JP2022040181A - ヒトｂｔｎｌ３タンパク質、核酸、および抗体、ならびにそれらの使用 - Google Patents

ヒトｂｔｎｌ３タンパク質、核酸、および抗体、ならびにそれらの使用 Download PDF

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Abstract

Figure 2022040181000001
【課題】ＢＴＮＬ３タンパク質およびそのバリアント、それらをコードする核酸、ならびにそれらに結合する抗体を提供する。
【解決手段】本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質は、単離されたタンパク質および／または可溶性タンパク質であり得る多量体タンパク質および／または融合タンパク質である。ＢＮＴＬ３タンパク質は、細胞の表面に結合し、かつ／または細胞の表面で発現し得る。抗ＢＴＮＬ３抗体を含むＢＴＮＬ３タンパク質、ならびにＢＴＮＬ３のアンタゴニストおよびアゴニストの使用も提供される。
【選択図】図６

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年７月１９日に出願された米国仮出願第６１／６７３，６３９号の利益を主張するものであり、当該仮出願は参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本発明は、ブチロフィリン様タンパク質、ならびにその断片、バリアント、および誘導体、そのようなタンパク質をコードする核酸、これらのタンパク質に結合する抗体、ならびにこれらのタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストに関する。そのような分子を含む薬学的組成物およびそれらを含有するそのような分子または組成物の使用も企図される。
免疫応答または炎症応答の調節は、様々な治療状況において有益であり得る。免疫応答または炎症応答の下方調節は、様々な種類の自己免疫疾患または炎症性疾患の治療において望ましくあり得る。任意の免疫応答の強化は、例えば、ワクチンに含まれる抗原、および／または癌細胞、線維症を媒介する細胞、もしくは病原体上で優先的に発現した抗原等の特定の抗原への応答を増幅するのに有益であり得る。したがって、免疫応答または炎症応答を調節することができる分子は、様々な病理学的状況において治療的価値を有する可能性がある。本発明は、不適切である、不十分である、かつ／または正常ではない炎症および／または免疫応答を特徴とする疾患を診断および治療するための治療薬を提供する。これらのうちの薬剤のいくつかは、免疫応答を刺激することができる。他の薬剤は、炎症および／または免疫応答を阻害することができる。
本発明は、ＢＴＮＬ３タンパク質およびそのバリアント、それらをコードする核酸、ならびにそれらに結合する抗体を提供する。より具体的には、本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質は、単離されたタンパク質および／または可溶性タンパク質であり得る多量体タンパク質および／または融合タンパク質である。ＢＮＴＬ３タンパク質は、細胞の表面に結合し、かつ／または細胞の表面で発現し得る。抗ＢＴＮＬ３抗体を含むＢＴＮＬ３タンパク質、ならびにＢＴＮＬ３のアンタゴニストおよびアゴニストの使用も提供される。
一実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む、単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質、任意に、可溶性タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質を包含し、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列アライメントウィンドウは、少なくとも５０、６０、７０、８０、または１００アミノ酸長であり、ＢＴＮＬ３タンパク質は、少なくとも二量体、三量体、または四量体であり、ＢＴＮＬ３タンパク質は、非ヒト宿主細胞によって産生されており、多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。わずかに異なる実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む、単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質、任意に、可溶性タンパク質を提供し、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも５０、６０、７０、８０、または１００アミノ酸長であり、ＢＴＮＬ３タンパク質は、（ａ）の単量体ポリペプチドの分子量の少なくとも約２、３、もしくは４倍の分子量、および／または（ａ）の単量体ポリペプチドの分子量の少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６倍の分子量を有し、ＢＴＮＬ３タンパク質は、非ヒト宿主細胞によって産生されており、多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。これらの実施形態のいずれかの代替として、またはこれに加えて、（ａ）および（ｂ）のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と比較して、単一アミノ酸の２０、１５、１２、１０、８、または５個を超えない挿入、欠失、または置換を有する配列を含み得る。いくつかの実施形態において、多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、（ａ）の単量体ポリペプチドの重量の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍を超えない重量であり得る。これらの実施形態のいずれかにおける多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、少なくとも二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、および／またはより高次の多量体でもあり得、これは、多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、および／またはより高次の多量体であり得ることも意味する。いくつかの実施形態において、多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を超えないものであり得る。多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～２３４、２３５、２３６、２３７、もしくは２３８のアミノ酸配列、または配列番号９のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～１６４、１６５、１６６、１６７、もしくは１６８のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸２３７～２５９も配列番号９のアミノ酸１６７～１８９も含まず、いくつかの実施形態において、これらのアミノ酸配列は、さらなるアミノ酸配列、例えば、Ｆｃポリペプチドのアミノ酸配列を含み得る。そのようなＦｃポリペプチドは、（ｉ）天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列または（ｉｉ）天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の１５、１０、または５個を超えない挿入、欠失、または置換を有する天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と実質的に類似したアミノ酸配列を含み得る。天然ヒトＦｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥアイソタイプのものであり得る。多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体、ホモ六量体、ホモ七量体、ホモ八量体、ホモ九量体、ホモ十量体、より高次のホモ多量体、ヘテロ多量体、または種の混合物であり得る。多量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの分子量の約４倍の分子量、（ａ）のポリペプチドの分子量の２倍と（ｂ）のポリペプチドの分子量の２倍の約合計、（ａ）のポリペプチドの分子量の３倍と（ｂ）のポリペプチドの分子量の約合計、または（ａ）のポリペプチドの分子量と（ｂ）のポリペプチドの分子量の３倍の約合計を有し得る。そのような多量体ＢＴＮＬ３タンパク質をコードする核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターならびにこれらのベクターおよび／またはこれらの核酸を含む宿主細胞も提供される。
別の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのＢＴＮＬ３融合タンパク質のアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長である）、および（ｂ）第１のポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、少なくとも２０アミノ酸長の配列番号２のアミノ酸２３７～４６６の配列の断片を含まない第２のポリペプチドを含むＢＴＮＬ３融合タンパク質を提供し、このＢＴＮＬ３融合タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。この融合タンパク質は、単離され得、かつ／または可溶性タンパク質であり得る。第２のポリペプチドは、Ｆｃポリペプチドであり得、このＦｃポリペプチドは、天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるか、または実質的に類似したアミノ酸配列を有し、天然ヒトＦｃ領域と比較して、単一アミノ酸の５、１０、１５、または２０個を超えない挿入、欠失、または置換を含む。天然ヒトＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭアイソタイプのものであり得る。ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６を含み得る。ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、配列番号７と実質的に類似したアミノ酸配列を含み得、このアミノ酸配列は、配列番号７と比較して、単一アミノ酸の５、１０、１５、または２０個を超えない挿入、欠失、または置換を含み、かつ／またはＢＴＮＬ３融合タンパク質は、配列番号７を含み得る。ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、少なくとも二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体であり得る。いくつかの実施形態において、ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を超えないものであり得る。ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、リンカーを含み得る。いくつかの実施形態において、ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、リンカーを含まない。そのようなＢＴＮＬ３融合タンパク質は、多量体であり得、この多量体は、単量体ＢＴＮＬ３融合タンパク質の分子量の少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍の分子量を有し得る。別の態様において、いくつかのそのような多量体は、単量体ＢＴＮＬ３融合タンパク質の分子量の約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍を超えない分子量を有し得る。そのようなＢＴＮＬ３融合タンパク質をコードする核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターならびにこれらのベクターおよび／またはこれらの核酸を含む宿主細胞も提供される。
別の実施形態において、本発明は、配列番号２、６、もしくは９の約２５～１３１位から伸びる配列番号２の断片のアミノ酸配列、または配列番号２、６、もしくは９のアミノ酸２５～１３１と比較して、単一アミノ酸の５もしくは１０個を超えない挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントを含む、ＢＴＮＬ３タンパク質、任意に、可溶性タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質を提供し、このＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２の約１３２～２３６位から伸びる配列番号２の断片のアミノ酸配列も、配列番号２のアミノ酸１３２～２３６と比較して、単一アミノ酸の２０、１５、１０、１０、もしくは５個を超えない挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントも含まず、ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。ＢＴＮＬ３タンパク質は、非ヒトまたは哺乳類宿主細胞において作製され得る。このＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２、６、または９のアミノ酸２５～１３１と比較して、単一アミノ酸の５個を超えない挿入、欠失、または置換を含み得る。または、別の態様において、可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸２５～１３１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。この可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、少なくとも二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体であり得る。そのようなＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、より高次の多量体、またはこれらの種の混合物でもあり得る。別の態様において、この可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体を超えないものであり得る。そのような可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、多量体であり得、この多量体は、単量体可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質の分子量の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍の分子量を有する。別の態様において、そのような可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、多量体であり得、これは、単量体可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質の分子量の約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍を超えない分子量を有する。そのような可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、例えば、抗体のＦｃ断片および／またはリンカー等の別のポリペプチドをさらに含み得る。そのような可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質をコードする核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターならびにこれらのベクターおよび／またはこれらの核酸を含む宿主細胞も提供される。
あるいは、ＢＴＮＬ３タンパク質、任意に、可溶性タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２もしくは６の約１３２～２３６位から伸びる配列番号２もしくは６の断片のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは６のアミノ酸１３２～２３６と比較して、単一アミノ酸の２０、１５、１０、もしくは５個を超えない挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントを含み得、このＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２もしくは６の２５～１３１位から伸びる配列番号２の断片のアミノ酸配列も、配列番号２もしくは６のアミノ酸２５～１３１と比較して、単一アミノ酸の１０個を超えない挿入、欠失、または置換を含むそのバリアントも含まず、ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。ＢＴＮＬ３タンパク質は、非ヒトまたは哺乳類宿主細胞において作製され得る。そのような可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したそのようなＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したそのようなＢＴＮＬ３タンパク質は、少なくとも二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、またはより高次の多量体であり得る。別の態様において、可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体を超えないものであり得る。そのようなＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したそのようなＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したそのようなＢＴＮＬ３タンパク質は、例えば、抗体のＦｃ断片および／またはリンカー等の別のポリペプチドをさらに含み得る。そのような可溶性ＢＴＮＬ３、またはマイクロビーズ等の表面に結合したそのようなＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したそのようなＢＴＮＬ３タンパク質は、多量体であり得、この多量体は、単量体可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質の分子量の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍の分子量を有する。加えて、可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質は、多量体であり得、この多量体は、単量体可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質の分子量の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍を超えない分子量を有する。そのようなＢＴＮＬ３融合タンパク質をコードする核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターならびにこれらのベクターおよび／またはこれらの核酸を含む宿主細胞も提供される。
さらなる実施形態において、ＤＮＡによってコードされるＢＴＮＬ３融合タンパク質が提供され、このＤＮＡは、（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡと（このＤＮＡは、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５２、５５、５８、もしくは６１～６９６、６９９、７０２、７０５、もしくは７０８、または配列番号８のヌクレオチド５２、５５、５８、もしくは６１～４８６、４８９、４９２、４９５、もしくは４９８のヌクレオチド配列からなるか、あるいは（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）のＤＮＡにハイブリダイズする）、（ｂ）配列番号１または配列番号８の配列からなるポリヌクレオチドをハイブリダイズせず、（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとインフレームで別のポリペプチドをコードする別のＤＮＡとを含み、この融合タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、リンカー配列を含み得、単離され得、かつ／または可溶性タンパク質であり得る。そのようなＢＴＮＬ３融合タンパク質は、多量体であり得、この多量体は、単量体ＢＴＮＬ３融合タンパク質の分子量の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍の分子量を有する。さらなる態様において、そのようなＢＴＮＬ３融合タンパク質は、多量体であり得、この多量体は、単量体ＢＴＮＬ３融合タンパク質の分子量の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍を超えない分子量を有する。そのようなＢＴＮＬ３融合タンパク質をコードする核酸、ならびにこれらの核酸を含むベクターならびにこれらのベクターおよび／またはこれらの核酸を含む宿主細胞も提供される。
上または下で論じられるＢＴＮＬ３タンパク質のうちのいずれも、単離され得、かつ／または可溶性であり得、ＢＴＮＬ３タンパク質の複数の分子を含む多量体または凝集種を含み得る。多量体または凝集体に含まれる単量体ＢＴＮＬ３タンパク質種の分子量は、還元条件下でのゲル電気泳動または還元条件下で行われるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定され得る。多量体または凝集種の分子量は、非還元条件下で行われるゲル電気泳動および／またはＳＥＣによって測定され得る。いくつかの実施形態において、多量体または凝集体は、単量体種の分子量の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍の分子量を有する。いくつかの実施形態において、多量体または凝集体は、単量体種の分子量の約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍を超えない分子量を有する。そのような多量体または凝集体の単量体ＢＴＮＬ３タンパク質は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～２３４、２３５、２３６、２３７、もしくは２３８、または配列番号９のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～１６４、１６５、１６６、１６７、もしくは１６８のアミノ酸のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９の１８～１６６との（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸長である）、または（ｃ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６の配列のような配列を有するポリペプチド（これが、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と比較して、単一アミノ酸の２０、１５、１０、または５個を超えない挿入、欠失、または置換を含み得ることを除く）を含む。
別の態様において、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む単離されたバリアントＢＴＮＬ３タンパク質が本明細書に記載され、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長であり、このタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、このタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる。
多量体、融合、およびバリアントＢＴＮＬ３タンパク質を含む本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質のうちのいずれかをコードする単離されたＤＮＡも本明細書に記載され、このＤＮＡは、エクソン配列を含まない。
別の態様において、ＢＴＮＬ３タンパク質を含む融合タンパク質および別のポリペプチドをコードするＤＮＡが提供され、このＤＮＡは、（ａ）（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５２、５５、５８、もしくは６１～６９６、６９９、７０２、７０５、もしくは７０８、または配列番号８のヌクレオチドもしくは５２、５５、５８、もしくは６１～４８６、４８９、４９２、４９５、もしくは４９８のＤＮＡ配列からなるか、または（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、および（ｂ）配列番号１または配列番号８の配列からなるＤＮＡにハイブリダイズせず、（ａ）のＤＮＡによってコードされるポリペプチドとインフレームで別のポリペプチドをコードする別のＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。これらのＤＮＡを含むベクターならびにこのベクターおよび／またはこのＤＮＡを含む宿主細胞も企図される。
本発明は、多量体ＢＴＮＬ３タンパク質、ＢＴＮＬ３融合タンパク質、および可溶性もしくはバリアントＢＴＮＬ３タンパク質、またはマイクロビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質もしくは細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質を含む上述のＢＴＮＬ３タンパク質のうちのいずれかを作製する方法を提供し、この方法は、ＤＮＡの発現に好適な条件下でＢＴＮＬ３タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を培地中で培養することと、細胞集団または培養培地からのこの発現したＢＴＮＬ３タンパク質を回収することとを含む。このＤＮＡは、宿主細胞に導入され得る。
さらに別の態様において、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を治療する方法が提供され、この方法は、患者に、治療的に有効な用量の以下のうちのいずれか１つを投与することを含む：（１）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列を含む任意のＢＴＮＬ３タンパク質、（２）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の５、１０、１５、もしくは２０個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント（このＢＴＮＬ３バリアントタンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる）、あるいは（３）アゴニスト抗ＢＴＮＬ３抗体等のＢＴＮＬ３アゴニストまたは抗ＢＴＮＬ３抗体に対する抗イディオタイプ抗体。あるいは、そのような治療は、エクスビボで行われ得る。さらなる代替案として、ＢＴＮＬ３タンパク質またはアゴニストは、ナノ粒子での投与等のインビボまたはエクスビボ投与のために小粒子に結合し得る。この方法は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質によるＴ細胞増殖の阻害を拮抗することができるＢＴＮＬ３バリアントタンパク質を除く、この方法を実践するために上および下で論じられる多量体ＢＴＮＬ３タンパク質、ＢＴＮＬ３融合タンパク質、またはＢＴＮＬ３タンパク質のうちのいずれかの使用を含む。自己免疫疾患または炎症性疾患は、数ある中でもとりわけ、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性特発性関節炎、および乾癬性関節炎を含む）、アジソン病、喘息、多腺性内分泌障害症候群、全身性エリテマトーデス、慢性活動性肝炎、甲状腺炎、リンパ球性腺下垂体炎、早発閉経、特発性副甲状腺機能低下症、悪性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性好中球減少症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、強皮症、原発性シェーグレン症候群、多発性筋炎、自己免疫性溶血性貧血、炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎、乾癬、皮膚炎、サルコイドーシス、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、１型および２型糖尿病、移植関連状態、例えば、組織不適合性または移植片対宿主病、痛風および関連炎症性結晶沈着症、または線維症、例えば、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝硬変症、強皮症、腎移植線維症、腎同種移植ネフロパシー、肺線維症（特発性肺線維症を含む）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、混合本態性クリオグロブリン血症、ならびに温式自己免疫性溶血性貧血であり得る。
さらなる態様において、Ｔ細胞増殖を阻害するための方法が提供され、この方法は、Ｔ細胞に、（１）配列番号２のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～２３４、２３５、２３６、２３７、もしくは２３８、または配列番号９のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～１６４、１６５、１６６、１６７、もしくは１６８のアミノ酸配列を含む任意のＢＴＮＬ３タンパク質、または（２）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の５、１０、１５、または２０個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを添加することを含み、このＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。この方法は、Ｔ細胞増殖を阻害するための上および下で論じられる可溶性多量体ＢＴＮＬ３タンパク質、ＢＴＮＬ３融合タンパク質、または可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質の使用を包含する。このＴ細胞増殖の阻害は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで生じ得る。
別の態様において、制御性Ｔ（「Ｔ ｒｅｇ」）細胞を増大させるための方法が提供され、この方法は、Ｔ細胞に、（１）配列番号２のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～２３４、２３５、２３６、２３７、もしくは２３８、または配列番号９のアミノ酸１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３～１６４、１６５、１６６、１６７、もしくは１６８のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質、または（２）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の５、１０、１５、または２０個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを添加することを含み、このＢＴＮＬ３タンパク質またはバリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。この方法は、Ｔ ｒｅｇ細胞を増大させるために上および下で論じられるプレートもしくはビーズ等の表面に結合したＢＴＮＬ３タンパク質または細胞表面上で発現したＢＴＮＬ３タンパク質、多量体であり得る可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、またはＢＴＮＬ３融合タンパク質もしくは可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質の使用を包含する。このＴ ｒｅｇ細胞の増大は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで生じ得る。この方法は、Ｔ細胞集団を本明細書に記載の有効な量のＢＴＮＬ３タンパク質、融合タンパク質、またはアゴニストと接触させることを含む。Ｔ ｒｅｇ細胞の「増大」は、Ｔ ｒｅｇ細胞（ＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋）の、全体としてのＴ細胞（ＣＤ３＋ＦＯＸＰ３－）に対する比率がより大きくなることを意味する。この比率は、当技術分野で周知の方法である抗体を用いて細胞タンパク質を検出するＦＡＣＳ分析によって決定され得る。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：２０２７－２０３５を参照されたい。
別の実施形態は、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を治療するための方法を含み、この方法は、患者に、治療的に有効な用量の抗ＢＴＮＬ３抗体を投与することを含み、この抗ＢＴＮＬ３抗体は、天然ＢＴＮＬ３タンパク質によるＴ細胞の増殖の阻害をアゴナイズし、抗ＢＴＮＬ３抗体は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６のアミノ酸配列からなるタンパク質に結合する。
別の実施形態は、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を治療するための方法を含み、この方法は、患者に、治療的に有効な用量の抗ＢＴＮＬ３抗体を投与することを含み、抗ＢＴＮＬ３抗体は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６のアミノ酸配列からなるタンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗ＢＴＮＬ３抗体は、細胞表面ＢＴＮＬ３タンパク質に結合し、ＢＴＮＬ３、例えば、好中球発現ＢＴＮＬ３のＢ３０．２ドメインを介して細胞内シグナル伝達カスケードを誘導することができる。そのような細胞内シグナル伝達は、ＢＴＮＬ３を発現する細胞の増殖を阻害するか、またはある場合には、細胞死を引き起こすことができる。自己免疫疾患または炎症性疾患には、例えば、うっ血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、ならびに痛風および関連炎症性結晶沈着症等の過剰な好中球活性を特徴とする疾患が含まれる。
さらなる方法は、癌患者の治療を含み、この方法は、患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６からなるＢＴＮＬ３タンパク質または配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９０％もしくは９５％同一のＢＴＮＬ３タンパク質に結合する治療的に有効な量の抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態において、そのような抗ＢＮＴＬ３抗体は、１０－８、１０－９、１０－１０、または１０－１１Ｍを超えない平衡解離定数（ＫＤ）で、本明細書に記載のヒトＢＴＮＬ３タンパク質に結合することができる。いくつかの実施形態において、そのような抗ＢＴＮＬ３抗体は、配列番号２および／または配列番号９と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質に結合することができ、配列番号２および／または９とのアライメントウィンドウは、少なくとも５０、６０、７０、８０、または１００アミノ酸長であり、任意に、ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。いくつかの実施形態において、抗ＢＴＮＬ３抗体は、配列番号２および／または９のアミノ酸配列の断片を含むタンパク質に結合することができる。この抗体は、ＢＴＮＬ３によるＴ細胞増殖の抑制を拮抗するアンタゴニスト抗ＢＴＮＬ３抗体であり得る。あるいは、この抗体は、癌細胞上で発現したＢＴＮＬ３に結合し、それによりその増殖を阻害するか、ある場合には、細胞死を引き起こすように癌細胞にシグナル伝達することができる。癌は、例えば、急性または慢性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、リンパ球性白血病、リンパ球性または皮膚リンパ腫、癌腫、腺癌、肉腫、胸腺腫、縦隔新生物、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、様々な種類の皮膚癌、膀胱癌、悪性神経膠腫、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道新生物、小腸癌、結腸癌、または直腸癌、腎臓癌または尿管癌、睾丸癌、尿道癌または陰茎癌、婦人科腫瘍、卵巣癌、骨肉腫、内分泌系癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系新生物、および形質細胞腫であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、癌細胞上で発現したＢＴＮＬ３に結合するアゴニスト抗体であり得、Ｂ３０．２ドメインを介する細胞内シグナル伝達を引き起こす。
癌患者を治療する方法がさらに提供され、この方法は、患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む治療的に有効な量のバリアントＢＴＮＬ３タンパク質を投与することを含み、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長であり、バリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、バリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる。癌は、腺癌であり得る。
別の態様において、病原体に感染した患者を治療する方法が本明細書に提供され、この方法は、患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６および／または配列番号９のアミノ酸１８～１６６からなるアミノ酸配列のＢＴＮＬ３タンパク質、または配列番号２のアミノ酸１８～２３６および／または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％または９５％同一の配列からなるアミノ酸配列のＢＴＮＬ３タンパク質に結合する治療的に有効な量の抗体を投与することを含み、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長である。この抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができるアンタゴニスト抗体であり得る。
さらなる態様において、病原体に感染した患者を治療する方法が本明細書に記載され、この方法は、患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む治療的に有効な量のバリアントＢＴＮＬ３タンパク質を投与することを含み、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長であり、バリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、バリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる。
別の態様において、自己免疫状態または炎症性状態を有する患者を治療するための方法が本明細書に記載され、この方法は、（ａ）患者からＴ細胞を取り出すステップと、（ｂ）抗ＣＤ３抗体およびＢＴＮＬ３タンパク質を含むタンパク質の組み合わせでＴ細胞を刺激するステップと（ＢＴＮＬ３タンパク質は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％または９５％同一のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長である）、または（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の２０個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む）、（ｃ）刺激されたＴ細胞を収集するステップと、（ｄ）患者に収集されたＴ細胞を戻すステップとを含み、ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。ＢＴＮＬ３タンパク質は、（ｂ）（ｉｉｉ）のＢＴＮＬ３タンパク質であり得、このアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の５または１０個を超えない挿入、欠失、または置換を有する。ＢＴＮＬ３タンパク質は、（ｂ）（ｉ）のＢＴＮＬ３タンパク質であり得る。自己免疫状態または炎症性状態は、数ある中でもとりわけ、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性特発性関節炎、および乾癬性関節炎を含む）、アジソン病、喘息、多腺性内分泌障害症候群、全身性エリテマトーデス、慢性活動性肝炎、甲状腺炎、リンパ球性腺下垂体炎、早発閉経、特発性副甲状腺機能低下症、悪性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性好中球減少症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、強皮症、原発性シェーグレン症候群、多発性筋炎、自己免疫性溶血性貧血、炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎、乾癬、皮膚炎、サルコイドーシス、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、１型および２型糖尿病、移植関連状態、例えば、組織不適合性または移植片対宿主病、痛風および関連炎症性結晶沈着症、または線維症、例えば、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝硬変症、強皮症、腎移植線維症、腎同種移植ネフロパシー、肺線維症（特発性肺線維症を含む）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、混合本態性クリオグロブリン血症、ならびに温式自己免疫性溶血性貧血からなる群から選択され得る。
患者に例えば癌または病原体に対するワクチンを接種するための方法が提供され、この方法は、患者に、抗原と、（ａ）（ｉ）ＢＴＮＬ３タンパク質（このアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６からなる）、または（ｉｉ）ＢＴＮＬ３タンパク質（このアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％または９５％同一のアミノ酸配列からなり、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長である）に結合するアンタゴニスト抗体、または（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むバリアントＢＴＮＬ３タンパク質（配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６とのアミノ酸配列のアライメントウィンドウは、少なくとも８０アミノ酸長であり、バリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、バリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる）を投与することを含む。この抗原は、癌抗原または病原体に対する免疫応答を誘発することができる抗原であり得る。アンタゴニスト抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる。そのような方法において、アンタゴニスト抗ＢＮＴＬ３抗体またはバリアントＢＴＮＬ３タンパク質は、この抗原の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。アンタゴニスト抗ＢＴＮＬ３抗体またはバリアントＢＴＮＬ３タンパク質および抗原を含むワクチンが本明細書で企図される。
本発明は、例えば、以下の項目も提供される。
（項目１）
単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドと、を含み、
配列番号２のアミノ酸１８～２３６との前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、少なくとも二量体であり、
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、非ヒト宿主細胞によって産生されており、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目２）
単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドと、を含み、
配列番号２のアミノ酸１８～２３６との前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、（ａ）のポリペプチドの分子量の少なくとも約２倍の分子量を有し、
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、非ヒト宿主細胞によって産生されており、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目３）
前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９５％同一である、項目１または２に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目４）
前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９７％同一である、項目３に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。（項目５）
前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１８～２３６のアミノ酸配列を含む、項目４に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目６）
前記（ａ）および（ｂ）のアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸２３７～２５９を含まない、項目１～５のいずれか一項に記載の多量体ＢＮＴＬ３タンパク質。
（項目７）
前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドがそれぞれ、配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９０％同一の前記アミノ酸配列に加えてさらなるアミノ酸配列を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目８）
前記（ａ）および（ｂ）の前記さらなるアミノ酸配列がＦｃポリペプチドのアミノ酸配列である、項目７に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目９）
（ｉ）前記Ｆｃポリペプチドが天然ヒトＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉ）前記Ｆｃポリペプチドが、天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の１５個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む、項目８に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１０）
前記（ｉｉ）のＦｃポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の１０個を超えない挿入、欠失、または置換を有する、項目９に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１１）
前記（ｉｉ）のＦｃポリペプチドが、前記天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の５個を超えない挿入、欠失、または置換を有する、項目１０に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１２）
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができる、項目８～１１のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１３）
前記天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１４）
前記天然ヒトＦｃ領域がＩｇＧ１アイソタイプのものである、項目９～１３のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１５）
前記天然ヒトＦｃ領域がＩｇＧ２アイソタイプのものである、項目９～１３のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１６）
前記天然ヒトＦｃ領域がＩｇＧ４アイソタイプのものである、項目９～１３のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１７）
ホモ三量体またはより高次のホモ多量体である、項目１～１６のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１８）
ホモ四量体またはより高次のホモ多量体である、項目１７に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目１９）
ヘテロ多量体である、項目１～１６のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目２０）
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、
前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの分子量の約４倍の分子量、
前記（ａ）のポリペプチドの分子量の２倍と前記（ｂ）のポリペプチドの分子量の２倍の約合計、
前記（ａ）のポリペプチドの分子量の３倍と前記（ｂ）のポリペプチドの分子量の約合計、または
前記（ａ）のポリペプチドの分子量と前記（ｂ）のポリペプチドの分子量の３倍の約合計を有する、項目１～１９のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目２１）
ＢＴＮＬ３融合タンパク質であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸１８～２３６との前記ＢＴＮＬ３融合タンパク質のアミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長である、第１のポリペプチドと、
（ｂ）前記第１のポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、少なくとも２０アミノ酸長の配列番号２のアミノ酸２３７～４６６の配列の断片を含まない、第２のポリペプチドと、を含み、
前記ＢＴＮＬ３融合タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、ＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２２）
前記第２のポリペプチドがＩｇＧ Ｆｃポリペプチドである、項目２１に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２３）
前記Ｆｃポリペプチドが、天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の１５個を超えない挿入、欠失、または置換を含むアミノ酸配列を有する、項目２２に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２４）
前記Ｆｃポリペプチドが、前記天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の１０個を超えない挿入、欠失、または置換を含むアミノ酸配列を有する、項目２３に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２５）
前記Ｆｃポリペプチドが、前記天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列と比較して、単一アミノ酸の５個を超えない挿入、欠失、または置換を含むアミノ酸配列を有する、項目２４に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２６）
前記ＢＴＮＬ３融合タンパク質がＦｃＲｎに結合することができる、項目２３～２５のいずれか一項に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２７）
前記天然ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列を含む、項目２６に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２８）
前記天然ヒトＦｃ領域がＩｇＧ１アイソタイプのものである、項目２３～２７のいずれか一項に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目２９）
前記天然ヒトＦｃ領域がＩｇＧ２アイソタイプのものである、項目２３～２７のいずれか一項に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３０）
前記天然ヒトＦｃ領域がＩｇＧ４アイソタイプのものである、項目２３～２７のいずれか一項に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３１）
前記第１のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６と少なくとも９５％同一である、項目２１～３０のいずれか一項に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３２）
前記第１のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸１８～２３６を含む、項目３１に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３３）
配列番号７と実質的に類似したアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号７と比較して、単一アミノ酸の２０個を超えない挿入、欠失、または置換を含む、項目２１～３２のいずれか一項に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３４）
前記アミノ酸配列が、配列番号７と比較して、単一アミノ酸の１５個を超えない挿入、欠失、または置換を含む、項目３３に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３５）
前記アミノ酸配列が、配列番号７と比較して、単一アミノ酸の１０個を超えない挿入、欠失、または置換を含む、項目３４に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３６）
前記アミノ酸配列が、配列番号７と比較して、単一アミノ酸の５個を超えない挿入、欠失、または置換を含む、項目３５に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３７）
前記アミノ酸配列が配列番号７の配列を含む、項目３６に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３８）
非還元条件下での前記ＢＴＮＬ３融合タンパク質の分子量が、前記ＢＴＮＬ３融合タンパク質の単量体種の分子量の少なくとも約４倍である、項目２１～３７のいずれか一項に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目３９）
非還元条件下での前記ＢＴＮＬ３融合タンパク質の分子量が、前記ＢＴＮＬ３融合タンパク質の単量体種の分子量の約４倍である、項目３８に記載のＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目４０）
単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質であって、
（ａ）配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと、を含み、
配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、少なくとも二量体であり、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、非ヒト宿主細胞によって産生されており、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目４１）
単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質であって、
（ａ）配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドと、を含み、
配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、（ａ）のポリペプチドの分子量よりも約３倍大きい分子量を有し、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、非ヒト宿主細胞によって産生されており、
前記多量体ＢＴＮＬ３タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、単離された多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目４２）
前記（ａ）および（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸１８～１６６と比較して、単一アミノ酸の１０個を超えない挿入、欠失、または置換を含む、項目４０または４１に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目４３）
ＤＮＡによってコードされるＢＴＮＬ３融合タンパク質であって、前記ＤＮＡが、
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５２～７０８のヌクレオチド配列もしくは配列番号８のヌクレオチド５２～４９８のヌクレオチド配列からなるか、または
（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で前記（ｉ）のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１もしくは配列番号８の配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズせず、前記（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされた前記ポリペプチドとインフレームでポリペプチドをコードする、別のポリヌクレオチドと、を含み、
前記融合タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、ＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目４４）
リンカー配列を含む、項目１～４３のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質またはＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目４５）
前記タンパク質の分子量が、前記タンパク質の単量体種の分子量の約４倍である、項目４４に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質またはＢＴＮＬ３融合タンパク質。
（項目４６）
配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む単離されたバリアントＢＴＮＬ３タンパク質であって、
配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９の１８～１６６との前記アミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、
前記バリアントＢＴＮＬ３タンパク質が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、
前記バリアントＢＴＮＬ３タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる、単離されたバリアントＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目４７）
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、項目４６に記載のバリアントＢＴＮＬ３タンパク質。
（項目４８）
項目１～４７のいずれか一項に記載の多量体ＢＴＮＬ３タンパク質、ＢＴＮＬ３融合タンパク質、またはバリアントＢＴＮＬ３タンパク質をコードする単離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡがエクソン配列を含まない、単離されたＤＮＡ。
（項目４９）
ＢＴＮＬ３タンパク質および別のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡであって、前記ＤＮＡが、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡであって、前記ＤＮＡが、
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド５２～７０８のヌクレオチド配列もしくは配列番号８のヌクレオチド５２～４９８のヌクレオチド配列からなるか、または
（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で前記（ｉ）のＤＮＡにハイブリダイズする、ＤＮＡと、
（ｂ）配列番号１または配列番号８の配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズせず、前記（ａ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとインフレームでポリペプチドをコードする、別のＤＮＡと、を含み、
前記融合タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、単離されたＤＮＡ。
（項目５０）
項目４８または４９に記載のＤＮＡを含む、ベクター。
（項目５１）
項目４８または４９に記載のＤＮＡまたは項目５０に記載のベクターを含む、非ヒト宿主細胞。
（項目５２）
ＢＴＮＬ３タンパク質を作製する方法であって、
項目５１に記載の宿主細胞を、前記核酸の発現に好適な条件下で、培地中で培養することと、
前記細胞または前記培養培地から前記発現したタンパク質を回収することと、を含む、方法。
（項目５３）
自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を治療する方法であって、前記患者に、治療的に有効な用量のＢＴＮＬ３タンパク質を投与することを含み、前記治療的に有効な用量のＢＴＮＬ３タンパク質が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６のアミノ酸配列または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であって、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記アミノ酸配列のアライメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、アミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６の配列と比較して、単一アミノ酸の２０個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、方法。
（項目５４）
前記自己免疫疾患または炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、移植関連状態、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、サルコイドーシス、喘息、または線維症からなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記自己免疫疾患または炎症性疾患がクローン病である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記自己免疫疾患または炎症性疾患が潰瘍性大腸炎である、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
前記自己免疫疾患または炎症性疾患が線維症である、項目５４に記載の方法。
（項目５８）
Ｔ細胞増殖を阻害するための方法であって、前記Ｔ細胞にＢＴＮＬ３タンパク質を添加することを含み、前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であって、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記アミノ酸配列のアライメントウィンドウが少なくとも８０アミノ酸長である、アミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６の配列と比較して、単一アミノ酸の２０個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、方法。
（項目５９）
前記阻害が、インビトロまたはエクスビボで生じる、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記阻害がインビボで生じる、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
癌患者を治療する方法であって、前記患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６および／または配列番号９のアミノ酸１８～１６６からなるＢＴＮＬ３タンパク質に結合する治療的に有効な量の抗体を投与することを含む、方法。
（項目６２）
前記抗体がアンタゴニスト抗体である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記癌が腺癌である、項目６１または６２に記載の方法。
（項目６４）
癌患者を治療する方法であって、前記患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む治療的に有効な量のバリアントＢＴＮＬ３タンパク質を投与することを含み、
配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記アミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、
前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、
前記タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる、方法。
（項目６５）
前記癌が腺癌である、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
病原体に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６および／または配列番号９のアミノ酸１８～１６６からなるＢＴＮＬ３タンパク質に結合する治療的に有効な量の抗体を投与することを含む、方法。
（項目６７）
前記抗体がアンタゴニスト抗体である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
病原体に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む治療的に有効な量のバリアントＢＴＮＬ３タンパク質を投与することを含み、
配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記アミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、
前記バリアントＢＴＮＬ３タンパク質が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、
前記バリアントＢＴＮＬ３タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる、方法。
（項目６９）
患者に抗原に対するワクチンを接種するための方法であって、前記患者に、前記抗原と、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６および／または配列番号９のアミノ酸１８～１６６からなるタンパク質に結合するアンタゴニスト抗体、または
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むバリアントＢＴＮＬ３タンパク質と、を投与することを含み、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記アミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長であり、前記バリアントＢＴＮＬ３タンパク質が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まず、前記バリアントＢＴＮＬ３タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる、方法。
（項目７０）
前記抗原が癌抗原である、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記抗原が、病原体に対する免疫応答を誘発することができる、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記抗原が、前記アンタゴニスト抗体の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る、項目６９～７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
自己免疫状態または炎症性状態を有する患者を治療するための方法であって、
（ａ）前記患者からＴ細胞を取り出すステップと、
（ｂ）抗ＣＤ３抗体を含むタンパク質とＢＴＮＬ３タンパク質の組み合わせで前記Ｔ細胞を刺激するステップであって、前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であって、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６との前記アミノ酸配列のアライメントウィンドウが、少なくとも８０アミノ酸長である、アミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６の配列と比較して、単一アミノ酸の２０個を超えない挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む、刺激するステップと、
（ｃ）前記刺激されたＴ細胞を収集するステップと、
（ｄ）前記患者に前記収集されたＴ細胞を戻すステップと、を含み、
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる、方法。
（項目７４）
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、前記（ｂ）（ｉｉｉ）のＢＴＮＬ３タンパク質であり、前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６の配列と比較して、単一アミノ酸の１０個を超えない挿入、欠失、または置換を有する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６の配列と比較して、単一アミノ酸の５個を超えない挿入、欠失、または置換を有する、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ＢＴＮＬ３タンパク質が、前記（ｂ）（ｉ）のＢＴＮＬ３タンパク質である、項目７３に記載の方法。
（項目７７）
前記自己免疫状態または炎症性状態が、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、サルコイドーシス、喘息、移植関連状態、１型もしくは２型糖尿病、または線維症からなる群から選択される、項目７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
ブチロフィリン様（ＢＴＮＬ）タンパク質ファミリー（ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＥＲＭＡＰ、およびＭＯＧ）の一部であるヒトタンパク質のドメイン構造、ならびに関連ブチロフィリンおよびＢ７ファミリーの一般構造が図示される。各楕円または円は、タンパク質ドメインを表す。これらのドメインは、以下のように示される：
Figure 2022040181000002
特定のドメイン構造で識別されていない領域は、水平線で示される。
健常なドナーの血液由来の様々な一次ヒト免疫細胞中に存在するＢＴＮＬ３ ｍＲＮＡの相対量を示す。縦軸は、ＲＯＳＥＴＴＡ ＲＥＳＯＬＶＥＲ（登録商標）を用いて生成されたＢＴＮＬ３ ｍＲＮＡの発現の強度値を示す。試験したこれらの様々な細胞型は、ｘ軸に沿って、１：末梢血単核球、２：Ｔ細胞、３：ＣＤ４＋Ｔ細胞、４：ＣＤ８＋Ｔ細胞、５：Ｂ細胞、６：単球、７：マクロファージ、８：好中球、９：好酸球、１０：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で示される。レーン８の水平線とエラーバーは、好中球におけるＢＴＮＬ３の発現のために得られた平均強度値と標準偏差を示す。方法は、実施例１で詳細に説明される。 以下のｘ軸で識別される正常なヒト組織から抽出されたＲＮＡの次世代ＲＮＡシーケンシングによって測定されたＢＴＮＬ３の発現量を示す：１：副腎（別途特定されず）、２：動脈（大動脈）、３：血液、４：骨髄（別途特定されず）、５：脳（前帯状）、６：脳（小脳）、７：脳（前頭葉）、８：脳（別途特定されず）、９：乳房、１０：気管支、１１：上行結腸、１２：結腸（別途特定されず）、１３：Ｓ状結腸、１４：十二指腸、１５：食道、１６：腹部脂肪、１７：心臓（別途特定されず）、１８：心臓（心室）、１９：心臓（左室）、２０：島細胞、２１：腎臓（皮質）、２２：腎臓（髄質）、２３：腎臓（別途特定されず）、２４：肝臓、２５：肺、２６：腸間膜リンパ節、２７：リンパ節（別途特定されず）、２８：骨格筋（別途特定されず）、２９：視神経、３０：卵巣、３１：膵臓頭部、３２：膵臓（別途特定されず）、３３：末梢血単核球、３４：前立腺、３５：直腸、３６：網膜、３７：皮膚（別途特定されず）、３８：小腸（十二指腸）、３９：小腸（回腸）、４０：小腸（空腸）、４１：脊髄（頸部）、４２：脊髄（腰部）、４３：脊髄（胸部）、４４：脾臓、４５：胃（腹部）、４６：胃（別途特定されず）、４７：胃（幽門）、４８：睾丸、４９：甲状腺、５０：舌、および５１：膀胱（排尿筋）。ｙ軸は、発現量を示し、１細胞当たりのＢＴＮＬ３転写物の数として示される。 様々なヒト疾患組織の試料の次世代ＲＮＡシーケンシング分析によって測定されたＢＴＮＬ３の発現量を示す。ｘ軸は、以下の各試料の性質を示す：１：転移性腺癌、２：腺癌（転移性結腸癌）、３：腺癌（転移性胃癌）、４：腺癌（中程度分化型）、５：腺癌（別途特定されず）、６：腺癌（低分化）、７：小細胞癌腫（別途特定されず）、８：小細胞癌腫（燕麦細胞）、９：癌腫（分化されていない）、１０：ＩＩ型糖尿病試料、１１：急性骨髄性白血病、１２：急性骨髄白血病、１３：悪性黒色腫、および１４：悪性転移性黒色腫。ｙ軸は、発現量を示し、１細胞当たりのＢＴＮＬ３転写物の数として示される。 ｙ軸は、ある場合には、マイクロタイター皿上で固定化されたタンパク質で、場合によっては溶液中の様々な他のタンパク質の存在下で活性化されたマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖レベルを示す。ｘ軸に沿って印をつけたレーンは、以下のように処理した試料を表す：レーン１：固定化活性化タンパク質または他のタンパク質の使用なし、レーン２：細胞を活性化するために固定化抗ＣＤ３抗体を使用（反応にヒトＩｇＧを含めた）、レーン３：細胞を活性化するために固定化抗ＣＤ３抗体を使用（反応に組換えＢ７－２．Ｆｃを含めた）、レーン４：細胞を活性化するために固定化抗ＣＤ３抗体を使用（反応に組換えＢＴＮＬ２．Ｆｃを含めた）、レーン５：細胞を活性化するために固定化抗ＣＤ３抗体を使用（反応に組換えＢＴＮＬ３．Ｆｃを含めた）、レーン６：細胞を活性化するために固定化ヒトＩｇＧを使用（反応に組換えＢＴＮＬ２．Ｆｃを含めた）、およびレーン７：細胞を活性化するために固定化ヒトＩｇＧを使用（反応に組換えＢＴＮＬ３．Ｆｃを含めた）。 この図において、各黒色の点は、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞における特定の配列のＲＮＡ発現のデータを反映し、そこでの配列の発現は、細胞が供される刺激物によって有意に上方または下方制御される。刺激物の影響を受けなかった発現の配列は、この図には示されない。ｘ軸は、アレイ分析で検出された各特定の配列の刺激していない細胞と刺激した細胞の両方のシグナル強度平均のｌｏｇ１０を示す。ｙ軸は、２４時間培養した刺激していない細胞における同一の配列の発現と比較した、２４時間刺激した後の発現の比率のｌｏｇ１０を示す。用いた刺激は、以下の通りである：左：抗ＣＤ３抗体のみで刺激、中央：抗ＣＤ３抗体とマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ融合タンパク質で刺激、および右：抗ＣＤ３抗体とヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃ融合タンパク質で刺激。
配列表の簡単な説明
配列番号１：ヒトＢＴＮＬ３コーディング領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号２：ヒトＢＴＮＬ３のアミノ酸配列
配列番号３：ＩｇＫシグナル配列のアミノ酸配列
配列番号４：ヒト成長ホルモンのシグナル配列のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃ融合タンパク質をコードする全長ヌクレオチド配列
配列番号６：ヒトＢＴＮＬ３融合タンパク質の全長アミノ酸配列
配列番号７：成熟ＢＴＮＬ３．Ｆｃのアミノ酸配列（シグナル配列なし）
配列番号８：ＢＴＮＬ３のスプライスバリアントをコードするヌクレオチド配列
配列番号９：配列番号８によってコードされるアミノ酸配列
配列番号１０：ペプチドリンカー
配列番号１１：ペプチドリンカー
配列番号１２：ペプチドリンカー
配列番号１３：ペプチドリンカー
配列番号１４：ペプチドリンカー
配列番号１５：ペプチドリンカー
配列番号１６：ペプチドリンカー
配列番号１７：ペプチドリンカー
配列番号１８：ペプチドリンカー
（詳細な説明）
本発明は、ＢＴＮＬ３タンパク質、またはＢＴＮＬ３タンパク質のアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、抗ＢＴＮＬ３抗体、および／またはＢＴＮＬ３タンパク質のバリアント形態の使用を提供する。本発明は、多量体、融合タンパク質、およびそのバリアントを含むＢＴＮＬ３タンパク質、そのようなタンパク質の使用、ならびに上述のすべてをコードする核酸を提供する。ＢＴＮＬ３タンパク質は、Ｔ細胞活性化、増殖、およびサイトカイン産生を低減させることによってＴ細胞の機能を変化させることができる。そのような効果は、数ある中でもとりわけ、炎症性腸疾患および線維障害等のＴ細胞媒介性自己免疫疾患または炎症性疾患の効果的な治療につながり得る。ＢＴＮＬ３のアンタゴニストは、ＢＴＮＬ３がＴ細胞活性化、増殖、およびサイトカイン分泌を阻害しないように阻止または拮抗するように機能することができ、したがって、Ｔ細胞活性化の全体的な増加につながり得る。そのような効果は、癌等の疾患の治療またはワクチンの有効性向上に有用であり得る。さらに、ＢＴＮＬ３のアゴニストは、例えば、ＢＴＮＬ３タンパク質をクラスター化することによって、免疫細胞機能を、その機能を遮断することなく変化させることができ得る。そのようなアゴニストは、例えば、増殖および／またはサイトカイン分泌を増加または減少させることによって、そのような細胞の活性を調節し得るＢ３０．２ドメインを介したＢＴＮＬ３を発現する細胞への細胞内シグナル伝達を媒介し得る。ＢＴＮＬ３が好中球およびいくつかの種類の癌細胞上で発現するため、そのような細胞内シグナル伝達は、そのような細胞によって媒介される疾患の経過を調節し得る。
定義
「配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗する」ことができるＢＴＮＬ３アンタゴニストの生物学的活性は、実施例４に記載のＴ細胞増殖アッセイを行い、かつ配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質の活性に影響を及ぼすかを決定するように制御された様式で試料のうちのいくつかにアンタゴニストを添加することによって決定され得る。同様の試験によって、Ｔ細胞によるＴ細胞増殖の阻害を増加させるアゴニスト抗体の活性がアッセイされ得る。
「抗体」は、本明細書で意図される場合、免疫グロブリンの重鎖可変領域および／または免疫グロブリンの軽鎖可変領域を含む。抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、第２の重鎖定常領域（ＣＨ２）、および第３の重鎖定常領域（ＣＨ３）を含む全長の四量体抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ抗体であり得る。あるいは、抗体は、Ｆａｂ断片等の断片、または任意に、ｓｃＦｖ断片等の組換え断片であり得る。ＶＨまたはＶＬ領域のいずれかの単一可変領域を含む単一ドメイン抗体も、本明細書で意図される抗体である。単一ドメイン抗体は、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／００６２７８４号に記載されており、単一ドメイン抗体を記載する部分は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、一価の様々な形態（一本鎖抗体、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ドメイン抗体、および例えば、記述部分が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２００９／０８９００４号および米国特許第５，８３７，８２１号に記載の様々な形式を含む）、ならびに多価分子（Ｆ（ａｂ）２、ならびに例えば、記述部分が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願第ＷＯ２００９／０８９００４号および米国特許第５，８３７８２１号に記載のもの等）が、「抗体」の意味に包含される。
本明細書の複数の箇所において、タンパク質の多量体種が、タンパク質の単量体種の分子量の「少なくとも約」２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍の分子量を有すると述べられている。この意味は明白であるが、この表現は、単量体の約４、５、６倍等の種を含み、そのような種とより大きい種との組み合わせ、またはより大きい種のみだけではない。同様に、複数の箇所において、多量体が、「少なくとも」二量体、三量体、四量体等であることが述べられている。この表現は、二量体、三量体、四量体等の種を含み、述べられた種とより大きい種との組み合わせ、またはより大きい種のみではないことが明確に意図されている。さらに、本明細書の複数の箇所において、多量体種は、タンパク質の単量体種の分子量の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍「を超えない」分子量を有することが述べられている。この意味は明白であるが、この表現は、単量体の約４、５、６倍等の種を含み、そのような種とより小さい種との組み合わせ、またはより小さい種のみではないことが明確に意図されている。同様に、複数の箇所において、多量体が、二量体、三量体、四量体等「超えない」ことが述べられている。この語句は、二量体、三量体、四量体等の種を含み、述べられた種とより小さい種との組み合わせ、またはより小さい種のみだけではないことが明確に意図されている。
「ＢＴＮＬ３タンパク質」には、本明細書で意図される場合、ＢＴＮＬ３遺伝子の天然に存在する対立遺伝子バリアントによってコードされるタンパク質を含む、全長ヒトＢＴＮＬ３タンパク質ならびにその断片および／またはバリアント、ならびに天然に存在するＢＴＮＬ３タンパク質と比較していくつかの配列変化を含み得る組換え的に産生されたＢＴＮＬ３タンパク質、すなわち、非ヒトまたは哺乳類宿主細胞等の宿主細胞で産生されたタンパク質が含まれる。細胞外領域のほとんどまたはすべてを含む全長ヒトＢＴＮＬ３タンパク質の可溶性断片を含み、かつ膜貫通領域を含まないタンパク質が具体的に企図される。そのようなタンパク質は、ビーズまたはマイクロタイタープレート等の表面に結合する。
患者は、患者が同一の一般時間枠中に、任意に全く同時に、２つ以上の分子を受ける場合、例えば治療薬またはワクチン成分であり得る２つ以上の分子で「同時」治療を受ける。例えば、患者に１日１回１つの分子が継続的に投与され、かつ月に１回別の分子も継続的に投与される場合、患者は、これらの２つの分子を同時に受けていることになる。同様に、それぞれ２週間毎に投与されるが、同日には投与されない２つの異なる分子が投与される患者は、これら２つの分子での同時治療を受けていることになる。さらに、１つの分子を継続的に１週間に１回受け、かつ別の分子を３日間のみ１日１回受ける患者は、これら２つの分子で短期間同時治療を受けていることになる。
「ｓｃＦｖ」は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、定常領域を含まない一本鎖抗体である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の可変長のリンカーも含み得る。ｓｃＦｖは他のアミノ酸配列に融合することができるが、ｓｃＦｖと称されるタンパク質の一部は、好ましくは、ＶＨ領域、ＶＬ領域、および任意に、これらの配列を連結するリンカー以外のいかなる相当量のアミノ酸配列も含まない。
「Ｆｃポリペプチド」は、本明細書で意図される場合、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域のすべてもしくは一部を含む抗体重鎖の断片、またはそのような断片のバリアントである。Ｆｃポリペプチドは、ＣＨ１ドメインもＶＨドメインも含まない。例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．１１０－１１，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または他のサブタイプを含む、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＡアイソタイプのものであり得る。Ｆｃポリペプチドは、多量体、ある場合には二量体であり得る。そのような多量体Ｆｃポリペプチドは、本明細書において「Ｆｃ領域」と称される。いくつかのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＭまたはＩｇＡ Ｆｃポリペプチドは、より高次の多量体を形成し得る。多量体Ｆｃ領域内の単一ポリペプチド鎖は、「Ｆｃポリペプチド」と称される。Ｆｃポリペプチドのバリアントは、本明細書で意図される場合、天然に存在するＦｃポリペプチドと比較して、単一アミノ酸の１～３０個（具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以下等を含む）の挿入、欠失、または置換を含み得る。天然に存在するＦｃポリペプチドまたは「天然」Ｆｃポリペプチドは、生存生物、例えば、ヒトまたはマウスＦｃポリペプチドに自然に出現する配列を有する。したがって、「天然ヒト」Ｆｃポリペプチドは、天然に存在するヒトＦｃポリペプチドに見られるアミノ酸配列を有する。機能に影響を及ぼすことなく変形が許容され得る場所に関する指針は、当技術分野において見出され得る。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８０７，７０６号および国際出願第ＷＯ２００９／０８９００４号で特定されるアミノ酸残基の変化は、ホモ二量体形成と比較して、ヘテロ二量体形成を促進するために用いられ得る。同様に、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎの結合を阻止しないＦｃポリペプチドは、本明細書で意図されるＦｃバリアントに生じ得る変化に包含される。ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎへの結合は、約ｐＨ６でＢｉａｃｏｒｅ ３０００等のＢｉａｃｏｒｅ計器を用いて確認され得る。ヒトＦｃＲｎは、標準の化学反応を用いてＣＭ５チップにカップリングされ得る。Ｆｃ含有タンパク質は、移動相の一部であり得、応答は、共鳴装置で測定され得る。Ｆｃポリペプチドの変化は、例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ９７／３４６３１号に記載されている。あるいは、例えば、種内および種間のＩｇＧ配列の比較は、高度に保存されたアミノ酸を配置することができ、それらのアミノ酸の変化が構造および／または機能に影響を及ぼし得ることを当業者に示唆する。ヒンジ配列の多数のアライメント、ＣＨ２およびＣＨ３領域（これらは一緒になってＦｃ領域を形成する）は、例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１で入手可能である。その一方で、様々なＩｇＧによって異なるアミノ酸は、機能に影響を及ぼすことなく変形が許容される可能性のある部位である。同様に、補体固定につながる抗体依存性細胞傷害性および／またはＣ１ｑ結合を含むエフェクター機能の増加または減少等の他の所望の特性を有するＦｃバリアントは、Ｆｃバリアントが意味することに包含される。
「全長抗体」という用語は、ほとんどの天然に存在する抗体、例えば、ＩｇＧ抗体の構造に類似した分子、すなわち、２つの全重鎖および２つの全軽鎖を含む分子を指す。例えば、天然に存在する抗体の構造の考察については、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記参照）、またはＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．１０９－３２，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい。全長抗体の構造を記載する参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。「全長抗体」には、完全な重鎖（多くの場合、異常に長いＣＤＲ３領域を有する）を２つのみ含み、軽鎖を含まない天然に存在するヒトコブラクダ抗体の構造に類似した抗体も含まれる。Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７－３０２、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５－２６２９０。これらのヒトコブラクダ抗体の構造を記載する参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
多量体ＢＴＮＬ３タンパク質等の「多量体」タンパク質は、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質である。「多量体」という用語は、多量体がいくつのポリペプチド鎖を含むかを明示する「二量体」、「三量体」、または「四量体」等の用語を包含する。「ホモ多量体」は、同一のポリペプチド鎖の２つ以上のコピーからなり、任意の異なるポリペプチド鎖を含まない。同様に、「ホモ二量体」は、同一のポリペプチド鎖の２つのコピーからなり、「ホモ三量体」は、同一のポリペプチド鎖の３つのコピーからなる。「ヘテロ多量体」は、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含む。ヘテロ多量体が３つ以上のポリペプチド鎖を有する場合、それらのうちのいくつかは、少なくとも１つがその他と異なる限り、互いに同一であり得る。タンパク質が「少なくとも三量体」であると言われる場合、それが三量体またはより高次の多量体であることを意味する。同様の意味が、「少なくとも四量体」、「少なくとも五量体」等に帰される。同様に、三量体「を超えない」の多量体タンパク質は、三量体または二量体である。
「Ｆａｂ断片」は、ＶＬおよびＣＬ領域を含む軽鎖、ならびにＶＨおよびＣＨ１領域を含む重鎖の部分を含む抗体断片である。Ｆａｂ断片は、ＣＨ２もＣＨ３領域も含まない。Ｆａｂ断片が何であるかの考察については、例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１１０－１１ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ
Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい。異なる種類のＦａｂ断片は、ヒンジ領域を含まないか、ヒンジ領域の一部を含むか、または全ヒンジ領域を含むかのいずれかであり得る。
「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、本明細書で使用する場合、ｓｃＦｖとＦｃポリペプチドとの融合物である組換えタンパク質である。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４９：２４３－２５２、Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５１：１２３－１３５、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７：１－２０を参照されたい。ｓｃＦｖ－Ｆｃは、二量体であり得る。
本明細書で意図される場合、「非還元条件」は、ジスルフィド架橋が破壊されるようにタンパク質内のジスルフィド架橋が還元されない条件である。
「組換え」タンパク質または抗体は、遺伝子操作のプロセスに由来するものである。「遺伝子操作」という用語は、上昇したレベルもしくは低下したレベルで遺伝子を発現するか、または遺伝子の変異体形態を発現する細胞を作成するために用いられる組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ方法を指す。言い換えれば、細胞は、組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクト、形質転換、または形質導入され、それにより細胞に所望のポリペプチドの発現を変化させるように変化している。
可溶性分泌タンパク質および細胞表面上で発現したタンパク質は、多くの場合、真核細胞の小胞体（ＥＲ）と結合した膜を通るタンパク質の挿入を媒介する疎水性配列であるＮ末端「シグナル配列」を含む。Ｉ型膜貫通タンパク質も、シグナル配列を含む。「シグナル配列」は、本明細書で意図される場合、ＥＲ膜を通してＥＲの内腔にタンパク質の一部またはすべてを挿入した後に通常酵素的に除去されるアミノ末端疎水性配列である。したがって、シグナル配列は分泌または膜貫通タンパク質の前駆体形態の一部として存在し得るが、タンパク質の成熟形態では一般に不在であることが当技術分野で既知である。タンパク質がシグナル配列を含むと言われる場合、タンパク質の前駆体形態がシグナル配列を含むが、タンパク質の成熟形態がシグナル配列を含まない可能性が高いことを理解すべきである。シグナル配列は、切断部位に隣接し、かつすぐ上流に残基を含み（１位）、３位に別の残基を含み、これらは、この酵素的切断に重要である。一部がシグナル配列およびそれらの特定方法を記載する、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０（１）：１－６、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７－２１、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８５），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４：９９－１０５は、参照により本明細書に組み込まれる。シグナル配列は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（上記参照）によって説明されるように特定され得る。哺乳類宿主細胞において機能的なシグナルペプチドまたは配列の例として、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）に記載のインターロイキン－２受容体のシグナル配列、欧州特許第０ ３６７ ５６６号に記載のインターロイキン－４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン－１受容体シグナル配列、欧州特許第０ ４６０ ８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド、ヒトＩｇＫのシグナル配列（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ；配列番号３）、およびヒト成長ホルモンのシグナル配列（ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ；配列番号４）が挙げられる。これらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他のシグナル配列が当技術分野で既知である。
「免疫グロブリン様」（Ｉｇ様）ドメインは、本明細書で意図される場合、主にその三次構造によって区別される。例えば、Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９－２０、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｏｄ（１９８９），Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１－６３、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１－４０５を参照されたい。しかしながら、可変および定常免疫グロブリン様ドメインは、それらの一次アミノ酸配列内の保存された位置に出現する、いくつかの高度に保存されたアミノ酸を実際含む。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ＳｅｒｖｉｃｅＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい。可変領域ならびにＣＨ１およびＣＨ２定常領域のそのような保存されたアミノ酸は、例えば、Ｈａｒｐａｚ ａｎｄ Ｃｈｏｔｈｉａ（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５２８－３９、およびＷｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１－４０５に詳細に説明されている。そのような保存された残基を論じるこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。適切な間隔で出現するそのような高度に保存されたアミノ酸またはその保存的バリアントの存在は、ＩｇＣ様またはＩｇＶ様ドメインの存在を示し得る。
２つのアミノ酸または２つの核酸配列のパーセント同一性は、コンピュータプログラムＧＡＰ、すなわち、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラムＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７－９５）を用いて配列情報を比較することによって決定され得る。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメータには、以下のものが含まれる：（１）ヌクレオチドの単項比較マトリックス（同一性には値１、非同一性には値０を含む）のＧＣＧ実装、およびＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）に記載のＧｒｉｂｓｋｏｖ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ（（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５）の加重アミノ酸比較マトリックスまたは他の同等の比較マトリックス、（２）各ギャップにペナルティ８およびアミノ酸配列の各ギャップにおける各シンボルにさらなるペナルティ２、または各ギャップにペナルティ５０およびヌクレオチド配列の各ギャップにおける各シンボルにさらなるペナルティ３、（３）エンドギャップにはペナルティなし、および（４）長いギャップには最大ペナルティなし。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列同一性を決定するための比較に関連して、「アライメントウィンドウ」とは、本明細書に記載のパラメータを用いたコンピュータプログラムＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７－９５）によって別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと部分的または全体的に一致したポリヌクレオチドまたはポリペプチドの一部を意味する。例えば、２０個のアミノ酸のポリペプチドが著しくより長いタンパク質とアライメントされ、第１の１０個のアミノ酸がこの長いタンパク質と正確に一致する一方で、最後の１０個のアミノ酸がこの長いタンパク質と全く一致しない場合、アライメントウィンドウは、１０個のアミノ酸である。その一方で、２０個のアミノ酸のポリペプチドの最初および最後のアミノ酸がこの長いタンパク質と一致し、８個の他の一致がそれらの間に散乱する場合、アライメントウィンドウは、２０アミノ酸長である。しかしながら、本明細書で意図される場合、例えば少なくとも２５個のアミノ酸または７５個のヌクレオチドの同一のアミノ酸もしくは保存的に置換されたアミノ酸または同一のヌクレオチドを有しないいずれかのアライメントされた鎖における長いストレッチは、アライメントウィンドウのエンドポイントを構成する。配列比較のためのアライメントウィンドウは、少なくとも約２５、５０、６０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２２５、３００、４００、４５０、５００、もしくは６００アミノ酸長またはヌクレオチド長であり得る。
２つのポリペプチドまたはヌクレオチド配列は、それらが上述のＧＡＰプログラムを用いて決定されるときに少なくとも９０％同一である場合、「実質的に類似している」と見なされ、類似の生物学的活性を有する。本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質またはそのバリアントの場合、２つの配列が実質的に類似しているかを決定するときに試験される生物学的活性は、固定化抗ＣＤ３抗体によって活性化されたＴ細胞の増殖を阻害するか、またはある特定のアンタゴニストＢＴＮＬ３バリアントタンパク質のそのような阻害を拮抗する能力であり得る。
ＢＴＮＬファミリー
ＢＴＮＬ３は、そのドメイン構造に基づいてタンパク質のブチロフィリン様（ＢＴＮＬ）ファミリーに属している。例えば、Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４：４３－５２およびＡｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０－７５を参照されたい。ＢＴＮＬファミリーにおけるヒトタンパク質には、ＢＴＮＬ２、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、ＥＲＭＡＰ、およびＭＯＧが含まれ、これらのタンパク質のドメイン構造が、図１で図式的に示される。図１から明らかであるように、ＢＴＮＬ２は、その細胞外領域に４つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン（２つのＩｇＶ様および２つのＩｇＣ様ドメイン）を有する唯一のファミリーメンバーである。ＭＯＧおよびＥＲＭＡＰはそれぞれ、Ｉｇ様ドメインを１つのみ有する。ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、およびＢＴＮＬ９は、明らかにＩｇＶ様またはＩｇ様ドメインおよびＩｇ様ドメインに類似した多くの特性を有する別のドメインである細胞外ドメインも１つ有するが、これらのドメインは、実際には、Ｉｇ様に分類されない。すべてのＢＴＮＬファミリーメンバーは、膜貫通ドメインを有する。ＢＴＮＬ２およびＭＯＧが短い細胞内領域を有する一方で、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、ＢＴＮＬ９、およびＥＲＭＡＰは、Ｂ３０．２ドメインを含むより長い細胞内領域を有する。細胞内Ｂ３０．２の機能は知られていないが、いくつかのタンパク質のＢ３０．２ドメインにおける変異は、ある特定の疾患と関連づけられている。Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５：１６９６－１７０５を参照されたく、この関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、いくつかのＢ３０．２ドメインの結合パートナー、具体的には、ＢＴＮ１Ａ１ Ｂ３０．２ドメインに結合するキサンチンオキシドレダクターゼ（ＸＯＲ）が特定されている。例えば、Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：２２４４４－２２４５６を参照されたい。Ｊｅｏｎｇらが仮説するように、ＸＯＲとＢＴＮ１Ａ１との相互作用は、ＢＴＮ１Ａ１の受容体または細菌表面との会合後に抗菌特性を有する反応性酸素および窒素種を生成することによって先天性免疫系において役割を果たし得る（同文献の１１ページ）。反応性酸素および窒素種は、下流標的にも作用して遺伝子発現を制御し得る（同文献）。加えて、ＢＴＮ３Ａ１のＢ３０．２ドメインは、ＢＴＮ３Ａ１の細胞外ドメインの三次構造へのその影響によってγδＴ細胞活性化において役割を果たすと仮説されている。Ｐａｌａｋｏｄｅｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：３２７８０－３２７９０。加えて、アゴニスト抗ＢＴＮ３抗体は、ＢＴＮ３Ａのリン酸化と相関した作用であるＢＮＴ３を発現するリンパ球による増殖およびサイトカイン産生を減少させた。これらの結果は、観察されたリンパ球への作用が細胞内シグナル伝達に起因しており、これにはＢ３０．２ドメインが関与し得ることを示唆した。Ｙａｍａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．８８：７５７－７６７。
ヒトＢＴＮＬ３によってＢＴＮＬファミリーの他のヒトメンバーと共有される配列同一性の程度が以下に示される。
Figure 2022040181000003
図１に示されるように、ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、およびＢＴＮＬ９は、類似したドメイン構造を有する。ＢＴＮＬ３のアミノ酸配列は、他のＢＴＮＬタンパク質のアミノ酸配列よりもＢＴＮＬ８のアミノ酸配列にはるかに類似している。
配列同一性のレベルを超えて、ＢＴＮＬタンパク質ファミリー内のある特定の部位は、以下の表２に示されるように高度に保存され、これは、６個すべてのヒトＢＴＮＬ様タンパク質のアライメントである。アライメントの真下に、コンセンサス配列（「ＡＬＬ」とラベル付けされたもの）がある。コンセンサスアミノ酸（複数可）が、アミノ酸が出現するアライメントの一部にアミノ酸配列が及ぶすべてのタンパク質に出現する場合、太字で示される。コンセンサスアミノ酸（複数可）が、配列がアライメントのその一部に及ぶタンパク質のうちの１つを除くすべてに出現する場合、通常のフォントで現れる。ある部位があらゆる場合において２つ以上のアミノ酸（それぞれ、他方の保存的変異である）のうちの１つを有する場合、これらのアミノ酸は、太字フォントでその位置の下に列記される。ある部位がアライメントのその一部に及ぶ配列のうちの１つを除くすべてに２つ以上のアミノ酸（それぞれ、他方の保存的変異である）のうちの１つを有する場合、これらのアミノ酸は、通常のフォントでその位置の下に列記される。表２のアライメント上の番号付けは、配列番号２の番号付けであり、これは、配列番号２の１７位で終わるシグナル配列を含むヒトＢＴＮＬ３の全長アミノ酸配列である。
Figure 2022040181000004
Figure 2022040181000005
Figure 2022040181000006
当業者であれば、これらのタンパク質間のコンセンサス配列が、これらのタンパク質の構造または機能に重要であり得る特徴を反映することを理解する。それらの様々な発現パターンを考慮すると、これらのタンパク質が同一の機能を有しない可能性が高く、したがって、各タンパク質の機能に重要なすべてのアミノ酸がこのファミリー内に保存される可能性は低い。しかしながら、これらの保存アミノ酸の多くは、言うまでもなく機能に必要な適切な構造の維持に重要である。多くの部位で、互いに保存的変異である２つ以上のアミノ酸のうちの１つは、ＢＴＮＬファミリーのすべてまたはほとんどのメンバーに出現する。当業者であれば、ＢＴＮＬ３におけるそのような保存的変異が機能に悪影響を及す可能性が低いことを理解する。例えば、配列番号２の３６位（上の表２のアライメントと同一の番号付けを有する）で、ＢＴＮＬファミリーの様々なメンバーは、３つの異なる疎水性アミノ酸、アラニン（ＢＴＮＬ３、ＢＴＮＬ８、およびＥＲＭＡＰ）、イソロイシン（ＢＴＮＬ２）、またはバリン（ＢＴＮＬ３およびＭＯＧ）のうちの１つを有する。当業者であれば、ＢＴＮＬ３アミノ酸配列のこの位置でのバリンからアラニンまたはイソロイシンへの変化が機能に影響を及ぼす可能性が低いことを理解する。保存的変異がこのファミリー内に出現する部位のすべてに同様の考察が適用される。したがって、ＢＴＮＬ３タンパク質は、本明細書で意図される場合、配列番号２を含むタンパク質またはその断片を含み、この配列は、保存的変異がＢＴＮＬファミリーのメンバー間に出現する部位で保存的変異によって変化し得、このタンパク質は、以下の実施例に記載の方法によって測定されるときにＴ細胞の増殖を阻害することができる。そのような部位には、例えば、配列番号２の３、１６、２０、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４２、４８、５３、５５、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７２、７９、８１、８２、８７、８８、８９、９１、９７、９８、１００、１０１、１０４、１１２、１１６、１２８、１６５、１８９、１９１、１９５、１９７、２０１、２０４、２２３、２５５、２５８、２７２、２７６、２７７、２８３、２８４、２８７、２９０、２９１、３０３、３０８、３１１、３１６、３１８、３２３、３２６、３２８、３２９、３３１、３３２、３４０、３４９、３５０、３５２、３５５、３５７、３６０、３６９、３７１、３７５、３８６、３９１、３９４、３９８、４０１、４０６、４０７、４０９、４１８、４２１、４２６、４３０、４３６、および４４４位が含まれる。さらに、機能に影響を及ぼすことなくＢＴＮＬ３内の他の部位での変異も許容され得る。例えば、保存されていない位置での保存的置換は、機能に影響を及ぼす可能性が低い。
したがって、ＢＴＮＬ３タンパク質には、本明細書で意図される場合、（１）天然に存在する多型または組換え的に導入されたアミノ酸変化を有し、（２）配列番号２および／または配列番号２のアミノ酸１８～２３６および／または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつ（３）本明細書に記載の方法によって測定されるときにＴ細胞増殖を低減させるか、または天然ＢＴＮＬ３の阻害剤として作用する能力を保持するタンパク質が含まれる。いくつかのそのような多型は、Ｔ細胞増殖を阻害するＢＴＮＬ３タンパク質の能力を強化し得、かつ／または商業生産プロセスにおけるＢＴＮＬ３タンパク質の産生をより容易にし得る。他のそのような多型は、天然ＢＴＮＬ３の阻害剤を産生し得る。これらの多型は、例えば、２２、２５、２６、２７、２９、３７、３９、４１、４３、４５、４６、４７位、および表２で保存されていないと示される任意の他の部位等の保存されていないＢＴＮＬ３内の部位に出現し得る。
ＢＴＮＬタンパク質の発現パターンおよび生物学的機能は、一部の事例である程度調査されているが、別の事例では調査されていない。ＥＲＭＡＰは、赤血球の表面上で発現し、特定の生物学的機能を割り当てられていない。ＭＯＧは、髄鞘の成分である。ＥＲＭＡＰとＭＯＧは、いずれも免疫系において役割を果たすと考えられていないが、ＭＯＧに対する抗体が、多くの場合、多発性硬化症を有する患者から検出される。ＢＴＮ１は、ＭＯＧと相同であり、ＢＴＮ１は、牛乳に含まれている。ヒトによる牛乳の消費がヒトＭＯＧと交差反応するＢＴＮ１に対する抗体の発生につながり、それ故に多発性硬化症等の自己免疫疾患につながり得るという仮説が立てられている。Ｇｕｇｇｅｎｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６１－６８を参照されたい。ＢＴＮＬ２は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌を阻害するが、Ｂ細胞増殖を阻害しないことが示されている。したがって、ＢＴＮＬ２は、Ｔ細胞媒介事象の負の共制御因子として作用すると考えられている。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２４４，８２２号を参照されたい。ＢＴＮＬ２の多型は、明らかにサルコイドーシスに関連づけられており、ＢＴＮＬ２がこの疾患の開始もしくは媒介またはこの疾患への寄与もしくは応答のいずれかにおいて役割を果たし得ることを示唆する。Ｖａｌｅｎｔｏｎｙｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７（４）：３５７－６４。様々なＢＴＮＬ２多型と、潰瘍性大腸炎、リウマチ性関節炎、突発性封入体筋炎、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、類結核癩、および抗原特異的ＩｇＥ応答性との間により仮説的な関連が導き出されている。Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０－７５。
様々な細胞型および組織における様々なＢＴＮＬタンパク質をコードするＲＮＡのレベルが報告されている。ＢＴＮＬ３は、回腸、小腸、結腸、肝臓、肺、骨髄、および脾臓で発現する。Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０－３７５。ＢＴＮＬ３発現について試験された免疫機能に関連した様々な細胞型のうち、ＢＴＮＬ３ ＲＮＡは、主に好中球で発現する。Ａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４６：３７０－７５。免疫機能に関与する細胞におけるＢＴＮＬ３ ＲＮＡの発現は、ＢＴＮＬ３が、炎症応答の駆動または発赤後の応答の緩和のいずれかによって免疫機能において役割を果たし得ることを示唆する。
ＢＴＮＬ３タンパク質
本発明は、ナノ粒子、ビーズ、またはマイクロタイタープレート等の表面への結合によって任意に固定化され得るＢＴＮＬ３の可溶性分泌バージョン、ならびに細胞表面上で発現することができる膜貫通ドメインを含むバージョンを包含する。そのようなＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。いくつかのバリアントＢＴＮＬ３タンパク質もこの活性を有するが、この阻害を拮抗するバリアントも企図される。そのようなタンパク質は、単離することができ、すなわち、ＢＴＮＬ３タンパク質が調製物に存在するタンパク質の少なくとも８０％または少なくとも９０％を構成する精製タンパク質調製物の一部となることができる。本発明は、以下に記載のＢＴＮＬ３核酸によってコードされるＢＴＮＬ３タンパク質をさらに含む。ＢＴＮＬ３タンパク質は、本明細書で意図される場合、上および下で論じられる融合タンパク質および多量体を含む、配列番号２、６、７、または９のアミノ酸配列、ならびにその断片、誘導体、およびバリアントを含むタンパク質を包含する。配列番号２、６、および９のアミノ酸配列は、１位で始まり、約１５位～約２０位、任意に、１７位で終わるシグナル配列を含む。したがって、成熟ＢＴＮＬ３のアミノ酸配列は、配列番号２、６、または９の約１６位～約２１位で始まる。任意に、ＢＴＮＬ３の成熟アミノ酸配列は、配列番号２、６、または９の１８位で始まる。
ＢＴＮＬ３のシグナル配列の後に、配列番号２、６、または９の約２５位から約１３１位まで伸びるＩｇ様ドメインが続く。その後の領域である配列番号２または６の約１３２位～約２３６位は、ＢＴＮＬ２のＩｇＣ様ドメインとアライメントするが、一般にＩｇＣｌ様ドメインに見られる特徴的な配列特性のうちのいくつかを欠く。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１－４０５、Ｐｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３６）：２１１８１－２１１８７を参照されたい。このドメインは、配列番号９のアミノ酸配列で実質的に短縮され、これは、ＢＴＮＬ３のスプライスバリアントによってコードされるアミノ酸配列である。ＢＴＮＬ３の膜貫通ドメインは、配列番号２の約２３７位または配列番号９の約１６７位で始まり、配列番号２の約２５９位または配列番号９の約１８９位で終わる。ＢＴＮＬ３の細胞内部分は、配列番号２の約２６０位で始まり、４６６位で終わるか、または配列番号９の約１９０位で始まり、４３２位で終わる。この細胞内領域は、配列番号２の約２８８位から約４４５位または配列番号９の約２５４位から４１１位まで伸びるＢ３０．２ドメインを含む。Ｂ３０．２ドメインは、約１７０個のアミノ酸の球状ドメインである。Ｈｅｎｒｙら（上記参照）は、Ｂ３０．２ドメインについてある程度詳細に論じており、いくつかのＢ３０．２ドメインのアライメントおよびこのアライメントに由来するコンセンサス配列を提供している。Ｂ３０．２ドメインが何であるかを（配列比較によって）示し、かつ説明する、Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５（１２）：１６９６－１７０５の一部は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｂ３０．２ドメインは、ＢＴＮＬ９、ＢＴＮＬ８、およびＥＲＭＡＰでも見られ、これらはすべて、本明細書に記載のタンパク質のブチロフィリン様ファミリーのメンバーである。上の表２の約２８８位～４４５位のＢＴＮＬタンパク質のアライメントは、高度の相同性を呈し、Ｈｅｎｒｙら（上記参照）によってアライメントされたより異種の集団のＢ３０．２ドメインを含むタンパク質間で観察される相同性よりも確実に高い。
同様に、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質は、１位で始まり、約１５位～約２０位、任意に１７位で終わるシグナル配列を含む。したがって、成熟タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２の約１６位～約２１位で始まる。任意に、成熟アミノ酸配列は、配列番号９の１８位で始まる。この後に、配列番号９の約２５から１３１まで伸びるＩｇＶ様ドメインが続く。配列番号２に存在するその後のドメインの大半は、配列番号９で欠損している。膜貫通ドメインは、配列番号９の約１６７位で始まり、配列番号９の約１８９位まで伸びる。膜貫通ドメインを超えて約１０個のアミノ酸で始まる配列番号９は、配列番号２には見られない一続きの３６個のアミノ酸を含む。Ｂ３０．２ドメインは、配列番号９の約２５４位で始まり、配列番号９の約４１１位で終わる。
ＢＴＮＬ３タンパク質は、本明細書で意図される場合、少なくとも２つのＢＴＮＬ３タンパク質を含むヘテロ多量体およびホモ多量体を含む。いくつかの実施形態において、生物学的に活性な多量体は、ホモ多量体であり得る。そのようなホモ多量体の大きさは、非還元条件下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって決定され得る。そのような多量体に含まれる単量体ＢＴＮＬ３タンパク質の大きさは、還元条件下における多量体のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定され得る。そのような条件は、ジスルフィド架橋を破壊し、かつ水素結合または電荷相互作用等の非共有結合相互作用を妨害すると予想される。したがって、ジスルフィド結合または非共有結合相互作用によって一緒に結合される多量体は、還元条件下で単量体まで低減すると予想される。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なＢＴＮＬ３ホモ多量体の大きさは、単量体ＢＴＮＬ３タンパク質の大きさの少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍であり得る。いくつかの実施形態において、そのようなホモ多量体の大きさは、単量体ＢＴＮＬ３タンパク質の大きさの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６倍を超えないものであり得る。
ＢＴＮＬ３タンパク質は、本明細書において意図される場合、全長ＢＴＮＬ３ ｍＲＮＡのスプライスバリアントによってコードされるタンパク質も含む。ＢＴＮＬ３のｃＤＮＡコーディング配列は、配列番号１の１位から１４０１位まで伸び、最後の３つのヌクレオチドは、終止コドンである。このコーディング配列は、第１のエクソン内で始まる。最も一般的なスプライスバリアントは、８個のエクソン、すなわち配列番号２のアミノ酸１～１６をコードするエクソン１、配列番号２のアミノ酸１７～１３２をコードするエクソン２、配列番号２のアミノ酸１３３～２２４をコードするエクソン３、配列番号２のアミノ酸２２５～２６２をコードするエクソン４、配列番号２のアミノ酸２６３～２６９をコードするエクソン５、配列番号２のアミノ酸２７０～２７８をコードするエクソン６、配列番号２のアミノ酸２７９～２８７をコードするエクソン７、およびアミノ酸２８８～４６６をコードするエクソン８を含む。しかしながら、代替のスプライシングは、異なるエクソンを含む異なるメッセージを生成することができる。これらのうちの１つは、Ｓｈｉｂｕｉおよび同僚によってクローニングされた。Ｓｈｉｂｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４４：２４９－２５２。Ｓｈｉｂｕｉらが報告したクローンＣｏｌＦ４１００からのアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢ０２０６２５のこのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列も参照により本明細書に組み込まれる。このスプライスバリアントによってコードされるタンパク質は、第３および第４のエクソンによってコードされる配列番号２の一部を欠く。したがって、コードされたタンパク質は、成熟ＢＴＮＬ３タンパク質の第２のＩｇ様ドメインの大半を欠損している。配列番号２と配列番号９を比較されたい。さらに、配列番号９の細胞内領域は、配列番号２には見られない配列（配列番号９の残基２００～２３５）を含む。このスプライスバリアントにおける余分なアミノ酸の挿入および欠失は両方ともに、非標準スプライス部位の使用の結果である。配列番号２と同様に、配列番号９は、配列番号９の残基１６～２１、任意に残基１７で終わるシグナル配列を含む。
他のスプライスバリアントが形成され得る。例えば、２つの細胞外ドメインのいずれかをコードするエクソンのうちの１つであるエクソン２またはエクソン３のいずれかを欠損するスプライスバリアントが企図される。同様に、エクソン５、６、７、または８のうちのいずれかを欠損するスプライスバリアントも企図される。ＢＴＮＬ３タンパク質は、本明細書で意図される場合、様々なエクソンを欠損しているスプライスバリアントによってコードされ得る。加えて、スプライスバリアントは、隠れたスプライス部位を用いる。
いくつかの実施形態において、ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２もしくは配列番号９を含む全長膜貫通タンパク質の可溶性断片またはそのバリアントであり得る。いくつかの実施形態において、ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２または配列番号９の残基１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０から、配列番号２または配列番号９の残基１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、もしくは１４０まで伸びる免疫グロブリン様ドメインを含むＢＴＮＬ３の断片を含む。そのような実施形態は、配列番号２の残基１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または１４０から、配列番号２の残基２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、または２３８まで伸びるその後のドメインをすべて含み得るか、または含み得ない。例えば、配列番号９は、配列番号２の１５８位～２２７位に存在するアミノ酸を欠く。このドメイン他の部分を欠くバリアントも企図される。さらなる実施形態において、ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２の残基１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または１４０から、配列番号２の残基２２０、２２１、２２２、２２３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、または２３８まで伸びる断片を含み得る。そのような実施形態は、配列番号２の残基１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０から伸びる残基から、配列番号２の残基１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または１４０まで伸びるその前のドメインを含み得るか、または含み得ない。ＢＴＮＬ３タンパク質は、ＢＴＮＬ３の細胞外領域のほとんどまたはすべてを含む断片を含み得る。そのようなタンパク質は、配列番号２の残基１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０から、配列番号２の残基２２０、２２１、２２２、２２３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、または２３８まで、任意に、配列番号２の約残基１８から約残基２３６まで伸びるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号９の残基１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０から、配列番号９の残基１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０まで伸びる細胞外領域のほとんどまたはすべてを含む断片を含み得る。これらの断片はすべて、以下で論じられるように、配列番号２または配列番号９と比較して、変異を含み得、配列番号２または配列番号９と比較して、単一アミノ酸の規定数の置換、挿入、または欠失を含み得る。これらの実施形態は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。配列番号２のアミノ酸１８～２３６も配列番号９のアミノ酸１８～１６６のアミノ酸配列も含まないいくつかのＢＴＮＬ３タンパク質バリアントは、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができる。
本発明は、本明細書において免疫原性断片と称される抗体の生成に有用なＢＴＮＬ３タンパク質のエピトープを包含する。免疫原性断片は、好ましくは、少なくとも１０アミノ酸長であり、配列番号２または配列番号９の連続アミノ酸を含み得る。そのようなエピトープは、特異的スプライスバリアントによってコードされるタンパク質への特異的結合の利点を有し得るスプライス接合によってコードされるＢＴＮＬ３タンパク質の領域に及び得る。いくつかの実施形態において、エピトープは、ＢＴＮＬ３の細胞外領域内に位置し、これは、配列番号２の約アミノ酸１８位から約２３６位まで、または配列番号９の約残基１８から約残基１６６まで伸びる。エピトープは、第１の免疫グロブリン可変領域様ドメイン内に部分的にまたは完全に存在し得、これは、配列番号２または配列番号９の約アミノ酸２５位から１３１位まで伸びる。あるいは、エピトープは、その後のドメイン内に部分的にまたは完全に存在し得、これは、配列番号２の約アミノ酸１３２位から２３６位まで伸びる。配列番号９において、実質的に短縮されるこのドメインは、配列番号９の約１３２位から１６６位まで伸びる。この短縮されたドメインは、抗体が結合するエピトープの一部またはすべても含み得る。
ＢＴＮＬ３タンパク質は、本明細書で意図される場合、配列番号２もしくは配列番号９、または上述の配列番号２もしくは配列番号９の断片もしくは一部のうちの１つと比較して、単一アミノ酸の１個以上の挿入、欠失、または置換を含み得る。いくつかの実施形態において、ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２もしくは配列番号９と比較して、または上述の配列番号２もしくは配列番号９の断片のうちの１つと比較して、単一アミノ酸の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個を超えない置換、挿入、または欠失を含む。本発明の範囲内のそのようなＢＴＮＬ３タンパク質バリアントは、Ｔ細胞増殖を低減させる能力を保持し得るか、または本明細書に記載の方法によってアッセイされるときに変化していないＢＴＮＬ３タンパク質によるこのＴ細胞増殖の低減の阻害剤もしくはアンタゴニストとして作用し得る。
いくつかの実施形態において、置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。生物学的活性に影響を及ぼす可能性の低い保存的アミノ酸置換の例として、アラニンのセリンへの置換、バリンのイソロイシンへの置換、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩への置換、トレオニンのセリンへの置換、アラニンのグリシンへの置換、アラニンのトレオニンへの置換、セリンのアスパラギンへの置換、アラニンのバリンへの置換、セリンのグリシンへの置換、チロシンのフェニルアラニンへの置換、アラニンのプロリンへの置換、リジンのアルギニンへの置換、アスパラギン酸塩のアスパラギンへの置換、ロイシンのイソロイシンへの置換、ロイシンのバリンへの置換、アラニンのグルタミン酸塩への置換、アスパラギン酸塩のグリシンへの置換、およびこれらの逆の変化が挙げられる。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）を参照されたい。さらに、ある群内の１つのアミノ酸の同一の群内の別のアミノ酸との交換は、保存的置換であり、これらの群は、（１）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ノルロイシン、およびフェニルアラニン、（２）ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミン、およびアスパラギン、（３）アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、（４）セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびシステイン、ならびに（５）グリシン、プロリン、およびアラニンである。上で論じられるように、ＢＴＮＬファミリーメンバーがアライメントされる（表２）ときに保存的置換が存在する部位は、保存的置換が機能に影響を及ぼす可能性が特に低い部位である。同様に、高度に保存された残基、例えば、とりわけ、配列番号２の残基２、４０、５７、および６５は、置換に対する耐性が低い可能性が高い。
ＢＴＮＬ３タンパク質またはそのバリアントは、配列番号２または配列番号９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得、アライメントウィンドウは、少なくとも５０、６０、７５、８０、９０、または１００アミノ酸長であり、ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができる。上で論じられるように、他のヒトＢＴＮＬファミリーメンバーとの配列ミスマッチは、当業者にとって、機能に影響を及ぼすことなく配列番号２または配列番号９の配列のどこで修飾を行うことができるかの指針となり得る。いくつかの実施形態において、挿入、欠失、または置換は、ヒトＢＴＮＬファミリーメンバー間で保存されていない残基で、またはそれに隣接して出現し得る。表２を参照されたい。いくつかの実施形態において、これらの変化は、配列番号２の保存されていない残基：２２、２５～２７、２９、３７、３９、４１、４３、４５～４７、４９、５０、５６、５８～６２、７１、７３～７６、８０、８６、９３、９４、９６、１０２、１０３、１０５～１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７～１２３、１２６、１２７、１３０、１３２～１３７、１３９～１５８、１６０～１６２、１６４、１６６～１８７、１９０、１９２～１９４、１９６、１９８～２００、２０２～２０３、２０５～２１７、２１９～２２２、および／または２２４～２３６のうちの１つ以上の残基で（欠失または置換の場合）、またはその残基に隣接して（挿入の場合）出現する。配列番号９における類似の部位（そのような類似の部位が存在する場合）での変化も企図される。あるいは、ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２または配列番号９と比較して、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、または３０個を超えないアミノ酸置換、欠失、または挿入を含み得る。上述のタンパク質は、本明細書で意図される場合、固定化抗ＣＤ３抗体によって活性化されたＴ細胞の増殖を阻害するか、または配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質によるそのような阻害を拮抗することができる限り、ＢＴＮＬ３タンパク質またはそのバリアントである。
ＢＴＮＬ３タンパク質は、様々な程度にグリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。例として、ＢＴＮＬ３タンパク質は、配列番号２または配列番号９を含むタンパク質にすでに見られるものに加えて、１つ以上のＮまたはＯ結合グリコシル化部位を含み得る。配列番号２は、１０３位および３６８位に２つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を含む。配列番号９は、１０３位および３３４位に潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を含む。配列番号２または９の１０３位の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位は、ＢＴＮＬ３に最も密接に関連するＢＴＮＬタンパク質であるＢＴＮＬ８にも存在する。したがって、このグリコシル化部位は、ＢＴＮＬ３の機能または構造において役割を果たしている可能性がある。当業者であれば、配列Ａｓｎ Ｘｘｘ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘｘｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）の一部であるアスパラギン残基が、Ｎ－グリカンへの付加の部位としての機能を果たし得ることを認識する。加えて、Ｏ結合グリコシル化部位としての機能を果たし得る多くのセリンおよびトレオニン残基が存在する。グリコシル化は、インビボ半減期を増加させ得るか、または生物学的活性を変化させ得る。ＢＴＮＬ３タンパク質のバリアントは、結果として生じるタンパク質がＴ細胞の増殖を阻害することができる限り、配列番号２に存在するＮおよび／またはＯ結合グリコシル化部位よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個多くのＮおよび／またはＯ結合グリコシル化部位を含むタンパク質も含む。ＢＴＮＬ３タンパク質のバリアントは、固定化抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害するか、または変異していないバージョンのＢＴＮＬ３タンパク質がそうする能力を阻害することができる限り、配列番号２に存在するＮおよび／またはＯ結合グリコシル化部位よりも１、２、３、４、または５個少ないＮおよび／またはＯ結合グリコシル化部位を有するタンパク質も含む。
ＢＴＮＬ３タンパク質は、本明細書で意図される場合、（上述の）配列番号２または配列番号９のバリアントおよび／または断片であるアミノ酸配列を含み得る少なくとも１つのＢＴＮＬ３ポリペプチド、ならびに少なくとも１つの他の部分を含む融合タンパク質であり得る。他方の部分は、ＢＴＮＬ３タンパク質以外のポリペプチドであり得る。他方の部分は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、または細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、および／もしくは放射性部分等の非タンパク質部分であり得る。
ＰＥＧの結合は、少なくともいくつかのタンパク質のインビボ半減期を増加させることが示されている。さらに、細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、および／もしくは放射性部分が、診断または治療目的で、例えば、抗体が結合し得る細胞を配置するか、その増殖を阻害するか、またはそれを死滅させるために抗体に融合させられている。同様に、そのような部分に融合するＢＴＮＬ３タンパク質を用いて、ＢＴＮＬ３が結合し得る細胞、例えば、免疫応答に関与する細胞を見つけるか、その増殖を阻害するか、またはそれを死滅させることができる。そのような細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、および／もしくは放射性部分には、例えば、メイタンシン誘導体（ＤＭ１等）、エンテロトキシン（ブドウ球菌エンテロトキシン等）、ヨウ素同位体（ヨウ素１２５等）、テクネチウム同位体（Ｔｃ－９９ｍ等）、シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８等）、リボソーム不活性化タンパク質（ボウガニン、ゲロニン、またはサポリン－Ｓ６等）、およびカリケアマイシン、商標ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ）名で販売される製品の一部である細胞傷害性物質がある。
ＢＴＮＬ３以外の様々なポリペプチドを、様々な目的で、例えば、タンパク質のインビボ半減期を増加させるため、タンパク質の特定、単離、および／または精製を促進するため、タンパク質の活性を増加させるため、かつタンパク質のオリゴマー化を助長するためにＢＴＮＬ３ポリペプチドに融合させることができる。
多くのポリペプチドは、それらが一部である組換え融合タンパク質の特定および／または精製を促進することができる。例として、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、または固定化金属イオンに対して高い親和性を有する非隣接ヒスチジン残基の天然に存在する配列であるＨＡＴ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。これらのポリペプチドを含むＢＴＮＬ３タンパク質は、例えば、固定化ニッケルまたは固定化コバルトイオンを含むＴＡＬＯＮ（商標）樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。例えば、Ｋｎｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７（２６）：１５３５８－１５３６６を参照されたい。ポリアルギニンを含むポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーによる効果的な精製を可能にする。他の有用なポリペプチドは、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４に記載の抗原性特定ペプチドを含む。そのようなペプチドの１つに、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドがあり、高度に抗原性であり、かつ特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合されたエピトープを提供し、発現した組換え融合タンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と指定されるマウスハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載のある特定の二価金属カチオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、受入番号ＨＢ９２５９でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を親和性試薬として用いて、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを含むポリペプチド精製試薬を回収することができる。他の好適なタンパク質タグおよび親和性試薬は、１）固定化グルタチオンに対するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ融合タンパク質の親和性を利用するＧＳＴ－Ｂｉｎｄ（商標）系（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載のもの、２）モノクローナル抗体に対するＴ７遺伝子１０タンパク質のアミノ末端１１アミノ酸の親和性を利用するＴ７－ＴＡＧ（登録商標）親和性精製キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載のもの、または３）タンパク質タグに対するストレプトアビジンの操作された形態の親和性を利用するＳＴＲＥＰ－ＴＡＧ（登録商標）システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載のものである。上述のタンパク質タグ、ならびに他のタンパク質タグのうちのいくつかは、Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ（１９９０），ＴＩＢＴＥＣＨ ８：８８－９３，Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｐ．２３９－２６６，Ｓｅｅｔｈａｒａｍ ａｎｄ Ｓｈａｒｍａ（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９１）、およびＢｒｅｗｅｒ ａｎｄ Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ，ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．９１－１１１，Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（ｅｄｓ．），Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）に記載されている。タンパク質タグを記載するこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、例えば、ＦＬＡＧタグとポリヒスチジンタグの融合物等の上述のタグのうちの２つ以上の融合物は、本発明のＢＴＮＬ３タンパク質に融合することができる。
ＢＴＮＬ３以外のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、例えば、二量体、三量体、もしくはより高次の多量体を形成する傾向、増加したインビボ半減期、および／または増加した生物学的活性等の他の種類の特有の利点を有し得る。「より高次の多量体」は、例えば「二量体」とともに用いられるとき、２つを超えるポリペプチド鎖を含む多量体を意味する。「三量体またはより高次の多量体」等の表現で用いられる場合、より高次の多量体は、３つを超えるポリペプチド鎖を含む。したがって、より高次の多量体は、比較される多量体よりも多くのポリペプチド鎖を有する多量体である。融合タンパク質を調製するための技法が知られており、例えば、国際出願第ＷＯ９９／３１２４１号およびＣｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（２００１）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：１２３－１３３）に記載されている。
例として、抗体、任意にＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含むポリペプチド、または実質的に類似したタンパク質は、ＢＴＮＬ３ポリペプチドまたはその断片に融合することができる。抗体のＦｃ領域は、ヒンジおよびＣＨ２、ならびに抗体からのＣＨ３ドメインまたはこれらと実質的に類似した免疫グロブリンドメインの大部分またはすべてを含むポリペプチドである。考察については、Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２１２－２１３（１９８９）を参照されたい。Ｆｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ等のヒトＩｇＧ Ｆｃであり得る。Ｆｃ断片は、天然ヒトまたは動物Ｆｃ断片であり得る。Ｆｃ領域の切断された形態、すなわち、二量体化を助長するヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインのある部分を欠損する形態も用いられ得る。抗体および他の免疫グロブリンアイソタイプの他の部分も用いられ得る。抗体のＦｃ領域を含む組換え融合タンパク質は、二量体またはより高次の多量体を形成する可能性が高い。抗体由来タンパク質の様々な部分を含む融合タンパク質は、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．（（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５－３９）、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７－７０）、Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐｐ．１０．１９．１－１０．１９．１１（１９９２））、Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．（（１９９４），ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２－４００１）、ならびに米国特許第５，４５７，０３５号および国際出願第ＷＯ９３／１０１５１号に記載されている。いくつかの実施形態において、変化したＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域よりも低いＦｃ受容体に対する親和性を有する利点を有し得る。これは、免疫エフェクター細胞によってそのような組換え融合タンパク質が結合する細胞の溶解を緩和させ得るため、利点であり得る。Ｆｃ領域に対するそのような変化は、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４５７，０３５号および国際特許出願第ＷＯ９３／１０１５１号に記載されている。以下の実施例２は、ヒトＢＴＮＬ３の細胞外領域およびヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含む融合タンパク質の産生を説明する。
あるいは、ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、本明細書に記載のＢＴＮＬ３ポリペプチドおよび融合タンパク質（例えば、血清アルブミンタンパク質、任意に、ヒトタンパク質、もしくはその断片、または血清アルブミンに結合するタンパク質、もしくはその断片等）の半減期を増加させる効果を有する非Ｆｃポリペプチドのすべてまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態において、このさらなるポリペプチドは、任意にヒトタンパク質であるフィブロネクチンタンパク質のすべてまたは一部であり得る。
ＢＴＮＬ３タンパク質を含む組換え融合タンパク質は、ロイシンジッパーを含むポリペプチドを含み得る。既知のロイシンジッパー配列には、二量体化を助長する配列および三量体化を助長する配列がある。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９－６４を参照されたい。ロイシンジッパーは、多くの場合、他のアミノ酸が散在した４個または５個のロイシン残基を有する反復的な７アミノ酸繰り返しを含む。ロイシンジッパーの使用および調製は、当技術分野で周知である。ＢＴＮＬ３融合タンパク質は、１つ以上のペプチドリンカーを含み得る。概して、ペプチドリンカーは、複数のポリペプチドと結合して多量体を形成し、かつタンパク質の結合部分の所望の機能に必要とされる可撓性または剛性を提供する機能を果たす一続きのアミノ酸である。典型的には、ペプチドリンカーは、約１～３０アミノ酸長である。ペプチドリンカーの例として、－－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－－、ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号ＮＯ：１１）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号ＮＯ：１２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号ＮＯ：１３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号ＮＯ：１４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号ＮＯ：１５）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１７）、およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）が挙げられるが、これらに限定されない。結合部分は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９－８３（１９８８）、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９８９－９５（１９９３）、Ｎｅｗｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：５４５－５３（１９９６）、ならびに米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号に記載されている。これらの参考文献の関連部分、すなわち、リンカーを説明する部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
あるいは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質による固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖の阻害を拮抗することができるＢＴＮＬ３バリアントタンパク質が本明細書に記載される。そのようなＢＴＮＬ３バリアントは、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９の１８～１６６と少なくとも約９０％、９５％、または９８％同一のアミノ酸配列を含み得、かつ／あるいは配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と比較して、単一アミノ酸の２０、１５、１０、８または５個を超えない挿入、欠失、または置換を含むアミノ酸配列を含み得る。そのようなバリアントは、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６と同一のアミノ酸配列を含まない。
組換えＢＴＮＬ３融合タンパク質は、その通常のシグナル配列を欠くが、代わりにそれを置換する異なるシグナル配列を有するＢＴＮＬ３タンパク質を含み得る。シグナル配列の選択は、組換えタンパク質が産生される宿主細胞の種類に依存し、異なるシグナル配列が、天然シグナル配列を置換することができる。哺乳類宿主細胞において機能的なシグナル配列の例として、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン－７（ＩＬ－７）のシグナル配列、ヒトＩｇＫのシグナル配列（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ；配列番号３）、ヒト成長ホルモンのシグナル配列（ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ；配列番号４）、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）に記載のインターロイキン－２受容体のシグナル配列、欧州特許第０ ３６７ ５６６号に記載のインターロイキン－４受容体シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチド、および欧州特許第０ ４６０ ８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン－１受容体シグナルペプチドが挙げられる。これらのシグナル配列を記載するこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＢＴＮＬ３核酸
本発明は、例えば、配列番号２または配列番号９のアミノ酸配列を含むタンパク質ならびにその断片および／またはバリアントを含む本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡを含む単離された核酸を包含する。そのような核酸は、エクソン配列を含まないＤＮＡを含む。これらの核酸は、とりわけ、組換えタンパク質の産生および例えば診断用途のための組織試料中のＢＴＮＬ３核酸の存在の検出に有用である。そのような核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。当技術分野で知られているように、ｃＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡに存在し得るエクソン配列を含まない。核酸は、ＢＴＮＬ３タンパク質をコードする中断されていないオープンリーディングフレームを含み得る。本発明の核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（一本鎖形態と二本鎖形態の両方）、ならびに対応する相補配列を含む。「単離された核酸」は、天然に存在する源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接した遺伝子配列から分離された核酸である。オリゴヌクレオチド等の化学的に合成された核酸の場合、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物もしくはｃＤＮＡ等の鋳型から酵素的に合成された場合、そのようなプロセスに由来する核酸が単離された核酸であることが理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子またはベクター等のより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を指す。
さらに、本発明は、（１）当技術分野で周知のいくつかの方法、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション、アレイへのハイブリダイゼーション等によってＢＴＮＬ３核酸を検出するためのプローブ、（２）ＢＴＮＬ３核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー、または（３）例えば、アンチセンス核酸（ペプチド核酸を含む）、リボザイム、トリプルヘリックス形成分子、もしくは干渉ＲＮＡでの発現の阻害によって、ＢＴＮＬ３核酸の発現を制御する手段としての機能を果たすことができるＢＴＮＬ３タンパク質をコードする核酸の断片を包含する。これらのＲＮＡのうちのいずれかをコードするＤＮＡも、本明細書で意図されるＢＴＮＬ３核酸である。ＰＣＲプライマーは、ＢＴＮＬ３核酸配列に加えて、増幅された核酸の使用を促進する制限酵素切断部位等の他の配列を含み得る。ＰＣＲは、例えば、以下の参考文献：Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７－９１、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている。以下で説明されるように、ＰＣＲは、ＢＴＮＬ３ ｍＲＮＡの過剰発現または過小発現の検出に有用であり得、ＰＣＲプライマーは、ＢＮＴＬ３遺伝子の様々な部分から採取され、異なるスプライスバリアントを区別するようにも選択され得る。アンチセンスＲＮＡ（およびそれらをコードするＤＮＡ）、ＤＮＡ、または合成ヌクレオチド、ならびに発現を制御するためのこれらの使用は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８４），Ｃｅｌｌ ３６（４）：１００７－１５、Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１１）：３４５－５２、Ｈａｒｅｌ－Ｂｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８（６）：２３０９－１８、Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（２０）：７４４８－５１、Ｚｏｎ（１９８８），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５（９）：５３９－４９、Ｈａｒｅｌ－Ｂｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０（７）：２４３１－３５、Ｍａｒｃｕｓ－Ｓｅｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１４）：５７４９－６３、Ｇａｍｂａｒｉ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．７（１７）：１８３９－６２、およびＬｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（３）：６４８－５２に記載されている。核酸を用いて遺伝子発現を調節する技法を記載するこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。同様に、干渉ＲＮＡ（およびそれらをコードするＤＮＡ）ならびに選択された遺伝子の発現を阻害するためのこれらの使用が当技術分野で周知であり、例えば、Ｆｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．７：３１－５７、Ｂｏｓｈｅｒ ａｎｄ Ｌａｂｏｕｅｓｓｅ（２０００），Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：Ｅ３１－Ｅ３６に記載されている。これらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、リボザイムまたはＤＮＡザイムは、例えば、Ｌｅｗｉｎ ａｎｄ Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ（２００１），Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７（５）：２２１－２８、Ｍｅｎｋｅ ａｎｄ Ｈｏｂｏｍ（１９９７），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１）：１７－３３、Ｎｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：２９３－３０１、Ｓｉｏｕｄ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１（５）：５７５－８８、およびＳａｎｔｉａｇｏ ａｎｄ Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７９（１２）：６９５－７０６に記載されるように、特異的ＲＮＡを切断するように標的化され、それ故に遺伝子発現を阻害するために用いられ得る。遺伝子発現を調節する方法を記載するこれらの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。ＢＴＮＬ３発現を制御することができるそのような核酸は、ＢＴＮＬ３機能のインビボもしくはインビトロ研究に、または治療薬、任意に、遺伝子治療薬として用途を見出すことができる。
本発明は、配列番号１もしくは配列番号８の配列を含む核酸、例えば、ＤＮＡ、またはその断片、あるいは中程度にストリンジェントな条件下で、任意に、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは配列番号８のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸（ＢＴＮＬ３ ｃＤＮＡ）も含み、核酸は、固定化抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるタンパク質をコードする。ハイブリダイゼーション技法は、当技術分野で周知であり、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１，（１９８９））、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３－６．４（１９９５））によって説明されている。概して、フィルターハイブリダイゼーションの中程度にストリンジェントな条件は、約５０％ホルムアミド、約４２℃～５５℃の温度の６×ＳＳＣ、および約６０℃での０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄におけるハイブリダイゼーションを含む。概して、高度にストリンジェントな条件は、約６８℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄以外は上述のハイブリダイゼーション条件と定義される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２６ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）である）を、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに用いることができ、洗浄、任意に少なくとも２回の洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後に１５分間行われる。
当業者に知られており、かつ以下でさらに記載される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記参照）を参照のこと）ハイブリダイゼーション反応および二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって所望の程度のストリンジェンシーを達成するために、洗浄温度および洗浄塩濃度を必要に応じて調節することができることを理解されたい。既知の配列の核酸がハイブリダイズされるとき、ハイブリッドの長さは、その核酸の配列をアライメントし（例えば、ＧＡＰを用いて）、かつ最適な配列相補性の領域（複数を含む）を特定することによって決定され得る。上述の条件とは若干異なる条件を、長さが比較的短いハイブリッドに適用することができる。５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、このハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５～１０℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（摂氏温度）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍ（摂氏温度）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である。そのようなハイブリダイズ核酸はそれぞれ、少なくとも１５ヌクレオチド長、または少なくとも１８ヌクレオチド長、または少なくとも２０ヌクレオチド長、または少なくとも２５ヌクレオチド長、または少なくとも３０ヌクレオチド長、または少なくとも４０ヌクレオチド長、または少なくとも５０ヌクレオチド長、または少なくとも１００ヌクレオチド長を有し得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．（上記参照）。
ｃＤＮＡ等のＢＴＮＬ３核酸は、以下のポリヌクレオチドを含む核酸を含む：（１）配列番号１または配列番号８のすべてまたは断片（この断片は、Ｔ細胞の増殖を阻害することができるＢＴＮＬ３タンパク質をコードする）、（２）配列番号１または配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．７％同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（アライメントウィンドウは、少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、または１２００ヌクレオチド長であり、この配列は、固定化抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるか、またはそのような阻害を拮抗することができるＢＴＮＬ３タンパク質をコードする）、（３）本発明のＢＴＮＬ３タンパク質をコードする核酸の検出または増幅、あるいはＢＴＮＬ３ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現の制御に有用な配列番号１もしくは配列番号８または実質的に類似した配列の断片、（４）配列番号１または配列番号８と比較して、単一ヌクレオチドの１、２、３、４、６、８、１０、１５、２０、２５、または３０個を超えない変化（複数可）を含むポリヌクレオチド（変化は、単一ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換であり得、このポリヌクレオチドは、固定化抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することができるか、またはそのような阻害のアンタゴニストとしての機能を果たすことができるＢＴＮＬ３タンパク質をコードする）、ならびに（５）ヒトＢＴＮＬ３タンパク質の断片、誘導体、およびバリアントを含む本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ＢＴＮＬ３タンパク質および抗ＢＴＮＬ３抗体を作製する方法
多量体ＢＴＮＬ３タンパク質もしくはバリアントＢＴＮＬ３タンパク質を含むＢＴＮＬ３タンパク質、または抗ＢＴＮＬ３抗体（もしくは抗イディオタイプ抗体）は、以下のように作製され得る。本明細書に記載されるようにＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体をコードする核酸、例えば、ＤＮＡは、哺乳類細胞であり得る宿主細胞、例えば、非ヒト宿主細胞に導入され得るベクターに導入され得る。ＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体をコードするＤＮＡ等の核酸を含むベクターおよび宿主細胞は、本発明によって包含される。ＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体をコードする核酸を含む宿主細胞は、ＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体が発現することができるような条件下で培養され得る。その後、発現したＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体は、その細胞が培養される培地から、またはその細胞から得られ、当技術分野で既知の多くの適切な手段のうちのいずれかによって精製され得る。加えて、ＢＴＮＬ３タンパク質を産生するための遺伝子操作方法は、既知の方法に従う、無細胞発現系、細胞宿主、組織、および動物モデルにおけるポリヌクレオチド分子の発現を含む。
ベクターは、宿主における増殖のために選択可能なマーカーおよび複製起点を含み得る。ベクターは、ＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体をコードする核酸に作動可能に連結された哺乳類、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子等由来の好適な転写物または翻訳制御配列をさらに含み得る。そのような制御配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳を制御する適切な配列が挙げられる。ヌクレオチド配列は、制御配列が標的タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に関連するときに作動可能に連結される。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列が抗ＢＴＮＬ３抗体をコードする配列またはＢＴＮＬ３タンパク質をコードする配列の転写を指向する場合、核酸配列に作動可能に連結される。ＢＴＮＬ３タンパク質が融合タンパク質である場合、その融合タンパク質の一部をコードする核酸配列、例えば、シグナル配列は、ベクターの一部であり得、抗ＢＴＮＬ３抗体またはＢＴＮＬ３タンパク質をコードする核酸は、付加されたシグナル配列および抗ＢＴＮＬ３抗体を含むタンパク質またはＢＴＮＬ３タンパク質がベクターによってコードされるようにベクターに挿入され得る。
ＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体の発現に好適な宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、および高等真核細胞（哺乳類細胞を含む）を含むヒトおよび非ヒト細胞を含む。ベクター中の制御配列は、それらが宿主細胞中で作動可能なように選択される。好適な原核宿主細胞は、エシェリキア属、バシラス属、およびサルモネラ属、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属、およびスタヒロコッカス属のメンバーの細菌を含む。原核細胞、例えば、大腸菌における発現の場合、ＢＴＮＬ３タンパク質または抗ＢＴＮＬ３抗体をコードするポリヌクレオチド分子は、好ましくは、組換えポリペプチドの発現を促進するためにＮ末端メチオニン残基を含む。Ｎ末端メチオニンは、発現したポリペプチドから任意に切断され得る。好適な酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリス等の種を含む、サッカロミセス属、ピチア属、およびクルイベロミセス属を含む細胞を含む。昆虫宿主細胞における好適な発現系は、例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓによる総説（（１９８８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７）に記載されている。好適な哺乳類宿主細胞は、サル腎臓細胞のＣＯＳ－７株（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：１７５－１８２）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９５８），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ６０：１２７５－１２８１）、ＣＶ－１（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７０），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５：２１－２７）、ヒト腎臓由来の２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））カタログ番号ＣＲＬ－１０８５２（商標））、およびヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ ２）を含む。この段落で言及されるこれらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
細胞宿主で用いるための発現ベクターは、概して、１つ以上の選択可能な表現型マーカー遺伝子を含む。そのような遺伝子は、例えば、抗生物質に対する耐性を与えるタンパク質または栄養要求要件を供給するタンパク質をコードする。多種多様のそのようなベクターは、商業的供給源から容易に入手可能である。例として、ｐＧＥＭ（登録商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＳＰＯＲＴ（商標）ベクター、およびｐＰＲＯＥＸ（商標）ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が挙げられる。酵母ベクターは、多くの場合、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含む。酵母と大腸菌の両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと称される）を用いることもできる。酵母ベクターの上述の特徴に加えて、シャトルベクターは、大腸菌における複製および選択のための配列も含む。酵母宿主で発現した標的ポリペプチドの直接分泌は、ＢＴＮＬ３または抗体をコードするヌクレオチド配列の５’末端で酵母α因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列の包含によって達成され得る。Ｂｒａｋｅ（１９８９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：２６９－２８０。
哺乳類宿主細胞における使用に好適な発現ベクターの例として、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＣ４０９（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１），ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１－２８３２）、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられる。哺乳類宿主細胞で用いるための発現ベクターは、ウイルスゲノム由来の転写物および翻訳制御配列を含み得る。ＢＴＮＬ３ ＲＮＡを発現させるために用いられ得る一般に用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列には、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の配列が含まれるが、これらに限定されない。哺乳類発現ベクターを構築するための方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１－１７０）、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５－９４１）、Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８－７７１）、欧州特許第Ａ－０３６７５６６号、および国際公開第ＷＯ９１／１８９８２号に開示されている。これらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
抗ＢＴＮＬ３抗体
本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質に特異的に結合する抗体、抗ＢＴＮＬ３抗体に結合する抗イディオタイプ抗体、およびこれらの抗体の使用が本明細書に記載される。抗ＢＴＮＬ３抗体は、ポリペプチドに結合することができ、このポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１８～２３６または配列番号９のアミノ酸１８～１６６からなる。本明細書で使用される場合、第１の抗体によるＢＴＮＬ３タンパク質上のエピトープの特異的結合は、第１の抗体が、第１の抗体と競合する別の抗体によってＢＴＮＬ３タンパク質から置き換えられ得るが、結合において第１の抗体と競合しない他の抗ＢＴＮＬ３抗体によっては置き換えられ得ないことを意味する。多数の競合的結合アッセイが当技術分野で既知である。
典型的には、結合における抗体の競合を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイによって評価することができる。目的とする抗体は、ビオチニル化され得る。ビオチニル化された抗体は、抗体が結合する抗原を発現することで知られている細胞と合わせられる。ビオチニル化された抗体が予想通り細胞に結合する場合、蛍光色素に接合されるストレプトアビジンからなる二次物を用いて蛍光強度のシフトが観察されるはずである。非標識バージョンの同一の抗体との細胞のプレインキュベーションは、観察された蛍光シフトを完全に排除するはずである。異なる非標識抗体とのプレインキュベーションは、蛍光シフトを完全にまたは部分的に排除し得るか、または影響を及ぼし得ない。後者の場合、非標識抗体が標識抗体と競合しないとの結論が下される。前者の場合、抗体は、結合において実際に競合し、本明細書で意図される場合、エピトープが完全にまたは部分的に、のいずれかで重なり合っているとの結論が下される。あるいは、非標識抗体は、標識抗体によって結合されるエピトープの立体構造を変化させることによって競合し得る。企図される抗体には、任意の特異的に提供された抗ＢＴＮＬ３抗体と完全にまたは部分的に、のいずれかで競合する抗体がある。
いくつかの実施形態において、抗ＢＮＴＬ３抗体は、１０－８、１０－９、１０－１０、または１０－１１Ｍを超えない平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＢＴＮＬ３タンパク質に結合することができる。ＫＤは、一般に、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙが販売する計器等の表面プラズモン共鳴を用いてリアルタイムでタンパク質間の相互作用を検出することができる特殊な計器の使用によって一般に決定される。いくつかの実施形態において、抗ＢＴＮＬ３抗体は、配列番号２および／または配列番号９と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または１００％同一のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質に結合することができ、配列番号２および／または９とのアライメントウィンドウは、少なくとも５０、６０、７０、８０、または１００アミノ酸長であり、任意に、ＢＴＮＬ３タンパク質は、固定化抗ＣＤ３抗体によって刺激されたＴ細胞の増殖を阻害することができるか、または配列番号７のアミノ酸配列を含むＢＴＮＬ３タンパク質によるそのような阻害を拮抗することができる。いくつかの実施形態において、抗ＢＴＮＬ３抗体は、配列番号２および／または９のアミノ酸配列の断片を含むタンパク質に結合することができる。
加えて、ＢＴＮＬ３タンパク質の存在下または不在下での抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞の活性化に対する抗ＢＴＮＬ３抗体の影響は、抗体の機能特性についてのさらなる有用な情報を提供し得る。具体的には、ＢＴＮＬ３が抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞の増殖を阻害するその通常の役割を果たすことを阻止または阻害する抗体が企図される。あるいは、ＢＴＮＬ３による抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞の増殖の阻害をアゴナイズまたは強化する抗体が企図される。したがって、抗体は、ＢＴＮＬ３のアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかであり得る。ＢＴＮＬ３が細胞内Ｂ３０．２ドメインを含むため、その細胞外ドメインが天然に存在するリガンドまたはアゴニスト抗体等のアゴニストによって結合されるときに、それが発現する細胞にシグナルを形質導入し得る。この種のアゴニスト抗体は、Ｔ細胞の増殖の阻害を強化する抗体とははっきりと異なり得る。本発明は、それぞれＢＴＮＬ３の特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体および結合においてこれらと競合するモノクローナル抗体を含む。抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり得、様々な形態であり得る。
ＢＴＮＬ３タンパク質上のエピトープは、連続アミノ酸を含み得、非連続アミノ酸も含み得る。エピトープは、タンパク質断片またはペプチドライブラリの使用、アラニンスキャニング、エピトープ抽出、エピトープ除去、またはＸ線結晶学を含む当技術分野で既知の方法によって特定され得る。例えば、Ｌｅｉｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８（１２）：２２０８－１６、Ｋｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１７（１１－１２）：９３７－４４、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２（４）：９２１－２７、Ｏｂｕｎｇｕ ｅｔ ａｔ．（２００９），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：７２５１－６０を参照されたい。これらの参考文献の関連部分、すなわち、エピトープマッピングの方法を記載する部分は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＢＴＮＬ３がＩｇＶ様ドメイン等の周知の三次構造のドメインをいくつかを含むといった事実を特に考慮して、既知の三次構造の類似物によって生成されたＢＴＮＬ３の三次構造は、エピトープの決定を助けるものとして用いられ得る。
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得、当技術分野で周知の方法によって産生され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８），Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７：２１９７、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１－３００５（ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を記載する）、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６（１９８５）（ＥＢＶハイブリドーマ技術を記載する）、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．１６２－６４，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたく、これらの参考文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のＢＴＮＬ３タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も本明細書に企図される。そのようなハイブリドーマ株は、従来の技術によって産生および特定され得る。抗ＢＴＮＬ３抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養され得る。さらに、抗ＢＴＮＬ３抗体は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えば、ＮＳＯ、ＮＳＩ）、またはＷＩ３８細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および例えば大腸菌を含む細菌細胞を含む他の培養細胞において産生され得る。そのような抗体は、この抗体をコードするＤＮＡ等の核酸および所望の宿主細胞でのこれらの核酸の発現を可能にする核酸を導入することによって産生され得る。その後、これらの抗体は、これらの核酸が導入される細胞を培養することによって産生され得る。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラス、および任意のそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４等のものであり得る。
抗ＢＴＮＬ３抗体は、多くの哺乳類種に見られる抗体等の２つの重鎖および２つの軽鎖を含む全長四量体抗体であり得る。そのような全長抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＥアイソタイプのものであり得る。これがＩｇＧ抗体である場合、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。あるいは、抗ＢＴＮＬ３抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、任意に、１つ以上の定常領域様ドメインも含む一本鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３）、二量体または多価抗体（例えば、Ｌａｎｔｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：２００１－０５、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ（２００１），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１（５）：８４５－５５を参照のこと）、四量体抗体（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ ＩＩ，Ｃｈ．３，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１）を参照のこと）、キメラ抗体（Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ（上記参照）、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３－４６、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－５５、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２－５４、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８－７０）、非ヒトトランスジェニック哺乳動物において産生された（例えば、米国特許第６，１５０，５８４号に記載されるもの）か、またはインビトロ選択によって産生された（米国特許出願第２００２／００５８０３３号）完全なヒト抗体、あるいはヒト化抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（上記参照）、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（上記参照）、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（上記参照））であり得る。さらに、抗体は、変化した特性、例えば、それが結合するエピトープに対するより高い親和性等を有する抗体を産出するインビトロ選択スキームによって「成熟」し得る。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－１９、Ｐｉｎｉ ａｎｄ Ｂｒａｃｃｉ（２０００），Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１（２）：１５５－６９、Ｅｌｌｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９（５－６）：３４９、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２１（１）：４９－５６、Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３－７１、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｕｒｉａｕ（上記参照）、Ａｄａｍｓ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｒ（１９９９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１－２）：２４９－６０、Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｐｌａｃｅｎｔａ ２１ Ｓｕｐｐｌ．Ａ：Ｓ１０６－１２を参照されたい。あるいは、本発明のＢＴＮＬ３タンパク質に特異的に結合することができる抗体の断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ’ｓ）等も、抗ＢＴＮＬ３抗体として本明細書で意図されるものに包含される。ＦａｂおよびＦｖ断片の考察については、Ｋｕｂｙ（上記参照），ｐｐ．１０９－１１２、およびＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記参照）を参照されたい。本発明は、ＢＴＮＬ３タンパク質に特異的に結合する抗体に特異的に結合し、かつＢＴＮＬ３タンパク質の作用を模倣する抗イディオタイプ抗体も包含する。そのような抗イディオタイプ抗体は、ＢＴＮＬ３タンパク質と同一の用途を見出す。抗イディオタイプ抗体を生成するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｂｙ ｅｔ ａｌ．（上記参照、３７１－７２）を参照されたい。本発明のＢＴＮＬ３タンパク質および別のタンパク質に特異的に結合することができる様々な種類の組換えおよび非組換え二重特異的抗体も企図される。様々な種類の二重特異的抗体およびこれらを作製するための方法は、例えば、米国特許第４，４７４，８９３号、同第６，０６０，２８５号、および同第６，１０６，８３３号に記載されている。
抗ＢＴＮＬ３抗体は、２つの完全な重鎖および２つの完全な軽鎖を含む全長四量体二重特異的抗体、または例えば重鎖および軽鎖およびＦｃ領域を含む多量体一価抗体を含む多量体抗体であり得る。そのような多量体抗体は、ヘテロ二量体の形成を促進するある特定の変異をそれらのＦｃ領域に含み得る。そのような抗体および変異は、国際特許公開第国際出願第ＷＯ２００９／０８９００４号および米国出願第２００７／０１０５１９９号に記載されており、そのような抗体および変異を記載する部分は、参照により本明細書に組み込まれる。そのような抗体のＦｃ領域は、天然ヒト配列または他の種にとって自然である配列を有し得る。あるいは、または加えて、そのような抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ領域に対する様々なＦｃ受容体の親和性を増加または減少させることによってエフェクター機能を増加または減少させる変異をそれらのＦｃ領域に含み得る。いくつかのそのようなＦｃ変化は、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４５７，０３５号および国際特許出願公開第ＷＯ９３／１０１５１号に記載されている。
抗ＢＴＮＬ３抗体は、抗体が結合することができる細胞を見つけるか、その増殖を阻害するか、またはそれを死滅させるために用いられ得る部分に複合体化され得る。そのような細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、および／または放射性部分には、例えば、メイタンシン誘導体（ＤＭ１等）、エンテロトキシン（ブドウ球菌エンテロトキシン等）、ヨウ素同位体（ヨウ素１２５等）、テクネチウム同位体（Ｔｃ－９９ｍ等）、シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８等）、リボソーム不活性化タンパク質（ボウガニン、ゲロニン、またはサポリン－Ｓ６等）、およびカリケアマイシン、商標ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ）名で販売される製品の一部である細胞傷害性物質がある。
抗体は、米国特許出願第２００４／０５８８２０号に記載されるように、任意に抗体の別の部分に融合する単一の重鎖または軽鎖可変領域のみを含み得、これらの単一ドメイン抗体を記載する部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
ラクダおよびラマにおいて見出されているいくつかの天然に存在する抗体は、２つの重鎖からなり、軽鎖を含まない二量体である。これらの抗体の構造を記載する部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７－３０２、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５－９０。この構造を有する抗ＢＴＮＬ３抗体は、本発明の抗ＢＴＮＬ３抗体のものである。
抗ＢＴＮＬ３抗体は、様々な活性および用途を有し得る。抗ＢＴＮＬ３抗体は、例えば、Ｔ細胞増殖のＢＴＮＬ３依存性阻害を遮断または拮抗することによって、ＢＴＮＬ３の生物学的機能を遮断または阻害するアンタゴニスト抗体であり得、これを本明細書の実施例に記載の方法によってアッセイすることができる。抗体は、アゴニスト抗体であることもできる。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗体は、ＢＴＮＬ３逆構造（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に結合し、かつＢＴＮＬ３結合を模倣して、Ｔ細胞の活性化または増殖を阻害することができる。アゴニスト抗体は、抗ＢＴＮＬ３抗体に結合し、かつ／またはＢＴＮＬ３逆構造にも結合し、ＢＴＮＬ３の活性を模倣する抗イディオタイプ抗体であってもよく、すなわち、これらは、本明細書に記載されるようにＴ細胞の増殖を阻害する。そのようなアゴニスト抗ＢＴＮＬ３抗体は、ＢＴＮＬ３タンパク質と同一の用途で用いられ得る。抗ＢＴＮＬ３抗体は、例えば、可能性として他のタンパク質と組み合わせて、細胞表面上でＢＴＮＬ３タンパク質を安定化または撹乱することによって、アゴニスト性またはアンタゴニスト性を示し得る。例えば、アゴニスト抗体は、ＢＴＮＬ３の膜貫通形態を安定化するか、または細胞表面上でＢＴＮＬ３タンパク質と他のＢＴＮＬ３タンパク質または異なるタンパク質との相互作用を安定化することによって、あるいは細胞表面上でＢＴＮＬ３タンパク質をクラスター化することによって、ＢＴＮＬ３の活性を強化し得る。さらに、アンタゴニスト抗体は、ＢＴＮＬ３の膜貫通形態を不安定化するか、あるいは細胞の細胞表面上でＢＴＮＬ３の複数の分子間の相互作用またはＢＴＮＬ３と他のタンパク質との相互作用を不安定化することによってＢＴＮＬ３活性を阻害し得る。アゴニスト抗ＢＮＴＬ３抗体は、ＢＴＮＬ３の膜貫通形態にも結合して、それが発現する細胞に生物学的シグナルを形質導入させることができる。そのようなシグナルは、例えば、ＢＴＮＬ３を発現する免疫細胞、例えば、好中球の免疫機能を減少または増加させ得る。いくつかの実施形態において、アゴニスト抗ＢＴＮＬ３抗体は、増殖の減少または癌細胞もしくは好中球等のＢＴＮＬ３を発現する細胞の細胞死を引き起こし得る。アンタゴニスト抗ＢＴＮＬ３抗体を用いて、免疫応答を強化することができる。したがって、アンタゴニスト抗ＢＮＴＬ３抗体は、例えば、癌治療に、またはワクチン、例えば、癌特異的抗原に対する応答を誘導するためのワクチンに用途を見出すことができる。
抗ＢＴＮＬ３抗体は、細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、および／または放射性部分に複合体化され得る。そのような抗体を用いて、ＢＴＮＬ３を発現する細胞見つけるか、その増殖を阻害するか、またはそれを死滅させることができる。いくつかの癌細胞がＢＴＮＬ３を発現するため、そのような抗体複合体を用いて、そのような癌を治療することができる。同様に、好中球がＢＴＮＬ３を発現するため、そのような抗体複合体を用いて、過剰な数の好中球または過剰な好中球活性を特徴とする状態、例えば、喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、ＣＯＰＤ、ならびに痛風および関連炎症性結晶沈着症を治療することができる。そのような細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、および／または放射性部分には、例えば、メイタンシン誘導体（ＤＭ１等）、エンテロトキシン（ブドウ球菌エンテロトキシン等）、ヨウ素同位体（ヨウ素１２５等）、テクネチウム同位体（Ｔｃ－９９ｍ等）、シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８等）、リボソーム不活性化タンパク質（ボウガニン、ゲロニン、またはｓａｐｏｒｉｎ－Ｓ６等）、およびカリケアマイシン、商標ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ）名で販売される製品の一部である細胞傷害性物質がある。
本発明の抗体を、インビトロまたはインビボのいずれかで本発明のＢＴＮＬ３タンパク質の存在を検出するためのアッセイにおいて用いることもできる。これらの抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって本発明のＢＴＮＬ３タンパク質を精製する際に用いることもできる。
ＢＴＮＬ３ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト
アンタゴニストまたはアゴニスト抗体に加えて、アフィボディ等のＢＴＮＬ３タンパク質を特異的に結合することができる他の抗体関連分子（Ｒoｎｎｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．
（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１（１－２）：１９９－２１１（アフィボディを記載する部分は、参照により本明細書に組み込まれる））、および国際出願第ＷＯ００／２４７８２号に記載のＢＴＮＬ３に特異的に結合し、かつＢＴＮＬ３タンパク質の生物学的活性を阻害することができる生物学的に活性なペプチド（これらのペプチドを記載する部分は、参照により本明細書に組み込まれる）が、本発明に包含される。さらに、ＢＴＮＬ３アンタゴニストは、ＢＴＮＬ３タンパク質および／またはｍＲＮＡ、例えば、干渉ＲＮＡ（もしくはそれらをコードするＤＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡ等の発現の調節に有用な上述の核酸を含む。
アンタゴニストは、ＢＴＮＬ３またはその受容体に結合するようにインビトロで選択されたアミノ酸配列を含み、かつ任意にＢＴＮＬ３とその受容体との相互作用を妨害し得るタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのようなタンパク質は、ＢＴＮＬ３の通常の活性を欠き、かつデコイとして本質的に作用するＢＴＮＬ３のバリアント形態であり得る。あるいは、そのようなタンパク質は、ＢＴＮＬ３の生物学的機能を助長または模倣するＢＴＮＬ３アゴニストであり得る。ＢＴＮＬ３またはその受容体に結合するタンパク質は、ＢＴＮＬ３とその受容体との相互作用を妨害するそれらの能力についてスクリーニングされ得るか、またはあるいは、そのようなタンパク質を直接得るための選択が設計され得る。あるいは、ＢＴＮＬ３アンタゴニストは、野生型ＢＴＮＬ３タンパク質の生物学的活性を妨害するバリアントＢＴＮＬ３タンパク質、例えば、野生型ＢＴＮＬ３とその受容体との相互作用を遮断する可溶性で生物学的に不活性のＢＴＮＬ３バリアントであり得る。
タンパク質は、例えば、ファージディスプレイまたは細菌表面のディスプレイ等のいくつかの方法によって選択され得る。例えば、Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９８９），Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５－２１８、Ｌｕｚｚａｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．１：１４９－８３、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１３（４）：３６６－３７２を参照されたい。これらの方法において、結合ドメインのライブラリの各メンバーを個々のファージ粒子または細菌細胞上に提示することができ、選択された条件下で目的とするタンパク質に結合する細菌またはファージを選択することができる。選択された結合ドメインをコードする核酸は、選択されたファージまたは細菌を増殖させ、かつそれらから核酸を単離することによって得ることができる。
あるいは、タンパク質は、完全にインビトロで選択され得る。例えば、潜在的結合ドメインのライブラリ中のそれぞれの個々のポリペプチドは、それをコードする核酸に付着することができ、選択された条件下で目的とするタンパク質に結合するものが選択され得る。ポリペプチドがそれらをコードする核酸に付着されているため、効果的な結合ドメインをコードする核酸の増幅、クローニング、またはシーケンシング等のその後の作業が促進される。抗体－リボソーム－ｍＲＮＡ粒子、リボソームディスプレイ、共有結合性ＲＮＡ－ペプチド融合物、または共有結合性ＤＮＡ－ＲＮＡ－ペプチド融合物を含むそのような選択の様々なスキームが当技術分野で既知である。Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５（２４）：５１３２－５１３４、Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７－４９４２、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７－１２３０２、Ｌｏｈｓｅ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．４（２）：１９８－２０４、Ｋｕｒｚ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１８）：Ｅ８３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１８：２６８－９３、Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４（２）：４０５－０８、米国特許第６，２６１，８０４号、国際出願第ＷＯ００／３２８２３号、および同第ＷＯ００／３４７８４号。そのような選択がどのように行われ得るかを記載するこれらの出版物の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。そのようなタンパク質は、アンタゴニストまたはアゴニストであるように選択され得る。
治療的用途
本明細書において、ＢＴＮＬ３．Ｆｃ融合タンパク質が活性化Ｔ細胞の増殖を阻害することができることが実証される。実施例４の図５を参照されたい。ＢＴＮＬ３は、変化した遺伝子発現プロファイルに反映されるように、固定化抗ＣＤ３抗体に応答してＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化状態も低減させる。実施例５の図６を参照されたい。また、本明細書において、ＢＴＮＬ３が好中球およびいくつかの種類の癌細胞上で比較的高度に発現することが示される。図２および４。いくつかの状況において、好中球上で発現するＢＴＮＬ３の多型形態は、免疫ホメオスタシスを変化させる可能性があり得る。したがって、ＢＴＮＬ３、またはＢＴＮＬ３経路をアゴナイズする能力を有する分子は、Ｔ細胞または好中球によって媒介される自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する治療薬として有用であり得る。これらの疾患には、数ある中でもとりわけ、例えば、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性特発性関節炎、および乾癬性関節炎を含む）、アジソン病、喘息、多腺性内分泌障害症候群、全身性エリテマトーデス、慢性活動性肝炎、甲状腺炎、リンパ球性腺下垂体炎、早発閉経、特発性副甲状腺機能低下症、悪性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性好中球減少症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、強皮症、原発性シェーグレン症候群、多発性筋炎、自己免疫性溶血性貧血、炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎、乾癬、皮膚炎、サルコイドーシス、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、１型および２型糖尿病、移植関連状態、例えば、組織不適合性または移植片対宿主病、痛風および関連炎症性結晶沈着症、または線維症、例えば、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝硬変症、強皮症、腎移植線維症、腎同種移植ネフロパシー、肺線維症（特発性肺線維症を含む）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、混合本態性クリオグロブリン血症、ならびに温式自己免疫性溶血性貧血が含まれる。
ＢＴＮＬ３経路を遮断または阻害するＢＴＮＬ３アンタゴニストは、腫瘍学状況に用途を見出すことができる。上で説明されるように、ＢＴＮＬ３アンタゴニストは、例えば、細胞膜およびそれらの受容体上で発現する内因性ＢＴＮＬ３タンパク質の結合を妨害するＢＴＮＬ３タンパク質の抗ＢＴＮＬ３抗体またはバリアント形態を含む。以下に示されるように、ＢＴＮＬ３は、ある特定の癌細胞において比較的高度に発現する。実施例３の図４。これは、Ｔ細胞の活性化を阻害するＢＴＮＬ３の能力が免疫系による除去を逃れる癌細胞の能力において役割を果たし得ることを示唆する。
ＢＴＮＬ３またはその受容体のいずれかに結合し、かつこれらの分子間の相互作用を遮断または阻害することができる抗体を癌治療の治療薬として用いることができる。上述のＢＴＮＬ３の他のアンタゴニストを用いることもできる。ＢＴＮＬ３経路遮断剤で治療することができる様々な癌のうちのいくつかには、多くの他の癌の中でもとりわけ、急性または慢性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、リンパ球性白血病、リンパ球性または皮膚リンパ腫、癌腫、腺癌、肉腫、胸腺腫、縦隔新生物、乳癌、前立腺癌、頭頸部癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、様々な種類の皮膚癌、膀胱癌、悪性神経膠腫、胃腸系癌（食道癌、胃癌、小腸癌、結腸癌、または直腸癌を含む）、膵臓癌、腺癌、肝胆道新生物、腎臓癌または尿管癌、睾丸癌、尿道癌または陰茎癌、婦人科腫瘍、卵巣癌、骨肉腫、内分泌系癌、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、中枢神経系新生物、および形質細胞腫が含まれる。
同様に、抗ＢＴＮＬ３抗体を含むＢＴＮＬ３アンタゴニストを、多種多様の病原体による感染症を治療するための治療薬として用いることができる。これは、病原体がＴ細胞応答を抑制する場合、特に重要であり得る。ＢＴＮＬ３アンタゴニストで治療することができる病原性感染症には、数ある中でもとりわけ、制限なく、ウイルス、細菌、真菌、および様々な真核性病原体（マラリア、すなわち、マラリア原虫種、リーシュマニア種、線虫、および蠕虫、例えば、回虫種のメンバーを含む）による感染症が含まれる。いくつかの実施形態において、ＢＴＮＬ３アンタゴニストは病原体のすべてもしくは一部であるか、またはそれが病原体に対する免疫応答を誘発することができる程度に病原体のすべてもしくは一部と十分に類似した抗原の投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与され得る。
ＢＴＮＬ３アンタゴニストは、ワクチンをより効果的にする薬剤として用途を見出すこともできる。ＢＴＮＬ３をワクチンとともに用いて、任意の抗原に対する応答を誘導することができる。これらの抗原には、上述の癌由来の細胞等の癌細胞上で高度に発現した抗原がある。これらの癌抗原には、以下のヒトタンパク質がある：ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＧＭ２／ＧＤ２シンターゼ、ＣＥＡ、ＭＬＡＮＡ／ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、スルビビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座切断点、ＥＰＨＡ２、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＲＧ、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）、ペアードボックス３（ＰＡＸ３）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、Ｒｈｏ関連ＧＴＰ結合タンパク質ＲｈｏＣ、ｖ－ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス関連癌遺伝子（ＭＹＣＮ）、ＴＲＰ－２、ＧＤ３ガングリオシド、フコシルＧＭ１、メソテリン、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、テトラネクチン（ＴＮ）、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１（特に切断点を含むペプチド）、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２前駆体（ＯＹ－ＴＥＳ－１）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、ＬＣＫ、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ、別名メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ－１、Ｂ７Ｈ３（別名ＣＤ２７６）、レグマイン、ＴＩＥ２、前立腺関連遺伝子４タンパク質（ＰＡＧＥ－４）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、プロタミン２（別名ＭＡＤ－ＣＴ－１）、ｇｌｏｍｕｌｉｎ（別名ＦＡＰ）、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＸ２、ＳＳＸ５、Ｆｏｓ関連抗原１、ＣＤ２０、インテグリンανβ３、５Ｔ４癌胎児性抗原、ＣＡ ＩＸ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２２（別名Ｓｉｇｌｅｃ－２）、ＣＤ３０（別名ＴＮＦＲＳＦ１）、ＣＤ３３（別名Ｓｉｇｌｅｃ－３）、ＣＤ４０、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ５５、ＣＤ５６（別名ＮＣＡＭ）、ＣＴＬＡ－４（別名ＣＤ１５２）、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＨＬＡ－ＤＲ１０（ＭＨＣ ＩＩ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ－６、シアリルルイスＹ、ＴＡＧ－７２、ＴＡＬ６、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦ、ＣＤ５２（別名ＣＡＭＰＡＴＨ－１）、ＣＤ４、ＣＤ７３、ＣＡ１２５（別名ＭＵＣ１６）、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０（別名Ｂ７－１）、ＰＤＧＦＲβ、前立腺特異的膜抗原（数ある中でもとりわけ、ＰＳＭＡ、別名グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２）。癌抗原は、ヒトヘルペスウイルス４タンパク質ＬＭＰ２、ヒト乳頭腫ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７、ならびにグリコセラミドグロボＨ（グロボＨを記載する部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８（６）：３２７０－３２７５に記載のもの）、α４β１およびα４β７インテグリンのα４サブユニット、α４β７インテグリン、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ５補体タンパク質、ＩｇＥ、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）も含む。
ＢＴＮＬ３アンタゴニスト、例えば、抗ＢＴＮＬ３抗体は、ワクチンをより効果的にするために用いられるとき、抗原の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。この抗原は、上述の癌抗原の一部またはすべてであり得る。抗原は、病原体の一部もしくはすべて、または病原体の一部もしくはすべてに類似した分子、疾患を媒介する任意の細胞の表面で特異的に発現した分子の一部もしくはすべて、細胞から分泌された可溶性抗原、または病原体に対する免疫応答を誘発することができる分子でもあり得る。
ＢＴＮＬ３を介して細胞内シグナル伝達をアゴナイズする分子は、癌細胞がＢＴＮＬ３を発現する癌の治療薬としての機能を果たし得る。同様に、ＢＴＮＬ３を発現する免疫細胞、例えば、好中球によって媒介される炎症性疾患は、ＢＴＮＬ３を介する細胞内シグナル伝達をアゴナイズする分子で治療され得る。そのようなアゴニストは、抗ＢＴＮＬ３抗体であり得、細胞内シグナル伝達は、ＢＴＮＬ３のＢ３０．２ドメインを介して媒介され得る。
したがって、好中球上で発現したＢＴＮＬ３に結合し、それにより好中球の増殖を下方制御または阻害することができる分子は、過剰な好中球または過度の好中球活性が存在する状態、例えば、うっ血性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、ならびに痛風および関連炎症性結晶沈着症における有用な治療薬であり得る。そのような分子には、抗ＢＴＮＬ３抗体が含まれ得る。
その一方で、好中球の増殖を促進する分子は、感染しやすい好中球減少症を有する患者において有用であり得る。そのような患者には、癌の化学療法または放射線治療を受けた患者、有毒な化学物質または薬物に曝露された患者、またはある特定の自己免疫疾患を有する患者が含まれる。増殖の下方制御または阻害の細胞内シグナルを阻止する様式で好中球の表面上でＢＴＮＬ３に結合する分子は、そのような患者に有用な治療薬であり得る。そのような分子には、抗ＢＴＮＬ３抗体が含まれ得る。さらに、デコイとして作用し、それにより好中球上で発現したＢＴＮＬ３と、ＢＴＮＬ３に通常結合することによってＢＴＮＬ３が発現する好中球の増殖を下方制御または阻害するリガンドとの相互作用を阻止する分子は、そのような状態の治療薬であり得る。そのような分子には、ＢＴＮＬ３タンパク質またはそのバリアントが含まれ得る。
加えて、上述の細胞傷害性、細胞増殖抑制性、発光性、および／または放射性部分に複合体化される抗体を用いて、癌細胞がＢＴＮＬ３を発現する癌を治療することができか、または好中球数の増加を特徴とする炎症性または自己免疫疾患、例えば、喘息、ＣＯＰＤ、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、ならびに痛風および関連炎症性結晶沈着症を治療することができる。
本明細書で言及される任意の疾患の「治療」は、疾患の少なくとも１つの症状の緩和、疾患の重症度の軽減、またはある場合には、疾患と同時に起こり得るか、または少なくとも他の疾患につながり得るより重度の症状への疾患進行の遅延もしくは予防を包含する。治療は、疾患が完全に治癒されることを意味する必要はない。有用な治療薬は、疾患の重症度を低減させるか、疾患もしくはその治療に関連した１つ以上の症状の重症度を低減させるか、または治療された状態の後にある頻度で生じ得るより重度の症状もしくはより重度の疾患の発症を遅延させることのみを必要とする。例えば、疾患が炎症性腸疾患である場合、治療薬は、内臓内の明らかな炎症部位の数、冒された内臓の全範囲を減少させ、痛みおよび／もしくは腫れを軽減し、下痢、便秘、もしくは嘔吐等の症状を軽減し、かつ／または内臓の穿孔を予防し得る。患者の状態は、バリウム注腸もしくは注腸後に行われるＸ線、内視鏡検査、大腸内視鏡検査、および／または生体検査等の標準の技法によって評価され得る。好適な手順は、患者の状態および症状により異なる。
疾患を治療するために用いられる薬物の「治療的に有効な量」とは、疾患の重症度を低減させるか、疾患もしくはその治療に関連した１つ以上の症状の重症度を低減させるか、または治療された状態の後にある頻度で生じ得るより重度の症状もしくはより重度の疾患の発症を遅延させる量である。
本発明は、数ある中でもとりわけ、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性特発性関節炎、および乾癬性関節炎を含む）、アジソン病、喘息、多腺性内分泌障害症候群、全身性エリテマトーデス、慢性活動性肝炎、甲状腺炎、リンパ球性腺下垂体炎、早発閉経、特発性副甲状腺機能低下症、悪性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性好中球減少症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、強皮症、原発性シェーグレン症候群、多発性筋炎、自己免疫性溶血性貧血、炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎、乾癬、皮膚炎、サルコイドーシス、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、１型および２型糖尿病、移植関連状態、例えば、組織不適合性または移植片対宿主病、痛風および関連炎症性結晶沈着症、または線維症、例えば、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝硬変症、強皮症、腎移植線維症、腎同種移植ネフロパシー、肺線維症（特発性肺線維症を含む）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、混合本態性クリオグロブリン血症、ならびに温式自己免疫性溶血性貧血等の炎症性疾患を治療する方法を包含する。
そのような治療は、特定の障害の重症度もしくはその障害によって引き起こされる症状の重症度を反映する指標のベースラインを超える持続的改善を誘導するか、あるいはある場合またはあらゆる場合において治療された状態に続くより重度の疾患の発症を遅延させるか、または予防するのに十分な期間、治療的に有効な量のＢＴＮＬ３タンパク質、またはＢＴＮＬ３もしくはその受容体に結合するアゴニスト抗体を用いることを伴う。本発明の治療は、一般に用いられる問題となっている障害の他の治療の前、治療の後、または治療の最中に用いられ得るか、または他の治療なしで用いられ得る。例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎は、スルファサラジン、５－アミノサリチル酸、またはコルチコステロイドで一般に治療される。これらの治療は、ＢＴＮＬ３タンパク質またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いる治療の前、治療の最中、または治療の後に用いられ得る。
同様に、癌は、多くの場合、化学治療薬で治療され、そのような薬剤は、本明細書に記載の抗ＢＴＮＬ３抗体等のＢＴＮＬ３アンタゴニスト治療薬とともに用いられ得る。いくつかの実施形態において、ＢＴＮＬ３アンタゴニストは、化学治療薬の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。化学治療薬には、例えば、当技術分野で既知の数ある中でもとりわけ、以下の治療薬：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、テモゾロマイド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メチルロムスチン、ストレプトゾトシン、シス－ジアンミンジ－クロロ白金、アジリジニルベンゾ－キノン、およびチオテパ）、無機イオン（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）、ナイトロジェンマスタード（例えば、塩酸メルファラン、イホスファミド、クロラムブシル、およびメクロレタミンＨＣｌ）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ））、抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、およびブレオマイシン）、植物誘導体（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンデシン、ＶＰ－１６、およびＶＭ－２６）、代謝拮抗物質（例えば、ロイコボリンを有するか、または有しないメトトレキサート、ロイコボリンを有するか、または有しない５－フルオロウラシル、５－フルオロデオキシウリジ、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、ゲムシタビン、およびフルダラビン）、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン）、ならびにアクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ－アスパラギナーゼ、およびミトキサントロンが含まれる。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９３）を参照されたい。
癌を、放射線の様々な形態を用いて一般に様々な方法で治療される。本明細書において、癌患者へのＢＴＮＬ３アンタゴニストの投与が、放射線治療または任意の他の抗腫瘍性治療の前に、それと同時に、またはその後に起こり得ることが企図される。
自己免疫状態または炎症性状態の場合、Ｔ細胞を、例えばアフェレーシスを介して患者から取り出し、Ｔ細胞が制御性または阻害性表現型を得るように任意に他のタンパク質とともにＢＴＮＬ３を用いてエクスビボで刺激することができる。その後、このＴ細胞を患者に戻して移すことができる。制御性または阻害性表現型を得るようにＴ細胞を刺激するために、それらを、表面の存在下で、例えば、ビーズとともに、またはＴＧＦ－βおよびＩＬ－２の存在下でヒトＴ細胞アゴニスト抗ＣＤ３抗体、ｒＢＴＮＬ３．Ｆｃ、およびｒＢ７－１．ＦｃもしくはｒＢ７－２．Ｆｃでコーティングされるマイクロタイタープレートのウェル内でインキュベートすることができる。あるいは、表面を、ｒＢＴＮＬ３もしくはＢＴＮＬ３．Ｆｃを含むタンパク質とアゴニスト抗ＣＤ３抗体の組み合わせ、またはこれらのタンパク質のみを含む組み合わせでコーティングすることができる。一実施形態において、アゴニスト抗ＣＤ３抗体、ｒＢＴＮＬ３．Ｆｃ、およびｒＢ７－１．ＦｃまたはｒＢ７－２．Ｆｃは、例えば、２：１０：２．５の分子量比であり得る。ＴＧＦ－βおよびＩＬ－２は、例えば、ＴＧＦ－βの場合、約０．０５～５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－２の場合、約０．５～１０ｎｇ／ｍＬ等の適切な濃度であり得る。これは、Ｔ細胞が阻害性または制御性になるようにプログラムして、制御性Ｔ（「Ｔ ｒｅｇ」）細胞の「拡大」をもたらす。Ｔ ｒｅｇ細胞の「拡大」とは、Ｔ ｒｅｇ細胞（ＣＤ３＋ＦＯＸＰ３＋）の全体としてのＴ細胞（ＣＤ３＋ＦＯＸＰ３－）に対する比率がより高くなることを意味する。この比率は、当技術分野で周知の方法である細胞タンパク質を検出するための抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって決定され得る。例えば、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：２０２７－２０３５を参照されたい。Ｔ細胞は、そのような状況下で例えば３～７日間インキュベートされ、その後、収集され、同一の患者に戻して送達され得る。任意に、Ｔ細胞は、約３、４、５、６、または７日間インキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を静置させ、すなわち、例えばＩＬ－２の存在下でＴ細胞受容体または共刺激刺激物なしで培養し、その後、上述のように１～４回以上再刺激することもできる。そのようなレジームで治療可能な自己免疫状態または炎症性状態には、数ある中でもとりわけ、例えば、関節炎（リウマチ性関節炎、若年性特発性関節炎、および乾癬性関節炎を含む）、アジソン病、喘息、多腺性内分泌障害症候群、全身性エリテマトーデス、慢性活動性肝炎、甲状腺炎、リンパ球性腺下垂体炎、早発閉経、特発性副甲状腺機能低下症、悪性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性好中球減少症、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、強皮症、原発性シェーグレン症候群、多発性筋炎、自己免疫性溶血性貧血、炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎、乾癬、皮膚炎、サルコイドーシス、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、１型および２型糖尿病、移植関連状態、例えば、組織不適合性または移植片対宿主病、痛風および関連炎症性結晶沈着症、または線維症、例えば、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肝硬変症、強皮症、腎移植線維症、腎同種移植ネフロパシー、肺線維症（特発性肺線維症を含む）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、混合本態性クリオグロブリン血症、ならびに温式自己免疫性溶血性貧血が含まれる。
上述の治療薬のうちのいずれも、組成物の形態で投与され得、すなわち、生理学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤等の１つ以上のさらなる成分とともに投与され得る。例えば、組成物は、本明細書に記載の可溶性ＢＴＮＬ３タンパク質、抗ＢＴＮＬ３抗体、またはＢＴＮＬ３アゴニストもしくはアンタゴニスト、ならびに緩衝液、抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸、低分子量のポリペプチド（１０個未満のアミノ酸を有するもの等）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース、もしくはデキストリン等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、グルタチオン、ならびに／または他の安定剤、賦形剤、および／もしくは防腐剤を含み得る。この組成物は、液体または凍結乾燥物として製剤化され得る。薬学的製剤に用いられ得る成分のさらなる例は、関連部分が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，（１９８０）に提示されている。
上述の治療用分子を含む組成物は、非経口、局所、経口、経鼻、膣内、直腸、または肺（吸入）投与を含むが、これらに限定されない任意の適切な手段によって投与され得る。注入される場合、組成物（複数可）は、ボーラス注入または持続輸注によって関節内、静脈内、動脈内、心筋内、腹腔内、または皮下投与され得る。局所的投与、すなわち、疾患部位での投与が企図され、インプラント、皮膚用パッチ剤、または坐薬からの経皮送達および持続放出も同様に企図される。吸入による送達には、例えば、経鼻または経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態での吸入等が含まれる。体腔に挿入される坐薬を介する投与は、例えば、選択された体腔に組成物の固体形態を挿入し、それを溶解させることによって達成され得る。他の代替案には、点眼薬、経口調製物、例えば、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、およびチューインガム、ならびに局所調製物、例えば、ローション、ゲル、噴霧剤、および軟膏が含まれる。多くの場合、ポリペプチドである治療用分子は、局所的に、または注入もしくは吸入によって投与され得る。
上述の治療用分子は、治療される状態の治療に効果的であり得る任意の投与量、頻度、および期間、投与され得る。投与量は、治療用分子の分子的性質および治療される障害の性質に依存する。治療は、所望の結果を達成するのに必要な限り続けられ得る。治療の周期性は、全治療期間を通して一定である場合があるか、一定でない場合がある。例えば、治療は、最初は週間隔で起こり、後に隔週で起こり得る。数日間、数週間、数ヶ月、または数年の治療が本発明に包含される。治療は、中断され、その後、再開され得る。維持用量は、初期治療後に投与され得る。
投与量は、体重１キログラム当たりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）もしくは皮膚表面１平方メートル当たりのミリグラム（ｍｇ／ｍ２）として、または身長もしくは体重にかかわらず固定用量として測定され得る。これらは、当技術分野における標準の投与量単位である。ヒトの皮膚表面積は、標準の式を用いて身長および体重から計算される。例えば、ＢＴＮＬ３またはその受容体に結合する治療用ＢＴＮＬ３タンパク質または抗体は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。あるいは、約１ｍｇ～約５００ｍｇの用量が投与され得る。または、約５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、もしくは３００ｍｇの用量が投与され得る。
本発明は、特定の実施例を参照して以下で説明される。これらの実施例は、いかなる形でも本発明を制限するようには意図されていない。本開示の目的のために、十分に本発明の範囲内である様々な変更および修正が本発明に加えられ得ることが理解される。多数の他の変更を加えることもでき、これらは、それら自体が当業者に容易に提案し、かつ本明細書に開示され、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神に包含される。
実施例１：ヒト免疫細胞におけるヒトＢＴＮＬ３タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現
一次ヒト免疫細胞におけるヒトＢＴＮＬ３をコードするｍＲＮＡの発現に関する情報を集めるために以下の実験を行った。
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）の様々な商業的に利用可能な選択方法を用いて、一次免疫細胞を全血またはＬｅｕｋｏｐａｋから単離した。例えば、ＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標）ヒトＴ細胞濃縮キットおよび／またはＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キット（これら両方ともにＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのもの）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ単球単離キットＩＩを用いて単球を単離した。そのような市販の試薬を用いたそのような細胞分離は、当技術分野において慣習的である。負に選択された単球の７日間のエクスビボ成熟によってマクロファージを得た。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって各単離された細胞集団を分析して、単離された細胞集団が予想した細胞表面タンパク質を発現しているかを決定した。ＲＮＡを単離し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（商標）ＨＧ－Ｕ１３３３ Ｐｌｕｓ ２．０）によって評価した。ヒトＢＴＮＬ３転写物検出のためのデータ正規化および分析を、ＲＯＳＥＴＴＡ ＲＥＳＯＬＶＥＲ（登録商標）ソフトウェア（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｂｉｏｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。
これらの分析の結果が図２に示される。試験した細胞型には、末梢血単核球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびＮＫ細胞が含まれた。試験した細胞型のうち、好中球（図２のレーン８）が最高量のＢＴＮＬ３を発現した。
実施例２：ヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃの調製
以下は、ヒトＢＴＮＬ３の細胞外領域、リンカー、およびヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分を含む融合タンパク質がどのように作製されたかを説明する。リンカーおよびヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片に融合した配列番号２のアミノ酸１～２３６であるヒトＢＴＮＬ３の細胞外ドメインをコードする適切なベクターのｃＤＮＡを構築した。配列番号５は、このｃＤＮＡの配列を提供し、配列番号６は、シグナル配列を含むこのｃＤＮＡによってコードされるＢＴＮＬ３．Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列を提供する。シグナル配列を欠く成熟ＢＴＮＬ３．Ｆｃタンパク質配列が配列番号７に提供される。Ｃｏｓ ＰＫＢ細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴ ＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＢＴＮＬ３．Ｆｃ哺乳類発現構築物でトランスフェクトし、０．５％低Ｉｇ血清を有する完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。これらの方法は、Ｅｔｔｅｈａｄｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，ＯＶＥＲＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＫＩＮＡＳＥ Ｂα ＥＮＨＡＮＣＥＳ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＩＮ ＴＲＡＮＳＩＥＮＴ ＳＹＳＴＥＭＳ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｔａｒｇｅｔ ｔｏ Ｍａｒｋｅｔ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １７ｔｈ ＥＳＡＣＴ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｔｙｌoｓａｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ，Ｊｕｎｅ １０－１４，２００１，Ｖｏｌ．１，Ｌｉｎｄｎｅｒ－Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．３１－３５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００１で詳細に説明されている。組換えタンパク質の作製方法を記載するこの参考文献の部分は、参照により本明細書に組み込まれる。トランスフェクションの７日後、上清を収集し、ＢＴＮＬ３．Ｆｃタンパク質をタンパク質Ａカラムクロマトグラフィー（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）ＳｕＲｅ ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。
結果として生じたタンパク質の大きさを、ゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。ＣＨ３領域間の非共有結合相互作用およびヒンジ領域間に形成されたジスルフィド結合の結果、二量体化を引き起こすＦｃ領域が存在したため、このタンパク質が二量体であることが予想された。このタンパク質が二量体である場合、その予想される分子量は、様々なグリコシル化のため、約１２０ｋＤを超える可能性が高い。同様に、それが単量体であると予想された還元条件下におけるその予想された分子量は、少なくとも約６０ｋＤである。還元ゲル上でいくつかの帯を観察し、これらの帯の大半は、約５０～６４ｋＤであった。非還元条件下でＳＥＣによって観察された主なピークの分子量は、約１４０ｋＤであったが、より高い分子量種およびより低い分子量種も観察された。これらのデータは、タンパク質が非還元条件下で少なくとも二量体であり、より高次の多量体も形成する可能性が高いことを示す。
実施例３：ヒト正常組織および腫瘍組織におけるＢＴＮＬ３の発現
ヒト正常組織および腫瘍組織におけるＲＮＡレベルでのＢＴＮＬ３の発現レベルを決定するために、ＲＮＡを単離し、次世代シーケンシング分析によって評価した。具体的には、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）試薬を用いて、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）シーケンシング系内で処理した試料および反応物を調製した。データを分析して、１細胞当たりのＢＴＮＬ３ ＲＮＡの数を定量した。正常なヒト組織についてのこの分析の結果が図３に示される。ＢＴＮＬ３発現が大半の組織でほとんどまたはまったく検出されなかったが、より高いレベルの発現が結腸および小腸由来の試料で検出された。したがって、ＢＴＮＬ２様のＢＴＮＬ３は、主に消化管で発現する。
同様の方法を用いて、様々なヒト腫瘍組織試料におけるＢＴＮＬ３ ＲＮＡ発現のレベルを決定した。これらの結果が図４に示される。中程度のレベルのＢＴＮＬ３発現がいくつかの異なる腺癌試料で検出されたが、すべての腫瘍組織で検出されたわけではなかった。加えて、中程度のレベルおよび高レベルのＢＴＮＬ３発現がＩＩ型糖尿病患者由来のいくつかの試料で検出され、ＢＴＮＬ３がある場合においてこの疾患を媒介するか、またはこの疾患に応答する役割を果たし得ることを示唆する。
実施例４：マウスＣＤ４＋Ｔ細胞増殖のインビトロ分析
以下の実験を行って、インビトロでのマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖へのヒトＢＴＮＬ３：Ｆｃ融合タンパク質の影響を決定した。
１回の実験につき少なくとも５匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集した脾臓から調製した単一細胞脾細胞懸濁液を用いて、マウスＥＡＳＹＳＥＰ（商標）ＣＤ４＋ネガティブ選択キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の純度は、ＦＡＣＳ分析で評価したとき、９０％を超えた。組織培養処理マイクロタイタープレートを、様々な濃度の抗マウスＣＤ３モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ ２Ｃ１１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、ＵＳＡ）および図５の簡単な説明において示されるＦｃ融合タンパク質でコーティングした。ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて各ウェルの全タンパク質含有量を均等化した。すべてのコーティング／希釈をＰＢＳ中で行った。プレートを一晩インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、次いで、１～２×１０５精製ＣＤ４＋脾細胞／ウェルを添加した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を、７２時間培養の最後の６時間中に３Ｈ－チミジン（１μＣｉ／ウェル）組み込みによって決定した。ヒトＩｇＧを負の対照として用いた。正の対照として、Ｔ細胞増殖の阻害を以前に示したマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ、およびＴ細胞の正の共刺激分子として既知のヒトＢ７－２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）も含んだ。
結果が図５に示される。図５のレーン１は、固定化タンパク質もさらなるタンパク質も含まない負の対照アッセイを表す。レーン２および３は、固定化抗マウスＣＤ３抗体と、ヒトＩｇＧ（レーン２）またはヒトＢ７－２－Ｆｃタンパク質のいずれかを含む正の対照アッセイの結果を示す。レーン４は、固定化抗マウスＣＤ３抗体と負の共刺激分子であるマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃを含むアッセイの結果を示す。レーン５は、固定化抗マウスＣＤ３抗体とヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃを含むアッセイの結果を示す。レーン６および７は、固定化ヒトＩｇＧと、マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ（レーン６）またはヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃ（レーン７）のいずれかを用いたアッセイの結果を示す。これらのデータは、マウスＴ細胞増殖へのヒトＢ７－２－Ｆｃの刺激作用およびマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃの阻害作用を裏付け、ヒトＢＴＮＬ３．ＦｃがマウスＴ細胞増殖を阻害することができることを示す。これらのデータは、ヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃ融合タンパク質が、マウスＴ細胞に、マウスＢＮＴＬ２．Ｆｃ融合タンパク質を用いて観察された作用と同様の作用を有し得ることを示唆する。さらに、これらのデータは、近接したヒトＢＴＮＬ３のマウスホモログが単離されなかったという事実にもかかわらず、ヒトＢＴＮＬ３がマウスＴ細胞上の受容体と相互作用することができることを示唆する。
実施例５：マウスＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子発現へのＢＴＮＬ３．Ｆｃの効果
標準の抗ＣＤ３増殖アッセイにおいて、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を上述のように単離し、固定化抗ＣＤ３抗体と、さらなるタンパク質なし、固定化マウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ、または固定化ヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃで刺激した。増殖を３Ｈ－チミジン組み込みによって測定した。２４時間刺激した後、ＲＮＡを細胞から単離し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｃＤＮＡチップを用いて分析して、多くの種類の配列の発現レベルを決定した。結果が図６および以下の表４に示される。固定化抗ＣＤ３抗体でのマウスＣＤ４＋細胞の刺激は、予想通り、多くの免疫制御および炎症遺伝子の発現を上方制御した。マウスＢＴＮＬ２．ＦｃまたはヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃの包含は、この応答を弱めた。
図６において、黒色の点は、刺激していない細胞と比較した、刺激した細胞で観察された特定の配列の発現の相対量を表す。刺激した細胞と刺激していない細胞との間に有意な発現差のない配列は、図６に示されていない。図６において、左側のパネルは、抗ＣＤ３抗体のみで刺激した細胞のデータを示し、中央のパネルは、抗ＣＤ３抗体とマウスＢＴＮＬ２．Ｆｃ融合タンパク質で刺激した細胞のデータを示し、右側のパネルは、抗ＣＤ３抗体とヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃ融合タンパク質で刺激した細胞を示す。これらのデータは、抗ＣＤ３抗体で２４時間刺激することによって多くの遺伝子の発現が有意に上方または下方制御されることを示す。しかしながら、マウスＢＴＮＬ２．ＦｃまたはヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃのいずれかの添加は、この遺伝子数を実質的に減少させる。これらのデータは、ＢＴＮＬ２．Ｆｃが負の共刺激分子であることを裏付け、ＢＴＮＬ３．Ｆｃも負の共刺激分子であることを示す。したがって、これらの結果は、これら両方の分子が抗ＣＤ３抗体によるマウスＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を阻害することを示す。
以下の表４は、この実験のさらなる数値データを提供する。アッセイした４５，０６０個の配列のうち、多くの（２６，５３０個の）配列の発現は、抗ＣＤ３抗体のみでの刺激によっては統計的に有意な様式で変化しなかった。しかしながら、８，６３１個および９，８９９個の配列の発現は、抗ＣＤ３抗体のみでの刺激時に、それぞれ、有意に上方または下方制御された。これらの数は、マウスＢＴＮＬ２．ＦｃまたはヒトＢＴＮＬ３．Ｆｃのいずれかを添加したときに有意に減少した。したがって、ＢＴＮＬ２およびＢＴＮＬ３は両方ともに、Ｔ細胞の活性化を阻害する。
Figure 2022040181000007

Claims (1)

  1. 明細書に記載の組成物等。
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