JP2022049718A - Treatment of retinal degenerative disease by introduction of cx3cl1 gene using adeno-associated virus - Google Patents

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Abstract

To provide a prophylactic and/or therapeutic method for retinal degenerative diseases by gene therapy, and a prophylactic and/or therapeutic pharmaceutical composition for retinal degenerative diseases.SOLUTION: The introduction of the CX3CL1 gene using an adeno-associated virus (AAV) vector, particularly an AAV8 vector, exhibits a pyramidal cell protective action, and an AAV vector, particularly an AAV8 vector, carrying the CX3CL1 gene can be used as a prophylactic and/or therapeutic agent for retinal degenerative diseases.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）を用いたＣＸ３ＣＬ１遺伝子の導入による網膜変性疾患の予防又は治療方法、及び、ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターを有効成分として含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。 The present invention comprises a method for preventing or treating a retinal degenerative disease by introducing a CX3CL1 gene using an adeno-associated virus (AAV), and a retinal degenerative disease containing an AAV vector carrying the CX3CL1 gene as an active ingredient. With respect to pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of.

網膜は眼底に位置する組織であり、光の情報を電気信号に変え、脳に刺激を伝える役割を持つ。組織学的に幾つかの層に分けることができ、外側から網膜色素上皮層、内節・外節層、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層に分けられる。光刺激を電気信号に変換する役割を担う視細胞は核を外顆粒層に持ち、外節に光に反応するタンパク質オプシンを発現する。また、視細胞はそれぞれ暗所と明所で機能する杆体細胞と錐体細胞に分類できる。ヒトの網膜においては、杆体細胞は周辺部に位置し、錐体細胞は黄斑に密集している（中心窩に一番多い）ことが知られ、このため、杆体細胞は周辺視野を、錐体細胞は中心視野及び視力をつかさどることが知られている。 The retina is a tissue located in the fundus of the eye and has the role of converting light information into electrical signals and transmitting stimuli to the brain. It can be histologically divided into several layers. It is divided into fibrous layers. The photoreceptor cells, which are responsible for converting light stimuli into electrical signals, have nuclei in the outer nuclear layer and express the light-responsive protein opsin in the outer nodes. In addition, photoreceptor cells can be classified into rod cells and cone cells that function in the dark and bright areas, respectively. In the human retina, rod cells are known to be located in the peripheral area and cone cells are densely packed in the macula (most often in the fovea centralis), so rod cells view the peripheral visual acuity and the cones. Cells are known to control central visual field and visual acuity.

網膜色素変性症（Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ：ＲＰ）は、杆体細胞、錐体細胞、又は網膜色素上皮細胞における遺伝子変異が原因で視細胞及び網膜色素上皮細胞が変性する、数千人に一人の頻度で発症する病気である。多くの場合は杆体細胞に何らかの変異が認められ、まず杆体細胞の変性が発生し、患者は夜盲及び視野狭窄を経験する。更に病気が進行すると、二次的に錐体細胞の変性が起き、中心視力の低下及び最終的な失明に至る。現在、治療法は確立されておらず、患者の視覚機能を回復又は維持させる治療法が望まれている。 Retinitis pigmentosa (RP) occurs in one in thousands of people with degeneration of photoreceptor and retinal pigment epithelial cells due to genetic mutations in rod cells, pyramidal cells, or retinal pigment epithelial cells. Illness. In most cases, some mutations are found in the rod cells, first the degeneration of the rod cells occurs, and the patient experiences night blindness and tunnel vision. As the disease progresses further, pyramidal cell degeneration occurs secondarily, leading to diminished central visual acuity and ultimate blindness. Currently, no treatment method has been established, and a treatment method that restores or maintains the visual function of a patient is desired.

黄斑ジストロフィーは、錐体細胞が密集する黄斑が徐々に障害を受けることにより視力低下をきたす、遺伝性進行性疾患である。黄斑ジストロフィーは、スタルガルト黄斑ジストロフィー又は黄色斑眼底としても公知のスタルガルト病を含む。黄斑ジストロフィーは錐体細胞機能障害にともなう色覚異常、中心視力低下又は中心視野異常によって特徴付けられる。 Macular dystrophy is a hereditary progressive disease in which the macula, which is densely populated with pyramidal cells, is gradually damaged, resulting in decreased visual acuity. Macular dystrophy includes Stargard's macular dystrophy or Stargard's disease, also known as the macular fundus. Macular dystrophy is characterized by color vision deficiency, central visual acuity loss, or central visual field dysfunction associated with pyramidal cell dysfunction.

錐体杆体ジストロフィー（Ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＣＲＤ）及び杆体錐体ジストロフィー（Ｒｏｄ－ｃｏｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ＲＣＤ）は、錐体細胞及び杆体細胞の変性を引き起こし、多くの場合盲目をもたらす、遺伝性進行性疾患である。ＣＲＤは、錐体細胞の生存性低下又は細胞死と、続く杆体細胞の生存性低下又は細胞死によって特徴付けられる。対照的に、ＲＣＤは、杆体細胞の生存性低下又は細胞死と、続く錐体細胞の生存性低下又は細胞死によって特徴付けられる。 Pyramidal rod dystrophy (CRD) and rod-cone dystrophy (RCD) cause degeneration of pyramidal and rod cells, often leading to blindness, a hereditary progressive disease. Is. CRD is characterized by decreased viability or cell death of pyramidal cells, followed by decreased viability or cell death of rod cells. In contrast, RCD is characterized by reduced rod viability or cell death followed by pyramidal cell viability or cell death.

加齢性黄斑変性症（Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）は、黄斑変性症とも称され、高齢者に盲目を引き起こす病態である。加齢性黄斑変性症は、滲出性及び非滲出性のＡＭＤの両方を含む。非滲出性のＡＭＤは、ドライ型、萎縮性、又はドルーゼノイド（ｄｒｕｓｅｎｏｉｄ）（加齢性）黄斑変性症としても公知である。非滲出性のＡＭＤにおいて、ドルーゼンは、網膜色素上皮細胞に隣接するブルッフ膜に典型的に蓄積する。続いて、ドルーゼン及び障害された網膜色素上皮細胞が、黄斑における錐体細胞の機能に干渉すると、視力喪失が起こり得る。非滲出性のＡＭＤは、長年にわたり漸進的な視力喪失を生じる。非滲出性のＡＭＤは、滲出性のＡＭＤをもたらし得る。滲出性のＡＭＤは、ウェット型又は血管新生黄斑症としても知られ、急速に進行し、中心視力に重度の損傷を引き起こし得る。 Age-related macular degeneration (AMD), also called macular degeneration, is a condition that causes blindness in the elderly. Age-related macular degeneration includes both exudative and non-exudative AMD. Non-exudative AMD is also known as dry, atrophic, or drusenoid (age-related) macular degeneration. In non-exudative AMD, drusen typically accumulates in Bruch's membrane adjacent to retinal pigment epithelial cells. Subsequently, loss of vision can occur when drusen and impaired retinal pigment epithelial cells interfere with the function of pyramidal cells in the macula. Non-exudative AMD causes gradual loss of vision over the years. Non-exudative AMD can result in exudative AMD. Wet AMD, also known as wet or angiogenic macular degeneration, can progress rapidly and cause severe damage to central visual acuity.

マイクログリアは網膜内に存在するグリア細胞の一つである。近年、マイクログリアの網膜色素変性症における有害な作用が複数報告されており、新たな標的細胞として注目されている。正常な網膜ではマイクログリアは内網状層及び外網状層に局在するが、網膜色素変性症においては、外顆粒層に浸潤することが報告されている。浸潤したマイクログリアは活性化した形態をとっており、高い貪食機能を持っている。マイクログリアは一般的に、細胞死を起こした細胞の残骸を貪食し、除去することが知られているが、網膜色素変性症においては、マイクログリアが生きている視細胞も過剰に貪食してしまい、病態の進行を速めることが報告されている（非特許文献１）。また、活性化したマイクログリアはＴＮＦα等のサイトカインを放出し、それら自体が更なる視細胞の変性を誘導することも知られている。実際に、網膜色素変性症のモデルマウスであるｒｄ１０マウスにおいてマイクログリアの活性を抑制させると、病態進行を遅延できることが報告されている（Ｐｅｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１４年、第３４巻、８１３９～８１５０頁）。よって、マイクログリアを標的とする新規薬剤探索は網膜色素変性症の進行を抑制する新たな治療選択肢になる可能性がある。 Microglia are one of the glial cells present in the retina. In recent years, a plurality of harmful effects of microglia on retinitis pigmentosa have been reported, and they are attracting attention as new target cells. It has been reported that microglia are localized in the inner plexiform and outer plexiform layers in the normal retina, but infiltrate the outer nuclear layer in retinitis pigmentosa. The infiltrated microglia take an activated form and have a high phagocytic function. Microglia are generally known to phagocytose and remove debris from cells that have caused cell death, but in retinitis pigmentosa, microglia also over-phagoide living photoreceptors. It has been reported that the progression of the pathological condition is accelerated (Non-Patent Document 1). It is also known that activated microglia release cytokines such as TNFα, which themselves induce further degeneration of photoreceptor cells. In fact, it has been reported that suppression of microglial activity in rd10 mice, which are model mice for retinitis pigmentosa, can delay the progression of pathological conditions (Peng et al., J. Neuroscii., 2014, Vol. 34, 8139-8150). Therefore, the search for new drugs targeting microglia may become a new therapeutic option to suppress the progression of retinitis pigmentosa.

ＣＸ３ＣＬ１（ＦＫＮ，フラクタルカイン）は、ＣＸ３Ｃサブファミリーに属する唯一の遺伝子であり、正常な神経において恒常的に発現しているケモカインである。マイクログリアではその唯一の受容体であるＣＸ３ＣＲ１が発現している。ＣＸ３ＣＬ１はＮ末端からシグナルペプチド、ケモカインドメイン、ムチン様ストークドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインに分けられる。ＣＸ３ＣＬ１は膜貫通タンパク質として発現されるが、細胞外切断酵素であるＡＤＡＭ－１０やＡＤＡＭ－１７、カテプシンＳなどにより細胞外領域の根元が切断され、可溶型タンパク質として存在することが知られている。また、ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１シグナル経路はマイクログリアを非活性化状態に保つ機能を持つことが知られている。 CX3CL1 (FKN, fractalkine) is the only gene belonging to the CX3C subfamily and is a chemokine that is constitutively expressed in normal nerves. In microglia, its only receptor, CX3CR1, is expressed. CX3CL1 is divided into a signal peptide, a chemokine domain, a mucin-like stalk domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain from the N-terminal. CX3CL1 is expressed as a transmembrane protein, but it is known that the root of the extracellular region is cleaved by extracellular cleavage enzymes such as ADAM-10, ADAM-17, and cathepsin S, and the protein exists as a soluble protein. There is. Further, it is known that the CX3CL1 / CX3CR1 signal pathway has a function of keeping microglia in an inactivated state.

網膜色素変性症においては、リコンビナントＣＸ３ＣＬ１タンパク質を硝子体内投与することにより、マイクログリアの活性抑制及び病態の進行抑制を誘導することが報告されている（非特許文献１）。 In retinitis pigmentosa, it has been reported that intravitreal administration of recombinant CX3CL1 protein induces suppression of microglial activity and suppression of progression of pathological conditions (Non-Patent Document 1).

パーキンソン病及びアルツハイマー病においては、可溶型ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸を搭載したＡＡＶ９ベクターが、神経細胞脱落を抑制することが報告されている（特許文献１、非特許文献２、３及び４）。また、可溶型ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸を搭載したＡＡＶ４ベクターを脳室内に投与した結果、可溶型ＣＸ３ＣＬ１の分泌が確認されたことが記載されている（非特許文献５）。 In Parkinson's disease and Alzheimer's disease, it has been reported that an AAV9 vector carrying a nucleic acid encoding soluble CX3CL1 suppresses neuronal shedding (Patent Document 1, Non-Patent Documents 2, 3 and 4). Further, it is described that the secretion of soluble CX3CL1 was confirmed as a result of intraventricular administration of an AAV4 vector carrying a nucleic acid encoding soluble CX3CL1 (Non-Patent Document 5).

国際公開第２０１３／００６５１４号International Publication No. 2013/006514

Ｚａｂｅｌら、Ｇｌｉａ、２０１６年、第６４巻、１４７９～１４９１頁Zabel et al., Glia, 2016, Vol. 64, pp. 1479-1491. Ｎａｓｈら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、２０１５年、第２３巻、１７～２３頁Nash et al., Mol. The. , 2015, Volume 23, pp. 17-23 Ｎａｓｈら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ、２０１３年、第３４巻、１５４０～１５４８頁Nash et al., Neurobiol. Aging, 2013, Vol. 34, pp. 1540-1548 Ｍｏｒｇａｎｔｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１２年、第３２巻、１４５９２～１４６０１頁Morganti et al., J. Mol. Neurosci. , 2012, Vol. 32, pp. 14592-14601 Ｆｉｎｎｅｒａｎら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０１５年、第２４巻、７５７頁Finneran et al., Cell Transplantation, 2015, Vol. 24, p. 757.

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いたＣＸ３ＣＬ１遺伝子の導入による網膜変性疾患の予防又は治療方法、及び、ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターを有効成分として含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。 A method for preventing or treating retinal degenerative disease by introducing the CX3CL1 gene using an adeno-associated virus (AAV), and a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal degenerative disease, which comprises an AAV vector carrying the CX3CL1 gene as an active ingredient. offer.

本発明者らは、網膜変性疾患の遺伝子治療について鋭意検討した結果、ＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８ベクターを用いたＣＸ３ＣＬ１遺伝子の導入が錐体細胞保護作用を示すこと、ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクター、特にＡＡＶ８ベクターが、網膜変性疾患の予防又は治療剤として使用できることを知見して本発明を完成した。 As a result of diligent studies on gene therapy for retinal degenerative diseases, the present inventors have shown that the introduction of the CX3CL1 gene using an AAV vector, particularly the AAV8 vector, exhibits a pyramidal cell protective effect, and an AAV vector carrying the CX3CL1 gene, in particular. The present invention was completed by discovering that the AAV8 vector can be used as a prophylactic or therapeutic agent for retinal degenerative diseases.

本発明のある態様を以下に示す。
（１）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（２）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１）に記載の医薬組成物。
（３）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２）に記載の医薬組成物。
（４）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（３）に記載の医薬組成物。
（５）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（６）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（１）乃至（５）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（７）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（１）に記載の医薬組成物。
（８）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（１）乃至（７）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（９）進行期の網膜色素変性症の治療用である（８）に記載の医薬組成物。
（１０）網膜下に投与するための、（１）乃至（９）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（１１）硝子体内に投与するための、（１）乃至（９）のいずれか１つに記載の医薬組成物。 An embodiment of the present invention is shown below.
(1) A pharmaceutical composition for preventing or treating retinal degenerative diseases, which comprises a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 and an adeno-associated virus (AAV) vector containing an operably linked promoter to the nucleic acid molecule.
(2) The pharmaceutical composition according to (1), wherein the CX3CL1 is a soluble CX3CL1.
(3) The pharmaceutical composition according to (2), wherein the soluble CX3CL1 is a human soluble CX3CL1.
(4) The pharmaceutical composition according to (3), wherein the human soluble CX3CL1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(5) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (4), wherein the AAV vector is an AAV8 vector.
(6) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (5), wherein the promoter is a CMV-derived promoter.
(7) The AAV vector is an AAV8 vector containing a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule, according to (1). The pharmaceutical composition described.
(8) Described in any one of (1) to (7), wherein the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod pyramidal dystrophy. Pharmaceutical composition.
(9) The pharmaceutical composition according to (8) for treating retinitis pigmentosa in the advanced stage.
(10) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (9) for administration under the retina.
(11) The pharmaceutical composition according to any one of (1) to (9) for administration into the glass.

本発明の別の態様を以下に示す。
（１２）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療有効量を対象に投与することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法。
（１３）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１２）に記載の方法。
（１４）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１４）に記載の方法。
（１６）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（１２）乃至（１５）のいずれか１つに記載の方法。
（１７）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（１２）乃至（１６）のいずれか１つに記載の方法。
（１８）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（１２）に記載の方法。
（１９）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（１２）乃至（１８）のいずれか１つに記載の方法。
（２０）進行期の網膜色素変性症の治療のための（１９）に記載の方法。
（２１）投与がＡＡＶベクターの網膜下への投与である、（１２）乃至（２０）のいずれか１つに記載の方法。
（２２）投与がＡＡＶベクターの硝子体内への投与である、（１２）乃至（２０）のいずれか１つに記載の方法。 Another aspect of the present invention is shown below.
(12) Prevention or treatment of retinal degenerative diseases, including administration to a therapeutically effective amount of an adeno-associated virus (AAV) vector containing a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 and a promoter operably linked to the nucleic acid molecule. Method.
(13) The method according to (12), wherein the CX3CL1 is a soluble CX3CL1.
(14) The method according to (13), wherein the soluble CX3CL1 is a human soluble CX3CL1.
(15) The method according to (14), wherein the human soluble CX3CL1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(16) The method according to any one of (12) to (15), wherein the AAV vector is an AAV8 vector.
(17) The method according to any one of (12) to (16), wherein the promoter is a CMV-derived promoter.
(18) The AAV vector is an AAV8 vector containing a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule, according to (12). The method described.
(19) The method according to any one of (12) to (18), wherein the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod cone dystrophy. the method of.
(20) The method according to (19) for the treatment of retinitis pigmentosa in the advanced stage.
(21) The method according to any one of (12) to (20), wherein the administration is subretinal administration of the AAV vector.
(22) The method according to any one of (12) to (20), wherein the administration is intravitreal administration of an AAV vector.

本発明の別の態様を以下に示す。
（２３）網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造のためのＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用。
（２４）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２３）に記載の使用。
（２５）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（２４）に記載の使用。
（２６）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（２５）に記載の使用。
（２７）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（２３）乃至（２６）のいずれか１つに記載の使用。
（２８）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（２３）乃至（２７）のいずれか１つに記載の使用。
（２９）前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（２３）に記載の使用。
（３０）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（２３）乃至（２９）のいずれか１つに記載の使用。
（３１）進行期の網膜色素変性症の治療用医薬組成物の製造のための（３０）に記載の使用。
（３２）医薬組成物が網膜下に投与するための医薬組成物である、（２３）乃至（３１）のいずれか１つに記載の使用。
（３３）医薬組成物が硝子体内に投与するための医薬組成物である、（２３）乃至（３１）のいずれか１つに記載の使用。 Another aspect of the present invention is shown below.
(23) Use of an adeno-associated virus (AAV) vector comprising a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 and a promoter operably linked to the nucleic acid molecule for the production of pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of retinal degenerative diseases.
(24) The use according to (23), wherein the CX3CL1 is a soluble CX3CL1.
(25) The use according to (24), wherein the soluble CX3CL1 is a human soluble CX3CL1.
(26) The use according to (25), wherein the human soluble CX3CL1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(27) The use according to any one of (23) to (26), wherein the AAV vector is an AAV8 vector.
(28) The use according to any one of (23) to (27), wherein the promoter is a CMV-derived promoter.
(29) The AAV vector is an AAV8 vector containing a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule, according to (23). Use of description.
(30) The method according to any one of (23) to (29), wherein the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod cone dystrophy. Use of.
(31) The use according to (30) for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of retinitis pigmentosa in the advanced stage.
(32) The use according to any one of (23) to (31), wherein the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for administration under the retina.
(33) The use according to any one of (23) to (31), wherein the pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for administration into the glass.

本発明の別の態様を以下に示す。
（３４）網膜変性疾患の予防又は治療のためのＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用。
（３５）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（３４）に記載の使用。
（３６）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（３５）に記載の使用。
（３７）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（３６）に記載の使用。
（３８）前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、（３４）乃至（３７）のいずれか１つに記載の使用。
（３９）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（３４）乃至（３８）のいずれか１つに記載の使用。
（４０）前記ＡＡＶベクターが配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、（３４）に記載の使用。
（４１）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（３４）乃至（４０）のいずれか１つに記載の使用。
（４２）進行期の網膜色素変性症の治療のための（４１）に記載の使用。
（４３）予防又は治療がＡＡＶベクターを網膜下に投与することによる、（３４）乃至（４２）のいずれか１つに記載の使用。
（４４）予防又は治療がＡＡＶベクターを硝子体内に投与することによる、（３４）乃至（４２）のいずれか１つに記載の使用。 Another aspect of the present invention is shown below.
(34) Use of an adeno-associated virus (AAV) vector containing a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 for the prevention or treatment of retinal degenerative diseases and a promoter operably linked to the nucleic acid molecule.
(35) The use according to (34), wherein the CX3CL1 is a soluble CX3CL1.
(36) The use according to (35), wherein the soluble CX3CL1 is a human soluble CX3CL1.
(37) The use according to (36), wherein the human soluble CX3CL1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(38) The use according to any one of (34) to (37), wherein the AAV vector is an AAV8 vector.
(39) The use according to any one of (34) to (38), wherein the promoter is a CMV-derived promoter.
(40) The AAV8 vector, wherein the AAV vector comprises a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule, according to (34). Use of.
(41) The method according to any one of (34) to (40), wherein the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod cone dystrophy. Use of.
(42) The use according to (41) for the treatment of retinitis pigmentosa in the advanced stage.
(43) The use according to any one of (34) to (42), wherein the prophylaxis or treatment is by administering the AAV vector subretinal.
(44) The use according to any one of (34) to (42), wherein the prevention or treatment is by administering the AAV vector into the vitreous.

本発明の別の態様を以下に示す。
（４５）ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）８ベクター。
（４６）前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（４５）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４７）前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、（４６）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４８）前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（４７）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（４９）前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、（４５）乃至（４８）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター。
（５０）ＡＡＶ８ベクターが、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである、（４５）乃至（４９）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター。
（５１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含む、（４５）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（５２）前記ＡＡＶ８ベクターが、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである、（５１）に記載のＡＡＶ８ベクター。
（５３）（４５）乃至（５２）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクター、及び一以上の賦形剤を含有する医薬組成物。
（５４）網膜変性疾患の予防又は治療用である（５３）に記載の医薬組成物。
（５５）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（５４）に記載の医薬組成物。
（５６）進行期の網膜色素変性症の治療用である（５５）に記載の医薬組成物。
（５７）網膜下に投与するための、（５３）乃至（５６）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（５８）硝子体内に投与するための、（５３）乃至（５６）のいずれか１つに記載の医薬組成物。
（５９）（４５）乃至（５２）のいずれか１つに記載のＡＡＶ８ベクターを用いて、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を視細胞及び／又は網膜色素上皮細胞に導入することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法。
（６０）網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、（５９）に記載の方法。
（６１）進行期の網膜色素変性症の治療のための（６０）に記載の方法。 Another aspect of the present invention is shown below.
(45) An adeno-associated virus (AAV) 8 vector comprising a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 and a promoter operably linked to the nucleic acid molecule.
(46) The AAV8 vector according to (45), wherein the CX3CL1 is a soluble CX3CL1.
(47) The AAV8 vector according to (46), wherein the soluble CX3CL1 is a human soluble CX3CL1.
(48) The AAV8 vector according to (47), wherein the human soluble CX3CL1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(49) The AAV8 vector according to any one of (45) to (48), wherein the promoter is a CMV-derived promoter.
(50) The AAV8 vector according to any one of (45) to (49), wherein the AAV8 vector is a self-complementary AAV8 vector.
(51) The AAV8 vector according to (45), which comprises a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule.
(52) The AAV8 vector according to (51), wherein the AAV8 vector is a self-complementary AAV8 vector.
(53) A pharmaceutical composition containing the AAV8 vector according to any one of (45) to (52) and one or more excipients.
(54) The pharmaceutical composition according to (53) for the prevention or treatment of retinal degenerative diseases.
(55) The pharmaceutical composition according to (54), wherein the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod cone dystrophy.
(56) The pharmaceutical composition according to (55) for the treatment of retinitis pigmentosa in the advanced stage.
(57) The pharmaceutical composition according to any one of (53) to (56) for administration under the retina.
(58) The pharmaceutical composition according to any one of (53) to (56) for administration into the glass.
(59) A retinal degenerative disease comprising introducing a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 into photoreceptor cells and / or retinal pigment epithelial cells using the AAV8 vector according to any one of (45) to (52). Prevention or treatment method.
(60) The method according to (59), wherein the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod cone dystrophy.
(61) The method according to (60) for the treatment of retinitis pigmentosa in the advanced stage.

ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターは、網膜変性疾患の予防及び／又は治療剤として使用できる。 The AAV vector carrying the CX3CL1 gene can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for retinal degenerative diseases.

図１は、マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクタープラスミドであるｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のベクターマップを示す。FIG. 1 shows a vector map of pscAAV-MCS-mouse soluble Cx3cl1 which is an AAV vector plasmid carrying the mouse soluble Cx3cl1 gene. 図２は、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクタープラスミドであるｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１のベクターマップを示す。FIG. 2 shows a vector map of pscAAV-MCS-human soluble CX3CL1 which is an AAV vector plasmid carrying the human soluble CX3CL1 gene. 図３は、マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子を搭載したＡＡＶ８ベクター（ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１）のｒｄ１０マウスへの各種用量での投与による、マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の網膜組織での発現を示す。縦軸は対照ビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）投与群の網膜組織におけるＣｘ３ｃｌ１の遺伝子発現の平均を１とした時の相対的な発現値を表す。横軸は投与群を表す。グラフ内の棒はそれぞれの群における平均値±平均値の標準誤差を示す。FIG. 3 shows the expression of mouse-soluble Cx3cl1 in retinal tissue by administration of an AAV8 vector (rAAV8-mouse-soluble Cx3cl1) carrying the mouse-soluble Cx3cl1 gene to rd10 mice at various doses. The vertical axis represents the relative expression value when the average gene expression of Cx3cl1 in the retinal tissue of the control vehicle-administered group is 1. The horizontal axis represents the administration group. The bars in the graph show the mean ± standard error of the mean in each group. 図４は、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のｒｄ１０マウスへの投与による、マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の網膜組織での経時的遺伝子発現変化を示す。図中の丸印、四角印、及び三角印は、それぞれの投与群を示す。縦軸は各評価日における対照ビヒクル群の網膜におけるＣｘ３ｃｌ１の遺伝子発現の平均を１とした時の相対的な発現値を表す。横軸は薬剤投与後の日数を表す。グラフ内の棒はそれぞれの群における平均値±平均値の標準誤差を示す。FIG. 4 shows changes in gene expression of mouse-soluble Cx3cl1 in the retinal tissue over time by administration of rAAV8-mouse-soluble Cx3cl1 to rd10 mice. Circles, squares, and triangles in the figure indicate the respective administration groups. The vertical axis represents the relative expression value when the average of Cx3cl1 gene expression in the retina of the control vehicle group on each evaluation day is 1. The horizontal axis represents the number of days after drug administration. The bars in the graph show the mean ± standard error of the mean in each group. 図５は、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のｒｄ１０マウスへの投与による、マウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１タンパク質の硝子体における発現を示す。縦軸は硝子体におけるＣＸ３ＣＬ１のタンパク質の濃度を表す。横軸は投与群を表す。グラフ内の棒はそれぞれの群における平均値±平均値の標準誤差を示す。FIG. 5 shows the expression of mouse-soluble CX3CL1 protein in the vitreous by administration of rAAV8-mouse-soluble Cx3cl1 to rd10 mice. The vertical axis represents the protein concentration of CX3CL1 in the vitreous. The horizontal axis represents the administration group. The bars in the graph show the mean ± standard error of the mean in each group. 図６は、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のｒｄ１０マウスへの投与による、マウス型ＣＸ３ＣＬ１タンパク質の血漿における検出を示す。縦軸は血漿におけるＣＸ３ＣＬ１のタンパク質の濃度を表す。横軸は投与群を表す。グラフ内の棒はそれぞれの群における平均値±平均値の標準誤差を示す。FIG. 6 shows the detection of mouse CX3CL1 protein in plasma by administration of rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 to rd10 mice. The vertical axis represents the protein concentration of CX3CL1 in plasma. The horizontal axis represents the administration group. The bars in the graph show the mean ± standard error of the mean in each group. 図７は、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のｒｄ１０マウスへの投与による、視覚運動反応保護作用を示す。縦軸は視覚運動反応に基づくマウスが認識できる空間周波数の限界（ｃ／ｄ）を表す。横軸は投与群を表す。グラフ内の棒はそれぞれ平均値±平均値の標準誤差を示す。FIG. 7 shows the visual-motor response protective effect by administration of rAAV8-mouse-soluble Cx3cl1 to rd10 mice. The vertical axis represents the limit (c / d) of the spatial frequency that can be recognized by the mouse based on the visual movement response. The horizontal axis represents the administration group. The bars in the graph indicate the standard error of the mean ± mean. 図８は、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のｒｄ１０マウスへの投与による、錐体細胞保護作用を示す。縦軸は観察エリアあたりにおける抗錐体オプシン抗体陽性である細胞（外節）数（錐体オプシン数）の平均を表す。横軸は投与群を表す。グラフ内の棒はそれぞれ平均値±平均値の標準誤差を示す。＊＊Ｐ＜０．０１、ダネット多重比較検定。FIG. 8 shows the pyramidal cell protective effect by administration of rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 to rd10 mice. The vertical axis represents the average number of cells (outer segment) positive for antipyramidal opsin antibody (number of pyramidal opsin) per observation area. The horizontal axis represents the administration group. The bars in the graph indicate the standard error of the mean ± mean. ** P <0.01, Dunnett's multiple comparison test. 図９は、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のｒｄ１０マウスへの投与による、錐体細胞保護作用を示す。縦軸は観察エリアあたりにおける抗錐体オプシン抗体陽性である細胞（外節）数（錐体オプシン数）の平均を表す。横軸は投与群を表す。グラフ内の棒はそれぞれ平均値±平均値の標準誤差を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ダネット多重比較検定。FIG. 9 shows the pyramidal cell protective effect by administration of rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 to rd10 mice. The vertical axis represents the average number of cells (outer segment) positive for antipyramidal opsin antibody (number of pyramidal opsin) per observation area. The horizontal axis represents the administration group. The bars in the graph indicate the standard error of the mean ± mean. * P <0.05, ** P <0.01, Dunnett's multiple comparison test.

以下、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書中で使用される用語が具体的に定義されていない場合、当該用語は、当業者に一般的に受け入れられている意味で使用される。 Hereinafter, the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited thereto. If the terms used herein are not specifically defined, they will be used in the sense generally accepted by those of skill in the art.

本発明は、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（以下、「本発明のＡＡＶベクター」とも称する）、並びに、本発明のＡＡＶベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」とも称する）を提供する。 The present invention includes an adeno-associated virus (AAV) vector containing a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 and a promoter operably linked to the nucleic acid molecule (hereinafter, also referred to as “AAV vector of the present invention”), and the present invention. Provided is a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal degenerative diseases (hereinafter, also referred to as “pharmaceutical composition of the present invention”) containing an AAV vector.

＜本発明のＡＡＶベクター＞
１．ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子
本発明のＡＡＶベクターは、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を含む。ＣＸ３ＣＬ１は、正常な神経において恒常的に発現しているケモカインであり、Ｎ末端からシグナルペプチド、ケモカインドメイン、ムチン様ストークドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインから構成される。天然において、ＣＸ３ＣＬ１は膜貫通タンパク質として発現されるが、細胞外切断酵素で切断され、可溶型ＣＸ３ＣＬ１としても存在できる。 <AAV vector of the present invention>
1. 1. Nucleic Acid Molecule Encoding CX3CL1 The AAV vector of the present invention comprises a nucleic acid molecule encoding CX3CL1. CX3CL1 is a chemokine that is constitutively expressed in normal nerves and is composed of a signal peptide, a chemokine domain, a mucin-like stalk domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain from the N-terminus. In nature, CX3CL1 is expressed as a transmembrane protein, but can also be cleaved by an extracellular cleavage enzyme and present as soluble CX3CL1.

本発明において、ＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在するＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、哺乳動物由来のＣＸ３ＣＬ１であり、ある態様では、ヒトＣＸ３ＣＬ１である。本発明において、ヒトＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在するヒトＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。 In the present invention, CX3CL1 includes naturally occurring CX3CL1 and a variant having a function thereof. In some embodiments, the CX3CL1 is a mammalian-derived CX3CL1 and in some embodiments is a human CX3CL1. In the present invention, the human CX3CL1 includes a naturally occurring human CX3CL1 and a variant having a function thereof.

本発明において、ＣＸ３ＣＬ１には、全長型（膜貫通型）ＣＸ３ＣＬ１及び可溶型ＣＸ３ＣＬ１が含まれる。ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、可溶型ＣＸ３ＣＬ１である。本発明において、「可溶型ＣＸ３ＣＬ１」とは、ケモカインドメイン及びムチン様ストークドメインを含み、かつ、膜貫通ドメインと細胞内ドメインを含まないＣＸ３ＣＬ１ポリペプチドをいう。可溶型ＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在する可溶型ＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である。本発明において、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１には、天然に存在するヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１及びその機能を有する改変体が含まれる。 In the present invention, the CX3CL1 includes a full-length type (transmembrane type) CX3CL1 and a soluble type CX3CL1. In some embodiments, the CX3CL1 is a soluble CX3CL1. In the present invention, the "soluble CX3CL1" refers to a CX3CL1 polypeptide containing a chemokine domain and a mucin-like stalk domain and not containing a transmembrane domain and an intracellular domain. Soluble CX3CL1 includes naturally occurring soluble CX3CL1 and variants having its function. In some embodiments, the CX3CL1 is a human soluble CX3CL1. In the present invention, the human soluble CX3CL1 includes a naturally occurring human soluble CX3CL1 and a variant having a function thereof.

ある態様では、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、アクセッション番号ＮＭ＿００２９９６．６のコーディング領域（配列番号１）を翻訳した配列（配列番号２）のアミノ酸番号１から３３８までのアミノ酸配列（配列番号４）からなるポリペプチドである。別の態様では、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１～数個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～５個、１～３個、又は１～２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能を有するポリペプチドである。別の態様では、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能を有するポリペプチドである。 In some embodiments, the human soluble CX3CL1 is from the amino acid sequences (SEQ ID NO: 4) from amino acids 1 to 338 of the sequence (SEQ ID NO: 2) translated from the coding region (SEQ ID NO: 1) of accession number NM_0029966.6. Polypeptide. In another aspect, the human soluble CX3CL1 has 1 to several, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, still more preferably 1 to 5, 1 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. It is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which ~ 3 or 1-2 amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and has the function of human soluble CX3CL1. In another aspect, the human soluble CX3CL1 comprises an amino acid sequence having at least 90%, 95%, or 98% identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and is functional to the human soluble CX3CL1. It is a polypeptide having.

ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１は、マウスＣＸ３ＣＬ１であり、ある態様では、マウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１である。ある態様では、マウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１は、アクセッション番号ＮＭ＿００９１４２．３のコーディング領域（配列番号５）を翻訳した配列（配列番号６）のアミノ酸番号１から３３６までのアミノ酸配列（配列番号８）からなるポリペプチドである。 In some embodiments, the CX3CL1 is the mouse CX3CL1 and in some embodiments the mouse soluble CX3CL1. In some embodiments, the mouse soluble CX3CL1 is from the amino acid sequences (SEQ ID NO: 8) from amino acids 1 to 336 of the sequence (SEQ ID NO: 6) translated from the coding region (SEQ ID NO: 5) of accession number NM_009142.3. Polypeptide.

本明細書において、「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、第４８巻、４４３～４５３頁）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下の通りである。
Ｇａｐ Ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１０
Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５
Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２ As used herein, "identity" refers to the parameters provided by default by the EMBOSS NEEDLE program (Needleman et al., J. Mol. Biol., 1970, Vol. 48, pp. 443-453). It means the obtained value Identity. The above parameters are as follows.
Gap Open penalty = 10
Gap Extension penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62

本発明において、ＣＸ３ＣＬ１又は可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能として、ＣＸ３ＣＲ１受容体に結合する能力が挙げられる。また、ＣＸ３ＣＬ１又は可溶型ＣＸ３ＣＬ１の機能として、マイクログリアの活性を抑制する能力が挙げられる。このようなＣＸ３ＣＬ１の機能は、公知の方法を用いて当業者に容易に評価され得る。 In the present invention, one of the functions of CX3CL1 or soluble CX3CL1 is the ability to bind to the CX3CR1 receptor. Further, as a function of CX3CL1 or soluble type CX3CL1, the ability to suppress the activity of microglia can be mentioned. Such a function of CX3CL1 can be easily evaluated by those skilled in the art using known methods.

ある態様では、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子であり、ある態様では、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる核酸分子である。 In one embodiment, the nucleic acid molecule encoding CX3CL1 is a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and in one embodiment comprises a polynucleotide consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3. It is a nucleic acid molecule.

ＣＸ３ＣＬ１をコードする「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドアナログを使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡのアナログが含まれる。当該核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ある態様としては、一本鎖ＤＮＡである。 "Nucleic acid molecules" encoding CX3CL1 include DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (eg, mRNA) as well as DNA or RNA analogs produced using nucleotide analogs. The nucleic acid molecule may be single-stranded or double-stranded, and in one embodiment, it is single-stranded DNA.

ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子は、公的に利用可能な配列情報に基づき、当該分野で公知の標準的なポリヌクレオチド合成法を使用して合成することができる。また、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を一旦取得すれば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１－８．５）等の当業者に公知の方法を使用して、所定の部位に変異を導入することによって、ＣＸ３ＣＬ１の機能を有する改変体を作製することも可能である。 The nucleic acid molecule encoding CX3CL1 can be synthesized using standard polynucleotide synthesis methods known in the art, based on publicly available sequence information. Further, once the nucleic acid molecule encoding CX3CL1 is obtained, it is known to those skilled in the art such as a site-directed mutagen (Current Protocols in Molecular Biology edition, 1987, John Wiley & Sons Section 8.1-8.5). It is also possible to make a variant having the function of CX3CL1 by introducing a mutation at a predetermined site using the method.

２．ＡＡＶベクター
本発明では、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子を搭載するベクターとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する。ＡＡＶは、ＡＡＶの宿主細胞への感染や複製に必要な機能をコードする遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子）及び末端逆位反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ：ＩＴＲ）を含む一本鎖ＤＮＡ分子からなるゲノム（ＡＡＶゲノム）を有するエンベロープを持たない正十二面体ウイルスである。ＡＡＶは、非病原性であり、非分裂期の細胞へも感染できることが知られている。ＡＡＶには１００を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。ＡＡＶベクターは、キャプシド、及びそれに封入された、１つ以上のＩＴＲが隣接した異種核酸分子配列を含むゲノム（ＡＡＶベクターゲノム）を含む。 2. 2. AAV vector In the present invention, an adeno-associated virus (AAV) vector is used as a vector carrying a nucleic acid molecule encoding CX3CL1. AAV is a genome consisting of single-stranded DNA molecules containing genes (Rep and Cap genes) encoding functions required for infection and replication of AAV to host cells and inverted periodic repeats (ITR). It is a non-enveloped regular duohedral virus with (AAV genome). AAV is known to be non-pathogenic and can also infect non-mitotic cells. There are more than 100 serotypes in AAV, and it is known that the host range and the characteristics of the virus differ depending on the serotype. AAV vectors include a capsid and a genome containing a heterologous nucleic acid molecule sequence flanked by one or more ITRs (AAV vector genome).

本発明で使用されるＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第７，０５６，５０２号及びＹａｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、２００２年、７６巻、２０４３～２０５３頁に記載されているＡＡＶベクターであり、具体的には、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター（例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉら、２０１１年、３６５巻、２３５７～２３６５頁）等である。ある態様では、本発明で使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８ベクターである（例えば、国際公開第２００３／０５２０５１号）。本発明で使用されるＡＡＶベクターに含まれるＩＴＲは、野生型の配列であってもよく、或いは、ＩＴＲの機能を有する改変体又は後述の自己相補型ベクターで使用される変異を含むＩＴＲ（変異ＩＴＲ）であってもよい。ある態様では、本発明で使用されるＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等に由来のＩＴＲ又はその変異ＩＴＲである。ある態様では、本発明で使用されるＩＴＲは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ又はその変異ＩＴＲである。 The AAV vectors used in the present invention are, for example, US Pat. No. 7,056,502 and Yan et al., J. Mol. Vilol. , 2002, Vol. 76, pp. 2043-2053, specifically AAV1 vector, AAV2 vector, AAV3 vector, AAV4 vector, AAV5 vector, AAV8 vector, AAV9 vector, AAV2 / 8. Vectors (eg, Nathwani et al., 2011, Vol. 365, pp. 2357-2365) and the like. In some embodiments, the AAV vector used in the present invention is an AAV8 vector (eg, WO 2003/052051). The ITR contained in the AAV vector used in the present invention may be a wild-type sequence, or an ITR (mutation) containing a variant having a function of ITR or a mutation used in a self-complementary vector described later. It may be ITR). In some embodiments, the ITR used in the present invention is an ITR derived from AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9, etc. or a mutant ITR thereof. In some embodiments, the ITR used in the present invention is an AAV2-derived ITR or a mutant ITR thereof.

ある態様では、本発明で使用されるＡＡＶベクターは、自己相補型ＡＡＶ（Ｓｅｌｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ（ｓｃ））ＡＡＶ）ベクターである。ある態様では、本発明で使用されるＡＡＶベクターは、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである。自己相補型ＡＡＶベクターは、自己相補性のＡＡＶベクターゲノムを有するＡＡＶベクターである（例えば、国際公開第２００１／０９２５５１号、国際公開第２００１／０１１０３４号）。通常のＡＡＶベクターでは、ベクターゲノムが一本鎖ＤＮＡであるために宿主細胞への感染後に一本鎖ゲノムから二本鎖ゲノムを形成ためには時間がかかる。一方、自己相補型ＡＡＶベクターでは、連結された異種核酸分子配列とその相補配列を有するベクターゲノム（自己相補性ベクターゲノム）を含み、宿主細胞内で速やかに二本鎖ゲノムを形成する。自己相補型ＡＡＶベクターのある態様において、変異ＩＴＲによって連結された異種核酸分子配列とその相補配列を含み、さらに両端に２つのＩＴＲを有する。変異ＩＴＲはＤシーケンス（パッケージングシグナル）が欠損し、Δｔｒｓ（末端切断領域（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）の変異）が含まれる構造を有する。当該構造はＲｅｐを介したニッキングを防ぎ、自己相補性ベクターゲノムのパッケージングを誘導することができる。 In some embodiments, the AAV vector used in the present invention is a self-complementary AAV (Self-complementary (sc)) AAV) vector. In some embodiments, the AAV vector used in the present invention is a self-complementary AAV8 vector. A self-complementary AAV vector is an AAV vector having a self-complementary AAV vector genome (eg, WO 2001/092551, WO 2001/011034). In a normal AAV vector, since the vector genome is single-stranded DNA, it takes time to form a double-stranded genome from the single-stranded genome after infection of a host cell. On the other hand, the self-complementary AAV vector contains a linked heterologous nucleic acid molecular sequence and a vector genome (self-complementary vector genome) having the complementary sequence thereof, and rapidly forms a double-stranded genome in the host cell. In some embodiments of a self-complementary AAV vector, it comprises a heterologous nucleic acid molecule sequence linked by a mutant ITR and its complementary sequence, and further has two ITRs at both ends. The mutant ITR has a structure in which the D sequence (packaging signal) is deleted and Δtrs (mutation of the terminal cleavage site) is included. The structure can prevent Rep-mediated nicking and induce packaging of the self-complementary vector genome.

３．プロモーター
本発明のＡＡＶベクターは、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。「作動可能に連結された」とは、目的の核酸分子にコードされたタンパク質が宿主細胞において発現可能なように１以上のプロモーターが目的の核酸分子に連結されていることを意味する。本発明において使用されるプロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター、並びに当業者に公知の他のウイルス及び真核細胞プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ある態様として、本発明において使用されるプロモーターは、ＣＭＶ由来プロモーターである。ある態様として、本発明において使用されるプロモーターは、組織特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターの例としては、網膜色素上皮細胞特異的プロモーター、視細胞特異的プロモーター、杆体細胞特異的プロモーター、及び錐体細胞特異的プロモーターが挙げられる。より具体的な例としては、Ｎｒｌ、Ｃｒｘ、Ｒａｘ（Ｍａｔｓｕｄａ及びＣｅｐｋｏ、２００７年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０４巻、１０２７～１０３２頁）、オプシンプロモーター、光受容体間レチノイド結合タンパク質プロモーター（ＩＲＢＰ１５６）、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、神経ロイシンジッパー（ＮＲＬＬ）プロモーター（例えば、Ｓｅｍｐｌｅ－Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｍｏｌ． Ｖｉｓ．、２０１０年、１６巻、９１６～９３４頁を参照）が挙げられる。別の態様としては、錐体アレスチンプロモーター、Ｃａｂｐ５プロモーター、Ｃｒａｌｂｐプロモーター、Ｎｄｒｇ４プロモーター、ベストロフィン１プロモーター、チキンベータアクチン（ＣＢＡプロモーター）、クラスタリンプロモーター、Ｈｅｓ１プロモーター、ビメンチンプロモーター、表面抗原分類（ＣＤ４４）プロモーター及びグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが挙げられる。 3. 3. Promoter The AAV vector of the invention comprises a promoter operably linked to a nucleic acid molecule encoding CX3CL1. By "operably linked" is meant that one or more promoters are linked to the nucleic acid molecule of interest so that the protein encoded by the nucleic acid molecule of interest can be expressed in the host cell. Promoters used in the present invention include, but are not limited to, the SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) -derived promoters, and other viruses and eukaryotic cell promoters known to those of skill in the art. In one embodiment, the promoter used in the present invention is a CMV-derived promoter. In one embodiment, the promoter used in the present invention is a tissue-specific promoter. Examples of tissue-specific promoters include retinal pigment epithelial cell-specific promoters, photoreceptor cell-specific promoters, rod cell-specific promoters, and cone cell-specific promoters. More specific examples include Nrl, Crx, Rax (Masuda and Cepko, 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 104, pp. 1027-1032), opsin promoter, photoreceptive. Interbody retinoid binding protein promoter (IRBP156), rhodopsin kinase (RK) promoter, neuroleucine zipper (NRLL) promoter (see, eg, Single-Roland et al., Mol. Vis., 2010, Vol. 16, pp. 916-934). Can be mentioned. In another embodiment, pyramidal arrestin promoter, Cabp5 promoter, Cralbp promoter, Ndrg4 promoter, bestlophin 1 promoter, chicken beta actin (CBA promoter), clusterlin promoter, Hes1 promoter, vimentin promoter, surface antigen classification (CD44) promoter. And the glia fibrous acid protein (GFAP) promoter.

本発明のＡＡＶベクターは、プロモーターの他にも、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ（Ａ））、コザック配列等（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９０年、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）の発現調節配列を含んでもよい。 In addition to the promoter, the AAV vector of the present invention includes enhancers, polyadenylation signals (poly (A)), Kozak sequences and the like (eg, Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Energy, 1990, 185, Academic Press). It may contain an expression-regulating sequence of San Diego, Calif.).

ある態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含む、ＡＡＶ８ベクターである。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含む、自己相補型ＡＡＶ８ベクターである。 In some embodiments, the AAV vector of the invention is an AAV8 vector comprising a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule. In some embodiments, the AAV vector of the invention is a self-complementary AAV8 vector comprising a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule. Is.

＜本発明のＡＡＶベクターを製造する方法＞
本発明のＡＡＶベクターは、当該分野で公知の方法を使用して製造することができる。製造方法の一例としては、第一に、野生型ＡＡＶゲノムから、両端のＩＴＲを残して、Ｒｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子の代わりに、異種核酸分子（例えば、ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子）配列を挿入したＡＡＶベクタープラスミドを作製する。また、ＡＡＶヘルパー機能を補完するＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子を含むプラスミド、及び、ＡＡＶの複製を促進するヘルパーウイルス付属遺伝子（例えば、領域ＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ４）を含むプラスミドを準備する。これらの３つのプラスミドをパッケージング細胞にコトランスフェクトすることで該細胞内に組換ＡＡＶ（即ち、ＡＡＶベクター）が産生される。その後、パッケージング細胞を培養して、ＡＡＶベクターを生成し、当該分野において公知の標準的技術を使用して、ＡＡＶベクターを精製する。使用されるパッケージング細胞の例としては、哺乳動物細胞、具体的には、Ａ５４９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞が挙げられる。精製方法としては、塩化セシウム密度勾配遠心分離法、ベンゾナーゼを用いたＤＮＡ及びＲＮＡの消化、ショ糖勾配遠心分離法、イオジキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）密度勾配遠心分離法、限外ろ過法、ダイアフィルトレーション法、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、ポリエチレングリコール沈殿法や硫酸アンモニウム沈殿法などを用いることができる。 <Method for Producing AAV Vector of the Present Invention>
The AAV vector of the present invention can be produced using a method known in the art. As an example of the production method, first, a heterologous nucleic acid molecule (for example, a nucleic acid molecule encoding CX3CL1) sequence was inserted from the wild-type AAV genome in place of the Rep gene and the Cap gene, leaving the ITRs at both ends. Create an AAV vector plasmid. In addition, a plasmid containing the Rep gene and Cap gene of AAV that complements the AAV helper function, and a plasmid containing a helper virus-associated gene (for example, regions VA, E2A, E4) that promotes replication of AAV are prepared. Cotransfection of these three plasmids into packaging cells produces recombinant AAV (ie, AAV vectors) within the cells. The packaging cells are then cultured to generate an AAV vector and the AAV vector is purified using standard techniques known in the art. Examples of packaging cells used include mammalian cells, specifically A549 cells, HeLa cells, HEK293 cells, HEK293T17 cells. Purification methods include cesium chloride density gradient centrifugation, DNA and RNA digestion using benzoase, sucrose gradient centrifugation, Iodixanol density gradient centrifugation, ultrafiltration, and diafiltration. , Affinity chromatography method, ion exchange chromatography method, polyethylene glycol precipitation method, ammonium sulfate precipitation method and the like can be used.

本発明のＡＡＶベクターの製造方法として、別の態様では、ＡＡＶベクターゲノムは、バキュロウイルスとしてパッケージングされ、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞に導入されてもよい。この際、Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子も別のバキュロウイルスによって同様に昆虫細胞に導入される。バキュロウイルスは、ＡＡＶベクターの効率的な産生のために必要な遺伝子を含んでいてもよい。次に、２種のバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞を培養してＡＡＶベクターを生成し、当該分野で公知の方法を使用してＡＡＶベクターを精製し、製剤化することができる（例えば、米国特許第５４３６１４６号、同第５７５３５００号、同第６０９３５７０号、及び同第６５４８２８６号、ＵＳ２００２／０１６８３４２）。 As a method of producing the AAV vector of the present invention, in another aspect, the AAV vector genome may be packaged as a baculovirus and introduced into an insect cell, eg, Sf9 cell. At this time, the Rep and Cap genes are also introduced into insect cells by another baculovirus. Baculovirus may contain genes required for efficient production of AAV vectors. Insect cells infected with two baculoviruses can then be cultured to generate an AAV vector, and the AAV vector can be purified and formulated using methods known in the art (eg, USA). Patents No. 5436146, No. 5753500, No. 6093570, and No. 6548286, US2002 / 0168342).

＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、本発明のＡＡＶベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物である。網膜変性疾患とは、網膜組織を構成する細胞に障害が発生することにより、視機能に異常をきたす疾患の総称であり、杆体細胞の変性を伴う網膜疾患及び錐体細胞の変性を伴う網膜疾患を含む。ある態様では、網膜変性疾患は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである。ある態様では、網膜変性疾患は、網膜色素変性症である。ある態様では、本発明の医薬組成物は、進行期の網膜色素変性症の治療用医薬組成物である。本明細書において「進行期の網膜色素変性症」とは、杆体細胞機能の消失が認められる時期以降の網膜色素変性症、光干渉断層撮影において外顆粒層の菲薄化を認める網膜色素変性症、矯正視力がｌｏｇＭＡＲ視力において２０／８０から２０／４００であることを認める網膜色素変性症、又は夜盲を認める網膜色素変性症をいう。杆体細胞機能の消失は暗順応網膜電図における振幅の消失を認めることで判断できる。また、中心視野が２０度以下に狭まることからも判断できる。 <Pharmaceutical composition of the present invention>
The pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating retinal degenerative diseases, which comprises the AAV vector of the present invention. Retinal degenerative disease is a general term for diseases that cause abnormalities in visual function due to damage to the cells that make up the retinal tissue. Retinal diseases associated with degeneration of rod cells and retinal diseases associated with degeneration of cone cells. including. In some embodiments, the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod pyramidal dystrophy. In some embodiments, the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa. In some embodiments, the pharmaceutical composition of the invention is a therapeutic pharmaceutical composition for retinitis pigmentosa in advanced stages. As used herein, "advanced retinitis pigmentosa" refers to retinitis pigmentosa after the time when the loss of body cell function is observed, and retinitis pigmentosa in which thinning of the outer granule layer is observed in photointerference tomography. Retinitis pigmentosa in which corrected visual acuity is 20/80 to 20/400 in logMAR visual acuity, or retinitis pigmentosa in which night blindness is observed. Loss of rod cell function can be determined by the loss of amplitude in the dark-adapted electroretinogram. It can also be judged from the fact that the central visual field is narrowed to 20 degrees or less.

本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、すなわち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。ある態様では、本発明の医薬組成物は、本発明のＡＡＶベクター、及び一以上の賦形剤を含有する。これらの医薬組成物の剤型としては、例えば、注射用医薬組成物、及びその他の非経口用医薬組成物が挙げられ、眼内投与、網膜下投与、硝子体内投与、脈絡膜上投与等により投与することができる。ある態様では、本発明の医薬組成物は、網膜下又は硝子体内に投与される。本発明のＡＡＶベクターの製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、又は添加剤等を使用することができる。本発明の医薬組成物は、さらに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント又は免疫賦活薬等、少量の補助的物質を含有することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by a commonly used method using excipients usually used in the art, that is, pharmaceutical excipients, pharmaceutical carriers and the like. In some embodiments, the pharmaceutical composition of the invention comprises the AAV vector of the invention and one or more excipients. Examples of the dosage form of these pharmaceutical compositions include injection pharmaceutical compositions and other parenteral pharmaceutical compositions, which are administered by intraocular administration, subretinal administration, intravitreal administration, intrachoroidal administration and the like. can do. In some embodiments, the pharmaceutical composition of the invention is administered subretinal or intravitreal. In formulating the AAV vector of the present invention, excipients, carriers, additives and the like corresponding to these dosage forms can be used to the extent pharmaceutically acceptable. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a small amount of ancillary substances such as wetting agents, emulsifying agents, pH buffering agents, adjuvants or immunostimulants.

＜本発明の予防又は治療方法＞
本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターの治療有効量を対象に投与することを含む、網膜変性疾患の予防又は治療方法（以下、「本発明の予防又は治療方法」ともいう）を提供する。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーの予防又は治療方法である。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、網膜色素変性症の予防又は治療方法である。ある態様では、本発明の予防又は治療方法は、進行期の網膜色素変性症を治療する方法である。 <Prophylactic or therapeutic method of the present invention>
The present invention also provides a method for preventing or treating a retinal degenerative disease (hereinafter, also referred to as "the method for preventing or treating the present invention"), which comprises administering a therapeutically effective amount of the AAV vector of the present invention to a subject. In some embodiments, the method of prevention or treatment of the present invention is a method of preventing or treating retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod cone dystrophy. In some embodiments, the prophylactic or therapeutic method of the present invention is a prophylactic or therapeutic method for retinitis pigmentosa. In some embodiments, the prophylactic or therapeutic method of the invention is a method of treating retinitis pigmentosa in advanced stages.

本発明の予防又は治療方法において、「対象」とは、その予防又は治療を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様では、その予防又は治療を必要とするヒトである。対象への「投与」には、眼内投与、硝子体内投与、網膜下投与、脈絡膜上投与等が含まれる。投与方法としては、注射（例えば、硝子体内又は網膜下又は脈絡膜上注射）、遺伝子銃、ゲル、エレクトロポレーション、脂質に基づくトランスフェクション試薬の使用、薬物送達デバイスの埋め込み、又は他のいずれかの適したトランスフェクション方法が挙げられる。 In the prophylactic or therapeutic method of the invention, a "subject" is a human or other animal in need of its prevention or treatment, and in some embodiments a human in need of its prevention or treatment. "Administration" to the subject includes intraocular administration, intravitreal administration, subretinal administration, intrachoroidal administration and the like. The method of administration may be injection (eg, intravitreal or subretinal or intrachoroidal injection), gene gun, gel, electroporation, use of lipid-based transfection reagents, implantation of a drug delivery device, or any other method. Suitable transfection methods can be mentioned.

ある態様において、本発明のＡＡＶベクターは、硝子体内に投与される。硝子体内投与において、本発明のＡＡＶベクターは、懸濁液又は溶液等の剤型で送達され得る。硝子体内投与に際しては、例えば、最初に、眼の表面に局所麻酔剤を適用し、その後局所消毒溶液を適用する。器具を使用するか、又は使用せずに眼を開いたまま維持し、直接観察下、細く短い（例えば、３０ゲージの）針によって、強膜を通して対象の眼の硝子体腔内にベクターを注射する。硝子体内投与は他の眼内投与方法に比べて、比較的侵襲性が低いことが特徴である。 In some embodiments, the AAV vector of the invention is administered intravitrealally. For intravitreal administration, the AAV vector of the invention can be delivered in a dosage form such as a suspension or solution. For intravitreal administration, for example, a local anesthetic is first applied to the surface of the eye, followed by a local disinfectant solution. Keep the eye open with or without an instrument and inject the vector into the vitreous cavity of the subject's eye through the sclera with a thin, short (eg, 30 gauge) needle under direct observation. .. Intravitreal administration is characterized by being relatively less invasive than other intraocular administration methods.

ある態様において、本発明のＡＡＶベクターは、網膜下に投与される。網膜下に投与されたＡＡＶベクターは、一般的に、視細胞や網膜色素上皮細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ＲＰＥ）等の細胞に導入されることが知られている（Ａｌｌｏｃｃａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、２００７年、８１巻、１１３７２～１１３８０頁）。網膜下投与において、本発明のＡＡＶベクターは、懸濁液や溶液等の剤型で、直接観察下、手術用顕微鏡を使用して網膜下注射される。網膜下投与のある態様としては、硝子体切開後、微細なカニューレを使用して、１つ以上の小さな網膜切開を通して網膜下の空間に注射することが挙げられる。 In some embodiments, the AAV vector of the invention is administered subretinal. It is known that the AAV vector administered subretinal is generally introduced into cells such as photoreceptor cells and retinal pigment epithelium (RPE) (Allocca et al., J. Virol., 2007, Volume 81, pp. 11372-11380). For subretinal administration, the AAV vector of the present invention is injected subretinal in a dosage form such as a suspension or solution under direct observation using a surgical microscope. One embodiment of subretinal administration includes a vitreous incision followed by injection into the subretinal space through one or more small retinal incisions using a fine cannula.

ある態様において、本発明のＡＡＶベクターは、脈絡膜上投与（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）される。脈絡膜上投与において、ベクターは、懸濁液又は溶液の剤型で投与される。最初に、眼の表面に局所麻酔剤を適用し、その後、局所消毒溶液を適用する。脈絡膜上投与に際しては、器具を使用するか、又は使用せずに、眼を開いたまま維持し、直接観察下、細く短い（例えば、３０ゲージの）針によって、対象の眼の脈絡膜上にＡＡＶベクターを注射する。 In some embodiments, the AAV vector of the invention is administered suprachoroidally. For intrachoroidal administration, the vector is administered in a suspension or solution form. First, a local anesthetic is applied to the surface of the eye, and then a local disinfectant solution is applied. For intrachoroidal administration, keep the eye open with or without an instrument, and under direct observation, AAV on the choroid of the subject's eye with a thin, short (eg, 30 gauge) needle. Inject the vector.

ある態様において、本発明の予防又は治療方法は、本発明のＡＡＶベクターを用いて本発明の核酸分子を視細胞及び／又は網膜色素上皮細胞に導入することを含む。 In certain embodiments, the prophylactic or therapeutic method of the invention comprises introducing the nucleic acid molecule of the invention into photoreceptor and / or retinal pigment epithelial cells using the AAV vector of the invention.

本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は、疾患の重症度、以前の処置、対象の一般的な健康状態、年齢、投与方法、他の疾患等を考慮して適宜最適化され得る。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は、約０．００１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、ある態様では約０．０１～２５ｍｇ／ｋｇ体重、別の態様では約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、別の態様では約１～１０ｍｇ／ｋｇ、２～９ｍｇ／ｋｇ、３～８ｍｇ／ｋｇ、４～７ｍｇ／ｋｇ又は５～６ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は１眼あたりに投与するベクターゲノムの量（ｖｇ／ｅｙｅ）でも表すことができる。ｖｇは、ゲノムコピー（ＧＣ）とも表記できる。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターの治療有効量は、約１×１０6～１×１０12ｖｇ／ｅｙｅであり、別の態様では、約１×１０7～４×１０10ｖｇ／ｅｙｅである。本発明のＡＡＶベクターの治療有効量の投与には、単回投与、複数回投与、漸減投与、漸増投与が含まれる。ある態様では、本発明のＡＡＶベクターは、１日に少なくとも１、２、３、又は４回投与することができる。予防又は治療のための投与期間は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４週間の期間に及び得る。 The therapeutically effective amount of the AAV vector of the present invention can be appropriately optimized in consideration of the severity of the disease, previous treatment, general health condition of the subject, age, administration method, other diseases and the like. In some embodiments, the therapeutically effective amount of the AAV vector of the invention is about 0.001-30 mg / kg body weight, in one aspect about 0.01-25 mg / kg body weight, in another aspect about 0.1-20 mg / kg. Body weight, in another embodiment about 1-10 mg / kg, 2-9 mg / kg, 3-8 mg / kg, 4-7 mg / kg or 5-6 mg / kg body weight. The therapeutically effective amount of the AAV vector of the present invention can also be expressed by the amount of the vector genome (vg / eye) administered per eye. vg can also be expressed as a genome copy (GC). In one embodiment, the therapeutically effective amount of the AAV vector of the invention is about 1 × 10 6 to 1 × 10 12 vg / eye, and in another embodiment, about 1 × 10 7 to 4 × 10 10 vg / eye. be. Administration of a therapeutically effective amount of the AAV vector of the present invention includes single dose, multiple doses, tapering doses, and tapering doses. In some embodiments, the AAV vector of the invention can be administered at least 1, 2, 3, or 4 times daily. The duration of administration for prophylaxis or treatment is at least about 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, It can span a period of 21, 22, 23 or 24 weeks.

本発明のＡＡＶベクターは、それが有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。 The AAV vector of the present invention can be used in combination with various therapeutic or prophylactic agents for diseases for which it is considered to be effective. The combination may be administered simultaneously, separately, consecutively, or at desired time intervals. The co-administered product may be a combination drug or a separately formulated product.

本発明はまた、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物の製造のための本発明のＡＡＶベクターの使用を提供する。本発明はまた、網膜変性疾患の予防又は治療のための本発明のＡＡＶベクターの使用を提供する。 The present invention also provides the use of the AAV vector of the present invention for the production of pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of retinal degenerative diseases. The invention also provides the use of the AAV vector of the invention for the prevention or treatment of retinal degenerative diseases.

本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。 Specific embodiments referenced herein are provided for further understanding, but these are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention.

実施例１ コンストラクトの作製：クローニング、プラスミド作製、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１作製
マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の核酸分子配列を搭載したＡＡＶベクタープラスミドを、ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳプラスミド（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号ＶＰＫ－４３０)にマウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１核酸分子配列（配列番号７）をＢａｍＨＩ（５’側）とＸｂａＩ（３’側）制限酵素を使用し挿入して、作製した。得られたプラスミドをｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１と称する。マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子はＣＭＶ由来プロモーターの下流、かつ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）の上流に位置しており、開始コドンの前にコザック配列(ＧＣＣＡＣＣ)が存在する。また、マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１遺伝子の下流に終止コドンを配置し、マウス全長ＣＸ３ＣＬ１アミノ酸配列（配列番号６）の内のアミノ酸番号１から３３６までのアミノ酸配列（配列番号８）を有するマウス可溶型ＣＸ３ＣＬ１が発現されるようにデザインした。ＩＴＲを含むＩＴＲ間の長さは１９６９ｂ．ｐ.であり、ＡＡＶベクターにパッケージできるサイズである。ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１のベクターマップを図１に示す。このプラスミドをＳｔｂｌ３大腸菌株（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ｃ７３７３０３）を用いて増幅した。この他、組換ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）作製に必要なプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（ＡＡＶｐｒｏ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＡＡＶ２）、タカラバイオ社、カタログ番号６２３０）及びｐＲＣＡＡＶ８をＤＨ５α大腸菌株（タカラバイオ社、カタログ番号９０５７）を用いて増幅した。ｐＲＣＡＡＶ８は、ｐＲＣ５（ＡＡＶｐｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ （ＡＡＶ５）、タカラバイオ社、カタログ番号６６６４）のＣａｐ配列部分をＡＡＶ８のＣａｐ配列（アクセッション番号ＮＣ＿００６２６１．１の２１２１ｂ．ｐ.－４３３７ｂ．ｐ.）に変換したプラスミドである。１平方センチメートルあたり２５００細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ１７細胞株を播種し、４日後にｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＲＣＡＡＶ８を一過性にトランスフェクションし、３日間及び６日間培養した細胞培養上清を回収した。培養上清中に含まれるｒＡＡＶ８をｍＰＥＳ ＭｉｎｉＫｒｏｓ Ｓａｍｐｌｅｒ ３００ｋＤａ(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ社、カタログ番号 Ｓ－０２－Ｅ３００－０５－Ｎ)を用いてタンジェンシャルフロー・フィルトレーション（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮されたサンプルを０．２２μｍフィルターにかけ、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティーカラムＰＯＲＯＳ（登録商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶ８ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ａ３０７９０）で精製した。精製したサンプルを塩化セシウムの濃度勾配を利用した超遠心にかけた。この超遠心では垂直ローター（ＶＴｉ５０（ベックマン・コールター社、カタログ番号３６２７５８））を使用した。超遠心したサンプルにおいて、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍの吸光測定値が高いフラクションを回収した。回収したサンプルをりん酸緩衝生理食塩水を用いて３回透析したものを、作製されたマウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ遺伝子を搭載したＡＡＶ８ベクター（ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１と称する）のストックとした。ウイルスタイター測定はＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号 ＶＰＫ－１４５)を用いて実施した。 Example 1 Preparation of construct: Cloning, plasmid preparation, rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 preparation An AAV vector plasmid carrying the nucleic acid molecular sequence of mouse soluble Cx3cl1 was used as a pscAAV-MCS plasmid (Cell BioLabs, Catalog No. VPK-). A mouse-soluble Cx3cl1 nucleic acid molecular sequence (SEQ ID NO: 7) was inserted into 430) using BamHI (5'side) and XbaI (3'side) restriction enzymes to prepare the mixture. The obtained plasmid is referred to as pscAAV-MCS-mouse soluble type Cx3cl1. The mouse-soluble Cx3cl1 gene is located downstream of the CMV-derived promoter and upstream of SV40 poly (A), and the Kozak sequence (GCCACC) is present before the start codon. In addition, a stop codon is placed downstream of the mouse-soluble Cx3cl1 gene, and the mouse-soluble type has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) from amino acids 1 to 336 in the full-length mouse CX3CL1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 6). It was designed so that CX3CL1 was expressed. The length between ITRs including ITRs is 1969b. p., A size that can be packaged in an AAV vector. The vector map of pscAAV-MCS-mouse soluble type Cx3cl1 is shown in FIG. This plasmid was amplified using a Stbl3 E. coli strain (Thermo Fisher Scientific, Catalog No. C737303). In addition, the plasmid pHelper (AAVpro Helper Free System (AAV2), Takara Bio Inc., Catalog No. 6230) and pRCAAV8 required for recombinant AAV (rAAV) preparation were used with the DH5α Escherichia coli strain (Takara Bio Inc., Catalog No. 9057). Amplified. pRCAAV8 converted the Cap sequence portion of pRC5 (AAVpro Packaging Plasmad (AAV5), Takara Bio Inc., Catalog No. 6664) into the Cap sequence portion of AAV8 (Avsion No. NC_006261.1, 2121b.p.-4337b.p.). It is a plasmid. HEK293T17 cell lines were seeded at a density of 2500 cells per square centimeter, and after 4 days, pscAAV-MCS-mouse soluble Cx3cl1, pHelper, and pRCAAV8 were transiently transfected and cultured for 3 and 6 days. The supernatant was collected. The rAAV8 contained in the culture supernatant was concentrated using tangential flow filtration using mPES MiniKros Sampler 300 kDa (Spectrum Labs, Catalog No. S-02-E300-05-N). .. Concentrated samples were filtered by 0.22 μm and affinity column POROS® Capture Select® AAV8 Affinity Resin (Thermo Fisher Scientific) 90, Catalog No. 30 using AKTAexplorer100 (GE Healthcare). The purified sample was subjected to ultracentrifugation using a concentration gradient of cesium chloride. A vertical rotor (VTi50 (Beckman Coulter, Catalog No. 362758)) was used for this ultracentrifuge. Fractions with high absorbance measurements at 280 nm and 260 nm were collected in ultracentrifugated samples. The collected sample was dialyzed three times using phosphate buffered saline to prepare a stock of the prepared AAV8 vector (referred to as mouse-soluble Cx3cl1) carrying the mouse-soluble Cx3cl gene. Virus titer measurements were performed using the QuickTiter AAV Quantification kit (Cell Biolabs, Catalog No. VPK-145).

実施例２ コンストラクトの作製：クローニング、プラスミド作製、ｒＡＡＶ８－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１作製
ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１の核酸分子配列を搭載したＡＡＶベクタープラスミドを、ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳプラスミド（Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号ＶＰＫ－４３０）にヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１核酸分子配列（配列番号３）をＢａｍＨＩ（５’側）とＸｂａＩ（３’側）制限酵素を使用し挿入して、作製した。得られたプラスミドをｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１と称する。ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子はＣＭＶ由来プロモーターの下流、かつ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙ（Ａ）の上流に位置しており、開始コドンの前にコザック配列(ＧＣＣＡＣＣ)が存在する。また、ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子の下流に終止コドンを配置し、ヒト全長ＣＸ３ＣＬ１配列（配列番号２）の内のアミノ酸番号１から３３８までのアミノ酸配列（配列番号４）を有するヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が発現されるようにデザインした。ＩＴＲを含むＩＴＲ間の長さは１９７５ｂ．ｐ.であり、ＡＡＶベクターにパッケージできるサイズである。ｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１のベクターマップを図２に示す。このプラスミドをＳｔｂｌ３大腸菌株を用いて増幅した。この他、ｒＡＡＶ作製に必要なプラスミドｐＨｅｌｐｅｒ及びｐＲＣＡＡＶ８をＤＨ５α大腸菌株を用いて増幅した。１平方センチメートルあたり２５００細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を播種し、４日後にｐｓｃＡＡＶ－ＭＣＳ－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１、ｐＨｅｌｐｅｒ、及びｐＲＣＡＡＶ８を一過性にトランスフェクションし、４日間培養した細胞の培養上清を回収した。培養上清中に含まれるｒＡＡＶ８をｍＰＥＳ ＭｉｎｉＫｒｏｓ Ｓａｍｐｌｅｒ ３００ｋＤａ(Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社、カタログ番号 Ｓ－０２－Ｅ３００－０５－Ｎ)を用いてＴａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを用いて濃縮した。濃縮されたサンプルを０．２２μＭフィルターにかけ、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティーカラムで精製した。精製したサンプルを塩化セシウムの濃度勾配を利用した超遠心にかけた。この超遠心では垂直ローター（ＶＴｉ５０）を使用した。超遠心したサンプルにおいて、２８０ｎｍ及び２６０ｎｍの吸光測定値が高いフラクションを回収した。回収したサンプルをりん酸緩衝生理食塩水を用いて３回透析したものを、作製されたヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶ８ベクター（ｒＡＡＶ８－ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１と称する）のストックとした。ウイルスタイター測定はＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ(Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、カタログ番号 ＶＰＫ－１４５)を用いて実施した。 Example 2 Preparation of construct: Cloning, plasmid preparation, rAAV8-human soluble CX3CL1 preparation An AAV vector plasmid carrying the nucleic acid molecular sequence of human soluble CX3CL1 was used as a pscAAV-MCS plasmid (Cell BioLabs, Catalog No. VPK-). A human soluble CX3CL1 nucleic acid molecular sequence (SEQ ID NO: 3) was inserted into 430) using BamHI (5'side) and XbaI (3'side) restriction enzymes. The obtained plasmid is referred to as pscAAV-MCS-human soluble CX3CL1. The human soluble CX3CL1 gene is located downstream of the CMV-derived promoter and upstream of SV40 poly (A), with the Kozak sequence (GCCACC) present before the start codon. In addition, a human soluble CX3CL1 having a stop codon located downstream of the human soluble CX3CL1 gene and having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) from amino acids 1 to 338 in the human full-length CX3CL1 sequence (SEQ ID NO: 2). Was designed to be expressed. The length between ITRs including ITRs is 1975b. p., A size that can be packaged in an AAV vector. The vector map of pscAAV-MCS-human soluble CX3CL1 is shown in FIG. This plasmid was amplified using the Stbl3 E. coli strain. In addition, the plasmids pHelper and pRCAAV8 required for rAAV preparation were amplified using the DH5α Escherichia coli strain. The HEK293T cell line was seeded at a density of 2500 cells per square centimeter, and after 4 days, pscAAV-MCS-human soluble CX3CL1, pHelper, and pRCAAV8 were transiently transfected, and the culture supernatant of the cells cultured for 4 days. Was recovered. The rAAV8 contained in the culture supernatant was concentrated using MPES MiniKros Sampler 300 kDa (Spectrum, Catalog No. S-02-E300-05-N) using Tangential Flow Filtration. The concentrated sample was filtered by 0.22 μM and purified by an affinity column using AKTAexplorer100 (GE Healthcare). The purified sample was subjected to ultracentrifugation using a concentration gradient of cesium chloride. A vertical rotor (VTi50) was used in this ultracentrifuge. Fractions with high absorbance measurements at 280 nm and 260 nm were collected in ultracentrifugated samples. The collected sample was dialyzed three times using phosphate buffered saline to prepare a stock of the prepared AAV8 vector (referred to as rAAV8-human soluble CX3CL1) carrying the human soluble CX3CL1 gene. Virus titer measurements were performed using the QuickTiter AAV Quantification kit (Cell Biolabs, Catalog No. VPK-145).

実施例３ ウイルス感染プロトコル
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を投与するプロトコルはＸｉｏｎｇらの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１５年、１２５巻、１４３３～１４４５頁）に従ったものである。実施例１で作製したｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を網膜色素変性症のモデルマウスであるｒｄ１０マウスに投与した。生後１日齢のマウスを氷上麻酔させ、眼球を露出し、ガラスシリンジで網膜下に投与を行った。ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を最終濃度が２．２×１０10ｖｇ／ｍＬ、２．２×１０11ｖｇ／ｍＬ又は２．２×１０12ｖｇ／ｍＬになるようにビヒクル（りん酸緩衝生理食塩水に０．２５％のＦａｓｔ Ｇｒｅｅｎ ＦＣＦ（ナカライテスク社、カタログ番号１５９３９－５４）及び０．００１％のプルロニック Ｆ―６８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加した溶液）で調製し、１眼あたり６．５×１０6ｖｇ／０．３μＬ、６．５×１０7ｖｇ／０．３μＬ又は６．５×１０8ｖｇ／０．３μＬで投与した。投与したマウスは体温を戻し覚醒させ、親マウスと共に飼育し、生後２８日齢～生後３５日齢で離乳後、生後５０日齢～生後５１日齢まで生存させた。
ｒｄ１０マウスでは網膜色素変性症患者同様、杆体細胞の細胞死（生後２０日齢～生後２８日齢）が発生した後に錐体細胞の細胞死が起こる（Ｇａｒｇｉｎｉら、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．、２００７年、５００巻、２２２～２３８頁）。また、杆体細胞の保護は間接的に錐体細胞の保護に繋がることも知られている（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄら、Ｃ． Ｒ． Ｂｉｏｌ．、２０１４年、３３７巻、２０７～２１３頁）。ｒｄ１０マウスにおける網膜保護効果を検証する場合は、杆体細胞変性前又はそれと同時に薬剤を投与する方法が一般的である（非特許文献１）が、その場合は薬剤の錐体細胞直接的な保護効果が検証できないため、杆体細胞非依存的に錐体細胞保護効果が期待できるかを、生後２８日齢～生後２９日齢のｒｄ１０マウスに薬剤を投与し検証した。その際の投与方法は次の通りである。ｒｄ１０マウスにミドリンＰ点眼液（参天製薬社）を点眼し、散瞳させ、ケタミン・キシラジン混合麻酔液を筋肉内注射し麻酔した。麻酔後にヒアレイン点眼液０．３％（参天製薬社）を点眼し、角膜を保護した。耳側の強膜に３０ゲージの針で穴をあけ、投与液を１μＬ充填したハミルトンシリンジの針を通し、硝子体を通り、鼻側の網膜に挿して網膜下投与した。ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１は、最終濃度が２×１０11ｖｇ／ｍＬ又は２×１０12ｖｇ／ｍＬになるように調製し、１眼あたり２×１０8ｖｇ／１μＬ又は２×１０9ｖｇ／１μＬで投与した。投与したマウスはアンチセダン（日本全薬工業社）を筋肉内注射し覚醒させ、最長生後５１日齢まで生存させた。 Example 3 Virus Infection Protocol The protocol for administering rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 at 1 day of age follows the method of Xiong et al. (J. Clin. Invest. 2015, Vol. 125, pp. 1433-1445). be. The rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 prepared in Example 1 was administered to rd10 mice, which are model mice for retinitis pigmentosa. One-day-old mice were anesthetized on ice, the eyeballs were exposed, and administration was performed under the retina with a glass syringe. Vehicle (phosphate buffered physiology) with rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 to a final concentration of 2.2 × 10 10 vg / mL or 2.2 × 10 11 vg / mL or 2.2 × 10 12 vg / mL. Prepared in saline solution with 0.25% Fast Green FCF (Nacalai Tesque, Catalog No. 15939-54) and 0.001% Pluronic F-68 (Thermo Fisher Scientific) per eye). It was administered at 6.5 × 10 6 vg / 0.3 μL, 6.5 × 10 7 vg / 0.3 μL or 6.5 × 10 8 vg / 0.3 μL. The administered mice were awakened by returning to body temperature, and were bred together with the parent mice, and survived from 28 days after birth to 35 days after birth after weaning and from 50 days after birth to 51 days after birth.
Similar to patients with retinitis pigmentosa, rd10 mice undergo pyramidal cell death after rod cell death (20-day-old to 28-day-old) (Gargini et al., J. Comp. Neurol., 2007). Year, 500 volumes, pp. 222-238). It is also known that the protection of rod cells indirectly leads to the protection of pyramidal cells (Leveillard et al., CR Biol., 2014, 337, pp. 207-213). When verifying the retinal protective effect in rd10 mice, it is common to administer the drug before or at the same time as rod cell degeneration (Non-Patent Document 1), but in that case, the direct protective effect on the pyramidal cells of the drug. However, it was verified whether the pyramidal cell protective effect could be expected in a rod-independent manner by administering a drug to rd10 mice aged 28 days to 29 days after birth. The administration method at that time is as follows. Midrin P ophthalmic solution (Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) was instilled into rd10 mice, the eyes were dilated, and a ketamine / xylazine mixed anesthetic solution was intramuscularly injected for anesthesia. After anesthesia, Hyalein ophthalmic solution 0.3% (Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) was instilled to protect the cornea. A 30-gauge needle was used to make a hole in the sclera on the ear side, a needle of a Hamilton syringe filled with 1 μL of the administration solution was passed through, the vitreous body was passed, and the sclera was inserted into the retina on the nasal side for subretinal administration. rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 was prepared to have a final concentration of 2 × 10 11 vg / mL or 2 × 10 12 vg / mL and 2 × 10 8 vg / 1 μL or 2 × 10 9 vg per eye. It was administered at 1 μL. The treated mice were awakened by intramuscular injection of antisedan (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) and survived up to 51 days after birth.

実施例４ 網膜組織のＣｘ３ｃｌ１遺伝子発現評価
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを生後５１日齢でイソフルラン麻酔下で放血により安楽死させ、眼球を摘出した。角膜及び水晶体を除去し、網膜を他組織から単離するように採材し、網膜組織におけるＣｘ３ｃｌ１の遺伝子発現評価を実施した。網膜からＲＮＡを抽出し、逆転写でｃＤＮＡを作製後、Ｃｘ３ｃｌ１及びベータアクチン（ハウスキーピング遺伝子）に対するＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを行った。Ｃｘ３ｃｌ１のＣｔ値をベータアクチンのＣｔ値で補正し、比較Ｃｔ法により対照ビヒクル群と各投与群の比較を行った。結果を図３に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的なＣｘ３ｃｌ１ ｍＲＮＡの発現上昇が見られた。 Example 4 Evaluation of Cx3cl1 gene expression in retinal tissue rd10 mice to which rAAV8-mouse-soluble Cx3cl1 or vehicle was administered subretinal at 1 day of age were euthanized by blood discharge under isoflurane anesthesia at 51 days of age, and the eyeballs were euthanized. It was removed. The cornea and crystalline lens were removed, and the retina was collected so as to be isolated from other tissues, and the gene expression of Cx3cl1 in the retinal tissue was evaluated. RNA was extracted from the retina, cDNA was prepared by reverse transcription, and then a Taqman gene expression assay for Cx3cl1 and beta actin (housekeeping gene) was performed. The Ct value of Cx3cl1 was corrected by the Ct value of beta actin, and the control vehicle group and each administration group were compared by the comparative Ct method. The results are shown in FIG. 6.5 × 10 6 (6.5e6) vg / eye administration group, 6.5 × 10 7 (6.5e7) vg / eye administration group and 6.5 × 10 8 (6.5e8) vg / eye administration group In, a dose-dependent increase in the expression of Cx3cl1 mRNA was observed.

生後２８日齢～生後２９日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスにおいては、投与７日後（Ｐｏｓｔ ｄ７）、１４日後（Ｐｏｓｔ ｄ１４）、及び２２日後（Ｐｏｓｔ ｄ２２）に上記に記載の通り網膜からｃＤＮＡを作製し、前記と同様にＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイでＣｘ３ｃｌ１遺伝子発現を評価した（図４）。２×１０8（２ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において、Ｃｘ３ｃｌ１ ｍＲＮＡの発現は投与７日後に対照ビヒクル群に比べ上昇しており、１４日後及び２２日後では更に上昇していた。なお、２×１０9（２ｅ９）ｖｇ／ｅｙｅ投与群は投与２２日後のみで評価しており、その時点において、２×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群より高い発現傾向が見られた。 In rd10 mice to which rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 or vehicle was administered subretinal from 28 days to 29 days after birth, 7 days (Post d7), 14 days (Post d14), and 22 days (Post) after administration (Post). cDNA was prepared from the retina as described above in d22), and Cx3cl1 gene expression was evaluated by the Taqman gene expression assay in the same manner as described above (FIG. 4). In the 2 × 10 8 (2e8) vg / eye administration group, the expression of Cx3cl1 mRNA was increased 7 days after administration as compared with the control vehicle group, and was further increased after 14 days and 22 days. The 2 × 10 9 (2e9) vg / eye administration group was evaluated only 22 days after the administration, and at that time, a higher expression tendency was observed than the 2 × 10 8 vg / eye administration group.

実施例５ 硝子体中及び血漿中のＣＸ３ＣＬ１タンパク質量評価
生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを生後５０日齢まで生存させ、血漿及び硝子体を採材した。硝子体は、眼球から角膜及び水晶体を切除し、露出させた硝子体をりん酸緩衝生理食塩水に浸して採材した。血漿は、イソフルラン麻酔下で腹部大静脈から血液をヘパリン採血管に採取し、遠心して分離した上清から採取した。抗マウスＣＸ３ＣＬ１抗体を用いたＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号 ＭＣＸ３１０）により硝子体及び血漿中のＣＸ３ＣＬ１タンパク質量を評価した。結果をそれぞれ図５及び図６に示す。硝子体においては、６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群、６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的なＣＸ３ＣＬ１タンパク質の値の上昇が確認でき、特に６．５×１０7ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群において大幅な上昇が見られた。血漿においては対照ビヒクル群に比べ、６．５×１０7ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8ｖｇ／ｅｙｅ投与群において用量依存的な上昇が確認できた。これらは、網膜組織で発現したＣＸ３ＣＬ１タンパク質が一部全身血流に移行していることを示唆する。 Example 5 Evaluation of CX3CL1 protein amount in vitreous body and plasma rd10 mice to which rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 or vehicle was administered subretinal at 1 day of age were allowed to survive until 50 days of age, and plasma and vitreous were alive. I collected data. The vitreous body was collected by excising the cornea and the crystalline lens from the eyeball and immersing the exposed vitreous body in phosphate buffered saline. Plasma was collected from the supernatant obtained by collecting blood from the abdominal vena cava under isoflurane anesthesia into a heparin blood collection vessel and centrifuging it. The amount of CX3CL1 protein in the vitreous and plasma was evaluated by an ELISA kit (R & D Systems, Catalog No. MCX310) using an anti-mouse CX3CL1 antibody. The results are shown in FIGS. 5 and 6, respectively. In the vitreous, 6.5 × 10 6 (6.5e6) vg / eye administration group, 6.5 × 10 7 (6.5e7) vg / eye administration group, 6.5 × 10 8 (6.5e8) A dose-dependent increase in the CX3CL1 protein level was confirmed in the vg / eye administration group, and a significant increase was observed especially in the 6.5 × 10 7 vg / eye administration group and the 6.5 × 10 8 vg / eye administration group. Was done. In plasma, a dose-dependent increase was confirmed in the 6.5 × 10 7 vg / eye administration group and the 6.5 × 10 8 vg / eye administration group as compared with the control vehicle group. These suggest that the CX3CL1 protein expressed in the retinal tissue is partially transferred to the systemic blood flow.

実施例６ 視覚運動反応試験
Ｘｉｏｎｇらの方法（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１５年、１２５巻 １４３３～１４４５頁）に従って視覚運動反応試験を実施した。生後１日齢にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１又はビヒクルを網膜下に投与したｒｄ１０マウスを対象に生後４４日齢～生後４５日齢に視覚運動反応試験を実施した。本試験にはＣｅｒｅｂｒａｌＭｅｃｈａｎｉｃｓ社のＯｐｔｏＭｏｔｒｙ ＨＤを使用した。全てのマウスは評価のおよそ１週間前に覚醒下でプラットフォームに５分ほど置き、チャンバーに順化させた。評価当日、マウスを覚醒下でプラットフォームに乗せ、動物が探索行動をやめ、プラットフォームから落ちることなく、落ち着いたと実験者が判断したら検査を開始した。白黒の格子のコントラストを１００％、回転速度を１２度／秒に設定し、格子画面を回転させ、回転させた格子に対するマウスの視覚運動反応を観察した。盲目マウスは応答せず、目の見えるマウスは回転させた格子の動きを追跡するかのようにその頭部も回した。視覚運動反応は、マウスが認識できる格子の最小の厚さ、すなわち空間周波数の限界（ｓｐａｔｉａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ；ｃｙｃｌｅｓ／ｄｅｇｒｅｅ（ｃ／ｄ）で表される）を指標に評価した。なお、実験者はそれぞれの個体の投与内容が分からないよう、ブラインドで試験を実施した。結果を図７に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ変化は見られなかったが、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群において視覚運動反応が保持される傾向が確認された。 Example 6 Visual motor response test A visual motor response test was performed according to the method of Xiong et al. (J. Clin. Invest., 2015, Vol. 125, pp. 1433-1445). A visual motor response test was performed from 44 days to 45 days after birth in rd10 mice to which rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 or vehicle was administered subretinal at 1 day after birth. Optimotor HD from Cerebral Technologies was used for this test. All mice were placed on the platform for about 5 minutes under awakening approximately 1 week before evaluation and acclimatized to chambers. On the day of the evaluation, the mice were placed on the platform under awakening, and when the experimenter determined that the animals had stopped exploring and were calm without falling off the platform, the test was started. The contrast of the black-and-white grid was set to 100%, the rotation speed was set to 12 degrees / sec, the grid screen was rotated, and the visual motion response of the mouse to the rotated grid was observed. Blind mice did not respond, and visible mice also rotated their heads as if they were tracking the movement of the rotated grid. The visual-motor response was evaluated using the minimum thickness of the grid recognizable by the mouse, that is, the limit of spatial frequency (expressed by cycles / delegate (c / d)) as an index. In addition, the experimenter conducted the test blindly so as not to understand the administration content of each individual. The results are shown in FIG. No change was observed in the 6.5 × 10 6 (6.5e6) vg / eye administration group compared with the control vehicle group, but the 6.5 × 10 7 (6.5e7) vg / eye administration group and 6.5. It was confirmed that the visual motor response tended to be maintained in the × 10 8 (6.5e8) vg / eye administration group.

実施例７ 錐体細胞保護効果の評価
ｒｄ１０マウスにおいて、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１による錐体細胞保護効果を検証するため、錐体細胞の外節を免疫組織化学法で染色し、陽性となった各外節１つを各錐体細胞１つとみなし、残存する錐体細胞数の評価を実施した。具体的には以下の通りである。生後１日齢に網膜下にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を感染させたｒｄ１０マウスを生後５０日齢にイソフルラン麻酔下で放血により安楽死させ、眼球を採材し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定した眼球から角膜・水晶体・虹彩・強膜・脈絡膜・網膜色素上皮細胞を除き、網膜を単離した。単離した網膜を免疫組織染色用ブロッキング剤でブロッキング後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７がラベルされた抗赤色／緑色オプシン抗体（メルク社、カタログ番号ＡＢ５４０５）及びＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８がラベルされた抗青色オプシン抗体（メルク社、カタログ番号ＡＢ５４０７）で染色した。染色した網膜は４か所に切れ込みを入れ、視細胞側を上にするようにスライドに乗せ、フラットマウントを作製した。視神経乳頭部位から１．５ｍｍの位置をＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ－Ｘ７１０蛍光顕微鏡の４０倍レンズを用いて画像を取得した。撮影部位に存在する抗錐体オプシン抗体で陽性となった細胞(外節)数はＩｍａｇｅ Ｊ（ｖｅｒ １．４９）ソフトウェアを用いて定量化した。１画面（観察エリア）あたりの錐体オプシンの数を残存する錐体細胞の数の指標として評価した。結果を図８に示す。６．５×１０6（６．５ｅ６）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ変化は見られなかったが、６．５×１０7（６．５ｅ７）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では有意な上昇を示した（Ｐ＜０．０１、ダネット多重比較検定）。また、６．５×１０8（６．５ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群でも上昇傾向を示している。これらのデータはｒｄ１０マウスにおいて、ｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１の網膜下投与によりマウス錐体細胞数が保持されることを示している。 Example 7 Evaluation of pyramidal cell protective effect In order to verify the pyramidal cell protective effect of rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 in rd10 mice, the outer nodes of the pyramidal cells were stained by immunohistochemical method and became positive. Each outer segment was regarded as one pyramidal cell, and the number of remaining pyramidal cells was evaluated. Specifically, it is as follows. At 1 day of age, rd10 mice infected with rAAV8-mouse-soluble Cx3cl1 under the retina were euthanized by blood discharge under isoflurane anesthesia at 50 days of age, and the eyeballs were collected for 30 minutes with 4% paraformaldehyde. Fixed. The cornea, lens, iris, sclera, choroid, and retinal pigment epithelial cells were removed from the fixed eyeball, and the retina was isolated. After blocking the isolated retina with a blocking agent for immunohistochemical staining, an anti-red / green opsin antibody (Merck, Catalog No. AB5405) labeled Alexa Fluoro® 647 and DyLight® 488 were labeled. It was stained with an anti-blue opsin antibody (Merck, Catalog No. AB5407). The stained retina was cut in four places and placed on a slide with the photoreceptor side facing up to prepare a flat mount. Images were acquired at a position 1.5 mm from the optic disc site using a 40x lens of a KEYENCE BZ-X710 fluorescence microscope. The number of cells (outer segment) positive for the antipyramidal opsin antibody present at the imaging site was quantified using ImageJ (ver 1.49) software. The number of pyramidal opsin per screen (observation area) was evaluated as an index of the number of remaining pyramidal cells. The results are shown in FIG. No change was observed in the 6.5 × 10 6 (6.5e6) vg / eye group compared with the control vehicle group, but there was a significant increase in the 6.5 × 10 7 (6.5e7) vg / eye group. (P <0.01, Danette multiple comparison test). In addition, the 6.5 × 10 8 (6.5e8) vg / eye administration group also showed an increasing tendency. These data indicate that subretinal administration of rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 preserves mouse pyramidal cell counts in rd10 mice.

また、生後２８日齢に網膜下にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を感染させたｒｄ１０マウスを投与後２２日（生後５０日齢）で網膜を採材し、前記と同様の方法で錐体オプシン数を評価した結果を図９に示す。２×１０8（２ｅ８）ｖｇ／ｅｙｅ投与群及び２×１０9（２ｅ９）ｖｇ／ｅｙｅ投与群では対照ビヒクル群に比べ有意な上昇を示した（それぞれＰ＜０．０１、Ｐ＜０．０５、ダネット多重比較検定）。これらのデータは、病態がある程度進行し、杆体細胞死が起こった後にｒＡＡＶ８－マウス可溶型Ｃｘ３ｃｌ１を網膜下投与してもｒｄ１０マウスの錐体細胞数が保持されることを示している。 In addition, rd10 mice infected with rAAV8-mouse-soluble Cx3cl1 under the retina at 28 days of age were administered to the retina 22 days after administration (50 days after birth), and pyramidal opsin was collected by the same method as described above. The result of evaluating the number is shown in FIG. The 2 × 10 8 (2e8) vg / eye administration group and the 2 × 10 9 (2e9) vg / eye administration group showed a significant increase as compared with the control vehicle group (P <0.01 and P <0.05, respectively). , Danette multiple comparison test). These data indicate that subretinal administration of rAAV8-mouse soluble Cx3cl1 after rod cell death has progressed to some extent retains the pyramidal cell count of rd10 mice.

本発明のＣＸ３ＣＬ１遺伝子を搭載したＡＡＶベクターは、網膜変性疾患、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、杆体錐体ジストロフィー等の予防及び／又は治療剤として期待される。 The AAV vector carrying the CX3CL1 gene of the present invention is a prophylactic and / or therapeutic agent for retinitis pigmentosa, such as retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, and cone dystrophy. Expected as.

Claims (11)

ＣＸ３ＣＬ１をコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、網膜変性疾患の予防又は治療用医薬組成物。 A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of retinal degenerative diseases, which comprises an adeno-associated virus (AAV) vector containing a nucleic acid molecule encoding CX3CL1 and a promoter operably linked to the nucleic acid molecule. 前記ＣＸ３ＣＬ１が可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、請求項１に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the CX3CL1 is a soluble CX3CL1. 前記可溶型ＣＸ３ＣＬ１がヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１である、請求項２に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the soluble CX3CL1 is a human soluble CX3CL1. 前記ヒト可溶型ＣＸ３ＣＬ１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the human soluble CX3CL1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターである、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the AAV vector is an AAV8 vector. 前記プロモーターがＣＭＶ由来プロモーターである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the promoter is a CMV-derived promoter. 前記ＡＡＶベクターが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸分子及び該核酸分子に作動可能に連結されたＣＭＶ由来プロモーターを含むＡＡＶ８ベクターである、請求項１に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical according to claim 1, wherein the AAV vector is an AAV8 vector containing a nucleic acid molecule encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a CMV-derived promoter operably linked to the nucleic acid molecule. Composition. 網膜変性疾患が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、黄斑ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、又は杆体錐体ジストロフィーである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7, wherein the retinal degenerative disease is retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, macular dystrophy, cone dystrophy, or rod cone dystrophy. 進行期の網膜色素変性症の治療用である、請求項８に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 8, which is for the treatment of retinitis pigmentosa in the advanced stage. 網膜下に投与するための、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 9, for administration under the retina. 硝子体内に投与するための、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 9, which is to be administered intravitrealally.
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CA2740923A1 (en) * 2008-10-21 2010-04-29 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
WO2010070394A1 (en) * 2008-12-17 2010-06-24 Universite Pierre Et Marie Curie-Paris Vi Modulators of the cx3cr1 receptor and therapeutic uses thereof
EP3210632B1 (en) * 2016-02-23 2022-09-28 EyeServ GmbH Gene therapy for the treatment of a retinal degeneration disease
JP7046828B2 (en) * 2016-04-15 2022-04-04 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Composition for the treatment of exudative age-related macular degeneration

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