JP2021522828A

JP2021522828A - ヘテロ接合性ｅｌａｎｅ遺伝子の対立遺伝子の差次的ノックアウト

Info

Publication number: JP2021522828A
Application number: JP2020563637A
Authority: JP
Inventors: バラム，デヴィッド; イザール，リオール; ヘルマン，アサエル; エマニュエル，ラフィ; マシアッチ，ミカルゴラン; ジョージソン，ジョセフ
Original assignee: エメンドバイオインコーポレーテッド
Priority date: 2018-05-06
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2021-09-02
Also published as: EP3790980A4; EP3790980A1; WO2019217294A1; US20210363547A1

Abstract

細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、細胞に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組成物を導入することを含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０１８年１０月９日に出願された米国仮出願第６２／７４３，３０９号、２０１８年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／７２３，９４１号、２０１８年５月６日に出願された米国仮出願第６２／６６７，５３６号の利益を主張するものであり、その各々の内容を参照により本明細書に援用される。

本出願を通じて、丸括弧で参照されることを含んで、各種出版物が参照される。本出願において言及される全ての出版物の開示は、本発明が属する当該技術及び本発明とともに利用されることができる当該技術分野の特徴の追加の記述を提供するために、その全体を参照により本出願に援用される。

配列リストに対する参照
本出願は、「１９０５０６＿９０５２２−Ａ−ＰＣＴｊＳｅｑｕｅｎｃｅＪＬｉｓｔｉｎｇ＿ＡＤＲ．ｔｘｔ」と名前をつけたファイルに存在するヌクレオチド配列を参照により援用し、このファイルはサイズが２４９キロバイトであり、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓと互換性があるオペレーションシステムを有する、ＩＢＭ−ＰＣ機械フォーマットにおいて２０１９年５月３日に作成され、２０１９年５月６日に本出願の一部として提出されたテキストファイルに含まれる。

ヒトゲノムには、挿入及び欠失、反復配列のコピー数の差並びに一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、いくつかの種類のＤＮＡの変動がある。ＳＮＰは、ゲノム中の一塩基（アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）又はグアニン（Ｇ））がヒト対象間又は個人の一対の染色体間で異なるときに生じるＤＮＡ配列の変動である。長年にわたって、種々のタイプのＤＮＡの変動はピンポイントの遺伝形質若しくは疾患因果関係についての研究のマーカーとして又は遺伝性障害の潜在的原因としてのいずれかで研究コミュニティの中心となってきた。ＳＮＰは通常、良性で疾患の原因ではないと考えられている。

遺伝性障害は、ゲノム中の１つ又は複数の異常によって起こる。遺伝性障害は、「ドミナントな」又は「潜性」のいずれかとみなされてもよい。潜性遺伝性障害は、提示されるためには２コピーの（すなわち２個の対立遺伝子の）異常／欠損遺伝子が必要となる障害である。対照的に、ドミナントな遺伝性障害では、正常な（機能性の／健康な）遺伝子又は遺伝子群にわたって優位を示す遺伝子又は遺伝子群が関与する。このように、ドミナントな遺伝性障害においては、特定の遺伝性障害の症状を引き起こす又は寄与するためには１コピー（すなわち対立遺伝子）のみの異常欠損遺伝子しか必要とされない。このような変異には、例えば変化した遺伝子産物が新しい分子機能又は遺伝子発現の新しいパターンを持つ機能獲得型変異が含まれる。機能獲得型変異は、一般的にドミナントネガティブ変異である。ドミナントネガティブ変異の例は、１個の対立遺伝子が突然変異して機能を失い、残された単一の野生型対立遺伝子が特定の細胞機能に十分なほどの必要なタンパク質を作成しないハプロ不全である。他の例には、野生型対立遺伝子に対して拮抗的に働く遺伝子産物を有するドミナントネガティブ変異が含まれる。

好中球減少症
好中球減少症は、血液循環中の好中球の絶対数の減少と定義され、通常末梢血液中の好中球絶対数（ＡＮＣ）を測定することにより診断される。好中球減少症の重症度は、ＡＮＣが１０００〜１５００／μＬであると軽度、ＡＮＣが５００〜１０００／μＬであると中等度、又はＡＮＣが５００／μＬ未満であると重度とみなされる（Ｂｏｘｅｒ２０１２）。

好中球減少症は、先天性（遺伝性）又は後天性に分類することができる。先天性条件での、通常常染色体性優性遺伝の２つの主要なタイプは、周期性好中球減少症（ＣｙＮ）及び重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）である。周期性好中球減少症は、好中球数が正常レベルからゼロまで変動することにより特徴づけられる一方、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）は、出生時に非常に低いＡＮＣ（５００／ｍＴ）が認められ、前骨髄球／骨髄球ステージで骨髄中の骨髄造血の成熟化が停止し、細菌感染症を早期発症することにより特徴づけられる（Ｃａｒｌｓｓｏｎｅｔａｌ．２０１２；Ｈｏｒｗｉｔｚら、２０１３）。

ＳＣＮを、血液中の非常に低いＡＮＣを測定し、骨髄穿刺法を検査して骨髄成熟の停止を同定することにより診断してもよい（Ｄａｌｅ２０１７）。ＳＣＮは、通常生後６か月前に診断される一方、ＣｙＮの診断は、概して生後２年の間、又はそれ以降になされ、主要な臨床所見は反復性急性口腔医学的疾患である。ＳＣＮが疑われるとき、悪性血液疾患を除外し、細胞充実度を決定し、骨髄成熟度を評価し、正確な原因の徴候を検出するために、今では細胞遺伝学的骨髄試験が決定的である、骨髄検査が必要となることが多い。ＳＣＮ及びＣｙＮを評価する際、抗好中球抗体アッセイ、免疫グロブリンアッセイ（ＩｇＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリプシノーゲン及び糞便エラスターゼ）並びに脂溶性ビタミンレベル（ビタミンＡ、Ｅ及びＤ）も関心事項である（Ｄｏｎａｄｉｅｕ２０１１を参照）。

ＳＣＮは、常染色体性―潜性（ＨＡＸ１、Ｇ６ＰＣ３）、常染色体性―ドミナント（ＥＬＡＮＥ、ＧＦＩ１）又はＸ染色体連鎖（ＷＡＳ）型の遺伝であることができ、又は孤発性に生じることもできる（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、２０１２；Ｂｏｘｅｒ２０１２）。

周期性及び先天性好中球減少症は、「好中球エラスターゼ遺伝子」（ＥＬＡＮＥ遺伝子）―好中球エラスターゼのための遺伝子の突然変異によって引き起こされることが最も多い。ＥＬＡＮＥ遺伝子変異は、ＳＣＮ患者の４０〜５５％で同定され、男性と女性は等しく発症する（Ｄｏｎａｄｉｅｕら、２０１１；Ｄａｌｅ２０１７）。ＥＬＡＮＥ遺伝子中の突然変異は、常染色体性及び孤発性のＳＣＮの症例と関連している（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、２０１２）。今日までに、２００種類を超える様々なＥＬＡＮＥ突然変異が同定されてきており、全てのエキソン並びにイントロン３及びイントロン４にわたってランダムに分布している（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。例えば予後不良に特に関連づけられるＣ１５１Ｙ及びＧ２１４Ｒなどの、ＣｙＮ及びＳＣＮに関連する１２０種類を超える別個のＥＬＡＮＥ遺伝子変異が今では知られている（ＣｙＮ及びＳＣＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子の包括的リストについては、Ｍａｋａｒｙａｎら、２０１２を参照；またＧｅｒｍｅｓｈａｕｓｅｎら、２０１３を参照）。

ＥＬＡＮＥは、好中球細胞外トラップ（病原体と結合する繊維のネットワーク）の機能に関与する好中球エラスターゼ（ＮＥ）をコードする。いくつかの研究から、変異ＥＬＡＮＥの産物は、骨髄での好中球の産出を妨害し、好中球減少症を引き起こすことが示唆されている。これらの研究から、ＮＥでの突然変異は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を惹起し、骨髄での好中球形成プロセスにおける細胞損失につながることが分かる（Ｍａｋａｒｙａｎら、２０１７）。

現在の治療
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、ＳＣＮの第一選択治療とみなされる（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ及びＬｅｖｉｎｅ２０１２）。Ｇ−ＣＳＦは、より多い好中球の生産を刺激し、アポトーシスを遅延させる（Ｓｃｈａｆｆｅｒ及びＫｌｅｉｎ２００７）。ＳＣＮ患者の１０％はまだ重度の細菌性感染症又は敗血症で死亡するけれども、悪性病変が発生している患者を含めて、全体の生存率は今では８０％を超えると推定される（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。Ｇ−ＣＳＦ療法は敗血症での死亡数を防止することに成功しているけれども、長期治療するとＳＣＮ患者に骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病が発生するリスクが高まることと関連することが明らかになった。ＳＣＮにおいて最も一般的な白血病は、ＡＭＬであるが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び二重表現型白血病も文献に報告されている（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ，及びＬｅｖｉｎｅ２０１２）。Ｇ−ＣＳＦに強い応答がある（投与量８μｇ／ｋｇ／ｄａｙ未満）患者は、Ｇ−ＣＳＦ時から１５年後ＭＤＳ／白血病の発症について累積発症率が１５％だった一方、高投与量にも関わらずＧ−ＣＳＦに対して応答不良だった患者の発症率は３４％だったとこれまでに報告された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、２０１０）。

造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、Ｇ−ＣＳＦ療法に応答しない又はＡＭＬ／ＭＤＳが発症した患者に対しての代替的な根治療法である。しかしながら、ＨＣＴを受ける慢性好中球減少症患者には、真菌及び移植片対宿主病などの感染性合併症が発症するリスクが高い（Ｓｋｏｋｏｗａら、２０１７）。さらに、ＨＣＴでは、生存率を改善するためには適合血縁ドナーが必要となるが、ほとんどの患者には利用可能な適合ドナーがいない（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｃｈｏｉ，及びＬｅｖｉｎｅ２０１２）。

開示されるのは、ドミナントな変異対立遺伝子を破壊する又は生じたｍＲＮＡを分解することによりドミナントな変異対立遺伝子の発現をノックアウトする手法である。

本開示は、一方の対立遺伝子は変異が疾患表現型を生じる変異タンパク質をコードするような変異を保持し（「変異対立遺伝子」）、他方の対立遺伝子は機能性タンパク質をコードする（「機能性対立遺伝子」）、遺伝子の２個の対立遺伝子間を識別／区別するために少なくとも１つの自然発生のヘテロ接合性ヌクレオチドの差又は遺伝子多型（一塩基多型（ＳＮＰ）等）を利用する方法を提供する。

本発明の実施形態は、ある一定の細胞又は対象においてドミナントな変異対立遺伝子を発現する遺伝子の少なくとも１つのヘテロ接合性ＳＮＰを利用する方法を提供する。本発明の実施形態において、利用されるＳＮＰは、疾患表現型と関連してもしなくてもよい。本発明の実施形態において、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異対立遺伝子中のヘテロ接合性ＳＮＰに存在し、したがって遺伝子の機能性対立遺伝子中の異なるヌクレオチド塩基を有するヌクレオチド塩基を標的とすることにより遺伝子の変異対立遺伝子を標的とする。

いくつかの実施形態において、方法は、変異タンパク質の発現をノックアウトし、機能性タンパク質の発現を許容するステップをさらに含む。

本発明は、細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法を提供する。

本発明は、本発明の方法によって取得される改変細胞を提供する。

本発明は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細胞を提供する。

本発明は、改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

本発明は、本発明の細胞と薬学的に許容される担体とを混合することを含む、組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法を提供する。

本発明は、インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、及び対象から細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の改変細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、を含む、方法を提供する。

本発明は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用を提供する。

本発明は、治療有効量の本発明の改変細胞、組成物又は方法によって調製された組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法を提供する。

本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
ａ）対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法を提供する。

本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、自家改変細胞は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断するように改変され、
上記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を細胞に導入することから生じ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断することに影響する、投与すること、を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法を提供する。

本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択する方法であって、方法は、
ａ）対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を求めて選別し、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された対象の細胞を配列決定することによりｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、そして
ｄ）治療のために１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみを選択するステップ、を含む方法を提供する。

本発明の実施形態は、
ｅ）対象の骨髄から末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいずれかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）のＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が第１の二本鎖切断することに影響した１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲが第２の二本鎖切断することに影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること、
ｇ）対象にステップ（ｆ）の改変細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさらに含む。

本発明は、配列番号１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ分子を提供する。

本発明は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方法は、細胞に本発明のＲＮＡ分子又は組成物を送達することを含む、方法を提供する。

本発明は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物の使用を提供する。

本発明は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を含む薬物であって、細胞に本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。

本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、本発明の方法、本発明の改変細胞、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物、又は本発明のＲＮＡ分子の使用を提供する。

本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。

本発明は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列、及び細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を細胞に送達するための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供する。

本発明は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するようＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡをＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットを提供する。

本発明は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変細胞、及び細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう組成物を細胞に送達するための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供する。

本発明は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変細胞をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットを提供する。

図１。ＳＮＰ位置の上流からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲまでのプロモーター領域を切除する。１つの実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略ｌａ−ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略ｌｂ−ｒｓ３７６ｌ００５）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。図２。ＳＮＰ位置の上流からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲまでのプロモーター領域を切除する。１つの実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略ｌａ−ｒｓ１０４１４８３７、戦略ｌｂ−ｒｓ３７６１００５）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。別の実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域ヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略ｌａ−ｒｓ１０４１４８３７、戦略ｌｂ−ｒｓ３７６１００５）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする。図３。イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流の領域までを切除する。１つの実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域ヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略２−ｒｓ１６８３５６４）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。別の実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略２−ｒｓ１６８３５６４）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。さらなる実施例において、第１のガイド配列は変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的配列を標的とし（戦略２−ｒｓ１６８３５６４）、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする。図４。イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流の領域までを切除する。この戦略は、健常な対立遺伝子を無傷のままにする一方、疾患発症性対立遺伝子（「変異対立遺伝子」）を特異的にノックアウトするよう設計される。対立遺伝子特異的編集は、集団におけるヘテロ接合頻度が比較的高い区別する（ヘテロ接合性）ＳＮＰ位置を標的とするガイドを使用することにより達成される。図５。ヘテロ接合性頻度及び選択ヘテロ接合性ＳＮＰ間の重複／連鎖に基づく集団内の予想される適用範囲。３個の治療戦略の代替解決策を設計すると、集団の約８０％を含めることができてもよい。集団の約８０％は、上記リストから１つ又は複数のヘテロ接合性ＳＮＰを保持していると評価される。そのうち３３％は１つのヘテロ接合性ＳＮＰを保持し、３１％はリストから２個のヘテロ接合性ＳＮＰを保持し、１６％は３個のヘテロ接合性ＳＮＰを保持する。一方で、２０％は上記リストのいかなるＳＮＰも保持しない。図６。ＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに播種した（３Ｋ／ウェル）。２４時間後、６５ｎｇのＷＴ−Ｃａｓ９又はＤｅａｄ−Ｃａｓ９及びｇ３６〜ｇ６６として識別され、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ試薬（サーモサイエンティフィック）を使用してＥＬＡＮＥの異なる領域及びＳＮＰを標的とする、２０ｎｇのｇＲＮＡプラスミドで同時導入した。編集の割合を以下の式にしたがって算出した。１００％−（未編集バンド強度／全バンド強度）Ｘ１００。３個の独立した実験のＤｅａｄ−Ｃａｓ９バックグラウンド活性を減算した後の各ｇＲＮＡの平均活性±ＳＤを示す。図７。健常ドナーからのＨＳＣをｓｐＣａｓ９−ＷＴ及びＥＭＸ１（ｓｇＥＭＸｌ）又はＥＬＡＮＥ（ｇ３５：ＩＮＴ４；ｇ５８：ｒｓ３７６ｌ００５；ｇ６２：ｒｓ１６８３５６４）のいずれかを標的とするｇＲＮＡのＲＮＡ構成要素でヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）。ヌクレオフェクション後７２時間で、ｇＤＮＡを抽出し、編集レベルをＩＤＡＡにより定量した。二度繰り返して実施された２個の独立した実験の平均編集％±ＳＤを示す。図８。ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子の特異的ノックアウトは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のイントロン４及びエキソン５を切除することにより媒介される。これは対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために、イントロン４でのＤＳＢを媒介しＳＮＰｒｓ１６８３５６４を利用することにより成し遂げられる。

本発明の実施形態は、細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子を含む組成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法を提供する。

本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、変異対立遺伝子は、１つ又は複数の多型部位に基づいて二本鎖切断のための標的とする。

本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、変異対立遺伝子は、１つ又は複数の多型部位での変異対立遺伝子の配列に基づいて二本鎖切断のための標的とする。

本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヌクレオチド塩基に基づいてＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、組成物は、１、２、３又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでもよい。本発明の実施形態において、組成物を細胞に導入することは、細胞に１、２、３又は複数の組成物を導入することを含む。本発明の実施形態において、各組成物は、異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列又は同一のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもしくはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含んでもよい。２個のＲＮＡ分子を含む本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ分子と同じＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成してもよいし、別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成してもよい。

本発明の実施形態において、第２の二本鎖切断は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内である。本発明の実施形態において、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域は、イントロン又は非翻訳領域（ＵＴＲ）から選択される。本発明の実施形態において、非コード領域は、イントロン３又はイントロン４である。本発明の実施形態において、ＵＴＲは、３’ＵＴＲである。

本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は、配列番号：１〜１１９２の何れか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドを含む。

本発明の実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部は、配列番号：１〜１１９２の何れか１つ、又は配列番号１１９３〜２０００の何れか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列にある１７〜２０個のヌクレオチドを含む。

本発明の実施形態において、第２の二本鎖切断は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内である

本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。

いくつかの実施形態においては、細胞は、ＥＬＡＮＥｒｓ１０４ｌ４８３７の多型部位でヘテロ接合性であり、１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は、１７〜２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：８２、８６、９３、９４、１１５、１１９、１３５、１７３、１８０、２１３、２１５、２２４、２２５、２６２、２６３、３０７、３０８、３１９、３２３、３５１、３５２、３７４、４６１、４６２、４６６、４６７、４７４、４７７、４７８、４９１、５０４、５０５、５３３、５３７、５３８、５５０、５５６、５６９、５７０、５８３、５８４、６８４、６８５、７１４、７４５、７９０、７９１、８４５、８４６、８５４、８５７、８５８、８６１、８６３、８６４、８８０、８８１、８８６、８９０、８９１、９０１、９１１、９１２、９３６、９３７、９３９、９４０、９６０、９６１、９７２、９７８、９７９、９８３、９８４、１０１８、１０３４、１０３５、１０４０、１０８６、１１１０、１１１１、１１３５、１１４４及び１１４５の何れか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列を含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、細胞は、ＥＬＡＮＥｒｓ３７６ｌ００５の多型部位でヘテロ接合性であり、１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は１７〜２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：２６、５７、６５、６６、７０、１８７、１８８、１９１、２０６、２２０、２２１、２４３、２４５、２６１、２７５、３５６、３５７、３９２、４１７、４１８、４３１、４４１、４４２、４４７、４８８、５１３、５１４、５４５、５４６、５４８、５９８、５９９、６０４、６０７、６０８、６１２、６１３、６３９、６４８、６５８、６５９、６６０、６８０、６８１、７４２、７４３、７５５、７５６、７５９、７６２、７６３、７６７、７７１、７７２、７７３、７８６、７８７、８１５、８１６、８１８、８１９、８２０、８３１、８３６、８４９、８５０、８７０、８７１、８９８、８９９、９０７、９０８、１００９、１０１０、１０１３、１０２３、１０２９、１０３０、１０８２、１０８３、４０９３、１０９９、１１００、１１０１、１１０７、１１０８及び１１８２の何れか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列を含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、細胞は、ＥＬＡＮＥｒｓ１６８３５６４の多型部位でヘテロ接合性であり、１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断に影響しない。このような実施形態において、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部は１７〜２０個のヌクレオチドを有して含み、配列番号：５２、８７、１２２、１６４、１７５、１９９、２１４、２９０、３２６、３４５、３４６、３７３、４０４、４１２、４３６、４３７、４５１、４５２、４８３、４８４、５１７、５２０、５２５、６１７、６１８、６２１、６４１、６６１、６７６、７２２、７３６、８０６、８５５、８５６、８７８、８７９、８８８、８８９、８９６、９０３、９０５、９１３、９１４、９２９、９３３、９３４、９３５、９８２、９９８、１０２１、１０２２、１０２６、１０４６、１０４７、１０５３、１０９７、１１２１、１１２２、１１２４、１１２６、１１２７、１１３１、１１３４、１１７５、１１７６、１１８３及び１１９０の何れか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列を含んでもよい。

本発明の実施形態は、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する細胞を、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である。

本発明の実施形態は、第１にＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であること、及び対象から細胞を取得することを含む。

本発明の実施形態は、細胞を対象から動員によって及び／又はアフェレシスによって取得することを含む。

本発明の実施形態は、細胞を対象から骨髄穿刺法によって取得することを含む。

本発明の実施形態において、組成物を細胞に導入する前に細胞を予備刺激する。

本発明の実施形態は、細胞を培養増殖して細胞群を取得することを含む。

本発明の実施形態において、細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦのうちの１つ又は複数とともに培養する。

本発明の実施形態において、細胞を少なくとも１つのサイトカインとともに培養する。

本発明の実施形態において、少なくとも１つのサイトカインは、組換えヒトサイトカインである。

本発明の実施形態において、細胞は、複数の細胞の中の１つであり、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子の両方を含む組成物を、複数の細胞の中の少なくとも細胞及び他の細胞に導入し、そして複数の細胞の中の少なくとも細胞及び他の細胞中のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改変細胞を取得する。

本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子を含む組成物を導入すること又は第２のＲＮＡ分子の導入は、細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む。

本発明の実施形態は、本発明の方法によって取得される改変細胞を提供する。

本発明の実施形態においては、改変細胞をさらに培養増殖する。

本発明の実施形態において、改変細胞は、生着することができる。

本発明の実施形態において、改変細胞は、患者に注入すると長期生着することができ、注入後少なくとも１２か月間で、好ましくは少なくとも２４か月間で、そしてさらに一層好ましくは注入後少なくとも３０か月間で分化造血細胞を生じる。さらなる実施形態において、改変細胞は、自家対象に注入すると長期生着することができる。さらなる実施形態において、改変細胞は、骨髄破壊せずに対象に注入しても長期生着することができる。本発明の実施形態において、改変細胞は、ヒトである対象に生着すると、長期生着を提供する十分な数で対象に送達される。

本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、子孫細胞を生じることができる。

本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、生着後に子孫細胞を生じることができる。

本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、自家移植後に子孫細胞を生じることができる。

本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる。

１つの実施形態において、細胞又は細胞群は、幹細胞である。１つの実施形態において、細胞は、胚性幹細胞である。１つの実施形態において、幹細胞は、造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。

本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である。

本発明の実施形態において、改変細胞又は改変細胞群は、骨髄細胞又は末梢単核細胞（ＰＭＣ）である。

本発明の実施形態は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細胞を提供する。

本発明の実施形態において、改変細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞から改変された。

本発明の実施形態は、改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

本発明の実施形態は、本発明の細胞と薬学的に許容される担体とを混合することを含む、組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法を提供する。

本発明の実施形態は、インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、及び対象から細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の改変細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、を含む、方法を提供する。

本発明の実施形態は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮに苦しむ対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離することであって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用を提供する。

本発明の実施形態は、治療有効量の本発明の改変細胞、組成物又は方法によって調製された組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法を提供する。

本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
ａ）対象から取得した細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、導入すること、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を培養増殖することであって、改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、培養増殖すること、及び
ｄ）対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法を提供する。

本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、自家改変細胞は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子が二本鎖切断するように改変され、
上記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を細胞に導入するから生じ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するよう、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、投与すること、を含み、
それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法を提供する。

本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択する方法であって、方法は、
ａ）対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を求めて選別し、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された対象の細胞を配列決定することによりｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、そして
ｄ）治療のために１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみを選択するステップ、を含む方法を提供する。

本発明の実施形態は、
ｅ）対象の骨髄から末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいずれかによりＨＳＰＣ細胞を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）のＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する１つ又は複数の多型部位のヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が第１の二本鎖切断することに影響した１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞におけるＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、導入すること、
ｇ）対象にステップ（ｆ）の改変細胞を投与し、それにより対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療するステップをさらに含む。

本発明の実施形態は、配列番号：１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ分子を提供する。

本発明の実施形態は、ガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子をさらに含む。

本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする。

本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部のヌクレオチド配列は、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部の配列とは異なるヌクレオチド配列である。

本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分をさらに含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分をさらに含む。

本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。

本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分をさらに含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分をさらに含む。

本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部分をさらに含む。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部分をさらに含む。

本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでである。本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでである。

本発明の実施形態において、組成物は、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む。本発明の実施形態において、組成物は、１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む。

本発明の実施形態は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方法は、細胞に本発明のＲＮＡ分子又は組成物を送達することを含む、方法を提供する。

本発明の実施形態において、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及びＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子を、対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する。

本発明の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列及びＲＮＡ分子又は複数のＲＮＡ分子を、対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する。

本発明の実施形態において、方法は、
変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することを含み、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、エキソンのエキソン全体又は部分に隣接している領域を標的とする。

本発明の実施形態において、方法は、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体、複数のエキソンを除去すること、又は遺伝子全体を除去することを含む。

本発明の実施形態において、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とする。

本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とする。

本発明の実施形態において、第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とする。

本発明の実施形態において、方法は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により変異対立遺伝子に挿入又は除去を受けさせ、変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生じさせることを生じる。

本発明の実施形態において、フレームシフトは、変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトを生じる。

本発明の実施形態において、フレームシフトにより変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成されるか、フレームシフトにより変異対立遺伝子の転写物のナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる。

本発明の実施形態において、不活性化又は治療により変異対立遺伝子によってコードされる切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる。

本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態において、細胞又は対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が、ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する。

本発明の実施形態は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物の使用を提供する。

本発明の実施形態は、細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を含む薬物であって、細胞に本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。

本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、本発明の方法、本発明の改変細胞、本発明の組成物又は本発明の方法により調製された組成物、又は本発明のＲＮＡ分子の使用を提供する。

本発明の実施形態は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、本発明のＲＮＡ分子、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物又は本発明の改変細胞を送達することにより薬物を投与する、薬物を提供する。

本発明の実施形態は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列、及び細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列を細胞に送達するための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供する。

本発明の実施形態は、本発明のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するようＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットを提供する。

本発明の実施形態は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変細胞、及び細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう組成物を細胞に送達するための説明書を備える、細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキットを提供する。

本発明の実施形態は、本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう本発明の組成物、本発明の方法により調製された組成物、又は本発明の改変細胞をＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキットを提供する。

定義
特に規定がない限り、本明細書において使用される技術的及び／又は科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者の一人によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと類似する又は同等の方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験において使用することができるがも、例示的な方法及び／又は材料は以下に記載されるものである。矛盾のある場合、定義を含む、特許明細書が支配するであろう。さらに、材料、方法及び実施例は例証にすぎず、必ずしも制限することを意図するものではない。

用語「ａ」及び「ａｎ」は、上で、そして本明細書の他の場所で使用するとき、列挙される構成要素の「１つ又は複数」を指すと理解されるべきである。単数形の使用には、特に他に明言されない限り複数形も含まれることは当業者の一人にとって明らかであろう。したがって、用語「ａ」、「ａｎ」及び「少なくとも１つの」は、本出願において交換可能に使用される。

本教示をより良く理解することを目的として、そして本教示の範囲を決して制限せず、他に示されない限り、本明細書及び請求項において使用される量、割合又は比率、及び他の数値を表現する全ての数字は、用語「訳」によって全ての事例において修正されるとして理解されるべきである。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、以下の明細書及び添付の特許請求項に記載されている数値パラメーターは、取得しようとする所望の特性に依存して変動することができる近似である。最低限各数値パラメーターは、報告された有効数字の数を考慮して、そして通常の端数処理方法を適用することにより少なくとも解釈されるべきである。

特に明言されない限り、本発明の実施形態の特徴又は特徴群特有の条件又は関係を修正する「実質的に」及び「およそ」などの形容詞は、この条件又は特質が、それが意図される適用にとって、実施形態の工程として許容できる範囲内と定義されるという意味と理解される。特に他に指示がない限り、本明細書及び請求項における単語「ｏｒ」は、排他的なｏｒよりむしろ包括的な「ｏｒ」とみなされ、それが結合する項目の少なくとも１つ又は任意の組み合わせを示す。

本出願の記述及び請求項において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「有する」の動詞並びにその活用形は、動詞の対象又は対象群が必ずしも構成要素、要素又は動詞の対象若しくは対象群の部分の完全な一覧表ではないことを示すよう使用される。本明細書において使用される他の用語は、当該技術分野において周知の意味によって定義される。

本明細書において使用するとき、用語「ヘテロ接合一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、集団内の対である染色体間で異なるゲノム中の単一のヌクレオチドの位置を指す。本明細書において使用するとき、この位置で最も一般的な又は最も普及しているヌクレオチド塩基は、参照（ＲＥＦ）、野生型（ＷＴ）、共通又は主要形と呼ばれる。この位置であまり普及していないヌクレオチド塩基は、代替（ＡＬＴ）、少数、希少又はバリアント形と呼ばれる。

ＲＮＡ分子の「ガイド配列部」は、特異的な標的ＤＮＡ配列にハイブリッド形成できるヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部は、ガイド配列部の長さにわたって標的とされるＤＮＡ配列と完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態においては、ガイド配列部は、長さが１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド、又は長さがおよそ１７〜２４、１８〜２２、１９〜２２、１８〜２０又は１７〜２０ヌクレオチドである。ガイド配列部の全長は、ガイド配列部の長さにわたって標的とされるＤＮＡ配列と完全に相補的である。ガイド配列部は、ガイド配列部がＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的部として働くＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるＲＮＡ分子の一部であってもよい。ガイド配列部を有するＤＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在すると、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特異的な標的ＤＮＡ配列に対して標的とすることができる。各可能性は、別々の実施形態を表す。ＲＮＡ分子は、いかなる望みの配列を標的とするようカスタム設計することができる。

用語「標的とする」は本明細書において使用するとき、ＲＮＡ分子が標的とされるヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリッドを形成するガイド配列部を指す。用語「標的とする」は、標的とされるヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリッド形成するが、標的上のハイブリッド形成に加えて意図していないオフターゲットのハイブリッド形成も起きるかもしれないような、可変的なハイブリッド形成効率を包含すると理解される。ＲＮＡ分子がある配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ分子の複合体がヌクレアーゼ活性のためにこの配列を標的とすると理解される。

複数の細胞に存在するＤＮＡ配列を標的とするという文脈においては、この標的とすることは、ＲＮＡ分子のガイド配列部が１つ又は複数の細胞の配列とハイブリッド形成することを包含し、またＲＮＡ分子が複数の細胞のうち全てより少ない細胞の標的配列とハイブリッド形成することを包含すると理解される。したがって、ＲＮＡ分子が複数の細胞の配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が１つ又は複数の細胞の標的配列とハイブリッド形成すると理解され、また全てより少ない細胞の標的配列とハイブリッド形成してもよいと理解される。したがって、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が１つ又は複数の細胞の標的配列とハイブリッド形成するのと関連して二本鎖切断を導入し、また全てより少ない細胞の標的配列とハイブリッド形成するのと関連して二本鎖切断を導入してもよい。本明細書において使用するとき、用語「改変細胞」は、標的配列とのハイブリッド形成、すなわち標的上のハイブリッド形成の結果としてＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体により二本鎖切断が引き起こされた細胞を指す。

本発明の実施形態において、ＲＮＡガイド分子は、変異対立遺伝子の多型部位に存在するヌクレオチド塩基に基づいて変異対立遺伝子を標的としてもよい。

本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、配列番号：１〜１１９２のいずれか１つに記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、７５、７６、２５２、２５３、２８７、２９５、２９６、３１１、５３６、５９２、５９５、５９６、５９７、６９５、７２９、７３７、８１２、８３９、９１５、９４７、１０４８、１０４９、１０７０、１０７１、１１６９に記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、７５、７６、９３、９４、９７、９８、１４８、１４９、１７１、１７３、１８０、１８２、１８３、１８４、１８７、１８８、２１３、２３２、２３４、２４９、２５２、２５３、２６４、２７２、２８７、２９１、２９５、２９６、３０５、３０６、３０７、３０８、３１１、３２６、３３３、３３４、３３７、３３８、３３９、３４０、３５１、３５２、３５８、３５９、３７８、３７９、３８５、３８８、３９９、４０８、４１０、４１９、４２０、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３６、４３７、４４９、４５０、４６５、４６８、４７６、４７７、４７８、４８０、４９５、４９７、４９９、５００、５０８、５１１、５２１、５２２、５２３、５２４、５２９、５３０、５３２、５３６、５４２、５４５、５４６、５６４、５６５、５６６、５７３、５７４、５８３、５８４、５９１、５９２、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０１、６０２、６０４、６１２、６１３、６１６、６２２、６２３、６３４、６４４、６４５、６５８、６５９、６６１、６７０、６７１、６７８、６８０、６８１、６８４、６８５、６８８、６８９、６９４、６９５、７１４、７１５、７１６、７２２、７２３、７２４、７２９、７３６、７３７、７３９、７４０、７４５、７５５、７５６、７６０、７６１、７６９、７７０、７７１、７７２、７７５、７７６、７８６、７８７、８０６、８０９、８１２、８１８、８１９、８２１、８２２、８２６、８２９、８３０、８３３、８３４、８３９、８４５、８４６、８６１、８６２、８７４、８７５、８７６、８７７、８８４、８８８、８８９、８９０、８９１、８９３、８９４、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９２５、９２８、９３０、９３１、９３９、９４０、９４２、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５７、９７２、９７４、９８２、９９４、９９８、１００６、１００７、１００８、１０２１、１０２２、１０２６、１０２７、１０２８、１０３１、１０３２、１０３４、１０３５、１０３９、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５７、１０７０、１０７１、１０７２、１０７４、１０７５、１０７６、１０７９、１０８４、１０９０、１０９１、１０９３、１０９４、１０９５、１１１２、１１１３、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２１、１１２２、１１２４、１１４０、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７９に記載されている、又は以下のグループ配列番号：６、１０、１３、１４、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２９、３０、３４、３５、３６、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５７、５８、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、８２、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０７、１０８、１０９．１１５、１１９、１２２、１２３．１２４．１２５．１２６、１２７、１２８、１３０、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９５、１９６、１９８、１９９、２０１、２０３、２０６、２０９、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２３２、２３３、２３４、２３６、２３７、２３８、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２８１、２８２、２８５、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、３０２、３０３、３０５、３０６、３０７、３０８、３１０、３１１、３１４、３１９、３２３、３２６、３２７、３２８、３２９、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４３、３４４、３４５、３４６、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６３、３６４、３６６、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９９、４００、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４１０、４１１、４１２、４１５、４１７、４１８、４１９、４２０、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３５、４３６、４３７、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４９、４５０、４５１、４５２、４５４、４５５、４５６、４５７、４６０、４６１、４６２、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８３、４８４、４８５、４８６、４８８、４８９、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０４、５０５、５０６、５０８、５０９、５１０、５１１、５１３、５１４、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７３、５７４、５７７、５７９、５８０、５８２、５８３、５８４、５８６、５８７、５８８、５９０、５９１、５９２、５９３、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２８、６２９、６３０、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４４、６４５、６４８、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５８、６５９、６６０、６６１、６６３、６６４、６６５、６６７、６７０、６７１、６７２、６７３、６７５、６７６、６７８、６８０、６８１、６８３、６８４、６８５、６８６、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９４、６９５、６９８、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１８、７１９、７２０、７２２、７２３、７２４、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６７、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７５、７７６、７７８、７７９、７８０、７８１、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９４、７９５、７９８、８００、８０１、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２６、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４３、８４４、８４５、８４６、８４９、８５０、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８７０、８７１、８７２、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９０１、９０２、９０３、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９２０、９２１、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３９、９４０、９４２、９４３、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７２、９７４、９７５、９７６、９７８、９７９、９８２、９８３、９８４、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９６、９９７、９９８、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８６、１０９０、１０９１、１０９３、１０９４、１０９５、１０９７、１０９９、１１００、１１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０７、１１０８、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２６、１１２７、１１２８、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１１３８、１１３９、１１４０、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４７、１１４８、１１４９、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１１５８、１１５９、１１６０、１１６２、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７５、１１７６、１１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３に記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む。本発明のいかなる実施形態においても、ＲＮＡ分子のガイド配列部は、配列番号：１〜１１９２の任意の単一の配列に、又は配列の上記グループからの任意の単一の配列に、記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドを含んでもよいと理解される。

本明細書において使用するとき、配列番号に記載されている「近接しているヌクレオチド」は、いかなるヌクレオチドも介在しないで配列番号に記載されている順序のヌクレオチドの配列であるヌクレオチドを指す。

本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２０個のヌクレオチドであってもよく、配列番号：１〜１１９２の任意の１つに記載されている２０個の近接しているヌクレオチドの配列である２０個のヌクレオチドから構成される。本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２０個のヌクレオチドより短くてもよい。例えば、本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが１７、１８又は１９個のヌクレオチドであってもよい。このような実施形態において、ガイド配列部は、それぞれ配列番号：１〜１１９２の任意の１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の、１７、１８又は１９個のヌクレオチドから構成されてもよい。例えば、配列番号：１に記載されている１７個の近接しているヌクレオチドの配列である１７個のヌクレオチドを有するガイド配列部は、以下のヌクレオチド配列の任意の１つから構成されてもよい（近接している配列から除外されるヌクレオチドを取り消し線で印をつけた）。

本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２０個のヌクレオチドより長くてもよい。例えば、本発明の実施形態において、ガイド配列部は、長さが２１、２２、２３又は２４個のヌクレオチドであってもよい。このような実施形態において、ガイド配列部は、配列番号：１〜１１９２の任意の１つに記載されている２０個の近接しているヌクレオチドの配列である２０個のヌクレオチド及び標的配列の３’末端、標的配列の５’末端又は両方に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチドの配列に完全に相補的な追加のヌクレオチドを含む。

本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイド配列部を含むＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列の切断を引き起こすＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。Ｃｐｆｌ等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、さらにｔｒａｃｒＲＮＡ分子なしでＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。あるいは、Ｃａｓ９等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。

本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、さらにｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を含んでもよい。このような実施形態を、ＲＮＡ分子のガイド部とトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の合成融合物として設計してもよい。（Ｊｉｎｅｋ（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ参照）。本発明の実施形態は、また別々のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド配列部を含む別々のＲＮＡ分子を利用してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。このような実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子と塩基対形成を介してハイブリッドを形成してもよく、本明細書に記載される発明の特定の応用において有利になることができる。

用語「ｔｒａｃｒメイト配列」は、ｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対形成を介してハイブリッドを形成し、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するようｔｒａｃｒＲＮＡ分子と十分に相補的な配列を指す。（ＵＳ８９０６６１６参照）。本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分をさらに含んでもよい。

本発明の実施形態によれば、ＲＮＡ分子は、長さが３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０又は１００個のヌクレオチドまでであってもよい。各可能性は、別々の実施形態を表す。本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、長さが１７〜３００個のヌクレオチド、長さが１００〜３００個のヌクレオチド、長さが１５０〜３００個のヌクレオチド、長さが２００〜３００個のヌクレオチド、長さが１００〜２００個のヌクレオチド又は長さが１５０〜２５０個のヌクレオチドであってもよい。各可能性は、別々の実施形態を表す。

本開示の目的においては、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、及び遺伝子産物の合成を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列はコード及び／又は転写配列に隣接してもしなくてもよい。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製開始点、マトリックス結合領域及び遺伝子座調節領域を含むが、かならずしもこれらに限定されるものではない。

「真核」細胞は、真菌細胞（酵母菌等）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞及びヒト細胞を含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書において使用するとき、用語ＨＳＰＣは、造血幹細胞及び造血幹前駆細胞の両方を指す。幹細胞の非限定的な例は、骨髄細胞、骨髄系前駆細胞、多能性前駆細胞、系統限定前駆細胞を含む。

本明細書において使用するとき、「前駆細胞」は、幹細胞に由来し、有糸分裂能力及び多分化能（例えば、１つより多いが全ての種類ではない細胞の成熟系統へと分化又は発達することができる）を保持する系統細胞を指す。本明細書において使用するとき、「造血」又は「赤血球産生」は、各種種類の血液細胞（例えば、赤血球、巨核球、骨髄球（例えば、単球、マクロファージ及び好中球）ならびにリンパ球）ならびに体内（骨髄中等）で形成される他の要素を指す。

用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書において使用するとき、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を開裂することができる酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然源から分離されても由来してもよい。天然源は、任意の生存生物であってもよい。あるいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合開裂能を保持する改変又は合成タンパク質であってもよい。ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して遺伝子改変を成し遂げることができる。

本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するヘテロ接合性多型部位を標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するヘテロ接合性多型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

本開示は、一方の対立遺伝子は変異が疾患表現型を生じる変異タンパク質をコードするような変異を保持し（「変異対立遺伝子」）、他方の対立遺伝子は機能性タンパク質をコードする（「機能性対立遺伝子」）、遺伝子の２個の対立遺伝子間を識別／区別するために少なくとも１つの自然発生のヌクレオチドの差又は遺伝子多型（一塩基多型（ＳＮＰ）等）を利用する方法を提供する。方法は、変異タンパク質の発現をノックアウトし、機能性タンパク質の発現を許容するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ドミナントネガティブな遺伝性障害を治療、寛解又は予防するための方法である。

本発明の実施形態は、ある一定の細胞又は対象においてドミナントな変異対立遺伝子を発現する遺伝子の少なくとも１つのヘテロ接合性ＳＮＰを利用する方法を提供する。本発明の実施形態において、利用されるＳＮＰは、疾患表現型と関連してもしなくてもよい。本発明の実施形態において、ガイド配列を含むＲＮＡ分子は、遺伝子の変異対立遺伝子中のヘテロ接合性ＳＮＰに存在し、したがって遺伝子の機能性対立遺伝子中の異なるヌクレオチド塩基を有するヌクレオチドを標的とすることにより遺伝子の変異対立遺伝子を標的とする。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン又はプロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン又はイントロンに存在する第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、又は第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に存在する非コード領域の配列を標的とする。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター領域、開始コドンまたは非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子の少なくともプロモーターの一部及び／又は開始コドン及び／又はＵＴＲの一部を標的とする。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、プロモーターの一部、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰ、又はＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーターの上流に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、この第２のヘテロ接合性ＳＮＰは、第１のヘテロ接合性ＳＮＰの下流のＥＬＡＮＥ遺伝子に存在し、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター、ＵＴＲもしくはイントロン又はエキソンにあり、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター、プロモーターの上流、又はＵＴＲに存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異誘発遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子及び機能性対立遺伝子の両方のイントロンに存在する配列を標的とするよう設計される。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に存在するプロモーターの上流の配列を標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の位置に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

本発明の実施形態によれば、変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することであって、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、エキソンのエキソン全体又は一部に隣接している領域を標的とする、ことを含む方法が提供される。

本発明の実施形態によれば、遺伝子のオープンリーディングフレーム全体、複数のエキソンを除去すること、又は遺伝子全体を除去すること、を含む方法が提供される。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子はＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン又はプロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン又はイントロンに存在する第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、又は第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に存在するイントロンの配列を標的とする。

本発明の実施形態によれば、第１のＲＮＡ分子又は第１及び第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とする。

本発明の実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とする。

本発明の実施形態によれば、第２のＲＮＡ分子は、イントロンを標的とする。

本発明の実施形態によれば、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により変異対立遺伝子に挿入又は欠失を受けさせ、変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生じさせることを含む方法が提供される。

本発明の実施形態によれば、フレームシフトは、変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトを生じる。

本発明の実施形態によれば、フレームシフトにより変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成される。

本発明の実施形態によれば、フレームシフトにより変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる。

本発明の実施形態によれば、不活性化又は治療により変異対立遺伝子によってコードされる切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる。

本開示の組成物及び方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、予防、寛解又は悪化を遅くするために利用されてもよい。

いくつかの実施形態において、細胞に、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター領域、開始コドン又は非翻訳領域（ＵＴＲ）に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするＲＮＡ分子を送達することにより変異対立遺伝子を不活性化し、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子は、少なくともプロモーターの一部を除去すること及び／又は開始コドン及び／又はＵＴＲの一部を除去することにより不活性化される。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、少なくともプロモーターの一部を除去することを含む。このような実施形態において、１つのＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター又はプロモーターの上流に存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され、別のＲＮＡ分子は、第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、この第２のヘテロ接合性ＳＮＰは、第１のＳＮＰの下流であり、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター、ＵＴＲもしくはイントロン又はエキソンに存在する。あるいは、１つのＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のプロモーター又はプロモーターの上流もしくはＥＬＡＮＥ遺伝子のＵＴＲに存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計されてもよく、別のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子及び機能性対立遺伝子の両方のイントロンに存在する配列を標的とするよう設計される。あるいは、１つのＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子及び機能性対立遺伝子の両方に存在するプロモーターの上流の配列を標的とするよう設計されてもよく、他のガイドは、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン、イントロン、ＵＴＲ又はプロモーターの下流等の、ＥＬＡＮＥ遺伝子の任意の位置に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とする。

いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去するステップを含むエキソンスキッピングステップを含む。変異対立遺伝子の疾患発症性の変異を含むエキソンを除去するには、エキソンのエキソン全体又は一部に隣接している領域を標的とする２個のＲＮＡ分子が必要とされる。疾患発症性の変異を含むエキソンの除去は、野生型の活性の一部又は全てを保持する残りのタンパク質生成物の発現を許容しながらタンパク質の疾患発症活性を除去するよう設計されてもよい。単一のエキソンスキッピングの代わりとして、複数のエキソン、オープンリーディングフレーム全体又は遺伝子全体を、切除されることが望まれる領域に隣接している２個のＲＮＡ分子を使用して切除することができる。

いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、２個のＲＮＡ分子を細胞に送達することを含み、１つのＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン又はプロモーターに存在する第１のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第１のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とし、他のＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の同一の又は異なるエキソン又はイントロンに存在する第２のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在する第２のＳＮＰのヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするか、又は第２のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子又は機能性対立遺伝子の両方に存在するイントロンの配列を標的とする。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが変異対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とし、それにより変異対立遺伝子の選択的スプライシングシグナル配列を破壊するために使用する。

変異対立遺伝子を不活性化するための上述した戦略の任意の１つ又は組み合わせを、本発明の文脈において使用してもよい。

変異対立遺伝子を不活性化するために、さらなる戦略を使用してもよい。例えば、本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせるためにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子のエキソン又はスプライス部位に向けさせ、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構によりヌクレオチドを挿入又は欠失させ、変異対立遺伝子のフレームシフト変異を形成させるために使用される。フレームシフト変異により、（１）変異対立遺伝子に早期の終止コドンが作成されることにより変異対立遺伝子が不活性化するかノックアウトされ、切断型タンパク質が作成されてもよく、又は（２）変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じてもよい。さらなる実施形態において、１つのＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子のプロモーターに向けさせるために使用される。

いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子を不活性化する方法は、機能性タンパク質の活性を活性化／増強することができる、タンパク質／ペプチド、タンパク質／ペプチドをコードする核酸又は化学物質等の小分子を提供すること等により機能性タンパク質の活性を増強することをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ＲＮＡがガイドするＤＮＡヌクレアーゼと結合する／関連している及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ＲＮＡがガイドするＤＮＡヌクレアーゼを関心のある遺伝子の変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間に差がある少なくとも１つのヌクレオチド（ヘテロ接合性ＳＮＰ等）を含む配列（機能性対立遺伝子には存在しない変異対立遺伝子の配列等）に向けさせるＲＮＡ分子を提供する。

いくつかの実施形態において、方法は、関心のある遺伝子の変異対立遺伝子を対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣａｓ９タンパク質等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと接触するステップを含み、対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣａｓ９タンパク質等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、関心のある遺伝子の機能性対立遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なる、関心のある遺伝子の変異対立遺伝子のヌクレオチド配列と結合し、それによって変異対立遺伝子を改変又はノックアウトする。

いくつかの実施形態において、対立遺伝子特異的ＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、関心のある遺伝子をコードする細胞に導入される。いくつかの実施形態において、関心のある遺伝子をコードする細胞は、哺乳類対象にある。いくつかの実施形態において、関心のある遺伝子をコードする細胞は、植物にある。

いくつかの実施形態において、開裂した変異対立遺伝子は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により挿入又は欠失を受けさせ（インデル）、変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生成する。いくつかの実施形態において、生成されたフレームシフトにより、変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトが生じる。いくつかの実施形態において、生成されたフレームシフトにより変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成され、切断型タンパク質が生成する。このような実施形態において、方法は、変異対立遺伝子によってコードされた切断型タンパク質及び機能性対立遺伝子によってコードされた機能性タンパク質を生じる。いくつかの実施形態において、本発明の方法を使用して変異対立遺伝子に生成されたフレームシフトにより、変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる。

いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子は、「好中球エラスターゼ」遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）の対立遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＳＣＮ又はＣｙＮ遺伝性障害に関連する変異配列と共存する／関連づけられるＥＬＡＮＥ遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰを標的とし、上記ＳＮＰのヘテロ接合性は、集団内で高度に蔓延している。本発明の実施形態において、ＲＥＦヌクレオチドは、治療すべき個々の対象の変異対立遺伝子には蔓延しているが、機能性対立遺伝子には蔓延していない。本発明の実施形態において、ＡＬＴヌクレオチドは、治療すべき個々の対象の変異対立遺伝子には蔓延しているが、機能性対立遺伝子には蔓延していない。いくつかの実施形態において、変異ＥＬＡＮＥ遺伝子内の疾患発症性の変異が標的とされる。

本発明の実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、ＥＬＡＮＥ関連疾患表現型に関連していてもしていなくてもよい。本発明の実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、ＥＬＡＮＥ関連疾患表現型に関連している。本発明の実施形態において、ＳＮＰは、ＥＬＡＮＥ関連疾患表現型に関連していない。

いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、関心のある遺伝子のエキソン内にある。このような実施形態において、ＲＮＡ分子のガイド配列部は、関心のある遺伝子のエキソンを標的とするよう設計されてもよい。

いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、関心のある遺伝子のイントロン又はエキソン内にある。いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、イントロンとエキソンの間のスプライス部位にある。いくつかの実施形態において、ヘテロ接合性ＳＮＰは、関心のある遺伝子のＰＡＭ部位にある。

当業者は、本発明の実施形態の各々において、個別に、本発明のＲＮＡ分子の各々は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する関心のある標的ゲノムＤＮＡ配列に関連しているような、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ヌクレアーゼと複合体を形成することができることを、理解するであろう。次にヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内部に二本鎖切断を作成する。したがって、本発明の実施形態において、本発明のガイド配列とＲＮＡ分子は、ＰＡＭ部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチド上流又は下流の位置を標的としてもよい。

それゆえに、本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ヌクレアーゼと複合体を形成している本発明のＲＮＡ分子は、標的部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８遺伝子上流又は下流の対立遺伝子で二本鎖切断に影響してもよい。当業者は、ヘテロ接合性多型部位が存在し、標的を明確化するために使用されるならば、ＲＮＡ分子は、ヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基のみを標的として二本鎖切断に影響するよう設計されてもよいことを理解するであろう。

ヘテロ接合性多型部位がＰＡＭ部位内部にあるならば、ＲＮＡ分子は、ＰＡＭ部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチド上流又は下流の配列を標的とするよう設計されてもよく、ＲＮＡ分子とヌクレアーゼの複合体は、ＰＡＭ部位のヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１つのみを標的としてＰＡＭ部位での切断に影響するよう設計され、例えばｔｒａｃｒＲＮＡは、ヘテロ接合性多型部位のＲＥＦ又はＡＬＴヌクレオチド塩基の１つを標的とするよう設計されることが理解される。

本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子に存在するヘテロ接合性多型部位を標的とするよう設計され、ＲＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子に存在するヘテロ接合性多型部位のヌクレオチド塩基、ＲＥＦ又はＡＬＴを標的とするよう設計される。

本発明の実施形態において、ＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬物は、ヘテロ接合体ＥＬＡＮＥ遺伝子に起因する疾患表現型を有する対象を治療するために利用される。本発明の実施形態において、疾患は、ＳＣＮ又はＣｙＮである。このような実施形態において、方法は、疾患表現型を改善、寛解又は予防する。

本発明の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬物は、対象を治療するにＳＣＮ又はＣｙＮのための第２の治療と組み合わせて使用される。本発明の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬物は、第２の治療の投与前に、第２の治療の投与中に及び／又は第２の治療の投与後に投与される。

本発明の実施形態において、本発明のＲＮＡ分子、組成物、方法、細胞、キット又は薬物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）治療と組み合わせて投与される。

上記の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子（類）及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子が対象又は細胞内で同時に効果的であることを指す。ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ分子（類）及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を実質的に同時に送達することができ、又は異なる時点で送達できるが同時に効果を持つことができる。例えば、これには、ＲＮＡ分子及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子が対象又は細胞内に実質的に現存する前に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを対象又は細胞に送達することが含まれる。

本発明の実施形態によれば、細胞の、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を選択すること、
ｂ）細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断には影響しない、導入すること、を含み、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供する。

本発明の実施形態によれば、細胞の、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方法は、
ａ）ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を選択するステップ、
ｂ）細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入するステップであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、ＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断には影響しない、ステップを含み、
方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することを含み、第２のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供する。

本発明の実施形態によれば、細胞の、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連している変異を有するＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、方法は、
細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、導入すること、を含み、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供する。

本発明の実施形態によれば、細胞の、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であるＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、方法は、
細胞に
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することを含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することを含み、第２のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより細胞内のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化する、方法を提供する。

本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子の複合体は、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響するが、細胞のＥＬＡＮＥ遺伝子の機能性対立遺伝子における二本鎖切断には影響しない。

本発明の実施形態において、細胞はまた、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の少なくとも１つのさらなる多型部位でヘテロ接合性である。

本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する細胞は、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象由来であってもよい。したがって、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する細胞を選択することは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象を選択することを含んでもよい。本発明のさらなる実施形態において、細胞を選択することは、ＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象由来の細胞を選択することを含んでもよい。本発明の実施形態において、本主題発明の組成物を細胞に導入することは、本発明の組成物をＥＬＡＮＥ遺伝子変異で苦しんでいる対象の細胞に導入することを含んでもよい。

したがって、本発明の実施形態において、細胞の、対象のＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するであって、方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを引き起こすＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有し、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４ｎから成る群から選択されるＥＬＡＮＥ遺伝子の１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である対象を選択するステップを含む、方法が提供される。

したがって、本発明の実施形態は、ＥＬＡＮＥ遺伝子を求めて対象又は細胞を選別することを包含する。当業者は、非限定的な例として、例えば、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、サンガー塩基配列決定法、核型分析、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法、及び／又はマイクロアレイ試験等の、従来技術のＥＬＡＮＥ遺伝子内の変異を選別する方法を容易に理解するだろう。本発明の実施形態においては、ＥＬＡＮＥ遺伝子内の変異をエキソン配列決定法により選別する。

本発明の実施形態において、対象は、末梢血液中の好中球絶対数（ＡＮＣ）を測定することによりＳＣＮ又はＣｙＮと診断される又は診断された。本発明の実施形態において、ＳＣＮは、対象が生後６か月に達する前に診断される又は診断された。本発明の実施形態において、ＣｙＮは、生後１２か月と２４か月の間に、又は生後２４か月の後に診断される又は診断された。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮは、１つ又は複数の再発性急性口腔医学的疾患によって診断される。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮは、骨髄検査によって診断され、好ましくは、骨髄検査は、細胞遺伝学的骨髄調査である。本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮは、抗好中球抗体アッセイ、免疫グロブリンアッセイ（ＩｇＧＡＭ）、リンパ球免疫表現型検査、膵臓マーカー（血清トリプシノーゲン及び糞便エラスターゼ）並びに脂溶性ビタミンレベル（ビタミンＡ、Ｅ及びＤ）のうちの１つ又は複数によって診断される。全ての診断方法を他のいかなる診断方法とともに使用してもよいことが理解される。

本発明の実施形態において、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象は、ＥＬＡＮＥ遺伝子のＥＬＡＮＥ病原性変異を同定するためにエキソンシーケンシングにより選別される。さらなる実施形態において、対象は、表１の少なくとも１つのＳＮＰのヘテロ接合性を確認するためにサンガーシーケンシングにより選別される。本発明の実施形態において、ＳＮＰは、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓＩ０４ｌ４８３７及びｒｓ３７６１００５のうちの１つである。本発明の実施形態において、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰのヌクレオチドは、ＢＡＣｂｉｏを使用して決定される。本発明の実施形態において、表２にしたがって適切なガイドを選択する。本発明の実施形態において、選択されたガイドは、対象から取得した、ＰＢＭＣ等の、細胞に導入され、細胞の病原性ＥＬＡＮＥ変異の減少は、次世代シーケンス技術等によって測定される。

ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムを用いると、ヌクレアーゼを疾患発症性の変異に立ち向かう配列特異的な様式で標的部位を標的とすることができる。造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は自己複製と分化の両方の能力があるので（Ｙｕ，Ｎａｔａｎｓｏｎ，ａｎｄＤｕｎｂａｒ２０１６）、治療可能性がある。したがって、本発明の実施形態は、ゲノム編集をＨＳＰＣに適用する。

本発明の実施形態において、自家製治療では、ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された患者由来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集した自家ＣＤ３４＋造血幹細胞を利用する。本発明の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄又は患者にアフェレシスした後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離される。

ＳＣＮ又はＣｙＮ等の、ドミナントネガティブ（又は複合ヘテロ接合性）の徴候がある場合、戦略は、変異対立遺伝子を編集することであり、ヘテロ接合性ＳＮＰ配列を標的とすることにより変異していない対立遺伝子又は他のオフターゲットの開裂を避けることである。

本発明の実施形態は、以下のステップを含む。
本明細書の以下の表１のＳＮＰのうちの少なくとも１つがヘテロ接合性を示すと同定されたＳＣＮ又はＣｙＮと診断された患者の選択。本発明の実施形態において、対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５又はｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、
候補患者の同定されたヘテロ接合性ＳＮＰ位置に基づく治療戦略の選択。
末梢血液の吸引によるか又は動員及びアフェレシスによるかのいずれかにより対象の骨髄からＨＳＰＣ細胞を取得する、任意選択で、ＨＳＰＣ細胞を処理する（濃縮する、刺激する、両方等）

ＨＳＰＣ細胞に（エクスビボエレクトロポレーション等により）
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は同一物をコードする配列（ｍＲＮＡ等）、
変異対立遺伝子の同定されたヘテロ接合性ＳＮＰの特定の配列（ＲＥＦ／ＡＬＴ配列）を標的とする特徴的なＲＮＡ分子及び
変異対立遺伝子と他の対立遺伝子の両方に共通である、イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲ中の配列を標的とする非特徴的なＲＮＡ分子を含む組成物を導入し、
それによりＨＳＰＣ細胞を編集してＥＬＡＮＥの変異対立遺伝子発現をノックアウトする。そして
編集したＨＳＰＣを候補患者に導入する。

本発明の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞を、骨髄又は患者アフェレシス後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から分離してもよい。骨髄又はＰＢＭＣを、ＨＳＰＣ動員後のアフェレシスにより患者から収集してもよい。本発明の実施形態において、アフェレシス生成物を洗浄して血小板を除去してもよく、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）等を使用する生成により、ＣＤ３４＋細胞集団を濃縮してもよい。本発明の実施形態において、選択された細胞を、組換えヒトサイトカインの混合物等により、エクスビボで予備刺激してもよい。本発明の実施形態において、細胞は、エレクトロポレーションを受けてもよい。本発明の実施形態において、エレクトロポレーションの前に、刺激した細胞（ＣＤ３４＋細胞等）、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、限定条件下でプレインキュベートしてもよい。本発明の実施形態において、細胞を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ混合物により又は組み立て済みＲＮＰ（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質であるリボヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡ）によりエクスビボでエレクトロポレーションし、その後細胞洗浄する。本発明の実施形態において、細胞を、最終製剤へと懸濁する。本発明の実施形態において、細胞を再懸濁してもよい。本発明の実施形態において、再懸濁した細胞を注入用バッグへと充填してもよい。本発明の実施形態において、バッグをコントロールレートフリーザーのフリーズダウンステップを使用して凍結しても及び／又は気相の液体窒素内で保存してもよい。本発明の実施形態において、製品を静脈内（ＩＶ）投与により患者に投与してもよい。

ドミナントな遺伝性障害
当業者は、いかなる種類のヘテロ接合体遺伝性障害（ドミナントな遺伝性障害等）の全ての対象も本明細書において記載される方法を受けてもよいことを理解するであろう。１つの実施形態において、本発明を、例えばＳＣＮ又はＣｙＮ等のドミナントな遺伝性障害に関与する、関連している又は原因となる遺伝子を標的とするために使用してもよい。いくつかの実施形態において、ドミナントな遺伝性障害は、ＳＣＮ又はＣｙＮである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＥＬＡＮＥ遺伝子（ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ，ｇｅｎｅＩＤＮｏ：３３５）である。

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＰＡＭ認識
いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はその機能性バリアントから選択される。いくつかの実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼである。このような実施形態において、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼをガイドするＲＮＡ配列（Ｃｐｆｌ等）は、このＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼに結合する及び／又はこのＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを変異対立遺伝子とその対応物である機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチド（ＳＮＰ等）を含む配列に向けさせる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、さらにｔｒａｃｒＲＮＡを含まない。非限定的な例において、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであるが、ドミナントな変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、ＰＡＭ部位内部にあっても及び／又はＲＮＡ分子がハイブリッド形成するよう設計された領域内部のＰＡＭ部位に近位であってもよい。当業者は、ＲＮＡ分子を、従来技術において周知の方法によりゲノム内の選択した標的と結合するよう操作することができることを理解するであろう。

本発明の実施形態において、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲシステムでは、成熟型ｃｒＲＮＡを利用する、つまり追加の標的認識要求として、ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９等の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをｃｒＲＮＡと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接するプロトスペーサーに接する標的ＤＮＡのプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対形成を介して標的ＤＮＡに向かわせる。次に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内部に二本鎖切断を作成する。当業者は、本発明の操作されたＲＮＡ分子の各々がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に接する関心のある標的ゲノムＤＮＡ配列と関連するように、例えばＰＡＭが、非限定的な例として、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ＷＴ（ＳｐＣＡＳ９）についてはＮＧＧ又はＮＡＧ、「Ｎ」は任意の核酸塩基であり、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）についてはＮＮＧＲＲＴ、空腸（Ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９ＷＴについてはＮＮＮＶＲＹＭ、ＳｐＣａｓ９−ＶＱＲバリアントについてはＮＧＡＮ又はＮＧＮＧ、ＳｐＣａｓ９−ＶＲＥＲバリアントについてはＮＧＣＧ、ＳｐＣａｓ９−ＥＱＲバリアントについてはＮＧＡＧ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮｍＣａｓ９）についてはＮＮＮＮＧＡＴＴ又はＣｐｆｌについてはＴＴＴＶ等、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの種類に関連している配列と適合するようにさらに設計されることを理解するであろう。本発明のＲＮＡ分子は、各々が１つ又は複数の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて複合体を形成するよう設計され、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対してそれぞれ１つ又は複数の異なるＰＡＭ配列を利用して関心のあるポリヌクレオチド配列を標的とするよう設計される。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ等の、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼは、ＤＮＡを細胞のゲノムの所望の位置で切断させるために使用されてもよい。最も一般的に使用されるＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステムに由来するけれども、他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼも本明細書において記載されるゲノム編集組成物及び方法において使用するために熟慮される。例えば、その内容を参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１５−０２１１０２３を参照する。

本発明の実施において使用することができるＣＲＩＳＰＲシステムは、非常に多岐にわたる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型又はＶ型システムとすることができる。適切なＣＲＩＳＰＲタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、ＣａｓｌＯ、Ｃａｓｌ２ａ、Ｃａｓｌ２ｂ、Ｃａｓｌ２ｃ、Ｃａｓｌ２ｄ、Ｃａｓｌ２ｄ、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、Ｃａｓｌｉ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、ＣｓｘｌＯ、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕｌ９６６がある（Ｋｏｏｎｉｎ２０１７等を参照）。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（Ｃａｓ９等）である。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ノカルディオプシスダッソンビエイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセスプリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセスヴィリドクロモジネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスヴィリドクロモジネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウムロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウムロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバチルスアシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バシラスシュードミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バシラスセレニチレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エグジゴバクテリウムシビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、デルブリュッキ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバシラスサリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロシラマリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａｍａｒｉｎａ）、バークホルデリアバクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナスナフタレニボラン（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）、クロコスファエラワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノテス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅｓｐ．）、ミクロキスティスエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、アセトハロビウムアラビティカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェックスデゲンシ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒｂｅｃｓｃｉｉ）、カンディダートゥスデスルフォルディス（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＤｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｊｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディアマグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ）、（ナトラナエロビウステルモフィルスムＮａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシドチオバシラスカルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルスフェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマティウムビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）、ニトロソコッカスハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカスワトソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナスハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉ）、クテドノバクテルラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウムエベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナバリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリアスプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃｓｐ．）、アルトロスピラマキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｍａｘｉｍａ）、アルトロスピラプラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルトロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａｓｐ．）、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａｓｐ．）、ミクロコレウスクソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オスキラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｓｐ．）、ペトロトーガモビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａｍｏｂｉｌｉｓ）、テルモシフォアフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ）、アカリオクロリスマリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓｍａｒｉｎａ）、フランシセラｃｆ．ノビシダＦｘｌ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｃｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａＦｘｌ）、アリサイクロバチルスアシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、オレイフィーラス属（Ｏｌｅｉｐｈｉｌｕｓｓｐ．）、細菌ＣＣ０９３９２４、デルタプロテオバクテリア細菌、又は既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする任意の種に由来してもよい。無培養細菌によってコードされたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼもまた、本発明の文脈において使用してもよい（Ｂｕｒｓｔｅｉｎｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１７を参照）。ｓｐＣａｓ９Ｄ１１３５Ｅバリアント、ｓｐＣａｓ９ＶＱＲバリアント、ｓｐＣａｓ９ＥＱＲバリアント又はｓｐＣａｓ９ＶＲＥＲバリアント等の、既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質のバリアントもまた、本発明の文脈において使用してもよい。

したがって、Ｃａｓ９タンパク質、修飾Ｃａｓ９、Ｃａｓ９のホモログあるいはオルソログ等のあるＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼ、又はＣｐｆｌ及びそのホモログ並びにオルソログ等の、他の型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを、本発明の組成物において使用してもよい。

特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、自然起源のＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通した定性的な生物学的特徴を有する化合物である。「機能性誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通した生物活性を有することを条件として、天然配列のフラグメント並びに天然配列ポリペプチドの誘導体及びそのフラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。本明細書において熟慮される生物活性は、機能性誘導体がＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、その共有結合的修飾物及びその融合物の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適切な誘導体又はそのフラグメントには、Ｃａｓタンパク質の変異体、融合物、共有結合的修飾物又はそれらのフラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。Ｃａｓタンパク質又はそのフラグメントを含む、Ｃａｓタンパク質及びＣａｓタンパク質の誘導体又はそのフラグメントは、細胞から入手可能であってもよく、化学的に合成してもよく、又はこれらの２個の製法の組み合わせによって入手可能であってもよい。細胞は、自然にＣａｓタンパク質を産生する細胞であってもよく、又は自然にＣａｓタンパク質を産生し、高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するか、内因性Ｃａｓと同一又は異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するよう遺伝子改変された細胞であってもよい。いくつかの場合において、この細胞は自然にはＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するよう遺伝子改変される。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃｐｆｌである。Ｃｐｆｌは、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを利用する単一のＲＮＡでガイドされたエンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆｌは、ＤＮＡをねじれ形のＤＮＡ二本鎖切断により開裂する。Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属由来の２個のＣｐｆｌ酵素が、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を行うことが証明されている（Ｚｅｔｓｃｈｅら、（２０１５）Ｃｅｌｌ．を参照）。

したがって、Ｃａｓ９タンパク質又は修飾Ｃａｓ９あるいはＣａｓ９のホモログ、オルソログ又はバリアント等の、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼあるいはＣｐｆｌ及びそのホモログ、オルソログ又はバリアント等の、他の型のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを、本明細書において使用してもよい。

いくつかの実施形態において、ガイド分子は、新規の又は改良された特性を加える１つ又は複数の化学修飾（例えば、分解からの安定性の改善、ハイブリッドエネルギーの改善又はＲＮＡでガイドされたＤＮＡヌクレアーゼとの結合特性の改善等）を含む。適切な化学修飾には、修飾塩基、修飾糖部分又は修飾ヌクレオシド間結合が含まれるがこれに限定されるものではない。適切な化学修飾の非限定的な例としては、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−０−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−０−メチルプソイドウリジン、「β、Ｄ−ガラクトシルキュェオシン」、２’−０−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、ｌ−メチルプソイドウリジン、ｌ−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、「２，２−ジメチルグアノシン」、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、「β、Ｄ−マンノシルキューオシン」、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−カルバモイル）スレオニン、２’−０−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、「３−（３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕ」、２’−Ｏ−メチル（Ｍ），３‘−ホスホロチオエート（ＭＳ）、３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、プソイドウリジン又は１−メチルプソイドウリジンがある。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

さらなる適切な化学修飾の非限定的な例としては、ｍ^１Ａ（１−メチルアデノシン）、ｍ^２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２‘−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ^２ｍ^６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ^６−メチルアデノシン）；ｉ^６Ａ（Ｎ^６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ^２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ^６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ^６Ａ（Ｎ^６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ^２ｉｏ^６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ^６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ^６Ａ（Ｎ^６−グリシニルカルバモイルアデノシン（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ））；ｔ^６Ａ（Ｎ^６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ^２ｔ^６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ^６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ^６ｔ^６Ａ（Ｎ^６−メチル−Ｎ^６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ^６Ａ（Ｎ^６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ^２ｈｎ^６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ^６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩））；Ｉ（イノシン）；ｍ^１Ｉ（ｌ−メチルイノシン）；ｍ^１Ｉｍ（ｌ，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ^３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ^２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ^４Ｃ（Ｎ^４−アセチルシチジン）；ｆ^５Ｃ（５−ホルミルシチジン）；ｍ^５Ｃｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ^４Ｃｍ（Ｎ^４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｋ^２Ｃ（ライシジン）；ｍ^１Ｇ（ｌ−メチルグアノシン）；ｍ^２Ｇ（Ｎ^２−メチルグアノシン）；ｍ^７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ^２ _２Ｇ（Ｎ^２，Ｎ^２−ジメチルグアノシン）；ｍ^２Ｇｍ（Ｎ^２、２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ^２ _２Ｇｍ（Ｎ^２，Ｎ^２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩））；ｙＷ（ワイブトシン）；_０２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（未修飾ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ウイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルウイオシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシルキュェオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−キューオシン）；ｐｒｅＱ_ｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱ_１（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ^＋（アーケオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ^５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ^４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ^５ｓ^２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ^２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ^３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ^５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ^５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ^５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ^５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ^５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ^５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ^５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ^５Ｕｍ（５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ^５Ｓ^２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ^５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ^５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−０−メチルウリジン）；ｃｍｍｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ジメチルアデノシン）；Ｉｍ（２’−０−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｇｍ（Ｎ４，２’−０−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’−０−ジメチルアデノシン）；ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，０−２’−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２’−０−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−０−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（ｌ，２’−０−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（ｌ，２’−０−ジメチルアデノシン）；ｘｍ５Ｕ（５−タウリノメチルウリジン）；ｘｍＶＵ（５−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−ｌ４（４−デメチルウイオシン）；ｉｍＧ２（イソウイオシン）；又はａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）がある。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。（米国特許第９，７５０，８２４号を参照）。

変異対立遺伝子を特異的に標的とするガイド配列
一定の遺伝子には数千のＳＮＰが含まれてもよい。遺伝子の各ＳＮＰを標的とするために２４塩基対の標的ウィンドウを使用するとなると、数十万個のガイド配列が必要となるだろう。ＳＮＰを標的とするよう利用されるときいかなる与えられたガイド配列であっても、ガイド配列が分解する、活性が制限される、活性がなくなる、又はオフターゲット効果が生じることがある。したがって、一定の遺伝子を標的とするには適切なガイド配列が必要である。本発明によって、変異タンパク質の発現をノックアウトし、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化し、そしてＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのガイド配列の新規なセットが同定された。

本開示は、機能性対立遺伝子は未修飾のままの一方で変異対立遺伝子を不活性化するために特異的に標的とすることができるガイド配列を提供する。本発明のガイド配列は、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で特異的に区別するよう設計され、区別する可能性が最も高い。不活性化させたいと望まれる変異対立遺伝子を標的とする全ての可能なガイド配列のうち、本発明において開示される特異的なガイド配列は、開示される実施形態で機能するのに特に効果的である。

簡潔に言えば、ガイド配列は、以下の、（１）母集団、特定の民族集団又は患者集団での有病率が１％を超えて高く、同一の集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルヘテロ接合率が１％を超える、ヘテロ接合性ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルを標的とし、（２）例えば、プロモーター、ＵＴＲ、エキソン又はイントロン等の、遺伝子の任意の部分から５ｋ塩基以内等の、遺伝子の部分に近位のＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置を標的とし、（３）疾患／遺伝子のための創始者又は一般的な病原性変異を標的とするＲＮＡ分子を使用して変異対立遺伝子を標的とするような特性を有してもよい。いくつかの実施形態において、母集団、特定の民族集団又は患者集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの有病率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超え、同一の集団でのＳＮＰ／挿入／欠失／インデルヘテロ接合率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。各可能性は、別々の実施形態を表し、随意に組み合わせてもよい。

各遺伝子について、ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルにしたがって、変異対立遺伝子を不活性化するために以下の（１）１個のＲＮＡ分子を使用するノックアウト戦略―ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを変異対立遺伝子に向けさせて二本鎖切断（ＤＳＢ）を作成し、変異対立遺伝子のエキソン又はスプライス部位領域でフレームシフト変異を形成するために、１個のＲＮＡ分子を利用する、（２）２個のＲＮＡ分子を使用するノックアウト戦略―２個のＲＮＡ分子を利用する。第１のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のプロモーター内の領域又は変異対立遺伝子の上流領域を標的とし、別のＲＮＡ分子は、変異対立遺伝子のプロモーター、エキソン又はイントロン内の第１のＲＮＡ分子の下流を標的とする、（３）エキソン（複数含む）スキッピング戦略―スプライス部位を破壊するために、イントロンの５’末端（ドナー配列）又はイントロンの３’末端（アクセプター配列）の何れかのスプライス部位領域にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを向けさせるために１個のＲＮＡ分子を使用してもよい。戦略のうち任意の１つを使用してもよい。あるいは、第１のＲＮＡ分子はエキソンの上流領域を標的とし、第２のＲＮＡ分子は第１のＲＮＡ分子の下流領域の標的とし、それによりエキソン（複数含む）を切除するように、２個のＲＮＡ分子を利用してもよい。各変異対立遺伝子について同定されたＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの位置に基づいて、変異対立遺伝子を不活性化するための上述した方法のいずれか１つ、又は組み合わせを利用してもよい。

１個のＲＮＡ分子のみを使用するときは、ＳＮＰの位置がエキソンの中にあるか、又はイントロンとエキソンとの間のスプライス部位のきわめて近く（２０塩基対内等）にあるときである。２個のＲＮＡ分子を使用するとき、ガイド配列は、第１のＳＮＰが、５’非翻訳領域内、プロモーター内又は転写開始点の５’最初の２キロベース等の、エキソン１の上流にあり、第２のＳＮＰが、転写開始点の５’最初の２キロベース、イントロン１、２又は３内又はエキソン１、２又は３内等の、第１のＳＮＰの下流であるように、２個のＳＮＰを標的としてもよい。

本発明のガイド配列は、標的とする遺伝子の上流部分、好ましくは標的とする遺伝子の最後のエキソンの上流部分のＳＮＰを標的としてもよい。ガイド配列は、エキソン１の上流、例えば、５’非翻訳領域内、プロモーター内又は転写開始点の５’最初の４〜５キロベース内のＳＮＰを標的としてもよい。

本発明のガイド配列はまた、既知のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位のきわめて近く（５０塩基対内、より好ましくは２０塩基対内等）のＳＮＰを標的としてもよい。

本発明のガイド配列はまた、（１）標的とする遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰ、（２）遺伝子の上流及び下流のヘテロ接合性ＳＮＰ、（３）母集団、特定の民族集団又は患者集団での、ＳＮＰ／挿入／欠失／インデルの有病率が１％を超えるＳＮＰ、（４）グアニジン−シトシン含有量が３０％を超えて８５％未満である、（５）４以上のチミン／ウラシル反復配列または８以上のグアニン、シトシン又はアデノシン反復配列がない、（６）オフターゲット解析によって同定されたオフターゲットがない、及び（７）好ましくはイントロンよりエキソンを標的とするか、又はＳＮＰの下流よりもＳＮＰの上流である、ものを標的としてもよい。

本発明の実施形態において、ＳＮＰは、遺伝子の上流又は下流であってもよい。本発明の実施形態において、ＳＮＰは、遺伝子の上流又は下流４，０００塩基対内である。

変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある遺伝子の疾患発症性変異配列の上流、下流又は内部であってもよい。変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある遺伝子のエキソン内部又はイントロン内部にあってもよい。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある遺伝子のエキソン内部にある。いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、関心のある遺伝子のエキソン内部又はイントロン内部にある、すなわちイントロンとエキソンの間のスプライス部位のきわめて近く、例えば、スプライス部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチド上流又は下流にある。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態において、ＳＮＰのヌクレオチドバリアントの各々は、変異対立遺伝子で発現してもよい。いくつかの実施形態において、ＳＮＰは、創始者又は一般的な病原性変異であってもよい。

ガイド配列は、（１）母集団で１％を超える等の、母集団での有病率が高いこと、そして（２）１％を超える等の、母集団でのヘテロ接合率が高いことの両方を持つＳＮＰを標的としてもよい。ガイド配列は、世界中に分布するＳＮＰを標的としてもよい。ＳＮＰは、創始者又は一般的な病原性変異であってもよい。いくつかの実施形態において、母集団での有病率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。各可能性は、別々の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、母集団でのヘテロ接合率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％を超える。各可能性は、別々の実施形態を表す。

いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、集団において有病率が高い疾患発症性変異と関連づけられる／共存する。このような実施形態において、「有病率が高い」とは、少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を指す。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。１つの実施形態において、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間で異なる少なくとも１つのヌクレオチドは、疾患発症性変異である。いくつかの実施形態において、ＳＮＰは集団内で高度に蔓延している。このような実施形態において、「高度に蔓延している」とは、集団の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％を指す。各可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。

本発明のガイド配列は、上記基準のいずれか１つを満たしてもよく、変異対立遺伝子を対応する機能性対立遺伝子と区別する可能性が最も高い。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、以下の表１に示されるようなＳＮＰ由来のＥＬＡＮＥ遺伝子に存在するヘテロ接合性ＳＮＰを標的とする。ＳＮＰの詳細は左から１番目のカラムに示され、ＳＮＰＩＤを含む（一塩基多型のＮＣＢＩの２０１８年版データベース（ｄｂＳＮＰ）に基づく）。ｒｓ番号がないバリアントについては、バリアントの特性をｇｎｏｍＡＤ２０１８ブラウザーデータベースに基づいて示した。２番目のカラムでは、各ＳＮＰに割り当てられた識別子を示す。３番目のカラムでは、ＥＬＡＮＥ遺伝子上での各ＳＮＰの位置を示す。

図５ではヒト集団において表１から選択されたある一定のＳＮＰの異型遺伝子性を開示する。

本発明の実施形態は、ＳＮＰ位置の上流からイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲまでのプロモーター領域を切除することを含んでもよい。ある実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰの特異的な配列（戦略１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略１ｂ−ｒｓ３７６ｌ００５）を標的とし、第２のガイド配列は、遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする（図１）。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰの特異的な配列（戦略１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略１ｂ−ｒｓ３７６ｌ００５）を標的とし、第２のガイド配列は、遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。別の実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合ＳＮＰの特異的な配列（戦略１ａ―ｒｓ１０４ｌ４８３７、戦略１ｂ−ｒｓ３７６ｌ００５）を標的とし、第２のガイド配列は、遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする（図２）。

本発明の実施形態は、イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流の領域を切除することを含んでもよい。ある実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２−ｒｓ１６８３５６４）を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン４の配列を標的とする。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２−ｒｓ１６８３５６４）を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通するイントロン３の配列を標的とする。さらなる実施形態において、第１のガイド配列は、変異対立遺伝子の上流領域のヘテロ接合性ＳＮＰ位置の特異的な配列（戦略２−ｒｓ１６８３５６４）を標的とし、第２のガイド配列は遺伝子の２個の対立遺伝子に共通する３’ＵＴＲの配列を標的とする（図３）。

本発明の実施形態は、イントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲから３’ＵＴＲの下流領域までを切除する。この戦略は、健常な対立遺伝子を無傷のままにする一方、疾患発症性対立遺伝子（「変異対立遺伝子」）を特異的にノックアウトするよう設計される。対立遺伝子特異的編集は、集団におけるヘテロ接合頻度が比較的高い区別する（ヘテロ接合性）ＳＮＰ位置を標的とするガイドを使用することにより達成される（図４）。

細胞への送達
例示される方法において、本明細書において記載されるＲＮＡ分子及び組成物を任意の適切な手段により標的細胞又は対象に送達してもよいことが理解される。以下の実施形態は、本発明のＲＮＡ分子及び組成物を送達する方法の非限定的な例を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ分子及び組成物は、任意の哺乳類又は植物細胞を含む、ドミナントネガティブな対立遺伝子を含む及び／又は発現する任意の細胞を標的としてもよい。例えば、１つの実施形態において、ＲＮＡ分子は、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を特異的に標的とし、標的細胞は、肝細胞である。

本主題発明の、ＲＮＡ分子組成物等の、核酸組成物を送達するために、任意の適切なウイルス性ベクターシステムを使用してもよい。従来のウイルス性又は非ウイルス性に基づく遺伝子導入方法は、核酸及び標的組織を導入するために使用することができる。特定の実施形態において、核酸は、インビトロ又はエクスビボ遺伝子治療用途で投与される。非ウイルス性ベクター送達システムは、裸の核酸及びリポソーム又はポロクサマー等の送達媒体と複合体を形成する核酸を含む。遺伝子治療方法を概説するため、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−８１３、Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｉｇｎｅｒ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：２１１−２１７、Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６２−１６６、Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ１１：１６７−１７５、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５−４６０、ＶａｎＢｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６（１０）：１１４９−１１５４、Ｖｉｇｎｅ（１９９５）ＲｅｓｔｏｒａｔｉｖｅＮｅｕｒｏｌｏｇｙａｎｄＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ８：３５−３６、Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５）ＢｒｉｔｉｓｈＭｅｄｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ５１（１）：３１−４４、Ｈａｄｄａｄａｅｔａｌ．（１９９５）ｉｎＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＤｏｅｒｆｌｅｒａｎｄＢｏｈｍ（ｅｄｓ．）、及びＹｕｅｔａｌ．（１９９４）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：１３−２６を参照する。

核酸及び／又はタンパク質の非ウイルス性送達方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、粒子銃加速器、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリカチオン又は脂質：核酸複合体、人工ビリオン及び核酸の薬剤増強取込みがあり、又は細菌もしくはウイルス（アグロバクテリウム、根粒菌属、ＮＧＲ２３４、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｏｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ、タバコモザイクウイルス、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス等）によって植物に送達することができる。（Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．（２００６）ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳｃｉ．１ｌ（ｌ）：ｌ−４等を参照）。Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）等を使用するＳｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎも、核酸を送達するために使用することができる。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性―脂質媒介送達も、インビボ又はインビトロ送達方法として熟慮される。（Ｚｕｒｉｓｅｔａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（ｌ）：７３−８０を参照；Ｃｏｅｌｈｏｅｔａｌ．（２０１３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６９、８１９−８２９；Ｊｕｄｇｅｅｔａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３、４９４−５０５；及びＢａｓｈａｅｔａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９、２１８６−２２００も参照。）

さらなる代表的な核酸送達システムとしては、Ａｍａｘａ．ＲＴＭＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ケルン、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（ロックビル、Ｍｄ．）、ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（ホリストン、Ｍａｓｓ．）及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃによって提供されるものがある（米国特許第６，００８，３３６号等を参照）。リポフェクションは、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号及び米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ．ＴＭ．、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ．ＴＭ．及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ．ＴＭ．ＲＮＡｉＭＡＸ等）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適したカチオン性及び中性脂質としては、Ｆｅｉｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものがある。送達を細胞（エクスビボ投与）又は標的組織（インビボ投与）に対してすることができる。

イムノリピド複合体等の標的リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４０４−４１０；Ｂｌａｅｓｅら（１９９５）ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．２：２９１−２９７；Ｂｅｈｒら（１９９４）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：３８２−３８９；Ｒｅｍｙら（１９９４）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．５：６４７−６５４；Ｇａｏら（１９９５）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２：７１０−７２２；Ａｈｍａｄら（１９９２）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：４８１７−４８２０；米国特許第１８６，１８３号、同４，２１７，３４４号、同４，２３５，８７１号、同４，２６１，９７５号、同４，４８５，０５４号、同４，５０１，７２８号、同４，７７４，０８５号、同４，８３７，０２８号及び同４，９４６，７８７号等を参照）。

さらなる送達方法としては、送達される核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達担体（ＥＤＶ）にパッケージングすることの使用がある。これらのＥＤＶは、抗体の一方の腕が標的細胞への特異性を有し、他方がＥＤＶへの特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的細胞に特異的に送達される。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面まで運び、次にＥＤＶは細胞内へとエンドサイトーシスにより運ばれる。一度でも細胞内に入れば、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７（７）：６４３を参照）。

核酸をウイルス媒介送達するためにＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースシステムを使用すると、ウイルスを体内の特定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核へ輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを患者に直接投与することもできるし（インビボ）、又は細胞をインビトロで処理し、改変細胞を患者に投与することもできる（エクスビボ）。核酸を送達するための従来のウイルスベースシステムとしては、遺伝子導入用のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアベクター及び単純ヘルペスベクターがあるが、これに限定されるものではない。

レトロウイルスの指向性は、異種エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するか感染し、一般的に高いウイルス力価を引き起こすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの異種配列をパッケージする能力を有するシス作用性末端反復配列から成る。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターを複製しパッケージするのに十分であり、次に治療遺伝子を標的細胞に組み込んで持続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く用いられるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びその組み合わせに基づくものがある（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００等を参照）。

臨床試験において、少なくとも６個のウイルスベクター手法が現在利用可能であり、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子により欠損ベクターを補完して形質導入薬剤を生成することを含む手法を利用する。

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ８５：３０４８−３０５；Ｋｏｈｎら（１９９５）ＮａｔＭｅｄ．１：１０１７−１０２；Ｍａｌｅｃｈら（１９９７）ＰＮＡＳ９４：２２１２１３３−１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験において使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓをパッケージしたベクトルについて５０％以上の形質導入効率が観察された（Ｅｌｌｅｍら（１９９７）ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０；Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９７）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１：１１１−２）。

パッケージングセルは、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞には、アデノウィルス、ＡＡＶをパッケージする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージするＰｓｉ−２ｃｅｌｌｓ又はＰＡ３１７が含まれる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする生産細胞株によって作成される。このベクターは通常、パッケージングし、その後宿主に組み込む（適用可能な場合）ために必要とされる最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。欠損しているウイルス機能は、パッケージングセルラインによってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、一般的にはパッケージングし、宿主ゲノムに組み込むために必要とされる、ＡＡＶゲノムからの末端逆位配列（ＩＴＲ）のみを持つ。ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージされ、そこには他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドが含まれる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウィルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製とヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠いているので相当量はパッケージされていない。アデノウィルスによる汚染を、アデノウィルスの方がＡＡＶより感受性が高い熱処理等によって低減することができる。さらに、ＡＡＶは、バキュロウイルスシステムを使用して臨床規模で作成することができる（米国特許第７，４７９，５５４号を参照）。

多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織タイプに対して高い特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターを、ウイルスコートタンパク質がこのウイルスの外面にある融合タンパク質としてのリガンドを発現することによってある一定の細胞タイプに特異性を有するよう改変することができる。このリガンドは、関心のある細胞タイプに存在すると知られている受容体に親和性を有するよう選択される。例えば、Ｈａｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７−９７５１で、モロニーマウス白血病ウイルスをｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するよう改変することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子受容体を発現した特定のヒト乳がん細胞に感染することが報告された。この原理を、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは細胞表面受容体のためのリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞ペアに拡張することができる。例えば、繊維状ファージを、実質的にあらゆる選択された細胞の受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（ＦＡＢ又はＦｖ等）を呈するよう操作することができる。上の記述は主にウイルスベクターに適用されるけれども、同一の原理を非ウイルス性ベクターに適用することができる。このようなベクターを、特異的な標的細胞による取り込みを好む特異的取り込み配列を含むよう操作することができる。

遺伝子治療ベクターを、個々の患者に、一般的に全身投与（例えば、硝子体内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は脳内注入）又は上述したような、局所投与によりインビボで送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植した細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺法、細胞生検等）又は万能ドナー造血幹細胞などの、細胞にエクスビボで送達することができ、通常ベクターを組み込んだ細胞を選択した後に、続けて患者に細胞を再移植する。

診断、研究のため、又は遺伝子治療（例えば、遺伝子導入した細胞の宿主生物への再注入を介して）のためのエクスビボ細胞遺伝子導入は、当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞を対象生物から単離し、核酸組成物を用いて遺伝子導入し、対象生物（患者等）に再注入する。エクスビボ遺伝子導入に適した各種細胞タイプは、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら（１９９４）ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ、ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ、３ｒｄｅｄ及び、患者からの細胞の単離及び培養方法を考察するためのそこに引用されている参考文献を参照）。

適した細胞には、真核細胞及び／又は細胞株が含まれるが、これに限定されるものではない。このような細胞又はこのような細胞から作製される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ等）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ等）、ｐｅｒＣ６ｃｅｌｌｓ、任意の植物細胞（分化型又は未分化型）、及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）等の昆虫細胞又はサッカロミセス、ピキア及びシゾサッカロミセス等の真菌細胞がある。特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ又はＨＥＫ２９３細胞株である。さらに、初代細胞を単離し、治療される患者に再導入して続けてガイドされたヌクレアーゼシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等）による治療をするためにエクスビボで使用してもよい。適した初代細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、及び限定されるものではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞等の他の血液細胞サブセットが含まれる。適した細胞としてはまた、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経型幹細胞及び間葉系幹細胞等の幹細胞がある。

１つの実施形態において、幹細胞は、細胞遺伝子導入及び遺伝子治療のためのエクスビボ方法において使用される。幹細胞を使用する利点は、インビトロで他の細胞タイプに分化できること、又は骨髄内に生着するだろう哺乳類（細胞のドナー等）に導入することができることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のサイトカインを使用してＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化する方法が知られている（非限定的な例として、Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）を参照）。

既知の方法を使用して、幹細胞を形質導入及び分化のために単離する。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）及びｌａｄ（分化抗体提示細胞）等の不必要な細胞と結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングすることにより、幹細胞を骨髄細胞から単離する（非限定的な例として、Ｉｎａｂａら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２を参照）。いくつかの実施形態において、既に改変された幹細胞を使用してもよい。

一般的に、細胞は少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に投与される。成句「薬学的に許容される」とは、適切な医学的良識の範囲内であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症なしで、妥当な利益／リスク比率でつりあった、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適している、化合物、物質、組成物及び／又は剤形を指す。成句「薬学的に許容される担体」は、本明細書において使用するとき、物質を被包する液体、固体充填剤、希釈剤、賦形剤又は溶媒等の薬学的に許容される物質、組成物又は媒体を意味する。

本明細書において記載されるＲＮＡ分子組成物のいずれの１つも、有糸分裂後の細胞又は活発に分裂しない、例えば停止細胞である、任意の細胞においてゲノム編集するのに適している。本発明のＲＮＡ分子組成物を使用して編集されることができる有糸分裂後の細胞の例は、肝細胞を含むが、これに限定されるものではない。

治療核酸組成物を含むベクター（例えば、レトロウイルス、リポソーム等）を、インビボで細胞に形質導入するために生物に直接投与することもできる。投与は、注射、注入、局所投与（点眼及びクリーム等）及びエレクトロポレーションを含むが、これに限定されるものではない、分子を血液細胞又は組織細胞と究極的に接触させて導入するために通常使用される経路のいずれかである。このような核酸を投与するのに適した方法は、当業者に利用可能であり、周知であり、特定の組成物を投与するために１つを超える経路を使用できるけれども、特定の経路が別の経路より即時で効果的な反応を提供できることが多い。いくつかの実施形態によれば、組成物は、ＩＶ注射により送達される。

免疫細胞（Ｔ細胞等）に導入遺伝子を導入するのに適したベクターには、非組み込みレンチウイルスベクターが含まれる。米国特許出願公開第２００９−０１１７６１７号を参照する。

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、以下に記載するように、利用可能な医薬品組成物の多種多様の適した製剤がある（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈｅｄ．、１９８９等を参照）

いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼと結合する／関連している及び／又はＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼを関心のある遺伝子の変異誘発遺伝子と機能性対立遺伝子との間に差がある少なくとも１つのヌクレオチド（ＳＮＰ等）を含む配列（機能性対立遺伝子には存在しない変異誘発遺伝子の配列等）に向けさせるＲＮＡ分子を提供する。この配列は、疾患関連変異内部にあってもよい。この配列は、疾患関連変異の上流又は下流にあってもよい。変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子との間のいかなる配列の差も機能性対立遺伝子の活性を保存する一方、本発明のＲＮＡ分子によって変異対立遺伝子を不活性化するため、そうでなければ変異対立遺伝子のドミナントな疾患発症性効果を無効にするために、標的となってもよい。

開示される組成物及び方法はまた、患者のドミナントな遺伝障害を治療するための薬物の製造に使用されてもよい。

本明細書において開示されるいくつかの実施形態についての作用機構
ＳＣＮ又はＣｙＮを引き起こすと証明されたＥＬＡＮＥの変異は、切断型Ｎ−終端タンパク質を生成するフレームＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の代替物からの翻訳を媒介し、その結果ＥＲ及びタンパク質ミスフォールディングストレスの原因となる。

いかなる理論又は機構にも拘束されることを望むものではないが、本発明は、ＳＣＮ又はＣｙＮを防止、寛解又は治療するために、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを適用して変異した病原性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子の発現を防止するか、変異した病原性対立遺伝子から切断型非病原性ペプチドを作成するか、又は変異した病原性ＥＬＡＮＥを修復／修正するなど、変異した病原性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を処理するが機能性ＥＬＡＮＥ対立遺伝子は処理しないために利用される。

ＯＲＦの上流又は下流に位置するＳＮＰを利用するいくつかの別の編集戦略を適用してもよい。この戦略には、全遺伝子の除去、遺伝子のＣ―終端を除去するための遺伝子の切断及び遺伝子の発現の減弱が含まれる。

いくつかの実施形態において、２個のガイド（表２に開示されたガイド等）を、全遺伝子（すなわちエキソン１、２、３、４及び５）を除去して変異タンパク質をノックアウトするために利用してもよい。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡを、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のＯＲＦ上流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列を標的とすることにより対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために利用し、第２のガイドＲＮＡを、ＥＬＡＮＥ遺伝子のエキソン５に位置する又は変異対立遺伝子の下流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列、又はＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のイントロン４、３’ＵＴＲ又は下流に位置する配列、又はＥＬＡＮＥ遺伝子の対立遺伝子のイントロン４、３’ＵＴＲ又は下流に位置するＳＮＰ／ＷＴ配列にＤＳＢを媒介するために利用してもよい。

エキソン３までに位置する終止コドンを獲得することになるフレームシフト変異を抱える健康な個人の記録がある。したがって、可能性のある戦略は、最大でエキソン１から３までを含むように変異対立遺伝子を切断することであってもよい。いくつかの実施形態において、２個のガイド（表２に開示されたガイド等）を、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のｃ−終端を切断するために利用してもよい。いくつかの実施形態において、第１のガイドＲＮＡを、変異対立遺伝子のエキソン５又は下流のＳＮＰ／ＷＴ配列を標的とすることにより対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために利用してもよく、第２のガイドＲＮＡを、ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン１、２又は３に位置する配列又はＳＮＰ／ＷＴ配列のＤＳＢを媒介するために利用してもよい。切断型変異対立遺伝子によってコードされたペプチド／タンパク質は、病原性効果を示さなくてもよい。あるいは、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構をトリガーとして変異対立遺伝子の発現をノックアウトしてもよい。結果をｍＲＮＡ及びタンパク質発現を検査することにより検証してもよい。

いくつかの実施形態において、変異対立遺伝子の発現を、ＯＲＦ上流に位置するＳＮＰを使用して配列を近位プロモーター及びエンハンサー領域から要素を切除することにより減弱してもよい。非限定的な例において、ＳＮＰを標的とすることによりエンハンサー領域の大部分を切除することにより、かなりの減少を達成してもよい。
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子を特異的に標的とするＲＮＡガイド配列の例

多くのガイド配列は、変異対立遺伝子を標的とするよう設計することができるけれども、以下の配列番号１〜１１９２によって特定される表２に記載されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている方法を効果的に実行するために、そして対立遺伝子間を効果的に区別するために特異的に選択された。

カラム１〜４を参照すると、カラム１に示される配列番号１〜１１９２の各々は、操作されたガイド配列に対応する。対応するＳＮＰの詳細は、カラム２に示される。２番目のカラムに示されるＳＮＰの詳細は、表１に示されるＳＮＰＩＤに対応する各ＳＮＰに割り当てられた識別子を示す。カラム３は、各ガイド配列の標的が示される部位でＥＬＡＮＥ遺伝子の多型か野生型配列かどうかを示す。カラム４は、示される部位での各ガイド配列のグアニン−シトシン含有量を示す。

表２では、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子配列内部の異なるＳＮＰと関連づけて上記実施形態において記載されるように使用するために設計されたガイド配列を示す。各操作されたガイド分子はさらに、配列ＮＧＧ又はＮＡＧ（「Ｎ」は任意の核酸塩基である）と適合するＰＡＭ等の、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に接して位置する関心のある標的ゲノムＤＮＡ配列と関連するように設計される。このガイド配列は、ＳｐＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．ｌ（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＧＡＮ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．２（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＥＱＲ（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＧＡＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＲＥＲ（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＧＣＧ）、ＳａＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＮＧＲＲＴ）、ＮｍＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｃｐｆｌ（ＰＡＭＳＥＱ：ＴＴＴＶ）又はＪｅＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭＳＥＱ：ＮＮＮＶＲＹＭ）等を含むが、これに限定されない、１つ又は複数の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて機能するよう設計された。本発明のＲＮＡ分子は各々、１つ又は複数の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせて複合体を形成するよう設計され、利用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対してそれぞれ１つ又は複数の異なるＰＡＭ配列を利用して関心のあるポリヌクレオチド配列を標的とするよう設計される。

前述の実施形態にとって、本明細書に開示された各実施形態は、他の開示された実施形態の各々に適用できると考慮される。例えば、本発明の任意のＲＮＡ分子又は組成物を本発明の任意の方法において利用してもよいことが理解される。

本明細書において使用するとき、全ての見出しはただ構成のためのみであり、いかなる方式でも本開示を制限することを意図するものではない。いかなる個々の段落の内容も全ての段落に等しく適用可能であってもよい。

本発明のより完全な理解を容易にするために、実施例を以下に提供する。以下の実施例で本発明を作成し、実施する例示的モードを説明する。しかしながら、本発明の範囲はこれらの実施例において開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、説明のみを目的としている。

さらに、本発明における以下の実施例は、ＳｐＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９を開示されるＳＮＰ位置に向けさせるのに適したガイド配列を、利用することを含む方法を開示する。実施例では開示される戦略の実現可能性が証明される。当業者は、特定の戦略の各々を適用するために同一のガイド配列を異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとともに使用して、開示されるＳＮＰを標的としてもよいことを理解するだろう。さらに、特定の戦略の各々を適用するために、他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを同一のＳＮＰに向けさせる異なるガイド配列を他のヌクレアーゼと一緒に使用してもよい。

実験的詳細
実施例１：ＳｐＣａｓ９と組み合わせて機能するのに適したＳＮＰを標的とするガイド配列及び開示される戦略に従う配列を選別する
ＨｅＬａ細胞を９６穴プレートに播種した（３Ｋ／ウェル）。２４時間後、細胞を６５ｎｇのＷＴ−Ｃａｓ９又はＤｅａｄ−Ｃａｓ９及びｇ３６〜ｇ６６として識別され、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ試薬（サーモサイエンティフィック）を使用してＥＬＡＮＥの異なる領域及びＳＮＰを標的とする、２０ｎｇのｇＲＮＡプラスミドで同時導入した。１２時間後、新鮮な培地を加え、そして遺伝子導入後７２時間で、ゲノムＤＮＡを抽出し、そしてＣａｓ９によって標的とされる予想領域を増幅し、生成物のサイズをＤＮＡラダーによるキャピラリー電気泳動により分析した。バンドの強度をＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒｓｏｆｔｗａｒｅｖｌ．０を使用して分析した。編集の割合を以下の式にしたがって算出した。１００％−（未編集バンド強度／全バンド強度）Ｘ１００。図６には、３個の独立した実験のＤｅａｄ−Ｃａｓ９バックグラウンド活性を減算した後の各ｇＲＮＡの平均活性±ＳＤを表す。

実施例２：切除戦略の実現可能性を証明する
ＨｅＬａ細胞をｓｐＣａｓ９−ＷＴとＲＮＡのペア（複数）で同時導入したが、戦略ｌａ、ｌｂ及び２のためにそれぞれｓｇ３５（ＩＮＴ４）とｇ３９（ｒｓ１０４ｌ４８３７）、ｇ５８（ｒｓ３７６ｌ００５）又はｇ６２（ｒｓ１６８３５６４）のいずれかだった。遺伝子導入後７２時間で、ｇＤＮＡを抽出し、ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）キット（１００４２９５８及び１００３１２２８、バイオ・ラッドラボラトリーズ）を使用して、エキソン１（戦略１）又はエキソン５（戦略２）のコピー数の減少を測定することにより切除効率を評価した。さらに、戦略２の切除率を正規化するためにエキソン１を使用する一方、戦略１の切除率を正規化するためにエキソン５を使用した。表４に開示される結果には、２個の独立した実験の平均％切除±ＳＤ（標準偏差）を示す。

実施例３：異なるｓｇＲＮＡによる編集を区別して対立遺伝子を評価する
製造業者説明書に従って、参照配列を標的とする、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を関連しているｇＲＮＡｓから構築し、ＷＴ−Ｃａｓ９（＃１０８１０５８）又はＨｉＦｉＣａｓ９（＃１０８１０６０）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＤＴ）から購入した。次にＲＮＰを、関連しているＳＮＰを抱えるｉＰＳＣへと４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｏｒ（Ｒ）システム（ロンザ）を使用してヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）した。７２時間後、ｇＤＮＡを抽出し、ＳＮＰ領域を増幅し、ＮＧＳ分析に送った。対立遺伝子の区別を参照対立遺伝子及び別の対立遺伝子で検出された編集割合にしたがって評価した。各部位でのインデル頻度をＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して算出した。結果を表５に要約する。

実施例４：ＨＳＣでの編集効率
健常ドナーからのＨＳＣをｓｐＣａｓ９−ＷＴ及びＥＭＸ１（ｓｇＥＭＸｌ）又はＥＬＡＮＥ（ｇ３５：ＩＮＴ４；ｇ５８：ｒｓ３７６ｌ００５；ｇ６２：ｒｓ１６８３５６４）のいずれかを標的とするｇＲＮＡのＲＮＡ構成要素でヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）。ヌクレオフェクション後７２時間で、ｇＤＮＡを抽出し、編集レベルをＩＤＡＡにより定量した。図７には、二度繰り返して実施された２個の独立した実験の平均編集％±ＳＤを示す。

実施例５：機能性成熟アッセイ
修正された細胞における表現型の救出を証明するために、患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から始める成熟アッセイを、再プログラム化された体細胞から調製した。この細胞は、患者由来細胞の再生可能な供給源を提供し、疾患表現型を正確に再現することが分かっている。簡潔には、患者のＰＢＭＣを、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４及びＳＶ４０ＬＴである、再プログラム化遺伝子を発現するエピソーム構築物で遺伝子導入する。同一のＳＮＰ遺伝子型を抱える患者由来ｉＰＳＣ及び通常のｉＰＳＣを、市販のキット（ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）ＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＫｉｔ、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して造血前駆細胞へと分化する。１２日後、分化効率を、フローサイトメトリー分析で前駆細胞マーカーＣＤ３４及びＣＤ４５の発現のために細胞を分析することにより推定する。通常及びＳＣＮ分化前駆細胞は、遺伝子編集を受け、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３及び好中球への分化を促進するＧＭ−ＣＳＦを含む条件培地で５日間生育する。通常の未編集及び編集された細胞、すなわちＳＣＮの編集された細胞を好中球へと分化する一方、未編集のＳＣＮに由来する細胞は分化の早い段階で停止する。好中球への分化効率を、フローサイトメトリーで好中球表面マーカー（例えばＣＤ１６、ＣＤ６６ｂ及び汎骨髄マーカーＣＤ３３の発現上昇等）を検出することにより測定する。

実施例６：免疫不全マウスにおけるインビボ投与量範囲知見及び体内分布パイロット研究
Ｇ−ＣＳＦを投与した後の、免疫不全ＮＳＧマウスにおける自己複製能力及び多系列能力を有するＨＳＣの存在及び数を測定するために投与スケジュール、投与量範囲及び投与経路を研究する。長期生着を確立するための機能免疫システムを再生することができるＨＳＣの存在及び数を測定するために再増殖アッセイを実施する。このような検証のために、ヒトの生着及び造血系再増殖を高度に支持する、ＮＳＧ細胞株を使用する。ＮＳＧマウスは、複数のサイトカインシグナル経路が欠損し、自然免疫に多くの欠陥があるのに加え、成熟Ｔ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を欠いているＮＯＤＳＣＩＤマウスである。一次移植の１６週間後に生着を評価する（移植後１２週間後分析）。

ＮＳＧマウスにおける１６週間の体内分布パイロット研究では、投与量及び最大持続時間を調べ、いくつかの細胞投与量レベルで実施する。この研究には、３個の投与量レベルと未編集のＳＣＮ細胞を受けたマウスのグループが含まれる。パイロット研究の期間は１６週間であるが、投与量が高い２個のグループのうちの１個は６か月間まで継続する。このパイロット研究でマウスは６か月間生存し、中心的な体内分布研究の期間は６か月である。この研究の間、ｑＰＣＲによる発現の持続性及び免疫組織化学を研究する。

実施例７：免疫不全マウスにおける中心的な体内分布研究
中心的な体内分布研究ではＮＳＧマウスを利用し、実施例６のパイロット投与量範囲の知見に従う。この研究は、優良試験所基準（ＧＬＰ）を遵守して実行され、中心的な非臨床薬物動態、薬力学及び毒性学研究である。毒性研究は、ＨＳＣ注入後の死亡率、臨床的知見、体重及び器官重量、並びに臨床的及び解剖学的病理学に基づく。

遺伝子を編集したＣＤ３４＋細胞をＮＳＧマウスに移植するには、内在性骨髄の枯渇を提供し、ドナー細胞の生着を許容するために、前処理が必要となる。したがって、臨床状況を模倣するためにブスルファン前処理を利用する。グループあたり１０匹の雄と雌のマウスの３個のグループ（遺伝子を編集した細胞、未編集の細胞及びブスルファン媒体のみのコントロール）を利用する。

ＮＳＧマウスモデルはヒト好中球を枯渇した状況と完全に類似するものではないけれども、エクスビボ遺伝子編集細胞をインビボ注射する前に、全ての割合のマウスをブスルファンで処理し、骨髄機能を枯渇させるので、この研究は遺伝子編集ＣＤ３４＋細胞の体内分布研究に使用するためのモデルの妥当性に影響しない。利用可能な好中球欠乏マウス株、Ｌｙｚ２^{Ｃｒｅ／Ｃｒｅ}Ｍｃｌ−ｌ^{ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ}（Ｍｃｌ−ｌ^{ΔＭｙｅｌｏ}）の骨髄系細胞白血病（Ｍｃｌ−１）抗アポトーシス性タンパク質から、Ｍｃｌ−ｌが骨髄系特異的に欠乏すると非常に重度の好中球減少症が生じることが分かる（Ｃｓｅｐｒｅｇｉら、２０１８）。Ｍｃｌ−ｌ^{ΔＭｙｅｌｏ}マウスは繁殖することができ、その生存率は、特定の病原体がいない（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）条件と従来の収容条件の両方で正常に近かった。しかしながら、ＮＳＧマウスとは対照的に、Ｍｃｌ−１^{ΔＭｙｅｌｏ}マウスモデルでは限られた経験しかない。

実施例８：修正分析
配列番号１〜１１９２に記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを含むガイド配列を、標的上の活性の高さについてスクリーニングする。標的上の活性は、ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析により測定される。

ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析によると、配列番号１〜１１９２に記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを含むガイド配列は、ＥＬＡＮＥ遺伝子の修正に適していることが分かる。

実施例９：ＥＬＡＮＥの対立遺伝子特異的ノックアウトの有効性
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子の特異的ノックアウトは、ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異対立遺伝子のイントロン４及びエキソン５を切除することにより媒介される。これは、図８に描かれるような対立遺伝子特異的ＤＳＢを媒介するために、イントロン４でのＤＳＢを媒介しＳＮＰｒｓ１６８３５６４を利用することにより成し遂げられる。この戦略を用いるとＨＳＣが効率的に成熟好中球及び機能性好中球へと分化できることを証明するために、健常ドナーを、イントロン４のそれぞれのＳＮＰ（表１参照）を標的とするｇ３５及びｇ６２を含むＲＮＰを有するＨＳＣ（ロンザ）でヌクレオフェクトする（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）。未編集の細胞をポジティブコントロールとして使用する。ヌクレオフェクション後４８（４８）時間で、公表された手順書（ＺｈｅｎｗａｎｇＪｉｅら、ＰｌｏｓＯｎｅ２０１７）にしたがってＨＳＣを好中球に分化する。編集された細胞と未編集の細胞の分化効率を、好中球特異的マーカーＣＤ６６ｂ及びＣＤ１７７で染色した後ＦＡＣＳによって測定する。ＨＳＣ媒介好中球の機能を評価するために、以下のアッセイを実行する。
１．貪食性をＥＺＣｅｌｌ（商標）ＰｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓＡｓｓａｙＫｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用してアッセイする。このキットは、フローサイトメトリーによる迅速で正確な検出及びインビトロでの貪食性の定量化のためのツールとして事前に標識されたザイモサン粒子を利用する。
２．ＨＳＣ由来好中球を大腸菌と共に培養し、次に細菌をコロニー形成のために寒天板に播種することによってキリングアッセイを実施する。未処理の細菌または未分化のHSCと培養した細菌をコントロールとして使用する。死滅効率は次のように計算される：(コロニー数_Neutrophils /コロニー数_{コントロール}）ｘ100。

３．ＥＺＣｅｌｌ（商標）ＣｅｌｌＭｉｇｒａｔｉｏｎ／ＣｈｅｍｏｔａｘｉｓＡｓｓａｙＫｉｔ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して走化性をアッセイする。

実施例１０：治療用の患者選択
ステップ１：ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された４人の患者Ａ〜Ｄを、エキソンシーケンシングしてＥＬＡＮＥ遺伝子内のＥＬＡＮＥ病原性変異を同定することにより選別する。ステップ２：同定された変異を有する対象を、次にサンガーシーケンシングしてｒｓ１６８３５６４、ｒｓ１０４ｌ４８３７及びｒｓ３７６ｌ００５の少なくとも１つのヘテロ接合性を確認することにより選別する。ステップ３．ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ１０４ｌ４８３７及びｒｓ３７６ｌ００５少なくとも１つでヘテロ接合性であると決定された各対象について、ＥＬＡＮＥ遺伝子内の変異対立遺伝子のヘテロ接合性ＳＮＰのヌクレオチドを、ＢＡＣｂｉｏを使用して決定する。ステップ４．表６にしたがって適切なガイドを選択する。

ステップ５．選択されたガイドをそれぞれの対象から取得したＰＢＭＣに導入し、ＰＢＭＣにおける病原性ＥＬＡＮＥ変異の減少を次世代シーケンス技術により検証する。患者Ａ〜Ｄのための方法論を以下に説明する。
１．患者Ａをステップ１にしたがって選別し、表現型及び臨床的状況と一致している、ＥＬＡＮＥの既知の病原性変異があることが分かる。患者Ａを関心のあるＳＮＰの周りで、ステップ２にしたがって選別し、３個のＳＮＰｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ１６８３５６４及びｒｓ３７６ｌ００５の全てでホモ接合性であることが分かる。患者Ａを、治療に好適ではないと判断する。
２．患者Ｂを既知の病原性ＥＬＡＮＥ変異について検証する。患者Ｂを、ステップ２にしたがって選別し、ＳＮＰｒｓ１６８３５６４及びｒｓ１０４ｌ４８３７でホモ接合性であることが分かる。患者Ｂは、プロモーター領域のｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であると分かる。患者Ｂを、治療に好適であると判断する。ステップ３にしたがって病原性ＥＬＡＮＥ変異と同一の対立遺伝子に存在するヌクレオチド（連鎖決定）を決定する。患者Ｂは、ＥＬＡＮＥ病原性変異と同一の対立遺伝子のｒｓ３７６１００５ＳＮＰ位置に参照ヌクレオチド塩基があることが分かる。ｇ５８ｒｅｆは、このＳＮＰの提示と完全に相補性があり、イントロン４の非コード領域に向けられるｇ３５と併せて選択される。ステップ４にしたがって、選択されたガイド組成物は、ガイドｇ５８ｒｅｆ及びｇ３５のペアを含む。この選択されたガイドのペアを使用する変異した対立遺伝子の切除が成功したかを患者ＰＭＢＣにＮＧＳ読み取りを使用するステップ５にしたがって検証する。
３．患者Ｃは、幼児期から重度の好中球減少症に苦しんでいる。ステップＡにしたがって選別し、ＥＬＡＮＥ遺伝子には病原性変異を見出さなかった。患者Ｃを、治療に好適でないと判断する。
４．患者Ｄは、ＥＬＡＮＥ遺伝子に既知の病原性変異があると検証され、ステップ２にしたがってＳＮＰの遺伝子型を同定すると、３個のＳＮＰのうち、２個でヘテロ接合性であることが分かる、つまりｒｓ１０４ｌ４８３７とｒｓ１６８３５６４の両方がヘテロ接合性であると分かる一方、ｒｓ３７６１００５はホモ接合性であると分かる。遺伝子操作に使用する２個の可能性のあるＳＮＰ間の選択をする。選択をするために、ステップ３を実行してＳＮＰと病原性変異間の連鎖を決定する、すなわち、ＳＮＰ（参照又は代替）のどのヌクレオチドがＥＬＡＮＥ病原性変異と同一の対立遺伝子に存在するかを決定する（ＳＮＰ提示）。患者Ｄをｒｓ１０４１４８３７の参照提示があると判断し、ｓｇ３９ｒｅｆが使用に適していると判断する。ｒｓ１６８３５６４ＳＮＰを参照すると、代替提示は、ＥＬＡＮＥ病原性変異と関連づけられていることが分かり、ガイドとしてｓｇ６２ａｌｔが使用に適していると判断する。これらのガイドの各々をｇ３５と併せて使用する。ステップ４にしたがって、可能性のあるガイド組成物の２個のペア、ｓｇ３９ｒｅｆ＋ｇ３５及びｇ６２ａｌｔ＋ｇ３５を同定する。ガイドペアのいずれが好ましいか決定するために、ガイドの各々及びガイドペアの編集特性及び特徴のデータベースを評価してオフターゲット効果及び編集効率を決定する。データベース評価に基づいてガイドペアを選択し、ＮＧＳ読み取りを提供するＰＭＢＣにステップ５にしたがって、利用する。

本明細書において使用するとき、全ての見出しはただ構成のためのみであり、いかなる方式でも本開示を制限することを意図するものではない。いかなる個々の段落の内容も全ての段落に等しく適用可能であってもよい。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することを含み、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
２．前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、前記変異対立遺伝子は、前記１つ又は複数の多型部位に基づいて前記二本鎖切断のための標的とされる、上記１に記載の方法。
３．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響する、上記１又は上記２に記載の方法。
４．前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部は、配列番号１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドを含む、上記１〜３の何れかに記載の方法。
５．前記第２の二本鎖切断は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内である、上記３又は４に記載の方法。
６．前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、上記３〜５の何れかに記載の方法。
７．前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、上記３〜５の何れかに記載の方法。
８．前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記３〜５の何れかに記載の方法。
９．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、上記３〜５の何れかに記載の方法。
１０．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、上記３〜５の何れかに記載の方法。
１１．前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記３〜５の何れかに記載の方法。
１２．重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する前記細胞を、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、上記１〜１１の何れかに記載の方法。
１３．第１にＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、及び前記対象から前記細胞を取得することを含む、上記１２に記載の方法。
１４．前記細胞を前記対象から動員によって及び／又はアフェレシスによって取得することを含む、上記１３又は１４に記載の方法。
１５．前記細胞を前記対象から骨髄穿刺法によって取得することを含む、上記１４に記載の方法。
１６．前記組成物を前記細胞に導入する前に前記細胞を予備刺激する、上記１〜１５の何れかに記載の方法。
１７．前記細胞を培養増殖して細胞群を取得することをさらに含む、上記１２〜１６の何れかに記載の方法。
１８．前記細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦのうちの１つ又は複数とともに培養する、上記１７に記載の方法。
１９．前記細胞を少なくとも１つのサイトカインとともに培養する、上記１７又は１８に記載の方法。
２０．前記少なくとも１つのサイトカインは、組換えヒトサイトカインである、上記１９に記載の方法。
２１．前記細胞は、複数の細胞の中の１つであり、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子の両方を含む前記組成物を、前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び他の細胞に導入し、そして前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び前記他の細胞中の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改変細胞を取得する、上記１〜２０の何れかに記載の方法。
２２．前記第１のＲＮＡ分子を含む前記組成物を導入すること又は前記第２のＲＮＡ分子の導入は、前記細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む、上記１〜２１の何れかに記載の方法。
２３．上記２１又は２２に記載の方法によって取得される改変細胞。
２４．上記２１に記載の細胞を培養増殖することから取得される改変細胞。
２５．生着することができる、上記２３又は２４に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２６．子孫細胞を生じることができる、上記２３〜２５の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２７．生着後に子孫細胞を生じることができる、上記２６に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２８．自家移植後に子孫細胞を生じることができる、上記２７に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
２９．生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる、上記２７又は２８の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３０．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、造血幹細胞及び／又は前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、上記２３〜２９の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３１．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、上記３０に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３２．前記改変細胞又は複数の改変細胞は、骨髄細胞又は末梢単核細胞（ＰＭＣ）である、上記２３〜３１の何れかに記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
３３．前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細胞。
３４．前記改変細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞から改変された、上記３３に記載の改変細胞。
３５．上記２３〜３４の何れかに記載の改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
３６．前記細胞と前記薬学的に許容される担体とを混合することを含む、上記３５に記載の組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法。
３７．インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって、前記方法は、
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、そして前記対象から前記細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記改変細胞を培養増殖すること、を含み、
前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、方法。
３８．ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用。
３９．治療有効量の上記２１〜３４の何れかに記載の改変細胞、上記３５に記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法によって調製された組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法。
４０．ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
ａ）前記対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与し、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法。
４１．ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、前記自家改変細胞は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子において二本鎖切断するように改変され、
前記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を前記細胞に導入することから生じ、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、こと、を含み、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法。
４２．ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択する方法であって、
ａ）前記対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異について選別し、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された前記対象の前記細胞を配列決定することによりｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、及び
ｄ）治療のために前記１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみを選択するステップを含む、方法。
４３．ｅ）前記対象の骨髄から吸引によるか又は動員及び末梢血液のアフェレシスによるかのいずれかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）の前記ＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子に存在する前記１つ又は複数の多型部位の前記ヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
前記第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の前記ＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第１のＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が第１の二本鎖切断に影響した前記１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、こと、
ｇ）前記対象にステップ（ｆ）の前記改変細胞を投与し、それにより前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、
ステップ（ｄ）において選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさらに含む、上記４２に記載の方法。
４４．配列番号：１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ分子。
４５．上記４４に記載のＲＮＡ分子及びガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を含む、組成物。
４６．前記第２のＲＮＡ分子は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする、上記４５に記載の組成物。
４７．前記第２のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記ヌクレオチド配列は、前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記配列とは異なるヌクレオチド配列である、上記４５又は４６に記載の組成物。
４８．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分を含む、上記４５〜４７の何れかに記載の組成物。
４９．ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する前記配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である、上記４８に記載の組成物。
５０．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を含む、上記４５〜４８の何れかに記載の組成物。
５１．前記第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部をさらに含む、上記４５〜５０の何れかに記載の組成物。
５２．前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでである、上記４２〜５１の何れかに記載の組成物。
５３．１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は前記１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む、上記４５〜５２の何れかに記載の組成物。
５４．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記方法は、前記細胞に上記４４に記載のＲＮＡ分子又は上記４５〜５３の何れかに記載の組成物を送達することを含む、方法。
５５．ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する対象に上記４４に記載のＲＮＡ分子若しくは上記４５〜５３の何れかに記載の組成物、又は上記４４に記載のＲＮＡ分子若しくは上記４５〜５３の何れかに記載の組成物によって改変された細胞を送達することを含む、方法。
５６．前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子及び前記ＲＮＡ分子若しくは複数のＲＮＡ分子を、前記対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する、上記５４又は５５に記載の方法。
５７．前記方法は、
ａ）変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することであって、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子は、エキソン全体又は前記エキソンの一部に隣接している領域を標的とする、こと、
ｂ）遺伝子の複数のエキソン、オープンリーディングフレーム全体を除去すること、又は遺伝子全体を除去すること、
ｃ）前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とすること、
ｄ）前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とすること、
ｅ）前記第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とすること、
ｆ）エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により前記変異対立遺伝子に挿入又は欠失を受けさせ、前記変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生成すること、を含み、
任意選択で前記フレームシフトは、前記変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトを生じ、
好ましくは、前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成される又は前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる、上記５４〜５６の何れかに記載の方法。
５８．前記不活性化又は治療により前記変異対立遺伝子によってコードされる切断型タンパク質及び前記機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる、上記５５〜５７の何れかに記載の方法。
５９．ａ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｂ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｃ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響し、
ｄ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｅ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｆ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、上記５５〜５８の何れかに記載の方法。
６０．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５、４５〜５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、の使用。
６１．細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５〜５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を含む薬物であって、前記細胞に上記４４に記載のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５〜５３の何れかに記載の組成物又は上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
６２．ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、上記１〜２２の何れかに記載の方法、上記２３〜３４の何れかに記載の改変細胞、上記３５若しくは４５〜５３の何れかに記載の組成物又は上記３６〜３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記４４に記載のＲＮＡ分子、の使用。
６３．ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、上記４４のＲＮＡ分子、上記３５若しくは４５〜５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は上記２３〜３４の何れかに記載の改変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、上記４４のＲＮＡ分子、上記３５もしくは４５〜５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は上記２３〜３４の何れかに記載の改変細胞を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
６４．上記４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及び前記細胞の前記変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
６５．上記４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
６６．上記３５若しくは４５〜５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３〜３４の何れかに記載の改変細胞、及び前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう前記組成物を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
６７．上記３５若しくは４５〜５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３〜３４の何れかに記載の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう上記３５若しくは４５〜５３の何れかに記載の組成物、上記３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は上記２３〜３４の何れかに記載の改変細胞をＳＣＮ若しくはＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。

Claims

細胞の、重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）又は周期性好中球減少症（ＣｙＮ）に関連している変異を有する好中球エラスターゼ遺伝子（ＥＬＡＮＥ遺伝子）遺伝子の変異対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することを含み、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、方法。
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、前記変異対立遺伝子は、前記１つ又は複数の多型部位に基づいて前記二本鎖切断のための標的とされる、請求項１に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することをさらに含み、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部は、配列番号１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドを含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
前記第２の二本鎖切断は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域内である、請求項３又は４に記載の方法。
前記細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法。
前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法。
前記細胞は、ｒｓ１０４１４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法。
前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響する、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法。
前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響する、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法。
前記細胞は、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、請求項３〜５の何れか一項に記載の方法。
重症先天性好中球減少症（ＳＣＮ）若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する前記細胞を、ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得することを含み、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
第１にＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象を選択することであって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、及び前記対象から前記細胞を取得することを含む、請求項１２に記載の方法。
前記細胞を前記対象から動員によって及び／又はアフェレシスによって取得することを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
前記細胞を前記対象から骨髄穿刺法によって取得することを含む、請求項１４に記載の方法。
前記組成物を前記細胞に導入する前に前記細胞を予備刺激する、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
前記細胞を培養増殖して細胞群を取得することをさらに含む、請求項１２〜１６の何れか一項に記載の方法。
前記細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦのうちの１つ又は複数とともに培養する、請求項１７に記載の方法。
前記細胞を少なくとも１つのサイトカインとともに培養する、請求項１７又は１８に記載の方法。
前記少なくとも１つのサイトカインは、組換えヒトサイトカインである、請求項１９に記載の方法。
前記細胞は、複数の細胞の中の１つであり、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子の両方を含む前記組成物を、前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び他の細胞に導入し、そして前記複数の細胞の中の少なくとも前記細胞及び前記他の細胞中の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化し、それにより複数の改変細胞を取得する、請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法。
前記第１のＲＮＡ分子を含む前記組成物を導入すること又は前記第２のＲＮＡ分子の導入は、前記細胞又は複数の細胞のエレクトロポレーションを含む、請求項１〜２１の何れか一項に記載の方法。
請求項２１又は２２に記載の方法によって取得される改変細胞。
請求項２１に記載の細胞を培養増殖することから取得される改変細胞。
生着することができる、請求項２３又は２４に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
子孫細胞を生じることができる、請求項２３〜２５の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
生着後に子孫細胞を生じることができる、請求項２６に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
自家移植後に子孫細胞を生じることができる、請求項２７に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
生着後少なくとも１２か月間又は少なくとも２４か月間子孫細胞を生じることができる、請求項２７又は２８の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
前記改変細胞又は複数の改変細胞は、造血幹細胞及び／又は前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項２３〜２９の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
前記改変細胞又は複数の改変細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項３０に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
前記改変細胞又は複数の改変細胞は、骨髄細胞又は末梢単核細胞（ＰＭＣ）である、請求項２３〜３１の何れか一項に記載の改変細胞又は複数の改変細胞。
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の１つの対立遺伝子の少なくとも一部を欠いている改変細胞。
前記改変細胞は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６ｌ００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞から改変された、請求項３３に記載の改変細胞。
請求項２３〜３４の何れか一項に記載の改変細胞及び薬学的に許容される担体を含む、組成物。
前記細胞と前記薬学的に許容される担体とを混合することを含む、請求項３５に記載の組成物のインビトロ又はエクスビボ調製方法。
インビトロ又はエクスビボで改変細胞を含む組成物を調製する方法であって、前記方法は、
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、そして前記対象から前記細胞を取得すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記改変細胞を培養増殖すること、を含み、
前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、方法。
ａ）ＳＣＮ若しくはＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する及び／又はＳＣＮ若しくはＣｙＮに苦しむ対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離することであって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２ｌ７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６１４８ｌ９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である、こと、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療するために前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与すること、を含む方法によってインビトロで調製される組成物の使用。
治療有効量の請求項２１〜３４の何れか一項に記載の改変細胞、請求項３５に記載の組成物又は請求項３６若しくは３７に記載の方法によって調製された組成物を投与することを含む、ＳＣＮ又はＣｙＮで苦しんでいる対象の治療方法。
ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２ｌ、ｒｓ２０ｌ０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９ｌ２２９、ｒｓ７ｌ３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４ｌ３８８９、ｒｓ７６ｌ４８１９４４、ｒｓ３７６ｌ００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２ｌ６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８ｌ０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
ａ）前記対象から取得した複数の細胞からＨＳＰＣを単離すること、
ｂ）１つ又は複数の細胞における前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、ステップ（ａ）の前記細胞に、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び
１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、を含む組成物を導入することであって、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響し、
任意選択で、前記細胞にＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体は、前記１つ又は複数の細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子における第２の二本鎖切断に影響し、
それにより改変細胞を取得する、こと、任意選択で
ｃ）ステップ（ｂ）の前記細胞を培養増殖することであって、前記改変細胞は生着することができ、生着後に子孫細胞を生じることができる、こと、及び
ｄ）前記対象にステップ（ｂ）又はステップ（ｃ）の前記細胞を投与し、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、方法。
ＳＣＮ又はＣｙＮに関連しているＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する治療を必要とする対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮの治療方法であって、前記対象は、ｒｓ１０４１４８３７、ｒｓ３７６１００５、ｒｓ１６８３５６４、ｒｓ９７４９２７４、ｒｓ７４００２１、ｒｓ２０１０４８０２９、ｒｓ１９９７２０９５２、ｒｓ２８５９１２２９、ｒｓ７１３３５２７６、ｒｓ５８０８２１７７、ｒｓ３８２６９４６、ｒｓ１０４１３８８９、ｒｓ７６１４８１９４４、ｒｓ３７６１００８、ｒｓ１０４０９４７４、ｒｓ３７６１００７、ｒｓ１７２１６６４９、ｒｓ１０４６９３２７、ｒｓ８１０７０９５、ｒｓ１０４２４４７０及びｒｓ７８３０２８５４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性であり、前記方法は、
前記対象に自家改変細胞又は自家改変細胞の子孫を投与することであって、前記自家改変細胞は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子において二本鎖切断するように改変され、
前記二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列及び第１のＲＮＡ分子を含む組成物を前記細胞に導入することから生じ、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記第１のＲＮＡ分子の複合体は、前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子を不活性化するよう、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における二本鎖切断に影響する、こと、を含み、それにより前記対象の前記ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する、方法。
ＳＣＮ又はＣｙＮと診断された対象のプールから治療のための対象を選択する方法であって、
ａ）前記対象のプールにおける各対象から細胞を取得するステップ、
ｂ）各対象の細胞をＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異について選別し、ＳＣＮ又はＣｙＮに関連するＥＬＡＮＥ遺伝子変異を有する対象のみを選択するステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）において選択された前記対象の前記細胞を配列決定することによりｒｓ１０４ｌ４８３７、ｒｓ３７６ｌ００５、ｒｓ１６８３５６４から成る群から選択される１つ又は複数の多型部位でのヘテロ接合性を選別するステップ、及び
ｄ）治療のために前記１つ又は複数の多型部位でヘテロ接合性である細胞を有する対象のみを選択するステップを含む、方法。
ｅ）前記対象の骨髄から吸引によるか又は動員及び末梢血液のアフェレシスによるかのいずれかにより造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を取得すること、
ｆ）ステップ（ｅ）の前記ＨＳＰＣ細胞に
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子に存在する前記１つ又は複数の多型部位の前記ヘテロ接合性対立遺伝子のヌクレオチド塩基を標的とする配列番号：１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含む第１のＲＮＡ分子、及び
前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける配列を標的とするガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を導入することであって、
前記第１のＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ又は複数の前記ＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の前記変異対立遺伝子における第１の二本鎖切断に影響し、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、前記第１のＲＮＡ分子と前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が第１の二本鎖切断に影響した前記１つ又は複数のＨＳＰＣ細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の両対立遺伝子のイントロン３、イントロン４又は３’ＵＴＲにおける第２の二本鎖切断に影響し、それにより改変細胞を取得する、こと、
ｇ）前記対象にステップ（ｆ）の前記改変細胞を投与し、それにより前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療すること、を含む、
ステップ（ｄ）において選択された対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
配列番号：１〜１１９２のいずれか１つに記載されている１７〜２０個の近接しているヌクレオチドの配列中の１７〜２０個のヌクレオチドを有するガイド配列部を含むＲＮＡ分子。
請求項４４に記載のＲＮＡ分子及びガイド配列部を含む第２のＲＮＡ分子を含む、組成物。
前記第２のＲＮＡ分子は、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の非コード領域を標的とする、請求項４５に記載の組成物。
前記第２のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記ヌクレオチド配列は、前記第１のＲＮＡ分子の前記ガイド配列部の前記配列とは異なるヌクレオチド配列である、請求項４５又は４６に記載の組成物。
前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する配列を有する部分を含む、請求項４５〜４７の何れか一項に記載の組成物。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに結合する前記配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である、請求項４８に記載の組成物。
前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、さらにｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を含む、請求項４５〜４８の何れか一項に記載の組成物。
前記第２のＲＮＡ分子は、１つ又は複数のリンカー部をさらに含む、請求項４５〜５０の何れか一項に記載の組成物。
前記第１及び／又は前記第２のＲＮＡ分子は、長さが３００ヌクレオチドまでである、請求項４２〜５１の何れか一項に記載の組成物。
１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子又は前記１つ又は複数のｔｒａｃｒＲＮＡ分子をコードする配列をさらに含む、請求項４５〜５２の何れか一項に記載の組成物。
細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための方法であって、前記方法は、前記細胞に請求項４４に記載のＲＮＡ分子又は請求項４５〜５３の何れか一項に記載の組成物を送達することを含む、方法。
ＳＣＮ又はＣｙＮを治療する方法であって、前記方法は、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する対象に請求項４４に記載のＲＮＡ分子若しくは請求項４５〜５３の何れか一項に記載の組成物、又は請求項４４に記載のＲＮＡ分子若しくは請求項４５〜５３の何れか一項に記載の組成物によって改変された細胞を送達することを含む、方法。
前記１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子及び前記ＲＮＡ分子若しくは複数のＲＮＡ分子を、前記対象及び／又は細胞に実質的に同時に又は異なる時間に送達する、請求項５４又は５５に記載の方法。
前記方法は、
ａ）変異対立遺伝子から疾患発症性の変異を含むエキソンを除去することであって、前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子は、エキソン全体又は前記エキソンの一部に隣接している領域を標的とする、こと、
ｂ）遺伝子の複数のエキソン、オープンリーディングフレーム全体を除去すること、又は遺伝子全体を除去すること、
ｃ）前記第１のＲＮＡ分子又は前記第１及び前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子のエキソン及びイントロンの間の選択的スプライシングシグナル配列を標的とすること、
ｄ）前記第２のＲＮＡ分子が、変異対立遺伝子と機能性対立遺伝子の両方に存在する配列を標的とすること、
ｅ）前記第２のＲＮＡ分子が、イントロンを標的とすること、
ｆ）エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構により前記変異対立遺伝子に挿入又は欠失を受けさせ、前記変異対立遺伝子の配列にフレームシフトを生成すること、を含み、
任意選択で前記フレームシフトは、前記変異対立遺伝子の不活性化又はノックアウトを生じ、
好ましくは、前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子中に早期の終止コドンが作成される又は前記フレームシフトにより前記変異対立遺伝子の転写物にナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構が生じる、請求項５４〜５６の何れか一項に記載の方法。
前記不活性化又は治療により前記変異対立遺伝子によってコードされる切断型タンパク質及び前記機能性対立遺伝子によってコードされる機能性タンパク質が生じる、請求項５５〜５７の何れか一項に記載の方法。
ａ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｂ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｃ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１０４ｌ４８３７又はｒｓ３７６ｌ００５でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響し、
ｄ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン４における二本鎖切断に影響し、
ｅ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子のイントロン３における二本鎖切断に影響し、
ｆ）前記細胞又は前記対象が、ｒｓ１６８３５６４でヘテロ接合性であり、前記第２のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの前記複合体が、前記ＥＬＡＮＥ遺伝子の３’ＵＴＲ領域における二本鎖切断に影響する、請求項５５〜５８の何れか一項に記載の方法。
細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するための、請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３５、４５〜５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、の使用。
細胞の、変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化する使用のための、請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３５若しくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を含む薬物であって、前記細胞に請求項４４に記載のＲＮＡ分子、請求項３５若しくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象におけるＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止するための、請求項１〜２２の何れか一項に記載の方法、請求項２３〜３４の何れか一項に記載の改変細胞、請求項３５若しくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物又は請求項３６〜３７に記載の方法により調製された組成物、又は請求項４４に記載のＲＮＡ分子、の使用。
ＳＣＮ又はＣｙＮを治療、寛解又は防止する使用のための、請求項４４のＲＮＡ分子、請求項３５若しくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は請求項２３〜３４の何れか一項に記載の改変細胞を含む薬物であって、ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に、請求項４４のＲＮＡ分子、請求項３５もしくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物又は請求項２３〜３４の何れか一項に記載の改変細胞を送達することにより前記薬物を投与する、薬物。
請求項４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及び前記細胞の前記変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するために、前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又は前記ｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
請求項４４に記載のＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくは前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子若しくは前記ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を前記ＳＣＮ又はＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、前記対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。
請求項３５若しくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は請求項２３〜３４の何れか一項に記載の改変細胞、及び前記細胞の前記ＥＬＡＮＥ遺伝子を不活性化するよう前記組成物を前記細胞に送達するための説明書を備える、前記細胞の変異ＥＬＡＮＥ対立遺伝子を不活性化するためのキット。
請求項３５若しくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は請求項２３〜３４の何れか一項に記載の改変細胞、及びＳＣＮ又はＣｙＮを治療するよう請求項３５若しくは４５〜５３の何れか一項に記載の組成物、請求項３６若しくは３７に記載の方法により調製された組成物、又は請求項２３〜３４の何れか一項に記載の改変細胞をＳＣＮ若しくはＣｙＮを有する又は有するリスクがある対象に送達するための説明書を備える、対象のＳＣＮ又はＣｙＮを治療するためのキット。