JP2021535359A - 単一サンプル中の低濃度及び高濃度タンパク質の濃度を決定する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】現在の方法では、分泌量の多いタンパク質が検出の直線範囲内にあることを確認するためにサンプル希釈を必要とするが、このような希釈により、多くの低濃度分析物の濃度が検出下限を下回る。【解決手段】 生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定するための方法が本明細書に開示される。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７２５００７号に対する優先権を主張する。

大きく異なるレベル（すなわち、少なくとも１０倍）で発現される同じサンプル中のタンパク質の濃度を決定するための現在の方法は不十分である。現在の方法では、分泌量の多いタンパク質が検出の直線範囲内にあることを確認するためにサンプル希釈を必要とするが、このような希釈により、多くの低濃度分析物の濃度が検出下限を下回る。

第１の態様では、本開示は、生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）アッセイプレート中の複数のサンプルウェルにおいて、（ｉ）第１の捕捉試薬及び（ｉｉ）生物学的サンプルをインキュベートすることであって、第１の捕捉試薬は表面に結合した第１の結合分子を含み、第１の結合分子は少なくとも１種の低濃度タンパク質に選択的に結合し、インキュベートすることは、生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質の第１の結合分子への結合を促進して、サンプルウェルの各々において第１の結合混合物を生成する時間及び条件下であり、各サンプルウェルが第１のサンプルウェルの容積を有する、インキュベートすることと、
（ｂ）サンプルウェルの各々において、第１の結合混合物を第２の捕捉試薬と混合することであって、第２の捕捉試薬は表面に結合した第２の結合分子を含み、第２の結合分子は少なくとも１種の高濃度タンパク質に選択的に結合し、混合することは、生物学的サンプル中の少なくとも１種の高濃度タンパク質の第２の結合分子への結合を促進して、サンプルウェルの各々において第２の結合混合物を生成する時間及び条件下であり、混合することは、各サンプルウェルの容積を増加させて、第１のサンプルウェルの容積よりも少なくとも１０倍大きい第２のサンプルウェルの容積を生成し、少なくとも１種の高濃度タンパク質は、少なくとも１種の低濃度タンパク質の予想濃度よりも、少なくとも１０倍高い濃度で生物学的サンプル中に存在すると予想される、混合することと、
（ｃ）生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定することと、を含む。

一実施形態では、アッセイプレートは、２つ以上の対照ウェルを含み、この方法は、
（ｄ）２つ以上の対照ウェル中で、（ｉ）第１の捕捉試薬ならびに（ｉｉ）既知量の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質を含むタンパク質標準をインキュベートすることであって、インキュベートすることは、タンパク質標準中の低濃度タンパク質の第１の結合分子への結合を促進して、対照ウェルの各々において第１の対照結合混合物を生成する時間及び条件下であり、各対照ウェルは第１の対照ウェルの容積を有する、インキュベートすることと、
（ｅ）２つ以上の対照ウェルの各々において、タンパク質標準中の高濃度タンパク質の第２の結合分子への結合を促進して、対照ウェルの各々において第２の対照結合混合物を生成する時間及び条件下で第１の対照結合混合物を第２の捕捉試薬とインキュベートすることであって、混合することは、各対照ウェルの容積を増加させて、第１の対照ウェルの容積より少なくとも１０倍大きい第２の対照ウェルの容積を生成する、インキュベートすることと、
（ｆ）各対照ウェルの第２の対照結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定することと、
（ｇ）各対照ウェルの第２の対照結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度に基づいて、各サンプルウェル中の第２の結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の決定された濃度を正規化することと、をさらに含む。

別の実施形態では、２つ以上の対照ウェルの異なる対照ウェルは、異なる濃度の低濃度タンパク質及び異なる濃度の高濃度タンパク質を有するタンパク質サンプルを含む。

さらなる実施形態では、各サンプルウェルの第２の結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の量を決定することは、
（ｉ）各サンプルウェルの第２の結合混合物を検出試薬と接触させることであって、検出試薬は第１の捕捉試薬に存在する結合分子及び第２の捕捉試薬の結合分子に結合し、接触させることは、検出試薬の第１の捕捉試薬に存在する結合分子及び第２の捕捉試薬中の結合分子への結合し、検出可能なタンパク質混合物を生成する時間及び条件下で行われる、接触させることと、
（ｉｉ）各サンプルウェル中で検出可能なタンパク質混合物を検出して、少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の量を決定することと、を含む。

様々な実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中の細胞又は細胞タンパク質抽出物を含む。別の実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、可溶性Ｆａｓ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質である。さらなる実施形態では、少なくとも１種の高濃度タンパク質は、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−ガンマ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、グランザイムＢ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、及びインターロイキン（ＩＬ−６）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質である。

一実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質はＩＬ−１７Ａを含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＩＦＮガンマを含む。別の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含む。

別の実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質はＩＬ−６を含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＩＦＮガンマ及びＴＮＦアルファを含む。さらなる実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含む。

一実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質はｓＦａｓを含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はグランザイムＢを含む。別の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含む。

一実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質はＩＬ−４を含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＩＬ−２及びＴＮＦアルファを含む。別の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＢ細胞、又はＢ細胞タンパク質抽出物を含む。

一実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質はＩＬ−１２を含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＴＮＦアルファを含む。別の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のマクロファージ、又はマクロファージタンパク質抽出物を含む。

一実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質はＧＭ−ＣＳＦを含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＩＬ−６を含む。別の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中の骨髄細胞、又は骨髄細胞タンパク質抽出物を含む。

一実施形態では、第１の結合分子及び第２の結合分子は抗体を含む。別の実施形態では、第１の捕捉試薬の表面はビーズを含み、第２の捕捉試薬の表面はビーズを含む。さらなる実施形態では、混合することは、各サンプルウェルの容積を増加させて、第１のサンプルウェルの容積よりも１０倍〜１００倍の間の大きな第２のサンプルウェルの容積を生成することを含む。別の実施形態では、各サンプルウェルの第２の結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の量の決定は、フローサイトメトリーによって実行される。

別の態様では、本開示は、任意の実施形態又は実施形態の組み合わせにおいて本明細書に開示されるような第１の捕捉試薬、第２の捕捉試薬、及び検出試薬を含むキットを提供する。

９６ウェルプレートにおける標準ウェルの左から右への配置（低濃度から高濃度へ）の模式図である。

引用されるすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。本明細書で使用される「及び」は、そうでないことが明確に言及されない限り、「又は」と交換可能に使用される。

本開示の任意の態様のすべての実施形態は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、組み合わせて使用することができる。

文脈上明らかに別段に必要でない限り、発明を実施するための形態及び特許請求の範囲全体を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（備える）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（備えている）」などの語は、排他的意味の対語としての包括的意味、又は網羅的意味で、すなわち、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（含むがそれらに限定されない）」の意味で解釈される。単数又は複数を使用する単語は、それぞれ、複数及び単数も含む。さらに、「本明細書における（ｈｅｒｅｉｎ）」、「上に（ａｂｏｖｅ）」、及び「以下に（ｂｅｌｏｗ）」という単語、ならびに類似の趣旨の単語は、本出願で使用される場合、全体としての本出願を指すものであり、本出願のいずれの特定の部分を指すものではない。

本開示の実施形態の説明は、網羅的であるようにも、本開示を、開示された正確な形態に限定するようにも意図されていない。本開示の特定の実施形態及び実施例が例証目的で本明細書に記載されているが、当業者であれば認識するであろうように、様々な同等の修正が本開示の範囲内で可能である。

第１の態様では、生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）アッセイプレート中の複数のサンプルウェルにおいて、（ｉ）第１の捕捉試薬及び（ｉｉ）生物学的サンプルをインキュベートすることであって、第１の捕捉試薬は表面に結合した第１の結合分子を含み、第１の結合分子は少なくとも１種の低濃度タンパク質に選択的に結合し、インキュベートすることは、生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質の第１の結合分子への結合を促進して、サンプルウェルの各々において第１の結合混合物を生成する時間及び条件下であり、各サンプルウェルが第１のサンプルウェルの容積を有する、インキュベートすることと、
（ｂ）サンプルウェルの各々において、第１の結合混合物を第２の捕捉試薬と混合することであって、第２の捕捉試薬は表面に結合した第２の結合分子を含み、第２の結合分子は少なくとも１種の高濃度タンパク質に選択的に結合し、混合することは、生物学的サンプル中の少なくとも１種の高濃度タンパク質の第２の結合分子への結合を促進して、サンプルウェルの各々において第２の結合混合物を生成する時間及び条件下であり、混合することは、各サンプルウェルの容積を増加させて、第１のサンプルウェルの容積よりも少なくとも１０倍大きい第２のサンプルウェルの容積を生成し、少なくとも１種の高濃度タンパク質は、少なくとも１種の低濃度タンパク質の予想濃度よりも、少なくとも１０倍高い濃度で生物学的サンプル中に存在すると予想される、混合することと、
（ｃ）生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定することと、を含む。

大きく異なるレベル（すなわち、少なくとも１０倍）で発現される同じサンプル中のタンパク質の濃度を決定するための現在の方法は不十分である。本明細書に開示される方法は、以前の方法に比べて大幅な改善を提供し、追加の多重分析を可能にする。これらの方法は、単一のアッセイを使用して広い濃度範囲で分泌タンパク質を測定し、試薬の消費量を削減することでワークフローを大幅に加速することによって、使いやすさに貢献する。タンパク質の捕捉、検出、及び定量は、同じサンプルウェル中で行うことができる。

生物学的サンプルは、低レベル及び高レベルで発現されると予想されるタンパク質を含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質が、少なくとも１種の低濃度タンパク質の予想濃度よりも少なくとも１０倍高い濃度で、生物学的サンプルに存在する（すなわち、細胞から分泌されるか、または細胞／タンパク質抽出物に存在する）と予想される。様々な実施形態では、少なくとも１種の高濃度タンパク質は、少なくとも１種の低濃度タンパク質の濃度よりも少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、又は２５０倍高い濃度で、生物学的サンプル中に存在する。少なくとも１種の低濃度タンパク質は、１種、２種、３種、４種、５種、又はそれ以上の低濃度タンパク質であり得る。同様に、少なくとも１種の高濃度タンパク質は、１種、２種、３種、４種、５種、又はそれ以上の高濃度タンパク質であり得る。少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質は、ユーザーが濃度を決定したい低濃度タンパク質及び高濃度タンパク質についての本明細書の要件を満たす任意のタンパク質であり得る。様々な非限定的な実施形態では、少なくとも１種の低濃度タンパク質は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、可溶性Ｆａｓ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質である。様々なさらなる実施形態では、少なくとも１種の高濃度タンパク質は、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−ガンマ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、グランザイムＢ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、及びインターロイキン（ＩＬ−６）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質である。

単離された細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、及び骨髄細胞を含むがこれらに限定されない）、細胞上清、その細胞抽出物、血清、血清抽出物、生体液（血液を含むがこれに限定されない）、及び生体液抽出物（血液抽出物を含むがこれに限定されない）を含むがこれらに限定されない、低濃度と高濃度の両方のタンパク質（本明細書で定義される）を発現する任意の適切な生物学的サンプルを使用することができる。１つの特定の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中の細胞を含む。別の特定の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞タンパク質抽出物を含む。

組み合わせるか、又は分離したりすることができる様々な特定の実施形態では、
（ａ）少なくとも１種の低濃度タンパク質がＩＬ−１７Ａを含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質がＩＦＮガンマを含み、そのような一実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含み、
（ｂ）少なくとも１種の低濃度タンパク質はＩＬ−６を含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＩＦＮガンマ及びＴＮＦアルファを含み、そのような一実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含み、
（ｃ）少なくとも１種の低濃度タンパク質はｓＦａｓを含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はグランザイムＢを含み、そのような一実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含み
（ｄ）少なくとも１種の低濃度タンパク質はＩＬ−４を含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＩＬ−２及びＴＮＦアルファを含み、そのような一実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のＢ細胞、又はＢ細胞タンパク質抽出物を含み、
（ｅ）少なくとも１種の低濃度タンパク質はＩＬ−１２を含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＴＮＦアルファを含み、そのような一実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中のマクロファージ、又はマクロファージタンパク質抽出物を含み、
（ｆ）少なくとも１種の低濃度タンパク質はＧＭ−ＣＳＦを含み、少なくとも１種の高濃度タンパク質はＩＬ−６を含み、そのような一実施形態では、生物学的サンプルは、細胞培養培地中の骨髄細胞、又は骨髄細胞タンパク質抽出物を含む。

生物学的サンプルは、ヒト、げっ歯類（すなわち、マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、ブタ、ヤギ、サル、ヒツジ、ウマ、ウシなどを含むがこれらに限定されない任意の起源のものであり得る。１つの特定の実施形態では、生物学的サンプルはヒト由来である。

この方法は、アッセイプレート（マイクロタイタープレートを含むがこれに限定されない）上の複数のサンプルウェルで実施される。したがって、これらの方法は、ユーザーによって適切と見なされるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５０、６０、７０、７５、８０、９０、９６、又は以上のウェル中にて、実行することができる。

この方法は、捕捉試薬を使用して、生物学的サンプル中に存在する低濃度タンパク質（第１の捕捉試薬）又は高濃度タンパク質（第２の捕捉試薬）に結合させる。捕捉試薬は、少なくとも１種の低濃度タンパク質（第１の結合分子）又は少なくとも１種の高濃度タンパク質（第２の結合分子）に選択的に結合する結合分子を含む。所与の生物学的サンプルから２つの異なる低濃度タンパク質を測定する場合、第１の結合分子の２つの異なる集団（すなわち、低濃度タンパク質１の第１の結合分子及び低濃度タンパク質２の第１の結合分子）が存在することが理解される。同様に、所与の生物学的サンプルから２つの異なる高濃度タンパク質を測定する場合、第２の結合分子の２つの異なる集団（すなわち、高濃度タンパク質１の第２の結合分子及び高濃度タンパク質２の第２の結合分子）が存在する。低濃度タンパク質又は高濃度タンパク質に選択的に結合する任意の適切な結合分子を使用することができる。様々な非限定的な実施形態では、結合分子は、抗体、アフィマー、アプタマー、又は他のタンパク質／糖／脂質又は組み合わせ分子を含む。１つの特定の実施形態では、第１及び第２の結合分子は、低濃度タンパク質又は高濃度タンパク質に選択的に結合する抗体を含む。このような選択的抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを含む多くのベンダーから市販されている。

第１及び第２の捕捉試薬中の第１及び第２の結合分子は、表面に結合している。ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン支持体、磁性又は常磁性ビーズ、アガロースビーズ、及びＮＨＳ活性化セファロース又はＣＮＢｒ活性化セファロースなどの濾過媒体を含むがこれらに限定されない任意の適切な表面を使用することができる。１つの特定の実施形態では、捕捉試薬中の結合分子は、磁性又は常磁性ビーズ、又は非磁性ビーズなどのビーズに結合される。一実施形態では、ビーズは、ポリスチレンビーズを含むがこれに限定されない非磁性ビーズである。そのようなポリスチレンビーズは、直径が５〜１０、６〜９、７〜８、又は約７μｍの間を含むがこれらに限定されない、任意の適切なサイズであり得る。磁性又は常磁性の捕捉ビーズは、通常、直径が約１ｍｍ以下であり、沈降や目詰まりを防ぐために十分なほど小さい。適切なビーズは、様々なソースから入手できる（例えば、ノルウェーのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＤｙｎａｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ−Ｏｎｅ（商標）又はＭｅｒｃｋ，ＦｒａｎｃｅからのＥｓｔａｐｏｒｅ）。ビーズは、抗体又は抗原の受動的又は能動的結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）のために、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）分子で事前に結合又はコーティングすることができる。他の実施形態では、捕捉ビーズはアガロースビーズであり得る。通常、アガロースビーズの直径は約２０μｍ〜３５０μｍである。別の特定の実施形態では、捕捉試薬中の結合分子は、マイクロタイタープレートのウェル内の印刷されたアレイに存在する。

任意の適切な密度の捕捉試薬をアッセイで使用することができる。１つの非限定的な実施形態では、低濃度又は高濃度のタンパク質に特異的な捕捉試薬の各集団は、１ミリリットルあたり約１万〜約１億の捕捉試薬の密度で存在する。様々なさらなる実施形態では、捕捉試薬の各集団は、１ミリリットルあたり、約１０万〜約５０００万の間、約２５万〜約２５００万の間、約５０万〜約１０００万の間、又は約７５万〜約５００万の間の捕捉試薬の密度で存在する。

インキュベーション、混合、及び接触の工程は、記載された結合イベントを促進する時間及び条件下で実行される。そのようなインキュベーション、混合、及び接触を促進するための任意の適切な条件を使用することができ、本明細書の教示に基づいて、温度、インキュベーションの長さ、撹拌又は他の混合力の適用、使用する媒体、組み込むための洗浄工程などの適切な条件を決定することは当業者のレベル内である。非限定的な実施形態は、本明細書に詳細に記載されている。

第１の結合分子は、生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質に結合して、サンプルウェルの各々において第１の結合混合物を生成し、各サンプルウェルは、第１のサンプルウェルの容積を有する。続いて、同じサンプルウェルにおいて、第１の結合混合物が第２の捕捉試薬と混合され、第２の結合分子が生物学的サンプル中の少なくとも１種の高濃度タンパク質に結合して、サンプルウェルの各々において第２の結合混合物を生成する。混合することは、各サンプルウェルの容積（すなわち、第１のサンプルウェルの容量）を増加させて、第１のサンプルウェルの容積より少なくとも１０倍大きい第２のサンプルウェルの容積を生成することを含む。低濃度タンパク質の捕捉後のこの希釈工程により、生物学的サンプル中の少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定するための大幅に改善されたダイナミックレンジが可能になる。様々な実施形態では、第２のサンプルウェルの容積の増加は、本明細書の教示に基づいてユーザーが適切とみなすような、第１のサンプルウェルの容積と比較して、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、又は２５０倍であり得る。

次に、この方法は、生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定することを含む。一実施形態では、決定する工程は、
（ｄ）各サンプルウェルの第２の結合混合物を検出試薬と接触させることであって、検出試薬は第１の捕捉試薬に存在する結合分子及び第２の捕捉試薬の結合分子に結合し、接触させることは、検出試薬の第１の捕捉試薬に存在する結合分子及び第２の捕捉試薬中の結合分子へ結合し、検出可能なタンパク質混合物を生成する時間及び条件下で行われる、接触させることと、
（ｅ）各サンプルウェル中で検出可能なタンパク質混合物を検出して、少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の量を決定することと、を含む。

使用される検出可能な標識に応じて、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、プレートリーダー、メソスケールディスカバリープラットフォーム、及び蛍光顕微鏡法を含むがこれらに限定されない、検出可能なタンパク質混合物を検出するための任意の適切な技術を使用することができる。蛍光標識、ハプテン、比色標識、様々な放射性標識、酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、シリコン、ガラス、又は金属粒子、タンパク質−タンパク質結合ペア、タンパク質−抗体結合ペアなどの標識粒子を含むがこれらに限定されない任意の適切な検出可能な標識を使用することができる。蛍光標識の例には、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、シアニン、ダンシルクロリド、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ブリリアントバイオレット染料、ブリリアント紫外線染料、及びフィコエリトリンが挙げられるがこれらに限定されない。生物発光マーカーの例には、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシなど）、ルシフェリン、エクオリンなどが含まれるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素系の例には、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。検出可能な標識は、様々なソースから市販されている。特定の実施形態では、検出標識は、フルオロフォア又は蛍光タンパク質を含む。

１つの特定の実施形態では、検出は、関連する結合複合体を流体の流れに懸濁すること、それらを電子検出装置に通すことによるフローサイトメトリーを含み、１秒あたりの最大数万の複合体の物理的及び化学的特性の同時マルチパラメトリック分析を可能にする。

第１及び第２の結合分子が抗体を含む一実施形態では、検出試薬は、第１及び第２の結合分子抗体に結合する能力を保持している、検出可能に標識された標的二次抗体又はそのフラグメントを含み得る。様々な実施形態では、検出試薬は、評価される低濃度タンパク質及び高濃度タンパク質の数に応じて、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上、別個に検出可能に標識された二次抗体又はそのフラグメントを含む。このような二次抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどの多くのベンダーから市販されている。

一実施形態では、アッセイプレートが２つ以上の対照ウェルを含み、この方法は、
（ｄ）２つ以上の対照ウェル中で、（ｉ）第１の捕捉試薬ならびに（ｉｉ）既知量の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質を含むタンパク質標準をインキュベートすることであって、インキュベートすることは、タンパク質標準中の低濃度タンパク質の第１の結合分子への結合を促進して、各対照ウェルにおいて第１の対照結合混合物を生成する時間及び条件下であり、各対照ウェルは第１の対照ウェルの容積を有する、インキュベートすることと、
（ｅ）２つ以上の各対照ウェル中で、タンパク質標準中の高濃度タンパク質の第２の結合分子への結合を促進して、各対照ウェルにおける第２の対照結合混合物を生成する時間及び条件下で第１の対照結合混合物を第２の捕捉試薬とインキュベートすることであって、混合することは、各対照ウェルの容積を増加させて、第１の対照ウェルの容積より少なくとも１０倍大きい第２の対照ウェルの容積を生成する、インキュベートすることと、
（ｆ）各対照ウェルの第２の対照結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定することと、
（ｇ）各対照ウェルの第２の対照結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質に基づいて、各サンプルウェル中の第２の結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の決定された濃度を正規化することと、をさらに含む。

工程（ｄ）−（ｆ）は上記の工程（ａ）−（ｃ）に対応し、１つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）の対照ウェルでのみ実行され、生物学的サンプルではなく、アッセイされる低濃度及び高濃度のタンパク質のためにタンパク質標準を使用する。次に、正規化工程を追加して、第２の対照結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度に基づいて、各サンプルウェル中の第２の結合混合物中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の決定された濃度を正規化する。本明細書に詳細に開示されるものを含む、任意の適切な正規化プロセスを使用することができる。一実施形態では、２つ以上の対照ウェルの異なる対照ウェルは、異なる濃度の低濃度タンパク質及び異なる濃度の高濃度タンパク質を有するタンパク質サンプルを含む。一実施形態では、正規化は、タンパク質標準中の各低濃度タンパク質及び高濃度タンパク質の標準曲線を生成することを含み、各生物学的サンプル中の低濃度タンパク質及び高濃度タンパク質の濃度は、各低濃度タンパク質及び高濃度タンパク質の標準曲線を参照することによって測定される。

他の実施形態では、これらの方法は、追加の細胞特徴付け及び機能アッセイとともに多重化させることができる。様々な非限定的な実施形態では、そのような追加の細胞特徴付け及び機能アッセイは、Ｔ細胞の同一性及び特徴付け、細胞生存率、アポトーシス、細胞数、及び細胞表面バイオマーカーアッセイを含むが、これらに限定されない。例えば、サンプルウェルは、検出可能な細胞生存率色素、細胞表面バイオマーカー、又はアポトーシスのマーカーと接触させることができる。例えば、Ｔ細胞とＢ細胞の表面マーカーは、分化プロセスにおけるそれらの系統と段階を同定する。

別の態様では、以下を含むキットが開示されている。
（ａ）本明細書の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに記載されるような第１の捕捉試薬；
（ｂ）本明細書の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに記載される第２の捕捉試薬；及び
（ｃ）本明細書の任意の実施形態又は実施形態の組み合わせに記載されるような検出試薬。

キットは、タンパク質標準、検出可能な標識、アッセイプレート、緩衝液などを含むがこれらに限定されない、本明細書に開示される任意の他の試薬又は方法を実行するための追加の有用なツールをさらに含み得る。

本開示の実施形態の説明は、網羅的であるようにも、又は本開示を、開示された正確な形態に限定するようにも意図されていない。本開示の特定の実施形態及び実施例が例証目的で本明細書に記載されているが、当業者であれば認識するであろうように、様々な同等の修正が本開示の範囲内で可能である。

タンパク質標準
タンパク質標準（ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、及びＩＬ−４）を単一の１．５ｍｌ遠心分離管に混合して、タンパク質標準を生成した。２００μＬの新鮮な培養培地（ＶＷＲからの１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０）をタンパク質標準とともにチューブに加え、混合した。タンパク質標準の細胞培養培地への連続１：３希釈液を調製した。

捕捉試薬の調製
第１の捕捉試薬（低濃度タンパク質）２４ｕＬのＩＬ−４捕捉ビーズ（抗ＩＬ−４抗体と共有結合したポリスチレンビーズ）（ＱＢｅａｄｓ（商標）キット（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ））を１．２ｍｌの緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水中０．１％ウシ血清アルブミン）で希釈及び混合した。
第２の捕捉試薬（高濃度タンパク質）２４ｕＬのＩＦＮγ捕捉ビーズ（抗ＩＦＮγ抗体と共有結合したポリスチレンビーズ）（ＱＢｅａｄｓ（商標）キット（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ））及び２４ｕＬのＴＮＦα捕捉ビーズ（抗ＴＮＦα抗体と共有結合したポリスチレンビーズ）（ＱＢｅａｄｓ（商標）キット（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ））を１．２ｍｌの緩衝液で希釈し、混合した。次に、混合物を１７倍量の新鮮な細胞培養培地（ＶＷＲからの１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０）で希釈した。

ＩＬ−４捕捉ビーズ混合物をボルテックスしてリザーバーに移した。各ウェルの底に、１０μＬのＩＬ−４捕捉ビーズミックス（約１２万捕捉ビーズ／ｍＬ）をアッセイプレートに添加した。ビーズが沈降することを防ぐために、ビーズをプレートに移す間、ビーズをリザーバー内で時折撹拌した。様々な濃度の１０μＬサイトカインタンパク質標準を、標準用に指定されたアッセイプレートの各ウェル（対照ウェル）に添加した（例えば、以下の図１を参照）。

プレートを３００ｇで５秒間回転させ、すべてのサンプルがウェルの底にあり、ウェルの側面に付着していないことを確認した。次に、プレートを２，０００ｒｐｍで２０秒間混合し（ｉＱｕｅ（商標）プレートシェーカー、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ））、徹底的に混合した。蓋をプレート上に置き、光を当てずにプレートを室温にて６０分間インキュベートした。

事前希釈し事前混合したＩＦＮγ／ＴＮＦα捕捉ビーズをボルテックスして混合し、１８０μＬの懸濁液（１３０００ビーズ／ｍＬ）を各サンプルウェルに添加した。ビーズが沈降するのを防ぐために、リザーバーからプレートへのビーズの移動中にビーズを時折撹拌した。蓋をプレート上に置き、光を当てずにプレートを室温にて６０分間インキュベートした。サンプルウェル内の液体の量のため、この工程ではプレートの振とうは行われなかった。

インキュベーション後、プレートを３００ｇで５分間回転させた。製造業者の推奨に従って、上澄みをＢｉｏＴｅｋ（商標）プレートウォッシャー（ＥＬｘ４０５モデル）で吸引した。プレート中の残渣の液体中のサンプルは、６０秒間、３０００ｒｐｍ、ｉＱｕｅ（商標）プレートシェーカー上で撹拌した。

１０μＬのＩＬ−４／ＩＦＮｇ／ＴＮＦａ検出試薬（様々なサプライヤーから入手可能なサイトカイン検出カクテル）を各ウェルに添加した。検出試薬は、第１の捕捉試薬に存在する結合分子に対するフィコエリシン（ＰＥ）結合体化抗体と（サンドイッチイムノアッセイ）、第２の捕捉試薬に存在する結合分子に対するＰＥ結合抗体を含む。プレートを３００ｇで５秒間回転させ、すべてのサンプルがウェルの底にあり、ウェルの側面に付着していないことを確認した。次に、ｉＱｕｅ（商標）プレートシェーカーを使用してプレートを２，０００ｒｐｍで２０秒間混合し、完全に混合したことを確認した。アッセイプレートを蓋で覆い、光を当てずに室温で１２０分間インキュベートした。

１００μＬの洗浄緩衝液を各ウェルに加えた。アッセイプレートを３００ｇで５分間回転させた。製造業者の推奨に従って、上澄みをＢｉｏＴｅｋ（商標）プレートウォッシャー（ＥＬｘ４０５モデル）で吸引した。残留液中のサンプルは、のｉＱｕｅ（商標）プレートシェーカーを用いて６０秒間３０００ｒｐｍで十分に撹拌した。２０μＬの洗浄緩衝液を各ウェルに加え、プレートをベンチで軽くたたいて、すべてのサンプルがウェルの底にあり、ウェルの側面に付着していないことを確認した。

サンプル取得は、ｉＱｕｅ（商標）Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ（ＶＢＲ）システム（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）上で実施し、データはＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔのＦｏｒｅＣｙｔ（商標）ソフトウェアによって分析した。

結果
結果を図２と図３に示し、検量線の直線範囲と、入力標準濃度と出力蛍光シグナルユニットの基本的な分布を示す。ＩＦＮｇの場合、線形範囲は９１〜２２，２０４ｐｇ／ｍＬである（以前の方法を使用した場合の８〜１６２８ｐｇ／ｍｌと比較して）。ＴＮＦａの場合、線形範囲は１８１〜５０，０００ｐｇ／ｍＬである（以前の方法を使用した場合の１２〜５８３１ｐｇ／ｍｌと比較して）。ＩＬ−４の場合、線形範囲は８〜６，７５９ｐｇ／ｍＬである。以前の方法と比較して、ＩＦＮｇとＴＮＦａの線形範囲は大幅に高い方にシフトしており、これは、サンプル中の高度に分泌されたＩＦＮｇ及びＴＮＦａタンパク質の定量を可能にする。ＩＬ−４の線形範囲は、同じサンプル中で弱く分泌されるＩＬ−４タンパク質を８ｐｇ／ｍＬまで定量することを可能にする。これらすべての結果は、本明細書に開示される方法が、同じアッセイにおいて高濃度の分泌タンパク質及び低濃度の分泌タンパク質を同時に検出及び定量することにおいて有意な改善を提供することを示唆している。

Claims (25)

1. 生物学的サンプル中の少なくとも１種の低濃度タンパク質及び少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定するための方法であって、前記方法が、
   （ａ）アッセイプレート中の複数のサンプルウェルにおいて、（ｉ）第１の捕捉試薬及び（ｉｉ）生物学的サンプルをインキュベートすることであって、前記第１の捕捉試薬が表面に結合した第１の結合分子を含み、前記第１の結合分子が前記少なくとも１種の低濃度タンパク質に選択的に結合し、前記インキュベートすることが、前記生物学的サンプル中の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質の前記第１の結合分子への結合を促進して、前記サンプルウェルの各々において第１の結合混合物を生成する時間及び条件下であり、各サンプルウェルが第１のサンプルウェルの容積を有する、インキュベートすることと、
   （ｂ）前記サンプルウェルの各々において、前記第１の結合混合物を第２の捕捉試薬と混合することであって、前記第２の捕捉試薬が表面に結合した第２の結合分子を含み、前記第２の結合分子が前記少なくとも１種の高濃度タンパク質に選択的に結合し、前記混合することが、前記生物学的サンプル中の前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の前記第２の結合分子への結合を促進して、前記サンプルウェルの各々において第２の結合混合物を生成する時間及び条件下であり、前記混合することが、各サンプルウェルの容積を増加させて、前記第１のサンプルウェルの容積よりも少なくとも１０倍大きい第２のサンプルウェルの容積を生成し、前記少なくとも１種の高濃度タンパク質が、前記少なくとも１種の低濃度タンパク質の予想濃度よりも、少なくとも１０倍高い濃度で前記生物学的サンプル中に存在すると予想される、混合することと、
   （ｃ）前記生物学的サンプル中の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定することと、を含む、方法。
2. 前記アッセイプレートが２つ以上の対照ウェルを含み、前記方法が、
   （ｄ）前記２つ以上の対照ウェル中で、（ｉ）前記第１の捕捉試薬ならびに（ｉｉ）既知量の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質を含むタンパク質標準をインキュベートすることであって、前記インキュベートすることが、前記タンパク質標準中の前記低濃度タンパク質の前記第１の結合分子への結合を促進して、前記対照ウェルの各々において第１の対照結合混合物を生成する時間及び条件下であり、各対照ウェルは第１の対照ウェルの容積を有する、インキュベートすることと、
   （ｅ）前記２つ以上の対照ウェルの各々において、前記タンパク質標準中の前記高濃度タンパク質の前記第２の結合分子への結合を促進して、前記対照ウェルの各々において第２の対照結合混合物を生成する時間及び条件下で前記第１の対照結合混合物を前記第２の捕捉試薬とインキュベートすることであって、前記混合することが、各対照ウェルの容積を増加させて、前記第１の対照ウェルの容積より少なくとも１０倍大きい第２の対照ウェルの容積を生成する、インキュベートすることと、
   （ｆ）各対照ウェルの前記第２の対照結合混合物中の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度を決定することと、
   （ｇ）各対照ウェルの前記第２の対照結合混合物中の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の濃度に基づいて、各サンプルウェル中の前記第２の結合混合物中の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の前記決定された濃度を正規化することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記２つ以上の対照ウェルの異なる対照ウェルが、異なる濃度の前記低濃度タンパク質及び異なる濃度の前記高濃度タンパク質を有するタンパク質サンプルを含む、請求項２に記載の方法。
4. 各サンプルウェルの前記第２の結合混合物中の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の量を決定することが、
   （ｉ）各サンプルウェルの前記第２の結合混合物を検出試薬と接触させることであって、前記検出試薬が、前記第１の捕捉試薬に存在する前記結合分子及び前記第２の捕捉試薬の前記結合分子に結合し、前記接触させることは、前記検出試薬が前記第１の捕捉試薬に存在する前記結合分子及び前記第２の捕捉試薬中の前記結合分子へ結合し、検出可能なタンパク質混合物を生成する時間及び条件下で行われる、接触させることと、
   （ｉｉ）各サンプルウェル中で前記検出可能なタンパク質混合物を検出して、前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の量を決定することと、を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記生物学的サンプルが細胞培養培地中の細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記生物学的サンプルが細胞タンパク質抽出物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記少なくとも１種の低濃度タンパク質が、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、可溶性Ｆａｓ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記少なくとも１種の高濃度タンパク質が、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−ガンマ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、グランザイムＢ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、及びインターロイキン（ＩＬ−６）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記少なくとも１種の低濃度タンパク質がＩＬ−１７Ａを含み、前記少なくとも１種の高濃度タンパク質がＩＦＮガンマを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記生物学的サンプルが、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記少なくとも１種の低濃度タンパク質がＩＬ−６を含み、前記少なくとも１種の高濃度タンパク質がＩＦＮガンマ及びＴＮＦアルファを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記生物学的サンプルが、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１種の低濃度タンパク質がｓＦａｓを含み、前記少なくとも１種の高濃度タンパク質がグランザイムＢを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記生物学的サンプルが、細胞培養培地中のＴ細胞、又はＴ細胞タンパク質抽出物を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記少なくとも１種の低濃度タンパク質がＩＬ−４を含み、前記少なくとも１種の高濃度タンパク質がＩＬ−２及びＴＮＦアルファを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記生物学的サンプルが、細胞培養培地中のＢ細胞、又はＢ細胞タンパク質抽出物を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記少なくとも１種の低濃度タンパク質がＩＬ−１２を含み、前記少なくとも１種の高濃度タンパク質がＴＮＦアルファを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記生物学的サンプルが、細胞培養培地中のマクロファージ、又はマクロファージタンパク質抽出物を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記少なくとも１種の低濃度タンパク質がＧＭ−ＣＳＦを含み、前記少なくとも１種の高濃度タンパク質がＩＬ−６を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記生物学的サンプルが、細胞培養培地中の骨髄細胞、又は骨髄細胞タンパク質抽出物を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１の結合分子及び前記第２の結合分子が、抗体を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記第１の捕捉試薬の前記表面がビーズを含み、前記第２の捕捉試薬の前記表面がビーズを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記混合することが、各サンプルウェルの容積を増加させて、前記第１のサンプルウェルの容積よりも１０倍〜１００倍大きな第２のサンプルウェルの容積を生成することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 各サンプルウェルの前記第２の結合混合物中の前記少なくとも１種の低濃度タンパク質及び前記少なくとも１種の高濃度タンパク質の量を決定することが、フローサイトメトリーによって実行される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. キットであって、
    （ａ）請求項１〜２４のいずれかに記載の第１の捕捉試薬と、
    （ｂ）請求項１〜２４のいずれかに記載の第２の捕捉試薬と、
    （ｃ）請求項４〜２４のいずれか一項に記載の検出試薬と、を含む、キット。

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