JP2021191244A - 多能性幹細胞及びその利用、神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法、並びに、神経変性疾患の治療薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】精度が高い、ＡＬＳ等の神経変性疾患の治療薬のスクリーニングの評価系を実現すること。【解決手段】本発明の多能性幹細胞はＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている。また、本発明の神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法は、上記多能性幹細胞を使用し、被験物質接触工程と、選択工程とを含む。【選択図】なし
Description
本発明は、多能性幹細胞及びその利用、神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法、並びに、神経変性疾患の治療薬に関する。
筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脳及び脊髄におけるモーターニューロンの進行性消失を特徴とする原因不明の神経変性疾患である。ヒト組織から細胞を調製して疾患モデルを構築すること難しかったため、ＡＬＳの治療薬の開発及びＡＬＳの病態発症のメカニズム解析はあまり進んでいなかった。
非特許文献１には、家族性ＡＬＳ患者の線維芽細胞からｉＰＳ細胞を生成し、モーターニューロンに分化させたことが記載されている。
非特許文献２には、ＡＬＳ患者由来のｉＰＳ細胞から分化させたモーターニューロンにおいて、核内のＴＤＰ−４３が細胞質に移行すること、および、細胞質においてＴＤＰ−４３の凝集体が形成されたことが記載されている。ＴＤＰ−４３は、ＡＬＳの病態と関連性があることが知られているＲＮＡ結合タンパク質である。そして、当該ｉＰＳ細胞を評価系として、ＴＤＰ−４３の局在変化を指標としてＡＬＳ治療薬のスクリーニングを行ったことが記載されている。
Brandi N. Davis-Dusenbery et. al.，Development (2014) 141, 491-501
Matthew F Burkhardt et. al., Mol Cell Nerurosci (2013) 56, 355-364
しかしながら、非特許文献２に記載のスクリーニング方法では精度が低く、評価系のさらなる改良が求められている。
本発明の一態様は、精度が高い、ＡＬＳ等の神経変性疾患の治療薬のスクリーニングの評価系を実現することを目的とする。
上記の課題を解決するために、本発明は、以下に示す態様を含む。
＜１＞ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞。
＜２＞神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞より分化誘導してなるモーターニューロンであって、その細胞質にＴＤＰ−４３が局在するように方向付けがなされたものに対して被験物質を接触させる被験物質接触工程と、前記被験物質接触工程後の、前記モーターニューロンの細胞質及び核におけるＴＤＰ−４３の局在量に基づいて、前記被験物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択する選択工程とを含む、スクリーニング方法。
＜３＞選択工程において、被験物質を接触させない場合と比較して、前記モーターニューロンの細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量が減り、前記モーターニューロンの核におけるＴＤＰ−４３の局在量が増加したものを、神経変性疾患の治療薬の候補として選択する、＜２＞のスクリーニング方法。
＜４＞前記被験物質接触工程前に、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導する発現誘導工程をさらに含む、＜２＞または＜３＞のスクリーニング方法。
＜５＞前記誘導発現されるＴＤＰ−４３は蛍光標識されている、＜２＞〜＜４＞のいずれか１つのスクリーニング方法。
＜６＞前記選択工程が、前記モーターニューロンの画像を撮影する撮影工程と、前記撮影工程によって得られた画像における、モーターニューロンの細胞質及び核を検出する検出工程と、前記検出工程によって検出された細胞質における蛍光領域の面積を、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量と計算し、前記検出工程によって検出された核における蛍光強度を、核におけるＴＤＰ−４３の局在量として計算する計算工程と、を含む、＜５＞のスクリーニング方法。
＜７＞前記被験物質接触工程と同時に、又は、前記被験物質接触工程よりも前に、前記モーターニューロンに、ＴＤＰ−４３の局在変化を誘導する局在変化誘導剤を接触させる局在変化誘導工程をさらに含む、＜２＞〜＜６＞のいずれか１つのスクリーニング方法。
＜８＞前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アルツハイマー病及びレビー小体病からなる群から選択される、＜２＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
＜９＞＜１＞の多能性幹細胞を含む、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングキット。
＜１０＞ＳＴＡＴ３阻害剤を有効成分として含有する、神経変性疾患の治療薬。
＜１１＞前記ＳＴＡＴ３阻害剤がニクロサミドである、＜１０＞の治療薬。
＜１＞ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞。
＜２＞神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞より分化誘導してなるモーターニューロンであって、その細胞質にＴＤＰ−４３が局在するように方向付けがなされたものに対して被験物質を接触させる被験物質接触工程と、前記被験物質接触工程後の、前記モーターニューロンの細胞質及び核におけるＴＤＰ−４３の局在量に基づいて、前記被験物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択する選択工程とを含む、スクリーニング方法。
＜３＞選択工程において、被験物質を接触させない場合と比較して、前記モーターニューロンの細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量が減り、前記モーターニューロンの核におけるＴＤＰ−４３の局在量が増加したものを、神経変性疾患の治療薬の候補として選択する、＜２＞のスクリーニング方法。
＜４＞前記被験物質接触工程前に、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導する発現誘導工程をさらに含む、＜２＞または＜３＞のスクリーニング方法。
＜５＞前記誘導発現されるＴＤＰ−４３は蛍光標識されている、＜２＞〜＜４＞のいずれか１つのスクリーニング方法。
＜６＞前記選択工程が、前記モーターニューロンの画像を撮影する撮影工程と、前記撮影工程によって得られた画像における、モーターニューロンの細胞質及び核を検出する検出工程と、前記検出工程によって検出された細胞質における蛍光領域の面積を、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量と計算し、前記検出工程によって検出された核における蛍光強度を、核におけるＴＤＰ−４３の局在量として計算する計算工程と、を含む、＜５＞のスクリーニング方法。
＜７＞前記被験物質接触工程と同時に、又は、前記被験物質接触工程よりも前に、前記モーターニューロンに、ＴＤＰ−４３の局在変化を誘導する局在変化誘導剤を接触させる局在変化誘導工程をさらに含む、＜２＞〜＜６＞のいずれか１つのスクリーニング方法。
＜８＞前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アルツハイマー病及びレビー小体病からなる群から選択される、＜２＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のスクリーニング方法。
＜９＞＜１＞の多能性幹細胞を含む、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングキット。
＜１０＞ＳＴＡＴ３阻害剤を有効成分として含有する、神経変性疾患の治療薬。
＜１１＞前記ＳＴＡＴ３阻害剤がニクロサミドである、＜１０＞の治療薬。
本発明の一態様によれば、ＡＬＳ等の神経変性疾患の治療薬のスクリーニングの精度が高い評価系を実現することができる。
〔１．多能性幹細胞〕
本発明に係る多能性幹細胞は、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている。
本発明に係る多能性幹細胞は、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている。
本発明に係る多能性幹細胞は少なくとも多能性（multipotency）を示し、より好ましくは多能性を示す状態かそれ以前の状態を示す。なお、本発明において、多能性とは、例えば神経系または造血系など一部の細胞種に分化できる能力を指す。また、本発明において、多能性とは、個体自体を構成することは出来ないが、個体を構成するすべての細胞および組織に分化できる能力を指す。多能性幹細胞の一例は、いわゆる「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、induced Pluripotent Stem Cell）」である。「誘導多能性幹細胞」とは、ＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell）に近い性質を有する細胞であり、より具体的には、未分化細胞であって、培養条件によって全能性（pluripotency）および未分化増殖能を有する細胞を包含する。ｉＰＳ細胞の一例として、ヒトまたはマウス由来のヒトｉＰＳ細胞が挙げられる。
ｉＰＳ細胞は公知の手法によって作製することができる。例えば、ヒトまたはマウス等の動物から採取した細胞（出発細胞と称する場合もある）に初期化因子を導入する、または、当該細胞を初期化因子で処理することによって、ｉＰＳ細胞を作製する。また、ｉＰＳ細胞の調製方法がPLoS One 12, e0171947(2017)に記載されている。
出発細胞の種類は特に限定されないが、線維芽細胞等の体細胞であることが好ましい。当該細胞の種類に応じた適切な方法で行えばよい。体細胞の種類は、生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、分化能を有する体性幹細胞、人工多能性幹細胞およびこれらの幹細胞から分化誘導された体細胞も含まれる。細胞を採取する対象は、神経変性疾患に罹患していない対象であってもよく、神経変性疾患に罹患している対象であってもよい。
体細胞の由来は、例えば、胎児期（胎仔期）の個体に由来するものの他、成熟した個体に由来するものを用いてもよい。
体細胞の由来は、例えば、胎児期（胎仔期）の個体に由来するものの他、成熟した個体に由来するものを用いてもよい。
ＴＤＰ−４３はＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（TAR DNA-binding protein 43）のことであり、２つのＲＮＡ認識モチーフを有するＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質である。転写、翻訳およびスプライシングの制御を含むＲＮＡ代謝にＴＤＰ−４３は関与している。ＴＤＰ−４３は、正常モーターニューロンでは主に核に局在している。一方、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患を有する対象のモーターニューロンでは、核内のＴＤＰ−４３が細胞質に移行し、細胞質においてＴＤＰ−４３の凝集体が形成される。当該ＴＤＰ−４３の凝集体による神経毒性によって神経細胞死が誘導される。野生型であるヒトＴＤＰ−４３の全長アミノ酸配列は、GenBank Accession No.NP_031401として登録されている。野生型であるヒトＴＤＰ−４３遺伝子は、GenBank Accession No.NM_007375.3として登録されている。
多能性幹細胞に誘導発現可能に導入されるＴＤＰ−４３遺伝子は、野生型のＴＤＰ−４３遺伝子であっても、変異型のＴＤＰ−４３遺伝子であってもよい。変異型のＴＤＰ−４３遺伝子の例として、ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の９０番目に相当するアラニンがバリンに置換されたアミノ酸配列をコードする変異型のＴＤＰ−４３遺伝子（Ａ９０Ｖ）；ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の３３７番目に相当するメチオニンがバリンに置換されたアミノ酸配列をコードする変異型のＴＤＰ−４３遺伝子（Ｍ３３７Ｖ）；ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の２９４番目に相当するグリシンがバリンに置換されたアミノ酸配列をコードする変異型のＴＤＰ−４３遺伝子（Ｇ２９４Ｖ）；ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の２９８番目に相当するグリシンがセリンに置換されたアミノ酸配列をコードする変異型のＴＤＰ−４３遺伝子（Ｇ２９８Ｓ）；ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の３１５番目に相当するアラニンがスレオニンに置換されたアミノ酸配列をコードする変異型のＴＤＰ−４３遺伝子（Ａ３１５Ｔ）；ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列の３４３番目に相当するグルタミンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列をコードする変異型のＴＤＰ−４３遺伝子（Ｑ３４３Ｒ）；等が挙げられる。
多能性幹細胞へのＴＤＰ−４３遺伝子の導入方法として、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現が誘導可能であれば、特に限定されない。「遺伝子の発現が誘導可能である」とは、例えば、所望する段階に達したときに遺伝子の発現を誘導することが出来ることを指す。これにより、例えば、多能性幹細胞の段階、若しくはモーターニューロン等への分化誘導の初期の段階において、ＴＤＰ−４３遺伝子が過剰に発現すること、並びに、ＴＤＰ−４３による細胞毒性を防止する。導入方法の例として、ＣｒｅＥＲＴ２−ＬｏｘＰシステム等が挙げられる。Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムを用いて、ＴＤＰ−４３遺伝子を導入することによって、タモキシフェン処理によってＴＤＰ−４３遺伝子の発現が誘導される。また、プロモータはＣＡＧプロモータが望ましい。
ＴＤＰ−４３遺伝子を多能性幹細胞に導入する際、誘導発現されるＴＤＰ−４３が標識されるように、標識タンパク質をコードする遺伝子も導入することが好ましい。誘導発現されるＴＤＰ−４３が標識されていることにより、ＴＤＰ−４３の細胞における局在を可視化することができる。例えば、標識タンパク質をコードする遺伝子およびＴＤＰ−４３遺伝子をＣｒｅＥＲＴ２−ＬｏｘＰシステムに導入することによって、誘導発現されるＴＤＰ−４３が標識される。標識タンパク質の例として、ｍＫａｔｅ２（赤色蛍光タンパク質）およびＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質等が挙げられる。
〔２．神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法〕
本発明に係る神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と略記する場合がある）は、被験物質接触工程と、選択工程と、を含む。以下、各工程について説明する。
本発明に係る神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と略記する場合がある）は、被験物質接触工程と、選択工程と、を含む。以下、各工程について説明する。
（１）被験物質接触工程
被験物質接触工程においては、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞より分化誘導してなるモーターニューロンに対して被験物質を接触させる。このモーターニューロンは、遺伝子の誘導発現によって生じるＴＤＰ−４３が、その細胞質に局在するように方向付けがなされている。
被験物質接触工程においては、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞より分化誘導してなるモーターニューロンに対して被験物質を接触させる。このモーターニューロンは、遺伝子の誘導発現によって生じるＴＤＰ−４３が、その細胞質に局在するように方向付けがなされている。
多能性幹細胞からモーターニューロンによる分化誘導は、公知の方法によって行うことができる。例えば、Klim, J.R.et al, Nat. Neurosci. 22, 167-179 (2019)に記載される方法によって、多能性幹細胞からモーターニューロンによる分化誘導することができる。また、２段階のステップ（ステップ１：モーターニューロンの前駆細胞への分化、ステップ２：前駆細胞からモーターニューロンの成熟化）によって、多能性幹細胞からモーターニューロンによる分化誘導することもできる。
多能性幹細胞からモーターニューロンによる分化誘導するときに使用する培地、添加剤および培養皿のコーティング剤等は、特に限定されず、公知の材料を使用することができる。また、培養温度等の培養条件も公知の手法を参考にして適宜設定できる。
モーターニューロンへの誘導剤の接触は、多能性幹細胞の培養を開始してから７日目以上が好ましい。
細胞質にＴＤＰ−４３が局在するように方向付けがなされたモーターニューロンとは、神経変性疾患モデルのモーターニューロンである。正常のモーターニューロンと比較して、核内のＴＤＰ−４３が細胞質に移行し、細胞質においてＴＤＰ−４３の凝集体が形成されるように構成されている。後述の局在変化誘導工程によってＴＤＰ−４３の局在変化を誘導することによって、細胞質にＴＤＰ−４３が局在するように方向付けがなされたモーターニューロンを作製してもよい。
モーターニューロンへの被験物質の接触は、例えば、培地に被験物質を添加することによって、被験物質をモーターニューロンに接触させることができる。モーターニューロンへの被験物質の接触期間（被験物質を含む培地によるモーターニューロンの培養期間）は、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上が挙げられる。また、当該培養期間は、１０日以下、９日以下、８日以下、７日以下、または６日以下が挙げられる。
（２）選択工程
被験物質接触工程後の、前記モーターニューロンの細胞質及び核におけるＴＤＰ−４３の局在量に基づいて、前記被験物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択する。
被験物質接触工程後の、前記モーターニューロンの細胞質及び核におけるＴＤＰ−４３の局在量に基づいて、前記被験物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択する。
選択工程において、被験物質を接触させない場合と比較して、前記モーターニューロンの細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量が減る、又は、前記モーターニューロンの核におけるＴＤＰ−４３の局在量が増加する、又は、これらの両方を満たすものを、神経変性疾患の治療薬の候補として選択してもよい。あるいは、前記モーターニューロンの細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量をＡ、核におけるＴＤＰ−４３をＢとしたときに、選択工程において、被験物質を接触させない場合と比較して、Ａ／（Ａ＋Ｂ）の減少、又は、Ｂ／（Ａ＋Ｂ）の増加、又は、これらの両方を満たすものを、神経変性疾患の治療薬の候補として選択してもよい。
ＴＤＰ−４３を蛍光標識している場合、例えば、撮影工程、検出工程および計算工程および比較工程を行うことによって、被験物質接触工程後のモーターニューロンの細胞質および核におけるＴＤＰ−４３の局在量を測定してもよい。ＴＤＰ−４３に蛍光標識をしている場合、後述に示すように、モーターニューロンの細胞質および核それぞれにおけるＴＤＰ−４３の局在量を数値化することができる。
（２−１）撮影工程
撮影工程においては、モーターニューロンの画像を撮影する。撮影工程前に、細胞質および核をそれぞれ容易に識別できるように、ＴＤＰ−４３とは異なる蛍光タンパク質によって標識する標識工程を行うことが好ましい。公知の細胞画像解析装置を用いて、モーターニューロンの画像の撮影を行うことができる。
撮影工程においては、モーターニューロンの画像を撮影する。撮影工程前に、細胞質および核をそれぞれ容易に識別できるように、ＴＤＰ−４３とは異なる蛍光タンパク質によって標識する標識工程を行うことが好ましい。公知の細胞画像解析装置を用いて、モーターニューロンの画像の撮影を行うことができる。
（２−２）検出工程
検出工程においては、撮影工程によって得られた画像における、モーターニューロンの細胞質および核を検出する。上述の通り、細胞質および核をそれぞれ蛍光標識することによって、細胞質および核をそれぞれ検出することができる。
検出工程においては、撮影工程によって得られた画像における、モーターニューロンの細胞質および核を検出する。上述の通り、細胞質および核をそれぞれ蛍光標識することによって、細胞質および核をそれぞれ検出することができる。
（２−３）計算工程
計算工程においては、検出工程によって検出された細胞質における蛍光領域の面積を、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量と計算する。また、前記検出工程によって検出された核における蛍光強度を、核におけるＴＤＰ−４３の局在量として計算する。このように、細胞質および核それぞれにおけるＴＤＰ−４３の局在量を数値化することによって、ＴＤＰ−４３の局在変化を感度良く検出することができる。
計算工程においては、検出工程によって検出された細胞質における蛍光領域の面積を、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量と計算する。また、前記検出工程によって検出された核における蛍光強度を、核におけるＴＤＰ−４３の局在量として計算する。このように、細胞質および核それぞれにおけるＴＤＰ−４３の局在量を数値化することによって、ＴＤＰ−４３の局在変化を感度良く検出することができる。
（３）その他の工程
本発明のスクリーニング方法は、本実施形態の効果が得られる範囲において、上述した工程以外の他の工程をさらに含んでいてもよい。他の工程の例として、発現誘導工程および局在変化誘導工程等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法は、本実施形態の効果が得られる範囲において、上述した工程以外の他の工程をさらに含んでいてもよい。他の工程の例として、発現誘導工程および局在変化誘導工程等が挙げられる。
（３−１）発現誘導工程
発現誘導工程において、被験物質接触工程前に、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導する。
発現誘導工程において、被験物質接触工程前に、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導する。
例えば、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導する発現誘導剤をモーターニューロンに接触させることによって、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導することができる。ＴＤＰ−４３遺伝子をＣｒｅＥＲＴ２−ＬｏｘＰシステムに導入する場合、モーターニューロンをタモキシフェンに接触させることによって、ＴＤＰ−４３遺伝子の発現が誘導される。培地に添加する発現誘導剤の添加濃度および接触期間等は、適宜選択することができる。モーターニューロンへの発現誘導剤の接触は、多能性幹細胞の培養を開始してから１３日目〜１７日目が好ましい。
（３−２）局在変化誘導工程
局在変化誘導工程の一例において、モーターニューロンに、ＴＤＰ−４３の局在変化を誘導する局在変化誘導剤を接触させる。局在変化誘導剤の接触によって、モーターニューロンの核内のＴＤＰ−４３を細胞質に移行させて、神経変性疾患モデルのモーターニューロンを調製することができる。局在変化誘導剤の例として、ＭＧ−１３２等のプロテアソーム阻害剤および亜ヒ酸ナトリウム等の亜ヒ酸塩等が挙げられる。局在変化誘導剤のモーターニューロンへの接触（培地への誘導剤の添加）は、被験物質をモーターニューロンに接触する前に行ってもよいし、被験物質の接触と同時に行ってもよい。
局在変化誘導工程の一例において、モーターニューロンに、ＴＤＰ−４３の局在変化を誘導する局在変化誘導剤を接触させる。局在変化誘導剤の接触によって、モーターニューロンの核内のＴＤＰ−４３を細胞質に移行させて、神経変性疾患モデルのモーターニューロンを調製することができる。局在変化誘導剤の例として、ＭＧ−１３２等のプロテアソーム阻害剤および亜ヒ酸ナトリウム等の亜ヒ酸塩等が挙げられる。局在変化誘導剤のモーターニューロンへの接触（培地への誘導剤の添加）は、被験物質をモーターニューロンに接触する前に行ってもよいし、被験物質の接触と同時に行ってもよい。
局在変化誘導剤としてＭＧ−１３２を使用する場合、ＭＧ−１３２の添加濃度は、２５ｎＭ以上４００ｎＭ以下であってもよく、５０ｎＭ以上２００ｎＭ以下であることが好ましい。局在変化誘導剤として亜ヒ酸塩を使用する場合は、亜ヒ酸塩の添加濃度は、２．５μＭ以上４０μＭ以下であってもよく、５μＭ以上２０μＭ以下であることが好ましい。
モーターニューロンへの局在変化誘導剤の接触は、ｉＰＳ細胞の培養を開始してから１７日目〜２０日目が好ましい。また、モーターニューロンへの局在変化誘導剤の接触期間（局在変化誘導剤を含む培地によるモーターニューロンの培養期間）は、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上が挙げられる。また、当該培養期間は、１０日以下、９日以下、８日以下、７日以下、または６日以下が挙げられる。
従来のスクリーニング方法では、ＡＬＳ患者のｉＰＳ細胞から作製したモーターニューロンを用いて、内因性のＴＤＰ−４３の局在変化を評価していた。従来のスクリーニング方法では、内因性のＴＤＰ−４３の局在量を数値化することが困難であったため、スクリーニングの精度が低かった。一方、本発明に係るスクリーニング方法は、外因性のＴＤＰ−４３遺伝子をｉＰＳ細胞に導入する。外因性のＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導することによって、外因性のＴＤＰ−４３の局在変化が可視化し易くなる。また、誘導発現されるＴＤＰ−４３を蛍光等で標識し、画像解析することによって、モーターニューロンの各領域におけるＴＤＰ−４３の局在量をそれぞれ数値化することができる。ＴＤＰ−４３の局在量を数値化することによって、スクリーニングの精度を向上させることができる。また、誘導発現されるＴＤＰ−４３を蛍光等で標識することによって、外因性のＴＤＰ−４３の局在変化を観察する際に、細胞固定後の抗体染色を必要しない。したがって、生きた細胞（live cells）の外因性のＴＤＰ−４３の局在変化を評価することができる。
本発明のスクリーニング方法は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびレビー小体病等の、ＴＤＰ−４３の局在変化が生じる神経変性疾患の治療薬のスクリーニングに有用である。ＡＬＳとして、例えば、家族性ＡＬＳ等が挙げられる。
〔３．神経変性疾患の治療薬のスクリーニングキット〕
本発明に係る神経変性疾患の治療薬のスクリーニングキット（以下、「本発明のスクリーニングキット」と略記する場合がある）は、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞を含む。当該多能性幹細胞に加え、多能性幹細胞の培地等を備えていてもよい。また、本実施形態に係るスクリーニングキットには、多能性幹細胞のモーターニューロンへの分化誘導手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙もしくはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、または磁気テープ、コンピューター等の読み取り可能なディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
本発明に係る神経変性疾患の治療薬のスクリーニングキット（以下、「本発明のスクリーニングキット」と略記する場合がある）は、ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞を含む。当該多能性幹細胞に加え、多能性幹細胞の培地等を備えていてもよい。また、本実施形態に係るスクリーニングキットには、多能性幹細胞のモーターニューロンへの分化誘導手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙もしくはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、または磁気テープ、コンピューター等の読み取り可能なディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
〔４．神経変性疾患の治療薬〕
本発明の神経変性疾患の治療薬（以下、「本発明の治療薬」と略記する場合がある）は、ＳＴＡＴ３阻害剤を有効成分として含有する。ＳＴＡＴ３阻害剤は、シグナル伝達性転写因子３；signal transducer and activator of transcription 3の阻害剤である。本発明の神経変性疾患の治療薬は、上記スクリーニング方法によってスクリーニングされた治療薬である。
本発明の神経変性疾患の治療薬（以下、「本発明の治療薬」と略記する場合がある）は、ＳＴＡＴ３阻害剤を有効成分として含有する。ＳＴＡＴ３阻害剤は、シグナル伝達性転写因子３；signal transducer and activator of transcription 3の阻害剤である。本発明の神経変性疾患の治療薬は、上記スクリーニング方法によってスクリーニングされた治療薬である。
ＳＴＡＴ３阻害剤として、ニクロサミド、スタティック、Ｃ１８８−９、Ｓ３Ｉ−２０１及びニフロキサシド（Nifuroxazide）等が挙げられ、ニクロサミドが好ましい。ＳＴＡＴ３阻害剤は市販のＳＴＡＴ３阻害剤であってもよく、公知の手法によって合成してもよい。
本発明の神経変性疾患の治療薬は、ＳＴＡＴ３阻害剤以外の他の成分をさらに含んでいてもよい。当該他の成分は特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、および粘度調整剤等が挙げられる。また、必要に応じて、公知の神経変性疾患の治療薬を、本発明に係る神経変性疾患の治療薬の一構成として加えて複合剤を構成してもよい。
上記薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、担体であって、本発明の治療薬と同時投与された場合に本発明の治療薬の機能（神経変性疾患の治療）を阻害せず、かつ、投与対象となるヒトまたは動物に対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。
上記担体としては、この分野で既報のものを広く使用でき、具体的には、例えば、水、各種塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、パラフィン、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドン等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。担体の種類は、本発明の治療薬の剤形、および投与方法等に応じて、適宜選択すればよい。
本発明の治療薬の剤形も特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、および注射剤等が挙げられ、好ましくは注射剤または経口投与用の剤形である。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
以下の実施例中、特に記載がない限り、％は質量％を表す。
〔材料と方法〕
＜ＴＤＰ−４３トランスフェクトヒトｉＰＳ細胞の構築と細胞培養＞
PLoS One 12, e0171947(2017)の記載に従って、ヒト皮膚線維芽細胞を用いてヒトｉＰＳ細胞を調製した。ヒト皮膚線維芽細胞には、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を導入することによってヒトｉＰＳ細胞を導入した。ヒト野生型である全長ＴＤＰ−４３遺伝子をＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムに導入した。ＴＤＰ−４３のＤＮＡ断片、ｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質遺伝子及びＣｒｅ−ＥＲＴ２をＡＡＶＳ１領域にゲノム編集技術を用いてトランスフェクトした。ＡＡＶＳ１領域は、細胞のセーフハーバー領域である。ゲノム編集技術により構築したＴＤＰ−４３遺伝子発現構築物の模式図を図１に示す。
＜ＴＤＰ−４３トランスフェクトヒトｉＰＳ細胞の構築と細胞培養＞
PLoS One 12, e0171947(2017)の記載に従って、ヒト皮膚線維芽細胞を用いてヒトｉＰＳ細胞を調製した。ヒト皮膚線維芽細胞には、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を導入することによってヒトｉＰＳ細胞を導入した。ヒト野生型である全長ＴＤＰ−４３遺伝子をＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムに導入した。ＴＤＰ−４３のＤＮＡ断片、ｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質遺伝子及びＣｒｅ−ＥＲＴ２をＡＡＶＳ１領域にゲノム編集技術を用いてトランスフェクトした。ＡＡＶＳ１領域は、細胞のセーフハーバー領域である。ゲノム編集技術により構築したＴＤＰ−４３遺伝子発現構築物の模式図を図１に示す。
ＴＤＰ−４３遺伝子発現構築物を、上記ヒトｉＰＳ細胞に導入した。次に、Cellartis DEF-CS 500 Culture System(Takara Bio)を用いて、コラーゲンＩをコートしたディッシュでｉＰＳ細胞を培養した。Ｄ−ＰＢＳ（−／−）で洗浄し、TrypLE Selectで処理することによって細胞を剥がしてから、コラーゲンＩをコートしたディッシュに播種した。
＜モーターニューロンへの分化＞
モーターニューロンへの分化誘導は、２段階（Ｓｔｅｐ１及びＳｔｅｐ２）に分けて行った。Ｓｔｅｐ１ではモーターニューロンの前駆細胞への分化を行った。Ｓｔｅｐ２では、前駆細胞からモーターニューロンの成熟化を行った。Ｓｔｅｐ１及びＳｔｅｐ２のプロトコールの模式図を図２に示す。
モーターニューロンへの分化誘導は、２段階（Ｓｔｅｐ１及びＳｔｅｐ２）に分けて行った。Ｓｔｅｐ１ではモーターニューロンの前駆細胞への分化を行った。Ｓｔｅｐ２では、前駆細胞からモーターニューロンの成熟化を行った。Ｓｔｅｐ１及びＳｔｅｐ２のプロトコールの模式図を図２に示す。
（Ｓｔｅｐ１：モーターニューロンの前駆細胞への分化）
Ｓｔｅｐ１では、１日目（Ｄａｙ１）に、マトリゲルをコートしたディッシュに、ＤＥＦ−ＣＳ培地（２．４μＭジアゾビビン及び４．７μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含む）に懸濁したｉＰＳ細胞を播種した。播種した翌日に培地を培地Ａに交換してｉＰＳ細胞を培養し、６日目（Ｄａｙ６）まで培養した。培地は２日に１回交換した。６日目（Ｄａｙ６）に培地を培地Ｂに交換してｉＰＳ細胞を培養し、１０日目（Ｄａｙ１０）まで培養した。培地は２日に１回交換した。培地Ａ及び培地Ｂの組成をそれぞれ、表１及び２に示す。
Ｓｔｅｐ１では、１日目（Ｄａｙ１）に、マトリゲルをコートしたディッシュに、ＤＥＦ−ＣＳ培地（２．４μＭジアゾビビン及び４．７μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含む）に懸濁したｉＰＳ細胞を播種した。播種した翌日に培地を培地Ａに交換してｉＰＳ細胞を培養し、６日目（Ｄａｙ６）まで培養した。培地は２日に１回交換した。６日目（Ｄａｙ６）に培地を培地Ｂに交換してｉＰＳ細胞を培養し、１０日目（Ｄａｙ１０）まで培養した。培地は２日に１回交換した。培地Ａ及び培地Ｂの組成をそれぞれ、表１及び２に示す。
１０日目（Ｄａｙ１０）に細胞を回収して凍結保存した。細胞の剥離液として、DMEM/F12、Accutase（Thermo Fisher Scientific）、９０Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Worthington）及び９Ｕ／ｍＬのパパイン（Worthington）を使用した。培地を０．２μｍフィルターに通してから遠心分離を行って、細胞を回収した。回収した細胞は、Stem-Cellbanker (Takara Bio)に懸濁して−１５０℃にて保管した。
（Ｓｔｅｐ２：モーターニューロンの成熟化）
Ｓｔｅｐ１において凍結保存した細胞を解凍後、成熟化培地に懸濁し、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンでコートした９６ウェルプレートに播種した。成熟化培地の組成を表３に示す。培地の半量を２週間に１回交換した。
Ｓｔｅｐ１において凍結保存した細胞を解凍後、成熟化培地に懸濁し、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンでコートした９６ウェルプレートに播種した。成熟化培地の組成を表３に示す。培地の半量を２週間に１回交換した。
＜ＴＤＰ−４３局在変化をベースとしたスクリーニングシステムの構築と当該スクリーニングシステムを用いたスクリーニング＞
上記Ｓｔｅｐ２で成熟化培地に懸濁し、３８４ウェルプレートに播種した細胞（Ｄａｙ１０）を用いて、ＴＤＰ−４３の局在変化の測定を行った。１３日目（Ｄａｙ１３）で培地を半量交換し、４−ＯＨＴ（４−ヒドロキシタモキシフェン）を１００ｎＭになるように培地に添加した。４−ＯＨＴの添加により、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムによってＬｏＸＰが切断を受けて、ＴＤＰ−４３及びｍＫａｔｅ蛍光タンパク質の共発現が誘導される。１７日目（Ｄａｙ１７）で培地を半量交換し、試験化合物及びストレッサー化合物（１００ｎＭのＭＧ−１３２（Wako））を培地に添加した。ＭＧ−１３２はプロテアソーム阻害剤である。２０日目（Ｄａｙ２０）に細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を０．１％のTriton X-100で１５分間することによって透過処理をし、１％の正常ロバ血清、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％のTriton X-100を含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。１％の正常ロバ血清を含むＰＢＳ及びＭＡＰ２抗体（Abcam、ab32454）を用いて、４℃下において一晩インキュベートすることによって、細胞を抗体染色した。細胞をＰＢＳですすいだ後、１％の正常ロバ血清を含むＰＢＳならびにＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲートＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Thermo Fisher Scientific）及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Dojindo）を１時間インキュベートすることによって、細胞を抗体染色した。そして、ArrayScan XTI（Thermo Fisher Scientific）を用いて蛍光画像を取得した。青色（Ex 386/23 nm）でＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、緑色（Ex 485/20 nm）でＭＡＰ２、赤色（Ex 560/25 nm）でｍＫａｔｅ２の蛍光画像を取得した。ｍＫａｔｅ２−ＴＤＰ−４３の局在解析は、HCS Studio Cellomics ScanのColocalization Measurementのメソッドに基づき、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＭＡＰ２で染色される細胞質領域と、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色される核領域を設定した。細胞質領域に発現しているＴＤＰ−４３及び核領域に発現しているＴＤＰ−４３それぞれを数値化することによって、ＴＤＰ−４３の局在変化の解析を行った。細胞質領域に局在するＴＤＰ−４３は、細胞質領域におけるＴＤＰ−４３の蛍光領域の面積を細胞数で補正した平均値として数値化した。核領域に局在するＴＤＰ−４３は、核領域におけるＴＤＰ−４３の蛍光強度を細胞数で補正した平均値として数値化した。
上記Ｓｔｅｐ２で成熟化培地に懸濁し、３８４ウェルプレートに播種した細胞（Ｄａｙ１０）を用いて、ＴＤＰ−４３の局在変化の測定を行った。１３日目（Ｄａｙ１３）で培地を半量交換し、４−ＯＨＴ（４−ヒドロキシタモキシフェン）を１００ｎＭになるように培地に添加した。４−ＯＨＴの添加により、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムによってＬｏＸＰが切断を受けて、ＴＤＰ−４３及びｍＫａｔｅ蛍光タンパク質の共発現が誘導される。１７日目（Ｄａｙ１７）で培地を半量交換し、試験化合物及びストレッサー化合物（１００ｎＭのＭＧ−１３２（Wako））を培地に添加した。ＭＧ−１３２はプロテアソーム阻害剤である。２０日目（Ｄａｙ２０）に細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を０．１％のTriton X-100で１５分間することによって透過処理をし、１％の正常ロバ血清、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％のTriton X-100を含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。１％の正常ロバ血清を含むＰＢＳ及びＭＡＰ２抗体（Abcam、ab32454）を用いて、４℃下において一晩インキュベートすることによって、細胞を抗体染色した。細胞をＰＢＳですすいだ後、１％の正常ロバ血清を含むＰＢＳならびにＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲートＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Thermo Fisher Scientific）及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Dojindo）を１時間インキュベートすることによって、細胞を抗体染色した。そして、ArrayScan XTI（Thermo Fisher Scientific）を用いて蛍光画像を取得した。青色（Ex 386/23 nm）でＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、緑色（Ex 485/20 nm）でＭＡＰ２、赤色（Ex 560/25 nm）でｍＫａｔｅ２の蛍光画像を取得した。ｍＫａｔｅ２−ＴＤＰ−４３の局在解析は、HCS Studio Cellomics ScanのColocalization Measurementのメソッドに基づき、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ＭＡＰ２で染色される細胞質領域と、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色される核領域を設定した。細胞質領域に発現しているＴＤＰ−４３及び核領域に発現しているＴＤＰ−４３それぞれを数値化することによって、ＴＤＰ−４３の局在変化の解析を行った。細胞質領域に局在するＴＤＰ−４３は、細胞質領域におけるＴＤＰ−４３の蛍光領域の面積を細胞数で補正した平均値として数値化した。核領域に局在するＴＤＰ−４３は、核領域におけるＴＤＰ−４３の蛍光強度を細胞数で補正した平均値として数値化した。
〔試験例１〕ｉＰＳ細胞から分化誘導したモーターニューロンの評価
Ｓｔｅｐ２におけて成熟化させたモーターニューロンに関し、成熟ニューロンのマーカーである、ＣＨＡＴ、ＨＢ９、ＩＳＬ１及びＢＲＮ３Ａの遺伝子発現量を測定した。また、上記成熟ニューロンのマーカーであるβ−チューブリンＩＩＩおよびＭＡＰ２による免疫染色を行った。遺伝子発現量の測定及び免疫染色の結果から、ｉＰＳ細胞からモーターニューロンへの成熟には、分化誘導後約２０日（Ｄａｙ２０）が適切であることが分かった（図示せず）。
Ｓｔｅｐ２におけて成熟化させたモーターニューロンに関し、成熟ニューロンのマーカーである、ＣＨＡＴ、ＨＢ９、ＩＳＬ１及びＢＲＮ３Ａの遺伝子発現量を測定した。また、上記成熟ニューロンのマーカーであるβ−チューブリンＩＩＩおよびＭＡＰ２による免疫染色を行った。遺伝子発現量の測定及び免疫染色の結果から、ｉＰＳ細胞からモーターニューロンへの成熟には、分化誘導後約２０日（Ｄａｙ２０）が適切であることが分かった（図示せず）。
〔試験例２〕構築したスクリーニングシステムによる化合物の評価
１７日目（Ｄａｙ１７）にＭＧ−１３２処理をすることによって、核におけるＴＤＰ−４３の局在量が減り、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量が増加した（図３）。よって、本実施例で調製した、ｉＰＳ細胞から分化誘導されたモーターニューロンを、ＭＧ−１３２と試験化合物とで処理し、細胞質及び核におけるＴＤＰ−４３の局在量をそれぞれ評価することによって、ＡＬＳ治療剤等の神経変性治療剤の候補をスクリーニングできることが分かった。また、ＴＤＰ−４３を蛍光タンパク質等によって蛍光標識することによって、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量は、細胞質における蛍光領域の面積を測定することによって数値化できることが分かった。また、核におけるＴＤＰ−４３の局在量は、核における蛍光強度を測定することによって数値化できることが分かった。よって、本実施例で構築したスクリーニングシステムを用いて画像解析を行うことによって、モーターニューロンの細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量と、モーターニューロンの核におけるＴＤＰ−４３の局在量をそれぞれ数値化することができた。そして、対照のモーターニューロン（ＴＤＰ−４３の局在が変化しているニューロン）のＴＤＰ−４３の局在量を比較できることが分かった（図４及び５）。
１７日目（Ｄａｙ１７）にＭＧ−１３２処理をすることによって、核におけるＴＤＰ−４３の局在量が減り、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量が増加した（図３）。よって、本実施例で調製した、ｉＰＳ細胞から分化誘導されたモーターニューロンを、ＭＧ−１３２と試験化合物とで処理し、細胞質及び核におけるＴＤＰ−４３の局在量をそれぞれ評価することによって、ＡＬＳ治療剤等の神経変性治療剤の候補をスクリーニングできることが分かった。また、ＴＤＰ−４３を蛍光タンパク質等によって蛍光標識することによって、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量は、細胞質における蛍光領域の面積を測定することによって数値化できることが分かった。また、核におけるＴＤＰ−４３の局在量は、核における蛍光強度を測定することによって数値化できることが分かった。よって、本実施例で構築したスクリーニングシステムを用いて画像解析を行うことによって、モーターニューロンの細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量と、モーターニューロンの核におけるＴＤＰ−４３の局在量をそれぞれ数値化することができた。そして、対照のモーターニューロン（ＴＤＰ−４３の局在が変化しているニューロン）のＴＤＰ−４３の局在量を比較できることが分かった（図４及び５）。
そして、細胞内における作用が既知である９４６個の試験化合物（Selleck）について評価を行った。９４６個の化合物を作用メカニズムで分類した円グラフを図６に示す。試験化合物の濃度は５μＭにして評価を行った。そして、ＭＧ−１３２のみ（対照）で処理したときの細胞質領域に発現しているＴＤＰ−４３及び核領域に発現しているＴＤＰ−４３の局在量と比較した。その結果、表４に示す７つの化合物がＡＬＳ治療剤の候補としてヒットした。すなわち、表４に示す７つの化合物が、ＭＧ−１３２のみ（対照）で処理したときと比較して、細胞質領域に発現しているＴＤＰ−４３及び核領域に発現しているＴＤＰ−４３の局在量が変化していた。表４のスタティック（stattic）は、ＳＴＡＴ３（シグナル伝達性転写因子３；signal transducer and activator of transcription 3）の阻害剤と知られている。また、スタティックは神経細胞の分化促進に関与していることが報告されている。本研究では、ＳＴＡＴ３阻害剤を用いて、ＴＤＰ−４３の局在が阻害されるメカニズムについて解析することにした。
〔試験例３〕ＳＴＡＴ３阻害剤によるＴＤＰ−４３の局在変化への影響
試験例３でヒットしたスタティック（stattic）及び、スタティックと同様にＳＴＡＴ３阻害剤であるニクロサミド（niclosamide）を用いて、ＴＤＰ−４３の局在が阻害されるメカニズムを解析することにした。ニクロサミドは駆虫薬として知られている。１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、スタティック又はニクロサミド及び１００ｎＭのＭＧ−１３２（Wako）を添加した。そして、２０日目（Ｄａｙ２０）のモーターニューロンを評価した。評価結果を図７及び８に示す。
試験例３でヒットしたスタティック（stattic）及び、スタティックと同様にＳＴＡＴ３阻害剤であるニクロサミド（niclosamide）を用いて、ＴＤＰ−４３の局在が阻害されるメカニズムを解析することにした。ニクロサミドは駆虫薬として知られている。１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、スタティック又はニクロサミド及び１００ｎＭのＭＧ−１３２（Wako）を添加した。そして、２０日目（Ｄａｙ２０）のモーターニューロンを評価した。評価結果を図７及び８に示す。
図７中、＊はＰ＜０．０１、＊＊はＰ＜０．００１を示す。Blankは未処理のモーターニューロン、Controlは１００ｎＭのＭＧ−１３２のみで処理したモーターニューロン、Niclosamideは１００ｎＭのＭＧ−１３２とニクロサミドとで処理したモーターニューロン、Staticは１００ｎＭのＭＧ−１３２とスタティックとで処理したモーターニューロンの結果を示す。Ｎ＝３であり、グラフの数値は平均値±標準偏差である。Tukeyの多重比較法を用いて統計解析を行った。
図７及び８に示すように、ニクロサミド及びスタティックいずれの処理によって、細胞質におけるＴＤＰ−４３の発現が抑制され、核におけるＴＤＰ−４３発現消失が抑制された。
次に、ＭＧ−１３２の代わりに、亜ヒ酸ナトリウムを用いて、スタティック又はニクロサミド処理によるＴＤＰ−４３の局在変化への影響を観察した。亜ヒ酸ナトリウムは、酸化ストレスを誘導することが知られている、ストレッサーである。１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、スタティック又はニクロサミド及び１０μＭの亜ヒ酸ナトリウム（SantaCruz）を添加した。そして、１８日目（Ｄａｙ１８）のモーターニューロンを評価した。評価結果を図９及び１０に示す。
図９中、＊はＰ＜０．０１、＊＊はＰ＜０．００１を示す。Blankは未処理のモーターニューロン、Controlは１０μＭの亜ヒ酸ナトリウムのみで処理したモーターニューロン、Niclosamideは１０μＭの亜ヒ酸ナトリウムとニクロサミドとで処理したモーターニューロン、Staticは１０μＭの亜ヒ酸ナトリウムとスタティックとで処理したモーターニューロンの結果を示す。Ｎ＝３であり、グラフの数値は平均値±標準偏差である。Tukeyの多重比較法を用いて統計解析を行った。
図９及び１０に示すように、亜ヒ酸ナトリウムのみで処理したモーターニューロンは、ＭＧ−１３２のみで処理したモーターニューロンと同様に、細胞質におけるＴＤＰ−４３の発現が増え、核におけるＴＤＰ−４３の発現が減少した。また、ニクロサミド及びスタティックいずれの処理によって、細胞質における亜ヒ酸ナトリウムの発現が抑制され、核における亜ヒ酸ナトリウム発現消失が抑制された。図９及び１０の結果から、スタティックよりもニクロサミドの方が、ストレッサー化合物によるＴＤＰ−４３の局在変化に影響を与えていると考えられる。試験例４以降は、ニクロサミドを用いて、ストレッサー化合物によるＴＤＰ−４３の局在変化が阻害されるメカニズムを解析することにした。
〔試験例４〕ニクロサミド処理による神経細胞障害の抑制
１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、ニクロサミド及び１００ｎＭのＭＧ−１３２を添加した。そして、２０日目（Ｄａｙ２０）又は２４日目（Ｄａｙ２４）のモーターニューロンを評価した。評価結果を図１１〜１３に示す。
１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、ニクロサミド及び１００ｎＭのＭＧ−１３２を添加した。そして、２０日目（Ｄａｙ２０）又は２４日目（Ｄａｙ２４）のモーターニューロンを評価した。評価結果を図１１〜１３に示す。
図１２のグラフはそれぞれ、神経細胞数当たりの軸索長（Neurite length per neuron）及び神経細胞当たりの分岐点の数（Branch points per neuron）を示す。神経形態変化の解析については、HCS Studio Cellomics ScanのNeuronal Profilingのメソッドに基づき、神経細胞当たりの神経突起長とBranch pointの数を解析した。画像解析による分岐点及び軸索の認識を示す図を図１１に示す。
図１２中、＊＊はＰ＜０．００１を示す。Blankは未処理のモーターニューロン、Controlは１００ｎＭのＭＧ−１３２のみで処理したモーターニューロン、Niclosamideは１００ｎＭのＭＧ−１３２とニクロサミドとで処理したモーターニューロンの結果を示す。Ｎ＝３であり、グラフの数値は平均値±標準偏差である。Tukeyの多重比較法を用いて統計解析を行った。
図１１〜１３に示すように、ＭＧ−１３２のみで処理することによって、神経細胞数がControlに比べて減った。また、ＭＧ−１３２の処理時間に伴い、神経細胞数が減ることも分かった。また、ニクロサミドの処理時間が３日間の結果に比べて、ニクロサミドの処理時間が７日間の結果では、ＭＧ−１３２によるＴＤＰ−４３の局在変化がより抑制されていた。さらに、ニクロサミドの処理時間が３日間のときは、神経細胞当たりの神経突起長と分岐点の数はControlから変化が見られなかった。一方、ニクロサミドの処理時間が７日間のときは、神経細胞当たりの神経突起長と分岐点の数がControlに比べて有意に増加した。以上の結果から、ニクロサミドは、ＭＧ−１３２によって誘導される神経細胞障害を緩和する効果を有することが分かった。
〔試験例５〕ニクロサミド処理による神経細胞障害の抑制
ニクロサミドが直接標的とする分子は知られていない。一方、ニクロサミドは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３、Ｗｎｔ／β−カテニン及びｍＴＯＲシグナル伝達を阻害することは知られている。また、ニクロサミドは、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化を阻害し、細胞内ＡＴＰ供給の減少を導くことも知られている。まず、ニクロサミド処理による酸化ストレスに伴う神経細胞障害への影響について検証することにした。
ニクロサミドが直接標的とする分子は知られていない。一方、ニクロサミドは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３、Ｗｎｔ／β−カテニン及びｍＴＯＲシグナル伝達を阻害することは知られている。また、ニクロサミドは、ミトコンドリアによる酸化的リン酸化を阻害し、細胞内ＡＴＰ供給の減少を導くことも知られている。まず、ニクロサミド処理による酸化ストレスに伴う神経細胞障害への影響について検証することにした。
１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、ニクロサミド及び１００ｎＭのＭＧ−１３２を添加した。そして、２０日目（Ｄａｙ２０）のモーターニューロンを評価した。細胞内ＡＴＰ量の測定は、CellTiter-Glo 2.0 Cell Viability Assay（Promega）を用いて行った。カスパーゼ３／７活性測定は、Caspase-Glo 3/7assay（Promega）を用いて行った。ＲＯＳ産生量の測定は、ROS-Glo H2O2 assay（Promega）を用いて行った。評価結果を図１４及び１５に示す。
図１４のグラフはそれぞれ、細胞内ＡＴＰ量（ATP content）、カスパーゼ３／７活性（Caspase 3/7）及びＲＯＳ（Ｈ２Ｏ２）産生量を示す。＊＊はＰ＜０．００１を示す。Blankは未処理のモーターニューロン、Controlは１００ｎＭのＭＧ−１３２のみで処理したモーターニューロン、Niclosamideは１００ｎＭのＭＧ−１３２とニクロサミドとで処理したモーターニューロンの結果を示す。Ｎ＝３であり、グラフの数値は平均値±標準偏差である。Tukeyの多重比較法を用いて統計解析を行った。
図１４及び１５に示すように、ニクロサミド処理によって用量依存的に、細胞内ＡＴＰ量及びカスパーゼ３／７活性が抑制された。カスパーゼ３／７活性はアポトーシス活性の指標となる。また、ニクロサミド処理によって用量依存的に、Ｈ２Ｏ２（ＲＯＳ）の産生量が減少した。また、図１５に示すように、CellROX試薬を用いた蛍光観察によっても、ニクロサミド処理によってＲＯＳ産生量が減少することを確認した。以上の結果から、ニクロサミドは酸化ストレス応答を最小限にし、ミトコンドリアによるＡＴＰ生産の減少によりＲＯＳ産生及び細胞障害を抑制することが示唆された。
〔試験例６〕複数のＳＴＡＴ３阻害剤によるＴＤＰ−４３の局在変化の抑制
ＳＴＡＴ３阻害剤として知られている、ニクロサミド（Sigma）、スタティック（Tocris Bioscience）、Ｃ１８８−９（Merck）、Ｓ３Ｉ−２０１（Seleck Chemicals）及びニフロキサシド（Nifuroxazide）に関し、ＭＧ−１３２によるＴＤＰ−４３の局在変化を抑制するか否かを検証した。１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、ＳＴＡＴ３阻害剤及び１００ｎＭのＭＧ−１３２を添加した。そして、２０日目（Ｄａｙ２０）のモーターニューロンを評価した。評価結果を図１６及び１７に示す。
ＳＴＡＴ３阻害剤として知られている、ニクロサミド（Sigma）、スタティック（Tocris Bioscience）、Ｃ１８８−９（Merck）、Ｓ３Ｉ−２０１（Seleck Chemicals）及びニフロキサシド（Nifuroxazide）に関し、ＭＧ−１３２によるＴＤＰ−４３の局在変化を抑制するか否かを検証した。１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンの培地に、ＳＴＡＴ３阻害剤及び１００ｎＭのＭＧ−１３２を添加した。そして、２０日目（Ｄａｙ２０）のモーターニューロンを評価した。評価結果を図１６及び１７に示す。
図１６及び１７中、＊はＰ＜０．０１、＊＊はＰ＜０．００１を示す。Blankは未処理のモーターニューロン、Controlは１００ｎＭのＭＧ−１３２のみで処理したモーターニューロンの結果を示す。Ｎ＝３であり、グラフの数値は平均値±標準偏差である。Tukeyの多重比較法を用いて統計解析を行った。
図１６及び１７に示すように、試験した５種類のＳＴＡＴ３阻害剤いずれも、ＭＧ−１３２による細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在変化を抑制することが分かった。一方、Ｓ３Ｉ−２０１及びニフロキサシドに関しては、ＭＧ−１３２による核におけるＴＤＰ−４３の局在変化を抑制していなかった。この結果は、ＳＴＡＴ３活性以外の因子が、ＴＤＰ−４３の核の局在に影響を与えていると考えられる。
図１８にはウエスタンブロットの結果を示す。図１８は、試験した５種類のＳＴＡＴ３阻害剤いずれも、リン酸化ＳＴＡＴ３（Phospho-STAT3）の発現量が減少し、ＳＴＡＴ３の制御に関与していることを示している。一方、ニクロサミドのみ、マイトファジーのマーカーであるリン酸化ユビキチンの発現量が増加し、オートファジーのマーカーであるＬＣ３の発現量が増加していた。これらの結果から、ＭＧ−１３２による核内のＴＤＰ−４３の消失をニクロサミドが抑制する作用は、ＳＴＡＴ３阻害以外の別の作用が関与していることが示唆された。
〔試験例７〕ニクロサミドによるマイトファジー及びオートファジーの活性化
ＰＩＮＫ１−Ｐａｒｋｉｎ経路はストレスにより障害を受けたミトコンドリアを除去すること、当該経路の異常はパーキンソン病の原因の１つであることが報告されている。ＰＩＮＫ１は、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（PTEN-induced putative kinase 1）である。また、ニクロサミドが、パーキンソン病モデルにおいてＰＩＮＫ１経路を活性化することが報告されている。上記で構築した評価システムを使用して、ニクロサミドによるＰＩＮＫ１経路の活性化を評価した。
ＰＩＮＫ１−Ｐａｒｋｉｎ経路はストレスにより障害を受けたミトコンドリアを除去すること、当該経路の異常はパーキンソン病の原因の１つであることが報告されている。ＰＩＮＫ１は、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（PTEN-induced putative kinase 1）である。また、ニクロサミドが、パーキンソン病モデルにおいてＰＩＮＫ１経路を活性化することが報告されている。上記で構築した評価システムを使用して、ニクロサミドによるＰＩＮＫ１経路の活性化を評価した。
まず、ＴＤＰ−４３を誘導発現しない場合（４−ＯＨＴ −）とＴＤＰ−４３を誘導発現する場合（４−ＯＨＴ ＋）で、ニクロサミド処理によるリン酸化ＳＴＡＴ３（Phospho-STAT3）の発現量の変化をウエスタンブロットによって測定した。また、ＭＧ−１３２処理をしない場合（ＭＧ−１３２ −）とＭＧ−１３２処理する場合（ＭＧ−１３２ ＋）で、ニクロサミド処理によるリン酸化ＳＴＡＴ３（Phospho-STAT3）の発現量の変化も測定した。ＭＧ−１３２処理は、１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンに行い、２０日目（Ｄａｙ２０）のモーターニューロンを評価した。測定結果を図１９に示す。
図１９に示すように、ニクロサミド処理によって、用量依存的にＳＴＡＴ３およびリン酸化ＳＴＡＴ３の発現量が変化し、ＳＴＡＴ３活性を改変した。また、ＴＤＰ−４３を誘導発現する（４−ＯＨＴ ＋）ことによって、ｍｋａｔｅ２−ＴＤＰ−４３の発現が誘導されることも確認した。
次に、ＴＤＰ−４３を誘導発現しない場合（４−ＯＨＴ −）とＴＤＰ−４３を誘導発現する場合（４−ＯＨＴ ＋）で、ニクロサミド処理によるリン酸化ＰＩＮＫ１（Phospho-PINK1）、リン酸化Ｐａｒｋｉｎ（Phospho-Parkin）、リン酸化ユビキチン（Phospho-Ubiquitin）の発現量の変化をウエスタンブロットによって測定した。また、ＭＧ−１３２処理をしない場合（ＭＧ−１３２ −）とＭＧ−１３２処理する場合（ＭＧ−１３２ ＋）で、ニクロサミド処理によるマイトファジーに関与する分子の発現量の変化をウエスタンブロットによって測定した。ＭＧ−１３２処理は、１７日目（Ｄａｙ１７）のモーターニューロンに行い、２０日目（Ｄａｙ２０）のモーターニューロンを評価した。ウエスタンブロットの結果を図２０に示す。
図２０に示すように、ニクロサミド処理によって、リン酸化ＰＩＮＫ１（Phospho-PINK1）、リン酸化Ｐａｒｋｉｎ（Phospho-Parkin）、リン酸化ユビキチン（Phospho-Ubiquitin）の発現量が増加した。ＰＩＮＫ１−Ｐａｒｋｉｎ経路において、自己リン酸化ＰＩＮＫ１が、ＰａｒｋｉｎのＳｅｒ６５のリン酸化およびユビキチンのＳｅｒ６５のリン酸化によって、マイトファジーを活性することが知られている。また、このマイトファジーの活性によって、損傷ミトコンドリアの分解が起こることも知られている。図２０の結果から、ニクロサミドはＰＩＮＫ１をリン酸化してＰＩＮＫ１を活性化し、さらにＰａｒｋｉｎおよびユビキチンもリン酸化することによってマイトファジーを誘導することが示唆された。
また、ニクロサミド処理によって、オートファジーに関与する分子の発現量の変化についても測定を行った。図２０の結果から、ニクロサミド処理によって、ＬＣ３の発現量が増加した一方、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２の発現量が減少していた。この結果から、ニクロサミド処理によってオートファジーが誘導されることが示唆された。
本発明の多能性幹細胞によって、精度が高い神経変性疾患の治療薬のスクリーニングシステムを提供することができ、例えば、医薬用途などに利用することができる。
Claims (11)
- ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞。
- 神経変性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、
ＴＤＰ−４３遺伝子が誘導発現可能に導入されている多能性幹細胞より分化誘導してなるモーターニューロンであって、その細胞質にＴＤＰ−４３が局在するように方向付けがなされたものに対して被験物質を接触させる被験物質接触工程と、
前記被験物質接触工程後の、前記モーターニューロンの細胞質及び核におけるＴＤＰ−４３の局在量に基づいて、前記被験物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択する選択工程とを含む、スクリーニング方法。 - 選択工程において、
被験物質を接触させない場合と比較して、前記モーターニューロンの細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量が減り、前記モーターニューロンの核におけるＴＤＰ−４３の局在量が増加したものを、神経変性疾患の治療薬の候補として選択する、請求項２に記載のスクリーニング方法。 - ＴＤＰ−４３遺伝子の発現を誘導する発現誘導工程をさらに含む、請求項２または３に記載のスクリーニング方法。
- 前記誘導発現されるＴＤＰ−４３は蛍光標識されている、請求項２〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
- 前記選択工程が、
前記モーターニューロンの画像を撮影する撮影工程と、
前記撮影工程によって得られた画像における、モーターニューロンの細胞質及び核を検出する検出工程と、
前記検出工程によって検出された細胞質における蛍光領域の面積を、細胞質におけるＴＤＰ−４３の局在量と計算し、前記検出工程によって検出された核における蛍光強度を、核におけるＴＤＰ−４３の局在量として計算する計算工程と、を含む、請求項５に記載のスクリーニング方法。 - 前記被験物質接触工程と同時に、又は、前記被験物質接触工程よりも前に、前記モーターニューロンに、ＴＤＰ−４３の局在変化を誘導する局在変化誘導剤を接触させる局在変化誘導工程をさらに含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
- 前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及びレビー小体病からなる群から選択される、請求項２〜７のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
- 請求項１に記載の多能性幹細胞を含む、神経変性疾患の治療薬のスクリーニングキット。
- ＳＴＡＴ３阻害剤を有効成分として含有する、神経変性疾患の治療薬。
- 前記ＳＴＡＴ３阻害剤がニクロサミドである、請求項１０に記載の治療薬。
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