JP2021531823A - 細胞を分析するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年7月13日に出願された米国仮特許出願番号第62/697,972号および2018年7月27日に出願された米国仮特許出願番号第62/711,444号の利益を主張するものであり、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、そのようないかなる矛盾する資料よりも優先され、および/または上位にあることが意図される。
本明細書で提供される方法による分析のための複数の細胞は、単一の対象または複数の対象に由来し得る。場合によっては、同じ数の細胞が、複数の対象のうちの対象に由来し得る。例えば、複数の対象のうちの対象に対して単一の細胞が提供され得る。他の場合には、異なる数の細胞が、複数の対象のうちの対象に由来し得る。場合によっては、細胞は、対象に由来するある量の材料中に提供され得、同じ量の材料が、複数の対象のうちの対象に由来し得る。
バーコード付き細胞は、そこに含まれる核酸分子を分析するためにシーケンシングを受けてもよい。複数のプールされた細胞のシーケンシングは、計算上および実験的に費用がかかる可能性がある。したがって、本開示は、実質的に削減された計算および実験コストで単一細胞レベルでシーケンシング情報を得るための方法を提供する。
場合によっては、区分された細胞は、単一細胞シーケンシングに供され得る。区分された細胞に、細胞に固有の細胞バーコードを提供してもよい。場合によっては、細胞バーコードに関連付けられる細胞の数は、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の細胞が細胞バーコードに関連付けられ得るように、1つよりも多くてよい。場合によっては、細胞バーコードに関連付けられる細胞の数は、約10、9、8、7、6、5、4、3、2以下、またはそれ以下の細胞が細胞バーコードに関連付けられ得るように、20未満であってよい。シーケンシングは、区分された細胞の核酸分子の配列(例えば、ゲノムDNA配列)を細胞バーコードと関連付けるために行われ得る。一例では、細胞は、区分が1つ以下の細胞を含むように、複数の区分(例えば、液滴)間で区分され得る。細胞は、細胞をバーコード付けおよび/またはさらに処理するのに有用な試薬と同時区分され得る。例えば、細胞は、それに結合した複数の核酸バーコード分子を含むビーズと同時区分され得る。核酸バーコード分子は、プライミング配列と、そのビーズに固有であり、ビーズに結合した複数の核酸バーコード分子のあらゆる核酸バーコード分子にわたって同じであるバーコード配列とを含み得る。このように、異なる区分内の異なる細胞に、固有の細胞バーコードを提供してもよい。細胞バーコードは、例えば、形質導入もしくはトランスフェクションを介して(例えば、本明細書の他の場所に記載されるように)、または細胞の核酸分子にハイブリダイズもしくはライゲーションするプライマー分子もしくはアダプターの構成要素として細胞に提供され得る。後者の場合、ビーズに結合した核酸バーコード分子は、ビーズから放出されて(例えば、光、熱または化学的刺激などの刺激の適用によって)、細胞の核酸バーコード分子と核酸分子との間の相互作用を容易にし得る。ランダムプライミング配列(例えば、ランダムNmer)の使用は、核酸分子の広範囲の配列がサンプリングされることを可能にし得る。核酸分子の全部または一部(例えば、それにハイブリダイズまたはライゲーションされたプライマーまたはアダプターを有する核酸分子)は、それらのそれぞれの区分内で(例えば、プライマー伸長反応を介して)複製され得る。区分の細胞の核酸分子と、細胞と同時区分された(例えば、ビーズに結合した)核酸バーコード分子との相互作用に続いて、区分は、複数のバーコード付き核酸配列を含み得る。バーコード付き核酸配列は、区分された細胞の核酸分子の配列、またはその相補体と、細胞バーコードまたはその相補体と、場合によっては、1つ以上のシーケンシングプライマーとを含み得る。区分のバーコード付き核酸配列の全部ではないが一部は、遺伝子型バーコードを含み得る。場合によっては、バーコード付き核酸配列は、第1の末端に第1のシーケンシングプライマーと、第2の末端に第2のシーケンシングプライマーとを含み得る。区分された細胞の核酸分子の配列、および細胞バーコード配列、またはその相補体は、第1のシーケンシングプライマーと第2のシーケンシングプライマーとの間に配置され得る。複数の区分のうちの異なる区分のバーコード付き核酸配列がプールされ(例えば、液滴を組み合わせることによって)、シーケンサー(例えば、Illuminaのシーケンサー)に提供され得る。場合によっては、シーケンシングプライマーおよび/または他の機能的配列が、それらのそれぞれの区分からのバーコード付き核酸配列の放出に続いてバーコード付き核酸配列に提供され得、その後、さらに処理されたバーコード付き核酸配列がシーケンシングを受け得る。
場合によっては、区分された細胞は、デコンボリューションプロセスを含む多重シーケンシング法を受け得る(例えば、図5を参照)。複数の区分のうちの区分が1つ以上の細胞を含むように、細胞は、複数の区分(例えば、10以上の区分、例えば、少なくとも約10、20、100、1,000、10,000、100,000またはそれ以上の区分)間で区分され得る。複数の区分のうちの区分が1つ以上の細胞を含むように、細胞は、複数の区分(例えば、約100,000、10,000、1,000、100、20、10以下、またはそれ以下の区分)間で区分され得る。異なる元の(例えば、祖先)細胞に対応する細胞が、区分の同じ組合せに存在し得る可能性は低い場合がある。例えば、96ウェルプレートのうち7ウェルに存在する細胞がウェルの同じセットに存在する可能性は10,000,000,000分の1未満であり得る。その後の分析にさらに多くの材料を提供するために、区分(例えば、ウェル)内に含まれる細胞をその区分内で分割することが可能であり得る。細胞は、それらのそれぞれの区分内で溶解または透過処理されて、その中の核酸分子へのアクセスを提供し得る。次いで、区分が固有の区分バーコードによって標識され得るように、得られた区分の内容物(例えば、溶解物)がシーケンシングのために処理され得る。細胞が溶解されない場合、区分バーコードは、遺伝子型バーコードと同じ方法で(例えば、本明細書の他の場所に記載されるように)提供され得る。あるいは、区分バーコードは、例えば、区分バーコードと、場合によっては追加の配列とを含み得る核酸バーコード分子を介して提供され得る。そのような核酸バーコード分子は、溶液中で提供されるか、ビーズなどの基質に結合され得る。場合によっては、区分バーコード配列を含む核酸バーコード分子は、細胞を加える前に区分内(例えば、溶液内、またはマルチウェルプレートのウェルの一部などの区分の表面に固定化される)に含まれ得る。場合によっては、核酸バーコード分子は、区分バーコードと、プライミング配列(例えば、本明細書の他の場所に記載されるような標的化されたプライミング配列またはランダムプライミング配列)とを含み得る。核酸バーコード分子のプライミング配列は、区分内に含まれる核酸分子にハイブリダイズまたはライゲーションし得る。区分内に含まれる核酸分子(例えば、核酸バーコード分子にハイブリダイズまたはライゲーションされた核酸分子)は、1つ以上の複製プロセス、例えば、1つ以上のプライマー伸長反応または核酸増幅反応を受け得る。区分の核酸分子と、区分に提供される核酸バーコード分子との相互作用に続いて、区分は、複数のバーコード付き核酸配列を含み得る。バーコード付き核酸配列は、区分内で区分された細胞のうちの1つの核酸分子の配列、またはその相補体と、区分バーコードまたはその相補体と、場合によっては、1つ以上のシーケンシングプライマーとを含み得る。区分のバーコード付き核酸配列の全部ではないが一部は、遺伝子型バーコードを含み得る。場合によっては、バーコード付き核酸配列は、第1の末端に第1のシーケンシングプライマーと、第2の末端に第2のシーケンシングプライマーとを含み得る。区分された細胞の核酸分子の配列、および区分バーコード配列、またはその相補体は、第1のシーケンシングプライマーと第2のシーケンシングプライマーとの間に配置され得る。複数の区分のうちの異なる区分のバーコード付き核酸配列がプールされ、シーケンサー(例えば、Illuminaのシーケンサー)に提供され得る。場合によっては、シーケンシングプライマーおよび/または他の機能的配列が、それらのそれぞれの区分からのバーコード付き核酸配列の放出に続いてバーコード付き核酸配列に提供され得、その後、さらに処理されたバーコード付き核酸配列がシーケンシングを受け得る。
場合によっては、摂動は、複数の細胞にわたる遺伝子型に結合され得る(例えば、図3のパネルCを参照)。例えば、遺伝的、薬物または環境的摂動は、バーコード(例えば、RNAバーコードとして発現され得るDNAバーコード)に結合され、先のセクションに記載されるように複数の細胞のうちの細胞のゲノムに組み込まれ得る。摂動は、例えば、小分子、ノックアウト、オープンリーディングフレーム(ORF)またはクラスター化反復短回文配列リピート(CRISPR)単一ガイドRNA(sgRNA)の付加を含み得る。場合によっては、摂動は、温度またはpHの変化を含み得る。遺伝子型バーコード(例えば、対象に関連付けられるバーコード)を摂動バーコードに関連付けることによって、遺伝子型と摂動との間の関連付けを決定してもよい。この関連付けを使用して、トランスクリプトームの変化(RNAシーケンシングによる)および/または形態(シーケンシングがインサイチュで行われる場合)などの細胞応答を同定してもよい。
本開示は、本開示の方法を実装するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図6は、本明細書で提供される方法を実行するようにプログラムまたは構成されるコンピュータシステム601を示す。コンピュータシステム601は、本開示の方法の様々な態様、例えば、様々な試料から細胞をプールすること、複数の区分間で細胞を区分すること、区分内または区分外の細胞にバーコードを提供すること、シーケンシングリードをシーケンシングすること、および遺伝子型と表現型との間の関連付けを決定することなどを調整することができる。コンピュータシステム601は、ユーザの電子装置、または電子装置に対して遠隔に位置するコンピュータシステムであり得る。電子装置は、携帯型電子装置であり得る。
[実施例1]
新規治療薬候補の臨床試験結果予測:遺伝子型特異的反応
記載された方法を使用して、数千人の白血病患者から得られた癌細胞を含むバンクを確立する。様々な用量で細胞に新規治療薬候補を適用し、治療薬の適用の有無にかかわらず、遺伝子型バーコードの相対的増殖速度を測定する。これら2つの数値の比を使用して、遺伝子型に関連付けられる治療応答(および治療用量)に変動があるかどうかを決定する。
新規治療薬候補の臨床試験結果予測:遺伝子型特異的毒性
記載された方法を使用して、数千人の健常な患者から得られた正常な線維芽細胞を含むバンクを確立する。プールされた様式で、治療薬に感受性な細胞型(例:肝細胞)に細胞を再プログラムし、分化させることができる。様々な用量で細胞に新規治療薬候補を適用し、RNA−seq、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーなどの単一細胞表現型アッセイによって、毒性に関連するバイオマーカーの発現レベルを決定する。フローサイトメトリーの場合、毒性マーカーに基づいて細胞を分類する。高毒性ビン内の遺伝子型バーコードの存在を使用して、第I相臨床試験での選択のために患者を層別化することができる。
新規治療薬候補の臨床試験結果予測:遺伝子型特異的アジュバント療法
記載された方法を使用して、アルツハイマー病患者から得られた再プログラムされたニューロンを含むバンクを確立する。細胞に新規治療薬候補を適用する。さらに、摂動に対応するノックアウト/ノックダウン/過剰発現が標的治療薬または遺伝子治療にマッピングされる細胞に対して、遺伝子スクリーニングを行う。RNA−seq、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーなどの単一細胞表現型アッセイによって、治療応答、遺伝的摂動および遺伝子型の間の相乗効果を決定する。例えば、αシヌクレインの発現レベルは、応答のバイオマーカーとして使用することができる。
新規治療薬候補
記載された方法を使用して、性別、民族、年齢および病状に関する有意な変動を含むランダムなヒト集団から得られた毛髪試料由来の再プログラムされた幹細胞からバンクを確立する。様々な細胞型(例:心筋細胞、造血幹細胞、γアミノ酪酸作動性(GABA作動性)ニューロン)に細胞を分化させ、単一細胞アッセイ(例えば、RNA−seq、ATAC−seqなど)を使用して分子的にプロファイリングする。遺伝的変異体は表現型の変異に関連する。細胞に対して遺伝的摂動の候補を予測および試験して、治療薬のリードを生成する。
農業用途:植物
記載された方法を使用して、遺伝的に多様なプロトプラストの集団(自然変異または変異誘発によって生成された)からバンクを確立する。経路内の遺伝子の発現レベルの測定によって、細胞の光合成活性を決定する。表現型の変異に関連する遺伝的変異体を決定し、細胞に対して遺伝的摂動の候補を予測および試験する。最良の候補は、成体植物に成長する。
農業用途:動物
記載された方法を使用して、遺伝的に多様な動物の集団(自然変異または変異誘発によって生成された)からバンクを確立する。経路内の遺伝子の発現レベルの測定によって、細胞に関連する測定基準を決定する。表現型の変異に関連する遺伝的変異体を決定し、細胞に対して遺伝的摂動の候補を予測および試験する。最良の候補は、望ましい特性を有する成体動物に成長する。
摂動の分析
対象(例えば、ヒトまたは動物の対象)に対応する複数の細胞を提供する。例えば、遺伝子またはその一部をこの遺伝子の遺伝子型の多様なセットによって置き換えるように、複数の細胞を摂動させる。摂動は、第1の摂動バーコードに関連付けられる。細胞には遺伝子型バーコードも提供される(例えば、本明細書の他の場所に記載されるように)。したがって、摂動された細胞は、細胞の摂動に関連付けられる第1の摂動バーコードと、細胞に特異的な遺伝子型バーコードとを含む。次いで、細胞を第2の摂動に供し、第2の摂動バーコードが細胞に提供され得る。2回摂動された細胞は、第1の摂動バーコードと、第2の摂動バーコードと、遺伝子型バーコードとを含む。2回摂動された細胞が増殖して、2回摂動された細胞の1つ以上の複製を生成する。次いで、2回摂動された細胞は、例えば、本明細書の他の場所に記載されている単一細胞シーケンシングおよび/またはデコンボリューションアプローチを使用するシーケンシングに供される。このように、異なる摂動間の関連が同定され得る。一例では、第1の摂動は、Gタンパク質共役型受容体をコードする遺伝子に関連付けられる遺伝的多様性を変化させる。
Claims (111)
- 複数の細胞を分析する方法であって、
(a)複数の対象の細胞に由来する複数の細胞を提供することであって、前記複数の細胞が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、複数のバーコード配列を含むこと、
(b)前記複数の細胞の前記複数の核酸分子に由来する核酸分子をシーケンシングし、それにより、前記複数の核酸分子に対応する複数のシーケンシングリードを生成することであって、前記複数のシーケンシングリードの一部が、前記複数のバーコード配列を含むこと、
(c)前記複数のシーケンシングリードを処理することであって、この複数のシーケンシングリードが、前記複数のバーコード配列を含むこと、および
(d)前記複数のバーコード配列のうちのバーコード配列を使用して、前記複数のシーケンシングリードのサブセットを前記複数の対象のうちの対象と関連付けること、
を含み、
(b)の前に、バルク増殖環境での前記複数の対象の前記細胞の増殖時に、前記複数の細胞が生成される方法。 - 前記複数の核酸分子のサブセットが、前記複数のバーコード配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列が、前記複数の細胞に対して内因性である、請求項1に記載の方法。
- (a)の前に、前記複数の細胞の前記複数の核酸分子に前記複数のバーコード配列を組み込むことをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列が、形質導入を介して前記複数の細胞に組み込まれる、請求項4に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列が、ウイルスベクター、トランスフェクション、相同組換え組込み、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、抗体コンジュゲートオリゴヌクレオチドまたはエピソームベクターを使用して、前記複数の細胞に組み込まれる、請求項4に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列のうちの前記バーコード配列が、1塩基から1000塩基を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象が、複数のヒト対象を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象の同一性が、暗号化または曖昧化されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が体液に由来する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が、血液、血漿、尿、汗または唾液を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、皮膚細胞または有毛細胞を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が植物細胞を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞が、植物の葉または根に由来する、請求項13に記載の方法。
- 前記複数の細胞の増殖した細胞が、増殖速度によって層別化される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によって染色される、請求項15に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列の少なくともサブセットが、複数の摂動に関連付けられる複数の摂動バーコード配列を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、小分子、ノックアウト、抗体、細胞間相互作用、RNAi、オープンリーディングフレーム(ORF)およびクラスター化反復短回文配列リピート(CRISPR)単一ガイドリボ核酸(sgRNA)の付加からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、温度の変化またはpHの変化を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、遺伝子の変異型の導入を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列の少なくともサブセットが、複数の測定値に関連付けられる、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の測定値が、RNA−seq、ATAC−seq、インサイチュシーケンシングおよび細胞形態の測定値からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- (e)前記複数の細胞に複数の蛍光プローブを導入すること、
(f)前記複数のバーコード配列に前記複数の蛍光プローブをハイブリダイズさせるのに十分な条件に前記複数の細胞を供すること、および
(g)前記複数の細胞内の前記複数のバーコード配列にハイブリダイズした前記複数の蛍光プローブを光学的に検出すること、
をさらに含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。 - (e)から(g)を1回以上繰り返すことをさらに含む、請求項23に記載の方法。
- (c)または(d)が、外部データベースの使用を含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、(b)の前に、前記複数の核酸分子を処理して、前記核酸分子を生成することをさらに含み、この核酸分子がその後シーケンシングされる方法。
- 前記処理が、前記複数の核酸分子のコピーを生成することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記処理が、前記複数の細胞から前記複数の核酸分子を回収することを含む、請求項26に記載の方法。
- 複数の細胞を分析する方法であって、
(a)複数の対象の細胞に由来する第1の複数の細胞を提供することであって、前記第1の複数の細胞が、第1の複数の核酸分子を含み、前記第1の複数の核酸分子が、第1の複数のバーコード配列を含むこと、
(b)前記第1の複数の細胞のうちの細胞を複製するのに十分な条件に前記第1の複数の細胞を供して、前記第1の複数の細胞のうちの前記細胞とその複製とを含む第2の複数の細胞を提供することであって、前記第2の複数の細胞が、第2の複数のバーコード配列を含む第2の複数の核酸分子を含むこと、
(c)前記第1の複数の細胞および前記第2の複数の細胞のうちの細胞を複数の区分間で区分し、それにより、複数の区分された細胞を提供すること、ならびに
(d)前記複数の区分された細胞に由来する核酸分子をシーケンシングし、それにより、前記複数の区分された細胞の前記第2の複数の核酸分子に対応する複数のシーケンシングリードを生成することであって、前記複数のシーケンシングリードの一部が、前記第2の複数のバーコード配列を含むこと、
(e)前記複数のシーケンシングリードを処理することであって、この複数のシーケンシングリードが、前記第2の複数のバーコード配列を含むこと、ならびに
(f)前記第2の複数のバーコード配列のうちのバーコード配列を使用して、前記複数のシーケンシングリードのサブセットを前記複数の対象のうちの対象と関連付けること、
を含む方法。 - 前記第1の複数の核酸分子のサブセットが、前記第1の複数のバーコード配列を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード配列が、前記第1の複数の細胞に対して内因性である、請求項29に記載の方法。
- (a)の前に、前記第1の複数の細胞の前記第1の複数の核酸分子に前記第1の複数のバーコード配列を組み込むことをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード配列が、形質導入を介して前記第1の複数の細胞に組み込まれる、請求項32に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード配列が、ウイルスベクター、トランスフェクション、相同組換え組込み、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、抗体コンジュゲートオリゴヌクレオチドまたはエピソームベクターを使用して、前記第1の複数の細胞に組み込まれる、請求項32に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード配列または前記第2の複数のバーコード配列のうちのバーコード配列が、1塩基から1000塩基を含む、請求項29から34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の区分が複数のウェルを含む、請求項29から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のウェルのうちのウェルが、1つ以上の細胞を含む、請求項36に記載の方法。
- (e)が、前記複数の区分された細胞のうちの細胞に対応するものとして、前記複数のシーケンシングリードのうちのシーケンシングリードを同定することを含む、請求項36または37に記載の方法。
- 前記同定が、前記複数の区分のうちの区分間に分散されたシーケンシングリードの共有配列を同定することを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記複数の区分が複数の液滴を含む、請求項29から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の液滴のうちの液滴が、最大で単一の細胞を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記複数の液滴のうちの液滴が、複数のオリゴヌクレオチドをさらに含み、この複数のオリゴヌクレオチドが、1つ以上のシーケンシングプライマーもしくはその相補体、または1つ以上の追加のバーコード配列を含む、請求項40または41に記載の方法。
- (e)が、前記複数の区分された細胞のうちの細胞に対応するものとして、前記複数のシーケンシングリードのうちのシーケンシングリードを同定することを含む、請求項40から42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象が、複数のヒト対象を含む、請求項29から43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象の同一性が、暗号化または曖昧化されている、請求項29から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の複数の細胞が体液に由来する、請求項29から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が、血液、血漿、尿、汗または唾液を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記第1の複数の細胞が、皮膚細胞または有毛細胞を含む、請求項29から47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の複数の細胞が植物細胞を含む、請求項29から43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞が、植物の葉または根に由来する、請求項49に記載の方法。
- (d)の前に、バルク増殖環境での前記複数の対象の前記細胞の増殖時に、前記第1の複数の細胞が生成される、請求項26から47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の複数の細胞と前記その複製とが、増殖速度によって層別化される、請求項29から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の複数の細胞が、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によって染色される、請求項52に記載の方法。
- (d)でシーケンシングされた前記複数の区分された細胞の前記核酸分子の一部が、複数の摂動に関連付けられる複数の摂動バーコード配列を含む、請求項29から53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、小分子、ノックアウト、抗体、細胞間相互作用、RNAi、オープンリーディングフレーム(ORF)およびクラスター化反復短回文配列リピート(CRISPR)単一ガイドリボ核酸(sgRNA)の付加からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、温度の変化またはpHの変化を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、遺伝子の変異型の導入を含む、請求項54に記載の方法。
- (d)でシーケンシングされた前記複数の区分された細胞の前記核酸分子の一部が、複数の測定値に関連付けられる複数のバーコード配列を含む、請求項29から57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の測定値が、RNA−seq、ATAC−seq、インサイチュシーケンシングおよび細胞形態の測定値からなる群から選択される、請求項58に記載の方法。
- (g)前記第1の複数の細胞に複数の蛍光プローブを導入すること、
(h)前記第1の複数のバーコード配列に前記複数の蛍光プローブをハイブリダイズさせるのに十分な条件に前記第1の複数の細胞を供すること、および
(i)前記第1の複数の細胞内の前記第1の複数のバーコード配列にハイブリダイズした前記複数の蛍光プローブを光学的に検出すること、
をさらに含む、請求項29から59のいずれか一項に記載の方法。 - (g)から(i)を1回以上繰り返すことをさらに含む、請求項60に記載の方法。
- (e)または(f)が、外部データベースの使用を含む、請求項29から61のいずれか一項に記載の方法。
- (d)の前に、前記第2の複数の核酸分子を処理して、前記核酸分子を生成することをさらに含み、この核酸分子がその後シーケンシングされる、請求項29に記載の方法。
- 前記処理が、前記第2の複数の核酸分子のコピーを生成することを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記処理が、前記第2の複数の細胞から前記第2の複数の核酸分子を回収することを含む、請求項63に記載の方法。
- 複数の細胞を分析する方法であって、
(a)複数の対象の細胞に由来する複数の細胞を得ること、
(b)それらの起源の対象に従って、前記複数の細胞を差次的にタグ付けすること、
(c)前記複数の細胞の複数の核酸分子に由来する核酸分子をシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを提供すること、および
(d)前記複数の対象のうちの対象に、前記複数のシーケンシングリードのうちの共通のシーケンシングリードを割り当てることであって、前記共通のシーケンシングリードの割当てが、前記複数の細胞間の変動とは無関係に行われること、
を含み、
(c)の前に、バルク増殖環境での前記複数の対象の前記細胞の増殖時に、前記複数の細胞が生成される方法。 - 前記複数の細胞を前記差次的にタグ付けすることが、前記複数の細胞に複数のバーコード配列を導入することを含む、請求項66に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列が、形質導入を介して前記複数の細胞に組み込まれる、請求項67に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列が、ウイルスベクター、トランスフェクション、相同組換え組込み、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、抗体コンジュゲートオリゴヌクレオチドまたはエピソームベクターを使用して、前記複数の細胞に組み込まれる、請求項67に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列のうちのバーコード配列が、1塩基から1000塩基を含む、請求項67から69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象が、複数のヒト対象を含む、請求項66から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象の同一性が、暗号化または曖昧化されている、請求項66から71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が体液に由来する、請求項66から72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が、血液、血漿、尿、汗または唾液を含む、請求項73に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、皮膚細胞または有毛細胞を含む、請求項66から74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が植物細胞を含む、請求項66から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞が、植物の葉または根に由来する、請求項76に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、増殖速度によって層別化される、請求項66から77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によって染色される、請求項78に記載の方法。
- (c)でシーケンシングされた前記複数の細胞が、複数の摂動に関連付けられる複数の摂動バーコード配列を含む、請求項66から79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、小分子、ノックアウト、抗体、細胞間相互作用、RNAi、オープンリーディングフレーム(ORF)およびクラスター化反復短回文配列リピート(CRISPR)単一ガイドリボ核酸(sgRNA)の付加からなる群から選択される、請求項80に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、温度の変化またはpHの変化を含む、請求項80に記載の方法。
- 前記複数の摂動が、遺伝子の変異型の導入を含む、請求項80に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、複数の測定値に関連付けられる複数のバーコード配列を含む、請求項66から83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の測定値が、RNA−seq、ATAC−seq、インサイチュシーケンシングおよび細胞形態の測定値からなる群から選択される、請求項84に記載の方法。
- (e)前記複数の細胞に複数の蛍光プローブを導入すること、
(f)前記複数のバーコード配列に前記複数の蛍光プローブをハイブリダイズさせるのに十分な条件に前記複数の細胞を供すること、および
(g)前記複数の細胞内の前記複数のバーコード配列にハイブリダイズした前記複数の蛍光プローブを光学的に検出すること、
をさらに含む、請求項67に記載の方法。 - (e)から(g)を1回以上繰り返すことをさらに含む、請求項86に記載の方法。
- (d)が、外部データベースの使用を含む、請求項66から87のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項66に記載の方法であって、(c)の前に、前記複数の核酸分子を処理して、前記核酸分子を生成することをさらに含み、この核酸分子がその後シーケンシングされる方法。
- 前記処理が、前記複数の核酸分子のコピーを生成することを含む、請求項89に記載の方法。
- 前記処理が、前記複数の細胞から前記複数の核酸分子を回収することを含む、請求項89に記載の方法。
- 複数の細胞を分析する方法であって、
(a)複数の対象の細胞に由来する複数の細胞を提供することであって、前記複数の細胞が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、複数のバーコード配列を含むこと、
(b)前記複数の細胞の前記複数の核酸分子に由来する核酸分子をシーケンシングし、それにより、前記複数の核酸分子に対応する複数のシーケンシングリードを生成することであって、前記複数のシーケンシングリードの一部が、前記複数のバーコード配列を含むこと、
(c)前記複数のシーケンシングリードを処理することであって、この複数のシーケンシングリードが、前記複数のバーコード配列を含むこと、および
(d)前記複数のバーコード配列のうちのバーコード配列を使用して、前記複数のシーケンシングリードのサブセットを前記複数の対象のうちの対象と関連付けること、
を含み、
前記複数のバーコード配列が、形質導入またはトランスフェクションを介して、前記複数の細胞の前記複数の核酸分子に組み込まれる方法。 - 前記複数の核酸分子のサブセットが、前記複数のバーコード配列を含む、請求項92に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列が、前記複数の細胞に対して内因性である、請求項92に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列のうちのバーコード配列が、1塩基から1000塩基を含む、請求項92から94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象が、複数のヒト対象を含む、請求項92から95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の対象の同一性が、暗号化または曖昧化されている、請求項92から96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が体液に由来する、請求項92から97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が、血液、血漿尿、汗または唾液を含む、請求項98に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、皮膚細胞または有毛細胞を含む、請求項92から99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が植物細胞を含む、請求項92から95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記植物細胞が、植物の葉または根に由来する、請求項101に記載の方法。
- (b)の前に、バルク増殖環境での前記複数の対象の前記細胞の増殖時に、前記複数の細胞が生成される、請求項92から102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞の増殖した細胞が、増殖速度によって層別化される、請求項92から103のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)によって染色される、請求項104に記載の方法。
- (e)前記複数の細胞に複数の蛍光プローブを導入すること、
(f)前記複数のバーコード配列に前記複数の蛍光プローブをハイブリダイズさせるのに十分な条件に前記複数の細胞を供すること、および
(g)前記複数の細胞内の前記複数のバーコード配列にハイブリダイズした前記複数の蛍光プローブを光学的に検出すること、
をさらに含む、請求項92から105のいずれか一項に記載の方法。 - (e)から(g)を1回以上繰り返すことをさらに含む、請求項106に記載の方法。
- (c)または(d)が、外部データベースの使用を含む、請求項92から107のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項92に記載の方法であって、(b)の前に、前記複数の核酸分子を処理して、前記核酸分子を生成することをさらに含み、この核酸分子がその後シーケンシングされる方法。
- 前記処理が、前記複数の核酸分子のコピーを生成することを含む、請求項109に記載の方法。
- 前記処理が、前記複数の細胞から前記複数の核酸分子を回収することを含む、請求項109に記載の方法。
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