JP2022023774A - バイオフィルムの除去方法及び除去キット - Google Patents
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Abstract
【課題】食品及び食品と接触する器具等の表面に形成されているバイオフィルム中の食中毒細菌の殺菌及び除去に対して効果的な非加熱のバイオフィルムの除去方法及び除去キットを提供する。【解決手段】バイオフィルムの除去方法は、バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる工程１Ａと、バクテリオファージを接触させた後の前記対象に次亜塩素酸水を接触させる工程２Ａと、又は、バイオフィルムが形成されている対象に次亜塩素酸水を接触させる工程１Ｂと、次亜塩素酸水を接触させた後の前記対象にバクテリオファージを接触させる工程２Ｂと、をこの順に含む。前記次亜塩素酸水の温度が４０℃以上１００℃未満であってもよい。前記次亜塩素酸水が微酸性次亜塩素酸水であってもよい。バイオフィルムの除去キットは、１種以上のバクテリオファージを含む第１の殺菌組成物と、次亜塩素酸水を含む第２の殺菌組成物と、を備える。【選択図】なし
Description
新規性喪失の例外適用申請有り
本発明は、バイオフィルムの除去方法及び除去キットに関する。
加熱は効果的な殺菌方法であり、バイオフィルム中の細菌にも効果があるが、熱に弱い素材や非加熱生鮮食品には利用できない。非加熱的な食中毒細菌制御法としては、従来から、次亜塩素酸ナトリウム、過酢酸やオゾン等を利用した化学的制御法やマイクロバブルや超音波処理等の物理的手法を組み合わせた方法が報告されている。しかしながら、実試料についての殺菌効果、殺菌剤の安全性や費用の点で問題があるため、安価で安全性の高い制御法の開発が求められている。
一方、近年、食中毒細菌の抗生物質耐性菌の増加が世界的な問題となっており、抗生物質に依存しない安全性の高い細菌制御法としてバクテリオファージ（ファージと略す）に注目が集まっている。海外ではこれまでに食中毒細菌特異的なファージが単離され、実際にリステリアやサルモネラ、大腸菌の制御法としてファージを含む製剤が食品添加物としてＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ、一般的に安全である）認証され、ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｅａｔ食品等に使用されている。しかし、我が国ではファージの感染症治療や食品への利用についての研究開発はほとんど行われていない。貿易の自由化の進展から、海外で許可されている食品用ファージ製剤が近い将来、日本でも許可される可能性がある。しかし、ファージ単独処理ではファージ処理後に生残するファージ耐性菌が増殖する点が問題であるが、効果的なファージ耐性菌抑制法はまだ存在しない。さらに食品衛生法が２０１８年に改正され、全ての食品事業者に向けてＨＡＣＣＰの制度化が施行されようとしており、食の安全確保や食品ロスの軽減に寄与する新規技術開発は重要な課題である。
これまでに発明者は、界面活性剤との併用が微酸性次亜塩素酸水の殺菌効果を増大させることを示している（例えば、非特許文献１等参照）。
Soli KW et al., "Decontamination of fresh produce by the use of slightly acidic hypochlorous water following pretreatment with sucrose fatty acid ester under microbubble generation.", Food Control, Vol. 21, pp.1240-1244, 2010.
バイオフィルム形成阻害及び除去については種々の方法が報告されているが、このうち微酸性次亜塩素酸水単独、ファージ単独での処理は効果的ではない。感染症予防、食品の安全性確保を達成するために、効果的にバイオフィルム形成阻害及び除去できる加熱に頼らない殺菌方法が求められている。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、食品及び食品と接触する器具等の表面に形成されているバイオフィルム中の食中毒細菌の殺菌及び除去に対して効果的な非加熱のバイオフィルムの除去方法及び除去キットを提供する。
発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、バクテリオファージ及び次亜塩素酸水を併用することで、食品表面に形成されているバイオフィルム中の食中毒細菌及び一般細菌を効果的に殺菌及び除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる工程１と、
バクテリオファージを接触させた後の前記対象に次亜塩素酸水を接触させる工程２と、
をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法。
（２） バイオフィルムが形成されている対象に次亜塩素酸水を接触させる工程１Ｂと、
次亜塩素酸水を接触させた後の前記対象にバクテリオファージを接触させる工程２Ｂと、をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法。
（３） 前記次亜塩素酸水の温度が４０℃以上１００℃未満である、（１）又は（２）に記載のバイオフィルムの除去方法。
（４） 前記次亜塩素酸水が微酸性次亜塩素酸水である、（１）～（３）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（５） 前記バクテリオファージが、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含む、（１）～（４）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム
（６） 前記バクテリオファージが、大腸菌以外の菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを更に含む、（１）～（５）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（７） 前記対象が、野菜又は果物である、（１）～（６）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（８） １種以上のバクテリオファージを含む第１の殺菌組成物と、
次亜塩素酸水を含む第２の殺菌組成物と、
を備える、バイオフィルムの除去キット。
（９） 前記次亜塩素酸水が微酸性次亜塩素酸水である、（８）に記載のバイオフィルムの除去キット。
（１０） 前記バクテリオファージが、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含む、（８）又は（９）に記載のバイオフィルムの除去キット。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム
（１１） 前記バクテリオファージが、大腸菌以外の菌に対して抗菌活性を有するバクテリオファージを更に含む、（８）～（１０）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去キット。
（１２） バイオフィルムの除去対象が、野菜又は果物である、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去キット。
（１） バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる工程１と、
バクテリオファージを接触させた後の前記対象に次亜塩素酸水を接触させる工程２と、
をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法。
（２） バイオフィルムが形成されている対象に次亜塩素酸水を接触させる工程１Ｂと、
次亜塩素酸水を接触させた後の前記対象にバクテリオファージを接触させる工程２Ｂと、をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法。
（３） 前記次亜塩素酸水の温度が４０℃以上１００℃未満である、（１）又は（２）に記載のバイオフィルムの除去方法。
（４） 前記次亜塩素酸水が微酸性次亜塩素酸水である、（１）～（３）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（５） 前記バクテリオファージが、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含む、（１）～（４）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム
（６） 前記バクテリオファージが、大腸菌以外の菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを更に含む、（１）～（５）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（７） 前記対象が、野菜又は果物である、（１）～（６）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去方法。
（８） １種以上のバクテリオファージを含む第１の殺菌組成物と、
次亜塩素酸水を含む第２の殺菌組成物と、
を備える、バイオフィルムの除去キット。
（９） 前記次亜塩素酸水が微酸性次亜塩素酸水である、（８）に記載のバイオフィルムの除去キット。
（１０） 前記バクテリオファージが、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含む、（８）又は（９）に記載のバイオフィルムの除去キット。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム
（１１） 前記バクテリオファージが、大腸菌以外の菌に対して抗菌活性を有するバクテリオファージを更に含む、（８）～（１０）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去キット。
（１２） バイオフィルムの除去対象が、野菜又は果物である、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のバイオフィルムの除去キット。
上記態様によれば、食品及び食品と接触する器具等の表面に形成されているバイオフィルム中の食中毒細菌の殺菌及び除去に対して効果的な非加熱のバイオフィルムの除去方法及び除去キットを提供することができる。
＜バイオフィルムの除去方法＞
一実施形態において、本発明は、以下に示す工程をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法を提供する。
バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる工程１Ａ；
バクテリオファージを接触させた後の前記対象に次亜塩素酸水を接触させる工程２Ａ。
一実施形態において、本発明は、以下に示す工程をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法を提供する。
バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる工程１Ａ；
バクテリオファージを接触させた後の前記対象に次亜塩素酸水を接触させる工程２Ａ。
また、別の実施形態において、本発明は、以下に示す工程をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法を提供する。
バイオフィルムが形成されている対象に次亜塩素酸水を接触させる工程１Ｂ；
次亜塩素酸水を接触させた後の前記対象にバクテリオファージを接触させる工程２Ｂ。
バイオフィルムが形成されている対象に次亜塩素酸水を接触させる工程１Ｂ；
次亜塩素酸水を接触させた後の前記対象にバクテリオファージを接触させる工程２Ｂ。
バイオフィルムには、細菌が産生する多糖類、タンパク質、脂質、細胞外ＤＮＡ等からなる細胞外ポリマー（ＥＰＳ）が存在し、ＥＰＳが細菌の細胞周辺に蓄積することで、細菌が対象の表面から引き剥がされるのを防ぎ、外部環境の変化から細菌を保護する。
本実施形態の除去方法では、バクテリオファージが特定の細菌を溶菌するだけでなく、バクテリオファージが有する酵素によってＥＰＳを分解することで、バイオフィルム内に入り込むことができる。さらに、バクテリオファージに続いて次亜塩素酸水による処理を行なうことで、バクテリオファージにより分解された部分からバイオフィルム内に次亜塩素酸水が浸透し、効果的にバイオフィルム内の細菌を殺菌することができる。
よって、後述する実施例に示すように、バクテリオファージによる処理後に、次亜塩素酸水により処理を行なうことで、バイオフィルムを効果的に除去することができる。
よって、後述する実施例に示すように、バクテリオファージによる処理後に、次亜塩素酸水により処理を行なうことで、バイオフィルムを効果的に除去することができる。
或いは、本実施形態の除去方法では、まず次亜塩素酸水で処理することで、バイオフィルム表面のＥＰＳを分解することができる。さらに、次亜塩素酸水に続いてバクテリオファージによる処理を行なうことで、次亜塩素酸水により分解された部分からバイオフィルム内にバクテリオファージが入り込み、効果的にバイオフィルム内の該バクテリオファージが標的とする特定の細菌を溶菌することができる。
また、バクテリオファージ単独の処理、或いは、次亜塩素酸水による処理を行なった後にバクテリオファージによる処理を行なう場合には、処理後の対象表面にバクテリオファージが残存する。バクテリオファージは人体への影響はないと考えられているものの、対象が食品及び食品と接触する器具等である場合には、残存しないことが望ましい。よって、上述した本実施形態の除去方法のうち、バクテリオファージによる処理を行なった後に次亜塩素酸水による処理を行なう、工程１Ａ及び工程１Ｂを含む方法が好ましい。工程１Ａ及び工程１Ｂを含む方法では、バクテリオファージ及び次亜塩素酸水の使用量を適宜調整した上で、バクテリオファージによる処理後に、次亜塩素酸水により処理を行なうことで、バイオフィルムに加えて、処理に用いたバクテリオファージを次亜塩素酸水によって除去することができ、次亜塩素酸水処理後の対象にはバクテリオファージが残存しない状態とすることができる。
さらに、本実施形態の除去方法は、非加熱の殺菌方法であることから、対象が食品である場合に、食品の外観、色、味、食感など変化させずに殺菌することができる。
さらに、本実施形態の除去方法は、非加熱の殺菌方法であることから、対象が食品である場合に、食品の外観、色、味、食感など変化させずに殺菌することができる。
本実施形態の除去方法において、バイオフィルムが形成されている対象としては、食品及び食品と接触する器具が好ましく例示される。食品としては、例えば、果物、野菜等の農作物；乳製品、卵、肉類；魚介類、及びこれらの加工品等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、加熱処理を施さずに、生食用として多く流通していることから、果物、野菜又はこれらの非加熱加工品（例えば、サラダ類やカットフルーツ等）が好ましい。
食品と接触する器具には、食品の加工調理器具、及び食品を加工調理する装置が包含される。本実施形態の除去方法は、熱に弱い素材からなる食品と接触する器具に好適に用いられる。
食品と接触する器具には、食品の加工調理器具、及び食品を加工調理する装置が包含される。本実施形態の除去方法は、熱に弱い素材からなる食品と接触する器具に好適に用いられる。
次いで、本実施形態の除去方法を構成する各工程について以下に詳細を説明する。なお、工程１Ｂ及び工程２Ｂは、工程１Ａ及び工程２Ａの操作の順番を逆に実施しており、工程１Ｂは工程２Ａに、工程２Ｂは工程１Ａに対応している。よって、工程１Ｂ及び工程２Ｂの詳細の説明は割愛する。
［工程１Ａ］
工程１Ａでは、バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる。
工程１Ａでは、バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる。
バクテリオファージは、バイオフィルム内に含まれる細菌に対して抗菌活性を有するものを適宜選択して、用いることができる。
バイオフィルム内に含まれ、バクテリオファージによる殺菌対象となる細菌としては、食品に一般的に付着している菌が挙げられるが、中でも、病原性細菌が好ましい。本明細書において、病原性細菌とは、ヒトや、イヌ、ネコ等のペット等の動物に感染して疾患や病的症状の起源を与える細菌であって、かつ、バクテリオファージの宿主となってそのバクテリオファージによって食菌破壊される細菌を意味する。病原性細菌として具体的には、例えば、病原性大腸菌（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（腸管病原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管集合性大腸菌を含む）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌａ）属菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属菌、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
腸管出血性大腸菌としては、Ｏ２６、Ｏ９１、Ｏ１１１、Ｏ１５７が挙げられ、バクテリオファージによる殺菌対象となる腸管出血性大腸菌としては、Ｏ１５７が好ましい。なお、大腸菌は、菌体の表面にあるＯ抗原（細胞壁由来）とＨ抗原（べん毛由来）により細かく分類されており、Ｏ抗原については、現在約１８０に分類されている。例えば、Ｏ１５７とは、Ｏ抗原として１５７番目に発見されたものを持つという意味である。さらに細かく分類すると、Ｏ１５７でも、毒素（ベロ毒素）を産生して溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）等の重篤な症状を起こすものとしては、Ｈ抗原がＨ７（Ｏ１５７：Ｈ７）とＨ－（マイナス）のもの（Ｏ１５７：Ｈ－）の２種類が挙げられる。中でも、バクテリオファージによる殺菌対象となる腸管出血性大腸菌としては、Ｏ１５７：Ｈ７が好ましい。
大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージとしては、例えば、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ等が挙げられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム。
上記（ａ）のゲノムにおいて、配列番号１で表される塩基配列からなるゲノムを有するバクテリオファージは、後述する実施例に示すように、発明者がウシの腸サンプルから分離したバクテリオファージＦＰ４３（以下、単に「ファージＦＰ４３株」と称する場合がある）である。ＴＥＭ観察及びゲノムＤＮＡのシーケンス結果に基づいて、ファージＦＰ４３株は、合計２６６のＯＲＦ及び２つのｔＲＮＡ（Ｍｅｔ、Ａｒｇ）を含み、病原性因子に関連する遺伝子を含まない、１６９，２４８ｂｐからなるｄｓＤＮＡゲノム（配列番号１で表される塩基配列からなるゲノム）を有するＭｙｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーである。ファージＦＰ４３株は、１５分間の短い潜伏期間と９８ＰＦＵ／細胞の大きなバーストサイズを有し、４℃以上６０℃以下の範囲の温度とｐＨ４以上９以下で優れた安定性を示す。また、ファージＦＰ４３株は、腸内出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７及びその他大腸菌群（例えば、大腸菌Ｏ９１等）に対する抗菌活性を有することが確かめられている。
上記（ｂ）のゲノムについて、配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されていてもよい塩基の数は、１個以上３０個以下が好ましく、１個以上２０個以下がより好ましく、１個以上１０個以下がさらにより好ましく、１個以上５個以下がさらに好ましく、１個以上３個以下がよりさらに好ましく、１個以上２個以下が特に好ましく、１個以上が最も好ましい。
上記（ｃ）のゲノムにおいて、配列番号１で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９９％以上１００％未満であることがより好ましく、９９．５％以上１００％未満であることがさらにより好ましく、９９．９％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９９．９８％以上１００％未満であることがよりさらに好ましく、９９．９９％以上１００％未満であることが特に好ましく、９９．９９９％以上１００％未満であることが最も好ましい。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
上記（ｄ）のゲノムにおいて、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍの塩化ナトリウム，０．３Ｍのクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１質量％のＮ－ラウロイルサルコシン、０．０２質量％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２質量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０質量％のホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下の温度下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が挙げられる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％のＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％のＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
工程１で用いられるバクテリオファージは、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含むことが好ましく、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含むことがより好ましく、配列番号１で表される塩基配列と９０％以上１００％以下の同一性を有する配列を含むゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含むことがさらに好ましく、配列番号１で表される塩基配列と９９％以上１００％以下の同一性を有する配列を含むゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含むことがよりさらに好ましく、配列番号１で表される塩基配列と９９．９９９％以上１００％以下の同一性を有する配列を含むゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含むことが特に好ましく、配列番号１で表される塩基配列を含むゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、すなわち、ファージＦＰ４３株を含むことが最も好ましい。
大腸菌に対する抗菌活性を有するその他のバクテリオファージとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるゲノムを有するＴ偶数ウイルスＰＥ３７株、後述する実施例で用いたＰＥ１９６株や、その他の公知のＴ系ファージ（例えば、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７等）、ΦＸ－１７４、λ、ΦＸ８０、Ｑβ、Ｐ１等が挙げられる。
サルモネラ属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージとしては、例えば、配列番号３で表される塩基配列からなるゲノムを有するバクテリオファージＰＳ５株（参考文献１：Hoang MC et al., “Isolation, characterization and application of a polyvalent phage capable of controlling Salmonella and Escherichia coli O157:H7 in different food matrices.”, Food Research International, Vol.131, 108977, 2020, https://doi.org/10.1016/j.foodres.2020.108977.）、後述する実施例で用いたＳＥＧ５株等が挙げられる。
カンピロバクター属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージとしては、例えば、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）に対する抗菌活性を有するバクテリオファージＣＡＭＰ２１株（参考文献２：Furuta M et al., “Characterization and Application of Lytic Bacteriophages against Campylobacter jejuni Isolated from Poultry in Japan.”, Biocontrol Science, Vol. 22, No. 4, pp. 213-221, 2017.）等が挙げられる。
黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージとしては、例えば、配列番号４で表される塩基配列からなるゲノムを有するバクテリオファージＳＡ４６－ＣＴＨ２株（参考文献３：Hoang MC et al., “Isolation and application of bacteriophages alone or in combination with nisin against planktonic and biofilm cells of Staphylococcus aureus.”, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 104, pp. 5145-5158, 2020, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10581-4.）等が挙げられる。
カンピロバクター属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージとしては、例えば、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）に対する抗菌活性を有するバクテリオファージＣＡＭＰ２１株（参考文献２：Furuta M et al., “Characterization and Application of Lytic Bacteriophages against Campylobacter jejuni Isolated from Poultry in Japan.”, Biocontrol Science, Vol. 22, No. 4, pp. 213-221, 2017.）等が挙げられる。
黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージとしては、例えば、配列番号４で表される塩基配列からなるゲノムを有するバクテリオファージＳＡ４６－ＣＴＨ２株（参考文献３：Hoang MC et al., “Isolation and application of bacteriophages alone or in combination with nisin against planktonic and biofilm cells of Staphylococcus aureus.”, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 104, pp. 5145-5158, 2020, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10581-4.）等が挙げられる。
バクテリオファージとしては、上述したもののうち特定の細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを１種単独で用いてもよく、異なる細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ２種以上組み合わせて用いてもよい。また、特定の細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージについて、１種（１株）を単独で用いてもよく、２種以上の複数株を組み合わせて用いてもよいが、特定の細菌を確実に殺菌できることから、特定の細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージについて２種以上の複数株を組み合わせて用いることが好ましい。
中でも、より多種類の細菌への抗菌活性を期待できることから、異なる細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを２種以上組み合わせて用いることが好ましい。
また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、大腸菌以外の菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがより好ましい。また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、サルモネラ属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、リステリア属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、カンピロバクター属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、及び黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージからなる群より選ばれる１種以上のバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがさらに好ましい。
中でも、より多種類の細菌への抗菌活性を期待できることから、異なる細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを２種以上組み合わせて用いることが好ましい。
また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、大腸菌以外の菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがより好ましい。また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、サルモネラ属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、リステリア属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、カンピロバクター属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、及び黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージからなる群より選ばれる１種以上のバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがさらに好ましい。
殺菌対象が野菜又は果物である場合に、これらの対象は、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌、及びリステリア菌によって汚染されている可能性が高い。そのため、腸管出血性大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、サルモネラ属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、及びリステリア属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを組み合わせて用いることが好ましい。また、これら特定の細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージは、それぞれ２種以上の複数株のファージを組み合わせて用いることがより好ましい。
対象へのバクテリオファージの接触方法としては、例えば、噴霧、霧吹き、浸漬（ディッピング、ソーキング等）等が挙げられる。中でも、噴霧、又は霧吹きが好ましい。このときバクテリオファージは、例えば、水等に懸濁した状態で用いることができる。
バクテリオファージを水等に懸濁した状態で用いる場合に、バクテリオファージを含む溶液中のバクテリオファージの濃度は、例えば、１．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬ以上１．０×１０１１ＰＦＵ／ｍＬ以下程度とすることができ、５．０×１０８ＰＦＵ／ｍＬ以上５．０×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ以下程度とすることができ、１．０×１０９ＰＦＵ／ｍＬ以上１．０×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ以下程度とすることができる。
複数種類（複数株）のバクテリオファージを組み合わせて用いる場合には、１種類（１株）のバクテリオファージの濃度を上記範囲とすることができる。
複数種類（複数株）のバクテリオファージを組み合わせて用いる場合には、１種類（１株）のバクテリオファージの濃度を上記範囲とすることができる。
バクテリオファージによる処理は、低温で用いることが好ましい。低温とは、細菌が増殖しにくい程度に低い温度を意味し、５℃以上２５℃以下であることが好ましく、６℃以上２０℃以下であることがより好ましく、７℃以上１５℃以下であることがさらに好ましく、１０℃程度であることが特に好ましい。処理温度が上記範囲内であることにより、細菌の増殖を抑制しながら、バクテリオファージが増殖し、特定の細菌に対する抗菌活性を高く保つことができるため、効果的にバイオフィルムを分解及び除去することができる。
バクテリオファージによる処理時間は、対象のバイオフィルムに含まれる細菌の量に応じて適宜調整することができる。バクテリオファージの増殖時間を考慮して、例えば、１２時間以上６０時間以下とすることができ、２０時間以上４８時間以下とすることができ、２４時間程度とすることができる。
［工程２Ａ］
工程２Ａでは、バクテリオファージによる処理後の対象に、次亜塩素酸水を接触させる。
工程２Ａでは、バクテリオファージによる処理後の対象に、次亜塩素酸水を接触させる。
本明細書において、次亜塩素酸水とは、殺菌料の一種であり、塩酸又は塩化ナトリウム水溶液を電解することにより得られる次亜塩素酸を主成分とする水溶液を意味する。日本においては、平成１４年６月に食品添加物として指定されており、使用基準及び成分規格が定められている。
次亜塩素酸水には、強酸性次亜塩素酸水（強酸性電解水ともいう）、弱酸性次亜塩素酸水（弱酸性電解水ともいう）、及び微酸性次亜塩素酸水（微酸性電解水ともいう）が存在し、いずれを用いてもよいが、微酸性次亜塩素酸水を用いることが好ましい。
強酸性次亜塩素酸水は、０．２ｖ／ｗ％以下の塩化ナトリウム水溶液を有隔膜電解槽（隔膜で隔てられた陽極及び陰極により構成された槽）内で電解して、陽極側から得られる水溶液である。強酸性次亜塩素酸水における有効塩素含有量は２０ｍｇ／ｋｇ以上６０ｍｇ／ｋｇ以下であり、ｐＨは２．７以下である。
弱酸性次亜塩素酸水は、適切な濃度の塩化ナトリウム水溶液を有隔膜電解槽内で電解して、陽極側から得られる水溶液、又は、陽極から得られる水溶液に陰極から得られる水溶液を加えたものである。弱酸性次亜塩素酸水における有効塩素含有量は１０ｍｇ／ｋｇ以上６０ｍｇ／ｋｇ以下であり、ｐＨは２．７以上５．０以下である。
微酸性次亜塩素酸水は、塩酸及び必要に応じ塩化ナトリウム水溶液を加え適切な濃度に調整した水溶液を無隔膜電解槽（隔膜で隔てられていない陽極及び陰極で構成された槽）内で電解して得られる水溶液である。微酸性次亜塩素酸水における有効塩素含有量は１０ｍｇ／ｋｇ以上８０ｍｇ／ｋｇ以下であり、ｐＨは５．０以上６．５以下である。
強酸性次亜塩素酸水は、０．２ｖ／ｗ％以下の塩化ナトリウム水溶液を有隔膜電解槽（隔膜で隔てられた陽極及び陰極により構成された槽）内で電解して、陽極側から得られる水溶液である。強酸性次亜塩素酸水における有効塩素含有量は２０ｍｇ／ｋｇ以上６０ｍｇ／ｋｇ以下であり、ｐＨは２．７以下である。
弱酸性次亜塩素酸水は、適切な濃度の塩化ナトリウム水溶液を有隔膜電解槽内で電解して、陽極側から得られる水溶液、又は、陽極から得られる水溶液に陰極から得られる水溶液を加えたものである。弱酸性次亜塩素酸水における有効塩素含有量は１０ｍｇ／ｋｇ以上６０ｍｇ／ｋｇ以下であり、ｐＨは２．７以上５．０以下である。
微酸性次亜塩素酸水は、塩酸及び必要に応じ塩化ナトリウム水溶液を加え適切な濃度に調整した水溶液を無隔膜電解槽（隔膜で隔てられていない陽極及び陰極で構成された槽）内で電解して得られる水溶液である。微酸性次亜塩素酸水における有効塩素含有量は１０ｍｇ／ｋｇ以上８０ｍｇ／ｋｇ以下であり、ｐＨは５．０以上６．５以下である。
工程２で用いられる微酸性次亜塩素酸水における有効塩素含有量は上記範囲内（１０ｍｇ／ｋｇ以上８０ｍｇ／ｋｇ以下）のものであればよく、２０ｍｇ／ｋｇ（質量ｐｐｍ）以上６０ｍｇ／ｋｇ（質量ｐｐｍ）以下が好ましく、２０ｍｇ／ｋｇ以上５０ｍｇ／ｋｇ以下がより好ましく、２０ｍｇ／ｋｇ以上４０ｍｇ／ｋｇ以下がさらに好ましい。
工程２で用いられる微酸性次亜塩素酸水のｐＨは上記範囲内（５．０以上６．５以下）のものであればよく、５．０以上６．３以下が好ましく、５．０以上６．０以下がより好ましく、５．０以上５．５以下がさらに好ましい。
対象への次亜塩素酸水の接触方法としては、例えば、噴霧、霧吹き、浸漬（ディッピング、ソーキング等）等が挙げられる。中でも、浸漬（ディッピング、又はソーキング）が好ましい。
次亜塩素酸水の温度は、対象が熱による変性を受けない温度であればよく、例えば、５℃以上１００℃未満とすることができ、１０℃以上１００℃未満であることが好ましく、２０℃以上１００℃未満であることがより好ましく、４０℃以上１００℃未満であることがさらにより好ましく、４０℃以上８０℃以下であることがさらに好ましく、４５℃以上７０℃以下であることがよりさらに好ましく、４５℃以上６０℃以下であることが特に好ましく、５０℃程度であることが最も好ましい。次亜塩素酸水の温度が上記範囲内であることにより、次亜塩素酸水をバイオフィルム内に浸透させて、効果的にバイオフィルムを分解及び除去することができる。
また、対象が野菜又は果物であって、次亜塩素酸水の温度が４０℃以上１００℃未満程度（好ましくは、４０℃以上８０℃以下、より好ましくは４５℃以上７０℃以下、特に好ましくは４５℃以上６０℃以下、最も好ましくは５０℃程度）である場合に、野菜又は果物の細胞内に含まれる褐変の原因酵素であるポリフェノールオキシターゼ（空気に触れることで色素成分であるポリフェノールと反応し褐変成分を生成する）を失活させることができ、バイオフィルムの除去に加えて、野菜又は果物の経時的な褐変を効果的に防止する（色止めする）ことができる。すなわち、次亜塩素酸水の温度を上記の範囲内に調製することで、ポリフェノール及びポリフェノールオキシターゼを細胞内に含む野菜又は果物の褐変防止（色止め）を行うことができる。
次亜塩素酸水による処理時間は、対象のバイオフィルムに含まれる細菌の量に応じて適宜調整することができる。また、処理温度が比較的高温（４０℃以上１００℃未満程度）である場合には、処理時間を比較的短時間とすることが好ましく、１分間以上１０分間以下であることがより好ましく、３分間以上７分間以下であることがさらに好ましく、５分間程度であることが特に好ましい。
［その他の工程］
工程１Ａの前、工程１Ａ及び工程２Ａの間、及び工程２Ａの後に、洗浄工程を更に含むことができる。或いは、工程１Ｂの前、工程１Ｂ及び工程２Ｂの間、及び工程２Ｂの後に、洗浄工程を更に含むことができる。
洗浄工程では、水等の洗浄液を用いて対象を洗浄する。
工程１Ａの前、工程１Ａ及び工程２Ａの間、及び工程２Ａの後に、洗浄工程を更に含むことができる。或いは、工程１Ｂの前、工程１Ｂ及び工程２Ｂの間、及び工程２Ｂの後に、洗浄工程を更に含むことができる。
洗浄工程では、水等の洗浄液を用いて対象を洗浄する。
洗浄液は、工業量水等の水のみからなってもよく、界面活性剤等の食品及び食品と接触する器具に用いられる公知の洗浄成分をさらに含んでもよい。
例えば、工程１Ａの前に、或いは、工程１Ｂの前、洗浄工程を行うことで、対象に付着しており、容易に除去可能な土、泥、埃等の汚れを除去することができる。
また、例えば、工程１Ａ及び工程２Ａの間に洗浄工程を行うことで、工程１Ａで用いたバクテリオファージを除去して、続く工程２Ａにおける次亜塩素酸水による処理をより効果的に行うことができる。或いは、例えば、工程１Ｂ及び工程２Ｂの間に洗浄工程を行うことで、工程１Ｂで用いた次亜塩素酸水を除去して、続く工程２Ｂにおけるバクテリオファージによる処理をより効果的に行うことができる。
また、例えば、工程２Ａの後に、洗浄工程を行うことで、対象に残存する次亜塩素酸水を除去することができる。或いは、工程２Ｂの後に、洗浄工程を行うことで、対象に残存するバクテリオファージを除去することができる。
洗浄時間は、対象の種類や大きさに応じて適宜設定することができる。
洗浄温度は、対象の種類に応じて適宜設定することができ、食品の場合には、例えば、５℃以上２５℃以下程度の温度で行うことができる。
洗浄温度は、対象の種類に応じて適宜設定することができ、食品の場合には、例えば、５℃以上２５℃以下程度の温度で行うことができる。
＜バイオフィルムの除去キット＞
一実施形態において、本発明は、以下の２種類の殺菌組成物を備える、バイオフィルムの除去キットを提供する。
１種以上のバクテリオファージを含む第１の殺菌組成物；
次亜塩素酸水を含む第２の殺菌組成物。
一実施形態において、本発明は、以下の２種類の殺菌組成物を備える、バイオフィルムの除去キットを提供する。
１種以上のバクテリオファージを含む第１の殺菌組成物；
次亜塩素酸水を含む第２の殺菌組成物。
本実施形態の除去キットによれば、食品及び食品と接触する器具等の表面に形成されているバイオフィルム中の食中毒細菌を効果的に殺菌及び除去することができる。
本実施形態の除去キットにおいて、第１の殺菌組成物及び第２の殺菌組成物を使用する順番は特に限定されないが、第１の殺菌組成物及び第２の殺菌組成物はこの順で用いられることが好ましい。これにより、上記「バイオフィルムの除去方法」において説明したように、バクテリオファージ及び次亜塩素酸水の使用量を適宜調整した上で、バクテリオファージによる処理後に、次亜塩素酸水により処理を行なうため、バイオフィルムを効果的に除去することができ、さらに、次亜塩素酸水処理後の対象にはバクテリオファージが残存しない状態とすることができる。本実施形態の除去キットによるバイオフィルムの除去は、非加熱の殺菌方法であることから、対象が食品である場合に、食品の外観、色、味、食感など変化させずに殺菌することができる。
本実施形態の除去キットにおいて、バイオフィルムが形成されている対象としては、上記「バイオフィルムの除去方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、加熱処理を施さずに、生食用として多く流通していることから、果物、野菜又はこれらの非加熱加工品（例えば、サラダ類やカットフルーツ等）が好ましい。
［第１の殺菌組成物］
第１の殺菌組成物に含まれるバクテリオファージとしては、上記「バイオフィルムの除去方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、より多種類の細菌への抗菌活性を期待できることから、異なる細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを２種以上組み合わせて用いることが好ましい。
また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、大腸菌以外の菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがより好ましい。また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、サルモネラ属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、リステリア属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、カンピロバクター属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、及び黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージからなる群より選ばれる１種以上のバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがさらに好ましい。
第１の殺菌組成物に含まれるバクテリオファージとしては、上記「バイオフィルムの除去方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、より多種類の細菌への抗菌活性を期待できることから、異なる細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを２種以上組み合わせて用いることが好ましい。
また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、大腸菌以外の菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがより好ましい。また、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージと、サルモネラ属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、リステリア属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、カンピロバクター属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、及び黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージからなる群より選ばれる１種以上のバクテリオファージと、を組み合わせて用いることがさらに好ましい。
殺菌対象が野菜又は果物である場合に、これらの対象は、腸管出血性大腸菌、サルモネラ菌、及びリステリア菌によって汚染されている可能性が高い。そのため、腸管出血性大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、サルモネラ属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージ、及びリステリア属菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを組み合わせて用いることが好ましい。また、これら特定の細菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージは、それぞれ２種以上の複数株のファージを組み合わせて用いることがより好ましい。
第１の殺菌組成物のみでも十分に病原菌の殺菌効果を有するが、殺菌及び抗菌効果を有する食品添加物をさらに含んでいてもよい。抗菌効果を有する食品添加物としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸ブチル、プロピオン酸、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ポリリン酸、ポリリジン、しらこたん白抽出物、エタノール、グリシン、グリセリン脂肪酸エステル、酢酸ナトリウム、チアミンラウリル硫酸塩、カンゾウ油性抽出物、キトサン、モウソウチク抽出物、リゾチーム、ローズマリー抽出物等が挙げられる。上記の食品添加物は、「厚生省告示第３７０号 食品、添加物等の規格基準」等の国内規制を順守する形で用いればよい。
第１の殺菌組成物を長期的に安定して保存するために、食品に使用可能である化合物を更に含んでいてもよい。このような化合物としては、ナトリウム、カリウム等の塩類を含む緩衝剤；Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃａ等の微量の金属；グリセロール（終濃度０．００１～５質量％程度、好ましくは０．１～１％質量％）；例えばマルトース、グルコース等の糖類；グリシン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ｄｌ－α－トコフェロール、没食子酸プロピル、γ－オリザノール、カンゾウ油性抽出物、ｄ－α－トコフェロール、フェルラ酸、ミックストコフェロール、ローズマリー抽出物等の酸化防止剤等が挙げられる。
第１の殺菌組成物は、バクテリオファージが培地に懸濁されたものであってもよく、バクテリオファージの懸濁液をそのまま凍結したものであってもよく、バクテリオファージの懸濁液に公知の凍結保護剤を添加して凍結乾燥したものであってもよく、Ｌ－乾燥法により乾燥させたものであってもよい。保存安定性に優れることから、バクテリオファージの懸濁液に公知の凍結保護剤を添加して凍結乾燥したもの又はＬ－乾燥法により乾燥させたものであることが好ましい。
［第２の殺菌組成物］
第２の殺菌組成物に含まれる次亜塩素酸水としては、上記「バイオフィルムの除去方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、次亜塩素酸水としては、微酸性次亜塩素酸水が好ましい。
第２の殺菌組成物に含まれる次亜塩素酸水としては、上記「バイオフィルムの除去方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
中でも、次亜塩素酸水としては、微酸性次亜塩素酸水が好ましい。
［その他の構成］
本実施形態の除去キットは、第１の殺菌組成物又は第２の殺菌組成物を噴霧又は霧吹きするためのスプレー等の噴霧装置を更に含むことができる。
本実施形態の除去キットは、第１の殺菌組成物又は第２の殺菌組成物を噴霧又は霧吹きするためのスプレー等の噴霧装置を更に含むことができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
１．菌株及び培養条件
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、及び、大腸菌Ｏ９１：Ｈ－は、福岡市衛生環境研究所（日本、福岡）から提供された。各細菌株は、マイクロバンクにて－８０℃で保存した。
使用する前に、各菌株をトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ；Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした後、４℃で維持した。
１．菌株及び培養条件
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、及び、大腸菌Ｏ９１：Ｈ－は、福岡市衛生環境研究所（日本、福岡）から提供された。各細菌株は、マイクロバンクにて－８０℃で保存した。
使用する前に、各菌株をトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ；Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした後、４℃で維持した。
２．バクテリオファージの調製
バクテリオファージＦＰ４３はウシの腸サンプルから分離されたものであり、福岡市衛生環境研究所（福岡、日本）から提供された。ＴＥＭ観察及びゲノムＤＮＡのシーケンス結果に基づいて、ファージＦＰ４３は、合計２６６のＯＲＦ及び２つのｔＲＮＡ（Ｍｅｔ、Ａｒｇ）を含み、病原性因子に関連する遺伝子を含まない、１６９，２４８ｂｐからなるｄｓＤＮＡゲノム（配列番号１で表される塩基配列からなるゲノム）を有するＭｙｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーである。ファージＦＰ４３は、１５分間の短い潜伏期間と９８ＰＦＵ／細胞の大きなバーストサイズを有し、４℃以上６０℃以下の範囲の温度とｐＨ４以上９以下で優れた安定性を示す。また、ファージＦＰ４３は、腸内出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７及びその他の大腸菌（例えば、大腸菌Ｏ９１等）に対する抗菌活性を有することが確かめられている。
バクテリオファージＦＰ４３はウシの腸サンプルから分離されたものであり、福岡市衛生環境研究所（福岡、日本）から提供された。ＴＥＭ観察及びゲノムＤＮＡのシーケンス結果に基づいて、ファージＦＰ４３は、合計２６６のＯＲＦ及び２つのｔＲＮＡ（Ｍｅｔ、Ａｒｇ）を含み、病原性因子に関連する遺伝子を含まない、１６９，２４８ｂｐからなるｄｓＤＮＡゲノム（配列番号１で表される塩基配列からなるゲノム）を有するＭｙｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーである。ファージＦＰ４３は、１５分間の短い潜伏期間と９８ＰＦＵ／細胞の大きなバーストサイズを有し、４℃以上６０℃以下の範囲の温度とｐＨ４以上９以下で優れた安定性を示す。また、ファージＦＰ４３は、腸内出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７及びその他の大腸菌（例えば、大腸菌Ｏ９１等）に対する抗菌活性を有することが確かめられている。
ファージストックは、二重平板法を使用して調製した（Ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。具体的には、ファージ懸濁液（１００μＬ）をその宿主培養物（１００μＬ）と３７℃で２０分間混合した。次に、混合物を４８℃、４ｍＬの溶融寒天に加え、ＴＳＡプレートに注ぎ、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、５ｍＬのルリアブロス（ＬＢ、ベクトン、ディキンソンアンドカンパニー、スパークス、メリーランド州、米国）を上部寒天に加え、穏やかに振とうしながら３７℃で６時間インキュベートした。次に、ＬＢブロス及びファージ粒子を含むトップアガーを遠心分離管に収集した。チューブを１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。液体の上清を回収し、メンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ、メルクミリポア、アイルランド）で濾過した。濾液のファージ力価は、二重平板法を使用して決定され、濾液は、さらなる使用のためにファージストックとして４℃で保存した。
３．ファージＦＰ４３及び微酸性次亜塩素酸水を用いたレタスのバイオフィルムの除去試験
２ｃｍ角にカットしたレタスの葉を水で洗浄した。次いで、レタスに、上記「１．菌株及び培養条件」で予め培養した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、及び、その他の大腸菌（大腸菌Ｏ９１：Ｈ－）を１０６ＣＦＵずつ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のレタスを水で洗浄し、ファージＦＰ４３を含む溶液（１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して１０℃で２４時間保存した。次いで、ファージＦＰ４３による処理後のレタスを、２０℃又は５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：２２質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ：５．０）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のレタスを水で３回洗浄し、生菌数を測定した。生菌数の測定方法としては、洗浄後のレタスの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７（関東化学、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７上で大腸菌Ｏ１５７は紫色のコロニーを、大腸菌Ｏ１５７以外の大腸菌（大腸菌Ｏ９１）は青いコロニーを形成することから、これらのコロニー数を区別して計測し、それぞれの生菌数を算出した。なお、対照として、未処理のもの；Ｓａｌｉｎｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（ＳＭ）緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００８Ｍ ＭｇＳＯ４、及び０．０１ｗ／ｖ％ｇｅｌａｔｉｎ含有０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５））で処理した後、水で洗浄したもの；ＳＭ緩衝液で処理した後、２０℃の微酸性次亜塩素酸水で処理したもの；ＳＭ緩衝液で処理した後、５０℃の微酸性次亜塩素酸水で処理したもの；ファージＦＰ４３で処理した後、水で洗浄したものも準備し、同様に生菌数を算出した。
結果を図１に示す。図１において、「ＳＭ」とはＳａｌｉｎｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ 緩衝液の略であり、「ＳＡＥＷ」は微酸性次亜塩素酸水を示す。
２ｃｍ角にカットしたレタスの葉を水で洗浄した。次いで、レタスに、上記「１．菌株及び培養条件」で予め培養した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、及び、その他の大腸菌（大腸菌Ｏ９１：Ｈ－）を１０６ＣＦＵずつ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のレタスを水で洗浄し、ファージＦＰ４３を含む溶液（１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して１０℃で２４時間保存した。次いで、ファージＦＰ４３による処理後のレタスを、２０℃又は５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：２２質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ：５．０）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のレタスを水で３回洗浄し、生菌数を測定した。生菌数の測定方法としては、洗浄後のレタスの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７（関東化学、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７上で大腸菌Ｏ１５７は紫色のコロニーを、大腸菌Ｏ１５７以外の大腸菌（大腸菌Ｏ９１）は青いコロニーを形成することから、これらのコロニー数を区別して計測し、それぞれの生菌数を算出した。なお、対照として、未処理のもの；Ｓａｌｉｎｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（ＳＭ）緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００８Ｍ ＭｇＳＯ４、及び０．０１ｗ／ｖ％ｇｅｌａｔｉｎ含有０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５））で処理した後、水で洗浄したもの；ＳＭ緩衝液で処理した後、２０℃の微酸性次亜塩素酸水で処理したもの；ＳＭ緩衝液で処理した後、５０℃の微酸性次亜塩素酸水で処理したもの；ファージＦＰ４３で処理した後、水で洗浄したものも準備し、同様に生菌数を算出した。
結果を図１に示す。図１において、「ＳＭ」とはＳａｌｉｎｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ 緩衝液の略であり、「ＳＡＥＷ」は微酸性次亜塩素酸水を示す。
図１に示すように、ファージＦＰ４３及び微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理することで、大腸菌（特に、病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）及びレタスに存在する未知の菌の生菌数の減少が確認された。また、ファージＦＰ４３及び５０℃微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理した場合に、大腸菌を含む全ての菌の生菌数の減少が特に顕著であった。
［実施例２］
１．菌株及び培養条件
腸管出血性大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ Ｎｏ．１９６株（以下、単に「Ｎｏ．１９６株」と称する場合がある）は福岡市衛生環境研究所（日本、福岡）から提供された。Ｎｏ．１９６株は、マイクロバンクにて－８０℃で保存した。
使用する前に、Ｎｏ．１９６株をトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ；Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした後、４℃で維持した。
１．菌株及び培養条件
腸管出血性大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ Ｎｏ．１９６株（以下、単に「Ｎｏ．１９６株」と称する場合がある）は福岡市衛生環境研究所（日本、福岡）から提供された。Ｎｏ．１９６株は、マイクロバンクにて－８０℃で保存した。
使用する前に、Ｎｏ．１９６株をトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ；Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした後、４℃で維持した。
２．バクテリオファージの調製
バクテリオファージＰＥ１９６は牛肉より腸管出血性大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ Ｎｏ．１９６株を宿主として分離された。実施例１で用いたファージＦＰ４３とは異なる宿主域のファージである。ファージストックは、宿主としてＮｏ．１９６株を用いた以外は、実施例１の「２．バクテリオファージの調製」と同様の方法を用いて調製した。
バクテリオファージＰＥ１９６は牛肉より腸管出血性大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ Ｎｏ．１９６株を宿主として分離された。実施例１で用いたファージＦＰ４３とは異なる宿主域のファージである。ファージストックは、宿主としてＮｏ．１９６株を用いた以外は、実施例１の「２．バクテリオファージの調製」と同様の方法を用いて調製した。
３．ファージＰＥ１９６及び微酸性次亜塩素酸水を用いたキャベツのバイオフィルムの除去試験
２ｃｍ角にカットしたキャベツの葉を水で洗浄した。次いで、キャベツに、上記で予め培養したＮｏ．１９６株を１０６ＣＦＵ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のキャベツを水で洗浄し、ファージＰＥ１９６を含む溶液（１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して２５℃で２時間保存した。次いで、ファージによる処理後のキャベツを水で２回洗浄後、良く水分を除去し、５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：４０質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ５．０）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のキャベツを水で３回洗浄し、生菌数を測定した。生菌数の測定方法としては、洗浄後のキャベツの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７（関東化学、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７上での紫色のコロニー数から腸管出血性大腸菌数を算出した。なお、対照として、未処理のもの；Ｓａｌｉｎｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（ＳＭ）緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００８Ｍ ＭｇＳＯ４、及び０．０１ｗ／ｖ％ｇｅｌａｔｉｎ含有０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５））で処理した後、水で洗浄したもの；ＳＭ緩衝液で処理した後、５０℃の微酸性次亜塩素酸水で処理したもの；ファージＰＥ１９６で処理した後、水で洗浄したものも準備し、同様に生菌数を算出した。
結果を図２に示す。図２において、「ＳＭ緩衝液」とはＳＭ緩衝液の略であり、「ＳＡＥＷ」は微酸性次亜塩素酸水を示す。
２ｃｍ角にカットしたキャベツの葉を水で洗浄した。次いで、キャベツに、上記で予め培養したＮｏ．１９６株を１０６ＣＦＵ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のキャベツを水で洗浄し、ファージＰＥ１９６を含む溶液（１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して２５℃で２時間保存した。次いで、ファージによる処理後のキャベツを水で２回洗浄後、良く水分を除去し、５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：４０質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ５．０）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のキャベツを水で３回洗浄し、生菌数を測定した。生菌数の測定方法としては、洗浄後のキャベツの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７（関東化学、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７上での紫色のコロニー数から腸管出血性大腸菌数を算出した。なお、対照として、未処理のもの；Ｓａｌｉｎｅ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（ＳＭ）緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．００８Ｍ ＭｇＳＯ４、及び０．０１ｗ／ｖ％ｇｅｌａｔｉｎ含有０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５））で処理した後、水で洗浄したもの；ＳＭ緩衝液で処理した後、５０℃の微酸性次亜塩素酸水で処理したもの；ファージＰＥ１９６で処理した後、水で洗浄したものも準備し、同様に生菌数を算出した。
結果を図２に示す。図２において、「ＳＭ緩衝液」とはＳＭ緩衝液の略であり、「ＳＡＥＷ」は微酸性次亜塩素酸水を示す。
図２に示すように、ファージＰＥ１９６及び５０℃微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理することで、ファージ又は微酸性次亜塩素酸水による単独処理と比較して、病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７及びキャベツに存在する未知の菌の生菌数の顕著な減少が確認された。
また、ファージＰＥ１９６及び５０℃微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理した２ｃｍ角のキャベツ葉１枚あたりのファージの残存数を計測したところ、５．０×１０４ＰＦＵ／枚程度のファージの残存が確認された。
また、ファージＰＥ１９６及び５０℃微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理した２ｃｍ角のキャベツ葉１枚あたりのファージの残存数を計測したところ、５．０×１０４ＰＦＵ／枚程度のファージの残存が確認された。
［実施例３］
１．菌株及び培養条件
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ３３１３（以下、単に「ＮＢＲＣ３３１３」と称する場合がある）は独立行政法人製品評価技術基盤機構（東京、日本）より購入した。ＮＢＲＣ３３１３は、マイクロバンクにて－８０℃で保存した。
使用する前に、ＮＢＲＣ３３１３をトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ；Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした後、４℃で維持した。
１．菌株及び培養条件
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ３３１３（以下、単に「ＮＢＲＣ３３１３」と称する場合がある）は独立行政法人製品評価技術基盤機構（東京、日本）より購入した。ＮＢＲＣ３３１３は、マイクロバンクにて－８０℃で保存した。
使用する前に、ＮＢＲＣ３３１３をトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ；Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした後、４℃で維持した。
２．バクテリオファージの調製
バクテリオファージＳＥＧ５は鶏肉よりＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ３３１３を宿主として分離された。ファージストックは、宿主としてＮＢＲＣ３３１３を用いた以外は、実施例１の「２．バクテリオファージの調製」と同様の方法を用いて調製した。
バクテリオファージＳＥＧ５は鶏肉よりＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ３３１３を宿主として分離された。ファージストックは、宿主としてＮＢＲＣ３３１３を用いた以外は、実施例１の「２．バクテリオファージの調製」と同様の方法を用いて調製した。
３．ファージＳＥＧ５及び微酸性次亜塩素酸水を用いたキャベツのバイオフィルムの除去試験
２ｃｍ角にカットしたキャベツの葉を水で洗浄した。次いで、キャベツに、上記で予め培養したＮＢＲＣ３３１３を１０６ＣＦＵ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のキャベツを水で洗浄し、ファージＳＥＧ５を含む溶液（１０９ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して２５℃で２時間保存した。次いで、ファージによる処理後のキャベツを水で２回洗浄後、良く水分を除去し、５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：４０質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ５．０）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のキャベツを水で３回洗浄し、生菌数を測定した。生菌数の測定方法としては、洗浄後のキャベツの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＤＨＬ（Ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｄｅ ｌａｃｔｏｓｅ）寒天培地（日水製薬、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＤＨＬ寒天培地上の黒いコロニー数からサルモネラ菌数を算出した。
２ｃｍ角にカットしたキャベツの葉を水で洗浄した。次いで、キャベツに、上記で予め培養したＮＢＲＣ３３１３を１０６ＣＦＵ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のキャベツを水で洗浄し、ファージＳＥＧ５を含む溶液（１０９ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して２５℃で２時間保存した。次いで、ファージによる処理後のキャベツを水で２回洗浄後、良く水分を除去し、５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：４０質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ５．０）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のキャベツを水で３回洗浄し、生菌数を測定した。生菌数の測定方法としては、洗浄後のキャベツの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＤＨＬ（Ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｄｅ ｌａｃｔｏｓｅ）寒天培地（日水製薬、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＤＨＬ寒天培地上の黒いコロニー数からサルモネラ菌数を算出した。
図３に示すように、ファージＳＥＧ５及び５０℃微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理することで、ファージ又は微酸性次亜塩素酸水による単独処理と比較して、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＮＢＲＣ３３１３及びキャベツに存在する未知の菌の生菌数の顕著な減少が確認された。
また、ファージＳＥＧ５及び５０℃微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理した２ｃｍ角のキャベツ葉１枚あたりのファージの残存数を計測したところ、５．０×１０４ＰＦＵ／枚程度のファージの残存が確認された。
また、ファージＳＥＧ５及び５０℃微酸性次亜塩素酸水をこの順で用いて処理した２ｃｍ角のキャベツ葉１枚あたりのファージの残存数を計測したところ、５．０×１０４ＰＦＵ／枚程度のファージの残存が確認された。
［実施例４］
大腸菌株及びバクテリオファージについては、実施例１と同様のものを使用して、微酸性次亜塩素酸水による処理の後に、ファージＦＰ４３による処理を行なった。具体的な試験方法は以下に示すとおりである。
大腸菌株及びバクテリオファージについては、実施例１と同様のものを使用して、微酸性次亜塩素酸水による処理の後に、ファージＦＰ４３による処理を行なった。具体的な試験方法は以下に示すとおりである。
１．ファージＦＰ４３及び微酸性次亜塩素酸水を用いたレタスのバイオフィルムの除去試験
２ｃｍ角にカットしたレタスの葉を水で洗浄した。次いで、レタスに、上記「１．菌株及び培養条件」で予め培養した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、及び、その他の大腸菌（大腸菌Ｏ９１：Ｈ－）を１０５ＣＦＵずつ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のレタスを水で洗浄し、５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：４０質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ：５．５）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のレタスを水で３回洗浄し、ファージＦＰ４３を含む溶液（１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して１０℃で保存した。保存期間中の生菌数を次に示す方法で測定した。生菌数の測定方法としては、レタスの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７（関東化学、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７上で大腸菌Ｏ１５７は紫色のコロニーを、大腸菌Ｏ１５７以外の大腸菌（大腸菌Ｏ９１）は青いコロニーを形成することから、これらのコロニー数を区別して計測し、それぞれの生菌数を算出した。なお、対照として、５０℃の微酸性次亜塩素酸水の代わりに、水に５分間浸漬したもの；５０℃の微酸性次亜塩素酸水でのみ処理したもの（ファージＦＰ４３未処理）も準備し、同様に生菌数を算出した。
結果を図４に示す。図４において、「ＳＡＥＷ」は微酸性次亜塩素酸水を示す。
２ｃｍ角にカットしたレタスの葉を水で洗浄した。次いで、レタスに、上記「１．菌株及び培養条件」で予め培養した大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、及び、その他の大腸菌（大腸菌Ｏ９１：Ｈ－）を１０５ＣＦＵずつ接種して、１０℃で４８時間保存した。次いで、保存後のレタスを水で洗浄し、５０℃の微酸性次亜塩素酸水（有効塩素濃度：４０質量ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）、ｐＨ：５．５）に５分間浸漬した。次いで、浸漬後のレタスを水で３回洗浄し、ファージＦＰ４３を含む溶液（１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）を噴霧して１０℃で保存した。保存期間中の生菌数を次に示す方法で測定した。生菌数の測定方法としては、レタスの葉を１５ｍＬのＰＢＳ中でストマッカー処理（１分間、３０秒間休止後更に１分間、合計２分間）して破砕し、破砕液をＰＢＳにて１０倍連続希釈した。希釈液０．１ｍＬをＴＳＡ及びＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７（関東化学、日本）に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。培養後に計測したＴＳＡ上に形成されたコロニー数から全細菌の生菌数を算出した。ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｏ１５７上で大腸菌Ｏ１５７は紫色のコロニーを、大腸菌Ｏ１５７以外の大腸菌（大腸菌Ｏ９１）は青いコロニーを形成することから、これらのコロニー数を区別して計測し、それぞれの生菌数を算出した。なお、対照として、５０℃の微酸性次亜塩素酸水の代わりに、水に５分間浸漬したもの；５０℃の微酸性次亜塩素酸水でのみ処理したもの（ファージＦＰ４３未処理）も準備し、同様に生菌数を算出した。
結果を図４に示す。図４において、「ＳＡＥＷ」は微酸性次亜塩素酸水を示す。
図４に示すように、微酸性次亜塩素酸水で処理後には生菌数が２桁程度減少するが、この後、１０℃保存中に増加した。一方、微酸性次亜塩素酸水及びファージＦＰ４３をこの順で用いて処理することで、保存中に大腸菌（大腸菌Ｏ１５７及び大腸菌Ｏ９１：Ｈ－）の生菌数の減少が確認された。
以上のことから、微酸性次亜塩素酸水による処理及びバクテリオファージによる処理の順番は限定されず、いずれの順番であっても十分にバイオフィルムを除去し、各種食中毒菌の増殖を抑制できることが明らかとなった。
本実施形態によれば、食品及び食品と接触する器具等の表面に形成されているバイオフィルム中の食中毒細菌の殺菌及び除去に対して効果的な非加熱のバイオフィルムの除去方法及び除去キットを提供することができる。
Claims (12)
- バイオフィルムが形成されている対象にバクテリオファージを接触させる工程１Ａと、
バクテリオファージを接触させた後の前記対象に次亜塩素酸水を接触させる工程２Ａと、
をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法。 - バイオフィルムが形成されている対象に次亜塩素酸水を接触させる工程１Ｂと、
次亜塩素酸水を接触させた後の前記対象にバクテリオファージを接触させる工程２Ｂと、をこの順に含む、バイオフィルムの除去方法。 - 前記次亜塩素酸水の温度が４０℃以上１００℃未満である、請求項１又は２に記載のバイオフィルムの除去方法。
- 前記次亜塩素酸水が微酸性次亜塩素酸水である、請求項１～３のいずれか一項に記載のバイオフィルムの除去方法。
- 前記バクテリオファージが、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のバイオフィルムの除去方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム - 前記バクテリオファージが、大腸菌以外の菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のバイオフィルムの除去方法。
- 前記対象が、野菜又は果物である、請求項１～６のいずれか一項に記載のバイオフィルムの除去方法。
- １種以上のバクテリオファージを含む第１の殺菌組成物と、
次亜塩素酸水を含む第２の殺菌組成物と、
を備える、バイオフィルムの除去キット。 - 前記次亜塩素酸水が微酸性次亜塩素酸水である、請求項８に記載のバイオフィルムの除去キット。
- 前記バクテリオファージが、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのゲノムを有し、且つ、大腸菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージを含む、請求項８又は９に記載のバイオフィルムの除去キット。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むゲノム；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている配列を含むゲノム；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列を含むゲノム；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むゲノム - 前記バクテリオファージが、大腸菌以外の菌に対して抗菌活性を有するバクテリオファージを更に含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載のバイオフィルムの除去キット。
- バイオフィルムの除去対象が、野菜又は果物である、請求項８～１１のいずれか一項に記載のバイオフィルムの除去キット。
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2021
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