JP2021514611A - 感染症関連早産診断方法 - Google Patents

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Abstract

妊娠女性が、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、前記方法が、ｂ）以下の細菌：ｉｖ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａｐａｒｖｕｍ遺伝子型ＳＶ６；ｖ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ；及びｖｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｉｎｅｒｓの存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、前記細菌の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、上行性子宮内感染（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）による早産（ＰＴＢ）のリスクがある妊娠の診断のための方法及びキットに関する。
数十年に及ぶ研究、及び病因に関する理解の大きな進歩にもかかわらず、ＰＴＢは依然として国内及び世界的に重要な主たる産科医療問題である。ＰＴＢは、先進国の５歳までの新生児における死亡及び障害の１つの主因であり、周産期死亡率及び疾病率の主要な原因の１つであり、世界中で毎年約１５００万人の新生児が早産で出生している。あまりに早期に出生した新生児の多くは、正常で健康的な生活を送ることができるが、かなりの割合が短命で、生涯に亘って障害を経験する。個人、家族、及び社会に対する影響は大きく、周産期ケアと生涯に亘る障害とに関する医療コストについても同様である。
自然ＰＴＢ（ｓＰＴＢ）症例の約２０％は子宮内感染が原因であり、その大部分は、絨毛羊膜炎、臍帯炎、早産及び早期分娩を引き起こす、膣粘膜から妊娠子宮への細菌の上方移動に起因する。複数種の細菌がＰＴＢを引き起こすことが分かっている一方で、適切な予防的処置を受けるために、リスクのある妊娠初期の女性を特定することが課題となっている。従来の微生物学的方法は不正確であり、予測可能性が高くなく、熟練者による判定を要する（これはプロセスに時間がかかり、適切な熟練判定者の数が多くないので、広く実施されていない）。
予防的抗生物質を投与してｓＰＴＢを防ぐ試験は、様々な成功を収めている。ＰＴＢ低減の観点で最大の利益を達成するために、抗菌処置は、微生物リスクが低い女性の不必要な処置を回避しつつ、膣の微生物状態に基づきリスクのある女性に選択的に適用される必要がある。通常、女性は、細菌性膣炎（ＢＶ）又は他の関連する膣微生物のリスクファクターの診断に基づき試験候補となる。これは、ＢＶの存在が、膣微生物学に基づきｓＰＴＢのリスクがある女性を特定する唯一の手段であるからである。
ｓＰＴＢの病因には多数の微生物が関与している。感染症によるｓＰＴＢを定期的に引き起こす細菌の一部は、妊娠中の女性の生殖管でよく見られる一般的な細菌である。一方、他の細菌は、異常な膣微生物叢（例えば、ＢＶなど）を有する女性でのみ見られる、及び／又は生殖管感染症に関連している。感染症に関連するｓＰＴＢの最大半分において、羊膜腔内に複数種の細菌が存在する。最も頻繁にｓＰＴＢに関連する微生物は、妊娠中の女性の約半数の生殖管に存在する細胞内細菌の属であるＵｒｅａｐｌａｓｍａであり、これは膣内細菌叢の他のマーカーから独立している。いくつかの研究によれば、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ（通常、種レベルで定義されない）の存在が、ｓＰＴＢの弱いリスクファクターであることが示されている。
感染症に関連した早産のリスクがある女性の特定は、全く単純なものではなく、現在まで、ＢＶなどの状態の不正確な診断に依存している。ＢＶは、正常な膣微生物叢の乱れ、Ｈ２Ｏ２産生Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．の喪失、膣内ｐＨの上昇、並びにグラム不定球桿菌、嫌気性生物、及び生殖器マイコプラズマの増加により特徴付けられる。重要なこととして、ＢＶに関連する膣内微生物叢は、人種によって異なることが知られている。ＢＶは、アフリカ民族の集団におけるｓＰＴＢのリスク増加を予測することが示されているが、コーカサス集団では、保有率が低く（＜１０％）、比較的弱いリスク予測ファクターである（ＯＲ＜２）。好気性膣炎（ＡＶ）もｓＰＴＢのリスクファクターであり、微生物特性は異なるものの、ＢＶと同様のリスクプロファイルを示す。
リスクのある女性で処置に応答する女性の特定は、感染症関連のｓＰＴＢを防ぐために、成功する介入の設計において重要なファクターである。したがって、代替のｓＰＴＢ診断方法、又は少なくとも、これまでに知られている方法を補完する新しい診断方法の提供が必要である。
今日まで、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａの状態に基づきｓＰＴＢのリスクがある女性を特定することは、それが感染した早産で最も多く見られる微生物であり、容易に処置可能であるという事実にもかかわらず、不可能である。これは、現在のｓＰＴＢ予測方法の主たる弱点である。
本発明は、適切な予防的処置をリスクのある女性に適用する及び標的とすることができるように、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａのコロニー形成状態の評価を含む微生物学的プロファイルに基づいて、感染症に起因するｓＰＴＢのリスクがある妊娠を診断するための改善された又は代替の方法を提供することを目的とする。
背景技術のこれまでの議論は、単に、本発明の理解を容易にすることのみを意図している。この議論は、言及された資料が、本願優先日における技術常識一部である又は一部であったことの承認する又は認めるものではない。
本発明は、妊娠女性が、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
前記細菌の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す方法を提供する。
任意に、前記試験方法は、更に、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍの存在について試験し、以下のいずれか：
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６の不存在下でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；又は
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す。
好ましくは、前記試験方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。
試験は、任意に、Ｌ． ｉｎｅｒｓ、好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、及び／又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の高レベルの存在について試験することを、先に行ってもよい。もし、これらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種が高レベルで検出された場合、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクが低く、工程（ａ）は行う必要がない。
本発明は、更に、妊娠女性が、感染症に関連するｓＰＴＢを予防する処置により利益を受けるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
前記細菌の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあり、ｓＰＴＢを予防する処置により利益を受けることを示す方法を提供する。
本発明は、更に、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクがある妊娠女性を処置する方法であって、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
ｂ）前記細菌が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供する工程とを含む方法を提供する。
本発明は、更に、感染症に関連するｓＰＴＢを有する妊娠女性のリスクを低減する方法であって、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
ｂ）前記細菌が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供し、ｓＰＴＢのリスクを低減する工程とを含む方法を提供する。
任意に、抗生物質療法の後に、再感染の機会を低減するために、プロバイオティック療法を行う、又は共投与してもよい。
本発明は、妊娠女性が、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクがあるかどうかを判定するキットであって、前記キットは、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験するための手段と、
ｂ）使用のための指示とを含むキットを提供する。
本発明の更なる特徴は、そのいくつかの非限定的な実施形態の以下の説明において、より十分に説明される。この説明は、単に、本発明を例示する目的で記載されるに過ぎない。これは、前記した本発明の広い概要、開示、又は説明に対する限定として理解されるべきではない。説明は、添付図面を参照して行われる。
図１は、ＢＶの分子診断に基づくｓＰＴＢ検出率と、本発明のＧＬＵ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ； Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ； Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３又はＳＶ６；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）ＰＣＲアッセイを用いた診断との間の違いを示すベン図である。ＢＶは、Ｇ． ｖａｇｉｎａｌｉｓと２種類以上の更なるＢＶ関連細菌の場合にポジティブと定義する。 図２は、ＢＶの分子診断対本発明のＧＬＵ試験を用いた診断に基づく、出産時の在胎齢で細分化した、ｓＰＴＢ検出率間の差を示すＰＴＢ予測のグラフである。 図３は、１３４名の女性の膣スワブ中におけるＵｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の存在率の安定性のグラフであり、妊娠期間中に採取した３つの完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ）サンプルを用いている。黒色、サンプル時点１；ダークグレー、サンプル時点２；ライトグレー、サンプル時点３。 図４は、実施例３のタイムラインのフローチャート：「スクリーニングと処置」プログラムの臨床試験である。
発明の詳細な説明
検出方法
妊娠初期／中期に感染に関連した自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクがある女性を診断し、このリスクを低減するための抗生物質療法により、妊娠女性のどの集団に最も大きな利益がもたらされるかを確認するための、信頼性の高い、迅速で、安価で、シンプル且つ効果的な方法が世界的な必要として存在する。本発明を用いて、妊娠の前半期に感染に関連したｓＰＴＢのリスクがある女性のかなりの割合を特定することができ、その結果、標的抗菌剤及びプロバイオティック療法を適用して、細菌を排除し、ｓＰＴＢの割合を低減することができる。
したがって、本発明は、妊娠女性が、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
前記細菌の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す方法を提供する。
本発明は、更に、妊娠女性が、感染症に関連するｓＰＴＢを予防する処置により利益を受けるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
前記細菌の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあり、ｓＰＴＢを予防する処置により利益を受けることを示す方法を提供する。
任意に、抗生物質療法の後に、再感染の機会を低減するために、プロバイオティック療法を行う、又は共投与してもよい。
早産とは、世界保健機関（ＷＨＯ）によって、３７週間の妊娠期間が完了する前に、生きて産まれた新生児として定義されている。妊娠期間に基づいて、ＰＴＢには次のサブカテゴリがある。
・極めて早産（＜２８週間）
・非常に早産（２８〜＜３４週間）
・中期から後期早産（３５週間＋）。
本発明は、ｓＰＴＢの発生率が、上に挙げた細菌プロファイルについて試験でポジティブとされた妊娠女性でより高いことを見出した。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、前述した細菌について試験ポジティブとされた妊娠女性は、ｓＰＴＢのリスクを低減するために抗菌療法による利益を受ける可能性が高いと考える。
リストの細菌の３種以上の存在は、リストの４種の細菌であってもよい。
Ｕｒｅａｐｌａｓｍａは、ｓＰＴＢの大部分の症例に関連しているが、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａを有する大部分の女性は、ｓＰＴＢのリスクがない。本発明より前は、妊娠女性にリスクがあるかどうかを特定する方法はなかった。ＢＶ診断に関わるこれまでの試験では、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａの状態は、それがＢＶ関連生物ではないために無視されてきた。更に、今日まで、検出は、一般にヒトのＵｒｅａｐｌａｓｍａ種の属レベルまでの特定に限定されており、２つの既知の種及び関連する血清型を区別していない。好ましくは、感染症に関連するｓＰＴＢは、上行性子宮内感染、胎盤を通る母親の血液中の移動、羊水穿刺などの侵襲的手順によって引き起こされる感染、及び細菌による非妊娠子宮のコロニー形成に関連する。最も好ましくは、感染症に関連するｓＰＴＢは、上行性子宮内感染症に関連する。
任意に、本発明は、妊娠女性が、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；
ｉｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｖ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
以下のいずれか：
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６の不存在下でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；又は
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す方法を提供する。
任意に、本発明は、妊娠女性が、感染症に関連するｓＰＴＢを予防する処置により利益を受けるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；
ｉｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｖ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
以下のいずれか：
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６の不存在下でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；又は
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す方法を提供する。
任意に、試験されたＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓは、クレード４である。
理論に拘束されるものではないが、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍの存在が、それ自体、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクを高め得ると考えられる。ｓＰＴＢのリスクは、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＳＶ６を有する女性で既に高いので、Ｆ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍの存在によって加えられる更なる予測力は、Ｕ． ｐａｒｖｕｍ ＳＶ３／ＳＶ６がネガティブである女性においてのみ顕著である。
したがって、リスクは、以下のように分けられる。
Figure 2021514611
Figure 2021514611
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したがって、細菌種の以下の組合せが試験ポジティブである妊娠女性は、感染症関連のｓＰＴＢのリスクが高い。
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 他の組合せは、低リスクである。
任意に、試験されたＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓは、クレード４である。
任意に、試験は、膣液中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の高レベルの存在について試験することを、先に行ってもよい。もし、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種が高レベルで検出された場合、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクが低く、工程（ａ）は行う必要がない。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は、好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ． ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、及びＬ． ｊｅｎｓｅｎｉｉを含むリストから選択される。「高レベル」とは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、約１０，０００コピー、１５，０００コピー、又は好ましくは約２０，０００コピー超存在することを意味する。或いは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の高レベルの存在は、伸長因子Ｔｕ（ｔｕｆ）遺伝子のコピー数を決定することにより試験することができる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の高レベルの存在を定量するために使用できる他の遺伝子を、使用してもよい。
理論に拘束されるものではないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の高レベルは、妊娠女性に、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓに関連する感染症関連ｓＰＴＢのリスクに対してある程度の防御を与えると考えられる。したがって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の高レベルで検出された場合、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓに関連する感染症関連ｓＰＴＢのリスクが低く、前記方法の工程（ａ）は行う必要がない。
好ましくは、試験方法は、リアルタイムＰＣＲとしても知られる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。或いは、試験は、エンドポイントＰＣＲとそれに続くＤＮＡシークエンシング、デジタルＰＣＲ、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、細菌培養、又は免疫学的試験を介してもよい。培養の場合、ｑＰＣＲ試験などの試験の第２ラウンドを、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ（種及び特定のＵ． ｐａｒｖｕｍの遺伝子型を特定するため）及び／又はＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ（クレードを特定するため）を含むことを第１の方法によって判定したサンプルに対して行ってもよい。
好ましくは、試験は、１０〜２４週間の妊娠期間、１６〜２４週間の妊娠期間、より好ましくは１８〜２２週間の妊娠期間、最も好ましくは１８〜２０週間の妊娠期間、又は２２週間の妊娠期間の前に行われる。
好ましくは、サンプリングのために採取される流体は、子宮頸部液としても知られる膣液である。或いは、採取された流体は、子宮頸管液、子宮頸管粘液、及び／又は子宮頸管粘液栓由来の物質であることができる。
好ましくは、サンプルは、自身で採取した膣液である。例えば、サンプルは、膣スワブを使用して自身で採取することができる。或いは、膣液は、外科的、病院的、又は臨床的設定で採取することができる。例えば、膣液、子宮頸管粘液、及び／又は子宮頸管粘液栓からの物質を、腟鏡を用いて／用いずに膣スワブを使用して、医療提供者によって採取することができた。サンプルは更に、膣圧注後に採取された圧注液のサンプルであることができる。
膣スワブは、乾燥スワブであることができる。好ましくは、乾燥スワブを、直ちに液体培地に入れる。
本発明との比較目的のために、本発明において、ＢＶは、子宮頸部サンプル中のＧ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ ＤＮＡのｑＰＣＲ検出、及び１種以上の更なるＢＶ関連細菌（Ｆ． ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｌ． ａｍｎｉｏｎｉｉ、Ｓ． ｓａｎｇｕｉｎｅｇｅｎｓ、Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓ、又はＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）として定義される。
試験は、細菌の以下の組合せでポジティブとなることがある。
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 処置方法
本発明は、更に、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクがある妊娠女性を処置する方法であって、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
ｂ）前記細菌が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供する工程とを含む方法を提供する。
本発明は、更に、ｓＰＴＢを有する妊娠女性のリスクを低減する方法であって、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
ｂ）前記細菌が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供し、ｓＰＴＢのリスクを低減する工程とを含む方法を提供する。
本発明は、更に、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクがある妊娠女性を処置する方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；
ｉｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｖ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
ｂ）以下のいずれか：
−Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；又は
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供する工程とを含む方法を提供する。
本発明は、更に、感染症に関連するｓＰＴＢを有する妊娠女性のリスクを低減する方法であって、前記方法は、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；
ｉｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｖ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
ｂ）以下のいずれか：
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６の不存在下でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；又は
−Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供する工程とを含む方法を提供する。
任意に、抗生物質療法の後に、再感染の機会を低減するために、プロバイオティック療法を行う、又は共投与してもよい。
好ましくは、前記試験方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。
任意に、試験されたＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓは、クレード４である。
任意に、試験は、膣液中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、及び／又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉの高レベルの存在について試験することを、先に行ってもよい。もし、これらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種が高レベルで検出された場合、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクが低く、工程（ａ）は行う必要がない。
好ましくは、試験は、１０〜２４週間の妊娠期間、１６〜２４週間の妊娠期間、より好ましくは１８〜２２週間の妊娠期間、最も好ましくは１８〜２０週間の妊娠期間、又は２２週間の妊娠期間の前に行われる。
好ましくは、抗生物質療法は、１０〜２４週間の妊娠期間、１６〜２４週間の妊娠期間、より好ましくは１８〜２２週間の妊娠期間、最も好ましくは１８〜２０週間の妊娠期間、又は２２週間の妊娠期間の前に行われる。
好ましくは、プロバイオティック療法は、１０〜２４週間の妊娠期間、１６〜２４週間の妊娠期間、より好ましくは１８〜２２週間の妊娠期間、最も好ましくは１８〜２０週間の妊娠期間、又は２２週間の妊娠期間の前に行われる。
キット
本発明は、妊娠女性が、感染症に関連するｓＰＴＢのリスクがあるかどうかを判定するキットであって、前記キットは、
ａ）以下の細菌：
ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
の存在について、膣液のサンプルを試験するための手段と、
ｂ）使用のための指示とを含むキットを提供する。
キットは、更に、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍのための試験を含むことができる。
キットは、更に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種のための試験を含むことができる。好ましくは、試験されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ以外のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ． ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、及びＬ． ｊｅｎｓｅｎｉｉである。
本発明のキットはまた、ユーザのコンプライアンスを促進するように設計された指示を含むことができる。本明細書で使用される指示は、任意のラベル、インサートなどを意味し、包装材料の１つ以上の表面上に配してもよいし、指示を、別のシート上に設けてもよいし、又はそれらの任意の組合せであってもよい。例えば、実施形態では、本発明のキットは、本発明のｓＰＴＢに関連する細菌について試験するための指示を含む。一実施形態では、指示は、本発明の方法が、ｓＰＴＢの予測、及びｓＰＴＢを予防する処置により利益を受ける女性の予測に適していることを示す。
総論
当業者であれば、本明細書に記載された発明が、具体的に記載されたもの以外の改変例及び変形例を有し得ることを理解しよう。本発明は、そのようなあらゆる改変例及び変形例を包含する。本発明はまた、個別に又はまとめて、本明細書中に言及又は示される全ての工程、特徴、組成物、及び化合物、並びに任意のあらゆる組合せ、又は工程及び特徴の任意の２つ以上を含む。
本明細書に引用された各文書、文献、特許出願、又は特許は、その全体が参照により本明細書に援用される。このことは、読者により、それが、本明細書の一部として読まれ考慮されるべきであることを意味する。本明細書において引用された文書、文献、特許出願、又は特許は、本明細書において繰り返さないのは、簡潔性の理由のためだけに過ぎない。
本明細書に記載される又は本明細書に参照により援用される文献における製品についての製造業者の指示、記述、製品仕様、及び製品シートは、本明細書に参照により援用され、本発明の実施において使用することができる。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態のいずれによっても範囲が限定されるものではない。これらの実施形態は、例示のみを目的とすることを意図するものである。機能的に等価な生成物、組成物、及び方法が、本明細書に記載される発明の範囲内であることは明らかである。
本明細書に記載される発明は、値（例えば、濃度、信号、検出、振幅、配列など）の１つ以上の範囲を含むことができる。値の範囲は、範囲を定義する値を含む範囲内の全ての値と、その範囲に隣接する値であって、その範囲の境界を規定する値に直接隣接する値と同一又は実質的に同一の結果をもたらす値とを含むと理解される。したがって、特段の断りがない限り、本明細書及び請求項に示される数値パラメータは、本発明が得ようとする所望の性質に応じて変動し得る近似値である。したがって、「約８０％」は、「約８０％」と「８０％」も意味する。少なくとも、各数値パラメータは、有効桁数と通常の丸め手法を考慮して解釈すべきである。
本明細書全体を通して、文脈がそうでないこと必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数又は整数の群を包含することを意味するが、任意の他の整数又は整数の群を除外するものではないことが理解される。また、本開示、特に特許請求の範囲及び／又は各段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法において規定される意味を有することがあり、例えば、これらの用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することがあり、「本質的にからなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法において規定される意味を有し、例えば、これらは明示的に記載されていない要素を含むことを認めるが、先行技術に見られ且つ本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素は除外することに留意されたい。
本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明内に見出すことができ、全体に亘って適用され得る。特段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての他の科学的及び技術的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語「活性剤」は、１種の活性剤を意味することができる、又は２種以上の活性剤を包含することができる。
以下の実施例は、前述した発明を使用する方法をより十分に説明するため、並びに本発明の様々な態様を実施するために企図される最良の形態を説明するためのものである。これらの方法は、本発明の真の範囲を限定しているのではなく、例示目的で提示されることが理解される。
本発明の更なる特徴は、以下の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。この説明は、単に、本発明を例示する目的で記載されるに過ぎない。これは、前記した発明の広い説明に対する限定として理解されるべきではない。
実施例１
ＵＰＣＡＮ研究−低リスクで無症候の妊娠女性における、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、及びＣａｎｄｉｄａ ｓｐ．の膣内コロニー形成及び自然早産との関連性の前向き研究
被験体
研究は、西オーストラリア州パースのキングエドワード記念病院（ＫＥＭＨ）から募集された２０６名の低リスク妊娠女性であった。１５例が研究から除外され、フォローアップできなくなり、１９１名を分析に残した。この研究は、西オーストラリア州保健・女性・新生児保健局のヒト研究倫理委員会（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｗｏｍｅｎ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）によって承認された（２０５６／ＥＷ）。
包含及び除外基準
単胎妊娠女性は、１８歳から４０歳で、英語を話すこと及び読むことができ、妊娠第一期又は第二期である場合に包含資格があるとした。
ＰＴＢのリスクが高い（過去に１回以上のＰＴＢ）及び／又は子癇前症などの他の妊娠合併症とみなされた女性は、研究から除外した。その他の除外基準として、抗真菌剤、テトラサイクリン及び／又はマクロライド抗生物質を現在使用中であること、尿路感染症と現在診断されていること、及び再発性膣カンジダ症の病歴があることを含めた。
アンケート
研究への募集時及びその後の各サンプリングポイントで、女性に、プライベートな設定で匿名化された医療／生活様式のアンケートに記入するよう要請した。アンケートでは、まず、現在使用中の薬剤（抗生物質／天然／プロバイオティック）と、尿路感染症／膣カンジダ症と過去に診断されたことがあるかどうかについて質問した。現在及び過去の喫煙及び／又はアルコール摂取に関する情報について、「はい」又は「いいえ」として求め、その後、必要に応じて、１日間当たりのタバコの喫煙本数／消費した標準的飲料を定量化する質問を行った。妊娠期間中の１週間当たり性交の平均回数を記録した。
妊娠アウトカムデータ
病院の電子医療記録の妊娠アウトカムデータに、経験豊富な研究助産師がアクセスし、妊娠の完了後にコード化した。
サンプル採取
書面によるインフォームドコンセントが、本研究への登録前に担当助産師によって得られた。これは、研究によって作成されたデータの公開への同意を含んだ。参加者には、募集時（メジアン２１週間、範囲１３〜２６週間の妊娠期間［ＧＡ］）、〜２８週間のＧＡ（メジアン２９、範囲２４〜３８週間）、及び〜３６週間のＧＡ（メジアン３６、範囲３２〜４０週間）に２本の自己採取膣スワブ（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｕｒｒｉｅｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）が与えられた。１本目のスワブを、ＵｒｅａｐｌａｓｍａとＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の検出に使用し、２本目を、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．の検出に使用した。スワブ採取プロセスを標準化するために、詳細な口頭、書面、及び画像による指示が全ての女性に与えられた。簡単に説明すれば、参加者は、手袋を着用した状態で、スワブを膣内に５ｃｍ挿入し、これを２０秒間静かに回転させて、膣壁がスワブに確実に接触するようにした。続いて、スワブを直ちに１ｍＬのＵＴＭ培地（ＵｒｅａｐｌａｓｍａとＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）又は２ｍＬのＣＡＴ培地（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のいずれかを含む回収チューブに入れ、棒の中央の区切り点でスナップし、キャップをして４℃で保存した。サンプルはいずれも、採取後２４時間以内に培養のために氷上で実験室に移した。
Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の検出
培養
ＵＴＭチューブを１０秒間ボルテックスし、スワブから全ての細胞を遊離させた。その後、スワブをチューブ壁に押し付けて、全ての遊離液を放出させた後、廃棄した。２００μＬのサンプルを１．８ｍＬの１０Ｂブロス（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉａ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２、２％Ｏ２で４８時間インキュベートした。サンプルの残りを、２ｍＬのマイクロ遠心チューブに移し、ＤＮＡ抽出時まで−８０℃で凍結した。
ｐＨに関連する色の変化（黄色＞ピンク）で示されるポジティブ培養液を、直ちに２ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、−８０℃で凍結した。
ＤＮＡ抽出
製造業者の指示にしたがって、自動化されたＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｄｕｏ抽出プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ． ＭＡ、ＵＳＡ）でＳｉｅｍｅｎｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ １．０（Ｓｉｅｍｅｎｓ、ミュンヘン、ドイツ）を使用して、２５０μＬのＵＴＭスワブ溶出液からＤＮＡを抽出した。全ての抽出物を、最終容量１００μＬの溶出バッファー（Ｓｉｅｍｅｎｓ）で溶出した。Ｕ． ｐａｒｖｕｍ及びＵ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍのそれぞれの約２５０種の色変更ユニット（ＣＣＵ）からなるポジティブ抽出対照を全てのランに含めた。
リアルタイムＰＣＲ
培養に加えて、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲを使用して膣スワブから検出した。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）での使用に適合させたＹｉら（１）によって記載されているように、Ｕ． ｐａｒｖｕｍ及びＵ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍのウレアーゼ遺伝子を標的とするアッセイを使用して、膣スワブＤＮＡをスクリーニングした。反応混合物（最終濃度）は、１Ｘ Ｔａｑｍａｎ ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．９μＭの各プライマーＵＵ１６１３Ｆ及びＵＵ１５２４Ｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２５μＭのプローブＵＵ−ｐａｒｖｏ（ＦＡＭ）及びＵＵ−Ｔ９６０（ＶＩＣ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μＬのテンプレートＤＮＡ、及び最終体積を２０μＬにするためのヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。ＰＣＲサイクル条件は、９５℃で２０秒間の初期変性／Ｔａｑ活性化、その後の９５℃１秒間及び６０℃２０秒間の４０定量サイクルからなった（データ取得）。ポジティブ標準を各ランに含めた。
高分解能メルトＰＣＲ
Ｕ． ｐａｒｖｕｍＤＮＡがポジティブであったサンプルは、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、複数バンドの抗原遺伝子を標的とする、本発明者らがこれまでに記載した（２）高分解能メルト（ＨＲＭ）ＰＣＲアッセイを使用して、血清型（ＳＶ）１、ＳＶ３、ＳＶ６、又はＳＶ１４のいずれかとして遺伝子タイピング及び分類された。反応混合物（最終濃度）は、１Ｘ Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ３６０バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．３μＭの各プライマーＵＰＨＲＭ−Ｆ及びＵＰＨＲＭ−Ｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１Ｘ ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ ＨＲＭ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ３６０ ＤＮＡポリメラーゼ（０．１Ｕ／μＬ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μＬのテンプレートＤＮＡ、及び最終体積を２０μＬにするためのヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。ＰＣＲサイクル条件は、９５℃で１０分間の初期変性／Ｔａｑ活性化、その後の９５℃１５秒間及び６０℃１分間の４０サイクルからなった（データ取得）。Ｕ． ｐａｒｖｕｍ血清型の状態に関するデータを提供するために、アンプリコンを、その後、温度が１０秒間で９５℃上昇し、次に１分間で６０℃に低下するＨＲＭ工程に付した。次に、温度を０．０２５℃／ｓの速度で９５℃に上げ（連続的なデータ取得）、９５℃で１５秒間保持し、次に、６０℃に１５秒間で低下させた。ＨＲＭプロファイルは、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステムソフトウェアｖ１．２．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。全てのサンプルを２連で分析し、Ｕ． ｐａｒｖｕｍ ＳＶ１、ＳＶ３、ＳＶ６、及びＳＶ１４のポジティブ標準を各ランに含めた。
シークエンシング
ＨＲＭ分析に続いて、非標準の融解曲線パターンを生成したサンプルを、ＤＮＡシークエンシングに付した。ＰＣＲアンプリコンは、Ｖｅｒｉｔｉ ＰＣＲサーモサイクラー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で同一のＨＲＭプライマーセットを使用して生成した。反応混合物（最終濃度）は、１Ｘ Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ３６０バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５μＭの各プライマーＵＰＨＲＭ−Ｆ及びＵＰＨＲＭ−Ｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ３６０ ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５Ｕ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μＬのテンプレートＤＮＡ、及び最終体積を５０μＬにするためのヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。ＰＣＲサイクリング条件は、９５℃で１０分間の初期変性／Ｔａｑ活性化、その後の９５℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、及び７２℃で４５秒間の４０サイクルからなった。７２℃で７分間の最終伸長工程も含めた。
ＰＣＲアンプリコンのサイズ（３０５ｂｐ）を、Ｇｅｌ Ｒｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）で染色した１．５％アガロースゲルで確認し、製造業者の指示にしたがってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。精製したＤＮＡ断片は、Ｂｉｇ Ｄｙｅバージョン３．１ケミストリー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してシークエンスし、ＳＰＲＩを使用して事後洗浄した。断片は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（パース、西オーストラリア）の９６キャピラリーアレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、３７３０ｘＩ ＤＮＡアナライザで分離した。
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の検出
ＤＮＡ抽出
ＤＮＡを、前述したように２５０μＬのＵＴＭスワブ溶出液から抽出した。
リアルタイムＰＣＲ
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉｓ
Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓのＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲを用いて膣スワブ中に検出した。ＤＮＡサンプルを、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での使用に適合させたＦｅｒａｎｄｏｎら（３）によって記載されるＭ． ｈｏｍｉｎｉｓのｙｉｄＣ遺伝子を標的とするアッセイを用いてスクリーニングした。反応混合物（最終濃度）は、１Ｘ Ｔａｑｍａｎ ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．９μＭの各プライマーＭＨｙｉｄＣｆｗｄ及びＭＨｙｉｄＣｒｅｖ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２５μＭプローブのＭＨｙｉｄＣ（ＦＡＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μＬのテンプレートＤＮＡ、及び最終体積を２０μＬにするためのヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。ＰＣＲサイクル条件は、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．で記載の通りとした。ポジティブ標準を各ランに含めた。
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ
Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲを用いて膣スワブ中に検出した。ＤＮＡサンプルを、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での使用に適合させたＪｅｎｓｅｎら（４）によって記載されるＭ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＭｇＰａ遺伝子を標的とするアッセイを用いてスクリーニングした。反応混合物（最終濃度）は、１Ｘ Ｔａｑｍａｎ ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．９μＭの各プライマーＭｇＰａ−３５５Ｆ及びＭｇＰａ−４３２Ｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２５μＭプローブのＭｇＰａ−３８０ （ＶＩＣ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、７．９μＬのテンプレートＤＮＡ、及び最終体積を２０μＬにするためのヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。ＰＣＲサイクル条件は、９５℃で２０秒間の初期変性／Ｔａｑ活性化、その後の９５℃で１秒間及び６０℃で２０秒間の５０定量サイクルからなった（データ取得）。ポジティブ標準を各ランに含めた。
Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．の検出
培養
ＣＡＴチューブを１０秒間ボルテックスし、スワブから全ての細胞を遊離させた。その後、スワブをチューブ壁に押し付けて、全ての遊離液を放出させた後、廃棄した。１ｍＬのサンプルを２ｍＬのマイクロチューブに移し、ＤＮＡ抽出まで−８０℃で凍結した。残りのサンプル（約９００μＬ）を３７℃で２４時間インキュベートして、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．低細胞力価のため濃縮した。インキュベーション後、サンプルの２つの１０μＬのループをＣａｎｄｉｄａ Ｂｒｉｌｌｉａｎｃｅ寒天（Ｏｘｏｉｄ、Ｔｈｅｂａｒｔｏｎ、南オーストラリア、オーストラリア）にプレーティングし、３７℃で７２時間インキュベートした。
Ｃａｎｄｉｄａ Ｂｒｉｌｌｉａｎｃｅ寒天（Ｏｘｏｉｄ）のポジティブ培養物は、次のように分類した。緑色コロニー＝Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ；ピンク／黄色／ベージュ／茶色のコロニー＝非アルビカンスＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．。全てのポジティブ培養物を純度のために再プレーティングし、インキュベーション後、純粋培養物を２ｍＬのＳａｂａｒａｕｄ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅブロス（Ｏｘｏｉｄ）に再懸濁し、−８０℃で凍結した。
ＤＮＡ抽出
ＤＮＡは、前述した純粋なＣａｎｄｉｄａ ｓｐ．分離株ブロス再懸濁液２５０μＬから抽出した。
リアルタイムＰＣＲ
Ｃａｎｄｉｄａ Ｂｒｉｌｌｉａｎｃｅ寒天を用いて非アルビカンスＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．の同定を確認するために、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．及びＣ． ｇｌａｂｒａｔａのＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ （ＲＰＲ）遺伝子を標的とする多重リアルタイムＰＣＲアッセイを用いた。プライマー及びプローブ設計は、Ｉｎｎｉｎｇｓら（５）の設計と同様としたが、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での使用のために最適化した。反応混合物（最終濃度）は、１Ｘ Ｔａｑｍａｎ ＦＡＳＴ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．９μＭの各プライマーＣＡＮＤ−ＣＲ１Ｆ（５’ ＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＧＴ ３’）、ＣＡＮＤ−ＣＲ５Ｒ（５’ ＣＡＡＴＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＧＧＧＴ ３’）、ＧＬＡ−Ｆ（５’ ＴＧＧＣＴＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴ ３’）及びＧＬＡＲ（５’ ＡＣＣＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧ ３’）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２５μＭのプローブＡＬＬＣＡＮ（ＮＥＤ−ＴＴＣＧＣＡＴＡＴＴＧＣＡＣＴＭＡＡＹＡＧＣ−ＭＧＢ）及びＧＬＡ（ＶＩＣ−ＡＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＧＣＴＣＣＣＴＴＡＡＧＡ−ＴＡＭＲＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μＬのテンプレートＤＮＡ、及び最終体積を２０μＬにするためのヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からなった。ＰＣＲサイクル条件は、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．で記載の通りとした。
統計分析
データは、カテゴリカルデータの頻度分布、メジアン、四分位範囲、及び連続データの範囲を使用してまとめた。カテゴリカルな結果は、カイ二乗検定とフィッシャーの正確確率検定を使用して比較し、連続的なアウトカムは、マンホイットニー検定を使用して比較した。全ての分析は、妊娠期間全体を通して比較的安定なコロニー形成レベルを示すことから、募集時の微生物の検出で行った。ＳＰＳＳバージョン２０．０（Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ：ＩＢＭ Ｃｏｒｐ）統計ソフトウェアをデータ分析に使用した。Ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であるとみなした。
結果
合計２０６名の女性が研究に参加した。これらから、１５名を除外した又はフォローアップできなくなった。最終研究コホートを形成した１９１名の女性の人口統計／出生及び生活様式の特徴を、以下に示す（表１）。全体的なＰＴＢ率（＜３７週間のＧＡ）は９％であった。これには、１３例の自然出産と、母体又は胎児の状態のために陣痛誘導又は帝王切開を必要とした４例の出産が含まれた。これらの４例の出産は、早産と満期産との間の微生物の比較では除外した。６例の出産（５例の自然出産）（３％）が＜３４週間のＧＡであり、２例の出産（１％）が出生時体重＜１５００ｇであった。
Figure 2021514611
 妊娠中の膣内Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、及びＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．の検出
Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．、及びＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．の膣内検出率は、属及び種の両方のレベルで大きく変化した（表２）。Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．３種の被検出生物の中で最も多く、３つのサンプリングポイントに亘り、女性の４４〜４８％に存在していた。この属の中で、Ｕ． ｐａｒｖｕｍが、最も多い被検出種であり、Ｕ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍよりも３〜４倍多く存在していた（表２）。
Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．は、２番目に多い被検出種であり、女性の３４〜３８％に存在していた。この属の中で、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓが、遥かに多い被検出種であり、Ｃ． ｇｌａｂｒａｔａ 及び非アルビカンス／非グラビラータＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．より、それぞれ６〜２５及び１０〜２４倍多く存在していた（表２）。
Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓとＭ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出率は、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の検出率よりも遥かに低く、及びＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓの検出率は、３つのサンプリングポイントに亘って８〜１１％であり、一方、Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍでは、検出率は、２〜３％であった（表２）。
Figure 2021514611
 Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の検出のための培養及びリアルタイムＰＣＲの比較
３７℃（５％ＣＯ２、９５％Ｎ２）での１０Ｂブロス培養によるＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の検出率は、リアルタイムＰＣＲによる検出率とほぼ同一であった。２つの技法の一致率は、３つの時点でそれぞれ９９、１００、及び１００％であった。
Ｕ． ｐａｒｖｕｍの高分解能メルトＰＣＲ遺伝子タイピング
ＨＲＭ ＰＣＲは、コロニーを形成した臨床サンプルの９１％で単一のＵ． ｐａｒｖｕｍ遺伝子型を分割することができた。Ｕ． ｐａｒｖｕｍ遺伝子型ＳＶ６が最も多く検出され、ほぼ同程度でＳＶ３、ＳＶ１、ＳＶ６．１がそれぞれ続いた。遺伝子型ＳＶ１４の例はなかった（表２）。更に３％の例が、「混合」遺伝子型レベルに分割され、同一サンプル中に２種以上のＵ． ｐａｒｖｕｍ遺伝子型が存在することが示唆された。また、増幅が弱すぎて遺伝子型識別に十分なメルト曲線を生成できない（１％）、又は全く増幅が見られない（３％）例も少数あった。更に、１名の研究参加者について、３つ全てのサンプルが僅かに異なるＨＲＭ曲線を生成した。これは、ＤＮＡシークエンス時に、マルチバンドの抗原遺伝子の標的領域内に４つの固有のヌクレオチド多型を示し、４つの特徴付けられたＵ． ｐａｒｖｕｍの遺伝子型のいずれも示していない。配列は、遺伝子型ＳＶ６に最もよく一致し、その結果、遺伝子型ＳＶ６．１とみなした。
膣内コロニー形成ダイナミクス
１９１名の研究参加者のうち、１３４名が３つの時点全てでサンプルを提供した。これらの女性では、全ての生物の検出率は、研究期間中の最小の変動を示した（図１）。Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（３つのポイント全てで１．５％）は、全ての被検出生物の中で最も低い分散を示し、続いて、Ｕ． ｐａｒｖｕｍ（３６．６〜３７．３％）、Ｕ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ（９．７〜１１．２％）、非アルビカンス／非グラブラータＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．（０．７〜２．２％）、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ（３２．１〜３４．３％）、Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓ（９〜１１．２％）、最後にＣ． ｇｌａｂｒａｔａ（１．５〜５．２％）となった。これらの結果は、Ｕ． ｐａｒｖｕｍ／Ｕ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍが、募集時サンプリングで検出され、その後のサンプルでは、再度、Ｕ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍが検出されなかった１例を含む。
同様に、３つの時点のいずれにおいても、Ｕ． ｐａｒｖｕｍの遺伝子型検出には殆ど分散がなかった。ほぼ全ての例において、募集時に検出された遺伝子型は、２番目と３番目の時点を通して維持された。唯一の例外は、募集時にＵ． ｐａｒｖｕｍ遺伝子型ＳＶ６がコロニーを形成した参加者が、後の時点では混合遺伝子型プロファイルを示した場合と、３つの時点全てで混合遺伝子型プロファイルが検出された別の場合であった。これにより、ＨＲＭアッセイの制限により、各例に存在する同一の遺伝子型の組合せを確認することが不可能になった。正確な遺伝子型識別を可能にするために、ＨＲＭアッセイが２番目のサンプルの十分な増幅を生成しなかった例も更に２例あった。しかし、これらの例のいずれにおいても、１番目と３番目のサンプルの遺伝子型同定は一致した。
医薬及び生活様式の要因と募集時の生物の検出との関連性
募集時に１８９名の研究参加者によって提供された回答（表３）に基づくと、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．が、喫煙歴のある女性（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．−３７％存在に対して１７％不存在、ｐ＝０．００２；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．−４４％存在に対して２４％不存在、ｐ＝０．０３６）、及び妊娠中に性交を１週間に≧３回行った女性（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．−３５％存在に対して１８％不存在、ｐ＝０．０１８；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．−５６％存在に対して２１％不存在、ｐ＝０．００１）で、より高頻度に検出された。
Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．は、妊娠中に喫煙を続けた女性でより高頻度に検出された（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．−１８％存在に対して７％不存在、ｐ＝０．０２０）。
Figure 2021514611
 膣内微生物コロニー形成と自然早産との間の関連性
自然早産＜３７週間のＧＡ
試験中に採取した膣サンプルの全体的な微生物特性を表４に示す。Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．は、満期産の女性と比較して早産の女性の募集時サンプルで、より高頻度に検出された［８５％（９５％ＣＩ：６２〜１００％）対４５％（３７〜５２％）、ｐ＝０．００６］（表４）。種レベルでは、ＰＴＢ症例の間でＵ． ｐａｒｖｕｍの存在が有意に増加した［７７％（５０〜１００％）対３６％（２９〜４３％）、ｐ＝０．００４］。Ｕ． ｐａｒｖｕｍの力価とＰＴＢとの間には小さいが有意な関連性があり、ＰＴＢの例の平均のＵ． ｐａｒｖｕｍ力価が１０６ＣＣＵであるのに対して満期産の例では１０５ＣＣＵであった。Ｕ． ｐａｒｖｕｍの遺伝子型ＳＶ３とＳＶ６は、満期妊娠において等しく現れた。しかし、早産をした女性では、遺伝子型ＳＶ６が有意に多く、満期産の１５％（１０〜２０％）と比較して、早産の５４％（２２〜８５％）に認めらた（ｐ＝０．００２）。単独で検出された場合、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．の存在は、属又は種のいずれのレベルでもＰＴＢと関連していなかった。しかし、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓがＵ． ｐａｒｖｕｍと共にに検出された場合、ＰＴＢとの有意な正の関連性が観測された［４６％（１５〜７８％）対１３％（８〜１８％）、ｐ＝０．００５］。この関連性は、Ｕ． ｐａｒｖｕｍ遺伝子型ＳＶ６が存在したときに強くなった［３９％（８〜６９％）対７％（３〜１１％）、ｐ＝０．００３］。
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．存在と、ＰＴＢとの間に明らかな関連性はなかった。しかし、Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは、早産の女性の募集時サンプルにおいて満期産の女性よりも多く見られ（それぞれ１５対２％）、この結果は、有意性（ｐ＝０．０５７）の傾向を示した。同様に、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．は、また、早産の女性の募集時サンプルにおいて満期産の女性よりも多く見られた（それぞれ５４対３６％）。しかし、この差は、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．２４１）。
ＰＴＢと、Ｕ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ． ｇｌａｂｒａｔａ、非アルビカンス／グラブラータＣａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、又はＭ． ｈｏｍｉｎｉｓのいずれかとの間に関連性は検出されなかった。
Figure 2021514611
 ＜３４週間のＧＡの自然早産、＜１５００ｇの出生体重
体重＜１５００ｇの２名を含む５名の新生児が、＜３４週間のＧＡで出生した（表５）。Ｕ． ｐａｒｖｕｍは、全ての例で募集時に検出され、これらの８０％（４／５）で遺伝子型ＳＶ６が存在した。４例の最も早い早産（２５．９〜３１．４週間のＧＡ）では、募集時にＵ． ｐａｒｖｕｍとＣ． ａｌｂｉｃａｎｓの両方が検出された（表５）。残念なことに、数が不十分なため、＜３４週間のＧＡのＰＴＢのリスクについて統計分析を行うことができなかった。
Figure 2021514611
 実施例２
Ｐｒｅｄｉｃｔ１０００研究−早産予防のための微生物バイオマーカー
２種類の研究を行う：出産前ケアを提示する女性の大規模コホート研究と、新規微生物バイオマーカーの小規模サブ研究である。
コホート研究
本研究は、妊娠中の膣内のＵ． ｐａｒｖｕｍ、Ｕ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、及びＭ． ｈｏｍｉｎｉｓの保有率に関するデータを拡張し、このコホート内のＢＶに関連する主要な生物の保有率を定義することにより、これを更に拡張する。
更に、本研究は、妊娠中の膣液のｐＨとシアリダーゼレベルを記録し、これらの因子全てと、プライマリー及びセカンダリーアウトカムとの間の関連性を検出するために好適に適用される。１２ヶ月間に亘って、２０週間の妊娠前にＫＥＭＨの出産前クリニックに通院する未産女性と経産女性の両方に参加の打診をする。過去にＰＴＢ歴を有する女性を優先的に選ぶことにより、募集を充実させる。抗生物質又は抗真菌薬を服用している、多胎妊娠している、子宮頸部縫合をしている、又は膣内プロゲステロンを使用している場合、そのような女性は、不適格とする。
プライマリー及びセカンダリーエンドポイント
プライマリーエンドポイントは、３７週間の妊娠期間前のＰＴＢである。
セカンダリーエンドポイントとしては、３４週間の妊娠期間前のＰＴＢ、任意の在胎齢での切迫早産、ＰＰＲＯＭ、低出生体重、非常に低い出生体重、新生児敗血症又は他の病的状態、臨床及び／又は組織学的絨毛羊膜炎が挙げられる。
参加は、以下を伴う。
ｉ）生活様式、食事、性的活動、感染症（現在／過去）、及び過去１２ヶ月間以内の抗生物質／プロバイオティクスの使用について質問するアンケートの記入
ｉｉ）微生物のＤＮＡ分析（ｑＰＣＲ）及びシアリダーゼ測定（蛍光基質切断アッセイ）のための研究助産師が収集した膣後円蓋からの膣鏡補助スワブ。
ｉｉｉ）微生物培養用の２本目のスワブ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．及びＭ． ｈｏｍｉｎｉｓ）。
ｉｖ）膣液のｐＨの評価。
ｖ）病院の方針にしたがう、＜３４週間の妊娠期間の全ての出産からの胎盤の回収。
新しい微生物バイオマーカーのサブ研究
このサブ研究には、自然ＰＴＬ又はＰＰＲＯＭに続いて３４週間の妊娠期間前に出産したコホート研究の全ての女性の膣スワブのメタゲノム分析が含まれ、合併症なく帝王切開で満期産の同様の数の女性に一致した。本発明者らは、５０種の対照に一致する５０例を推定する。このサブ研究は、妊娠中の膣内微生物群組成に関する属及び種の各レベルのデータを提供する。また、早産と満期産の膣内微生物群を比較し、ＰＴＢのリスクに関連する微生物の属及び種を特定し、リスクスコアリングシステムの診断感度を大幅に高める。
３４週間の妊娠期間以下の全ての出産からの胎盤は、通常の臨床的プラクティスにしたがって、組織学的検査及び微生物培養のために回収する。更に、羊膜下スワブを胎盤プレートの４ヶ所から採取し、（母体の膣汚染がない）羊膜内感染症に関連する微生物叢をサンプリングする。微生物群の比較を通して羊膜内感染の原因として膣を確認するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子メタゲノムアプローチを使用して、膣と胎盤の各スワブを遡って分析する。
サンプル採取及び処置の必要性
ＫＥＭＨに参加する妊娠女性はいずれも、尿検査によりＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓとＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについて通常の方法で検査し、それに応じて処置される。更に、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．症などの膣感染症を示唆する症状を、適切なサンプルの採取と処置の処方によって管理する。研究中に回収した膣スワブは、本発明者らの現在のＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．及びＭ． ｈｏｍｉｎｉｓ培養プロトコルを用いて培養される。
本研究の培養成分は、将来の株特異的分析のための分離株のカタログを収集するために主に使用される。培養に加えて、ＢＶに関連する生物、Ｇ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ａ． ｖａｇｉｎａｅ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐｐ．、及び細菌性膣炎関連細菌−２（ＢＶＡＢ−２）の他に、これらの生物はいずれも、リアルタイムＰＣＲ分析によって検出及び半定量化される。Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．は、以前にＣＩＣ Ｐａｙｎｅ（Ｐ０１１６７９３４５）によって説明されたように、リアルタイムＰＣＲ分析を使用しても検出される。
膣液のｐＨ及びシアリダーゼのレベルも、それぞれｐＨグローブ及び蛍光基質アッセイによって測定される。
サンプル採取及び分析
膣スワブ
研究中、２つのスワブ採取キットが使用される。これらのうち１本は、臨床的に検証されたウレアプラズマ／マイコプラズマに特異的なＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＵＴＭ）キット（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）である。ＵＴＭキットは、フロックスワブとＵｒｅａｐｌａｓｍａ／Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．の成長を支持するように設計されたＵＴＭのバイアルを含む。これに加えて、高度なフロックスワブ（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が分子分析用の全てのサンプルの収集に使用される。
培養分析
収集後、スワブを助産師が直ちにＵＴＭに入れ、キャップをして、４℃で最長２４時間保管した後、処理する。２００μＬのサンプルを、尿素（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）を含む１．８ｍＬの１０Ｂ培地とアルギニン（Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓ）を含む１０Ｂ培地に添加し、３７℃／４８〜１２０ｈインキュベートする。ポジティブ培養物は、ブロス微量希釈法を使用して精製し、培養物１ｍＬを、将来の遺伝子型分析のために−８０℃で凍結される。
ＰＣＲ分析
フロック膣スワブを、回収チューブに戻し、４℃で＜２４時間保管した後、処理する。スワブを、２ｍＬのＰＢＳによく再懸濁し、膣内シアリダーゼのレベルを測定するために１００μＬのアリコートを取り出し、残りの溶出液を２０，０００ Ｘ ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去する。ペレットを、２５０μＬのＰＢＳに再懸濁し、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ抽出プラットフォームでＳｔｒａｔｅｃ ＩｎｖｉＭａｇ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、全量からＤＮＡを抽出する。
半定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、Ｕ． ｐａｒｖｕｍ及びＵ． ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ（１）、Ｍ． ｈｏｍｉｎｉｓ（２）、シアリダーゼポジティブ及びネガティブＧ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ（３）、Ａ． ｖａｇｉｎａｅ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｓｐｐ．及びＢＶＡＢ−２（４）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステムで検出する。Ｕ． ｐａｒｖｕｍのポジティブスワブを全て、高分解能メルトＰＣＲ遺伝子タイピングアッセイ（５）を使用して更に分析し、個々の血清型と混合型の血清型のコロニー形成の例を記録する。
Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ
膣及び胎盤スワブからのＤＮＡ抽出は、前述したように行われる。全ての抽出物について、ＰＣＲによる細菌ＤＮＡの存在を確認した後、８Ｆ／１４９２Ｒプライマーセット（６）（１．５ｋＢフルサイズ）とＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ精製キットで精製したポジティブアンプリコンを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子全体を増幅する。個々のサンプル由来の精製済みＰＣＲアンプリコンには、シークエンスアダプターとバーコードが取り付けられ、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ次世代シークエンスプラットフォームでシークエンスする。シークエンスデータは、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ（ＱＩＩＭＥ）ソフトウェアパッケージ（７）を使用して処理される。系統発生学的情報については、属と種の識別にそれぞれ９７％と９９％の配列相同性が使用される。
胎盤の組織病理学及び微生物学的分析
≦３４週間の妊娠期間の全ＰＴＢ症例由来の胎盤は、組織病理学検査及び微生物学のために、通常の臨床管理の一部として組織病理学部に移される。＜３４週間の妊娠期間での出生例は〜５０例に上ると予想される。帝王切開で出産された同数の通常の満期産胎盤を対照として用いる。
組織病理学的検査は、臨床アウトカムを知らされていない経験豊富な周産期病理学者によって行われる。胎盤外膜、臍帯、絨毛膜板、及び胎盤の半定量的組織学的スコアリングを、本発明者らの標準スコアリングシステムを使用して行う。
回収した全ての胎盤を、前述のように培養する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに加えて、羊膜下スワブを、好気性生物用に培養する。
このサンプルの一部は、対応する膣サンプルとの比較のためのメタゲノム分析のため、微生物ＤＮＡの抽出のために研究所に移す。
生活様式及び臨床データ収集
母親へのアンケートは、膣分泌物又は炎症、排尿障害、最近／過去の尿路感染症又は膣感染症の症状、喫煙習慣、性交の頻度／性質、抗生物質／プロバイオティクスの使用について尋ねる。研究における全て女性の産科及び新生児アウトカムデータは、病院のデータベースから取得される。
検定力
ＫＥＭＨでの全体的なＰＴＢ率は２５％で、州全体の保有率は８．８％である。本発明者らは、高リスクの例が多い本発明者らのクリニックでの募集により、ＰＴＢ率が少なくとも１５％になると予想する。ＰＴＢのリスクをモデル化するロジスティック回帰分析で使用される１０００名の女性のサンプルサイズは、ＰＴＢ率が少なくとも１２．０％（即ち、１２．０〜２５．４％又は１５．０〜３０．６％）であると同時に、他の関連する微生物学的所見及び部分的ｒ２＝０．１の臨床リスクファクターを調整する場合、ＰＴＢリスクの２倍の増加を超える微生物コロニー形成の影響を検出する少なくとも９０％の検定力を達成する（オッズ比≧２．５０に相当）。
統計分析
性器マイコプラズマ、明確なＵ． ｐａｒｖｕｍ血清型、及びＢＶ関連微生物叢のコロニー形成の発生率は、二項分布を使用して推定される。一次統計分析は、細菌感染症関連のＰＴＢの予測スコアを生成し、妊娠初期の微生物プロファイルのみと他の関連する母体及び産科の特徴に合わせて調整された微生物プロファイルを使用して、リスクの高い女性を特定する。単変量及び多変量ロジスティック回帰分析を使用して、全てのプライマリー及びセカンダリークリニカルエンドポイントの微生物及び調整済み微生物リスクスコアを作成する。ＰＴＢのこれらの微生物予測リスクスコアを導出するロジスティック回帰分析は、ロジスティック回帰分析を行う前に、微生物プロファイル内及び他の産科リスクファクターとの非線形関係を調査するように設計された、バイナリ、回帰、生存ツリーなどの再帰分割モデルで補完される。微生物プロファイルが、出産時の在胎齢及びセカンダリークリニカルエンドポイントが生じる在胎齢に及ぼす影響の大きさの二次評価は、比例Ｃｏｘ回帰を使用して行う。早産と満期産の膣内／胎盤微生物プロファイルの比較は、主成分分析を使用して行う。
一部のデータは、Ｐｒｅｄｉｃｔ１０００研究から照合されている。表６は、ｓＰＴＢ、ｎｓＰＴＢ、及び満期産に関して、本研究でスクリーニングされた全ての細菌の有無を示す。
Figure 2021514611
 実施例３
「スクリーニング及び処置」プログラムの臨床試験
試験設計
早産予防のための新規な母体微生物学的「スクリーニング＆処置」プログラムの前向き非盲検無作為化臨床試験。
単胎妊娠で且つＰＴＢのリスク増加に関連する膣内微生物プロファイルを有する未選択女性の妊娠中であることの特定の後、標的化抗菌処置を行うことにより、自然早産の割合が少なくとも３０％減少する。
包含及び除外基準
単胎妊娠、≧１６歳、ＧＡが超音波で確認された女性を対象とする。
多胎妊娠、症候性膣感染症、膣出血、膜の破裂、活発な収縮、募集の≦１４日間に抗菌療法を受けている女性は、対象外とする。
プライマリー＆セカンダリーエンドポイント
プライマリーエンドポイントは、介入群対対照群においてｓＰＴＢが≦３７週間で≧３０％減少することである。
セカンダリーエンドポイントとしては、ｓＰＴＢ≦３４及び２８週間、流産、出生体重≦２５００ｇ及び≦１５００ｇ、医原性ＰＴＢ、ＧＬＵ＋ｖｅ女性のｓＰＴＢを含むＣｏｒｅ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｓ；ＰＰＲＯＭ、子癇前症、処置応答、妊産婦死亡率及び敗血症、新生児死亡率、複合新生児罹患率、ＮＩＣＵ入院／期間、新生児敗血症（後期又は早期）、ＩＵＧＲ、及び組織学的絨毛羊膜炎が挙げられる。
募集
ワシントン州の３つの産科病院（ＫＥＭＨ、オズボーンパーク病院、ＳＪＯＧ−ミッドランド病院）の１８〜２０週間の妊娠期間で出産前クリニックに通院する女性に打診する。インフォームドコンセントが得られ、研究ＩＤ番号が割り当てられた後、ベースライン人口統計データを収集する。女性は事前にラベルされた膣内ＣＯＰＡＮ Ｅ−スワブ（室温で２４時間微生物の完全性を維持する安定化液を含む）を自己収集し、毎日収集するために収集ボックスに入れて、中央研究所に移し、−８０℃で保存後、抽出及び分析を行う。
無作為化＆盲検化
介入群又は対照群のいずれかへのランダム化は、未産、ＰＴＢ歴、及び研究サイト（１：１の割り当て比）によって層別化しながら、処置群をランダムに割り当てるカスタマイズされたランダム化プログラムによって実行する。群の割り当ては、Ｗｏｍｅｎ＆Ｉｎｆａｎｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （ＷＩＲＦ） Ｔｒｉａｌ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆｆｉｃｅで行う。ＧＬＵ試験手順に対して盲検とされた参加者を無作為化することにより、割り当てバイアスを回避する。全てのスワブは、同一プロトコルにしたがって処理及びスクリーニングする。サンプル処理と結果通知は、サンプル収集から４営業日以内に行う。
対照群の参加者の場合、スクリーニング検査の結果は試験終了後まで参加者に明らかにされず、通常の産科ケア（膣感染症の症状が現れた場合の処置を含む）を受け続ける。研究の募集と出産段階が完了するまで、参加者は、割り当てについて通知されない。プラセボは、次の理由から使用しない。ａ）プラセボそれ自体が膣内微生物叢及びディスバイオシス（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）に影響を及ぼし得る、ｂ）コロニー形成状態の知識が、参加者の行動を変える可能性がある、及びｃ）この試験の主要な比較対象である通常の産科ケアから逸脱する。
介入群の女性には、募集後約１週間で群の割り当てとスクリーニング状態（ポジティブ又はネガティブ）を通知する。ポジティブとスクリーニングされた者は、その検査結果が、募集した助産師に送付される。その後、この情報と推奨される処置計画に接する（下記参照）。参加者には、スクリーニングテストの結果に応じて調整された医薬品を含むパックが郵送される。介入群の女性は、処置を提供できるように自身の状態について通知される必要があるので、割り当てに盲検とされない。
出産アウトカムデータは、病院及び民間の医療記録から得る。
スクリーニング試験
スワブは、多重ＧＬＵ ＰＣＲアッセイで分析する。ＤＮＡの抽出と分析は、自動化テクノロジーを使用する分子微生物学ラボラトリで行い、最適な効率、正確度、及びターンアラウンドタイムを達成する。ＤＮＡはまた、リスク予測と処置に対する応答の改善を探索するためのフォローアップ研究における詳細なマイクロバイオーム分析のために保存される。
介入
ＧＬＵ＋ｖｅとスクリーニングされた女性は、経口アジスロマイシン（７日間２５０ｍｇ）と膣クリンダマイシンクリーム（２％）を７日間投与される。これらは標準的な抗生物質レジメンであり、妊娠期間に広く使用されている。抗菌処置の直後に、女性は、Ｃａｎｅｓｆｌｏｒ（Ｂａｙｅｒ）による膣プロバイオティック治療を開始する。処置は、連続６日間、毎晩１つの膣内カプセルと、その後の１週間１カプセルを４週間とからなる。
参加者は、処方箋を入手、理解度とコンプライアンスの確認を確実にするために、医薬品が郵送されてから数日後に、研究調査助産師から電話／テキストで連絡がされる。介入群の女性は、（５週間のプロバイオティクスコースの完了後の）２６〜２８週間時点で、スワブを再度採取し、事前に宛てられた特急封筒を使用して、採取日に、再試験のために研究室に郵送するよう求められる。結果は、研究助産師を介して参加者に伝達される。この時点で、服薬コンプライアンスとフィードバックに関するアンケートも返送される。ＢＶとプロバイオティクス療法の抗菌処置の有効性に関する公開データに基づいて、本発明者らは、処置の成功は９０％を超えると予想する。
検定力
６．９％のＷＡ２０１５単胎妊娠ＰＴＢ率に基づいて、これらの７０％がｓＰＴＢ（９）（全出生の４．８３％）であると仮定すると、群ごとに３０８７名の女性（全体で６１７４名）を募集すると、□＝０．０５で比率の両側ｚ検定を使用した場合、介入群におけるｓＰＴＢ率の３０％の低下−４．８３％から３．３８％−を検出する８０％の検定力を達成する；１群当たり〜４９４名の女性がポジティブとスクリーニングされると予想される。このサンプルサイズは、また、試験境界を決定するために使用されるＯ’Ｂｒｉｅｎ−Ｆｌｅｍｉｎｇ消費関数による単一の中間分析も可能とする（ＰＡＳＳ Ｐｏｗｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓａｍｐｌｅ Ｓｉｚｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， ２０１５）。出産時のＧＡは全ての女性の医療記録から電子的に抽出されるので、フォローアップができないことを補う調整は行わない。
統計分析
統計分析は、治療意図原則（ｉｎｔｅｎｔｉｏｎ−ｔｏ−ｔｒｅａｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に基づいて行われ、２６〜２８週間のＧＡで収集されたスワブに基づいて、処置の副次的評価を受ける。群間のＰＴＢアウトカムは、比率のｚ検定を使用して分析される。補足ロジスティック回帰分析を行って、層別化因子と母体及び／又は妊娠特性による交絡を調整しながら、ｓＰＴＢ率とカテゴリカルな副次的アウトカムの群間の差を調べる。試験におけるスクリーニング基準として使用される微生物リスクファクターの影響を評価するために、バイナリ及びノミナルロジスティック回帰を行う（ＰＡＳＳ ２０１４）。これらの回帰では、ｓＰＴＢのリスクファクターを調整し、将来の実施のためのリスク方程式を導き出すために、更なる微生物学的及び免疫学的データを、単独且つ母体及び妊娠特性と共に検討する。仮説検定はいずれも、□＝０．０５の両側とする。
文献
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（１４）Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ ＣＰ， Ｌｅｍｂｋｅ ＢＤ， Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｋ， Ｂｏｄｙ ＢＡ， Ｎｙｅ ＭＢ， Ｒｉｖｅｒｓ ＣＡ， Ｓｃｈｗｅｂｋｅ ＪＲ． （２０１２） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ， ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｖａｇｉｎｏｓｉｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５０（７）：２３２１−９．
（１５）Ｐａｙｎｅ， ＭＳ， Ｔａｂｏｎｅ Ｔ， Ｋｅｍｐ ＭＷ， Ｋｅｅｌａｎ ＪＡ， Ｓｐｉｌｌｅｒ ＯＢ， Ｎｅｗｎｈａｍ ＪＰ． （２０１３） Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｌｔ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５２（２）：５９９−６０６．
（１６）Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ Ａ， Ｐｒｕｅｓｓｅ Ｅ， Ｓｃｈｗｅｅｒ Ｔ， Ｐｅｐｌｉｅｓ Ｊ， Ｑｕａｓｔ Ｃ， Ｈｏｒｎ Ｍ， Ｇｌｏｅｃｋｎｅｒ ＦＯ． （２０１１） Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４１（１）．
（１７）Ｃａｐｏｒａｓｏ ＪＧ， Ｋｕｃｚｙｎｓｋｉ Ｊ， Ｓｔｏｍｂａｕｇｈ Ｊ， Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ Ｋ， Ｂｕｓｈｍａｎ ＦＤ， Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ＥＫ， Ｆｉｅｒｅｒ Ｎ， Ｐｅｎａ ＡＧ， Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ＪＫ， Ｇｏｒｄｏｎ ＪＩ， Ｈｕｔｔｌｅｙ ＧＡ， Ｋｅｌｌｅｙ ＳＴ， Ｋｎｉｇｈｔｓ Ｄ， Ｋｏｅｎｉｇ ＪＥ， Ｌｅｙ ＲＥ， Ｌｏｚｕｐｏｎｅ ＣＡ， ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｄ， Ｍｕｅｇｇｅ ＢＤ， Ｐｉｒｒｕｎｇ Ｍ， Ｒｅｅｄｅｒ Ｊ， Ｓｅｖｉｎｓｋｙ ＪＲ， Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ ＰＪ， Ｗａｌｔｅｒｓ ＷＡ， Ｗｉｄｍａｎｎ Ｊ， Ｙａｔｓｕｎｅｎｋｏ Ｔ， Ｚａｎｅｖｅｌｄ Ｊ， Ｋｎｉｇｈｔ Ｒ． （２０１０） ＱＩＩＭＥ ａｌｌｏｗｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （５）：３３５−６．
（１８）Ｊｅｎｓｅｎ ＪＳ， Ｂｊｏｒｎｅｌｉｕｓ Ｅ， Ｄｏｈｎ Ｂ， Ｌｉｄｂｒｉｎｋ Ｐ． （２００４） Ｕｓｅ ｏｆ ＴａｑＭａｎ ５′ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｌｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｕｒｅｔｈｒｉｔｉｓ ｗｈｏ ｗｅｒｅ ａｔｔｅｎｄｅｅｓ ａｔ ａ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｌｉｎｉｃ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４２（２）：６８３−９２．
（１９）Ｉｎｎｉｎｇｓ Ａ， Ｕｌｌｂｅｒｇ Ｍ， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ａ， Ｒｕｂｉｎ ＣＪ， Ｎｏｒｅｕｓ Ｎ， Ｉｓａｋｓｓｏｎ Ｍ， Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｂ． （２００７） Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４５（３）：８７４−８０．

Claims (11)

  1. 妊娠女性が、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクがあるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
    ａ）以下の細菌：
    ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
    ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
    ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
    の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
    前記細菌の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示すことを特徴とする方法。
  2. 試験方法が、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍの存在についても試験し、以下のいずれか：
    −Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６の不存在下でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；又は
    −Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
    の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す請求項１に記載の方法。
  3. 試験方法が、ｑＰＣＲである請求項１に記載の方法。
  4. 前記試験が、１０〜２４週間の妊娠期間で行われる請求項１に記載の方法。
  5. 妊娠女性が、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）を予防する処置により利益を受けるかどうかを判定するための方法であって、前記方法は、
    ａ）以下の細菌：
    ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
    ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
    ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
    の存在について、膣液のサンプルを試験する工程を含み、
    前記細菌の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあり、ｓＰＴＢを予防する処置により利益を受けることを示すことを特徴とする方法。
  6. 感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクがある妊娠女性を処置する方法であって、
    ａ）以下の細菌：
    ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
    ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
    ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
    の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
    ｂ）前記細菌が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供する工程とを含むことを特徴とする方法。
  7. 感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）を有する妊娠女性のリスクを低減する方法であって、
    ａ）以下の細菌：
    ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
    ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
    ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
    の存在について、膣液のサンプルを試験する工程と、
    ｂ）前記細菌が存在する場合、前記妊娠女性に、前記細菌を排除する抗生物質療法を提供し、ｓＰＴＢのリスクを低減する工程とを含むことを特徴とする方法。
  8. 妊娠女性が、感染症に関連する自然早産（ｓＰＴＢ）のリスクがあるかどうかを判定するキットであって、前記キットは、
    ａ）以下の細菌：
    ｉ）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６；
    ｉｉ）Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ；及び
    ｉｉｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
    の存在について、膣液のサンプルを試験するための手段と、
    ｂ）使用のための指示とを含むことを特徴とするキット。
  9. 試験方法が、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍの存在についても試験し、以下のいずれか：
    −Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６の不存在下でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ；又は
    −Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ３及び／又はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ 遺伝子型ＳＶ６、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ
    の存在が、被験体にｓＰＴＢのリスクがあることを示す請求項５から７のいずれかに記載の方法又は請求項８に記載のキット。
  10. 試験方法が、ｑＰＣＲである請求項５から７のいずれかに記載の方法又は請求項８に記載のキット。
  11. 前記試験が、１０〜２４週間の妊娠期間で行われる請求項５から７のいずれかに記載の方法又は請求項８に記載のキット。

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