を鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＵＳ遺伝子を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、ＧＵＳ遺伝子断片を単離および精製した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３０および配列番号３１に示した。
３．精製したＧＵＳ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる遺伝子断片と、３で得たＧＵＳ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＧＵＳ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＧＵＳ発現ベクターは、ＧＵＳ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
[Construction of GUS expression vector]
A GUS expression vector having the same promoter as in Example 1-1 (promoters in which positions 1 to 599 of SEQ ID NO: 1, Region III, and positions 600 to 907 of SEQ ID NO: 2 are arranged in this order) was constructed. .. The specific procedure is as follows.
1. 1. Using the vector prepared in Example 1-1 as a template, T-2512-sC-pUC-SEQ ID NO: 1 at
2. 2. The GUS gene was amplified by the PCR method using pBI221 (Clontech) as a template. The GUS gene fragment was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31.
3. 3. The purified GUS gene fragment was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase.
The gene fragment consisting of T-2512-sC-pUC-SEQ ID NO: 1 1-59, Region III, SEQ ID NO: 2 600-907-hsp12 5'UTR obtained in 4.1, and The GUS gene fragment obtained in 3 was ligated. As a result, a GUS expression vector having the same promoter sequence as in Example 1-1 was constructed. The GUS expression vector prepared in this item differs from the GUS expression control vector in that the enoA142 promoter is replaced with the same promoter as in Example 1-1.
［形質転換体の作製およびＧＵＳ活性の比較］
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法により、Aspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入されている形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて２日間培養した。その後、形質転換体を集菌し、乳鉢を用いて液体窒素中ですり潰して、粗酵素液を得た。粗酵素液のＧＵＳ活性は、公知の方法（Proc Natl Acad Sci (1986) Vol.83,No.22, pp.8447-8451）に準じて測定した。
[Preparation of transformants and comparison of GUS activity]
Aspergillus oryzae was transformed by the protoplast-PEG method using the prepared vector. From these, a transformant in which only one copy of the vector was introduced into the sC locus of the chromosome was selected by the PCR method. The selected transformants were cultured in dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% Л4.7H 2 O) for 2 days. Then, the transformant was collected and ground in liquid nitrogen using a mortar to obtain a crude enzyme solution. The GUS activity of the crude enzyme solution was measured according to a known method (Proc Natl Acad Sci (1986) Vol.83, No.22, pp.8447-8451).
（結果）
実施例１－１と同じプロモーターを有するＧＵＳ発現ベクターを使用した場合のＧＵＳ活性は、コントロールのＧＵＳ活性の１．５倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、ＧＵＳの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
(result)
The GUS activity when using the GUS expression vector having the same promoter as in Example 1-1 was 1.5 times the GUS activity of the control. This suggests that the promoter for filamentous fungi according to the embodiment of the present invention significantly increases the expression level of GUS.
〔実施例３：Ｌａｃ活性の比較〕
実施例３では、Aspergillus oryzae由来ラクターゼ（Ｌａｃ）をレポータータンパク質とし、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによるタンパク質の発現向上効果を検討した。
[Example 3: Comparison of Lac activity]
In Example 3, Lactase (Lac) derived from Aspergillus oryzae was used as a reporter protein, and the effect of improving the expression of the protein by the promoter for filamentous fungi according to the embodiment of the present invention was examined.
［Ｌａｃ発現コントロールベクターの構築］
Ｌａｃを発現するコントロールベクターは、以下の手順で構築した。
１．ｐＳＥＮＳＵ２５１２を、ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化した。次に、アガロース電気泳動によって、ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により、Ｌａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。このときに用いたプライマーは、増幅する断片の５’末端側にTCGCAAACを含ませることによりｈｓｐ１２の５’ＵＴＲを完全長とし、当該断片の３’末端側にＸｂａＩサイトが配置され、当該断片の３’末端にＧＧＧが配置されるように設計した。具体的なプライマーの配列は、配列番号３２および配列番号３３に示した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、ＸｂａＩで消化した。次に、アガロース電気泳動によって、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物を単離および精製した。
４．ｐＳＥＮＳＵ２５１２／ＰｍｌＩ－ＸｂａＩ消化物と、Ｌａｃ／ＸｂａＩ消化物とをライゲーションした。これにより、Ｌａｃ発現コントロールベクターを構築した。
[Construction of Lac expression control vector]
The control vector expressing Lac was constructed by the following procedure.
1. 1. pSENSU2512 was digested with PmlI-XbaI. The pSENSU2512 / PmlI-XbaI digest was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
2. 2. The Lac gene fragment was amplified by the PCR method using the genomic DNA extracted from Aspergillus oryzae RIB40 by the conventional method as a template. The fragments were then isolated and purified by agarose gel electrophoresis. The primer used at this time had the full length of the 5'UTR of hsp12 by including TCGCAAAC on the 5'end side of the fragment to be amplified, and the XbaI site was arranged on the 3'end side of the fragment. It was designed so that the GGG was placed at the 3'end. Specific primer sequences are shown in SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33.
3. 3. The purified Lac gene fragment was digested with XbaI. The Lac / XbaI digest was then isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
4. The pSENSU2512 / PmlI-XbaI digest and the Lac / XbaI digest were ligated. As a result, a Lac expression control vector was constructed.
［Ｌａｃ発現ベクターの構築］
実施例１－１と同じプロモーター（配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位がこの順に配置されたプロモーター）を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。具体的な手順は、以下の通りである。
１．実施例１－１で作製したベクターを鋳型として、インバースＰＣＲ法により、Ｔ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲからなる断片を増幅させた。使用したプライマーの配列は、配列番号２８および配列番号２９に示した。次に、アガロース電気泳動によって、断片を単離および精製した。
２．Aspergillus oryzae RIB40から常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３４および配列番号３５に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりＬａｃ遺伝子断片を増幅させた。次に、アガロース電気泳動を行って、断片を単離および精製した。
３．精製したＬａｃ遺伝子断片を、T4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した。
４．１で得たＴ－２５１２－ｓＣ－ｐＵＣ－配列番号１の第１位～第５９９位、ＲｅｇｉｏｎＩＩＩ、配列番号２の第６００位～第９０７位－ｈｓｐ１２ ５’ＵＴＲ断片と、３で得たＬａｃ遺伝子断片とをライゲーションした。これにより、実施例１－１と同じプロモーター配列を有するＬａｃ発現ベクターを構築した。本項目で作製したＬａｃ発現ベクターは、Ｌａｃ発現コントロールベクターと比較すると、ｅｎｏＡ１４２プロモーターが実施例１－１と同じプロモーターに置換されている点が異なっている。
[Construction of Lac expression vector]
A Lac expression vector having the same promoter as in Example 1-1 (promoters in which positions 1 to 599 of SEQ ID NO: 1, Region III, and positions 600 to 907 of SEQ ID NO: 2 are arranged in this order) was constructed. .. The specific procedure is as follows.
1. 1. Using the vector prepared in Example 1-1 as a template, T-2512-sC-pUC-SEQ ID NO: 1 at
2. 2. Using the genomic DNA extracted from Aspergillus oryzae RIB40 by a conventional method as a template, the Lac gene fragment was amplified by the PCR method using the primers set forth in SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35. The fragments were then isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
3. 3. The purified Lac gene fragment was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase.
Obtained in 4.1 with T-2512-sC-pUC-SEQ ID NO: 1 1-position 599, Region III, SEQ ID NO: 2 600-907-hsp12 5'UTR fragment, and 3. The Lac gene fragment was ligated. As a result, a Lac expression vector having the same promoter sequence as in Example 1-1 was constructed. The Lac expression vector prepared in this item differs from the Lac expression control vector in that the enoA142 promoter is replaced with the same promoter as in Example 1-1.
［形質転換体の作製］
作製したベクターを用いて、プロトプラスト－ＰＥＧ法によりAspergillus oryzaeを形質転換させた。この中から、ＰＣＲ法により、ベクターが染色体のｓＣ座位に１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、デキストリン－ペプトン培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）にて３日間培養し、培養上清を粗酵素液とした。
[Preparation of transformant]
Aspergillus oryzae was transformed by the protoplast-PEG method using the prepared vector. From this, a transformant in which only one copy of the vector was introduced into the sC locus of the chromosome was selected by the PCR method. The selected transformants were cultured in dextrin-peptone medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% KH 2 PO 4 , 0.05% Л4.7H 2 O) for 3 days, and the culture supernatant was obtained. Was used as a crude enzyme solution.
［Ｌａｃ活性の比較］
２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解させて、５．７ｍＭ基質溶液を調製した。１７５μＬの基質溶液に、適宜稀釈した粗酵素液を２５μＬ加え、反応を開始させた。反応温度は３０℃、反応時間は１０分間とした。反応後、５０μＬの１Ｍ 炭酸ナトリウム溶液を加えた。４１５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、Ｌａｃ活性を測定した。
[Comparison of Lac activity]
2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 4.5) to prepare a 5.7 mM substrate solution. To 175 μL of the substrate solution, 25 μL of an appropriately diluted crude enzyme solution was added to initiate the reaction. The reaction temperature was 30 ° C. and the reaction time was 10 minutes. After the reaction, 50 μL of 1M sodium carbonate solution was added. Lac activity was measured by measuring the absorbance at 415 nm.
（結果）
実施例１－１と同じプロモーターを有するＬａｃ発現ベクターを使用した場合のＬａｃ活性は、コントロールのＬａｃ活性の１．６倍だった。このことから、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターは、Ｌａｃの発現量を大幅に増加させることが示唆される。
(result)
The Lac activity when the Lac expression vector having the same promoter as in Example 1-1 was used was 1.6 times the Lac activity of the control. This suggests that the promoter for filamentous fungi according to the embodiment of the present invention significantly increases the expression level of Lac.
実施例１～３の結果から、本発明の一実施形態に係る糸状菌用プロモーターによれば、糸状菌の細胞中において、広汎なタンパク質を高発現させられることが示唆される。 From the results of Examples 1 to 3, it is suggested that the promoter for filamentous fungi according to the embodiment of the present invention can highly express a wide range of proteins in the cells of filamentous fungi.
本発明は、例えば、糸状菌を用いたタンパク質の生産に利用できる。 The present invention can be used, for example, for the production of proteins using filamentous fungi.
１ ｇｐｄＡプロモーター由来配列
２ ａｄｈプロモーター由来配列
５ エンハンサー配列
７ 目的タンパク質をコードする配列
１０ 糸状菌用プロモーター
1 gpdA promoter-derived
Claims (6)
ｇｐｄＡプロモーター由来配列、エンハンサー配列、およびａｄｈプロモーター由来配列がこの順序で連結されてなるポリヌクレオチドを含み、
上記ｇｐｄＡプロモーター由来配列は、下記（Ａ１）～（Ａ４）のいずれかであり、
上記ａｄｈプロモーター由来配列は、下記（Ｂ１）～（Ｂ４）のいずれかであることを特徴とする、糸状菌用プロモーター：
（Ａ１）配列番号１に示される塩基配列のうち、第１位～第５９９位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ａ２）上記（Ａ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ当該ポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および下記（Ｂ１）のポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ３）上記（Ａ１）に示される塩基配列において１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ａ４）上記（Ａ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ１）配列番号２に示される塩基配列のうち、第８３１位～第９０７位を少なくとも含むポリヌクレオチド；
（Ｂ２）上記（Ｂ１）に示される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ａ１）のポリヌクレオチド、エンハンサー配列、および当該ポリヌクレオチドがこの順序で連結された場合において、糸状菌細胞内でプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ３）上記（Ｂ１）に示される塩基配列のうち、１または複数個の塩基が置換、欠失または付加されたポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド；
（Ｂ４）上記（Ｂ１）に示される塩基配列との配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチドであり、かつ上記（Ｂ２）と同条件におけるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド。 A promoter for filamentous fungi having promoter activity in the filamentous fungus cell.
It contains a polynucleotide consisting of a gpdA promoter-derived sequence, an enhancer sequence, and an adh promoter-derived sequence linked in this order.
The above-mentioned gpdA promoter-derived sequence is one of the following (A1) to (A4).
The sequence derived from the adh promoter is one of the following (B1) to (B4), and the promoter for filamentous fungi:
(A1) Of the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, a polynucleotide containing at least positions 1 to 599;
(A2) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (A1) above, and the polynucleotide, enhancer sequence, and polynucleotide of the following (B1). A polynucleotide having promoter activity in filamentous fungal cells when linked in this order;
(A3) A polynucleotide in which one or more bases are substituted, deleted or added in the base sequence shown in (A1) above, and has promoter activity under the same conditions as in (A2) above;
(A4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (A1) above, and having promoter activity under the same conditions as in (A2) above;
(B1) Of the base sequences shown in SEQ ID NO: 2, a polynucleotide containing at least positions 831 to 907;
(B2) A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence shown in (B1) above, and the polynucleotide, enhancer sequence, and said polynucleotide of (A1) above. A polynucleotide having promoter activity in filamentous fungal cells when linked in this order;
(B3) Of the base sequences shown in (B1) above, a polynucleotide in which one or more bases are substituted, deleted or added, and has promoter activity under the same conditions as in (B2) above. ;
(B4) A polynucleotide having a sequence identity of 90% or more with the base sequence shown in (B1) above, and having promoter activity under the same conditions as in (B2) above.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020198980A JP2022086783A (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Promoter for filamentous fungi and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020198980A JP2022086783A (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Promoter for filamentous fungi and use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022086783A true JP2022086783A (en) | 2022-06-09 |
Family
ID=81894407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020198980A Pending JP2022086783A (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Promoter for filamentous fungi and use thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2022086783A (en) |
-
2020
- 2020-11-30 JP JP2020198980A patent/JP2022086783A/en active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6814142B2 (en) | Fungal Genome Modification System and Usage | |
| US20120041171A1 (en) | Process for the production of a recombinant polypeptide of interest | |
| CN107223157B (en) | Compositions and methods for helper-strain-mediated modification of fungal genomes | |
| EP2456872B1 (en) | Improved host cell for the production of a compound of interest | |
| EP2875119B1 (en) | Agse-deficient strain | |
| JP2002509698A (en) | Expression cloning in filamentous fungi | |
| JP2008531031A (en) | Aspergillus promoter for gene expression in fungal cells | |
| Navarro et al. | Posttranscriptional control mediates cell type-specific localization of catalase A during Aspergillus nidulans development | |
| EP4092128A1 (en) | Factor regulating protein expression efficiency of trichoderma reesei, and regulation method and use thereof | |
| US20080070277A1 (en) | Homologous Amds Genes as Selectable Marker | |
| Welsch et al. | Stepwise optimization of a low-temperature Bacillus subtilis expression system for “difficult to express” proteins | |
| US20130196374A1 (en) | Cis-acting element and use thereof | |
| JP2002515252A (en) | Methods for producing polypeptides in filamentous fungal mutant cells | |
| JP2022086783A (en) | Promoter for filamentous fungi and use thereof | |
| JP3343567B2 (en) | Filamentous fungal enhancer DNA base sequence and its use | |
| JP5763900B2 (en) | Plasmid for transforming filamentous fungi and method for transforming filamentous fungi using the same | |
| US20220267783A1 (en) | Filamentous fungal expression system | |
| JP5105691B2 (en) | Cyclic nucleotide derived from Aspergillus filamentous fungi, method for producing Aspergillus filamentous fungus self-cloning strain, and self-cloning strain | |
| JP5686974B2 (en) | New terminators and their use | |
| JP5507062B2 (en) | High expression promoter | |
| US5650294A (en) | Isolated promoter and terminator of elongation factor 1-α | |
| BR112021014923A2 (en) | CHIMERIC PROMOTER FOR USE IN METABOLIC ENGINEERING | |
| CN112105740A (en) | Long-chain non-coding RNA expression in fungal hosts | |
| JP4413557B2 (en) | Efficient production of proteins using filamentous fungi | |
| JP2013051893A (en) | New promoter and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230529 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240417 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240423 |