JP2022072905A - Protein original breed determination method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、飲食品や農作物、工業製品等に含まれているタンパク質について、その起源である生物種を判別する方法に関する。 The present invention relates to a method for discriminating the species of origin of a protein contained in foods and drinks, agricultural products, industrial products and the like.
飲食品や農作物、工業製品等に対して、原料由来や製造工程で混入した異物の検査が行われている。異物には、動植物やカビ、酵母等の微生物、ヒトの毛髪やムシ等の生物系異物と、金属類やプラスチック片等の非生物系異物がある。なかでも、飲食品や農作物における生物系異物は、異物の種類、例えば、毛髪なのか、植物片なのか、動物の肉片なのか、昆虫なのか、微生物なのか、といったことだけではなく、その異物がどの生物種由来のものかを特定することも重要である。 Food and drink, agricultural products, industrial products, etc. are inspected for foreign substances derived from raw materials and mixed in the manufacturing process. Foreign substances include microorganisms such as animals and plants, molds and yeasts, biological foreign substances such as human hair and beetles, and non-biological foreign substances such as metals and plastic pieces. Among them, biological foreign substances in foods and drinks and agricultural products are not only the types of foreign substances, such as hair, plant pieces, animal meat pieces, insects, and microorganisms, but also the foreign substances. It is also important to identify which species the species is derived from.
従来、生物系異物の解析には、外観観察による解析方法やＤＮＡを指標とした解析手法等が用いられている。外観観察は、光学顕微鏡、ＳＥＭ－ＥＤＳ（走査型電子顕微鏡）等を用いて行い、必要に応じて、ＦＴ－ＩＲ（フーリエ変換赤外分光光度計）測定も用いて、生物種の推定を行う。当該方法は、異物が特徴的な外観を保持しているときは有効であるが、形態が崩壊している場合は、異物を同定することができない。また、生物種の種レベルでの判別も困難である場合が多い。 Conventionally, for the analysis of biological foreign substances, an analysis method by observing the appearance, an analysis method using DNA as an index, and the like have been used. The appearance is observed using an optical microscope, SEM-EDS (scanning electron microscope), etc., and if necessary, the species is estimated using FT-IR (Fourier transform infrared spectrophotometer) measurement. .. This method is effective when the foreign body retains its characteristic appearance, but when the morphology is disintegrated, the foreign body cannot be identified. In addition, it is often difficult to distinguish species at the species level.
ＤＮＡを指標とした生物系異物解析は、一般的に、生物系異物の有無を分析する対象の被験試料からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型としてプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、得られた増幅産物の塩基配列を、データベース中の塩基配列データに対して相同性検索を行い、当該生物系異物の起源である生物種（起源種）を判別する（非特許文献１）。当該方法は、異物の形態が崩壊している場合であっても解析をすることができるが、レトルト処理等によってＤＮＡの断片化が進行している場合は用いることができない。また、卵のようなＤＮＡ含量が少ない生物系異物は、ＤＮＡ抽出そのものが困難である。 In the analysis of biological foreign substances using DNA as an index, generally, DNA is extracted from a test sample to be analyzed for the presence or absence of biological foreign substances, and the obtained DNA is used as a template to perform a PCR method using a primer. The nucleotide sequence of the amplified product is subjected to a homology search with respect to the nucleotide sequence data in the database to determine the biological species (origin species) that is the origin of the biological foreign substance (Non-Patent Document 1). This method can be analyzed even when the morphology of the foreign substance is disintegrated, but it cannot be used when DNA fragmentation is progressing due to retort treatment or the like. In addition, it is difficult to extract DNA from biological foreign substances such as eggs, which have a low DNA content.
また、タンパク質は、核酸と共に、生物を構成する主たる成分であり、その解析は臨床医学や創薬の研究に有用である。生体内で発現するタンパク質を検出、同定し、個々のタンパク質の機能やタンパク質同士の機能的なつながりを解明することは、新薬の開発や病気の早期診断につながることが期待される。例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析法）とデータベース検索によるペプチド分析によって、生体内で発現するタンパク質の網羅的解析を行うことができる。その他、生物種固有のタンパク質をマーカーとすることによって、当該タンパク質がいずれの生物種由来のタンパク質であるかを同定することができる。例えば、食肉（食用に供される、獣鳥類の肉。骨や臓器も含まれる。）をホモジナイズして抽出されたタンパク質をプロテアーゼで消化した後、得られたペプチドのアミノ酸配列をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定して、ブタやウマの種特異的なペプチドを検出することにより、当該食肉の起源種が、ブタであるのか、ウマであるのか、それともその両方であるのかを判別することができる（非特許文献２）。 In addition, proteins, together with nucleic acids, are the main constituents of living organisms, and their analysis is useful for clinical medicine and drug discovery research. Detecting and identifying proteins expressed in vivo and elucidating the functions of individual proteins and the functional relationships between proteins are expected to lead to the development of new drugs and early diagnosis of diseases. For example, LC-MS / MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) and peptide analysis by database search can be used to comprehensively analyze proteins expressed in vivo. In addition, by using a protein unique to an organism as a marker, it is possible to identify which species the protein is derived from. For example, after homogenizing meat (meat of animals and birds used for food, including bones and organs) and digesting the protein extracted with protease, the amino acid sequence of the obtained peptide is obtained by LC-MS /. By identifying by MS and detecting species-specific peptides in pigs and horses, it is possible to determine whether the species of origin of the meat is pigs, horses, or both. (Non-Patent Document 2).
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、微量のペプチドでも高感度に検出可能である。このため、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用して被験試料中の生物種特異的なペプチドを検出する方法は、生物系異物の解析に用いることが期待できる。しかしながら、ＭＳ／ＭＳでアミノ酸配列が同定可能なペプチドは１０～３５アミノ酸程度であり、膨大なアミノ酸配列データの中から、短いアミノ酸からなる種特異的なペプチドを見出すことは非常に困難である。 LC-MS / MS can detect even a small amount of peptide with high sensitivity. Therefore, a method of detecting a species-specific peptide in a test sample using LC-MS / MS can be expected to be used for analysis of biological foreign substances. However, the number of peptides whose amino acid sequence can be identified by MS / MS is about 10 to 35 amino acids, and it is very difficult to find a species-specific peptide consisting of short amino acids from a vast amount of amino acid sequence data.
本発明は、被験試料中の生物系異物のうちのタンパク質を含む異物について、その起源種を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用して判別する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for discriminating the origin species of a foreign substance containing a protein among biological foreign substances in a test sample by using LC-MS / MS.
本発明者らは、畜肉や魚肉、卵、昆虫などの特定の生物種のタンパク質のプロテアーゼ消化物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて網羅的に解析し、得られた大量の配列情報を、種々の生物に由来するタンパク情報を収載した公共データベースと照合して、目的の生物種に由来するタンパク質にのみ相同性が認められたペプチド配列を探索した。この結果に得られたペプチド配列を、当該生物種を判別するための種特異的ペプチドとすることにより、本発明を完成させた。 The present inventors comprehensively analyzed protease digestions of proteins of specific biological species such as livestock meat, fish meat, eggs, and insects using LC-MS / MS, and obtained a large amount of sequence information. By collating with a public database containing protein information derived from various organisms, we searched for peptide sequences in which homology was found only in proteins derived from the target organism species. The present invention was completed by using the peptide sequence obtained as a result as a species-specific peptide for discriminating the species.
すなわち、本発明は、下記の通りである。
［１］ 被験試料中のタンパク質の起源種を判別する方法であって、
被験試料からタンパク質を抽出する抽出工程と、
前記抽出工程で得られた抽出物を、リジン又はアルギニンのＣ端側のペプチド結合を切断するプロテアーゼにより消化する消化工程と、
前記消化工程で得られたペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより解析し、そのアミノ酸配列を同定する同定工程と、
前記同定工程で同定されたペプチドに、下記表の左欄のアミノ酸配列であるペプチドが含まれている場合に、当該被検試料中には当該左欄に対応する右欄の生物種を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する判別工程と、
を有する、タンパク質の起源種判別方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for determining the origin species of a protein in a test sample.
Extraction process to extract protein from test sample and
A digestion step of digesting the extract obtained in the above extraction step with a protease that cleaves a peptide bond on the C-terminal side of lysine or arginine, and a digestion step.
An identification step of analyzing the peptide obtained in the digestion step by LC-MS / MS and identifying the amino acid sequence thereof.
When the peptide identified in the identification step contains a peptide having the amino acid sequence in the left column of the table below, the test sample originates from the organism species in the right column corresponding to the left column. And the determination step to determine that the protein was contained
A method for determining the origin and species of a protein.
［２］ 前記プロテアーゼが、トリプシンである、前記［１］のタンパク質の起源種判別方法。
［３］ 前記抽出工程を、タンパク質変性剤の存在下で被験試料を破砕することにより行う、前記［１］又は［２］のタンパク質の起源種判別方法。
［４］ 前記タンパク質変性剤が尿素である、前記［３］のタンパク質の起源種判別方法。
［５］ 前記被験試料が、飲食品である、前記［１］～［５］のいずれかのタンパク質の起源種判別方法。
［６］ 前記被験試料が、レトルト処理又は焼成処理を経て製造されたものである、前記［１］～［５］のいずれかのタンパク質の起源種判別方法。
［７］ 前記タンパク質が、前記被験試料中の異物である、前記［１］～［６］のいずれかのタンパク質の起源種判別方法。
［８］ 前記タンパク質が、アレルゲンである、前記［１］～［６］のいずれかのタンパク質の起源種判別方法。
［９］ 前記被験試料の原料表示の真偽判定に用いる、前記［１］～［６］のいずれかのタンパク質の起源種判別方法。
[2] A method for determining the origin species of the protein of the above [1], wherein the protease is trypsin.
[3] The method for determining the origin species of the protein according to the above [1] or [2], wherein the extraction step is performed by disrupting a test sample in the presence of a protein denaturing agent.
[4] The method for determining the origin species of the protein according to the above [3], wherein the protein denaturing agent is urea.
[5] A method for determining the origin species of the protein according to any one of [1] to [5], wherein the test sample is a food or drink.
[6] The method for determining the origin species of any of the proteins [1] to [5] above, wherein the test sample is produced by undergoing a retort treatment or a calcining treatment.
[7] The method for determining the origin species of the protein according to any one of [1] to [6], wherein the protein is a foreign substance in the test sample.
[8] A method for determining the origin species of any of the proteins [1] to [6], wherein the protein is an allergen.
[9] The method for determining the origin species of the protein according to any one of [1] to [6], which is used for determining the authenticity of the raw material display of the test sample.
本発明に係るタンパク質の起源種判別方法は、生物種に特異的なペプチドを指標とするため、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを利用して非常に高感度に、被験試料中のタンパク質の起源種を判別することができる。ペプチドはＤＮＡと比較して高熱下で分解し難いため、特に、レトルト処理をした飲食品のような高温加熱処理を行った被験試料中のタンパク質の起源種の判別に有用である。 Since the method for determining the origin species of a protein according to the present invention uses a peptide specific to a biological species as an index, the origin species of the protein in the test sample can be discriminated with extremely high sensitivity using LC-MS / MS. can do. Since peptides are more difficult to decompose under high heat than DNA, they are particularly useful for determining the origin species of proteins in test samples that have been subjected to high-temperature heat treatment such as retort-treated foods and drinks.
本発明に係るタンパク質の起源種判別方法は、配列番号１～４５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを、種又は目を判別するためのペプチドとして用いることを特徴とする。これらのペプチドは、それぞれ、表中の「種又は目」及び「タンパク質名」の欄に記載の生物種又は生物目のタンパク質のプロテアーゼ消化物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより解析した際に同定されるペプチドであって、当該「種又は目」の欄に記載されている生物種又は生物目を起源とするタンパク質に特異的なペプチドである。被験試料中のタンパク質のプロテアーゼ消化物をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した場合に、ある生物種特異的ペプチドが含まれていた場合には、当該被験試料中には当該生物種を起源種とするタンパク質が含まれていたと判別される。 The method for discriminating the origin species of a protein according to the present invention is characterized in that a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 45 is used as a peptide for discriminating species or orders. These peptides are identified when the protease digestion of the protein of the species or order listed in the "Species or Orders" and "Protein Names" columns of the table is analyzed by LC-MS / MS, respectively. A peptide that is specific to a protein originating from the species or order listed in the "Species or Orders" column. When the protease digested product of the protein in the test sample is analyzed by LC-MS / MS, if a certain organism-specific peptide is contained, the organism is used as the origin species in the test sample. It is determined that the protein was contained.
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列は、牛肉（ウシの食肉部分）のタンパク質であるtroponin T 213-233の部分アミノ酸配列であり、ウシ以外の生物種を起源とするタンパク質には見当たらない配列である。そこで、これらのアミノ酸配列からなるぺプチドを、牛肉特異的ペプチドとした。同様に、配列番号３～５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、豚肉特異的ペプチドとし、配列番号６～１２のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、鶏肉特異的ペプチドとした。また、配列番号１３～２１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、鶏卵特異的ペプチドとし、配列番号２２～２７のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、ウズラ卵特異的ペプチドとした。配列番号２８～３３のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、ゴキブリ目特異的ペプチドとし、配列番号３４～４１のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、ハエ目特異的ペプチドとし、配列番号４２～４５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを、キイロショウジョウバエ特異的ペプチドとした。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is a partial amino acid sequence of troponin T 213-233, which is a protein of beef (meat portion of cattle), and is not found in proteins originating from organisms other than cattle. It is an array. Therefore, a peptide consisting of these amino acid sequences was used as a beef-specific peptide. Similarly, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 5 is designated as a pork-specific peptide, and a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 to 12 is used as chicken meat. It was designated as a specific peptide. Further, the peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 13 to 21 is used as a chicken egg-specific peptide, and the peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 22 to 27 is used as a quail egg. It was designated as a specific peptide. Peptides consisting of the amino acid sequences represented by any of SEQ ID NOs: 28 to 33 are designated as gokiburi-order specific peptides, and peptides consisting of the amino acid sequences represented by any of SEQ ID NOs: 34 to 41 are designated as flies-order specific peptides. A peptide having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 42 to 45 was used as a target peptide, and a peptide specific to Kiirosho fly was used as a peptide.
本発明に係るタンパク質の起源種判別方法は、具体的には、被験試料からタンパク質を抽出する抽出工程と、前記抽出工程で得られた抽出物を、リジン又はアルギニンのＣ端側のペプチド結合を切断するプロテアーゼにより消化する消化工程と、前記消化工程で得られたペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより解析し、そのアミノ酸配列を同定する同定工程と、前記同定工程で同定されたペプチドに、下記表の左欄のアミノ酸配列であるペプチドが含まれている場合に、当該被検試料中には当該左欄に対応する右欄の生物種を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する判別工程と、を有する。 Specifically, the method for determining the origin species of a protein according to the present invention is to apply a peptide bond on the C-terminal side of lysine or arginine to an extraction step of extracting a protein from a test sample and the extract obtained in the extraction step. The table below shows the digestion step of digestion with a protease to be cleaved, the identification step of analyzing the peptide obtained in the digestion step by LC-MS / MS to identify the amino acid sequence, and the peptide identified in the identification step. When a peptide having an amino acid sequence in the left column of is contained, it is determined that the test sample contains a protein originating from the organism species in the right column corresponding to the left column. , Have.
抽出工程における被験試料からのタンパク質を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、動物の組織片や培養細胞塊などからタンパク質を抽出する際に使用される抽出方法の中から適宜選択して用いることができる。本発明においては、抽出工程において被験試料中のタンパク質が、被験試料に含まれている各種酵素によって過度に分解されることを抑制するために、タンパク質変性剤によって抽出することが好ましく、タンパク質変性剤の存在下で機械的な破砕処理を行うことがより好ましい。タンパク質変性剤としては、尿素、グアニジン塩、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、界面活性剤等が挙げられる。界面活性剤としては、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０等が挙げられる。機械的な破砕処理としては、例えば、ホモジナイザーによる破砕、超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスビーズを用いた破砕等が挙げられる。タンパク質の抽出を効率よく行うため、被験試料は、抽出処理の前に予め、細断処理等を行って細片化しておくことも好ましい。 The method for extracting the protein from the test sample in the extraction step is not particularly limited, and is appropriately selected from the extraction methods used when extracting the protein from animal tissue pieces, cultured cell clusters, and the like. Can be used. In the present invention, it is preferable to extract with a protein denaturing agent in order to prevent the protein in the test sample from being excessively decomposed by various enzymes contained in the test sample in the extraction step, and the protein denaturing agent is preferable. It is more preferable to carry out the mechanical crushing treatment in the presence of. Examples of the protein denaturing agent include urea, guanidine salt, trichloroacetic acid (TCA), and a surfactant. Examples of the surfactant include SDS (sodium lauryl sulfate) CHAPS, Triton X-100, Tween 20, Nonidet P-40 and the like. Examples of the mechanical crushing treatment include crushing with a homogenizer, ultrasonic treatment, French press treatment, crushing with glass beads, and the like. In order to efficiently extract the protein, it is also preferable that the test sample is shredded in advance by shredding or the like before the extraction treatment.
次いで、消化工程として、抽出工程で得られた抽出物を、プロテアーゼにより消化する。当該抽出物は、プロテアーゼを添加する前に、遠心分離処理等の固液分離処理を行い、不溶物を除去しておいてもよい。また、透析処理や限界濾過処理等によって、タンパク質変性剤の除去や濃縮処理を行うことも好ましい。 Then, as a digestion step, the extract obtained in the extraction step is digested with a protease. Before adding the protease, the extract may be subjected to a solid-liquid separation treatment such as a centrifugation treatment to remove insoluble matter. It is also preferable to remove or concentrate the protein denaturant by dialysis treatment, limit filtration treatment or the like.
プロテアーゼとしては、タンパク質やペプチド中のリジン又はアルギニンのＣ端側のペプチド結合を切断する分解活性を有する酵素であれば特に限定されるものではない。本発明においては、タンパク質分解活性が高く、汎用されており、かつ配列番号１～４５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが得られやすいことから、トリプシンを用いることが好ましい。消化処理における消化温度、消化時間、及び反応溶液の組成等の条件は、使用するプロテアーゼがタンパク質分解活性を奏することが出来る条件であれば特に限定されるものではなく、使用するプロテアーゼの種類や、抽出物の量や濃度等を考慮して適宜決定することができる。 The protease is not particularly limited as long as it is an enzyme having a degrading activity that cleaves the peptide bond on the C-terminal side of lysine or arginine in a protein or peptide. In the present invention, trypsin is preferably used because it has high proteolytic activity, is widely used, and it is easy to obtain a peptide consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 45. The conditions such as the digestion temperature, the digestion time, and the composition of the reaction solution in the digestion process are not particularly limited as long as the protease used can exhibit proteolytic activity, and the type of protease used and the type of protease used are used. It can be appropriately determined in consideration of the amount and concentration of the extract.
消化処理により、抽出物中のタンパク質がペプチドに分解される。得られたペプチドは、次の同定工程へ供される前に、精製及び濃縮しておくことが好ましい。精製と濃縮処理は、一般的に質量分析に供されるペプチド試料に対して行われる精製処理等の中から適宜選択して用いることができる。例えば、消化処理後の消化物を、Ｃ１８逆相樹脂（オクタデシル基（ＯＤＳ）が結合した、逆相分配用樹脂）が充填された固相抽出スピンカラムにアプライし、遠心処理を行った後、カラムに吸着したペプチドをメタノール等の極性溶媒で溶出することによって、ペプチドを精製することができる。精製されたペプチド溶液から、溶媒を除去して乾燥させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに供するためのバッファーで所望の濃度となるように溶解させる。 The digestion process breaks down the proteins in the extract into peptides. The resulting peptide is preferably purified and concentrated before being subjected to the next identification step. The purification and concentration treatment can be appropriately selected and used from purification treatments and the like generally performed on peptide samples subjected to mass spectrometry. For example, the digested product after the digestion treatment is applied to a solid-phase extraction spin column packed with a C18 reverse phase resin (resin for reverse phase distribution to which an octadecyl group (ODS) is bonded), subjected to centrifugation, and then centrifuged. The peptide can be purified by eluting the peptide adsorbed on the column with a polar solvent such as methanol. The solvent is removed from the purified peptide solution, dried, and then dissolved in buffer for LC-MS / MS to the desired concentration.
その後、同定工程として、消化工程で得られたペプチドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより解析し、そのペプチドのアミノ酸配列を同定する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに使用するＨＰＬＣシステム及びＭＳ／ＭＳシステムは、いずれも、ペプチドのアミノ酸解析に用いられるＬＣ－ＭＳ／ＭＳの中から適宜選択して用いることができる。また、ＬＣの条件は、目的の種又は目特異的ペプチドを他のペプチドと分離可能な条件であればよく、ＭＳ／ＭＳの条件は、ＬＣで分離された目的のペプチドのアミノ酸配列を同定可能な条件であればよく、いずれも特に限定されるものではない。具体的な条件は、例えば、合成した目的のペプチドを用いて、使用するシステムに対して実験的に決定することができる。 Then, as an identification step, the peptide obtained in the digestion step is analyzed by LC-MS / MS, and the amino acid sequence of the peptide is identified. Both the HPLC system and the MS / MS system used for LC-MS / MS can be appropriately selected and used from LC-MS / MS used for amino acid analysis of peptides. Further, the LC condition may be any condition as long as the target species or eye-specific peptide can be separated from other peptides, and the MS / MS condition can identify the amino acid sequence of the target peptide separated by LC. Any of these conditions is not particularly limited. Specific conditions can be determined experimentally for the system used, for example, using the synthesized peptide of interest.
例えば、ＬＣは、Ｃ１８逆相樹脂が充填されたカラムが搭載されたＨＰＬＣシステムを用い、移動相として、ギ酸水溶液（Ａ）とギ酸含有アセトニトリル（Ｂ）の混合溶媒や、トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ）とトリフルオロ酢酸含有アセトニトリル（Ｂ）の混合溶媒等を用いたグラジエント溶出によって実施することができる。また、ＭＳ／ＭＳは、特に限定されるものではないが、Ｏｒｂｉｔｒａｐ型質量分析システム、飛行時間型質量分析システム（ＴＯＦ－ＭＳ）、及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析システム（ＦＴ－ＩＣＲ－ＭＳ）等の高分解能質量分析システムを用いることが好ましい。本発明においては、分析する対象がアミノ酸配列既知のペプチド（具体的には、配列番号１～４５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド）であるため、四重極型質量分析システム、イオントラップ型質量分析システム等の汎用されている質量分析システムを用いることもできる。 For example, LC uses an HPLC system equipped with a column filled with a C18 reverse phase resin, and uses a mixed solvent of formic acid aqueous solution (A) and formic acid-containing acetonitrile (B) or a trifluoroacetic acid aqueous solution (A) as a mobile phase. ) And trifluoroacetic acid-containing acetonitrile (B) can be carried out by gradient elution using a mixed solvent or the like. The MS / MS is not particularly limited, but is an Orbitrap type mass spectrometry system, a time-of-flight mass spectrometry system (TOF-MS), and a Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry system (FT-ICR-MS). It is preferable to use a high-resolution mass spectrometry system such as. In the present invention, since the subject to be analyzed is a peptide having a known amino acid sequence (specifically, a peptide consisting of any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 45), a quadrupole mass spectrometric system, an ion trap type. A general-purpose mass spectrometry system such as a mass spectrometry system can also be used.
例えば、消化工程で得られたペプチドを、ＨＰＬＣシステム中のＣ１８逆相樹脂が充填されたカラムにアプライし、ギ酸水溶液（Ａ）とギ酸含有アセトニトリル（Ｂ）の混合溶媒で溶出して分離する。ＬＣで分離された各ペプチドは、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ型質量分析システムを用いてそのアミノ酸配列を同定する。具体的には、ＨＰＬＣで分離されたペプチドを、まず、エレクトロスプレーイオン化法（ポジティブモード）でイオン化した後、最初の質量分離部でマススペクトルデータを取得し、さらに、取得されたマススペクトルデータ（ＭＳデータ）のうちの強度の高いイオン又は予め定めておいたイオンについて不活性ガスと衝突させフラグメンテーションを起こし、生じたフラグメントイオンについて２番目の質量分離部でプロダクトイオンスペクトルデータ（ＭＳ／ＭＳデータ）を取得する。こうして得られたＭＳデータとＭＳ／ＭＳデータに基づいて、各ペプチドのアミノ酸配列を同定する。 For example, the peptide obtained in the digestion step is applied to a column packed with a C18 reverse phase resin in an HPLC system, and is eluted with a mixed solvent of formic acid aqueous solution (A) and formic acid-containing acetonitrile (B) for separation. Each peptide separated by LC identifies its amino acid sequence using, for example, an Orbitrap-type mass spectrometry system. Specifically, the peptide separated by HPLC is first ionized by an electrospray ionization method (positive mode), and then mass spectrum data is acquired at the first mass separation section, and further, the acquired mass spectrum data ( High-intensity ions or predetermined ions in (MS data) are collided with an inert gas to cause fragmentation, and the generated fragment ions are subjected to product ion spectrum data (MS / MS data) in the second mass separator. To get. Based on the MS data and MS / MS data thus obtained, the amino acid sequence of each peptide is identified.
さらに、判別工程において、同定工程において同定されたペプチドのアミノ酸配列データに基づいて、被験試料中のタンパク質の起源を判別する。同定工程でアミノ酸配列が同定されたペプチドに、いずれかの生物種特異的ペプチドと同じアミノ酸配列からなるペプチドが含まれている場合に、当該被検試料中には、当該生物種特異的ペプチドと同じ生物種を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。本発明においては、鶏肉、豚肉、牛肉、鶏卵、ウズラ卵、ハエ、ゴキブリに起源するタンパク質が判別できる。 Further, in the discrimination step, the origin of the protein in the test sample is discriminated based on the amino acid sequence data of the peptide identified in the identification step. When the peptide whose amino acid sequence is identified in the identification step contains a peptide having the same amino acid sequence as any of the organism-specific peptides, the test sample contains the peptide specific to the organism. It is determined that the peptide contained a protein originating from the same species. In the present invention, proteins originating from chicken, pork, beef, chicken eggs, quail eggs, flies, and cockroaches can be discriminated.
同定工程において同定されたペプチド群の中に、牛肉特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、牛肉を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。同様に、同定されたペプチド群の中に、豚肉特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、豚肉を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。同定されたペプチド群の中に、鶏肉特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、鶏肉を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。同定されたペプチド群の中に、鶏卵特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、鶏卵を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。同定されたペプチド群の中に、ウズラ卵特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、ウズラ卵を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。 When at least one of the beef-specific peptides was contained in the peptide group identified in the identification step, it was determined that the test sample contained a protein originating from beef. do. Similarly, if the identified peptide group contained at least one of the pork-specific peptides, it was determined that the test sample contained a protein originating from pork. do. When at least one of the chicken-specific peptides is contained in the identified peptide group, it is determined that the test sample contains a protein originating from chicken. When at least one of the chicken egg-specific peptides is contained in the identified peptide group, it is determined that the test sample contains a protein originating from chicken eggs. When at least one of the quail egg-specific peptides is contained in the identified peptide group, it is determined that the test sample contains a protein originating from the quail egg. ..
同定工程において同定されたペプチド群の中に、ゴキブリ目特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、ゴキブリを起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。同定されたペプチド群の中に、ハエ目特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、ハエを起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。同定されたペプチド群の中に、キイロショウジョウバエ特異的ペプチドのうちの少なくとも１種が含まれていた場合には、当該被検試料には、キイロショウジョウバエを起源とするタンパク質が含まれていたと判別する。 When at least one of the cockroach-order-specific peptides was contained in the peptide group identified in the identification step, the test sample contained a protein originating from cockroach. Determine. When at least one of the flies-specific peptides is contained in the identified peptide group, it is determined that the test sample contains a protein originating from a fly. If the identified peptide group contains at least one of the Drosophila melanogaster-specific peptides, it is determined that the test sample contains a protein originating from Drosophila melanogaster. ..
本発明において供される被験試料としては、タンパク質を含む物やタンパク質を含むか否かを判別するものであれば特に限定されるものではなく、動植物や微生物などの生物に由来する成分を含むように製造されたものが好ましいが、生物に由来する成分を含まないように設計されたものであってもよい。具体的には、飲食品、農作物、工業製品等が挙げられる。 The test sample provided in the present invention is not particularly limited as long as it contains a protein and determines whether or not it contains a protein, and includes components derived from living organisms such as animals, plants and microorganisms. However, it may be designed so as not to contain components derived from living organisms. Specific examples thereof include foods and drinks, agricultural products, and industrial products.
本発明において供される被験試料としては、高温加熱処理を経て製造された飲食品や工業製品が好ましく、レトルト処理や焼成処理を経て製造された飲食品や工業製品より好ましい。高温加熱処理を経て製造された飲食品等は、ＤＮＡによる検査が難しいが、本発明はペプチドを指標とするため、高温加熱処理を経て製造された物を被験試料とした場合でも、当該被検試料中のタンパク質の起源種を精度よく判別することができる。 As the test sample provided in the present invention, foods and drinks and industrial products manufactured through high-temperature heat treatment are preferable, and foods and drinks and industrial products manufactured through retort treatment and baking treatment are preferable. It is difficult to inspect foods and drinks manufactured through high-temperature heat treatment with DNA, but since the present invention uses peptides as an index, even when a product manufactured through high-temperature heat treatment is used as a test sample, the test is performed. The origin species of the protein in the sample can be accurately determined.
本発明に係る判別方法は、飲食品や工業製品の生物系異物検査に用いることができる。例えば、被験試料を飲食品や工業製品として本発明に係る判別方法を行うことによって、飲食品等にハエやゴキブリのような異物が混入しているか否かを判別することができる。当該被検試料中にハエやゴキブリを起源とするタンパク質が含まれていると判別された場合、原因としては、製造中の作業環境の衛生状態が不適切である、製造ラインに欠陥が生じている、使用する原料が洗浄不良である、などの原因が考えられるため、これらを見直し、改善する対策をとることができる。 The discrimination method according to the present invention can be used for inspection of biological foreign substances in foods and drinks and industrial products. For example, by performing the discrimination method according to the present invention using the test sample as a food or drink or an industrial product, it is possible to determine whether or not a foreign substance such as a fly or a cockroach is mixed in the food or drink. If it is determined that the test sample contains proteins originating from flies or cockroaches, the cause is improper hygiene of the working environment during manufacturing, or a defect in the manufacturing line. There are possible causes such as poor cleaning of the raw materials used, so these can be reviewed and measures taken to improve them.
また、本発明に係る判別方法を用いることにより、アレルゲンの混入の有無を調べることもできる。例えば、卵は代表的な食物アレルゲンであるが、被験試料である飲食品に対して本発明に係る判別方法を行うことによって、飲食品中に鶏卵由来のタンパク質が含まれているか否かを判別することができる。 Further, by using the discrimination method according to the present invention, it is possible to investigate the presence or absence of allergen contamination. For example, eggs are a typical food allergen, but by performing the discrimination method according to the present invention on a food or drink as a test sample, it is possible to determine whether or not the food or drink contains a protein derived from chicken eggs. can do.
本発明に係る判別方法は、原料肉種が不明な場合の確認に利用できる。例えば、ミンチ肉やソーセージ、ハンバーグ等の肉の加工品について、原料の肉種が不明な場合に、これらを被験試料として本発明に係る判別方法を行うことによって、飲食品の原料肉種に豚肉、牛肉、鶏肉が含まれているかを調べることができる。例えば、ミンチを被験試料とした場合に、豚肉特異的ペプチドと牛肉特異的ペプチドが同定され、鶏肉特異的ペプチドは検出されなかった場合には、当該ミンチはブタとウシの合い挽きであることがわかる。 The discrimination method according to the present invention can be used for confirmation when the raw meat type is unknown. For example, for processed meat products such as minced meat, sausages, and hamburgers, when the meat type of the raw material is unknown, pork can be used as the raw material meat type of food and drink by performing the discrimination method according to the present invention using these as test samples. You can find out if it contains beef or chicken. For example, when minced meat is used as a test sample, a pork-specific peptide and a beef-specific peptide are identified, and if no chicken-specific peptide is detected, it is known that the minced meat is a combination of pig and bovine. ..
本発明に係る判別方法は、原料表示の真偽判定にも利用できる。例えば、本発明に係る判別方法によって、被験試料中に豚肉を起源とするタンパク質が含まれているか否かを判別できることから、本発明に係る判別方法は、ハラル（HALAL）検査にも利用できる。また、ハラル認証のある飲食品を被験試料として本発明に係る判別方法を行い、豚肉特異的ペプチドが検出されず、豚肉起源のタンパク質が含まれていないと判別された場合に、この判別結果は、ハラル認証の裏付けとなる。 The discrimination method according to the present invention can also be used for authenticity determination of raw material labeling. For example, since it is possible to determine whether or not the test sample contains a protein originating from pork by the discrimination method according to the present invention, the discrimination method according to the present invention can also be used for the HALAL test. Further, when the discrimination method according to the present invention is performed using a food or drink with halal certification as a test sample and it is determined that the pork-specific peptide is not detected and the protein of pork origin is not contained, this discrimination result is obtained. , Supports halal certification.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
＜食材又は飲食品からのタンパク質の抽出及びトリプシン消化＞
以降の実験において、特に記載のない限り、食材又は飲食品からのタンパク質抽出及び精製は、以下の方法で行った。
試料を１．５ｍＬ容チューブに採取し、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）－８Ｍ 尿素溶液（尿素４．８０５ｇを１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５ｍＬと超純水５ｍＬにて溶解した溶液）を加えて試料を破砕した後、５０ｍＭ 重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）（重炭酸アンモニウム４０ｍｇを超純水１０ｍＬに溶解した液。使用時まで冷蔵保存。）にて希釈した。得られた溶液を遠心分離処理（２０００ｒｐｍ、２分間）した後、上清１００μＬを別の１．５ｍＬ容チューブに採取し、５００ｍＭ（±）－ジチオスレイトール（（±）－ジチオスレイトール７７ｍｇを、超純水１ｍＬに溶解した液。使用時まで冷凍保存。）１０μＬを加えて、３７℃、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後の溶液を室温になるまで放置した後、５００ｍＭ ヨードアセトアミド（ヨードアセトアミド２７．９ｍｇを超純水３００μＬに溶解した液。用時調製）５０μＬを加えて暗所にて２５℃、３０分間インキュベーションした。その後、５０ｍＭ 重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）４００μＬを加えて、ボルテックスミキサーにて撹拌した後、遠心分離処理（２０００ｒｐｍ、２分間）した。次いで、上清３００μＬを、予め５０ｍＭ 重炭酸アンモニウム５００μＬで平衡化したトリプシン消化カラム（製品名：「ＭｏｎｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｔｒｙｐｓｉｎ ＨＰ」、ＧＬサイエンス社製）に負荷し、遠心分離処理（２００ｒｐｍ、１０分間）した。当該トリプシン消化カラムを通過した液を、再度同じトリプシン消化カラムに負荷し、遠心分離処理（２００ｒｐｍ、１０分間）し、トリプシン消化を行った。通過した液全量を、予めメタノール１００μＬ及び超純水１００μＬで平衡化したＣ１８逆相スピンカラム（製品名：「ＭｏｎｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｃ１８」、ＧＬサイエンス社製）に負荷し、遠心分離処理（５０００ｒｐｍ、２分間）し、液を通過させた。さらに、当該Ｃ１８逆相スピンカラムに超純水３００μＬを負荷し、遠心分離処理（５０００ｒｐｍ、２分間）して当該カラムを洗浄した。最後に、当該Ｃ１８逆相スピンカラムにメタノール１５０μＬを負荷し、遠心分離処理（５０００ｒｐｍ、２分間）し、メタノール液を全量回収した。回収したメタノール液を、窒素パージ（４０℃）にて乾固した後、０．１容量％ ギ酸水溶液（ギ酸１ｍＬと超純水１０００ｍＬを混合した液）を加えてボルテックスミキサーを用いて溶解したものを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した。
<Extraction of protein from foodstuffs or food and drink and digestion with trypsin>
In the following experiments, unless otherwise specified, protein extraction and purification from foodstuffs or foods and drinks were carried out by the following methods.
A sample was collected in a 1.5 mL tube and dissolved in a 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) -8 M urea solution (4.805 g of urea dissolved in 5 mL of 1 M Tris-HCl (pH 8.0) and 5 mL of ultrapure water. ) Was added to crush the sample, and the sample was diluted with 50 mM ammonium bicarbonate (pH 8.0) (a solution of 40 mg of ammonium bicarbonate in 10 mL of ultrapure water. Stored in a refrigerator until use). After centrifuging the obtained solution (2000 rpm, 2 minutes), 100 μL of the supernatant is collected in another 1.5 mL tube, and 500 mM (±) -dithiothreitol ((±) -dithiothreitol 77 mg) is collected. , A solution dissolved in 1 mL of ultrapure water. Stored frozen until use.) 10 μL was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After allowing the solution after incubation to reach room temperature, add 50 μL of 500 mM iodoacetamide (a solution prepared by dissolving 27.9 mg of iodoacetamide in 300 μL of ultrapure water. Prepared at the time of use) and incubate in a dark place at 25 ° C. for 30 minutes. bottom. Then, 400 μL of 50 mM ammonium bicarbonate (pH 8.0) was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer and then centrifuged (2000 rpm, 2 minutes). Next, 300 μL of the supernatant was loaded onto a trypsin digestion column (product name: “MonoSpin (registered trademark) Trypsin HP”, manufactured by GL Science Co., Ltd.) equilibrated with 500 μL of 50 mM ammonium bicarbonate in advance, and centrifuged (200 rpm, 10). Minutes). The liquid that had passed through the trypsin digestion column was loaded again on the same trypsin digestion column, centrifuged (200 rpm, 10 minutes), and trypsin digestion was performed. The entire amount of the passed liquid is loaded on a C18 reverse phase spin column (product name: "MonoSpin (registered trademark) C18", manufactured by GL Science Co., Ltd.) previously equilibrated with 100 μL of methanol and 100 μL of ultrapure water, and centrifuged (5000 rpm). 2 minutes) and let the liquid pass. Further, 300 μL of ultrapure water was loaded on the C18 reverse phase spin column, and the column was washed by centrifugation (5000 rpm, 2 minutes). Finally, 150 μL of methanol was loaded on the C18 reverse phase spin column and subjected to centrifugation (5000 rpm, 2 minutes), and the entire amount of the methanol solution was recovered. The recovered methanol solution was dried by nitrogen purge (40 ° C), then a 0.1 volume% formic acid aqueous solution (a mixture of 1 mL of formic acid and 1000 mL of ultrapure water) was added and dissolved using a vortex mixer. Was subjected to LC-MS / MS analysis.
＜ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析＞
以降の実験において、特に記載のない限り、トリプシン消化されたペプチドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、以下の方法で行った。
<LC-MS / MS analysis>
In subsequent experiments, unless otherwise stated, LC-MS / MS analysis of tryptic digested peptides was performed by the following method.
ＨＰＬＣ条件
ＨＰＬＣシステム：「ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
移動相Ａ：０．１容量％ ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１容量％ ギ酸アセトニトリル（ギ酸１ｍＬとアセトニトリル１０００ｍＬを混合した液）
グラジェント条件：７％Ｂ（０．０分）－２８％Ｂ（２８．０分）－４７％Ｂ（４０．０分）－１００％Ｂ（４５．０分～４８．２分）－７％Ｂ（４８．３分～５０．０分）
分析カラム：Ｃ１８逆相カラム「ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １３０Å」（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ、Waters社製)
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
注入量：１０μＬ
HPLC conditions HPLC system: "UltraMate 3000" (manufactured by Thermo Fisher Scientific)
Mobile phase A: 0.1% by volume Mobile phase B: 0.1% by volume Formic acid acetonitrile (a mixture of 1 mL of formic acid and 1000 mL of acetonitrile)
Granant conditions: 7% B (0.0 minutes) -28% B (28.0 minutes) -47% B (40.0 minutes) -100% B (45.0 to 48.2 minutes) -7 % B (48.3 to 50.0 minutes)
Analytical column: C18 reverse phase column "ACQUITY UPLC BEH C18 130 Å" (2.1 mm x 150 mm, 1.7 μm, manufactured by Waters)
Flow rate: 0.3 mL / min Column temperature: 40 ° C
Injection volume: 10 μL
ＭＳ／ＭＳ条件
ＭＳ／ＭＳシステム：Ｏｒｂｉｔｒａｐ型質量分析システム「Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）
モード：Ｆｕｌｌ ＭＳ／ｄｄ－ＭＳ２モード（ＭＳデータを取得後、強度の高い上位１０イオンのＭＳ／ＭＳデータを自動取得する）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法（ポジティブモード）
スプレー電圧：３．５０ｋＶ
キャピラリー温度：３５０℃
ヒーター温度：３００℃
プレカーサーイオン検出；
分解能：７０，０００
ＡＧＣターゲット：３ｅ６
最大注入時間：１００ｍ秒
測定ｍ/ｚ：２００－２０００
プロダクトイオン検出；
分解能：１７，５００
ＡＧＣターゲット：１ｅ５
最大注入時間：６０ｍ秒
コリジョンエネルギー：２７ｅＶ
MS / MS conditions MS / MS system: Orbitrap-type mass spectrometry system "Orbitrap MS" (manufactured by Thermo Fisher Scientific)
Mode: Full MS / dd-MS2 mode (After acquiring MS data, MS / MS data of the top 10 ions with high intensity are automatically acquired)
Ionization method: Electrospray ionization method (positive mode)
Spray voltage: 3.50 kV
Capillary temperature: 350 ° C
Heater temperature: 300 ° C
Precursor ion detection;
Resolution: 70,000
AGC target: 3e6
Maximum injection time: 100 msec Measurement m / z: 200-2000
Product ion detection;
Resolution: 17,500
AGC target: 1e5
Maximum injection time: 60msec Collision energy: 27eV
＜アミノ酸配列情報の取得＞
以降の実験において、特に記載のない限り、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で取得したアミノ酸配列情報は、以下の方法で取得した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にて得られたデータに対して、タンパク質のアミノ酸配列とその機能情報が掲載されたデータベースである「ＵｎｉＰｒｏｔ」（http://www.uniprot.org/downloads）とプロテオーム解析の総合ソフトウェアである「Ｍａｘ Ｑｕａｎｔ」とを用いてスペクトル解析を行い、アミノ酸配列情報を得た。
<Acquisition of amino acid sequence information>
In the following experiments, unless otherwise specified, the amino acid sequence information obtained by LC-MS / MS analysis was obtained by the following method.
For the data obtained by LC-MS / MS analysis, "UniProt" (http://www.uniprot.org/downloads), which is a database containing amino acid sequences of proteins and their functional information, and proteomics analysis. Amino acid sequence information was obtained by performing spectral analysis using "Max Quant", which is the comprehensive software of.
［実施例１］
食肉の起源種判別に用いるための豚肉特異的ペプチド、牛肉特異的ペプチド、鶏肉特異的ペプチドを調べた。
[Example 1]
Pork-specific peptides, beef-specific peptides, and chicken-specific peptides for use in determining the species of origin of meat were investigated.
＜試料＞
試料として、生肉、茹で肉、レトルト処理された肉、及びフリーズドライ処理された肉を用いた。
生肉としては、日本国内で入手した生物種が明確な食肉（ウシ、ブタ、ニワトリ）の生肉をそのまま実験に用いた。
茹で肉は、生肉を１５分間沸騰したお湯で茹でたものを用いた。
レトルト処理された肉は、日本国内で市販されており、原料表示からウシ、ブタ、又はニワトリの肉が含まれているレトルト食品を用いた。
フリーズドライ処理された肉は、日本国内で市販されており、原料表示からウシ、ブタ、又はニワトリの肉が含まれているフリーズドライ食品を、水で戻したものを用いた。
いずれの試料も、１０～２０ｍｇとなるように数ｍｍ角にカットしたものを、試験に供した。
<Sample>
Raw meat, boiled meat, retort-treated meat, and freeze-dried meat were used as samples.
As raw meat, raw meat of meat (cattle, pigs, chickens) with clear species obtained in Japan was used as it was in the experiment.
As the boiled meat, raw meat boiled in boiling water for 15 minutes was used.
The retort-treated meat was commercially available in Japan, and a retort-packed food containing bovine, pig, or chicken meat was used according to the raw material label.
The freeze-dried meat was commercially available in Japan, and the freeze-dried food containing bovine, pig, or chicken meat was reconstituted with water according to the raw material label.
All the samples were cut into several mm squares so as to have a size of 10 to 20 mg and subjected to the test.
＜生物種特異的ペプチドの特定＞
生肉を試料として、タンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。
<Specification of organism-specific peptides>
Proteins were extracted from raw meat as a sample, digested with trypsin, and then the purified peptides were comprehensively analyzed by LC-MS / MS to obtain amino acid sequence information of each peptide.
取得したアミノ酸配列情報の解析は、ＮＣＢＩのウェブサイト（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）に公開されているＢＬＡＳＴ解析ソフトウェアを用いて行った。取得した各ペプチドのアミノ酸配列情報について、当該ウェブサイトのタンパク質データベースに登録されているアミノ酸配列データに対して検索を行い、当該ペプチドの起源であるタンパク質及び生物種を推定した。なお、タンパク質及び種の推定は、ＭＳ／ＭＳスペクトルからペプチドを構成する全てのアミノ酸の配列情報が読み取れたペプチドについて、タンパク質データベースに対して検索を行い、ＭＳ／ＭＳスペクトルから読み取れたアミノ酸配列と検索結果から得られたアミノ酸配列が１００％一致していることを条件とした。 The acquired amino acid sequence information was analyzed using the BLAST analysis software published on the NCBI website (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). The acquired amino acid sequence information of each peptide was searched for the amino acid sequence data registered in the protein database of the website, and the protein and species that were the origin of the peptide were estimated. For protein and species estimation, a peptide whose sequence information of all amino acids constituting the peptide was read from the MS / MS spectrum was searched in the protein database, and the amino acid sequence read from the MS / MS spectrum was searched. The condition was that the amino acid sequences obtained from the results were 100% identical.
この結果、生肉から得られた各ペプチドは、ｍｙｏｓｉｎ、ｎｅｂｕｌｉｎ等の筋肉構成タンパク質やｂｅｔａ－ｅｎｏｌａｓｅ等の筋肉に存在する酵素の部分アミノ酸配列であると推定され、推定タンパク質から筋肉であることが示唆された。また、各ペプチドについて、種特異的ペプチドであるか否かを調べた。具体的には、タンパク質データベースに登録されているアミノ酸配列情報のうち、各ペプチドのアミノ酸配列と１００％一致しているアミノ酸配列を有するタンパク質が、試料とした生肉の起源種と同じ生物種のもののみであるペプチドを、種特異的ペプチドであるとした。 As a result, each peptide obtained from raw meat is presumed to be a partial amino acid sequence of a muscle-constituting protein such as myosin and nebulin and an enzyme present in muscle such as beta-enolase, suggesting that it is muscle from the estimated protein. Was done. In addition, it was investigated whether or not each peptide was a species-specific peptide. Specifically, among the amino acid sequence information registered in the protein database, the protein having an amino acid sequence that 100% matches the amino acid sequence of each peptide is the same biological species as the source species of the raw meat used as the sample. Peptides that are only are considered to be species-specific peptides.
一例として、ＭＳ／ＭＳスペクトルより読み取れたアミノ酸配列のうち、ＥＬＷＤＴＬＹＱＬＥＴＤＫＦＥＹＧＥＫ（配列番号２）をＢＬＡＳＴにて解析したところ、当該ペプチドは、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔのトリプシン消化産物と推定された。また、データベース検索の結果、このアミノ酸配列は、Bos Taurus（ウシ）、Bos mutus（ヤク）、Bos Indicus ×Bos Taurus（コブウシ×ウシ）、 Bison bison bison（アメリカバイソン）のみが持つ配列だと判明した。このため、当該ペプチドを、牛肉特異的ペプチドであるとした。同様にして、配列番号１のペプチドも、ウシのみが持つ配列だと判明したため、牛肉特異的ペプチドであるとした。 As an example, among the amino acid sequences read from the MS / MS spectrum, ELWDTLYQLETDKFEYGEK (SEQ ID NO: 2) was analyzed by BLAST, and the peptide was presumed to be a tryptic digest product of Troponin T. In addition, as a result of database search, it was found that this amino acid sequence is unique to Bos Taurus (bovine), Bos mutus (yaku), Bos Indicus x Bos Taurus (cow x bovine), and Bison bison bison (American bison). .. Therefore, the peptide is regarded as a beef-specific peptide. Similarly, since the peptide of SEQ ID NO: 1 was found to be a sequence possessed only by cattle, it was regarded as a beef-specific peptide.
一方で、ＭＳ／ＭＳスペクトルより読み取れたアミノ酸配列のうち、ＳＳＤＱＥＭＡＶＦＧＥＡＡＰＹＬＲ（配列番号４６）をＢＬＡＳＴにて解析したところ、当該ペプチドは、ｍｙｏｓｉｎ－２、ｍｙｏｓｉｎ－４、ｍｙｏｓｉｎ－１、ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎのトリプシン消化産物と推定された。また、データベース検索の結果、このアミノ酸配列は、Monodon monoceros（イッカク）、Cervus elaphus hippelaphus（アカシカ）、Camelus ferus（フタコブラクダ）、Camelus dromedarius（ヒトコブラクダ）、Bos mutus（ヤク）、Manis javanica（マレーセンザンコウ）、Physeter catodon（マッコウクジラ）、Delphinapterus leucas（シロイルカ）、Ailuropoda melanoleuca（ジャイアントパンダ）、Lipotes vexillifer（ヨウスコウカワイルカ）、Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis（スナメリ）、Phocoena sinus（コガシラネズミイルカ）、Orcinus orca（シャチ）、Erinaceus europaeus（ナミハリネズミ）、Phyllostomus discolor（フィロストムドコウモリ）、Globicephala melas（ヒレナガゴンドウ）、Condylura cristata（ホシバナモグラ）、Macaca mulatta（アカゲザル）、Macaca fascicularis（カニクイザル）、Desmodus rotundus（ナミチスイコウモリ）、Phoca vitulina（ゼニガタアザラシ）、Sousa chinensis（シナウスイロイルカ）、Mandrillus leucophaeus（ドリル）、Cercocebus atys（スーティーマンガベイ）、Chlorocebus sabaeus（ミドリザル）、Macaca nemestrina（ブタオザル）、Vicugna pacos（アルパカ）、Bos taurus（ウシ）、Bubalus bubalis（スイギュウ）、Muntiacus reevesi（キョン）、Ovis aries（ヒツジ）、Capra hircus（ヤギ）、Pteropus alecto（クロオオコウモリ）、Pteropus vampyrus（ジャワオオコウモリ）と多くの種が持つアミノ酸配列であった。このため、当該ペプチドは、牛肉特異的ペプチドとはならないことが判った。 On the other hand, among the amino acid sequences read from the MS / MS spectrum, SSDQEMAVFGEAAPYLR (SEQ ID NO: 46) was analyzed by BLAST, and the peptide was found to be myosin-2, myosin-4, myosin-1, and myosin healthy chain trypsin. It was presumed to be a digestive product. In addition, as a result of database search, this amino acid sequence was found in Monodon monoceros (Ikkaku), Cervus elaphus hippelaphus (Red-finned pilot whale), Camelus ferus (Futakobrakuda), Camelus dromedarius (Hitokobrakuda), Bos mutus (Yaku), Manis javanica (Malesenzankou). Physeter catodon, Delphinapterus leucas, Ailuropoda melanoleuca, Lipotes vexillifer, Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis, Phocoena sinus Erinaceus europaeus, Phyllostomus discolor, Globicephala melas, Condylura cristata, Macaca mulatta, Macaca fascicularis, Macaca fascicularis, Desmod vitulina, Sousa chinensis, Mandrillus leucophaeus, Cercocebus atys, Chlorocebus sabaeus, Macaca nemestrina, Vicugna pacos Amino acid sequences of many species such as bovine, Bubalus bubalis, Muntiacus reevesi, Ovis aries, Capra hircus, Pteropus alecto, Pteropus vampyrus. Met. Therefore, it was found that the peptide is not a beef-specific peptide.
この結果、牛生肉からは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で３４０個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号１～２の２個のペプチドのみが牛肉特異的ペプチドであった。
同様に、豚生肉からは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で３６３個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号３～５の３個のペプチドのみが豚肉特異的ペプチドであった。
鶏生肉からは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で４４０個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号６～１２の７個のペプチドのみが鶏肉特異的ペプチドであった。
As a result, 340 amino acid sequence information was obtained from raw beef by LC-MS / MS analysis, and of these, only two peptides of SEQ ID NOs: 1 and 2 were beef-specific peptides.
Similarly, 363 amino acid sequence information was obtained from raw pork by LC-MS / MS analysis, and of these, only 3 peptides of SEQ ID NOs: 3 to 5 were pork-specific peptides.
From raw chicken meat, 440 amino acid sequence information was obtained by LC-MS / MS analysis, and of these, only 7 peptides of SEQ ID NOs: 6 to 12 were chicken-specific peptides.
＜加工食品中のタンパク質の起源種判別＞
ウシ、ブタ、ニワトリの茹で肉、レトルト処理された肉、及びフリーズドライ処理された肉について、生肉と同様にしてタンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。得られたアミノ酸配列情報に、各生物種特異的ペプチドが含まれているか否かを調べた。
<Identification of the origin of protein in processed foods>
For boiled bovine, pig, and chicken meat, retort-treated meat, and freeze-dried meat, proteins are extracted in the same manner as raw meat, trypsin-digested, and then the purified peptide is subjected to LC-MS / MS. Comprehensive analysis was performed to obtain amino acid sequence information of each peptide. It was investigated whether or not the obtained amino acid sequence information contained a peptide specific to each species.
この結果、茹で肉及びフリーズドライ処理肉では、生肉と同様に、得られたアミノ酸配列情報に、ウシ、ブタ、ニワトリそれぞれの種特異的ペプチドがあることが確認された。
一方で、レトルト処理肉では、ウシでは、得られたアミノ酸配列情報に牛肉特異的ペプチドがあることが確認されたが、ブタとニワトリでは確認されなかった。そこで、ＭＳデータを取得後、強度の高い上位１０イオンのＭＳ／ＭＳデータを自動取得する網羅的分析から、特定のＭＳデータを選択してＭＳ／ＭＳデータを取得するプロダクトイオンスキャン法に変更してアミノ酸配列情報を取得したところ、ブタ、ニワトリからもそれぞれの特異的ペプチドが確認できた。
これらの結果から、様々な調理工程を経て製造された肉含有加工食品を被験試料とした場合でも、当該被検試料中に、牛肉、豚肉、及び鶏肉を起源とするタンパク質が含まれているかどうかを判別できることが示された。
As a result, it was confirmed that in the boiled meat and the freeze-dried meat, the obtained amino acid sequence information contains the species-specific peptides of bovine, pig, and chicken, as in the case of raw meat.
On the other hand, in the retort-treated meat, it was confirmed that the obtained amino acid sequence information contained a beef-specific peptide in cattle, but not in pigs and chickens. Therefore, after acquiring MS data, we changed from comprehensive analysis that automatically acquires MS / MS data of the top 10 ions with high intensity to the product ion scan method that selects specific MS data and acquires MS / MS data. When the amino acid sequence information was obtained, specific peptides could be confirmed from pigs and chickens.
Based on these results, whether or not the test sample contains proteins originating from beef, pork, and chicken, even when processed meat-containing foods produced through various cooking processes are used as test samples. Was shown to be able to determine.
［実施例２］
卵の起源種判別に用いるための鶏卵特異的ペプチド、ウズラ卵特異的ペプチドを調べた。
[Example 2]
We investigated chicken egg-specific peptides and quail egg-specific peptides for use in determining the species of origin of eggs.
＜試料＞
試料として、日本国内で市販されている鶏卵とウズラ卵の茹で卵、レトルト処理された卵、及びフリーズドライ処理された卵を用いた。
茹で卵は、生卵を１５分間沸騰したお湯で茹でたものを用いた。
レトルト処理された卵は、日本国内で市販されており、原料表示からニワトリ又はウズラの卵が含まれているレトルト食品を用いた。
フリーズドライ処理された卵は、日本国内で市販されており、原料表示からニワトリ又はウズラの卵が含まれているフリーズドライ食品を、水で戻したものを用いた。
いずれの試料も、１０～２０ｍｇとなるように数ｍｍ角にカットしたものを、試験に供した。
<Sample>
Boiled chicken and quail eggs, retort-treated eggs, and freeze-dried eggs commercially available in Japan were used as samples.
As the boiled egg, a raw egg boiled in boiling water for 15 minutes was used.
The retort-treated eggs are commercially available in Japan, and retort-packed foods containing chicken or quail eggs are used according to the raw material labeling.
The freeze-dried eggs are commercially available in Japan, and the freeze-dried foods containing chicken or quail eggs according to the raw material label are reconstituted with water.
All the samples were cut into several mm squares so as to have a size of 10 to 20 mg and subjected to the test.
＜生物種特異的ペプチドの特定＞
茹で卵を試料として、タンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。実施例１と同様にして、取得したアミノ酸配列情報の解析を行い、種特異的ペプチドを決定した。
<Specification of organism-specific peptides>
Proteins were extracted from boiled eggs as a sample, digested with trypsin, and then the purified peptides were comprehensively analyzed by LC-MS / MS to obtain amino acid sequence information of each peptide. The obtained amino acid sequence information was analyzed in the same manner as in Example 1 to determine a species-specific peptide.
茹で卵から得られた各ペプチドは、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ｏｖｏｍｕｃｏｉｄ等の卵白構成タンパク質やｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ等の卵黄構成タンパク質の部分アミノ酸配列であると推定され、推定タンパク質から卵であることが示唆された。また、各ペプチドについて、種特異的ペプチドであるか否かを調べた。 Each peptide obtained from the boiled egg was presumed to be a partial amino acid sequence of an egg white constituent protein such as ovalbumin and ovomucoid and an egg yolk constituent protein such as vitellogenin, and the estimated protein suggested that it was an egg. In addition, it was investigated whether or not each peptide was a species-specific peptide.
この結果、ニワトリ茹で卵からは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で１４９個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号１３～２１の９個のペプチドのみが鶏卵特異的ペプチドであった。
同様に、ウズラ茹で卵からは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で１４０個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号２２～２７の６個のペプチドのみがウズラ卵特異的ペプチドであった。
As a result, 149 amino acid sequence information was obtained from boiled chicken eggs by LC-MS / MS analysis, and of these, only 9 peptides of SEQ ID NOs: 13 to 21 were chicken egg-specific peptides.
Similarly, from boiled quail eggs, 140 amino acid sequence information was obtained by LC-MS / MS analysis, and of these, only 6 peptides of SEQ ID NOs: 22 to 27 were quail egg-specific peptides.
ニワトリとウズラのレトルト処理された卵及びフリーズドライ処理された卵について、茹で卵と同様にしてタンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。得られたアミノ酸配列情報に、各生物種特異的ペプチドが含まれているか否かを調べた。 For retorted and freeze-dried eggs of chickens and quail, proteins were extracted in the same manner as boiled eggs, trypsin-digested, and then the purified peptides were comprehensively analyzed by LC-MS / MS. , Amino acid sequence information of each peptide was acquired. It was investigated whether or not the obtained amino acid sequence information contained a peptide specific to each species.
この結果、レトルト処理卵及びフリーズドライ処理卵では、得られたアミノ酸配列情報に種特異的ペプチドは確認されなかったが、プロダクトイオンスキャン法に変更してアミノ酸配列情報を取得したところ、レトルト処理卵及びフリーズドライ処理卵からもそれぞれの特異的ペプチドが確認できた。
これらの結果から、様々な調理工程を経て製造された卵含有加工食品を被験試料とした場合でも、当該被検試料中に、鶏卵及びウズラ卵を起源とするタンパク質が含まれているかどうかを判別できることが示された。
As a result, no species-specific peptide was confirmed in the obtained amino acid sequence information in the retort-treated eggs and freeze-dried eggs, but when the product ion scan method was changed to obtain the amino acid sequence information, the retort-treated eggs were obtained. And each specific peptide was confirmed from the freeze-dried egg.
From these results, it is possible to determine whether or not the test sample contains proteins originating from chicken eggs and quail eggs, even when egg-containing processed foods produced through various cooking processes are used as test samples. It was shown that it can be done.
［実施例３］
ゴキブリ目とハエ目のムシの起源種判別に用いるための特異的ペプチドを調べた。
[Example 3]
Specific peptides for use in determining the origin species of cockroaches and flies were investigated.
＜試料＞
試料として、キイロショウジョウバエ、イエバエ、チャバネゴキブリ、チャバネアオカメムシを未処理のまま、又はレトルト処理したものを用いた。これらのムシは、住化テクノサービス社より購入した。
レトルト処理したムシは、レトルト食品用オートクレーブ（トミー精工社製）を用いて１２３℃、１８分間の加熱殺菌処理を行ったものを用いた。
いずれの試料も、虫一体を、試験に供した。
<Sample>
As a sample, untreated or retort-treated Drosophila melanogaster, Housefly, German cockroach, and German cockroach were used. These beetles were purchased from Sumika Techno Service.
The retort-treated beetle was heat-sterilized at 123 ° C. for 18 minutes using a retort-packed autoclave (manufactured by Tomy Seiko Co., Ltd.).
In each sample, the insects were subjected to the test.
＜生物種特異的ペプチドの特定＞
未処理のムシを試料として、タンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。実施例１と同様にして、取得したアミノ酸配列情報の解析を行い、種特異的ペプチドを決定した。
<Specification of organism-specific peptides>
Proteins were extracted from untreated beetles as a sample, digested with trypsin, and then the purified peptides were comprehensively analyzed by LC-MS / MS to obtain amino acid sequence information of each peptide. The obtained amino acid sequence information was analyzed in the same manner as in Example 1 to determine a species-specific peptide.
未処理のムシから得られた各ペプチドは、ｍｙｏｓｉｎ等の筋肉構成タンパク質の部分アミノ酸配列であると推定された。また、各ペプチドについて、目特異的ペプチドであるか否かを調べた。 Each peptide obtained from the untreated beetle was presumed to be a partial amino acid sequence of a muscle-constituting protein such as myosin. In addition, it was investigated whether or not each peptide was an eye-specific peptide.
この結果、未処理のチャバネゴキブリからは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で２４１個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号２８～３３の６個のペプチドのみがゴキブリ目特異的ペプチドであった。
同様に、未処理のキイロショウジョウバエとイエバエからは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で合計４４８個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号３４～４１の８個のペプチドのみがハエ目特異的ペプチドであった。
また、未処理のキイロショウジョウバエからは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で２６０個のアミノ酸配列情報が取得され、このうち配列番号４２～４５の４個のペプチドのみがキイロショウジョウバエ特異的ペプチドであった。
一方で、未処理のチャバネアオカメムシからは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で２２０個のアミノ酸配列情報が取得されたが、チャバネアオカメムシ特異的ペプチドやカメムシ目特異的ペプチドはみつからなかった。
As a result, 241 amino acid sequence information was obtained from untreated German cockroaches by LC-MS / MS analysis, and only 6 peptides of SEQ ID NOs: 28 to 33 were cockroach-specific peptides.
Similarly, from untreated Drosophila melanogaster and housefly, a total of 448 amino acid sequence information was obtained by LC-MS / MS analysis, of which only 8 peptides of SEQ ID NOs: 34-41 were fly-specific peptides. Met.
In addition, 260 amino acid sequence information was obtained from untreated Drosophila melanogaster by LC-MS / MS analysis, and of these, only 4 peptides of SEQ ID NOs: 42 to 45 were specific peptides of Drosophila melanogaster.
On the other hand, 220 amino acid sequence information was obtained from untreated stink bugs by LC-MS / MS analysis, but no peptide specific to stink bugs or stink bugs was found.
レトルト処理されたムシについて、未処理のムシと同様にしてタンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。得られたアミノ酸配列情報に、生物種特異的ペプチド又は目特異的ペプチドが含まれているか否かを調べた。 For the retorted beetle, the protein was extracted in the same manner as the untreated beetle, digested with trypsin, and then the purified peptide was comprehensively analyzed by LC-MS / MS to obtain the amino acid sequence information of each peptide. bottom. It was examined whether or not the obtained amino acid sequence information contained a species-specific peptide or an eye-specific peptide.
この結果、レトルト処理したムシでは、得られたアミノ酸配列情報に種又は目特異的ペプチドは確認されなかったが、プロダクトイオンスキャン法に変更してアミノ酸配列情報を取得したところ、レトルト処理したムシからもそれぞれの特異的ペプチドが確認できた。
これらの結果から、様々な調理工程を経て製造された加工食品を被験試料とした場合でも、当該被検試料中に、ゴキブリ目及びハエ目のムシを起源とするタンパク質が含まれているかどうかを判別できることが示された。
As a result, no species or eye-specific peptide was confirmed in the obtained amino acid sequence information in the retorted beetle, but when the amino acid sequence information was obtained by changing to the product ion scan method, the retort-treated beetle was used. Also, each specific peptide was confirmed.
From these results, it can be determined whether or not the test sample contains proteins originating from cockroaches and flies, even when processed foods produced through various cooking processes are used as test samples. It was shown that it can be discriminated.
［実施例４］
市販のレトルト調味液に、故意に混入させた異物が判別できるかを調べた。異物としては、牛肉、イエバエ、クロゴキブリを用いた。
[Example 4]
It was investigated whether foreign substances intentionally mixed in the commercially available retort seasoning liquid could be identified. As foreign substances, beef, housefly, and Smokybrown cockroach were used.
＜異物を混入したレトルト調味液＞
牛肉は、１０～２０ｍｇとなるように数ｍｍ角にカットしたものを用いた。イエバエ、クロゴキブリは購入した未処理の1体を、それぞれ用いた。
各異物を、それぞれ、市販のレトルト用調味液１００ｍＬと共にレトルト用パウチに封入した後、１２３℃、１８分間のレトルト処理したものを試験に供した。
<Retort seasoning liquid mixed with foreign matter>
The beef used was cut into several mm squares so as to be 10 to 20 mg. Houseflies and Smokybrown cockroaches used one of the purchased untreated bodies.
Each foreign substance was encapsulated in a retort pouch together with 100 mL of a commercially available seasoning solution for retort, and then retort-treated at 123 ° C. for 18 minutes and subjected to the test.
＜レトルト調味液中の異物の起源種判別＞
レトルト調味液から取り出して超純水にて洗浄した異物を試料として、タンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。
<Identification of the origin of foreign substances in the retort seasoning liquid>
A protein was extracted from a foreign substance taken out from the retort seasoning solution and washed with ultrapure water as a sample, digested with trypsin, and then the purified peptide was comprehensively analyzed by LC-MS / MS, and the amino acid sequence of each peptide was obtained. I got the information.
この結果、牛肉から取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号１と配列番号２の牛肉特異的ペプチドが含まれていることが確認された。
イエバエから取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号４０のハエ目特異的ペプチドが含まれていることが確認された。
クロゴキブリから取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号３０及び配列番号３１のゴキブリ目特異的ペプチドが含まれていることが確認された。
これらの結果から、実際のレトルト食品に混入された異物の起源種判別が可能であることが確認された。
As a result, it was confirmed that the amino acid sequence information obtained from beef contained the beef-specific peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
It was confirmed that the amino acid sequence information obtained from housefly contained the fly-order-specific peptides of SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, and SEQ ID NO: 40.
It was confirmed that the amino acid sequence information obtained from Smokybrown cockroach contained the cockroach-order-specific peptides of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31.
From these results, it was confirmed that it is possible to determine the origin and species of foreign substances mixed in actual retort foods.
［実施例５］
様々な部位の牛肉について、起源種判別が可能であることを確認した。
[Example 5]
It was confirmed that it is possible to identify the origin species of beef from various parts.
＜試料＞
牛肉としては、タン（舌）、肩ロース、及びハラミ（横隔膜）の生肉を、１０～２０ｍｇとなるように数ｍｍ角にカットしたものを、試料として用いた。
<Sample>
As the beef, raw meat of tongue (tongue), shoulder loin, and skirt steak (diaphragm) cut into several mm squares to a size of 10 to 20 mg was used as a sample.
＜様々な部位の牛肉の起源種判別＞
各試料からタンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。
この結果、タン、ハラミ、肩ロースから取得されたアミノ酸配列情報には、いずれにも、配列番号１と配列番号２の牛肉特異的ペプチドが含まれていることが確認され、様々な部位の牛肉について、配列番号１及び配列番号２の牛肉特異的ペプチドを用いた起源種判別が可能であることが判った。
<Identification of the origin of beef in various parts>
After extracting the protein from each sample and digesting it with trypsin, the purified peptide was comprehensively analyzed by LC-MS / MS, and the amino acid sequence information of each peptide was obtained.
As a result, it was confirmed that the amino acid sequence information obtained from tongue, halami, and shoulder loin contained the beef-specific peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and beef from various sites. It was found that the origin species can be discriminated using the beef-specific peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
［実施例６］
様々な食品素材を含む飲食品中のタンパク質の起源種判別が可能であることを確認した。
[Example 6]
It was confirmed that it is possible to identify the origin species of proteins in foods and drinks containing various food materials.
＜試料＞
試料としては、原料表示から牛肉、豚肉、及び鶏卵が含まれていることが確認された市販のハンバーグと、馬肉と牛肉からなる市販のニューコンミート（塩漬け肉）を用いた。
ハンバーグとニューコンミートは、それぞれ、１０ｍｇを分取し、試験に供した。
<Sample>
As samples, a commercially available hamburger steak confirmed to contain beef, pork, and chicken eggs from the raw material label, and a commercially available new commeat (salted meat) consisting of horse meat and beef were used.
For each of the hamburger steak and the new commeat, 10 mg was dispensed and used for the test.
＜様々な食品素材を含む加工食品中のタンパク質の起源種判別＞
各試料からタンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。
この結果、ハンバーグから取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号１と配列番号２の牛肉特異的ペプチドと、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５の豚肉特異的ペプチドと、配列番号２１の鶏卵特異的ペプチドとが含まれていることが確認された。また、ニューコンミートから取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号２の牛肉特異的ペプチドと、ウマ特異的ペプチド（ＶＲＤＬＥＧＥＶＥＳＥＱＫＲ：配列番号４７、ｍｙｏｓｉｎ由来）とが含まれていることが確認された。
これらの結果から、様々な食品素材を含む加工食品であっても、当該加工食品に含まれている複数種類のタンパク質の起源種判別が可能であることが判った。
<Identification of the origin of protein in processed foods including various food materials>
After extracting the protein from each sample and digesting it with trypsin, the purified peptide was comprehensively analyzed by LC-MS / MS, and the amino acid sequence information of each peptide was obtained.
As a result, the amino acid sequence information obtained from the hamburger includes the beef-specific peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, the pork-specific peptides of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 21. It was confirmed that the chicken egg-specific peptide was contained. Further, it was confirmed that the amino acid sequence information obtained from New Conmeat contained the beef-specific peptide of SEQ ID NO: 2 and the horse-specific peptide (VRDLEGEVESEQKR: SEQ ID NO: 47, derived from myosin).
From these results, it was found that even in processed foods containing various food materials, it is possible to determine the origin species of a plurality of types of proteins contained in the processed foods.
［実施例７］
焼成食品中のタンパク質の起源種判別が可能であることを確認した。
[Example 7]
It was confirmed that the origin species of proteins in baked foods can be identified.
＜試料＞
試料としては、市販パンケーキ、市販バームクーヘン、及び市販フィナンシェを用いた。
これらの焼成食品は、それぞれ、１ｇを分取し、試験に供した。
<Sample>
Commercially available pancakes, commercially available Baumkuchen, and commercially available financiers were used as samples.
1 g of each of these baked foods was separated and subjected to the test.
＜焼成食品中のタンパク質の起源種判別＞
各試料からタンパク質を抽出し、トリプシン消化した後、精製したペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて網羅的に分析し、各ペプチドのアミノ酸配列情報を取得した。
この結果、パンケーキから取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号１３、配列番号１６、及び配列番号２１の鶏卵特異的ペプチドが含まれていることが確認された。また、バームクーヘンから取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号１３、配列番号１６、及び配列番号２１の鶏卵特異的ペプチドが含まれていることが確認された。フィナンシェから取得されたアミノ酸配列情報には、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号２１の鶏卵特異的ペプチドが含まれていることが確認された。
これらの結果から、焼成食品であっても、当該加工食品に含まれているタンパク質の起源種判別が可能であることが判った。
<Identification of the origin of protein in baked foods>
After extracting the protein from each sample and digesting it with trypsin, the purified peptide was comprehensively analyzed by LC-MS / MS, and the amino acid sequence information of each peptide was obtained.
As a result, it was confirmed that the amino acid sequence information obtained from the pancake contained the egg-specific peptides of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 21. It was also confirmed that the amino acid sequence information obtained from Baumkuchen contained the egg-specific peptides of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 21. It was confirmed that the amino acid sequence information obtained from Financier contained the egg-specific peptides of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 21.
From these results, it was found that it is possible to determine the origin species of the protein contained in the processed food even if it is a baked food.
Claims (9)
被験試料からタンパク質を抽出する抽出工程と、
前記抽出工程で得られた抽出物を、リジン又はアルギニンのＣ端側のペプチド結合を切断するプロテアーゼにより消化する消化工程と、
前記消化工程で得られたペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより解析し、そのペプチドのアミノ酸配列を同定する同定工程と、
前記同定工程で同定されたペプチドに、下記表の左欄のアミノ酸配列であるペプチドが含まれている場合に、当該被検試料中には当該左欄に対応する右欄の生物種を起源とするタンパク質が含まれていたと判別する判別工程と、
を有する、タンパク質の起源種判別方法。
Extraction process to extract protein from test sample and
A digestion step of digesting the extract obtained in the above extraction step with a protease that cleaves a peptide bond on the C-terminal side of lysine or arginine, and a digestion step.
An identification step of analyzing the peptide obtained in the digestion step by LC-MS / MS to identify the amino acid sequence of the peptide, and
When the peptide identified in the identification step contains a peptide having the amino acid sequence in the left column of the table below, the test sample originates from the species in the right column corresponding to the left column. And the determination step to determine that the protein was contained
A method for determining the origin and species of a protein.
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