JP2021183603A - Ice recrystallization inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は氷再結晶化抑制剤に関する。 The present invention relates to an ice recrystallization inhibitor.
氷は、氷点下の環境下でも、時間の経過と共に多数の小粒径の氷結晶が少数の大粒径の氷結晶へと成長してゆく、再結晶化と呼ばれる現象を生ずる。上記再結晶が冷凍した生鮮食品もしくは医療用の臓器、および細胞組織等で生じると、組織または細胞を破壊するため、これらの品質を著しく低下させる。したがって、食品の品質保持および臓器、組織の保存にとって、再結晶化の抑制は大きな課題であった。 Even in a sub-freezing environment, ice causes a phenomenon called recrystallization in which a large number of small-sized ice crystals grow into a small number of large-sized ice crystals over time. When the recrystallization occurs in frozen fresh foods or medical organs, cell tissues, etc., it destroys the tissues or cells, and thus the quality thereof is significantly deteriorated. Therefore, suppression of recrystallization has been a major issue for maintaining the quality of food and preserving organs and tissues.
上記再結晶化を抑制する物質として、氷再結晶化抑制剤が使用されている。現在、氷再結晶化抑制剤としては、高分子である不凍タンパク質、または不凍多糖が使用されており、これらは氷の結晶表面に結合して氷の成長を抑制する。 As the substance that suppresses the recrystallization, an ice recrystallization inhibitor is used. Currently, as the ice recrystallization inhibitor, high molecular weight antifreeze protein or antifreeze polysaccharide is used, and these bind to the crystal surface of ice and suppress the growth of ice.
近年では、低分子化合物も氷再結晶化抑制剤として用いられている。例えば非特許文献１には、氷再結晶化抑制剤として、ｐ−メトキシ−Ｏ−グリコシルフェノールが開示されている。
In recent years, low molecular weight compounds have also been used as ice recrystallization inhibitors. For example, Non-Patent
また、特許文献１には、ｎ−アルキル−エリロンアミド、アリル基を含む配糖体、アリル基を含むアルドアミド、およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１つの氷再結晶化抑制剤が開示されている。
Further,
特許文献２には、移植の過程において、組織および臓器保存のために用いられる抗酸化組成物等が開示されており、フェニルグリコシドが上記抗酸化組成物の一例として記載されている。
しかしながら、上述した不凍タンパク質および不凍多糖は分子が大きいため、細胞の内部には取り込まれず、細胞内の氷の再結晶化は抑制できなかった。特に、不凍タンパク質には免疫原性等の問題もあるため、実用上、使用に制約があるという問題もある。 However, since the above-mentioned antifreeze protein and antifreeze polysaccharide have large molecules, they were not taken up inside the cell and the recrystallization of ice in the cell could not be suppressed. In particular, since antifreeze protein has problems such as immunogenicity, there is also a problem that its use is restricted in practice.
また、特許文献１に開示の低分子化合物は、細胞毒性および高浸透圧を有するため、添加量の低減の観点から改善の余地があった。
Further, since the low molecular weight compound disclosed in
さらに、特許文献２には、フェニルグリコシドの抗酸化組成物としての機能は記載されているが、氷再結晶化抑制剤としての機能は何ら記載されておらず、一切不明であった。
Further,
以上の状況から、細胞内にも移行することが可能な、低分子であり、かつ非タンパク質である氷再結晶化抑制剤が望まれてきた。 From the above situation, a small molecule and non-protein ice recrystallization inhibitor that can be transferred into cells has been desired.
本発明者らは鋭意検討した結果、特定の構造を有する低分子の配糖体が少量でも氷再結晶化抑制剤として強く作用することを見出し、本発明を完成するに至った。従来技術では、本発明の一態様に係る配糖体の一部が、抗酸化剤として用いられている（例えば、特許文献２）のみであり、これらがＩＲＩ活性を有することは驚くべきことである。 As a result of diligent studies, the present inventors have found that a low-molecular-weight glycoside having a specific structure acts strongly as an ice recrystallization inhibitor even in a small amount, and have completed the present invention. In the prior art, only some of the glycosides according to one aspect of the present invention are used as antioxidants (eg, Patent Document 2), and it is surprising that they have IRI activity. be.
すなわち、本発明は以下の構成を含む。
＜１＞下記化学式（１）で表される化合物を有効成分として含む、氷再結晶化抑制剤。
That is, the present invention includes the following configurations.
<1> An ice recrystallization inhibitor containing a compound represented by the following chemical formula (1) as an active ingredient.
化学式（１）中、Ｒ１はアルキル基または水素であり、Ｒ２は不飽和炭化水素基またはアシル基であり、Ｒ３は単糖類または多糖類である。
＜２＞上記単糖類が、グルコース、マンノースもしくはガラクトースであり、上記多糖類が、グルコース、マンノースおよびガラクトースからなる群より選ばれる１種以上の単糖類から構成される多糖類である、＜１＞に記載の氷再結晶抑制剤。
＜３＞Ｒ１が水素または（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは０〜３の整数）である、＜１＞または＜２＞に記載の氷再結晶抑制剤。
＜４＞Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がアルデヒド基またはアリル基であり、Ｒ３がグルコースであり、化学式（１）中のＲ３−Ｏがα−１−Ｏグリコシド結合またはβ−１−Ｏグリコシド結合を有する、＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の氷再結晶抑制剤。
＜５＞＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の氷再結晶化抑制剤と、溶媒とを含有する冷凍保存用液。
＜６＞上記氷再結晶化抑制剤の濃度が２ｍＭ超である、＜５＞に記載の冷凍保存用液。
＜７＞細胞、生体組織、臓器または食品における氷の再結晶を抑制するために使用される、＜５＞または＜６＞に記載の冷凍保存用液。
In the chemical formula (1), R 1 is an alkyl group or a hydrogen, R 2 is an unsaturated hydrocarbon group or an acyl group, and R 3 is a monosaccharide or a polysaccharide.
<2> The monosaccharide is glucose, mannose or galactose, and the polysaccharide is a polysaccharide composed of one or more monosaccharides selected from the group consisting of glucose, mannose and galactose. <1> The ice recrystallization inhibitor according to.
<3> The ice recrystallization inhibitor according to <1> or <2>, wherein R 1 is hydrogen or (CH 2 ) n CH 3 (n is an integer of 0 to 3).
<4> R 1 is a methyl group, R 2 is an aldehyde group or an allyl group, R 3 is glucose, and R 3- O in the chemical formula (1) is an α-1-O glycosidic bond or β-. The ice recrystallization inhibitor according to any one of <1> to <3>, which has a 1-O glycoside bond.
<5> A freezing storage liquid containing the ice recrystallization inhibitor according to any one of <1> to <4> and a solvent.
<6> The freezing storage liquid according to <5>, wherein the concentration of the ice recrystallization inhibitor is more than 2 mM.
<7> The freezing storage solution according to <5> or <6>, which is used to suppress recrystallization of ice in cells, biological tissues, organs or foods.
本発明の一態様によれば、少量でも高いＩＲＩ活性を有する低分子の氷再結晶化抑制剤を提供することができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to provide a low molecular weight ice recrystallization inhibitor having high IRI activity even in a small amount.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to this, and various modifications can be made within the scope described, and the present invention also relates to an embodiment obtained by appropriately combining the technical means disclosed in different embodiments. Included in the technical scope of.
なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。本明細書において「ＩＲＩ活性」とは、冷凍した物品において、氷の再結晶化を抑制し、氷の平均粒子径を増加させない効果を意味する。 Unless otherwise specified in the present specification, "A to B" representing a numerical range is intended to be "A or more and B or less". As used herein, the term "IRI activity" means the effect of suppressing the recrystallization of ice and not increasing the average particle size of ice in a frozen article.
〔１．氷再結晶化抑制剤〕
本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤は、下記化学式（１）で表される化合物を有効成分として含む。
[1. Ice recrystallization inhibitor]
The ice recrystallization inhibitor according to the embodiment of the present invention contains a compound represented by the following chemical formula (1) as an active ingredient.
化学式（１）中、Ｒ１はアルキル基または水素であり、Ｒ２は不飽和炭化水素基またはアシル基であり、Ｒ３は単糖類または多糖類である。 In the chemical formula (1), R 1 is an alkyl group or a hydrogen, R 2 is an unsaturated hydrocarbon group or an acyl group, and R 3 is a monosaccharide or a polysaccharide.
上記化合物は、糖類と芳香族化合物である非糖部（アグリコン）とが０−グリコシド結合をしている配糖体であると言える。実施例にて後述するように、化学式（１）中のアグリコンがバニリンもしくはオイゲノールである配糖体が優れたＩＲＩ活性を有するという結果が示されている。化学式（１）で表される化合物は、上記配糖体と基本骨格が共通するため、同様に優れたＩＲＩ活性を有すると考えられる。 It can be said that the above compound is a glycoside in which a saccharide and a non-sugar portion (aglycone) which is an aromatic compound have a 0-glycosidic bond. As will be described later in Examples, the results show that glycosides in which the aglycone in the chemical formula (1) is vanillin or eugenol have excellent IRI activity. Since the compound represented by the chemical formula (1) has the same basic skeleton as the glycoside, it is considered that the compound has similarly excellent IRI activity.
上記単糖類としては、例えば、プシコース、ソルボース、タガトース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース、ラムノース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、アラビノース、エリトルロース、エリトロース、トレオース、ヘプツロース、ヘキシロース、ペンツロース等が挙げられるが、これらに限定されない。上記Ｒ３が単糖類である場合、Ｒ３は１種の単糖類１つからなることになる。 Examples of the monosaccharides include psicose, sorbose, tagatous, allose, altrose, glucose, mannose, growth, idose, galactose, talose, fuculose, fuculose, lambnorth, glucose, galactose, fructose, xylose, arabinose, elittlerose, and erythrose. , Treose, hepturose, hexylose, pentulose and the like, but are not limited thereto. When the above R 3 is a monosaccharide, R 3 is composed of one type of monosaccharide.
また、上記Ｒ３は、上記単糖類を構成単位として組み合わせた糖鎖からなる多糖類であってもよい。多糖類としては、例えば、二糖、オリゴ糖、三糖、四糖またはそれ以上の多糖が挙げられる。構成単位の単糖類が２つ以上連なる場合は、各々の単糖類同士の間は、例えば、グリコシド結合による脱水縮合によって結合している。多糖類は、ホモ多糖であってもよく、ヘテロ多糖であってもよい。 Further, the R 3 may be a polysaccharide composed of a sugar chain in which the monosaccharide is combined as a constituent unit. Examples of the polysaccharide include disaccharides, oligosaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides or higher polysaccharides. When two or more monosaccharides of a constituent unit are connected to each other, the monosaccharides are bonded to each other by, for example, dehydration condensation by a glycosidic bond. The polysaccharide may be a homopolysaccharide or a heteropolysaccharide.
多糖類の具体例としては、例えば、セルロース、セルロース誘導体（ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）、スクロース、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ラクトースプルラン、カードラン、ザンタン、キチン、キトサン等が挙げられるが、これらに限定されない。 Specific examples of the polysaccharide include cellulose, cellulose derivatives (hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, etc.), sucrose, amylose, amylopectin, glycogen, lactose pullulan, curdlan, zantan, chitin, chitosan, and the like. , Not limited to these.
上記単糖類は、グルコース、マンノースもしくはガラクトースであることが好ましい。また、上記多糖類が、グルコース、マンノースおよびガラクトースからなる群より選ばれる１種以上の単糖類から構成される多糖類であることが好ましい。上記好ましい多糖類としては、例えばアミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、ラクトース、等が挙げられる。 The monosaccharide is preferably glucose, mannose or galactose. Further, it is preferable that the polysaccharide is a polysaccharide composed of one or more monosaccharides selected from the group consisting of glucose, mannose and galactose. Examples of the preferred polysaccharide include amylose, amylopectin, glycogen, cellulose, lactose and the like.
上記構成によれば、化学式（１）で表される化合物の構造が、実施例で用いた上記配糖体と同一またはより一層類似した構造となる。それゆえ、高いＩＲＩ活性を有する氷結晶化抑制剤を得る観点から好ましい。 According to the above structure, the structure of the compound represented by the chemical formula (1) is the same as or more similar to that of the glycoside used in the examples. Therefore, it is preferable from the viewpoint of obtaining an ice crystallization inhibitor having high IRI activity.
また、上記化合物は、細胞等の内部で氷結晶化抑制剤として機能することが必要とされるため、できるだけ低分子であることが好ましい。それゆえ、上記構成は、上記化合物の分子量を抑制する観点からも好ましい。 Further, since the above compound is required to function as an ice crystallization inhibitor inside cells and the like, it is preferably as small as possible. Therefore, the above configuration is also preferable from the viewpoint of suppressing the molecular weight of the above compound.
上記アルキル基の炭素数は、化学式（１）で表される化合物の分子量を抑制する観点から、１〜１０であることが好ましく、１〜６であることがさらに好ましく、１〜４であることがさらに好ましい。上記アルキル基は、直鎖状であってもよく、分岐を有していてもよい。 The carbon number of the alkyl group is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 4, from the viewpoint of suppressing the molecular weight of the compound represented by the chemical formula (1). Is even more preferable. The alkyl group may be linear or may have a branch.
アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、sec−ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、n−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、n−ヘキシル基、イソヘキシル基、n−ヘプチル基、４，４−ジメチルペンチル基、n−オクチル基、２，２，４−トリメチルペンチル基、ノニル基、デシル基等が挙げられるが、これらに限定されない。 Specific examples of the alkyl group include, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group, an n-pentyl group, and an isopentyl group. Examples thereof include neopentyl group, n-hexyl group, isohexyl group, n-heptyl group, 4,4-dimethylpentyl group, n-octyl group, 2,2,4-trimethylpentyl group, nonyl group, decyl group and the like. Not limited to these.
上記不飽和炭化水素基の炭素数は、化学式（１）で表される化合物の分子量を抑制する観点から、１〜１０であることが好ましく、１〜６であることがさらに好ましく、１〜４であることがさらに好ましい。 The number of carbon atoms of the unsaturated hydrocarbon group is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 4, from the viewpoint of suppressing the molecular weight of the compound represented by the chemical formula (1). Is more preferable.
不飽和炭化水素基の具体例としては、アリル基、アリール基、ベンジル基等が挙げられるが、これらに限定されない。 Specific examples of the unsaturated hydrocarbon group include, but are not limited to, an allyl group, an aryl group, a benzyl group and the like.
上記アシル基の炭素数としては、化学式（１）で表される化合物の分子量を抑制する観点から、１〜１０であることが好ましく、１〜６であることがさらに好ましく、１〜４であることがさらに好ましい。 The carbon number of the acyl group is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 4, from the viewpoint of suppressing the molecular weight of the compound represented by the chemical formula (1). Is even more preferable.
アシル基の具体例としては、アルデヒド基、アセチル基、エチルカルボニル基、ｎ−プロピルカルボニル基、イソプロピルカルボニル基、ｎ−ブチルカルボニル基、イソブチルカルボニル基、tert−ブチルカルボニル基、ｎ−ペンチルカルボニル基、イソペンチルカルボニル基、ネオペンチルカルボニル基、ｎ−ヘキシルカルボニル基、ｎ−ヘプチルカルボニル基、ｎ−オクチルカルボニル基、ｎ−ノニルカルボニル基、ｎ−デシルカルボニル基等の、置換基を有していないアシル基が挙げられる。 Specific examples of the acyl group include an aldehyde group, an acetyl group, an ethylcarbonyl group, an n-propylcarbonyl group, an isopropylcarbonyl group, an n-butylcarbonyl group, an isobutylcarbonyl group, a tert-butylcarbonyl group and an n-pentylcarbonyl group. An acyl having no substituent such as an isopentylcarbonyl group, a neopentylcarbonyl group, an n-hexylcarbonyl group, an n-heptylcarbonyl group, an n-octylcarbonyl group, an n-nonylcarbonyl group and an n-decylcarbonyl group. The group is mentioned.
本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤は、化学式（１）で表される化合物を一種類のみ含んでいてもよく、複数種類含んでいてもよい。 The ice recrystallization inhibitor according to the embodiment of the present invention may contain only one kind of the compound represented by the chemical formula (1), or may contain a plurality of kinds.
また、上記化合物は、天然由来の化合物であってもよく、合成品であってもよい。また、市販品であってもよい。上記化合物自体は公知であるため、上記化合物の取得方法は特に限定されるものではなく、合成する場合も、従来公知の有機合成の方法によることができる。一方、上記化合物がＩＲＩ活性を有することは、本発明者が初めて見出した知見である。 Further, the above-mentioned compound may be a naturally-derived compound or a synthetic product. Further, it may be a commercially available product. Since the compound itself is known, the method for obtaining the compound is not particularly limited, and the method for synthesizing the compound can also be a conventionally known organic synthesis method. On the other hand, it is the first finding by the present inventor that the above compound has IRI activity.
Ｒ１としては、上記化合物の分子量を小さくし、氷再結晶化抑制剤のＩＲＩ活性を高くしやすいため、水素または（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは０〜３の整数）であることが好ましい。 Since R 1 tends to reduce the molecular weight of the compound and increase the IRI activity of the ice recrystallization inhibitor, it may be hydrogen or (CH 2 ) n CH 3 (n is an integer of 0 to 3). preferable.
（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは０〜３の整数）としては、直鎖アルキル基がさらに好ましい。上記直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、またはブチル基が挙げられる。 As (CH 2 ) n CH 3 (n is an integer of 0 to 3), a linear alkyl group is more preferable. Examples of the linear alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, and a butyl group.
本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤は、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がアルデヒド基またはアリル基であり、Ｒ３がグルコースであり、化学式（１）中のＲ３−Ｏがα−１−Ｏグリコシド結合またはβ−１−Ｏグリコシド結合を有することが最も好ましい。 Ice recrystallisation inhibitor according to an embodiment of the present invention, R 1 is a methyl group, R 2 is an aldehyde group or an allyl group, R 3 is glucose, R 3 in formula (1) Most preferably, —O has an α-1-O glycoside bond or a β-1-O glycoside bond.
すなわち、化学式（１）中の非糖部が、バニリンおよびその誘導体、または、オイゲノールであることが最も好ましい。具体的には、下記化学式（２）で示される化合物もしくはその誘導体、または、下記化学式（３）で示される化合物であることが最も好ましい。上記バニリン誘導体としては例えば、バニリン酸、バニリルアルコール等が挙げられる。 That is, it is most preferable that the non-sugar portion in the chemical formula (1) is vanillin and a derivative thereof, or eugenol. Specifically, the compound represented by the following chemical formula (2) or a derivative thereof, or the compound represented by the following chemical formula (3) is most preferable. Examples of the vanillin derivative include vanillic acid and vanillyl alcohol.
上記構成であれば、実施例に示すように、氷再結晶化抑制剤が、特に優れたＩＲＩ活性を有する。また、Ｒ２がアルデヒド基であると、氷再結晶化抑制剤が特に優れた水溶性を示す。 With the above configuration, as shown in the examples, the ice recrystallization inhibitor has particularly excellent IRI activity. Further, when R 2 is an aldehyde group, the ice recrystallization inhibitor exhibits particularly excellent water solubility.
通常であれば、水が凍結した後、０℃以下の環境下であっても、前述したように、小粒径の氷結晶が粗大化する。その結果、上記水が、例えば冷凍保存中の細胞内の水である場合、冷凍保存中の生体組織内の水である場合等は、前述したように、粗大化した大粒径の氷の結晶によって、細胞、組織等の損傷が生じる。 Normally, after the water freezes, even in an environment of 0 ° C. or lower, as described above, ice crystals having a small particle size are coarsened. As a result, when the water is, for example, intracellular water during cryopreservation, water in living tissue during cryopreservation, etc., as described above, coarse-grained ice crystals having a large particle size are used. Causes damage to cells, tissues, etc.
一方、本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤は、上記化学式（１）で表される化合物が氷の再結晶化を抑制する有効成分として機能する。つまり、上記化合物は、タンパク質のような高分子ではなく、低分子であり、かつ、水溶性が高いため、細胞膜を透過しやすく、円滑に細胞内に取り込まれる。細胞内への取り込まれやすさという観点から、上記化合物の分子量は５００以下であることが好ましい。 On the other hand, in the ice recrystallization inhibitor according to the embodiment of the present invention, the compound represented by the above chemical formula (1) functions as an active ingredient for suppressing ice recrystallization. That is, since the above compound is not a polymer such as a protein but a small molecule and has high water solubility, it easily permeates the cell membrane and is smoothly taken up into the cell. From the viewpoint of easiness of being taken up into cells, the molecular weight of the above compound is preferably 500 or less.
そして、上記細胞、組織等が冷凍されると、細胞内に取り込まれた上記化合物、組織中の細胞内等に取り込まれた上記化合物は、当該細胞内外に存在する氷の表面を被覆し、当該氷の小粒径の結晶の粗大化を抑制するものと考えられる。 Then, when the cells, tissues, etc. are frozen, the compounds taken up into the cells, the compounds taken up into the cells, etc. in the tissues cover the surface of ice existing inside and outside the cells, and the said compound. It is considered to suppress the coarsening of crystals having a small particle size of ice.
本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤は、有効成分以外の成分を一種類以上含んでいても良い。当該有効成分以外の成分は、氷再結晶化抑制剤のＩＲＩ活性を阻害しない成分であれば特に限定されるものではない。例えば、従来公知の緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、賦形剤、担体、希釈剤、可溶化剤、安定剤、抗酸化剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、および、安定化剤を挙げることができる。 The ice recrystallization inhibitor according to one embodiment of the present invention may contain one or more kinds of components other than the active ingredient. The components other than the active ingredient are not particularly limited as long as they do not inhibit the IRI activity of the ice recrystallization inhibitor. For example, conventionally known buffers, pH regulators, tonicity agents, preservatives, excipients, carriers, diluents, solubilizers, stabilizers, antioxidants, fillers, binders, surfactants, etc. And a stabilizer can be mentioned.
本発明の一実施形態に係る再結晶化抑制剤に含まれる有効成分以外の成分の量は、特に限定されないが、好ましくは、再結晶化抑制剤全体を１００重量％とした場合に、１０重量％以下であることが好ましく、０重量％であってもよい。 The amount of the component other than the active ingredient contained in the recrystallization inhibitor according to the embodiment of the present invention is not particularly limited, but is preferably 10% by weight when the entire recrystallization inhibitor is 100% by weight. It is preferably% or less, and may be 0% by weight.
〔２．冷凍保存用液〕
本発明の一実施形態に係る冷凍保存用液は、本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤と、溶媒とを含有する。
[2. Freezing liquid]
The cryopreservation liquid according to one embodiment of the present invention contains an ice recrystallization inhibitor according to one embodiment of the present invention and a solvent.
上記構成によれば、上記氷再結晶化抑制剤が、細胞内外における氷の小粒径の結晶の粗大化を抑制するため、細胞、生体組織、臓器、生鮮食品、加工食品などの損傷および劣化を防止することができる。 According to the above configuration, the ice recrystallization inhibitor suppresses the coarsening of crystals having a small particle size of ice inside and outside the cells, so that damage and deterioration of cells, biological tissues, organs, fresh foods, processed foods, etc. Can be prevented.
本発明の一実施形態に係る冷凍保存用液は、本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤の濃度が２ｍＭ超であることが好ましく、３ｍＭ〜３０ｍＭであることがより好ましく、４ｍＭ〜２０ｍＭであることがさらに好ましく、５ｍＭ〜１０ｍＭであることが最も好ましい。 In the cryopreservation liquid according to the embodiment of the present invention, the concentration of the ice recrystallization inhibitor according to the embodiment of the present invention is preferably more than 2 mM, more preferably 3 mM to 30 mM, and 4 mM. It is more preferably ~ 20 mM, and most preferably 5 mM to 10 mM.
上記濃度が２ｍＭ以上であればＩＲＩ活性が高くなるため好ましく、上記濃度が３０ｍＭ以下であれば、細胞毒性を低減する上で好ましい。 When the concentration is 2 mM or more, the IRI activity is high, which is preferable, and when the concentration is 30 mM or less, it is preferable to reduce cytotoxicity.
上記溶媒としては、水、リン酸緩衝溶液、生理食塩水、細胞培養用の培地、組織培養用の培地、臓器の保存液等を挙げることができる。本発明の一実施形態に係る冷凍保存用液は、例えば、上記溶媒に、本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤の濃度が２ｍＭ超となるように添加し、混合することによって調製することができる。 Examples of the solvent include water, a phosphate buffer solution, physiological saline, a medium for cell culture, a medium for tissue culture, a preservation solution for organs, and the like. The cryopreservation liquid according to the embodiment of the present invention is, for example, added to the above solvent so that the concentration of the ice recrystallization inhibitor according to the embodiment of the present invention exceeds 2 mM, and mixed. Can be prepared.
上記冷凍保存用液は、細胞、生体組織、臓器または食品における氷の再結晶を抑制するために使用されることが好ましい。 The freezing solution is preferably used to suppress the recrystallization of ice in cells, biological tissues, organs or foods.
細胞としては、例えば、がん細胞、血球細胞、臓器細胞、骨細胞、皮膚細胞、生殖細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞等を用いることができる。生体組織としては、例えば、上皮組織、毛根、網膜等を用いることができる。臓器としては、例えば、心臓、肝臓、肺、膵臓、腎臓等を用いることができる。食品としては、例えば、冷凍生鮮食品、冷凍加工食品、アイスクリーム、氷菓子等を用いることができる。 As the cells, for example, cancer cells, blood cells, organ cells, bone cells, skin cells, germ cells, embryonic stem cells, iPS cells and the like can be used. As the biological tissue, for example, epithelial tissue, hair root, retina and the like can be used. As the organ, for example, the heart, liver, lungs, pancreas, kidneys and the like can be used. As the food, for example, frozen fresh food, frozen processed food, ice cream, ice confectionery and the like can be used.
上記冷凍保存用液を、例えば細胞または生体組織の冷凍保存に用いるのであれば、細胞培養用の培地または組織培養用の培地を溶媒として調製した上記冷凍保存用液に細胞または生体組織を必要量添加し、所望の温度にて冷凍することにより、細胞または生体組織における氷の再結晶化を抑制することができる。 If the cryopreservation solution is used, for example, for cryopreservation of cells or living tissue, a required amount of cells or biological tissue is added to the cryopreservation solution prepared using a medium for cell culture or a medium for tissue culture as a solvent. By adding and freezing at a desired temperature, recrystallization of ice in cells or living tissues can be suppressed.
また、上記冷凍保存用液を、例えば臓器の冷凍保存に用いるのであれば、臓器の保存液を溶媒として調製した上記冷凍保存用液に臓器を浸漬し、所望の温度にて冷凍することにより、臓器における氷の再結晶化を抑制することができる。 If the cryopreservation solution is used, for example, for the cryopreservation of an organ, the organ is immersed in the cryopreservation solution prepared using the organ preservation solution as a solvent and frozen at a desired temperature. It can suppress the recrystallization of ice in organs.
上記冷凍保存用液を、例えば食品の保存に用いるのであれば、水を溶媒として調製した上記冷凍保存用液を食品に注入、または、上記冷凍保存用液に食品を浸漬し、所望の温度にて冷凍することにより、食品における氷の再結晶化を抑制することができる。 If the freezing storage solution is used for storing food, for example, the freezing storage solution prepared by using water as a solvent is injected into the food, or the food is immersed in the freezing storage solution to a desired temperature. By freezing, it is possible to suppress the recrystallization of ice in food.
このように、本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤を、上記溶媒と混合することによって上記冷凍保存用液を調製する工程と、上記冷凍保存用液に冷凍保存の対象を添加もしくは浸漬する工程、または上記冷凍保存用液を冷凍保存の対象に注入する工程と、を備えることにより、冷凍保存の対象における氷の再結晶化を抑制することができる。 As described above, the step of preparing the above-mentioned freezing storage liquid by mixing the ice recrystallization inhibitor according to the embodiment of the present invention with the above-mentioned solvent, and the addition of the object of freezing storage to the above-mentioned freezing storage liquid. Alternatively, by providing a step of immersing or a step of injecting the above-mentioned freezing storage liquid into the target of freezing storage, recrystallization of ice in the target of frozen storage can be suppressed.
なお、上記冷凍保存用液を冷凍して氷とし、冷凍対象が浸漬されている溶液に当該氷を加えてもよく、既に冷凍されている対象に上記冷凍保存用液または氷を添加してもよい。効率的に氷の再結晶化を抑制する観点から、対象が冷凍される前に上記冷凍保存用液を添加等することが好ましい。 The frozen storage liquid may be frozen to make ice, and the ice may be added to the solution in which the frozen object is immersed, or the frozen storage liquid or ice may be added to the already frozen object. good. From the viewpoint of efficiently suppressing the recrystallization of ice, it is preferable to add the above-mentioned freezing storage solution before the subject is frozen.
上記冷凍保存用液は、〔１．氷再結晶化抑制剤〕で記載した有効成分以外の成分に加えて、さらに凍結保護剤を含んでいてもよい。上記冷凍保存用液における凍結保護剤の含有量は、本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤および上記凍結保護剤全体の重量を１００重量％としたときに、５重量％以上１０重量％以下であることが好ましい。 The above-mentioned freezing storage liquid is [1. In addition to the components other than the active ingredient described in [Ice Recrystallization Inhibitor], a freeze-protecting agent may be further contained. The content of the freeze-protecting agent in the above-mentioned freezing storage liquid is 5% by weight or more when the total weight of the ice recrystallization inhibitor and the above-mentioned freeze-protecting agent according to the embodiment of the present invention is 100% by weight. It is preferably 0% by weight or less.
上記凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、デキストラン、トレハロース等が挙げられる。 Examples of the cryoprotectant include dimethyl sulfoxide, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerol, polyvinylpyrrolidone, sorbitol, dextran, trehalose and the like.
〔４．氷再結晶化抑制剤の製造方法〕
上記氷再結晶化抑制剤の製造方法は、上記化学式（１）で表される化合物自体は、前述したように公知であるため、特に限定されるものではない。例えば、上記氷再結晶化抑制剤は、糖類と、芳香族化合物とを反応させること等により得られる。
[4. Manufacturing method of ice recrystallization inhibitor]
The method for producing the ice recrystallization inhibitor is not particularly limited because the compound represented by the chemical formula (1) itself is known as described above. For example, the ice recrystallization inhibitor can be obtained by reacting a saccharide with an aromatic compound or the like.
例えば、上記化学式（２）で表される化合物は、具体的には以下の方法により合成され得る。まず、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−グルコピラノシルブロマイド（１．３４ｇ ３．２８ｍｍｏｌ）を、アセトン等の有機溶媒に溶解し、水酸化リチウムの水溶液等に溶解させたバニリンを加えて、室温で撹拌する。次いで有機溶媒をエバポレータにより除去した後、水を加える。ジクロロメタンにて抽出を行い、有機層を回収した後、水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、さらに水でｐＨが中性になるまで洗浄をする。 For example, the compound represented by the above chemical formula (2) can be specifically synthesized by the following method. First, 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-glucopyranosyl bromide (1.34 g, 3.28 mmol) is dissolved in an organic solvent such as acetone, and then dissolved in an aqueous solution of lithium hydroxide or the like. Add the soaked vanillin and stir at room temperature. Then, after removing the organic solvent by an evaporator, water is added. Extraction is performed with dichloromethane, the organic layer is recovered, washed with an aqueous solution of sodium hydroxide, and further washed with water until the pH becomes neutral.
洗浄後、硫酸マグネシウム等で乾燥させ、溶媒を減圧留去して残渣を得る。得られた残渣を有機溶媒中で再結晶することで、前駆体化合物が得られる。得られた前駆体化合物を、メタノールに溶解し、ナトリウムメトキシドを加え、室温で撹拌する。反応が完了後、プロトン型陽イオン交換樹脂を通過させて中和し、エバポレータで溶媒を減圧留去する。残渣を少量の水に溶解させて冷凍乾燥させることで、前述した化学式（２）で表される配糖体（実施例で後述する化合物１）が得られる。
After washing, it is dried over magnesium sulfate or the like, and the solvent is distilled off under reduced pressure to obtain a residue. A precursor compound is obtained by recrystallizing the obtained residue in an organic solvent. The obtained precursor compound is dissolved in methanol, sodium methoxide is added, and the mixture is stirred at room temperature. After the reaction is completed, the solvent is neutralized by passing through a proton type cation exchange resin, and the solvent is distilled off under reduced pressure with an evaporator. By dissolving the residue in a small amount of water and freeze-drying, a glycoside represented by the above-mentioned chemical formula (2) (
上記有機溶媒としては、アセトン、ベンゼン等を用いることができる。上記水溶液としては、水酸化リチウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液等を用いることができる。撹拌の反応時間は、好ましくは５時間〜３０時間、より好ましくは１０時間〜２０時間である。 As the organic solvent, acetone, benzene and the like can be used. As the aqueous solution, a lithium hydroxide aqueous solution, a sodium hydroxide aqueous solution, or the like can be used. The reaction time of stirring is preferably 5 hours to 30 hours, more preferably 10 hours to 20 hours.
上記氷再結晶化抑制剤の製造方法としては、糖類と芳香族化合物との反応を、酵素を用いて進行させる方法（酵素法）を挙げることもできる。 As a method for producing the above-mentioned ice recrystallization inhibitor, a method (enzymatic method) in which the reaction between a saccharide and an aromatic compound is allowed to proceed using an enzyme can also be mentioned.
上記化学式（２）の化合物を酵素法により製造する場合を例に取ると、例えば以下の方法を挙げることができる。すなわち、スクロースを緩衝液等に溶解し、有機溶媒に溶解させたバニリンを加えて、室温でよく撹拌する。撹拌終了後、酵素を添加し、バニリンのフェノール性ヒドロキシ基の部分に対して、糖転移反応を行う。反応終了後、反応液を凍結乾燥して得られた残渣に酢酸エチルを加えて抽出を行い、回収した有機層に対してさらに水で抽出を行う。水層を凍結乾燥させることにより、前述した化学式（２）で表される配糖体（実施例で後述する化合物１）が得られる。
Taking the case where the compound of the above chemical formula (2) is produced by an enzymatic method as an example, the following method can be mentioned, for example. That is, sucrose is dissolved in a buffer solution or the like, vanillin dissolved in an organic solvent is added, and the mixture is well stirred at room temperature. After the stirring is completed, an enzyme is added and a glycosyl transfer reaction is carried out with respect to the phenolic hydroxy group portion of vanillin. After completion of the reaction, ethyl acetate is added to the residue obtained by freeze-drying the reaction solution for extraction, and the recovered organic layer is further extracted with water. By freeze-drying the aqueous layer, a glycoside represented by the above-mentioned chemical formula (2) (
上記酵素法において使用する原料は安価なスクロース（糖）およびバニリンであり、かつ１段階の反応により上記有効成分を製造できるため、上述した２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−グルコピラノシルブロマイドを用いる方法に比べて安価である。 Since the raw materials used in the above enzymatic method are inexpensive sucrose (sugar) and vanillin, and the above active ingredient can be produced by a one-step reaction, the above-mentioned 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α -It is cheaper than the method using glucopyranosyl bromide.
バニリンを溶解させる有機溶媒としては、ＤＭＳＯ及びエタノール等の水溶性有機溶媒または、酢酸エチル等の非水溶性有機溶媒が挙げられる。 Examples of the organic solvent for dissolving vanillin include water-soluble organic solvents such as DMSO and ethanol, and water-insoluble organic solvents such as ethyl acetate.
酵素法において使用可能な酵素としては、糖転移反応が可能な酵素であれば特に限定されないが、フェノール性水酸基へ糖を転移させる酵素が好ましく、そのような酵素としては例えばスクロースホスホリラーゼ、転移型α−アミラーゼ、及びハイドロキノン配糖化酵素等が挙げられる。 The enzyme that can be used in the enzymatic method is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of a glycosyl transfer reaction, but an enzyme that transfers a sugar to a phenolic hydroxyl group is preferable, and such an enzyme is, for example, sucrose phosphorylase or a transfer type α. -Amylase, hydroquinone saccharifying enzyme and the like can be mentioned.
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the embodiments obtained by appropriately combining the technical means disclosed in the different embodiments. Is also included in the technical scope of the present invention.
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to the following examples.
［ＩＲＩ活性の測定］
ＩＲＩ活性は、文献Charles A. Knight, John Hallett, A. L. DeVries (1988), Solute effects on ice recrystallization: An assessment technique, Cryobiology, 25 (1), 55-60に基づき、スプラットアッセイ法により測定した。
[Measurement of IRI activity]
IRI activity was measured by the splat assay method based on the literature Charles A. Knight, John Hallett, AL DeVries (1988), Solute effects on ice recrystallization: An assessment technique, Cryobiology, 25 (1), 55-60.
まず、円形のスライドガラスを、光学機器用冷却加熱ステージ（リンカム社製）にセットし、−８０℃に冷却した。次に、ＰＢＳ（ＮａＣｌ：０．９％（ｗ／ｖ）、ＫＣｌ：０．０２％（ｗ／ｖ）、ＮａＨ２ＰＯ４：０．０２％（ｗ／ｖ）、Ｎａ２ＨＰＯ４：０．１１５％（ｗ／ｖ））に溶解させた試料１０μＬを、空のカラムを用いて、１．２ｍの高さからスライドガラスに滴下し、氷ウェハを作製した。 First, a circular slide glass was set on a cooling / heating stage for optical instruments (manufactured by Rinkamu) and cooled to −80 ° C. Next, PBS (NaCl: 0.9% (w / v), KCl: 0.02% (w / v), NaH 2 PO 4 : 0.02% (w / v), Na 2 HPO 4 : 0. An ice wafer was prepared by dropping 10 μL of a sample dissolved in .115% (w / v)) onto a slide glass from a height of 1.2 m using an empty column.
なお、前記試料は、溶質として、後述するパラメトキシ−フェニルグリコシド（ＰＭＰＧｌｃ）、化合物１、化合物２を用い、後述する試験１、試験２では、濃度は２２ｍＭとした。対照としてはＰＢＳのみを用いた。後述する試験３では、化合物１の濃度を、図３の横軸に示すように種々の濃度とした。
The sample used paramethoxy-phenylglycoside (PMPGlc),
その後、即座に装置の蓋を閉め、−６．５℃に急速昇温しつつ、顕微鏡観察下に氷ウェハを置いた。−６．５℃に達した時点を０ｍｉｎとして、ストップウォッチで測定し、１、１０、２０、３０分時点での氷結晶をカメラで一度撮影した。結晶径は、撮影した画像内の結晶を大きいものから１０個選択して、それらの長径のｐｉｘｅｌ数と、直径に対して垂直な短径のｐｉｘｅｌ数とを、画像編集ソフト（Adobe photoshop）によって計測した。ｐｉｘｅｌ数を上記画像編集ソフトによってμｍに変換した後、それらの平均値をとり、その値を平均最大粒子径（Mean Largest Grain Size, ＭＬＧＳ）とした。 Immediately after that, the lid of the device was closed, and the ice wafer was placed under microscopic observation while rapidly raising the temperature to −6.5 ° C. The time when the temperature reached −6.5 ° C. was set to 0 min, the measurement was performed with a stopwatch, and the ice crystals at 1, 10, 20, and 30 minutes were photographed once with a camera. For the crystal diameter, select 10 crystals in the captured image from the largest ones, and use image editing software (Adobe photoshop) to determine the number of fixels with the major axis and the number of fixels with the minor axis perpendicular to the diameter. I measured it. After converting the number of pixels to μm by the above image editing software, the average value thereof was taken, and the value was taken as the average maximum particle size (Mean Largest Grain Size, MLGS).
［細胞凍結保護試験］
馬由来脱繊維血（コージンバイオ製）を１５ｍＬファルコンチューブに３ｍＬ入れ、遠心分離機（ｈｉｍａｃ ＣＦ１６ＲＸ（ＨＩＴＡＣＨＩ製）、ローター（Ｔ１１Ａ２１））を用いて、遠心分離（３３００ｇ １０ｍｉｎ ４℃）した。
[Cell freeze protection test]
3 mL of horse-derived defibrotic blood (manufactured by Kojin Bio) was placed in a 15 mL falcon tube and centrifuged (3300 g, 10 min, 4 ° C.) using a centrifuge (himac CF16RX (manufactured by Hitachi, T11A21)).
上清をピペッティングにて除き、ペレットにＰＢＳ（ＮａＣｌ：０．９％（ｗ／ｖ）、ＫＣｌ：０．０２％（ｗ／ｖ）、ＮａＨ２ＰＯ４：０．０２％（ｗ／ｖ）、Ｎａ２ＨＰＯ４：０．１１５％（ｗ／ｖ）、赤血球の洗浄および懸濁に用いる場合はさらにデキストロース：０．２％（ｗ／ｖ））を加え、撹拌して洗浄した。 The supernatant was removed by pipetting, and PBS (NaCl: 0.9% (w / v), KCl: 0.02% (w / v), NaH 2 PO 4 : 0.02% (w / v)) was added to the pellets. ), Na 2 HPO 4 : 0.115% (w / v), and if used for washing and suspending erythrocytes, further dextrose: 0.2% (w / v)) was added, and the mixture was washed with stirring.
洗浄を２回行った後、ペレットをＰＢＳに懸濁して３ｍＬとした溶液を、ＲＢＣ液とした。冷凍保存用液は、試験を行う化合物１と、凍結保護剤であるグリセロールとをＰＢＳに溶解させて作製した。冷凍保存用液における化合物１の濃度は、１．４ｍＭ、２．８ｍＭ、５．５ｍＭ、１１ｍＭ、２２ｍＭとし、各冷凍保存用液にグリセロールを７．５重量％含有させた。冷凍保存用液の対照としては、化合物１を含有せず、グリセロールのみをＰＢＳに７．５重量％または１０．０重量％含有させた液を用いた。また、冷凍保存用液を加えず、ＲＢＣ液のみを用いた試験区も設けた。
After washing twice, the pellet was suspended in PBS to make 3 mL, which was used as an RBC solution. The freezing storage solution was prepared by dissolving
ＲＢＣ液１５０μＬと、各冷凍保存用液１５０μＬとを１．５ｍＬエッペンチューブ中で混和した溶液を、１０分室温で静置した。 A solution prepared by mixing 150 μL of RBC solution and 150 μL of each freezing storage solution in a 1.5 mL Eppen tube was allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
静置後、撹拌して、ローター（Ｔ１５ＡＰ２１）を用いて遠心分離（３３００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃）した。その後、上清のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度を血液検査用ヘモグロビンキット（ヘモグロビンＢ−テストワコー、富士フィルム和光純薬）を用いて定量した。 After standing, the mixture was stirred and centrifuged (3300 × g, 5 min, 4 ° C.) using a rotor (T15AP21). Then, the hemoglobin (Hb) concentration in the supernatant was quantified using a hemoglobin kit for blood test (hemoglobin B-test Wako, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
定量後、溶液を攪拌して、全血のＨｂ濃度を定量し、凍結前の溶血度および赤血球残存度を下記式（４）によって算出した。 After quantification, the solution was stirred to quantify the Hb concentration of whole blood, and the degree of hemolysis before freezing and the degree of erythrocyte residual were calculated by the following formula (4).
さらに溶液の入ったエッペンチューブを液体窒素によって急速冷凍後、−８０℃のディープフリーザー中で保存した。一週間後、３７℃の湯浴にて急速解凍し、凍結前と同様にして、解凍後の溶結度および赤血球残存度を、下記式（５）によって算出した。 Further, the Eppen tube containing the solution was rapidly frozen in liquid nitrogen and then stored in a deep freezer at −80 ° C. One week later, the cells were rapidly thawed in a hot water bath at 37 ° C., and the degree of solubility and the degree of erythrocyte residual after thawing were calculated by the following formula (5) in the same manner as before freezing.
［化合物１の合成］
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−グルコピラノシルブロマイド（１．３４ｇ ３．２８ｍｍｏｌ）をアセトン４０ｍＬに溶解し、水酸化リチウム水溶液（０．２１ｇ ８．９ｍｍｏｌ）に溶解したバニリン（１．５ｇ ９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。
[Synthesis of compound 1]
2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-glucopyranosyl bromide (1.34 g 3.28 mmol) is dissolved in 40 mL of acetone and dissolved in an aqueous solution of lithium hydroxide (0.21 g 8.9 mmol). Vanillin (1.5 g, 9.9 mmol) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
ＴＬＣで反応を確認した後、エバポレータでアセトンを減圧留去し、水５ｍＬを加えた。ジクロロメタン３０ｍＬで３回抽出を行い、有機層を回収した後、１０％水酸化ナトリウム水溶液３０ｍＬで３回洗浄し、水３０ｍＬでｐＨが７になるまで洗浄した。 After confirming the reaction by TLC, acetone was distilled off under reduced pressure with an evaporator, and 5 mL of water was added. Extraction was performed 3 times with 30 mL of dichloromethane, the organic layer was recovered, washed 3 times with 30 mL of a 10% aqueous sodium hydroxide solution, and washed with 30 mL of water until the pH reached 7.
硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を２−プロパノール１０ｍＬ中で再結晶し、下記化学式（６）で表される、化合物Ｐ１（０．９９７２ｇ ６０．２％）を無色結晶として得た。化合物Ｐ１は、４−ホルミル‐２−メトキシフェニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル‐β−Ｄ−グルコピラノシドである。 After drying over magnesium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure. The obtained residue was recrystallized in 10 mL of 2-propanol to obtain compound P1 (0.9972 g 60.2%) represented by the following chemical formula (6) as colorless crystals. Compound P1 is 4-formyl-2-methoxyphenyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside.
化合物Ｐ１のＮＭＲによる同定結果を以下に示す。 The results of NMR identification of compound P1 are shown below.
１Ｈ ＮＭＲδ（ＣＤＣｌ３）：９．９０ （１Ｈ,ｓ）,７．４４−７．４１（２Ｈ,ｍ）,７．２２（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８．０Ｈｚ）,５．３５−５．２９（２Ｈ,ｍ）,５.２１‐５．１６（１Ｈ,ｍ）,５．１２−５．１０（１Ｈ,ｍ）,４．２８ （１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝１２．４, ５．１ Ｈｚ）,４．１９（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ ＝１２．３,２．４Ｈｚ）,３．８９（３Ｈ，ｓ）,３．８７−３．８３（１Ｈ,ｍ）,２．０８（３Ｈ,ｓ）,２．０７（３Ｈ,ｓ）,２．０５（３Ｈ,ｓ）,２．０５（３Ｈ,ｓ）
１３Ｃ ＮＭＲδ（ＣＤＣｌ３）：１９０．８４,１７０．４８,１７０．２０,１６９．３７,１６９．２２,１５１．１４, １５１．０７,１３２．９０,１２５．３２,１１８．３０,１１０．９３,９９．７７,７２．４５,７２．３２,７１．１０,６８．３３,６１．９３,５６．１５,２０．６７,２０．５９
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ ｍ/ｚ：ｃａｌｃｄ.ｆｏｒ：Ｃ２２Ｈ２６ＮａＯ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋ ５０５.１３１６ ｏｂｓｄ.ｆｏｒ：（Ｍ＋Ｎａ）＋ ５０５．１２２８
なお、ＮＭＲの帰属は、文献Shusheng Wang, Dan Liu, Xu Zhang, Shengyu Li, Yongxu
Sun, Jia Li, Yifa Zhoua, and Liping Zhanga (2007), Study on glycosylated prodrugs of toxoflavins for antibody-directed enzyme tumor therapy, Carbohydrate Research, 342, 1254-1260、および、Shiqiang Yan Sumei Ren Ning Ding Yingxia Li (2018),
Concise total synthesis of acylated phenolic glycosides vitexnegheteroin A and ovatoside D, Carbohydrate Research, 460, 41-46を参照した。
1 H NMR δ (CDCl 3 ): 9.90 (1H, s), 7.44-7.41 (2H, m), 7.22 (1H, dd, J = 8.0Hz), 5.35-5. .29 (2H, m), 5.21-5.16 (1H, m), 5.12-5.10 (1H, m), 4.28 (1H, dd, J = 12.4, 5. 1 Hz), 4.19 (1H, dd, J = 12.3, 2.4 Hz), 3.89 (3H, s), 3.87-3.83 (1H, m), 2.08 (3H) , S), 2.07 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.05 (3H, s)
13 C NMRδ (CDCl3): 190.84,170.48,170.20,169.37,169.22,151.14, 151.07,132.90,125.32,118.30,110.93 , 99.77,72.45,72.32,71.10,68.33,61.93,56.15,20.67,20.59
ESI-HRMS m / z: calcd.for: C 22 H 26 NaO 12 (M + Na) + 505.1316 obsd.for: (M + Na) + 505.1228
The attribution of NMR is the literature Shusheng Wang, Dan Liu, Xu Zhang, Shengyu Li, Yongxu.
Sun, Jia Li, Yifa Zhoua, and Liping Zhanga (2007), Study on glycosylated prodrugs of toxoflavins for antibody-directed enzyme tumor therapy, Carbohydrate Research, 342, 1254-1260, and Shiqiang Yan Sumei Ren Ning Ding Yingxia Li (2018) ),,
See Concise total synthesis of acylated phenolic glycosides vitexnegheteroin A and ovatoside D, Carbohydrate Research, 460, 41-46.
Ｐ１（２４１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍＬに溶解し、ナトリウムメトキシド（１０８ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を加え、ＴＬＣで反応完了を確認するまで室温で撹拌した。反応が完了した後、プロトン型陽イオン交換樹脂を通過させて中和し、エバポレータで溶媒を減圧留去した。残渣を少量の水に溶解させて冷凍乾燥し、下記化学式（２）で表される、化合物１を白色粉体（１４５．６ｍｇ、９２．７％）として得た。化合物１は、４−ホルミル‐２−メトキシフェニル−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
P1 (241 mg, 0.5 mmol) was dissolved in 20 mL of methanol, sodium methoxide (108 mg, 2 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature until the reaction was confirmed to be completed by TLC. After the reaction was completed, it was neutralized by passing it through a proton type cation exchange resin, and the solvent was distilled off under reduced pressure with an evaporator. The residue was dissolved in a small amount of water and freeze-dried to obtain
また、化合物１は酵素法によっても製造した。具体的には、以下の方法による。スクロース（１．０ｇ）を０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍＬに溶解させて得た溶液に、バニリンのＤＭＳＯ溶液（バニリンの濃度は１００ｍｇ／ｍＬ）を０．２０ｍＬ加えて、よく攪拌した。撹拌終了後、スクロースホスホリラーゼ（ロイコノストック メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来、オリエンタル酵母）の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液溶液（５００units／ｍＬ）を０．１ｍＬ加えて、４２℃で２４時間反応させ、反応液を得た。反応液を凍結乾燥後、得られた残渣に３ｍＬの水と３ｍＬの酢酸エチルを加えて混合し、水層と酢酸エチル層とを分離した。水層はさらに、２回、酢酸エチル（各１ｍＬ）によって抽出した。抽出した酢酸エチル層を収集した後、水（３ｍＬ）によって３回抽出した。抽出終了後に水層を凍結乾燥させて、上記化学式（２）で表される、化合物１を白色粉体（１５．９ｍｇ、３８．６％）として得た。
化合物１のＮＭＲによる同定結果を以下に示す。
The results of the identification of
１Ｈ ＮＭＲδ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．８４（１Ｈ,ｓ）,７．５１（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８．３,１.７Ｈｚ）,７．４２（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝１．５Ｈｚ）,７．２６（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝８．５Ｈz）,５．３６（１Ｈ,ｄ, Ｊ＝３．２Ｈｚ）,５．１３（１Ｈ,ｓ）,５．０７（２Ｈ,ｍ）,４．５８（１Ｈ,ｔ,Ｊ＝５．１Ｈｚ）,３．８３（３Ｈ,ｓ）,３．６６（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝１１．７,２．４ Ｈｚ）,３．２９−３．２４（２Ｈ, ｍ）,３．１８‐３．１６（１Ｈ,ｍ）
１３ＣＮＭＲδ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１９２．３０,１５２．４４,１５０．０２,１３１．２５,１２６．０３,１１５．３０,１１１．３１,１００．１３,７７．８２,７７．４９,７３．７９，７０．２７,６１．３１,５６．３９
ＥＳＩ−ＨＲＭＳｍ/ｚ：ｃａｌｃｄ.ｆｏｒ：Ｃ１５Ｈ１９Ｏ１０（Ｍ＋ＨＣＯＯ）−３５９.０９８４ ｏｂｓｄ.ｆｏｒ：（Ｍ＋ＨＣＯＯ）−３５９．０９８９
なお、ＮＭＲの帰属は化合物Ｐ１と同じ文献を参照した。
1 H NMR δ (DMSO-d 6 ): 9.84 (1H, s), 7.51 (1H, dd, J = 8.3, 1.7 Hz), 7.42 (1H, d, J = 1. 5Hz), 7.26 (1H, d, J = 8.5Hz), 5.36 (1H, d, J = 3.2Hz), 5.13 (1H, s), 5.07 (2H, m) , 4.58 (1H, t, J = 5.1Hz), 3.83 (3H, s), 3.66 (1H, dd, J = 11.7, 2.4Hz), 3.29-3 .24 (2H, m), 3.18-3.16 (1H, m)
13 CNMRδ (DMSO-d 6 ): 192.30,152.44,150.02,131.25,126.03,115.30,111.31,100.13,77.82,77.49,73 .79, 70.27, 61.31, 56.39
ESI-HRMSm / z: calcd.for: C 15 H 19 O 10 (M + HCOO) - 359.0984 obsd.for: (M + HCOO) - 359.0989
For the attribution of NMR, refer to the same document as compound P1.
［化合物２の合成］
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−グルコピラノシルブロマイド（６１７ｍｇ,１．５ｍｍｏｌ）をアセトン２０ｍＬに溶解し、水酸化リチウム水溶液（１７０ｍｇ
４．０５ｍｍｏｌ／５ｍＬ−Ｈ２Ｏ）に溶解したオイゲノール（７３９ｍｇ ４．５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で一晩撹拌した。
[Synthesis of compound 2]
2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-glucopyranosyl bromide (617 mg, 1.5 mmol) was dissolved in 20 mL of acetone, and an aqueous solution of lithium hydroxide (170 mg) was dissolved.
Eugenol (739 mg 4.5 mmol) dissolved in 4.05 mmol / 5 mL-H 2 O) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature.
ＴＬＣで反応を確認した後、エバポレータでアセトンを減圧留去したのちに水１０ｍＬを加えた。クロロホルム３０ｍＬで３回抽出を行い、有機層を回収した後、１０％水酸化ナトリウム水溶液３０ｍＬで３回洗浄し、水３０ｍＬでｐＨが７になるまで洗浄した。 After confirming the reaction by TLC, acetone was distilled off under reduced pressure with an evaporator, and then 10 mL of water was added. Extraction was performed 3 times with 30 mL of chloroform, the organic layer was recovered, washed 3 times with 30 mL of a 10% sodium hydroxide aqueous solution, and washed with 30 mL of water until the pH reached 7.
硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を２−プロパノール１０ｍＬ中で再結晶し、下記化学式（７）で表される、化合物Ｐ２（１５９ｍｇ，２１．５％）を無色結晶として得た。化合物Ｐ２は、４−アリル‐２−メトキシフェニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル‐β−Ｄ−グルコピラノシドである。 After drying over magnesium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure. The obtained residue was recrystallized in 10 mL of 2-propanol to obtain compound P2 (159 mg, 21.5%) represented by the following chemical formula (7) as colorless crystals. Compound P2 is 4-allyl-2-methoxyphenyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside.
化合物Ｐ２のＮＭＲによる同定結果を以下に示す。 The results of NMR identification of compound P2 are shown below.
１Ｈ ＮＭＲδ（ＣＤＣｌ３）：７．０４（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝８．０Ｈｚ）,６．７２（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝２．０Ｈｚ）,６．６９（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８．３,１．９Ｈｚ）,５．９４（１Ｈ,ｍ）,５．３０−５．２３（２Ｈ,ｍ）,５．２０−５．１３（１Ｈ,ｍ）,５．１１−５．０６（２Ｈ,ｍ），４．９４−４．８９（１Ｈ,ｍ）,４．２８（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝１２．２,５．１Ｈｚ）,４．１６（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝１２．２,２．４Ｈｚ）,３．８０（３Ｈ,ｓ）,３．７７−３．７２（１Ｈ,ｍ）,３．３４（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝６．６Ｈｚ）,２．０８（６Ｈ,ｓ）,２．０３（６Ｈ,ｓ）
ＥＳＩ−ＨＲＭＳｍ/ｚ：ｃａｌｃｄ.ｆｏｒ：Ｃ２４Ｈ３０ＮａＯ１１（Ｍ＋Ｎａ）＋
５１７.１６８０ ｏｂｓｄ.ｆｏｒ：（Ｍ＋Ｎａ）＋ ５１７．１５７０
なお、ＮＭＲの帰属は文献Thiago Belarmino de SouzaMarina OrlandiLuiz Felipe Leomil CoelhoLuiz Cosme Cotta MalaquiasAmanda Latercia Tranches DiasRoberta Ribeiro
de CarvalhoNaiara Chaves SilvaDiogo Teixeira Carvalho (2014), Synthesis and in vitro evaluation of antifungal and cytotoxic activities of eugenol glycosides, Medicinal Chemistry Research, 23, 496-502を参照した。
1 H NMR δ (CDCl 3 ): 7.04 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.72 (1H, d, J = 2.0 Hz), 6.69 (1H, dd, J = 8. 3,1.9Hz), 5.94 (1H, m), 5.30-5.23 (2H, m), 5.20-5.13 (1H, m), 5.11-5.06 ( 2H, m), 4.94-4.89 (1H, m), 4.28 (1H, dd, J = 12.2, 5.1Hz), 4.16 (1H, dd, J = 12.2) , 2.4Hz), 3.80 (3H, s), 3.77-3.72 (1H, m), 3.34 (2H, d, J = 6.6Hz), 2.08 (6H, s) ), 2.03 (6H, s)
ESI-HRMSm / z: calcd.for: C 24 H 30 NaO 11 (M + Na) +
517.1680 obsd.for: (M + Na) + 517.1570
The attribution of NMR is the literature Thiago Belarmino de SouzaMarina OrlandiLuiz Felipe Leomil CoelhoLuiz Cosme Cotta MalaquiasAmanda Latercia Tranches Dias Roberta Ribeiro
See de CarvalhoNaiara Chaves SilvaDiogo Teixeira Carvalho (2014), Synthesis and in vitro evaluation of antifungal and cytotoxic activities of eugenol glycosides, Medicinal Chemistry Research, 23, 496-502.
Ｐ２（１４６ｍｇ ０．３ｍｍｏｌ）をメタノール１２ｍＬに溶解し、ナトリウムメトキシド（６４．８ｍｇ １．２ｍｍｏｌ）を加え、ＴＬＣで反応完了を確認するまで室温で撹拌した。 P2 (146 mg 0.3 mmol) was dissolved in 12 mL of methanol, sodium methoxide (64.8 mg 1.2 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature until the reaction was confirmed to be completed by TLC.
反応が完了した後、プロトン型陽イオン交換樹脂を通過させて中和し、エバポレータで溶媒を減圧留去した。残渣を少量の水に溶解させて冷凍乾燥し、下記化学式（３）で表される化合物２を白色粉体（９０．４ｍｇ，９２．４％）として得た。化合物２は、４−アリル‐２−メトキシフェニル−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
After the reaction was completed, it was neutralized by passing it through a proton type cation exchange resin, and the solvent was distilled off under reduced pressure with an evaporator. The residue was dissolved in a small amount of water and freeze-dried to obtain
化合物２のＮＭＲによる同定結果を以下に示す。
The results of the identification of
１Ｈ ＮＭＲδ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．０６（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝８．１Ｈｚ）,６．８６（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝１．５Ｈｚ）,６．７３（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝８．２,１．１Ｈｚ）,６．０４（１Ｈ,ｄｄｔ,Ｊ＝１６．０,１０．０,６．８Ｈｚ）,５．２４（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝４．２Ｈｚ）,５．１６−５．０７（３Ｈ,ｍ）,５．０４（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝４．９Ｈｚ）,４．９０（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝７．１Ｈｚ）,４．５７（１Ｈ，ｓ）,３．８０（３Ｈ,ｓ）,３．７２（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝１１．１Ｈｚ）,３．５２−３.２８（１Ｈ,ｍ）,３．３６（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝７．１Ｈｚ）,３．３２−３．３０（２Ｈ,ｍ）,３．２４−３．２０（１Ｈ,ｍ）
１３Ｃ ＮＭＲδ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１４８．９６,１４４．９２,１３７．９３,１３３．６２,１２０．４１,１１５．６９,１１５．６０,１１３．０８,１００．３９,７７．００.７６．８７,７３．３１,６９．８０,６０．７７,５５．７５
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ ｍ/ｚ：ｃａｌｃｄ.ｆｏｒ：Ｃ１７Ｈ２３Ｏ９（Ｍ＋ＨＣＯＯ）−３７１．１３４８ ｏｂｓｄ.ｆｏｒ：（Ｍ＋ＨＣＯＯ）−３７１．１３４７
なお、ＮＭＲの帰属は、化合物Ｐ２と同じ文献を参照した。
1 H NMR δ (DMSO-d 6 ): 7.06 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.86 (1H, d, J = 1.5 Hz), 6.73 (1H, dd, J = 8.2,1.1Hz), 6.04 (1H, ddt, J = 16.0, 10.0, 6.8Hz), 5.24 (1H, d, J = 4.2Hz), 5.16 -5.07 (3H, m), 5.04 (1H, d, J = 4.9Hz), 4.90 (1H, d, J = 7.1Hz), 4.57 (1H, s), 3 .80 (3H, s), 3.72 (1H, d, J = 11.1Hz), 3.52-3.28 (1H, m), 3.36 (1H, d, J = 7.1Hz) , 3.32-3.30 (2H, m), 3.24-3.20 (1H, m)
13 C NMR δ (DMSO-d 6 ): 148.96, 144.92, 137.93, 133.62, 120.41, 115.69, 115.60, 113.08, 100.39, 77.00. 76.87,73.31,69.80,60.77,55.75
ESI-HRMS m / z: calcd.for : C 17 H 23 O 9 (M + HCOO) - 371.1348 obsd.for: (M + HCOO) - 371.1347
For the attribution of NMR, the same document as compound P2 was referred to.
〔試験１〕
上記化合物１および化合物２と、パラメトキシ−フェニルグリコシド（ＰＭＰＧｌｃ）のＩＲＩ活性の有無をそれぞれ調べた。
[Test 1]
The presence or absence of IRI activity of the
結果を図１に示す。図１は、上記［ＩＲＩ活性の測定］に記載した、−６．５℃に達してから３０分経過した時点での氷結晶を倍率１×１０４倍で観察した結果である。
The results are shown in FIG. FIG. 1 is the result of observing the ice crystals at a magnification of 1 × 10 4
図１より、ＰＭＰＧｌｃを添加した氷と比較して、本発明の一実施形態に係る氷再結晶化抑制剤に該当する化合物１を添加した氷は、結晶径が明確に小さいことがわかる。したがって、化合物１は氷の再結晶化を抑制する、非常に強いＩＲＩ活性を有することが示された。
From FIG. 1, it can be seen that the crystal diameter of the ice to which the
また、化合物２を添加した氷の結晶径は、ＰＭＰＧｌｃを添加した氷と比較すると大きかったが、対照と比較すると十分に小さかった。よって、化合物２は、化合物１より弱いものの、強いＩＲＩ活性を有することが分かった。
In addition, the crystal diameter of the ice to which
〔試験２〕
化合物１、化合物２、およびＰＭＰＧｌｃのＩＲＩ活性を、上記［ＩＲＩ活性の測定］に記載した方法に基づき、氷結晶の平均最大粒子径を比較することにより測定した。
[Test 2]
The IRI activities of
図２に結果を示す。図２は、上記化合物を添加後、氷の再結晶化を開始させてからの時間と、氷結晶の平均最大粒子径との相関を示すグラフである。図中、「ＰＢＳ」は、対照としてＰＢＳのみを試料として用いた結果を示し、「ＰＭＰＧｌｃ」はパラメトキシ−フェニルグリコシド、「１」は化合物１、「２」は化合物２をそれぞれ溶質とした試料を用いた結果を示す。
The results are shown in FIG. FIG. 2 is a graph showing the correlation between the time from the start of ice recrystallization after the addition of the above compound and the average maximum particle size of ice crystals. In the figure, "PBS" indicates the result of using only PBS as a sample as a control, "PMPGlc" is a sample containing paramethoxy-phenylglycoside, "1" is a
図２より、化合物１を添加した氷は、氷の再結晶化を開始させてから（−６．５℃に達してから）３０分経過後も平均最大粒子径が増加しないことがわかる。また、化合物２を添加した場合でも、ＰＢＳのみを添加した場合と比較して、平均最大粒子径が小さいことがわかる。したがって、化合物１および２が共にＩＲＩ活性を有することが示された。
From FIG. 2, it can be seen that the average maximum particle size of the ice to which the
〔試験３〕
化合物１の濃度を変化させた場合のＩＲＩ活性の変化を調べた。
[Test 3]
The change in IRI activity when the concentration of
図３に測定結果を示す。図３は、化合物１の濃度を変化させ、［ＩＲＩ活性の測定］に記載した試験を行って、−６．５℃に達してから３０分経過した時点での氷の平均最大粒子径をプロットした結果である。
FIG. 3 shows the measurement results. FIG. 3 plots the average maximum particle size of ice at 30 minutes after reaching −6.5 ° C. by varying the concentration of
図３より、化合物１の濃度が２ｍＭを超えると、氷の平均最大粒子径が急激に減少し、５ｍＭ以上の溶液を添加した氷は、再結晶化が完全に抑制されることが示された。
From FIG. 3, it was shown that when the concentration of
〔試験４〕
化合物１を用いて、上記［細胞凍結保護試験］に示す細胞凍結保護試験を行った。
[Test 4]
Using
図４に結果を示す。図４より、化合物１を添加した冷凍保存用液と混和した赤血球は、冷凍保存用液における化合物１の濃度が１．４ｍＭ、５．５ｍＭ、１１ｍＭのとき、グリセロールの濃度が同じ７．５ｍＭで、化合物１を含有しない対照よりも高い赤血球残存率を示した。また、化合物１の濃度が５．５ｍＭの溶液が最も高い効果を示すことがわかった。したがって、化合物１は、膜毒性を示さず、ＩＲＩ活性による、細胞凍結保護効果を有することが示された。
The results are shown in FIG. From FIG. 4, the erythrocytes mixed with the cryopreservation solution to which
本発明は、培養細胞、生体組織、臓器および食品等の冷凍保存用液の成分または食品添加物として好適に利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be suitably used as a component of a solution for cryopreservation such as cultured cells, biological tissues, organs and foods, or as a food additive.
Claims (7)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020089592 | 2020-05-22 | ||
| JP2020089592 | 2020-05-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021183603A true JP2021183603A (en) | 2021-12-02 |
Family
ID=78767131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021084662A Pending JP2021183603A (en) | 2020-05-22 | 2021-05-19 | Ice recrystallization inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2021183603A (en) |
-
2021
- 2021-05-19 JP JP2021084662A patent/JP2021183603A/en active Pending
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