JP2022078362A - ケモカイン産生促進剤、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬及び抗腫瘍免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

【課題】癌の微小環境における抗腫瘍免疫を増強することができるケモカイン産生促進剤、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬及び抗腫瘍免疫賦活剤を提供する。【解決手段】ケモカイン産生促進剤は、糖誘導体を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、ケモカイン産生促進剤、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬及び抗腫瘍免疫賦活剤に関する。

癌に対する治療法として、免疫チェックポイント阻害剤が期待されている。免疫チェックポイント阻害剤は、癌細胞による免疫チェックポイント分子を介した免疫抑制機構を阻害し、免疫系による抗腫瘍効果をもたらす。

進行性癌の微小環境では免疫抑制機構が亢進している。例えば、非特許文献１では、癌細胞における解糖系の活性化によって抗腫瘍免疫が抑制されることが報告されている。非特許文献２には、癌の微小環境では、癌細胞におけるグルコース代謝が亢進しているため、Ｔ細胞へのグルコースの供給量が低下することでＴ細胞の活性が低下することが示唆されている。

Ｔｉｎａ Ｃａｓｃｏｎｅ、外３６名、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｕｍｏｒ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２０１８年、２７、ｐ．９７７－９８７ Ｃｈｉｈ－Ｈａｏ Ｃｈａｎｇ、外１３名、「Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｓ ａ ｄｒｉｖｅｒ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ、２０１５年、１６２、ｐ．１２２９－１２４１

癌細胞に対するＴ細胞の走化性の亢進は、癌の微小環境における抗腫瘍免疫の活性化に重要である。非特許文献１には、７５種類の細胞走化性因子（ケモカイン）及びサイトカインの発現量を検討したところ、解糖系活性の低いメラノーマ細胞では解糖系活性の高いメラノーマ細胞よりも、Ｔ細胞の走化性を亢進するＣＸＣＬ１０が多く産生されることが示されている。非特許文献１では、細胞外酸性化速度を指標に抽出した解糖系活性の低いメラノーマ細胞によるケモカインの産生量が評価されているものの、癌細胞の解糖系を阻害することによるケモカインの産生量への影響は検討されていない。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、癌の微小環境における抗腫瘍免疫を増強することができるケモカイン産生促進剤、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬及び抗腫瘍免疫賦活剤を提供することを目的とする。

本発明者は、鋭意研究を重ね、癌細胞における解糖系の阻害によって、癌細胞によるケモカインの産生及びＴ細胞の走化性が亢進することに加え、癌細胞とＴ細胞の間における糖代謝バランスへの介入で抗腫瘍免疫が増強されることを見出し、本発明を完成させた。

本発明の第１の観点に係るケモカイン産生促進剤は、
糖誘導体を含む。

この場合、上記本発明の第１の観点に係るケモカイン産生促進剤は、
癌細胞からのＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の産生を促進する、
こととしてもよい。

また、上記本発明の第１の観点に係るケモカイン産生促進剤は、
乳酸・グリコール酸共重合体を含有する生体適合性粒子をさらに含み、
前記糖誘導体は、
前記生体適合性粒子に封入されている、
こととしてもよい。

本発明の第２の観点に係る免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬は、
糖誘導体を含む。

本発明の第３の観点に係る抗腫瘍免疫賦活剤は、
糖誘導体を含み、
免疫チェックポイント阻害剤と併用される。

上記本発明の第１の観点に係るケモカイン産生促進剤、上記本発明の第２の観点に係る免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬又は上記本発明の第３の観点に係る抗腫瘍免疫賦活剤において、
前記糖誘導体は、
２－デオキシ－Ｄ－グルコースである、
こととしてもよい。

本発明によれば、癌の微小環境における抗腫瘍免疫を増強することができる。

試験例１に係る肝癌細胞からのケモカインの分泌量に及ぼす２－デオキシ－Ｄ－グルコース（以下、単に「２ＤＧ」とする）の影響を示す図である。（Ａ）はＣＸＣＬ１０の分泌量を示す図である。（Ｂ）はＣＸＣＬ９の分泌量を示す図である。 試験例１に係る２ＤＧによる肝癌細胞へのＴ細胞の走化性の亢進を示す図である。 試験例１に係るＶｅｌｏｃｉｔｙ－Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ（Ｖ－Ｄ）プロットを示す図である。 試験例１に係るＴ細胞の移動速度を示す図である。 試験例１に係るＴ細胞の移動の方向性を示す図である。 試験例２に係る２ＤＧナノ粒子の粒度分布を示す図である。 試験例２に係る２ＤＧナノ粒子による肝癌細胞へのＴ細胞の走化性の亢進を示す図である。 試験例２に係るＶ－Ｄプロットを示す図である。 試験例２に係るＴ細胞の移動速度を示す図である。 試験例２に係るＴ細胞の移動の方向性を示す図である。 試験例２に係る肝癌細胞からの乳酸産生量を示す図である。 試験例２に係るＴ細胞からのＩＦＮγのｍＲＮＡの相対的な発現量を示す図である。 試験例２に係る肝癌細胞の２－ＮＢＤＧの相対的な取り込み量を示す図である。 試験例２に係るＴ細胞の２－ＮＢＤＧの相対的な取り込み量を示す図である。 試験例３に係る肝発癌マウスの肝臓の腫瘍の外観を示す図である。 試験例３に係る肝発癌マウスにおける腫瘍最大径を示す図である。 試験例３に係る肝発癌マウスにおける総腫瘍体積を示す図である。 試験例３に係る腫瘍組織におけるＣＸＣＬ９のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 試験例３に係る腫瘍組織におけるＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 試験例３に係る腫瘍組織におけるＣＸＣＬ１１のｍＲＮＡ発現量を示す図である。 試験例４に係る抗ＰＤ－１抗体抵抗性マウスの腫瘍の外観を示す図である。 試験例４に係る抗ＰＤ－１抗体抵抗性マウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。 試験例５に係る抗ＰＤ－１抗体抵抗性マウスの腫瘍の外観を示す図である。 試験例５に係る抗ＰＤ－１抗体抵抗性マウスにおける腫瘍体積の経時変化を示す図である。 試験例５に係る抗ＰＤ－１抗体抵抗性マウスの免疫染色した肝腫瘍組織を示す図である。 図２５に示す肝腫瘍組織におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞数を示す図である。 試験例６に係る肝発癌マウスの肝臓の腫瘍の外観を示す図である。 試験例６に係る肝発癌マウスにおける腫瘍最大径を示す図である。 試験例６に係る肝発癌マウスにおける総腫瘍体積を示す図である。

（実施の形態）
本発明に係る実施の形態について説明する。本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、糖誘導体を有効成分として含む。糖誘導体は、例えば解糖系を阻害するＤ－グルコースの誘導体である。好ましくは、糖誘導体は、グルコース環の２位においてヒドロキシル基を有さないグルコース誘導体である。グルコース誘導体としては、マンノース、ガラクトース及び５－チオ－グルコースが挙げられる。グルコース誘導体は、グルコース環上の任意の位置における水素の代わりにフッ素を有してもよい。フッ素を有するグルコース誘導体としては、例えば、２－フルオロ－２－デオキシ－Ｄ－グルコース及び２－ジフルオロ－２－Ｄ－デオキシ－グルコース等が挙げられる。

グルコース誘導体は、グルコース環上の６位以外の任意の位置において水酸基の代わりにアミノ基を有してもよい。アミノ基を有するグルコース誘導体としては、例えば、２－アミノ－２－デオキシ－Ｄ－グルコース及び２－アミノ－２－デオキシ－Ｄ－ガラクトース等が挙げられる。上記の他にグルコース誘導体として、２－Ｆ－マンノース、２－マンノサミン、２－デオキシガラクトース、２－Ｆ－デオキシガラクトース等が例示される。好適には、糖誘導体はグルコースの誘導体である２ＤＧである。２ＤＧは、グルコーストランスポーターを介して癌細胞内に取り込まれる。癌細胞内に蓄積した２ＤＧは解糖系を阻害する。

好ましくは、ケモカイン産生促進剤は、乳酸・グリコール酸共重合体（ポリラクチドグリコライド共重合体ともいう。以下、単に「ＰＬＧＡ」という）を含有する生体適合性粒子をさらに含む。生体適合性粒子は、生体への刺激又は毒性が低く、かつ投与後分解して代謝される性質を備える粒子である。糖誘導体は生体適合性粒子に封入されている。

ＰＬＧＡは、例えば１：９９～９９：１、好ましくは７５：２５、より好ましくは３：１の割合で、乳酸又はラクチドと、グリコール酸又はグリコライドと、からなるコポリマーである。ＰＬＧＡは、任意のモノマーから公知の方法で合成してもよいし、市販のＰＬＧＡを使用してもよい。市販のＰＬＧＡとしては、例えばＰＬＧＡ７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬社製）が挙げられる。乳酸及びグリコール酸の含有量が２５重量％～６５重量％であるＰＬＧＡは非晶質であり、アセトン等の有機溶媒に可溶である点で好ましい。

生体適合性粒子の粒径は、１０００ｎｍ未満で、例えば２．５～９００ｎｍ、好ましくは２５～５００ｎｍ又は５０～３００ｎｍ、より好ましくは１００～２５０ｎｍ、さらに好ましくは１３０～２００ｎｍ、特に好ましくは１５０～１８０ｎｍである。生体適合性粒子の粒径は、ふるい分け法、沈降法、顕微鏡法、光散乱法、レーザー回折・散乱法、電気的抵抗試験、透過型電子顕微鏡による観察、及び走査型電子顕微鏡による観察等で測定できる。粒径は粒度分布計で測定してもよい。粒径は、測定方法に応じて、ストーク相当径、円相当径及び球相当径で表すことができる。また、粒径は、複数の粒子を測定対象として、平均で表した平均粒径、体積平均粒径及び面積平均粒径等であってもよい。また、粒径は、レーザー回折・散乱法等の測定に基づく個数分布等から算出される平均粒径であってもよい。

具体的には、粒子の集団の全体積を１００％として累積カーブを求めたとき、その累積カーブが５０％となる点の粒径である５０％径（Ｄ_５０）を粒径としてもよい。累積カーブ及びＤ_５０は、市販の粒度分布計を用いて求めることができる。粒度分布計としては、例えば、ＮＩＫＫＩＳＯ Ｎａｎｏｔｒａｃ Ｗａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）が挙げられる。

上記生体適合性粒子は、表面をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾してもよい。例えば、上記生体適合性粒子の製造に、ＰＬＧＡのＰＥＧ修飾体を用いることで、表面がＰＥＧで修飾された生体適合性粒子が得られる。表面がＰＥＧで修飾されることで、生体適合性粒子の血中安定性が向上する。

糖誘導体が封入されている生体適合性粒子の製造方法として、公知の任意の製造方法を採用できる。例えば、生体適合性粒子は、水中エマルジョン法で製造できる。水中エマルジョン法では、ＰＬＧＡが溶解する良溶媒と、ＰＬＧＡが溶解しない貧溶媒の２種類の溶媒を用いる。良溶媒には、ＰＬＧＡが溶解し、かつ貧溶媒へ混和する有機溶媒を用いる。良溶媒及び貧溶媒の種類は、特に限定されない。

貧溶媒としては、水が挙げられる。貧溶媒として水を用いる場合、水に界面活性剤を添加してもよい。例えば、界面活性剤としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が好ましい。ＰＶＡ以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

良溶媒としては、低沸点かつ難水溶性の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン及びトルエン等が挙げられる。好ましくは、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトンのみ又はアセトンとエタノールとの混合液が用いられる。

水中エマルジョン法では、まず、良溶媒中にＰＬＧＡを溶解後、ＰＬＧＡが析出しないように糖誘導体溶液を良溶媒中へ添加し混合する。ＰＬＧＡと糖誘導体とを含む混合液を、撹拌下で貧溶媒中に滴下すると、混合液中の良溶媒が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の乳化が起き、良溶媒のエマルジョン滴が形成される。

さらに良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散するため、エマルジョン滴内のＰＬＧＡ及び糖誘導体の溶解度が低下する。最終的には、糖誘導体を含有する球形結晶粒子の生体適合性粒子が生成する。その後、良溶媒である有機溶媒を遠心分離又は減圧留去し、生体適合性粒子の粉末を得る。得られた粉末は、そのまま、又は必要に応じて凍結乾燥等により再分散可能な凝集粒子に複合化される。得られた生体適合性粒子における糖誘導体の含有率は、例えば０．０１～９９重量％、０．１～３０重量％、０．５～２０重量％、１～１５重量％、３～１０重量％又は５～１０重量％である。なお、ここでの糖誘導体の含有率は、生体適合性粒子の重量に対する糖誘導体の重量の割合である。含有率は、所定重量の生体適合性粒子から抽出された糖誘導体の重量を定量し、生体適合性粒子の重量に対する糖誘導体の重量の割合を算出することで求められる。

なお、生体適合性粒子における糖誘導体の含有率を高めるため、貧溶媒にカチオン性高分子を添加してもよい。カチオン性高分子としては、キトサン並びにキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース及びポリエチレンイミン、ポリビニルアミン並びにポリアリルアミン等のポリアミノ化合物等が挙げられる。

好適には、糖誘導体が封入されている生体適合性粒子は、強制薄膜式マイクロリアクターを用いて製造される。強制薄膜式マイクロリアクターを用いる場合、まず、互いに対向して配設され、少なくとも一方が他方に対して相対的に回転する処理用面間に、上述の良溶媒と貧溶媒とを導入する。これにより形成される薄膜流体中で、良溶媒と貧溶媒とを混合し、糖誘導体が封入されている生体適合性粒子を、薄膜流体中に析出させる。強制薄膜式マイクロリアクターとしては、好ましくはＵＬＲＥＡ ＳＳ－１１（エム・テクニック社製）が用いられる。

ケモカイン産生促進剤は、既知の方法で製造され、有効成分として０．０００００１～９９．９重量％、０．００００１～９９．８重量％、０．０００１～９９．７重量％、０．００１～９９．６重量％、０．０１～９９．５重量％、０．１～９９重量％、０．５～６０重量％、１～５０重量％又は１～２０重量％の糖誘導体又は糖誘導体が封入されている生体適合性粒子を含む。ケモカイン産生促進剤は、固形製剤であっても、液状製剤であってもよい。

ケモカイン産生促進剤は、糖誘導体又は生体適合性粒子に加え、薬理学上許容される担体等を含んでもよい。例えば、ケモカイン産生促進剤には、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が配合されてもよい。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤及び甘味剤等の添加物が配合されてもよい。

本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、下記試験例１及び試験例３に示すように、癌細胞からのケモカイン、特にはＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の少なくとも一つの産生を促進する。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１１がＣＤ８陽性Ｔ細胞の表面に発現している受容体ＣＸＣＲ３に結合することで、Ｔ細胞の走化性が亢進する。この結果、抗腫瘍免疫が活性化する。したがって、ケモカイン産生促進剤は、好ましくは、癌、特には固形癌の治療に用いられる。具体的には、固形癌としては、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、肝臓癌（肝癌）、腎臓癌（腎癌）、舌癌、甲状腺癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫及び平滑筋腫等が挙げられる。好適には、当該ケモカイン産生促進剤は、多血性腫瘍が形成される癌の治療に用いられる。多血性腫瘍とは、造影コンピューター断層撮影法等の造影検査において、造影にて増強される動脈血流の豊富な腫瘍である。多血性腫瘍が形成される癌種は、例えば、肝細胞癌及び腎細胞癌である。

ケモカイン産生促進剤のヒトへの投与経路は特に限定されない。ケモカイン産生促進剤は、例えば注射又は経口で投与される。ケモカイン産生促進剤の投与量は、投与対象の性別、年齢、体重及び症状等によって適宜決定される。当該ケモカイン産生促進剤は、糖誘導体が有効量となるように投与される。有効量とは、所望の結果を得るために必要な糖誘導体の量であり、治療又は処置する状態の進行の遅延、阻害、予防、逆転又は治癒をもたらすのに必要な量である。

ケモカイン産生促進剤の投与量は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回、又はそれ以上に分割して投与することができる。ケモカイン産生促進剤を分割して投与する場合、ケモカイン産生促進剤は、好ましくは１日に１～４回投与される。また、ケモカイン産生促進剤は、毎日、隔日、１週間に１回、隔週、１ヶ月に１回等の様々な投与頻度で投与してもよい。好ましくは、投与頻度は、医師等により容易に決定される。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、癌細胞からのケモカインの産生を促進する。ケモカインはＴ細胞の癌細胞への走化性を亢進するため、当該ケモカイン産生促進剤によれば、抗腫瘍免疫を増強することができる。また、別の実施の形態では、上記糖誘導体を含むＴ細胞走化性亢進剤が提供される。

本実施の形態に係る糖誘導体は、下記試験例２に示すように、Ｔ細胞からのＩＦＮγの産生を促進する。したがって、本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、ＩＦＮγ産生促進剤としても使用できる。

当該糖誘導体は、下記試験例２に示すように、癌細胞によるグルコースの取り込みを阻害する。よって、本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、グルコース取り込み阻害剤としても使用できる。癌細胞によるグルコースの取り込みが抑制されると、癌の微小環境において、Ｔ細胞によるグルコースの取り込みが相対的に増加する。このため、本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、Ｔ細胞のグルコース取り込み促進剤としても使用できる。Ｔ細胞によるグルコースの取り込みが増加することによっても、Ｔ細胞の癌細胞への走化性が亢進する。

さらに、当該糖誘導体は、下記試験例２に示すように、癌細胞における乳酸の産生を阻害する。よって、本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、乳酸産生阻害剤として使用できる。癌細胞から産生される乳酸の濃度が低下することによっても、Ｔ細胞の癌細胞への走化性は亢進する。

当該糖誘導体は、特にＰＬＧＡに封入した場合に、下記試験例３～５に示すように、癌組織におけるＣＸＣＬ９－ＣＸＣＲ３相互作用、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＲ３相互作用及びＣＸＣＬ１１－ＣＸＣＲ３相互作用を介してＴ細胞性腫瘍免疫を亢進させることで抗腫瘍効果をもたらす。したがって、本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬として使用できる。

免疫チェックポイント阻害剤は、公知のものであれば特に限定されない。例えば、免疫チェックポイント阻害剤として、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌は、有効量の免疫チェックポイント阻害剤を投与しても治療又は処置する癌の進行の遅延、阻害、逆転又は治癒の傾向がない、又は免疫チェックポイント阻害剤が有効な癌よりもその程度が小さい癌である。なお、免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌には、同じ癌種でも免疫チェックポイント阻害剤による癌の進行の遅延、阻害、逆転又は治癒の傾向が他の患者と比較して小さい場合も含まれる。免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌は、例えば、肺癌及び悪性黒色腫等である。

また、本実施の形態に係るケモカイン産生促進剤は、免疫チェックポイント阻害剤と併用される抗腫瘍免疫賦活剤としても使用できる。併用とは、所定の期間に同一患者に当該抗腫瘍免疫賦活剤と免疫チェックポイント阻害剤とを投与することをいう。併用では、抗腫瘍免疫賦活剤を免疫チェックポイント阻害剤と同時に投与することが好ましいが、一方の効果が残っている間に他方を投与する等して、時間が前後してそれぞれ単独で投与してもよい。併用においては、抗腫瘍免疫賦活剤及び免疫チェックポイント阻害剤の投与経路は同一であってもよいし、異なってもよい。例えば併用では、抗腫瘍免疫賦活剤及び免疫チェックポイント阻害剤それぞれの用量及び用法が規定された１つのレジメンに従って、所定の期間に渡って、抗腫瘍免疫賦活剤及び免疫チェックポイント阻害剤が投与される。なお、別の実施の形態では、上記抗腫瘍免疫賦活剤と併用される免疫チェックポイント阻害剤が提供される。

また、本実施の形態に係る糖誘導体は、生体適合性粒子に封入されてもよいこととした。生体適合性粒子に封入することで、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、標的組織に選択的に効率よく糖誘導体を集積させることができ、高い抗腫瘍効果が得られる。

他の実施の形態で提供される抗癌剤は、上記の糖誘導体又は糖誘導体が封入されている生体適合性粒子と、免疫チェックポイント阻害剤と、を含む。すなわち、当該抗癌剤は、糖誘導体又は糖誘導体が封入されている生体適合性粒子及び免疫チェックポイント阻害剤の両成分を単一の製剤に含む。これにより、糖誘導体と免疫チェックポイント阻害剤とを同一投与経路において同時に投与することができる。当該抗癌剤における糖誘導体と免疫チェックポイント阻害剤との重量比は特に限定されず、抗腫瘍効果等に応じて適宜調整される。

別の実施の形態では、上記の糖誘導体を患者に投与することにより、該患者の癌又は免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌を治療又は予防する方法が提供される。また、上記の糖誘導体を対象に投与することにより、対象におけるケモカインの産生を促進する方法、対象の癌細胞によるグルコースの取り込みを阻害する方法、対象のＴ細胞によるグルコース取り込みを促進する方法、対象における癌細胞からの乳酸の産生を阻害する方法、又は対象における抗腫瘍免疫を賦活する方法が提供される。

実施例を含む以下の試験例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例及び試験例によって限定されるものではない。

（試験例１：肝癌細胞の解糖系抑制によるＴ細胞走化性因子分泌を介したＴ細胞走化性亢進能の検討）
２ＤＧによる解糖系の阻害が肝癌細胞からの直接的なＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の分泌を亢進させるか否かを検討した。肝癌細胞株であるＨｕｈ７（国立大学法人東北大学 加齢医学研究所 医用細胞資源センター・細胞バンク）を２×１０^５個播種し、一晩インキュベートし生着させた。Ｈｕｈ７は、５％ＣＯ_２インキュベーターを用いて３７℃で培養した。Ｈｕｈ７の培地には、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。

２ＤＧを、０．１ｍＭ、１ｍＭ及び１０ｍＭとなるように培地に加え、２４時間インキュベートした。その後上記各培地にＩＦＮγ １００ｎｇ／ｍＬ及びＴＮＦα ５０ｎｇ／ｍＬを添加することで、Ｈｕｈ７からのＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０分泌刺激を行った。２４時間経過後の培養上清中のＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の濃度をＥＬＩＳＡ法（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ及びＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＣＸＣＬ１０／ＩＰ－１０ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ともにＲ＆Ｄ社製）にて測定した。

また、リアルタイム細胞動態解析装置（ＥＺ－ＴＡＸＩＳｃａｎ、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いて、ＩＦＮγ及びＴＮＦαによってＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０分泌刺激を受けた肝癌細胞へのＣＤ８陽性Ｔ細胞（以下、単に「Ｔ細胞」という）の走化性が２ＤＧによりさらに亢進するか否かを検討した。さらには、２ＤＧのＴ細胞走化性への影響が、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の受容体であるＣＸＣＲ３に対する中和抗体（抗ＣＸＣＲ３抗体）によりキャンセルされるか否かを検討した。

ヒト全血からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ－ＳＨＩＥＬＤ社製）にて末梢血単核球を抽出し、さらにＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）にてＴ細胞を抽出した。リアルタイム細胞動態解析装置では、４μｍ厚のチップ及びカバーグラスを使用した。リアルタイム細胞動態解析装置の各チャネルのチャンバーＡにＴ細胞を１×１０^５個ずつアプライした。各チャンネルのチャンバーＢには、試料としてＨｕｈ７含有培養上清をアプライした。チャンバーＢに含まれる細胞走化性因子としてのＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の濃度に応じて、チャンバーＡとチャンバーＢとの間に介在する微細流路にＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の濃度勾配が形成される。微細流路中に配置された水平なガラス面（テラス）をＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）カメラで撮像することで、チャンバーＡにアプライしたＴ細胞のガラス面上の動態を解析することができる。

チャンバーＢにアプライした試料は以下のように調製した。Ｈｕｈ７を５×１０^５個播種し、一晩インキュベートし生着させた後、Ｈｕｈ７を次の条件でインキュベートした。インキュベート後、剥離したＨｕｈ７を含む培養上清をチャンバーＢにアプライした。
（Ａ１）対照群 ２ＤＧ非含有培地にて４８時間インキュベートした。
（Ｂ１）ＩＦＮγ＋ＴＮＦα群 ２ＤＧ非含有培地にて２４時間インキュベート後、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγ及び５０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦαを添加し２４時間インキュベートした。
（Ｃ１）ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋２ＤＧ群 １０ｍＭ ２ＤＧ含有培地にて２４時間インキュベート後、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγ及び５０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦαを添加し２４時間インキュベートした。
（Ｄ１）ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋２ＤＧ＋抗ＣＸＣＲ３抗体群 １０ｍＭ ２ＤＧ含有培地にて２４時間インキュベート後、１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγ、５０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα及び抗ＣＸＣＲ３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し２４時間インキュベートした。

ホルダー温度を３７℃に設定して、１．５時間にわたってテラスを撮像した。得られた画像を専用ソフトウェアであるＴＡＸＩＳｃａｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いて解析した。

（結果）
図１（Ａ）及び図１（Ｂ）は、それぞれＨｕｈ７培養上清中のＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の濃度を示す。非刺激群に対し、ＩＦＮγ及びＴＮＦαによる刺激によってＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の濃度が増加した（２ＤＧ ０ｍＭ群）。ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の濃度は、２ＤＧ濃度依存的にさらに有意に増加した。

図２は、実験開始前（０時間）及び実験開始１．５時間後のＡ１～Ｄ１それぞれに対応するレーンのテラスの写真を示す図である。１．５時間後には、ＩＦＮγ＋ＴＮＦα群では、対照群と比較して、多くのＴ細胞がチャンバーＡからチャンバーＢの方向へ移動していることが観察された。ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋２ＤＧ群では、さらに多くのＴ細胞がチャンバーＡからチャンバーＢの方向へ移動していることが観察された。ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋２ＤＧ＋抗ＣＸＣＲ３抗体群においてチャンバーＡからチャンバーＢの方向へ移動したＴ細胞の個数は、ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋２ＤＧ群よりも減少した。

図３は、各レーンのテラスにおいて測定対象として無作為に抽出したＴ細胞に関するＶ－Ｄプロットを示す。測定対象としたＴ細胞の数は、レーン１で９個、レーン２で２０個、レーン３で２０個及びレーン４で１０個である。Ｖ－Ｄプロットの横軸は、測定対象としたＴ細胞１個あたり１分毎の移動の方向性を示す。細胞の移動の方向性は、チャンバーＢへの方向、すなわち細胞走化性因子への方向を１．５７ラジアン、水平方向への方向を０ラジアン、細胞走化性因子への方向とは逆の方向を－１．５７ラジアンとする。Ｖ－Ｄプロットの縦軸は、測定対象としたＴ細胞１個あたり１分毎の移動速度を示す。

図３に示されたすべての移動速度及び移動の方向性のレーンごとの平均値を、それぞれ図４及び図５に示す。対照群（レーン１）に対して、ＩＦＮγ及びＴＮＦα刺激でＴ細胞走化性は亢進した（レーン２）。Ｔ細胞走化性は、２ＤＧの投与によりさらに亢進した（レーン３）。Ｔ細胞走化性は、抗ＣＸＣＲ３抗体の併用によりキャンセルされた（レーン４）。以上の結果より、２ＤＧは、肝癌細胞におけるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の分泌を促進させることで、Ｔ細胞の走化性を亢進させることが証明された。

（試験例２：肝癌細胞と共培養したＴ細胞の機能に２ＤＧ－ＰＬＧＡが及ぼす効果についての検討）
ＵＬＲＥＡ ＳＳ－１１（エム・テクニック社製）を使用して、以下のように２ＤＧナノ粒子（２ＤＧ－ＰＬＧＡ）を作製した。まず、Ａ液をＡ液タンクに充填し、タンクを０．３ＭＰａに加圧した。その後、設定値４３℃でＡ液を１６７ｍＬ／分で送液し、次いで設定値４１℃（実測値約２９℃）でＢ液を１００ｍＬ／分で送液した。Ａ液は０．５％ＰＶＡを含む水溶液である。また、Ｂ液は、ＰＬＧＡ：２ＤＧ：アセトン：エタノールが重量比で０．６５：０．２５：６６：３３の溶液である。回転数を１０００ｒｐｍとし、背圧を０．０２ＭＰａとした。吐出液４００．５ｍＬを回収し、吐出液からエバポレーターで８０分間、溶媒を留去した。なお、Ｂ液におけるＰＬＧＡとして、ＰＬＧＡ－７５２０（乳酸：グリコール酸＝７５：２５、平均重量分子量２０，０００、和光純薬社製）を用いた。得られた２ＤＧ－ＰＬＧＡ水性分散液２２４ｍＬを凍結乾燥し、２．１６ｇの２ＤＧ－ＰＬＧＡを得た。

上記で調製した２ＤＧ－ＰＬＧＡ３．７ｍｇをチューブに量りとり、ミリＱ水３．７ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、５分間超音波処理を行った。ミリＱ水を対照とし、２ＤＧ－ＰＬＧＡの粒度分布をＮＩＫＫＩＳＯ Ｎａｎｏｔｒａｃ Ｗａｖｅ－ＥＸ１５０（日機装社製）で測定した。

２ＤＧ－ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率は、以下のように評価した。まず、標準溶液を調製した。２００ｍｇの２ＤＧを１００ｍＬメスフラスコに量りとり、水５０ｍＬを加えて溶解した。次にアセトニトリルを用いて１００ｍＬにメスアップし、標準原液（２０００μｇ／ｍＬ）とした。標準原液を２５０、１２５、６２．５、３１．２５μｇ／ｍＬになるようにアセトニトリル：水（１：１）を用いて段階希釈し、標準溶液とした。

試料溶液の調製では、試料として約２０ｍｇの２ＤＧ－ＰＬＧＡを量りとり、ミリＱ水１０ｍＬを加えた。ボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、３０分間超音波処理し試料原液とした。試料原液１．０ｍＬにアセトニトリルを加え２ｍＬとした。この液を２０℃、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した。遠心後の上澄み液を、０．２μｍメンブレンフィルターを用いてろ過し、得られたろ液を試料溶液とした。試料溶液についてはｎ＝３で試験を実施した。標準溶液及び試料溶液を下記条件にて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、標準溶液の検量線から試料溶液中の２ＤＧの濃度を計算により求めた。上記の２ＤＧ－ＰＬＧＡの重量及び２ＤＧの濃度に基づいて２ＤＧの含有率を算出した。

ＨＰＬＣの条件
機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ １０Ａ ｓｅｒｉｅｓ（島津製作所社製）
検出：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＥＬＳＤ－ＬＴ
ゲイン：８
ドリフト温度：４０℃
ガス圧力：３５０ｋＰａ（実測３５８ｋＰａ）
ネブライザーガス：Ｎ２
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ－５０４Ｄ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ：水、Ｂ：アセトニトリル
Ｂ．濃度 ７５％→６９％（８分）６９→７５％（８分→１６分）
流量：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
注入量：２０μＬ
測定時間：１６分

２ＤＧ－ＰＬＧＡにおける２ＤＧの含有率は、８．１±０．４％であった。図６に示すように、２ＤＧ－ＰＬＧＡの粒度分布はシングルピークで、Ｄ_５０が１６６ｎｍ±５．４ｎｍ、スパン値は１．５２±０．１５であった。当該２ＤＧ－ＰＬＧＡを以下の試験例で用いた。

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を用いてＨｕｈ７と共培養したＴ細胞における細胞走化性を検討し、肝癌細胞における２ＤＧ－ＰＬＧＡによる糖代謝抑制が共培養したＴ細胞の機能に及ぼす効果を解析した。

４μｍ厚のチップ及びカバーグラスを使用した上記リアルタイム細胞動態解析装置における各チャネルのチャンバーＢに５μＭ ＣＸＣＬ１０含有培地をアプライした。Ｈｕｈ７を５×１０^５個播種し、一晩インキュベートすることで生着させた後に、チャンバーＡにアプライするＴ細胞を以下のように調製した。なお、下記の操作で用いたＴ細胞は試験例１と同様に抽出した。
（Ａ２）ＰＬＧＡ＋グルコースなし群 Ｈｕｈ７の培地を１０ｍＭ ＰＬＧＡを含むグルコース非含有培地に交換し、２４時間インキュベート後、１×１０^５個のＴ細胞が播種されたＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした状態で２０時間共培養を行った。
（Ｂ２）２ＤＧ－ＰＬＧＡ＋グルコースなし群 Ｈｕｈ７の培地を１０ｍＭ ２ＤＧ－ＰＬＧＡを含むグルコース非含有培地に培地交換し、２４時間インキュベート後、１×１０^５個のＴ細胞が播種されたＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした状態で２０時間共培養を行った。
（Ｃ２）ＰＬＧＡ＋グルコースあり群 Ｈｕｈ７の培地を１０ｍＭ ＰＬＧＡ及び９００ｍｇ／ｄＬ グルコースを含む培地に交換し、２４時間インキュベート後、１×１０^５個のＴ細胞が播種されたＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした状態で２０時間共培養を行った。
（Ｄ２）２ＤＧ－ＰＬＧＡ＋グルコースあり群 Ｈｕｈ７の培地を１０ｍＭ ２ＤＧ－ＰＬＧＡ及び９００ｍｇ／ｄＬ グルコースを含む培地に交換し、２４時間インキュベート後、１×１０^５個のＴ細胞が播種されたＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした状態で２０時間共培養を行った。

上記Ａ２～Ｄ２について、共培養後、剥離したＨｕｈ７を含む培養上清をチャンバーＡにアプライした。ホルダー温度を３７℃に設定して、２時間にわたってテラスを撮像した。得られた画像をＴＡＸＩＳｃａｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２を用いて解析した。

上記Ａ２～Ｄ２について、ＰＬＧＡ又は２ＤＧ－ＰＬＧＡ投与から２４時間後のＨｕｈ７培養上清中の乳酸産生量を測定した（Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）。

また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに播種するＴ細胞を１×１０^６個とし、かつＨｕｈ７とＴ細胞との共培養時間を４時間とする点を除いて、Ａ２～Ｄ２と同様にそれぞれ調製したＴ細胞（Ａ３～Ｄ３）を得た。Ａ３～Ｄ３のＴ細胞について、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてｃＤＮＡ合成後に、リアルタイムＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）にて、β－アクチンのｍＲＮＡで補正したＩＦＮγ ｍＲＮＡの発現量を比較した（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ａｓｓａｙ ＩＤ；Ｈｓ００９８９２９１＿ｍ１（ＩＦＮγ）、Ｈｓ０１０６０６６５＿ｍ１（β－アクチン）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）。

Ｈｕｈ７を５×１０^４個播種し、一晩インキュベートすることで生着させた後に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに播種するＴ細胞を５×１０^５個とする点を除いて、Ａ３～Ｄ３と同様にそれぞれ調製したＴ細胞（Ａ４～Ｄ４）を得た。Ａ４～Ｄ４のＴ細胞に関して、蛍光性グルコースアナログである２－ＮＢＤＧ（２－ｄｅｏｘｙ－２－［（７－ｎｉｔｒｏ－２，１，３－ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ－４－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いてグルコース取り込み量を評価した。詳細には、Ｔ細胞の培地を、２－ＮＢＤＧ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）含有培地に交換し、１６時間インキュベートし、Ｈｕｈ７とＴ細胞とを分離した。その後、Ｈｕｈ７における単位タンパク質あたりの２－ＮＢＤＧの取り込み量及びＴ細胞における単位細胞あたりの２－ＮＢＤＧの取り込み量について、蛍光マイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯ ｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ ｓｙｓｔｅｍ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて４群間で相対比較を行った。

（結果）
図７は、実験開始前（０時間）及び実験開始２時間後のテラスの写真を示す図である。ＰＬＧＡ＋グルコースなし群及び２ＤＧ－ＰＬＧＡ＋グルコースなし群では、ＣＸＣＬ１０をアプライしたチャンバーＢの方向に移動したＴ細胞はほとんど見られなかった。ＰＬＧＡ＋グルコースあり群では、Ｔ細胞がチャンバーＢの方向へ移動していることが観察された。２ＤＧ－ＰＬＧＡ＋グルコースあり群では、さらに多くのＴ細胞がチャンバーＢの方向へ移動していた。

図８は、上記試験例１と同様にＶ－Ｄプロットを示す図である。測定対象としたＴ細胞の数は、レーン１で５個、レーン２で５個、レーン３で１５個及びレーン４で１５個である。当該Ｖ－Ｄプロットの横軸及び縦軸は、測定対象としたＴ細胞１個あたり１分毎の移動の方向性及び測定対象としたＴ細胞１個あたり１分毎の移動速度をそれぞれ示す。図８に示されたすべての移動速度及び移動の方向性のレーンごとの平均値を、それぞれ図９及び図１０に示す。グルコースありの条件では、方向性及び移動速度いずれの細胞走化性指標においても、ＰＬＧＡ＋グルコースあり群よりも２ＤＧ－ＰＬＧＡ＋グルコースあり群で高い値を示した。

上記Ａ２～Ｄ２の各群におけるＰＬＧＡ又は２ＤＧ－ＰＬＧＡ投与から２４時間後のＨｕｈ７培養上清中の乳酸産生量の結果を図１１に示す。グルコースなしの条件ではＰＬＧＡ及び２ＤＧ－ＰＬＧＡ投与いずれにおいても有意な乳酸産生は見られなかった。グルコースありの条件では、ＰＬＧＡを投与することで増加した乳酸産生量が２ＤＧ－ＰＬＧＡの投与で有意に抑制された。

上記Ａ３～Ｄ３の各群におけるＨｕｈ７との共培養４時間後の時点でのＴ細胞におけるＩＦＮγ ｍＲＮＡの相対的な発現量を図１２に示す。グルコースなし及びグルコースありのいずれにおいても、ＩＦＮγ ｍＲＮＡの発現量はＰＬＧＡを投与した場合と比較して、２ＤＧ－ＰＬＧＡを投与した場合に有意に増加していた。

上記Ａ４～Ｄ４におけるＨｕｈ７の２－ＮＢＤＧの相対的な取り込み量を図１３に示す。グルコースなし及びグルコースありのいずれにおいても、Ｈｕｈ７の２－ＮＢＤＧ取り込み量は、ＰＬＧＡを投与した場合と比較して、２ＤＧ－ＰＬＧＡを投与した群で減少した。特に、グルコースありの条件下では、Ｈｕｈ７における２－ＮＢＤＧ取り込み量の減少は、ＰＬＧＡを投与した場合に対して２ＤＧ－ＰＬＧＡを投与した場合に有意に減少した。

図１４は、上記Ａ４～Ｄ４におけるＴ細胞の２－ＮＢＤＧの相対的な取り込み量を示す。グルコースなし及びグルコースありのいずれにおいても、Ｔ細胞の２－ＮＢＤＧ取り込み量は、ＰＬＧＡを投与した場合と比較して、２ＤＧ－ＰＬＧＡを投与した群で有意に増加した。

以上の結果より、高濃度グルコース環境下で肝癌細胞と共培養したＴ細胞に関して、２ＤＧ－ＰＬＧＡはＴ細胞走化性及びＩＦＮγ産生量といったＴ細胞の機能を亢進させることが明らかとなった。また、その機序の一つとして、癌の微小環境における肝癌細胞のグルコース取り込み量の低下に伴う相対的なＴ細胞のグルコース取り込み量の増加、又は肝癌細胞からの乳酸産生量低下に伴うＴ細胞の機能の活性化が関与していると考えられた。

（試験例３：免疫応答性肝発癌マウスに対する２ＤＧのＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の発現増強を介した抗腫瘍効果の検討）
肝発癌モデル動物であるＳＴＡＭ（ＳＴｅｌｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ）マウスは、生後２日齢のＣ５７ＢＬ６／Ｎマウス雄に２００μｇのストレプトゾトシンを皮下注射し、出生から４週目に離乳を行い、餌を高脂肪食に切り替えることにより作製される。ＳＴＡＭマウス（ＳＭＣラボラトリーズ社製）雄１２週齢を、以下の２群に群分けした。

（ａ１）ＰＬＧＡ群 ８００ｍｇ／ｋｇ／日でＰＬＧＡを週１回尾静脈投与した。
（ｂ１）２ＤＧ－ＰＬＧＡ群 ８００ｍｇ／ｋｇ／日で２ＤＧ－ＰＬＧＡを週１回尾静脈投与した。

なお、ｂ１の２ＤＧ－ＰＬＧＡは、毎回投与前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液とし、１匹につき１回あたり２００μＬ投与した。２ＤＧ－ＰＬＧＡにおける２ＤＧ充填率が約８％であることを考慮すると、ｂ１におけるマウス１匹あたりの実質的な２ＤＧ単回投与量は約１．６ｍｇに相当する。

ａ１及びｂ１において、投与開始から２１日目に肝臓全体を観察し、肝臓内の腫瘍最大径、腫瘍個数及び総腫瘍体積を計測した。また、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてａ１及びｂ１における腫瘍組織からｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてｃＤＮＡ合成後に、リアルタイムＰＣＲにて、β－アクチンのｍＲＮＡで補正したＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１のｍＲＮＡの発現量を比較した（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ、Ａｓｓａｙ ＩＤ；Ｍｍ００４３４９４６＿ｍ１（ＣＸＣＬ９）、Ｍｍ００４４５２３５＿ｍ１（ＣＸＣＬ１０）、Ｍｍ００４４４６６２＿ｍ１（ＣＸＣＬ１１）及びＭｍ０２６１９５８０＿ｇ１（β－アクチン）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）

（結果）
投与開始２１日後の肝臓における腫瘍が図１５の矢印によって示されている。図１６及び図１７は、それぞれ投与開始２１日後の腫瘍最大径及び総腫瘍体積を示す。ＰＬＧＡ群と比べて２ＤＧ－ＰＬＧＡ群では腫瘍最大径及び総腫瘍体積を有意に減少させた。さらに、図１８、図１９及び図２０は、各群での腫瘍組織におけるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１のｍＲＮＡ発現量をそれぞれ示す。ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１のｍＲＮＡ発現量はＰＬＧＡ投与群と比べて２ＤＧ－ＰＬＧＡ投与群で有意に増加していた。

ＳＴＡＭマウスは、Ｔ細胞免疫も含めて免疫不全ではないマウスである。よって、免疫応答性の肝発癌マウスモデルに対する２ＤＧ－ＰＬＧＡによるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１発現亢進を介した抗腫瘍効果が証明された。

（試験例４：抗ＰＤ－１抗体抵抗性マウスにおける２ＤＧ及び２ＤＧ－ＰＬＧＡの抗腫瘍効果の検討）
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性）に抗ＰＤ－１抗体抵抗性悪性黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０を１×１０^７個皮下移植した。移植した細胞の生着及び増殖を確認するために、腫瘍サイズをノギスで計測し、腫瘍の体積が１００～１５０ｍｍ^２となった時点で以下の７群に群分けした。
（ａ２）対照群 ２００μｇのｉｓｏｔｙｐｅ ｒａｔ ＩｇＧを３日毎に腹腔内投与した。
（ｂ２）ＰＬＧＡ群 ２００μｇのｉｓｏｔｙｐｅ ｒａｔ ＩｇＧを３日毎の腹腔内投与に加えて、ＰＬＧＡ８００ｍｇ／ｋｇ／日を週１回尾静脈投与した。
（ｃ２）２ＤＧ群 ２００μｇのｉｓｏｔｙｐｅ ｒａｔ ＩｇＧを３日毎の腹腔内投与に加えて、１００ｍｇ／ｋｇ／日で２ＤＧを連日腹腔内投与した。
（ｄ２）２ＤＧ－ＰＬＧＡ群 ２００μｇのｉｓｏｔｙｐｅ ｒａｔ ＩｇＧを３日毎の腹腔内投与に加えて、８００ｍｇ／ｋｇ／日で２ＤＧ－ＰＬＧＡを週１回尾静脈投与した。
（ｅ２）抗ＰＤ－１抗体群 ２００μｇの抗ＰＤ－１抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社製）を３日毎に腹腔内投与した。

なお、ｃ２において１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与された２ＤＧの実質的な単回投与量は、平均体重２７ｇとするマウス１匹あたりのとしては約２．７ｍｇに相当する。ｂ２のＰＬＧＡ及びｄ２の２ＤＧ－ＰＬＧＡは、毎回投与前にＰＢＳにて１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液とし、１匹につき１回あたり２００μＬ投与した。２ＤＧ－ＰＬＧＡにおける２ＤＧ充填率が約８％であることを考慮すると、上記ｄ２におけるマウス１匹あたりの実質的な２ＤＧ単回投与量は約１．６ｍｇに相当し、ｃ２の約６０％程度となる。

ａ２～ｅ２において、投与開始から３日毎に腫瘍体積を計測し、腫瘍体積の経時的推移を評価した。また、投与１２日後に腫瘍を採取し肉眼で観察し、血液採取等を行った。

（結果）
図２１及び図２２には、それぞれ投与開始１２日後の腫瘍の外観及び腫瘍体積の経時変化が示されている。対照群、ＰＬＧＡ群及び抗ＰＤ－１抗体群と比べて、２ＤＧ群では、悪性黒色腫細胞の腫瘍が小さく、腫瘍体積の増大が抑制された。さらに、対照群、ＰＬＧＡ群及び抗ＰＤ－１抗体群と比べて、２ＤＧ－ＰＬＧＡ群では、悪性黒色腫細胞の腫瘍が明らかに小さく、腫瘍体積の増大が有意に抑制された。

（試験例５：抗ＰＤ－１抗体抵抗性マウスにおける２ＤＧ－ＰＬＧＡによるＴ細胞性腫瘍免疫を介した抗腫瘍効果の検討）
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性）にＢ１６Ｆ１０を１×１０^６個皮下移植した。移植した細胞の生着及び増殖を確認するために、腫瘍サイズをノギスで計測し、腫瘍の体積が１００～１５０ｍｍ^２となった時点で以下の４群に群分けした。
（ａ３）対照群 ８００ｍｇ／ｋｇ／日でＰＬＧＡを週１回尾静脈注射した。また、２００μｇのｉｓｏｔｙｐｅ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧをＰＬＧＡ初回投与前日以降３日毎に腹腔内投与した。
（ｂ３）抗ＣＸＣＲ３抗体群 ８００ｍｇ／ｋｇ／日でＰＬＧＡを週１回尾静脈注射した。また、２００μｇの抗ＣＸＣＲ３抗体をＰＬＧＡ初回投与前日以降３日毎に腹腔内投与した。
（ｃ３）２ＤＧ－ＰＬＧＡ群 ８００ｍｇ／ｋｇ／日で２ＤＧ－ＰＬＧＡを週１回尾静脈注射した。また、２００μｇのｉｓｏｔｙｐｅ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧを２ＤＧ－ＰＬＧＡ初回投与前日以降３日毎に腹腔内投与した。
（ｄ３）２ＤＧ－ＰＬＧＡ＋抗ＣＸＣＲ３抗体群 ８００ｍｇ／ｋｇ／日で２ＤＧ－ＰＬＧＡを週１回尾静脈注射した。また、２００μｇの抗ＣＸＣＲ３抗体を２ＤＧ－ＰＬＧＡ初回投与前日以降３日毎に腹腔内投与した。

なお、ａ３及びｂ３のＰＬＧＡ及びｃ３及びｄ３の２ＤＧ－ＰＬＧＡは、毎回投与前にＰＢＳにて１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液とし、１匹につき１回あたり２００μＬを投与した。２ＤＧ－ＰＬＧＡにおける２ＤＧ充填率が約８％であることを考慮すると、ｃ３及びｄ３におけるマウス１匹あたりの実質的な２ＤＧ単回投与量は約１．６ｍｇに相当する。

ａ３～ｄ３において、投与開始から３日毎に腫瘍体積を計測し、腫瘍体積の経時的推移を評価した。また、投与１２日後に腫瘍を採取し肉眼で観察し、血液採取等を行った。また、肝腫瘍組織に対してＲａｂｂｉｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＣＤ３抗体（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ社製）を用いて免疫染色を行った。

（結果）
図２３及び図２４には、それぞれ投与開始１２日後の腫瘍の外観及び腫瘍体積の経時変化が示されている。対照群及び抗ＣＸＣＲ３抗体群と比べて、２ＤＧ－ＰＬＧＡ群では、悪性黒色腫細胞の腫瘍が明らかに小さく、腫瘍体積の増大が有意に抑制された。一方、２ＤＧ－ＰＬＧＡ＋抗ＣＸＣＲ３抗体群では腫瘍体積増大の抑制効果が一部低下した。

肝腫瘍組織の免疫染色の結果を図２５に示す。図２５における矢印はＣＤ３陽性Ｔ細胞を示す。図２６は、ＨＰＦ（高倍率視野）当たりのＣＤ３陽性Ｔ細胞数の細胞数を示す。対照群及び抗ＣＸＣＲ３抗体群と比べて、２ＤＧ－ＰＬＧＡ群において、腫瘍内部への有意なＴ細胞浸潤の亢進が認められた。また、２ＤＧ－ＰＬＧＡによる腫瘍内部へのＴ細胞浸潤の亢進は抗ＣＸＣＲ３抗体によって抑制された。本試験例の結果と試験例３の結果より、２ＤＧ－ＰＬＧＡの抗腫瘍効果に関して、癌組織におけるＣＸＣＬ９－ＣＸＣＲ３相互作用、ＣＸＣＬ１０－ＣＸＣＲ３相互作用及びＣＸＣＬ１１－ＣＸＣＲ３相互作用を介したＴ細胞性腫瘍免疫の関与が示された。

（試験例６：肝発癌マウスに対する２ＤＧ－ＰＬＧＡ及び抗ＰＤ－１抗体の併用効果の検討
ＳＴＡＭマウス（ＳＭＣラボラトリーズ社製）雄１２週齢を、以下の４群に群分けした。
（ａ４）対照群 ２００μｇのｉｓｏｔｙｐｅ ｒａｔ ＩｇＧを３日毎に腹腔内投与した。
（ｂ４）抗ＰＤ－１抗体群 ２００μｇの抗ＰＤ－１抗体を３日毎に腹腔内投与した。
（ｃ４）抗ＰＤ－１抗体＋２ＤＧ群 ２００μｇの抗ＰＤ－１抗体を３日毎の腹腔内投与に加えて、１００ｍｇ／ｋｇ／日で２ＤＧを連日腹腔内投与した。
（ｄ４）抗ＰＤ－１抗体＋２ＤＧ－ＰＬＧＡ群 ２００μｇの抗ＰＤ－１抗体を３日毎の腹腔内投与に加えて、８００ｍｇ／ｋｇ／日で２ＤＧ－ＰＬＧＡを週１回尾静脈投与した。

なお、ｃ４で投与された１００ｍｇ／ｋｇ／日で投与された２ＤＧの実質的な単回投与量は、上記ｃ２と同様に約２．７ｍｇに相当する。ｄ４の２ＤＧ－ＰＬＧＡは、毎回投与前にＰＢＳにて１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液とし、１匹につき１回あたり２００μＬを投与した。２ＤＧ－ＰＬＧＡにおける２ＤＧ充填率が約８％であることを考慮すると、ｄ４におけるマウス１匹あたりの実質的な２ＤＧ単回投与量は約１．６ｍｇに相当し、ｃ４の約６０％程度となる。

ａ４～ｄ４において、投与開始から２１日目に肝臓全体を観察し、肝臓内の腫瘍最大径、腫瘍個数及び総腫瘍体積を計測し、血液採取等を行った。

（結果）
投与開始２１日後の肝臓における腫瘍が図２７の矢印によって示されている。図２８及び図２９は、それぞれ投与開始２１日後の腫瘍最大径及び総腫瘍体積を示す。抗ＰＤ－１抗体と２ＤＧを併用することで、腫瘍最大径及び総腫瘍体積が抗ＰＤ－１抗体群よりも低下した。さらに抗ＰＤ－１抗体と２ＤＧ－ＰＬＧＡとを併用することで、有意な総腫瘍体積の抑制が認められた。

表１は、投与開始２１日目の血清学的所見及び肝重量を示す。全群間で有意な差を認めなかった。以上より、肝発癌マウスモデルに対する２ＤＧ－ＰＬＧＡと抗ＰＤ－１抗体との併用効果が示された。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、医薬に好適である。

Claims (6)

1. 糖誘導体を含む、
   ケモカイン産生促進剤。
2. 癌細胞からのＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１の産生を促進する、
   請求項１に記載のケモカイン産生促進剤。
3. 乳酸・グリコール酸共重合体を含有する生体適合性粒子をさらに含み、
   前記糖誘導体は、
   前記生体適合性粒子に封入されている、
   請求項１又は２に記載のケモカイン産生促進剤。
4. 糖誘導体を含む、
   免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬。
5. 糖誘導体を含み、
   免疫チェックポイント阻害剤と併用される、
   抗腫瘍免疫賦活剤。
6. 前記糖誘導体は、
   ２－デオキシ－Ｄ－グルコースである、
   請求項１から３のいずれか一項に記載のケモカイン産生促進剤、請求項４に記載の免疫チェックポイント阻害剤抵抗性癌治療薬、又は請求項５に記載の抗腫瘍免疫賦活剤。

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