JP2021180631A - Measurement method, measurement device, and program - Google Patents

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Abstract

To provide a measurement method or the like that can properly evaluate cells.SOLUTION: The present invention discloses a measurement method for electrically measuring a cell 99 cultured with a cell culture chip 100. The cell culture chip 100 has a body part 10, a cell separation film 13, a first electrode 21, a second electrode 22, a third electrode 23 and a fourth electrode 24. The measurement method calculates electrical characteristics of the cell 99 on the basis of the size and phase of impedance when an AC voltage having a predetermined frequency is applied to between the first electrode 21 and the second electrode 22, between the third electrode 23 and the fourth electrode 4, between the first electrode 21 and the fourth electrode 24, and between the second electrode 22 and the third electrode 23, respectively.SELECTED DRAWING: Figure 4C

Description

本開示は、計測方法、計測装置、及びプログラムに関する。 The present disclosure relates to measuring methods, measuring devices, and programs.

近年、細胞培養チップとして、生体機能チップ(Organ On a Chip:OoC)の開発が盛んに行われている(例えば、特許文献1参照)。 In recent years, as a cell culture chip, a biological function chip (Organ Ona Chip: OoC) has been actively developed (see, for example, Patent Document 1).

特開2018−189474号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2018-189474

ところで、上記の特許文献1等に開示された従来のOoCでは、当該OoCを用いて行われる細胞の評価を適切に行えない場合がある。 By the way, in the conventional OoC disclosed in the above-mentioned Patent Document 1 and the like, there are cases where the cell evaluation performed using the OoC cannot be appropriately performed.

本開示は、上記に鑑みてなされ、適切に細胞の評価を行うことが可能な計測方法等を提供することを目的とする。 The present disclosure is made in view of the above, and an object of the present disclosure is to provide a measurement method or the like capable of appropriately evaluating cells.

上記目的を達成するために、本開示に係る計測方法の一態様においては、細胞培養チップを用いて培養された細胞を電気的に計測する計測方法であって、前記細胞培養チップは、第1流路と、所定方向から見て少なくとも一部が前記第1流路に重なる第2流路とを有する本体部と、前記第1流路が形成された第1主面、及び、前記第2流路が形成され、前記第1主面に背向する第2主面を有し、前記第1流路及び前記第2流路の間に配置された細胞分離膜と、前記第1流路内を前記第1流路に沿って延びる第1電極及び第2電極と、前記第2流路内を前記第2流路に沿って延びる第3電極及び第4電極と、を備え、前記計測方法は、前記第1電極と前記第2電極との間、前記第3電極と前記第4電極との間、前記第1電極と前記第4電極との間、及び、前記第2電極と前記第3電極との間が含まれる4つの電極セット間のそれぞれに、所定の周波数を有する交流電圧を印加する第1ステップと、前記交流電圧が印加された際の、それぞれの前記電極セット間において、大きさ及び位相差を有するインピーダンスを測定する第2ステップと、測定された前記インピーダンスの大きさ及び位相差に基づいて、前記細胞の電気的特性を算出する第3ステップと、を含む。 In order to achieve the above object, one aspect of the measurement method according to the present disclosure is a measurement method for electrically measuring cells cultured using a cell culture chip, wherein the cell culture chip is the first. A main body having a flow path, a second flow path whose at least a part overlaps the first flow path when viewed from a predetermined direction, a first main surface on which the first flow path is formed, and the second flow path. A cell separation membrane in which a flow path is formed, has a second main surface facing back to the first main surface, and is arranged between the first flow path and the second flow path, and the first flow path. The measurement is provided with a first electrode and a second electrode extending inside the first flow path, and a third electrode and a fourth electrode extending inside the second flow path along the second flow path. The method is as follows: between the first electrode and the second electrode, between the third electrode and the fourth electrode, between the first electrode and the fourth electrode, and between the second electrode and the fourth electrode. In the first step of applying an AC voltage having a predetermined frequency to each of the four electrode sets including the third electrode, and between the respective electrode sets when the AC voltage is applied. The second step is to measure the impedance having a magnitude and a phase difference, and the third step is to calculate the electrical characteristics of the cell based on the measured magnitude and the phase difference of the impedance.

また、本開示に係る計測装置の一態様においては、上記に記載の計測方法を実施するための計測装置であって、前記第1電極、前記第2電極、前記第3電極、及び、前記第4電極の各々に接続され、所定の周波数を有する交流電圧を前記4つの電極セット間のそれぞれに印加させ、それぞれの前記電極セット間において、大きさ及び位相を有するインピーダンスを測定する測定部と、測定された前記インピーダンスの大きさ及び位相に基づいて、前記細胞の電気的特性を算出し、算出された前記電気的特性を出力する制御部と、を備える。 Further, in one aspect of the measuring device according to the present disclosure, it is a measuring device for carrying out the measuring method described above, and is the first electrode, the second electrode, the third electrode, and the first electrode. A measuring unit connected to each of the four electrodes and having an AC voltage having a predetermined frequency applied to each of the four electrode sets to measure impedance having a magnitude and a phase between the electrode sets. A control unit that calculates the electrical characteristics of the cell based on the measured magnitude and phase of the impedance and outputs the calculated electrical characteristics is provided.

また、本開示に係る一態様は、上記に記載の計測方法をコンピュータに実行させるためのプログラムとして実現できる。 Further, one aspect of the present disclosure can be realized as a program for causing a computer to execute the measurement method described above.

本開示によれば、適切な細胞の評価を行うことが可能となる。 According to the present disclosure, it is possible to evaluate appropriate cells.

図1は、実施の形態に係る計測装置を示すブロック図である。FIG. 1 is a block diagram showing a measuring device according to an embodiment. 図2は、実施の形態に係る計測方法を示すフローチャートであるFIG. 2 is a flowchart showing a measurement method according to the embodiment. 図3は、実施の形態に係る細胞培養チップを説明するための概念図である。FIG. 3 is a conceptual diagram for explaining the cell culture chip according to the embodiment. 図4Aは、実施の形態に係る細胞培養チップの積層構造を説明するための分解斜視図である。FIG. 4A is an exploded perspective view for explaining the laminated structure of the cell culture chips according to the embodiment. 図4Bは、実施の形態に係る細胞培養チップを示す斜視図である。FIG. 4B is a perspective view showing a cell culture chip according to an embodiment. 図4Cは、図4Bに示すC−C線で切断した細胞培養チップの断面図である。FIG. 4C is a cross-sectional view of the cell culture chip cut along the line CC shown in FIG. 4B. 図5は、疑似モデルを計測した結果を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the pseudo model. 図6は、実施例に係る細胞培養チップ構成について説明する斜視図である。FIG. 6 is a perspective view illustrating a cell culture chip configuration according to an example. 図7は、実施例に係る培養細胞を計測した結果を示す第1グラフである。FIG. 7 is a first graph showing the results of measuring the cultured cells according to the examples. 図8は、実施例に係る培養細胞を計測した結果を示す第2グラフである。FIG. 8 is a second graph showing the results of measuring the cultured cells according to the examples.

(開示の基礎となった知見)
医薬品の開発コストの低減、ならびに倫理的な観点からの非臨床試験及び臨床試験の縮小が求められる中、このような要求に資する新たな技術として、例えば、特許文献1に示すような生体機能チップ(Organ On a Chip:OoC)の開発が盛んに行われている。OoCは、樹脂、ガラス等を組み合わせた人工の極小空間内において細胞を培養することで、生体内の組織機能をマイクロスケールで再現したデバイスである。このようなデバイスを用いて、培養された細胞に対して、薬剤を添加することで、当該薬剤の薬効及び毒性試験をはじめ、吸収、分布、代謝、排泄等、従来動物試験によって評価せざるを得なかった試験が、人工のデバイス内で評価可能になることが期待されている。
(Findings that became the basis of disclosure)
With the demand for reduction of drug development costs and reduction of non-clinical trials and clinical trials from an ethical point of view, as a new technology that contributes to such demands, for example, a biological function chip as shown in Patent Document 1. (Organ On a Chip: OoC) is being actively developed. OoC is a device that reproduces the tissue function in a living body on a microscale by culturing cells in an artificial microspace that combines resin, glass, and the like. By adding a drug to cultured cells using such a device, it is necessary to evaluate the drug efficacy and toxicity test, absorption, distribution, metabolism, excretion, etc. by conventional animal tests. It is hoped that the tests obtained will be evaluable within the artificial device.

OoCを用いた細胞の評価の一つとして、例えば、デバイス内で培養された細胞の電気抵抗の計測を行うことがある。デバイス内の細胞は、培養状態に応じてタイトジャンクション等の細胞間結合を形成してシート状の構造(言い換えると細胞シート)を形成する。細胞には、個々の細胞そのものに誘電体としての性質があり、細胞シートを形成することで、誘電性のシートとなる。このような細胞シート両主面を挟む位置に配置された電極間で細胞シートの電気抵抗を計測することで、電気抵抗の上昇として、細胞の培養状態を評価することが可能となる。 As one of the evaluations of cells using OoC, for example, the electrical resistance of cells cultured in a device may be measured. The cells in the device form cell-cell bonds such as tight junctions according to the culture state to form a sheet-like structure (in other words, a cell sheet). Each cell itself has the property of a dielectric, and by forming a cell sheet, it becomes a dielectric sheet. By measuring the electrical resistance of the cell sheet between the electrodes arranged at positions sandwiching both main surfaces of the cell sheet, it is possible to evaluate the cell culture state as an increase in the electrical resistance.

細胞の培養状態の評価は、次いで実施される薬剤評価試験等に対する細胞シートの適格性の担保につながるため、適切に評価されることが重要視される。つまり、細胞の電気抵抗の計測に基づいて細胞の培養状態が薬剤評価試験等に移行するために十分な状態であるか否かが数値化されるため、適切に細胞の電気抵抗が計測されることが重要視される。 Since the evaluation of the cell culture state leads to the assurance of the eligibility of the cell sheet for the drug evaluation test to be carried out next, it is important to evaluate it appropriately. In other words, based on the measurement of the electrical resistance of the cells, it is quantified whether or not the culture state of the cells is sufficient for shifting to the drug evaluation test, etc., so that the electrical resistance of the cells is appropriately measured. Is important.

ところで、従来のOoCを用いた細胞の電気抵抗の計測では、複数周波数のそれぞれにおいてインピーダンスを測定し、コンピュータを用いて細胞のインピーダンスの周波数依存性を等価回路モデルにフィッティングさせる解析処理(フィッティング解析ともいう)を行うことで、細胞の電気抵抗を推定する方法が採用されている。これは、OoCを構築するために培養した細胞に直接電極を接続することが技術的に困難であり、培養液(つまり、培地)の抵抗、及び、培養液と電極間で形成される電気二重層容量などの種々の付加成分の影響を除いて、直接電気抵抗を計測することが困難であることに起因する。なお、以降の説明では、上記のようにフィッティング解析及びその他の手法等によって「推定する」ことも「測定する」と記述する場合がある。 By the way, in the conventional measurement of the electrical resistance of a cell using OoC, the impedance is measured at each of a plurality of frequencies, and the frequency dependence of the impedance of the cell is fitted to the equivalent circuit model using a computer (also known as fitting analysis). A method of estimating the electrical resistance of cells is adopted by performing (referred to as). This is technically difficult to connect the electrode directly to the cultured cells to construct OoC, the resistance of the culture medium (ie, the medium), and the electrical double layer formed between the culture medium and the electrode. This is due to the difficulty in directly measuring electrical resistance, except for the effects of various additional components such as layer capacity. In the following description, "estimating" by fitting analysis and other methods as described above may also be described as "measuring".

フィッティング解析を用いて細胞の電気抵抗を測定するためには、相当数の周波数点でインピーダンスの計測を行うことが必要であり、また、フィッティング解析の条件によっては、例えば、測定点が少ない等の際に算出される細胞の電気抵抗の値が正確でない場合が生じ得る。さらに、上記のように複数の周波数点での測定値に対してのフィッティング解析を行う必要があり、細胞の電気抵抗を推定するために要する時間が膨大となるので、計測の即時性を損なってしまう。加えて、フィッティング解析のために高い処理能力を有する計算リソースを用いることが求められ、計測を実現するためのコストの増大につながり得る。このように、従来の電気抵抗の計測は、適切でない場合がある。また、加えて、従来の計測では、電気抵抗が算出されるのみであった。 In order to measure the electrical resistance of cells using fitting analysis, it is necessary to measure impedance at a considerable number of frequency points, and depending on the conditions of fitting analysis, for example, there are few measurement points. In some cases, the value of the electrical resistance of the cell calculated at that time may not be accurate. Furthermore, as described above, it is necessary to perform fitting analysis on the measured values at multiple frequency points, and the time required to estimate the electrical resistance of the cells becomes enormous, which impairs the immediacy of the measurement. It ends up. In addition, it is required to use computational resources with high processing power for fitting analysis, which may lead to an increase in cost for realizing measurement. As described above, the conventional measurement of electric resistance may not be appropriate. In addition, in the conventional measurement, only the electric resistance is calculated.

そこで、本開示では、上記に鑑みて、電気抵抗等の電気的特性をより適切に計測することが可能な計測方法等を提供する。 Therefore, in view of the above, the present disclosure provides a measuring method and the like capable of more appropriately measuring electrical characteristics such as electrical resistance.

(開示の概要)
上記の目的を達成するための、本開示に係る計測方法の一態様は、細胞培養チップを用いて培養された細胞を電気的に計測する計測方法である。細胞培養チップは、第1流路と、所定方向から見て少なくとも一部が第1流路に重なる第2流路とを有する本体部と、第1流路が上方に形成された第1主面、及び、第2流路が下方に形成され、第1主面に背向する第2主面を有し、第1流路及び第2流路の間に配置された細胞分離膜と、第1流路内を第1流路に沿って延びる第1電極及び第2電極と、第2流路内を第2流路に沿って延びる第3電極及び第4電極と、を備える。計測方法は、第1電極と第2電極との間、第3電極と第4電極との間、第1電極と第4電極との間、及び、第2電極と第3電極との間が含まれる4つの電極セット間のそれぞれに、所定の周波数を有する交流電圧を印加する第1ステップと、交流電圧が印加された際の、それぞれの電極セット間において、大きさ及び位相を有するインピーダンスを測定する第2ステップと、測定されたインピーダンスの大きさ及び位相に基づいて、細胞の電気的特性を算出する第3ステップと、を含む。
(Summary of disclosure)
One aspect of the measurement method according to the present disclosure for achieving the above object is a measurement method for electrically measuring cells cultured using a cell culture chip. The cell culture chip has a main body having a first flow path, a second flow path in which at least a part thereof overlaps the first flow path when viewed from a predetermined direction, and a first main flow path in which the first flow path is formed upward. A cell separation membrane having a surface and a second flow path formed downward, having a second main surface facing back to the first main surface, and arranged between the first flow path and the second flow path. A first electrode and a second electrode extending in the first flow path along the first flow path, and a third electrode and a fourth electrode extending in the second flow path along the second flow path are provided. The measurement method is between the first electrode and the second electrode, between the third electrode and the fourth electrode, between the first electrode and the fourth electrode, and between the second electrode and the third electrode. The first step of applying an AC voltage having a predetermined frequency to each of the four electrode sets included, and the impedance having a magnitude and a phase between the respective electrode sets when the AC voltage is applied. It comprises a second step of measurement and a third step of calculating the electrical properties of the cell based on the magnitude and phase of the measured impedance.

これによれば、細胞培養チップにおいて培養された細胞の評価を行う際に、当該細胞の電気的特性に応じて評価を行うことができる。細胞の電気的特性は、細胞の状態と対応しており、細胞の状態を数値として表すことができる。例えば、細胞培養の培養時間に対する電気的特性の変化として、上昇したか、又は、減少したか等の判定によって細胞を評価することができる。また、電気的特性が所定の閾値を超えたか否かによって細胞の評価を行うこともできる。このように数値に基づいて細胞の評価を行うことができるため、例えば、顕微鏡観察などの場合にみられる評価者の主観が入り込む余地がなく、適切な評価を行うことができる。 According to this, when evaluating the cells cultured in the cell culture chip, the evaluation can be performed according to the electrical characteristics of the cells. The electrical properties of a cell correspond to the state of the cell, and the state of the cell can be expressed numerically. For example, cells can be evaluated by determining whether the electrical characteristics have increased or decreased as a change in electrical characteristics with respect to the culture time of the cell culture. In addition, cells can be evaluated based on whether or not the electrical characteristics exceed a predetermined threshold value. Since the cells can be evaluated based on the numerical values in this way, there is no room for the subjectivity of the evaluator, which is seen in the case of microscopic observation, for example, and appropriate evaluation can be performed.

また、このような電気的特性を計測するために必要な測定として、4つの電極セット間において、所定の周波数を有する交流電圧を印加した際のインピーダンスの大きさ及び位相の測定のみが行われればよい。交流電圧を複数波長にわたって変化させて印加する場合に比べ、測定に要する時間が短縮され、計測の即時性が向上される。よって、電気的特性をより適切に計測することができる。すなわち、より適切に計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができるため、適切な細胞の評価を行うことができる。 Further, as a measurement necessary for measuring such electrical characteristics, if only the magnitude and phase of the impedance when an AC voltage having a predetermined frequency is applied between the four electrode sets are measured. good. Compared with the case where the AC voltage is changed over a plurality of wavelengths and applied, the time required for the measurement is shortened and the immediacy of the measurement is improved. Therefore, the electrical characteristics can be measured more appropriately. That is, since cells can be evaluated based on more appropriately measured electrical characteristics, appropriate cell evaluation can be performed.

また、例えば、第3ステップでは、測定されたインピーダンスの位相を用いて、測定されたインピーダンスの大きさからインピーダンスの実数部及び虚数部を抽出し、抽出された実数部に基づいて細胞のインピーダンスにおける実数成分を算出し、抽出された虚数部に基づいて細胞のインピーダンスにおける虚数成分を算出してもよい。 Further, for example, in the third step, the real and imaginary parts of the impedance are extracted from the measured impedance magnitude using the measured impedance phase, and the impedance of the cell is determined based on the extracted real part. The real number component may be calculated, and the imaginary number component in the impedance of the cell may be calculated based on the extracted imaginary part.

これによれば、測定されたインピーダンスの実数部及び虚数部を抽出して電気的特性を算出できる。インピーダンスの実数部は、抵抗成分に関与し、インピーダンスの虚数部は、容量成分に関与する。したがって、測定されたインピーダンスから、抵抗成分及び容量成分に関与する電気的特性を算出できる。よって、計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができる。 According to this, the real part and the imaginary part of the measured impedance can be extracted and the electrical characteristics can be calculated. The real part of the impedance is involved in the resistance component and the imaginary part of the impedance is involved in the capacitive component. Therefore, the electrical characteristics related to the resistance component and the capacitance component can be calculated from the measured impedance. Therefore, cells can be evaluated based on the measured electrical characteristics.

また、例えば、電気的特性は、細胞の抵抗R及び容量Cの少なくとも一方であってもよい。 Further, for example, the electrical property may be at least one of the resistance R p and the volume C p of the cell.

これによれば、電気的特性として、培養された細胞の抵抗R及び容量Cの少なくとも一方を計測できる。よって、計測された抵抗R及び容量Cの少なくとも一方に基づいて細胞の評価を行うことができる。 According to this, at least one of the resistance R p and the volume C p of the cultured cells can be measured as electrical characteristics. Therefore, cells can be evaluated based on at least one of the measured resistance R p and volume C p.

また、例えば、第3ステップでは、細胞の抵抗R及び容量Cが並列に接続された回路要素とみなし、第1電極、第2電極、第3電極、第4電極、及び回路要素を含む回路モデルを用いて電気的特性を算出してもよい。 Further, for example, in the third step, the resistance R p and the capacitance C p of the cells are regarded as circuit elements connected in parallel, and include the first electrode, the second electrode, the third electrode, the fourth electrode, and the circuit element. The electrical characteristics may be calculated using a circuit model.

これによれば、細胞の抵抗R及び容量Cが並列に接続された回路要素を含む回路モデルによって算出を行うことで、電気的特性を計測できる。よって、より適切に計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができるため、適切な細胞の評価を行うことができる。 According to this, the electrical characteristics can be measured by performing the calculation by a circuit model including circuit elements in which the resistance R p and the capacitance C p of the cells are connected in parallel. Therefore, since the cells can be evaluated based on the more appropriately measured electrical characteristics, it is possible to perform an appropriate cell evaluation.

また、例えば、回路モデルでは、4つの電極セット間のうち、第1電極と第4電極との間及び第2電極と第3電極との間には、回路要素が接続され、4つの電極セット間のうち、第1電極と第2電極との間及び第3電極と第4電極との間には、回路要素が接続されなくてもよい。 Further, for example, in the circuit model, circuit elements are connected between the first electrode and the fourth electrode and between the second electrode and the third electrode among the four electrode sets, and the four electrode sets are connected. Of the spaces, circuit elements may not be connected between the first electrode and the second electrode and between the third electrode and the fourth electrode.

これによれば、第1電極と第2電極との間の接続ノード、及び、第3電極と第4電極との間の接続ノードの間に回路要素が接続された回路モデルによって算出を行うことで、電気的特性を計測できる。よって、より適切に計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができるため、適切な細胞の評価を行うことができる。 According to this, the calculation is performed by a circuit model in which circuit elements are connected between the connection node between the first electrode and the second electrode and the connection node between the third electrode and the fourth electrode. With, the electrical characteristics can be measured. Therefore, since the cells can be evaluated based on the more appropriately measured electrical characteristics, it is possible to perform an appropriate cell evaluation.

また、例えば、第3ステップでは、第1電極と第4電極との間におけるインピーダンスの大きさ、及び、第2電極と第3電極との間におけるインピーダンスの大きさを加算し、第1電極と第2電極との間におけるインピーダンスの大きさ、及び、第3電極と第4電極との間におけるインピーダンスの大きさを減算し、得られた計算値を2で除してもよい。 Further, for example, in the third step, the magnitude of the impedance between the first electrode and the fourth electrode and the magnitude of the impedance between the second electrode and the third electrode are added to obtain the first electrode. The magnitude of the impedance between the second electrode and the magnitude of the impedance between the third electrode and the fourth electrode may be subtracted, and the obtained calculated value may be divided by two.

これによれば、インピーダンスの加減算によって回路モデル上で、各接続経路に重複する素子のインピーダンスを消去して整理できる。つまり、電気的特性を簡易な式で算出できるため、計算コストを縮小でき、かつ、計算時間を短縮でき、電気的特性の計測を適切に行うことができる。よって、より適切に計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができるため、適切な細胞の評価を行うことができる。 According to this, the impedance of the element overlapping in each connection path can be erased and arranged on the circuit model by adding or subtracting the impedance. That is, since the electrical characteristics can be calculated by a simple formula, the calculation cost can be reduced, the calculation time can be shortened, and the electrical characteristics can be appropriately measured. Therefore, since the cells can be evaluated based on the more appropriately measured electrical characteristics, it is possible to perform an appropriate cell evaluation.

また、例えば、第3ステップでは、第1電極が第1抵抗を有し、第2電極が第2抵抗を有し、第3電極が第3抵抗を有し、第4電極が第4抵抗を有するとみなし、第1電極、第2電極、第3電極、第4電極、及び回路要素を含む回路モデルを用いて電気的特性を算出してもよい。 Further, for example, in the third step, the first electrode has the first resistance, the second electrode has the second resistance, the third electrode has the third resistance, and the fourth electrode has the fourth resistance. The electrical characteristics may be calculated using a circuit model including the first electrode, the second electrode, the third electrode, the fourth electrode, and the circuit element.

これによれば、第1電極が第1抵抗を有し、第2電極が第2抵抗を有し、第3電極が第3抵抗を有し、第4電極が第4抵抗を有する適切な回路モデルによって算出を行うことで、電気的特性を計測できる。よって、より適切に計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができるため、適切な細胞の評価を行うことができる。 According to this, a suitable circuit in which the first electrode has the first resistance, the second electrode has the second resistance, the third electrode has the third resistance, and the fourth electrode has the fourth resistance. Electrical characteristics can be measured by performing calculations using a model. Therefore, since the cells can be evaluated based on the more appropriately measured electrical characteristics, it is possible to perform an appropriate cell evaluation.

また、例えば、第3ステップでは、第1電極と、第1流路を満たす第1流体との間に、第1容量が形成され、第2電極と、第1流体との間に、第2容量が形成され、第3電極と、第2流路を満たす第2流体との間に、第3容量が形成され、第4電極と、第2流体との間に、第4容量が形成されるとみなし、第1電極、第2電極、第3電極、第4電極、及び回路要素、ならびに、第1容量、第2容量、第3容量、及び第4容量を含む回路モデルを用いて電気的特性を算出してもよい。 Further, for example, in the third step, a first capacitance is formed between the first electrode and the first fluid that fills the first flow path, and a second capacitance is formed between the second electrode and the first fluid. A capacitance is formed, a third capacitance is formed between the third electrode and the second fluid that fills the second flow path, and a fourth capacitance is formed between the fourth electrode and the second fluid. Assuming that, electricity is used using a circuit model including a first electrode, a second electrode, a third electrode, a fourth electrode, and a circuit element, and a first capacitance, a second capacitance, a third capacitance, and a fourth capacitance. The target characteristics may be calculated.

これによれば、第1電極、第2電極、第3電極、第4電極、及び回路要素、ならびに、第1容量、第2容量、第3容量、及び第4容量を含む適切な回路モデルによって算出を行うことで、電気的特性を計測できる。よって、より適切に計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができるため、適切な細胞の評価を行うことができる。 According to this, by a suitable circuit model including the first electrode, the second electrode, the third electrode, the fourth electrode, and the circuit element, and the first capacitance, the second capacitance, the third capacitance, and the fourth capacitance. By performing the calculation, the electrical characteristics can be measured. Therefore, since the cells can be evaluated based on the more appropriately measured electrical characteristics, it is possible to perform an appropriate cell evaluation.

また、例えば、第3ステップでは、第1電極及び第2電極間に第1流体の成分に応じた2つの第1水平抵抗が直列に接続され、2つの第1水平抵抗の間の接続ノードと回路要素との間に第1流体の成分に応じた第1垂直抵抗が接続され、第3電極及び第4電極間に第2流体の成分に応じた2つの第2水平抵抗が直列に接続され、2つの第2水平抵抗の間の接続ノードと回路要素との間に第2流体の成分に応じた第2垂直抵抗が接続されるとみなし、第1電極、第2電極、第3電極、第4電極、回路要素、第1容量、第2容量、第3容量、及び第4容量、ならびに、2つの第1水平抵抗、第1垂直抵抗、2つの第2水平抵抗、及び、第2垂直抵抗を含む回路モデルを用いて電気的特性を算出してもよい。 Further, for example, in the third step, two first horizontal resistors corresponding to the components of the first fluid are connected in series between the first electrode and the second electrode, and the connection node between the two first horizontal resistors is connected. A first vertical resistor corresponding to the component of the first fluid is connected to the circuit element, and two second horizontal resistors corresponding to the component of the second fluid are connected in series between the third electrode and the fourth electrode. It is considered that the second vertical resistance corresponding to the component of the second fluid is connected between the connection node between the two second horizontal resistances and the circuit element, and the first electrode, the second electrode, the third electrode, 4th electrode, circuit element, 1st capacitance, 2nd capacitance, 3rd capacitance, and 4th capacitance, as well as two first horizontal resistance, first vertical resistance, two second horizontal resistance, and second vertical. Electrical characteristics may be calculated using a circuit model that includes resistors.

これによれば、各電極間に形成される、第1流体及び第2流体に応じた第1水平抵抗、第1垂直抵抗、第2水平抵抗、及び、第2垂直抵抗を含む適切な回路モデルによって算出を行うことで、電気的特性を計測できる。よって、より適切に計測された電気的特性に基づいて細胞の評価を行うことができるため、適切な細胞の評価を行うことができる。 According to this, an appropriate circuit model including a first horizontal resistance, a first vertical resistance, a second horizontal resistance, and a second vertical resistance formed between the electrodes according to the first fluid and the second fluid. The electrical characteristics can be measured by performing the calculation. Therefore, since the cells can be evaluated based on the more appropriately measured electrical characteristics, it is possible to perform an appropriate cell evaluation.

また、本開示に係る計測装置の一態様は、上記のいずれかに記載の計測方法を実施するための計測装置であって、第1電極、第2電極、第3電極、及び、第4電極の各々に接続され、所定の周波数を有する交流電圧を、4つの電極セット間のそれぞれに印加させ、それぞれの電極セット間における交流インピーダンス及び位相差を測定する測定部と、測定された交流インピーダンス及び位相差に基づいて、細胞の電気的特性を算出し、算出された電気的特性を出力する制御部と、を備える。 Further, one aspect of the measuring device according to the present disclosure is a measuring device for carrying out the measuring method according to any one of the above, and is a first electrode, a second electrode, a third electrode, and a fourth electrode. An AC voltage connected to each of the four electrode sets and having a predetermined frequency is applied to each of the four electrode sets, and a measuring unit for measuring the AC impedance and the phase difference between the respective electrode sets, and the measured AC impedance and A control unit that calculates the electrical characteristics of the cell based on the phase difference and outputs the calculated electrical characteristics is provided.

これによれば、上記の計測方法と同様の効果を奏する計測装置を実現できる。すなわち、より適切に計測された電気的特性に基づいて適切な細胞の評価を行うことが可能な計測措置を実現できる。 According to this, it is possible to realize a measuring device having the same effect as the above-mentioned measuring method. That is, it is possible to realize a measurement measure capable of performing an appropriate cell evaluation based on more appropriately measured electrical characteristics.

また、本開示の一態様に係るプログラムは、上記のいずれかに記載の計測方法をコンピュータに実行させるためのプログラムである。 Further, the program according to one aspect of the present disclosure is a program for causing a computer to execute the measurement method described in any of the above.

これによれば、コンピュータを用いて、上記の計測方法と同様の効果を奏することができる。 According to this, the same effect as the above-mentioned measurement method can be obtained by using a computer.

なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なCD−ROM等の記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。 It should be noted that these comprehensive or specific embodiments may be realized by a recording medium such as a system, a method, an integrated circuit, a computer program or a computer-readable CD-ROM, and the system, a method, an integrated circuit, or a computer program. And may be realized by any combination of recording media.

以下、本開示の実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置、及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。 Hereinafter, embodiments of the present disclosure will be described with reference to the drawings. It should be noted that all of the embodiments described below show comprehensive or specific examples. The numerical values, shapes, materials, components, arrangement positions of the components, connection forms, steps, the order of steps, and the like shown in the following embodiments are examples, and are not intended to limit the scope of claims. Further, among the components in the following embodiments, the components not described in the independent claims are described as arbitrary components.

なお、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化する。また、以下の説明では、互いに直交するX軸、Y軸、及びZ軸を用いて説明を行うが、細胞培養チップ等の使用時における方向を規定するものではない。また、以下の説明では、特に、Z軸プラス側を上側、Z軸マイナス側を下側として、Z軸方向を上下方向いう場合がある。 It should be noted that each figure is not necessarily exactly illustrated. In each figure, substantially the same configurations are designated by the same reference numerals, and duplicate explanations are omitted or simplified. Further, in the following description, the X-axis, Y-axis, and Z-axis that are orthogonal to each other will be used, but the direction when the cell culture chip or the like is used is not defined. Further, in the following description, in particular, the Z-axis direction may be referred to as a vertical direction, with the Z-axis plus side as the upper side and the Z-axis minus side as the lower side.

また、本明細書において、平行などの要素間の関係性を示す用語、及び、矩形などの要素の形状を示す用語、ならびに、数値、及び、数値範囲は、厳格な意味のみを表す表現ではなく、実質的に同等な範囲、例えば数%程度の誤差等の差異も含むことを意味する表現である。 Further, in the present specification, terms indicating relationships between elements such as parallel, terms indicating the shape of elements such as rectangles, numerical values, and numerical ranges are not expressions expressing only strict meanings. , It is an expression meaning that a difference such as a substantially equivalent range, for example, an error of about several percent is included.

(実施の形態)
[細胞培養装置]
はじめに、実施の形態における計測装置について説明する。図1は、実施の形態に係る計測装置を示すブロック図である。
(Embodiment)
[Cell culture device]
First, the measuring device according to the embodiment will be described. FIG. 1 is a block diagram showing a measuring device according to an embodiment.

図1に示すように、本実施の形態における計測装置300は、測定部200と、制御部201と、スイッチボックス202と、細胞培養チップ100とを備える。 As shown in FIG. 1, the measuring device 300 in the present embodiment includes a measuring unit 200, a control unit 201, a switch box 202, and a cell culture chip 100.

細胞培養チップ100は、計測装置300を用いて細胞を培養する際の培養槽にあたるデバイスである。計測装置300は、電極を用いてインピーダンスを測定することにより細胞培養チップ100において培養されている細胞の電気抵抗等の電気的特性を計測し、計測された細胞の電気的特性によって当該細胞の状態を推定する。なお、細胞の状態とは、培養中における細胞の状態(つまり培養状態)、及び、その他の試験において細胞が示す状態とを包含する概念である。細胞培養チップ100には、培養中の細胞の電気抵抗等を測定するための電極が設けられる。具体的には、細胞培養チップ100は、電極として、第1電極21と第2電極22と第3電極23と第4電極24とを備える。細胞培養チップ100の詳細な構成については後述する。 The cell culture chip 100 is a device that corresponds to a culture tank when cells are cultured using the measuring device 300. The measuring device 300 measures the electrical characteristics such as the electrical resistance of the cells cultured in the cell culture chip 100 by measuring the impedance using the electrodes, and the state of the cells is determined by the measured electrical characteristics of the cells. To estimate. The state of the cell is a concept including the state of the cell during culturing (that is, the state of culturing) and the state indicated by the cell in other tests. The cell culture chip 100 is provided with an electrode for measuring the electrical resistance and the like of the cells being cultured. Specifically, the cell culture chip 100 includes a first electrode 21, a second electrode 22, a third electrode 23, and a fourth electrode 24 as electrodes. The detailed configuration of the cell culture chip 100 will be described later.

測定部200は、細胞培養チップ100に設けられる電極のうちの2つの電極の組み合わせである電極セット間のインピーダンスを測定するための測定装置である。具体的には、測定部200は、測定対象となる電極セットの各々が接続される第1端子T1及び第2端子T2を有し、当該第1端子T1及び第2端子T2に電気的に接続された2つの電極間のインピーダンスを測定する装置である。測定部200は、例えば、第1端子T1及び第2端子T2間に交流電圧を印加し、その際の第1端子T1及び第2端子T2間の電流変化を計測することでインピーダンスの大きさ及び位相を測定する。なお、第1端子T1と第2端子T2間のインピーダンスの大きさ及び位相の測定においては、第1端子T1と第2端子T2間に交流電流を流して、その際の第1端子T1と第2端子T2間の電圧変化を計測しても良い。測定部200として、例えば、LCRメータが用いられる。 The measuring unit 200 is a measuring device for measuring the impedance between the electrode sets, which is a combination of two electrodes among the electrodes provided on the cell culture chip 100. Specifically, the measuring unit 200 has a first terminal T1 and a second terminal T2 to which each of the electrode sets to be measured is connected, and is electrically connected to the first terminal T1 and the second terminal T2. It is a device that measures the impedance between the two electrodes. The measuring unit 200 applies, for example, an AC voltage between the first terminal T1 and the second terminal T2, and measures the current change between the first terminal T1 and the second terminal T2 at that time to measure the magnitude of the impedance and the magnitude of the impedance. Measure the phase. In measuring the impedance magnitude and phase between the first terminal T1 and the second terminal T2, an alternating current is passed between the first terminal T1 and the second terminal T2, and the first terminal T1 and the first terminal T1 at that time are measured. The voltage change between the two terminals T2 may be measured. As the measuring unit 200, for example, an LCR meter is used.

制御部201は、各々の電極セット間において測定されたインピーダンスに基づいて細胞の電気抵抗等を算出し、算出結果を出力する処理装置である。制御部201は、例えば、図示しないディスプレイ装置、又は、音声出力装置等に接続され、これらの装置に算出結果の電気抵抗等を出力することで、計測装置300のユーザに結果を提示させる。また、制御部201は、測定部200と細胞培養チップ100に設けられた電極との電気的な接続を切り替える制御信号をスイッチボックス202に送信する処理装置でもある。制御部201は、一例として、プロセッサ等の回路と、当該プロセッサに接続されたメモリ等の記憶装置とによって、上記の機能を実施するためのプログラムが実行されることで実現される。なお、制御部201は、上記の処理を実行可能な専用の回路であってもよい。 The control unit 201 is a processing device that calculates the electrical resistance of cells and the like based on the impedance measured between each electrode set and outputs the calculation result. The control unit 201 is connected to, for example, a display device (not shown), a voice output device, or the like, and outputs the electric resistance or the like of the calculated result to these devices so that the user of the measuring device 300 presents the result. Further, the control unit 201 is also a processing device that transmits a control signal for switching the electrical connection between the measurement unit 200 and the electrode provided on the cell culture chip 100 to the switch box 202. The control unit 201 is realized, for example, by executing a program for performing the above functions by a circuit such as a processor and a storage device such as a memory connected to the processor. The control unit 201 may be a dedicated circuit capable of executing the above processing.

スイッチボックス202は、制御部201から送信された制御信号を受信し、当該制御信号に基づいて、第1端子T1及び第2端子T2の接続先を切り替える。スイッチボックス202では、第1端子T1は、第1スイッチSW1に接続されている。第1スイッチSW1は、制御信号に基づいて、第1接続端子S1、又は、第3接続端子S3と第1端子T1との接続を選択的に切り替える。また、スイッチボックス202では、第2端子T2は、第2スイッチSW2に接続されている。第2スイッチSW2は、第2接続端子S2、又は、第4接続端子S4と第2端子T2との接続を選択的に切り替える。 The switch box 202 receives the control signal transmitted from the control unit 201, and switches the connection destination of the first terminal T1 and the second terminal T2 based on the control signal. In the switch box 202, the first terminal T1 is connected to the first switch SW1. The first switch SW1 selectively switches the connection between the first connection terminal S1 or the third connection terminal S3 and the first terminal T1 based on the control signal. Further, in the switch box 202, the second terminal T2 is connected to the second switch SW2. The second switch SW2 selectively switches the connection between the second connection terminal S2 or the fourth connection terminal S4 and the second terminal T2.

第1接続端子S1は、例えば、細胞培養チップ100の第1電極21に接続されている。同様に、第2接続端子S2は、例えば、細胞培養チップ100の第2電極22に接続されている。同様に、第3接続端子S3は、例えば、細胞培養チップ100の第3電極23に接続されている。同様に、第4接続端子S4は、例えば、細胞培養チップ100の第4電極24に接続されている。例えば、第1電極21と第4電極24との間の電極セット間でインピーダンスを測定する場合、制御部201は、スイッチボックス202に制御信号を送信して第1端子T1と第1接続端子S1とを接続するように第1スイッチSW1を切り替えさせ、第2端子T2と第4接続端子S4とを接続するように第2スイッチSW2を切り替えさせる。 The first connection terminal S1 is connected to, for example, the first electrode 21 of the cell culture chip 100. Similarly, the second connection terminal S2 is connected to, for example, the second electrode 22 of the cell culture chip 100. Similarly, the third connection terminal S3 is connected to, for example, the third electrode 23 of the cell culture chip 100. Similarly, the fourth connection terminal S4 is connected to, for example, the fourth electrode 24 of the cell culture chip 100. For example, when measuring the impedance between the electrode sets between the first electrode 21 and the fourth electrode 24, the control unit 201 transmits a control signal to the switch box 202 to connect the first terminal T1 and the first connection terminal S1. The first switch SW1 is switched so as to connect with, and the second switch SW2 is switched so as to connect the second terminal T2 and the fourth connection terminal S4.

また、本実施の形態では、インピーダンスの測定に交流電圧を用いるため、電極の極性を考慮することなく、測定したい電極セットを構成する2つの電極の一方に繋がる接続端子に第1端子T1が接続され、他方に繋がる接続端子に第2端子T2が接続されればよい。 Further, in the present embodiment, since the AC voltage is used for impedance measurement, the first terminal T1 is connected to the connection terminal connected to one of the two electrodes constituting the electrode set to be measured without considering the polarity of the electrodes. The second terminal T2 may be connected to the connection terminal connected to the other terminal.

つまり、第2電極22と第3電極23との間の電極セット間でインピーダンスを測定する場合、第1スイッチSW1による第2接続端子S2と第1端子T1との接続、及び、第2スイッチSW2による第3接続端子S3と第2端子T2との接続が行われる必要はない。第2電極22と第3電極23との間の電極セット間でインピーダンスを測定する場合、例えば、制御部201は、スイッチボックス202に制御信号を送信して第1端子T1と第3接続端子S3とを接続するように第1スイッチSW1を切り替えさせ、第2端子T2と第2接続端子S2とを接続するように第2スイッチSW2を切り替えさせる。 That is, when measuring the impedance between the electrode sets between the second electrode 22 and the third electrode 23, the connection between the second connection terminal S2 and the first terminal T1 by the first switch SW1 and the second switch SW2. It is not necessary to connect the third connection terminal S3 and the second terminal T2 by the above method. When measuring the impedance between the electrode sets between the second electrode 22 and the third electrode 23, for example, the control unit 201 transmits a control signal to the switch box 202 to connect the first terminal T1 and the third connection terminal S3. The first switch SW1 is switched so as to connect with, and the second switch SW2 is switched so as to connect the second terminal T2 and the second connection terminal S2.

このように、本実施の形態では、測定対象となる電極セットを切り替えながらインピーダンスの測定が実施される。 As described above, in the present embodiment, the impedance is measured while switching the electrode set to be measured.

なお、図示しないが、計測装置300は、さらに、細胞培養に用いられる培地の貯留タンク及びポンプ等の流体制御装置、細胞培養チップを所定の培養条件に適合させるガスチャンバ及び温調機器等の環境制御装置等を備える細胞培養システムに組み込まれて実現されてもよい。あるいは、計測装置300とは別に準備された、これらの装置を用いて細胞の培養が行われてもよく、その培養細胞の状態を評価する際に、計測装置300が用いられてもよい。 Although not shown, the measuring device 300 further includes an environment such as a fluid control device such as a culture medium storage tank and a pump used for cell culture, a gas chamber for adapting the cell culture chip to a predetermined culture condition, and a temperature control device. It may be realized by incorporating it into a cell culture system provided with a control device or the like. Alternatively, cells may be cultured using these devices prepared separately from the measuring device 300, and the measuring device 300 may be used when evaluating the state of the cultured cells.

[細胞培養方法及び計測方法]
上記の計測装置300及び細胞培養のための各種装置を用いた細胞の培養は、以下のようにして行われる。図2は、実施の形態における細胞培養方法を示すフローチャートである。図2に示すように、はじめに、培養する細胞99を細胞培養チップ100に播種し、培地、温度、ガス等の培養環境を制御して細胞99の培養を開始する(ステップS101)。ここで、細胞培養チップ100を用いて培養される細胞99の種類には特に限定はない。
[Cell culture method and measurement method]
Cell culture using the above-mentioned measuring device 300 and various devices for cell culture is performed as follows. FIG. 2 is a flowchart showing a cell culture method according to the embodiment. As shown in FIG. 2, first, the cells 99 to be cultured are seeded on the cell culture chip 100, and the culture environment such as medium, temperature, and gas is controlled to start the culture of the cells 99 (step S101). Here, the type of cells 99 cultured using the cell culture chip 100 is not particularly limited.

また、詳細は後述するが、細胞培養チップ100の第1流路33と第2流路41との2つの流路のそれぞれにおいて細胞を培養することが可能である。例えば、第1流路33において肺細胞を培養し、第2流路41において血管細胞を培養することで、第1流路33と第2流路41とを併せて呼吸器系の臓器モデルを構築してもよい。また、例えば、第1流路33において脳血液関門系の細胞を培養し、第2流路41において脳神経細胞を培養することで、脳血液関門通過試験モデルを構築してもよい。また、各流路において培養される細胞は、1種でなくてもよく、複数種の組み合わせであってもよい。各流路において培養される細胞は、流路内で再現したい臓器等の細胞構成に合わせ、適切な比率で異なる種の細胞が混合培養されてもよい。 Further, as will be described in detail later, it is possible to culture cells in each of the two channels of the cell culture chip 100, the first channel 33 and the second channel 41. For example, by culturing lung cells in the first channel 33 and vascular cells in the second channel 41, the first channel 33 and the second channel 41 can be combined to form a respiratory organ model. You may build it. Further, for example, a blood-brain barrier passage test model may be constructed by culturing cells of the blood-brain barrier system in the first channel 33 and culturing brain nerve cells in the second channel 41. Further, the cells to be cultured in each channel do not have to be one type, and may be a combination of a plurality of types. As the cells to be cultured in each channel, cells of different species may be mixed and cultured in an appropriate ratio according to the cell composition of the organ or the like to be reproduced in the channel.

培養された細胞は、タイトジャンクション等の細胞間結合によってシート様構造を形成する。このようなシート様構造により、培養された細胞は、シートの一方の主面から他方の主面にかけて抵抗成分(すなわち膜抵抗)を有する。 The cultured cells form a sheet-like structure by cell-cell connections such as tight junctions. Due to such a sheet-like structure, the cultured cells have a resistance component (that is, membrane resistance) from one main surface to the other main surface of the sheet.

続いて、制御部201は、実行されたプログラムに従ってスイッチボックス202に制御信号を送信して、4つの電極セットのうちの測定対象となる電極セットを選択する(ステップS102)。選択された電極セットの各電極は、第1スイッチSW1および第2スイッチSW2によって対応する接続端子と端子とが導通状態となることで、第1端子T1及び第2端子T2に接続される。 Subsequently, the control unit 201 transmits a control signal to the switch box 202 according to the executed program, and selects the electrode set to be measured from the four electrode sets (step S102). Each electrode of the selected electrode set is connected to the first terminal T1 and the second terminal T2 by making the corresponding connection terminal and the terminal conductive by the first switch SW1 and the second switch SW2.

ここで、測定部200は、第1端子T1及び第2端子T2に接続された電極セット間に所定の交流電圧を印加する(第1ステップS103)。測定部200は、交流電圧の印加によって、電極セット間に流れる電流を計測することで、インピーダンスの大きさ及び各々の電極での位相差の測定を行う(第2ステップS104)。もしくは、第1ステップS103において、測定部200は、第1端子T1及び第2端子T2に接続された電極セット間に所定の交流電流を流してもよい。この場合、第2ステップS104において、測定部200は、交流電流を流すために電極セット間に生じる電圧を計測することで、インピーダンスの大きさ及び各々の電極での位相差の測定を行ってもよい。 Here, the measuring unit 200 applies a predetermined AC voltage between the electrode sets connected to the first terminal T1 and the second terminal T2 (first step S103). The measuring unit 200 measures the magnitude of the impedance and the phase difference at each electrode by measuring the current flowing between the electrode sets by applying the AC voltage (second step S104). Alternatively, in the first step S103, the measuring unit 200 may pass a predetermined alternating current between the electrode sets connected to the first terminal T1 and the second terminal T2. In this case, in the second step S104, the measuring unit 200 may measure the magnitude of the impedance and the phase difference at each electrode by measuring the voltage generated between the electrode sets for passing the alternating current. good.

測定された電極セット間のインピーダンスの大きさ及び位相差は、例えば、制御部201の記憶装置等に蓄積される。制御部201は、電気的特性の算出に必要な電極セット間のインピーダンスの大きさ及び位相差が、全て記憶装置に格納されたか否かを判定する。つまり、実行されたプログラムにおいて定められた所定の電極セット間のインピーダンスの大きさ及び位相差の測定が全て行われたかを判定する(ステップS105)。 The measured impedance magnitude and phase difference between the electrode sets are stored in, for example, a storage device of the control unit 201. The control unit 201 determines whether or not all the impedance magnitudes and phase differences between the electrode sets required for calculating the electrical characteristics are stored in the storage device. That is, it is determined whether all the measurements of the impedance magnitude and the phase difference between the predetermined electrode sets defined in the executed program have been performed (step S105).

所定の電極セットは、第1電極21と第4電極24との電極セット、第2電極22と第3電極23との電極セット、第1電極21と第2電極22との電極セット、及び、第3電極23と第4電極24との4つの電極セットである。制御部201は、所定の電極セットのうちのいずれかの電極セットでの測定が行われていないと判定すると(ステップS105でNo)、測定されていない電極セットが第1端子T1及び第2端子T2に接続されるように電極セットを変更する制御信号を生成してスイッチボックス202に送信する(ステップS106)。 The predetermined electrode set includes an electrode set of the first electrode 21 and the fourth electrode 24, an electrode set of the second electrode 22 and the third electrode 23, an electrode set of the first electrode 21 and the second electrode 22, and a predetermined electrode set. It is a set of four electrodes of the third electrode 23 and the fourth electrode 24. When the control unit 201 determines that the measurement has not been performed on any of the predetermined electrode sets (No in step S105), the unmeasured electrode set is the first terminal T1 and the second terminal. A control signal for changing the electrode set so as to be connected to T2 is generated and transmitted to the switch box 202 (step S106).

このように、所定の電極セットにおけるインピーダンスの大きさ及び位相差の測定が全て完了するまで、電極セットを変更しながら、交流電圧(もしくは、交流電流)の印加及びインピーダンスの測定を繰り返す。制御部201は、所定の電極セットのうちの全ての電極セットでの測定が行われたと判定すると(ステップS105でYes)、培養されている細胞99の電気的特性の算出を行う(第3ステップS107)。このようにして、測定値に基づく計算処理によって、細胞99の電気的特性の計測が行われる。 In this way, the application of the AC voltage (or the AC current) and the measurement of the impedance are repeated while changing the electrode set until all the measurements of the impedance magnitude and the phase difference in the predetermined electrode set are completed. When the control unit 201 determines that the measurement has been performed on all the electrode sets in the predetermined electrode set (Yes in step S105), the control unit 201 calculates the electrical characteristics of the cultured cells 99 (third step). S107). In this way, the electrical characteristics of the cell 99 are measured by the calculation process based on the measured values.

また、この電気的特性の計測を、細胞99の培養と並行して継続的に行うことで、細胞99の培養状況に応じて変化する電気的特性を追跡することができる。つまり、ここでの細胞培養方法では、細胞99の培養と並行してステップS101〜第3ステップS107を繰り返し実施する。なお、測定されたインピーダンスからの電気的特性の算出については、後述にて詳細に説明する。 Further, by continuously measuring the electrical characteristics in parallel with the culture of the cells 99, it is possible to track the electrical characteristics that change according to the culture state of the cells 99. That is, in the cell culture method here, steps S101 to 3 steps S107 are repeatedly carried out in parallel with the culture of the cells 99. The calculation of the electrical characteristics from the measured impedance will be described in detail later.

[細胞培養チップ]
以下では、さらに、本実施の形態において用いられる細胞培養チップ100について、より詳細に説明する。図3は、実施の形態に係る細胞培養チップを説明するための概略図である。
[Cell culture chip]
Hereinafter, the cell culture chip 100 used in the present embodiment will be described in more detail. FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the cell culture chip according to the embodiment.

本実施の形態における細胞培養チップ100は、本体部10と、細胞分離膜13と、第1電極21と、第2電極22と、第3電極23と、第4電極24と、を備える。本体部10には、第1流路33及び第2流路41が形成されている。第1流路33は、細胞分離膜13の第1主面13y上(つまり、第1主面13yの上方)に形成され、第2流路41は、細胞分離膜13の第2主面13z上(つまり、第2主面13zの下方)に形成されている。第1主面13y及び第2主面13zは、シート状の細胞分離膜13の互いに背向する主面である。つまり、第1流路33及び第2流路41は、細胞分離膜13を介して分離されている。 The cell culture chip 100 in the present embodiment includes a main body 10, a cell separation membrane 13, a first electrode 21, a second electrode 22, a third electrode 23, and a fourth electrode 24. A first flow path 33 and a second flow path 41 are formed in the main body 10. The first flow path 33 is formed on the first main surface 13y of the cell separation membrane 13 (that is, above the first main surface 13y), and the second flow path 41 is the second main surface 13z of the cell separation membrane 13. It is formed above (that is, below the second main surface 13z). The first main surface 13y and the second main surface 13z are the main surfaces of the sheet-shaped cell separation membrane 13 facing each other. That is, the first flow path 33 and the second flow path 41 are separated via the cell separation membrane 13.

第1電極21及び第2電極22は、第1流路33内を第1流路33に沿って延びている。また、第3電極23及び第4電極24は、第2流路41内を第2流路41に沿って延びている。これにより、第1流路33及び第2流路41が延びる方向において、第1電極21と、第3電極23又は第4電極24との間に均一な電界が形成される。同様に、第1流路33及び第2流路41が延びる方向において、第2電極22と、第3電極23又は第4電極24との間に均一な電界が形成される。つまり、第1流路33及び第2流路41が延びる方向において、いずれの箇所においても略均一に交流電圧が印加されることで、測定されるインピーダンスは培養されている細胞略全体の状態を反映したものとなる。 The first electrode 21 and the second electrode 22 extend in the first flow path 33 along the first flow path 33. Further, the third electrode 23 and the fourth electrode 24 extend in the second flow path 41 along the second flow path 41. As a result, a uniform electric field is formed between the first electrode 21 and the third electrode 23 or the fourth electrode 24 in the direction in which the first flow path 33 and the second flow path 41 extend. Similarly, a uniform electric field is formed between the second electrode 22 and the third electrode 23 or the fourth electrode 24 in the direction in which the first flow path 33 and the second flow path 41 extend. That is, in the direction in which the first flow path 33 and the second flow path 41 extend, the AC voltage is applied substantially uniformly at any of the locations, so that the measured impedance is the state of almost the entire cultured cell. It will be reflected.

本実施の形態では、上記のように構成された細胞培養チップ100を用いて、細胞シートの抵抗成分を、第1電極21〜第4電極24の4つの電極から順次2つの電極を選択し交流電圧を印加した際のインピーダンスとして計測する。 In the present embodiment, using the cell culture chip 100 configured as described above, the resistance component of the cell sheet is exchanged by sequentially selecting two electrodes from the four electrodes 21 to 24 of the first electrode. It is measured as the impedance when a voltage is applied.

細胞分離膜13上では、細胞99が培養される。図中では、第1主面13y上において細胞99が培養されているが、第2主面13z上において細胞99が培養されてもよく、第1主面13y及び第2主面13zの両方の上で細胞99が培養されてもよい。また、第1主面13y上と第2主面13z上とで、同種の細胞を培養してもよく、異なる種類の細胞を培養してもよい。 The cells 99 are cultured on the cell separation membrane 13. In the figure, the cells 99 are cultured on the first main surface 13y, but the cells 99 may be cultured on the second main surface 13z, and both the first main surface 13y and the second main surface 13z may be cultured. Cell 99 may be cultured on top. Further, cells of the same type may be cultured on the first main surface 13y and 13z of the second main surface, or cells of different types may be cultured.

以下、さらに具体的な細胞培養チップ100の構成について、図4A〜図4Cを参照しつつ説明する。図4Aは、実施の形態に係る細胞培養チップの積層構造を説明するための分解斜視図である。図4Aでは、細胞培養チップ100を構成する各部材を分解することによって詳細に示している。 Hereinafter, a more specific configuration of the cell culture chip 100 will be described with reference to FIGS. 4A to 4C. FIG. 4A is an exploded perspective view for explaining the laminated structure of the cell culture chips according to the embodiment. FIG. 4A shows in detail by decomposing each member constituting the cell culture chip 100.

図4Aに示すように、細胞培養チップ100は、本体部10を構成する第1基板11、第1隔壁層12、第2隔壁層14、及び、第2基板15がこの順に積層された積層構造を有する。また、細胞分離膜13は、第1隔壁層12及び第2隔壁層14に挟持されるようにしてこれらの間に配置される。 As shown in FIG. 4A, the cell culture chip 100 has a laminated structure in which the first substrate 11, the first partition wall layer 12, the second partition wall layer 14, and the second substrate 15 constituting the main body 10 are laminated in this order. Have. Further, the cell separation membrane 13 is arranged between the first partition wall layer 12 and the second partition wall layer 14 so as to be sandwiched between them.

第1基板11は、Z軸マイナス側の主面に第1電極21及び第2電極22が形成されたガラス、樹脂、及びセラミックス等の材料から成る板状の部材である。第1基板11は、細胞99を培養する際に当該細胞99と接触するため、細胞毒性を有さない材料で形成される。このことは、以降の細胞培養チップ100を構成する各構成要素のすべてにおいて同様である。第1基板11は、実施の形態においては、透光性を有するガラスから成り、矩形の主面を有する板状部材である。 The first substrate 11 is a plate-shaped member made of a material such as glass, resin, and ceramics in which the first electrode 21 and the second electrode 22 are formed on the main surface on the minus side of the Z axis. The first substrate 11 is made of a material that does not have cytotoxicity because it comes into contact with the cells 99 when the cells 99 are cultured. This is the same for all of the components constituting the subsequent cell culture chip 100. In the embodiment, the first substrate 11 is a plate-shaped member made of translucent glass and having a rectangular main surface.

第1基板11のZ軸マイナス側の主面には、上記した第1電極21及び第2電極22と、第1電極21及び第2電極22の各々を、上記のスイッチボックス202等の細胞培養チップ100の外部に接続するために用いられる第1接点21b及び第2接点22bとが形成される。第1接点21b及び第2接点22bは、第1基板11の外周部に形成されている。第1接点21b及び第2接点22bは、第1基板11のZ軸マイナス側の主面のうち、本体部10の他の部材が積層された際に露出する位置に形成される。 On the main surface of the first substrate 11 on the negative side of the Z axis, the above-mentioned first electrode 21 and second electrode 22 and each of the first electrode 21 and the second electrode 22 are placed in a cell culture such as the above switch box 202. A first contact 21b and a second contact 22b used for connecting to the outside of the chip 100 are formed. The first contact 21b and the second contact 22b are formed on the outer peripheral portion of the first substrate 11. The first contact 21b and the second contact 22b are formed at positions on the main surface of the first substrate 11 on the minus side of the Z axis that are exposed when the other members of the main body 10 are laminated.

また、第1接点21bと第1電極21とは、第1引き出し線21aを介して接続されている。したがって、第1引き出し線21aの形状を変更することにより、第1接点21bは、第1基板11の任意の箇所に形成できる。例えば、第1引き出し線21aが第1基板11の両主面を貫通する場合、第1接点21bは、第1基板11のZ軸プラス側の主面に形成されてもよい。同様に、第2接点22bと第2電極22とは、第2引き出し線22aを介して接続され、第2引き出し線22aの形状により、第2接点22bが第1基板11の任意の箇所に形成できる。 Further, the first contact 21b and the first electrode 21 are connected via the first lead wire 21a. Therefore, by changing the shape of the first leader wire 21a, the first contact point 21b can be formed at an arbitrary position on the first substrate 11. For example, when the first lead-out wire 21a penetrates both main surfaces of the first substrate 11, the first contact 21b may be formed on the main surface on the Z-axis plus side of the first substrate 11. Similarly, the second contact 22b and the second electrode 22 are connected via the second lead wire 22a, and the second contact 22b is formed at an arbitrary position on the first substrate 11 due to the shape of the second lead wire 22a. can.

第1電極21、第1接点21b、及び、第1引き出し線21a、ならびに、第2電極22、第2接点22b、及び、第2引き出し線22aは、導電性を有すればどのような材料で形成されてもよい。また、第1電極21、第1接点21b、及び、第1引き出し線21a、ならびに、第2電極22、第2接点22b、及び、第2引き出し線22aは、同じ材料で形成されてもよく、それぞれ異なる材料で形成されてもよい。本実施の形態においては、第1電極21、第1接点21b、及び、第1引き出し線21a、ならびに、第2電極22、第2接点22b、及び、第2引き出し線22aは、いずれも酸化インジウム錫(ITO)膜によって形成される。 The first electrode 21, the first contact 21b, and the first lead wire 21a, and the second electrode 22, the second contact 22b, and the second lead wire 22a are made of any material as long as they have conductivity. It may be formed. Further, the first electrode 21, the first contact 21b, and the first leader wire 21a, and the second electrode 22, the second contact 22b, and the second leader wire 22a may be made of the same material. They may be made of different materials. In the present embodiment, the first electrode 21, the first contact 21b, and the first lead wire 21a, and the second electrode 22, the second contact 22b, and the second lead wire 22a are all indium oxide. It is formed by a tin (ITO) film.

ITO膜は、透明電極の一種であり、ITO膜を介して主面の一方側から他方側を視認可能にできる。このように透明電極を用いることで、上記の第1基板11の透光性と併せて、第1基板11のZ軸プラス側から本体部10の内側を視認可能に構成できる。より詳しくは、本体部10の内部に形成された第1流路33を、第1基板11を介して視認することができるため、第1流路33内で培養される細胞99が視覚的に観察可能となる。 The ITO film is a kind of transparent electrode, and the other side can be visually recognized from one side of the main surface through the ITO film. By using the transparent electrode in this way, it is possible to visually configure the inside of the main body 10 from the Z-axis plus side of the first substrate 11 in addition to the translucency of the first substrate 11 described above. More specifically, since the first flow path 33 formed inside the main body portion 10 can be visually recognized via the first substrate 11, the cells 99 cultured in the first flow path 33 can be visually recognized. It becomes observable.

第1電極21、第1接点21b、及び、第1引き出し線21a、ならびに、第2電極22、第2接点22b、及び、第2引き出し線22aは、第1基板11上にスパッタリング等によってITO膜を成膜し、フォトリソグラフィ等によってパターン加工して一体的に形成される。これにより、膜厚が略均一な第1電極21及び第2電極22等が形成される。 The first electrode 21, the first contact 21b, and the first lead wire 21a, and the second electrode 22, the second contact 22b, and the second lead wire 22a are formed on the first substrate 11 by sputtering or the like to form an ITO film. Is formed into a film and patterned by photolithography or the like to be integrally formed. As a result, the first electrode 21, the second electrode 22, and the like having a substantially uniform film thickness are formed.

なお、第1電極21、第1接点21b、及び、第1引き出し線21a、ならびに、第2電極22、第2接点22b、及び、第2引き出し線22aの形成は、他の公知の技術を用いて行ってもよい。また、第1電極21、第1接点21b、及び、第1引き出し線21a、ならびに、第2電極22、第2接点22b、及び、第2引き出し線22aの材料にはITOではなく、金、白金等の導電性薄膜が用いられてもよい。なお、第1電極21及び第2電極22は、パターン加工によって形成される、主面を有する平板状であるが、第1基板11上に配置された針金状の配線材であってもよい。 The first electrode 21, the first contact 21b, and the first lead wire 21a, and the second electrode 22, the second contact 22b, and the second lead wire 22a are formed by using other known techniques. You may go there. Further, the materials of the first electrode 21, the first contact 21b, the first lead wire 21a, the second electrode 22, the second contact 22b, and the second lead wire 22a are not ITO but gold and platinum. Or the like, a conductive thin film may be used. The first electrode 21 and the second electrode 22 are flat plates having a main surface formed by pattern processing, but may be wire-shaped wiring materials arranged on the first substrate 11.

第1電極21、第1接点21b、及び、第1引き出し線21aと、第2電極22、第2接点22b、及び、第2引き出し線22aとは、Y軸方向において第1基板11を二等分する中心線を対称線として、互いに離間した状態で略線対称に形成されている。 The first electrode 21, the first contact 21b, and the first lead wire 21a, and the second electrode 22, the second contact 22b, and the second lead wire 22a bisect the first substrate 11 in the Y-axis direction. The center line to be divided is used as a symmetric line, and the symmetric lines are formed substantially symmetrically in a state of being separated from each other.

第1基板11は、上記の導電性の電極等に短絡が生じないように、絶縁性材料によって形成されればよい。また、第1基板11には、積層される第1隔壁層12に通じるように、所定方向に沿って第1基板11を厚み方向(Z軸方向)貫通する第1開口31及び31a、ならびに、第2開口32及び32aが設けられる。これらの開口は、上記した第1流路33及び第2流路41にアクセスするために用いられる。例えば、第1開口31は、第1流路33に試料等の液体を供給するための入口を成し、第1開口31aは、第1流路33から試料等の液体を排出するための出口を成す。 The first substrate 11 may be formed of an insulating material so that a short circuit does not occur in the conductive electrode or the like. Further, the first substrate 11 has first openings 31 and 31a that penetrate the first substrate 11 in the thickness direction (Z-axis direction) along a predetermined direction so as to pass through the laminated first partition wall layer 12, and Second openings 32 and 32a are provided. These openings are used to access the first flow path 33 and the second flow path 41 described above. For example, the first opening 31 forms an inlet for supplying a liquid such as a sample to the first flow path 33, and the first opening 31a is an outlet for discharging the liquid such as a sample from the first flow path 33. Make up.

第1隔壁層12は、例えば、シリコーン樹脂によって形成された板状の部材である。第1隔壁層12は、積層構造において第1隔壁層12に接する第1基板11、第2隔壁層14、及び、細胞分離膜13との密着性が高い樹脂等の材料であれば、他の材料を用いて形成されてもよい。第1隔壁層12は、少なくとも一部が第1基板11に形成された第1電極21及び第2電極22に対応して第1隔壁層12を厚み方向(Z軸方向)に貫通する第1貫通孔を有する。第1貫通孔は、第1流路33に対応している。第1貫通孔の両端は、第1基板11に形成された第1開口31及び31aに対応している。また、第1隔壁層12には、第2開口32及び32aに対応し、積層される第2隔壁層14に通じるように、第1隔壁層12を厚み方向に貫通する第3開口32b及び32cが設けられる。 The first partition wall layer 12 is, for example, a plate-shaped member formed of a silicone resin. The first partition wall layer 12 may be another material such as a resin having high adhesion to the first substrate 11, the second partition wall layer 14, and the cell separation membrane 13 in contact with the first partition wall layer 12 in the laminated structure. It may be formed using a material. The first partition wall layer 12 has at least a portion corresponding to the first electrode 21 and the second electrode 22 formed on the first substrate 11 and penetrates the first partition wall layer 12 in the thickness direction (Z-axis direction). It has a through hole. The first through hole corresponds to the first flow path 33. Both ends of the first through hole correspond to the first openings 31 and 31a formed in the first substrate 11. Further, in the first partition wall layer 12, the third openings 32b and 32c corresponding to the second openings 32 and 32a and penetrating the first partition wall layer 12 in the thickness direction so as to lead to the laminated second partition wall layer 14. Is provided.

細胞分離膜13は、一般にメンブレンとも呼ばれ、第1隔壁層12側の第1主面13y及び第1主面13yに背向する第2隔壁層14側の第2主面13zを有する膜状部材である。細胞分離膜13は、所定の孔径の孔が多数設けられた多孔質性の樹脂材料によって形成される。細胞分離膜13に設けられた孔は、第1主面13yと第2主面13zとを貫通し、第1主面13y及び第2主面13z間のイオンなどの電解質、及び、所定の孔径より小さい微小粒子等を通過させる。なお、所定の孔径とは、不均一な孔径を有する多数の孔のそれぞれの孔径の平均値である。また、所定の孔径は、細胞培養チップ100を用いて培養される細胞99の細胞径よりも十分に小さく設定され、例えば3マイクロメートルなどが設定される。 The cell separation membrane 13 is also generally called a membrane, and has a membrane shape having a first main surface 13y on the first partition wall layer 12 side and a second main surface 13z on the second partition wall layer 14 side facing back to the first main surface 13y. It is a member. The cell separation membrane 13 is formed of a porous resin material provided with a large number of pores having a predetermined pore diameter. The pores provided in the cell separation membrane 13 penetrate the first main surface 13y and the second main surface 13z, and have an electrolyte such as ions between the first main surface 13y and the second main surface 13z, and a predetermined pore diameter. Allows smaller particles to pass through. The predetermined hole diameter is an average value of the hole diameters of a large number of holes having non-uniform hole diameters. Further, the predetermined pore diameter is set sufficiently smaller than the cell diameter of the cells 99 cultured using the cell culture chip 100, and is set to, for example, 3 micrometers.

このように、細胞分離膜13は、所定の孔径よりも十分に大きい細胞99が第1主面13yから第2主面13z、又は、第2主面13zから第1主面13yへと通過することを抑制し、所定の孔径よりも小さい溶液成分(例えば、培地成分等)を交換可能な半通過性膜である。また、細胞分離膜13は、細胞培養チップ100において培養される細胞99が接着細胞である場合、当該細胞99の足場としての機能も有する。したがって、この場合には、細胞分離膜13は、培養される細胞99が接着可能な材料が選定されて用いられる。細胞分離膜13は、第1貫通孔及び後述する第2貫通孔に対応する箇所に配置され、積層方向(つまりZ軸方向)から見た平面視における第1貫通孔及び第2貫通孔の外側で第1隔壁層12と第2隔壁層14との間に挟持される。 In this way, in the cell separation membrane 13, cells 99 sufficiently larger than a predetermined pore size pass from the first main surface 13y to the second main surface 13z, or from the second main surface 13z to the first main surface 13y. It is a semi-transmissive membrane capable of suppressing this and exchanging solution components (for example, medium components) smaller than a predetermined pore size. Further, when the cells 99 cultured in the cell culture chip 100 are adherent cells, the cell separation membrane 13 also has a function as a scaffold for the cells 99. Therefore, in this case, the cell separation membrane 13 is selected and used as a material to which the cultured cells 99 can adhere. The cell separation membrane 13 is arranged at a location corresponding to the first through hole and the second through hole described later, and is outside the first through hole and the second through hole in a plan view seen from the stacking direction (that is, the Z-axis direction). It is sandwiched between the first partition wall layer 12 and the second partition wall layer 14.

このようにすることで、第1貫通孔と第2貫通孔とが重なる箇所において、細胞分離膜13によって第1流路33及び第2流路41がそれぞれ区画される。ここで、第1電極21及び第2電極22が形成された第1基板11の主面の一部、第1貫通孔、ならびに、第1主面13yによって画定される第1主流路33aが第1流路33の一部として形成される。言い換えると、第1基板11と細胞分離膜13との間に第1貫通孔によって第1主流路33aが形成される。 By doing so, the first flow path 33 and the second flow path 41 are respectively partitioned by the cell separation membrane 13 at the location where the first through hole and the second through hole overlap. Here, a part of the main surface of the first substrate 11 on which the first electrode 21 and the second electrode 22 are formed, the first through hole, and the first main flow path 33a defined by the first main surface 13y are the first. It is formed as a part of one flow path 33. In other words, the first main flow path 33a is formed by the first through hole between the first substrate 11 and the cell separation membrane 13.

第1電極21及び第2電極22は、このように画定される第1流路33の、特に、第1主流路33aに接しており、第1主流路33a内を第1主流路33aに沿って延びる。また、第1流路33には、第1開口31に対応する一端に第1流入口33c、第1開口31aに対応する他端に第1流出口33eが形成され、それぞれ第1開口31及び31aを介して細胞培養チップ100の外部に連通している。 The first electrode 21 and the second electrode 22 are in contact with the first main flow path 33a defined in this way, particularly the first main flow path 33a, and the inside of the first main flow path 33a is along the first main flow path 33a. Extends. Further, in the first flow path 33, a first inflow port 33c is formed at one end corresponding to the first opening 31, and a first outlet 33e is formed at the other end corresponding to the first opening 31a, respectively. It communicates with the outside of the cell culture chip 100 via 31a.

また、第1流路33には、第1流入口33cから第1主流路33aにつながる第1流入路33b、及び、第1流出口33eから第1主流路33aにつながる第1流出路33dが形成される。第1流入路33b及び第1流出路33dは、第1主流路33aを画定する細胞分離膜13に対して、第2隔壁層14によって画定される。つまり、細胞分離膜13は、第1主流路33aを画定する大きさがあればよく、第1隔壁層12の全体に及んでいなくてもよい。なお、例えば、第1流入路33bは、第1主流路33aが延びる方向に対してY軸マイナス側かつX軸プラス側に30度傾斜して延びている。また、第1流出路33dは、第1主流路33aが延びる方向に対してY軸プラス側かつX軸マイナス側に30度傾斜して延びている。 Further, in the first flow path 33, a first inflow path 33b connecting the first inflow port 33c to the first main flow path 33a and a first outflow path 33d connecting the first outflow port 33e to the first main flow path 33a are provided. It is formed. The first inflow path 33b and the first outflow path 33d are defined by the second partition wall layer 14 with respect to the cell separation membrane 13 defining the first main flow path 33a. That is, the cell separation membrane 13 may have a size that defines the first main flow path 33a, and may not cover the entire first partition wall layer 12. For example, the first inflow path 33b extends at an inclination of 30 degrees toward the Y-axis minus side and the X-axis plus side with respect to the direction in which the first main flow path 33a extends. Further, the first outflow path 33d extends at an inclination of 30 degrees toward the Y-axis plus side and the X-axis minus side with respect to the direction in which the first main flow path 33a extends.

第2隔壁層14は、例えば、シリコーン樹脂によって形成された板状の部材である。第2隔壁層14は、積層構造において第2隔壁層14に接する第2基板15、第1隔壁層12、及び、細胞分離膜13との密着性が高い樹脂等の材料であれば、他の材料を用いて形成されてもよい。第2隔壁層14は、少なくとも一部が、後述する第2基板15に形成された第3電極23及び第4電極24に対応して第2隔壁層14を厚み方向(Z軸方向)に貫通する第2貫通孔を有する。第2貫通孔は、第2流路41に対応している。第2貫通孔の両端は、第1基板11に形成された第2開口32及び32a、ならびに、第1隔壁層12に形成された第3開口32b及び32cに対応している。 The second partition wall layer 14 is, for example, a plate-shaped member formed of a silicone resin. The second partition wall layer 14 may be another material such as a resin having high adhesion to the second substrate 15, the first partition wall layer 12, and the cell separation membrane 13 in contact with the second partition wall layer 14 in the laminated structure. It may be formed using a material. At least a part of the second partition wall layer 14 penetrates the second partition wall layer 14 in the thickness direction (Z-axis direction) corresponding to the third electrode 23 and the fourth electrode 24 formed on the second substrate 15 described later. Has a second through hole. The second through hole corresponds to the second flow path 41. Both ends of the second through hole correspond to the second openings 32 and 32a formed in the first substrate 11 and the third openings 32b and 32c formed in the first partition wall layer 12.

ここで、上記の第1隔壁層12の場合と同様に、第3電極23及び第4電極24が形成された第2基板15の主面の一部、第2貫通孔、ならびに、第2主面13zによって画定される第2主流路41aが第2流路41の一部として形成される。言い換えると、第2基板15と細胞分離膜13との間に第2貫通孔によって第2主流路41aが形成される。第3電極23及び第4電極24は、このように画定される第2流路41の、特に、第2主流路41aに接しており、第2主流路41a内を第2主流路41aに沿って延びる。 Here, as in the case of the first partition wall layer 12, a part of the main surface of the second substrate 15 on which the third electrode 23 and the fourth electrode 24 are formed, the second through hole, and the second main. The second main flow path 41a defined by the surface 13z is formed as a part of the second flow path 41. In other words, the second main flow path 41a is formed by the second through hole between the second substrate 15 and the cell separation membrane 13. The third electrode 23 and the fourth electrode 24 are in contact with the second main flow path 41a defined in this way, particularly the second main flow path 41a, and the inside of the second main flow path 41a is along the second main flow path 41a. Extends.

また、第2流路41には、第2開口32及び第3開口32bに対応する一端に第2流入口41c、第2開口32a及び第3開口32cに対応する他端に第2流出口41eが形成される。このように、第2流入口41cは第2開口32及び第3開口32bを介して、第2流出口41eは第2開口32a及び第3開口32cを介して、細胞培養チップ100の外部にそれぞれ連通している。 Further, in the second flow path 41, the second inlet 41c is at one end corresponding to the second opening 32 and the third opening 32b, and the second outlet 41e is at the other end corresponding to the second opening 32a and the third opening 32c. Is formed. As described above, the second inlet 41c passes through the second opening 32 and the third opening 32b, and the second outlet 41e passes through the second opening 32a and the third opening 32c to the outside of the cell culture chip 100, respectively. Communicate.

また、第2流路41には、第2流入口41cから第2主流路41aにつながる第2流入路41b、及び、第2流出口41eから第2主流路41aにつながる第2流出路41dが形成される。第2流入路41b及び第2流出路41dは、第2主流路41aを画定する細胞分離膜13に対して、第1隔壁層12によって画定される。つまり、細胞分離膜13は、第2主流路41aを画定する大きさがあればよく、第2隔壁層14の全体に及んでいなくてもよい。なお、このような構成とするため、第2流入路41b及び第2流出路41dは、第1流入路33b及び第1流出路33dが延びる方向と重ならない方向に延びている。例えば、第2流入路41bは、第2主流路41aが延びる方向に対してY軸マイナス側かつX軸マイナス側に30度傾斜して延びている。また、第2流出路41dは、第2主流路41aが延びる方向に対してY軸プラス側かつX軸プラス側に30度傾斜して延びている。 Further, in the second flow path 41, a second inflow path 41b connecting the second inflow port 41c to the second main flow path 41a and a second outflow path 41d connecting the second outflow port 41e to the second main flow path 41a are provided. It is formed. The second inflow passage 41b and the second outflow passage 41d are defined by the first partition wall layer 12 with respect to the cell separation membrane 13 defining the second main flow path 41a. That is, the cell separation membrane 13 may have a size that defines the second main flow path 41a, and may not cover the entire second partition wall layer 14. In addition, in order to make such a configuration, the second inflow passage 41b and the second outflow passage 41d extend in a direction that does not overlap with the direction in which the first inflow passage 33b and the first outflow passage 33d extend. For example, the second inflow path 41b extends at an inclination of 30 degrees toward the minus side of the Y axis and the minus side of the X axis with respect to the direction in which the second main flow path 41a extends. Further, the second outflow path 41d extends at an inclination of 30 degrees toward the Y-axis plus side and the X-axis plus side with respect to the direction in which the second main flow path 41a extends.

第2基板15は、Z軸プラス側の主面に第3電極23及び第4電極24が形成されたガラス、樹脂、及びセラミックス等の材料から成る板状の部材である。第2基板15は、実施の形態においては、透光性を有するガラスから成り、矩形の主面を有する板状部材である。 The second substrate 15 is a plate-shaped member made of a material such as glass, resin, and ceramics in which the third electrode 23 and the fourth electrode 24 are formed on the main surface on the plus side of the Z axis. In the embodiment, the second substrate 15 is a plate-shaped member made of translucent glass and having a rectangular main surface.

第2基板15のZ軸プラス側の主面には、上記した第3電極23及び第4電極24と、第3電極23及び第4電極24の各々を、上記のスイッチボックス202等の細胞培養チップ100の外部に接続するために用いられる第3接点23b及び第4接点24bとが形成される。第3接点23b及び第4接点24bは、第2基板15の外周部に形成されている。第3接点23b及び第4接点24bは、第2基板15のZ軸プラス側の主面のうち、本体部10の他の部材が積層された際に露出する位置に形成される。 On the main surface on the Z-axis plus side of the second substrate 15, the above-mentioned third electrode 23 and fourth electrode 24, and each of the third electrode 23 and the fourth electrode 24 are placed in a cell culture such as the above-mentioned switch box 202. A third contact 23b and a fourth contact 24b used for connecting to the outside of the chip 100 are formed. The third contact 23b and the fourth contact 24b are formed on the outer peripheral portion of the second substrate 15. The third contact 23b and the fourth contact 24b are formed at positions on the main surface on the Z-axis plus side of the second substrate 15 that are exposed when the other members of the main body 10 are laminated.

また、第3接点23bと第3電極23とは、第3引き出し線23aを介して接続されている。したがって、第3引き出し線23aの形状を変更することにより、第3接点23bは、第2基板15の任意の箇所に形成できる。例えば、第3引き出し線23aが第2基板15の両主面を貫通する場合、第3接点23bは、第2基板15のZ軸マイナス側の主面に形成されてもよい。同様に、第4接点24bと第4電極24とは、第4引き出し線24aを介して接続され、第4引き出し線24aの形状により、第4接点24bが第2基板15の任意の箇所に形成できる。 Further, the third contact 23b and the third electrode 23 are connected via a third lead wire 23a. Therefore, by changing the shape of the third leader wire 23a, the third contact 23b can be formed at an arbitrary position on the second substrate 15. For example, when the third leader wire 23a penetrates both main surfaces of the second substrate 15, the third contact 23b may be formed on the main surface on the negative side of the Z axis of the second substrate 15. Similarly, the 4th contact 24b and the 4th electrode 24 are connected via the 4th leader wire 24a, and the 4th contact 24b is formed at an arbitrary position on the 2nd substrate 15 due to the shape of the 4th leader wire 24a. can.

第3電極23、第3接点23b、及び、第3引き出し線23a、ならびに、第4電極24、第4接点24b、及び、第4引き出し線24aは、導電性を有すればどのような材料で形成されてもよい。また、第3電極23、第3接点23b、及び、第3引き出し線23a、ならびに、第4電極24、第4接点24b、及び、第4引き出し線24aは、同じ材料で形成されてもよく、それぞれ異なる材料で形成されてもよい。本実施の形態においては、第3電極23、第3接点23b、及び、第3引き出し線23a、ならびに、第4電極24、第4接点24b、及び、第4引き出し線24aは、いずれもITO膜によって形成される。 The third electrode 23, the third contact 23b, and the third leader wire 23a, and the fourth electrode 24, the fourth contact 24b, and the fourth leader wire 24a are made of any material as long as they have conductivity. It may be formed. Further, the third electrode 23, the third contact 23b, and the third leader wire 23a, and the fourth electrode 24, the fourth contact 24b, and the fourth leader wire 24a may be made of the same material. They may be made of different materials. In the present embodiment, the third electrode 23, the third contact 23b, and the third leader wire 23a, and the fourth electrode 24, the fourth contact 24b, and the fourth leader wire 24a are all ITO films. Formed by.

上記の第1基板11の場合と同様に、透明電極のITO膜を介して主面の一方側から他方側を視認可能にできる。このように透明電極を用いることで、上記の第2基板15の透光性と併せて、第2基板15のZ軸マイナス側から本体部10の内側を視認可能に構成できる。より詳しくは、本体部10の内部に形成された第2流路41を、第2基板15を介して視認することができるため、第2流路41内で培養される細胞99が視覚的に観察可能となる。 Similar to the case of the first substrate 11 described above, the other side can be visually recognized from one side of the main surface via the ITO film of the transparent electrode. By using the transparent electrode in this way, it is possible to visually configure the inside of the main body 10 from the Z-axis minus side of the second substrate 15 in addition to the translucency of the second substrate 15 described above. More specifically, since the second flow path 41 formed inside the main body portion 10 can be visually recognized via the second substrate 15, the cells 99 cultured in the second flow path 41 can be visually recognized. It becomes observable.

第3電極23、第3接点23b、及び、第3引き出し線23a、ならびに、第4電極24、第4接点24b、及び、第4引き出し線24aは、第2基板15上にスパッタリング等によってITO膜を成膜し、フォトリソグラフィ等によってパターン加工して一体的に形成される。これにより、膜厚が略均一な第3電極23及び第4電極24等が形成される。 The third electrode 23, the third contact 23b, and the third leader wire 23a, and the fourth electrode 24, the fourth contact 24b, and the fourth leader wire 24a are formed on the second substrate 15 by sputtering or the like to form an ITO film. Is formed into a film and patterned by photolithography or the like to be integrally formed. As a result, the third electrode 23, the fourth electrode 24, and the like having a substantially uniform film thickness are formed.

なお、第3電極23、第3接点23b、及び、第3引き出し線23a、ならびに、第4電極24、第4接点24b、及び、第4引き出し線24aの形成は、他の公知の技術を用いて行ってもよい。また、第3電極23、第3接点23b、及び、第3引き出し線23a、ならびに、第4電極24、第4接点24b、及び、第4引き出し線24aの材料にはITOではなく、金、白金等の導電性薄膜が用いられてもよい。なお、第3電極23及び第4電極24は、パターン加工によって形成される、主面を有する平板状であるが、第2基板15上に配置された針金状の配線材であってもよい。 The third electrode 23, the third contact 23b, and the third leader wire 23a, and the fourth electrode 24, the fourth contact 24b, and the fourth leader wire 24a are formed by using other known techniques. You may go there. Further, the materials of the third electrode 23, the third contact 23b, and the third leader wire 23a, and the fourth electrode 24, the fourth contact 24b, and the fourth leader wire 24a are not ITO but gold and platinum. Or the like, a conductive thin film may be used. The third electrode 23 and the fourth electrode 24 are flat plates having a main surface formed by pattern processing, but may be wire-shaped wiring materials arranged on the second substrate 15.

第3電極23、第3接点23b、及び、第3引き出し線23aと、第4電極24、第4接点24b、及び、第4引き出し線24aとは、Y軸方向において第2基板15を二等分する中心線を対称線として、互いに離間した状態で略線対称に形成されている。また、第3接点23b及び第4接点24bは、X軸方向において第2基板15を二等分する中心線よりもX軸方向プラス側に配置されている。一方、第1接点21b及び第2接点22bは、X軸方向において第1基板11を二等分する中心線よりもX軸方向マイナス側に配置されている。これにより第1接点21b及び第4接点24bは、積層方向から見た平面視において重ならず、第2接点22b及び第3接点23bは、積層方向から見た平面視において重ならない。つまり、このような電極の配置は、細胞培養チップ100の各電極を外部に接続する際に、空間的な障壁を緩和できる構成である。 The third electrode 23, the third contact 23b, and the third leader wire 23a, and the fourth electrode 24, the fourth contact 24b, and the fourth leader wire 24a bisect the second substrate 15 in the Y-axis direction. The center line to be divided is used as a symmetric line, and the symmetric lines are formed substantially symmetrically in a state of being separated from each other. Further, the third contact 23b and the fourth contact 24b are arranged on the plus side in the X-axis direction with respect to the center line that bisects the second substrate 15 in the X-axis direction. On the other hand, the first contact 21b and the second contact 22b are arranged on the minus side in the X-axis direction with respect to the center line that bisects the first substrate 11 in the X-axis direction. As a result, the first contact 21b and the fourth contact 24b do not overlap in the plan view seen from the stacking direction, and the second contact 22b and the third contact 23b do not overlap in the plan view seen from the stacking direction. That is, such an arrangement of the electrodes is a configuration that can alleviate the spatial barrier when connecting each electrode of the cell culture chip 100 to the outside.

第2基板15は、上記の導電性の電極等に短絡が生じないように、絶縁性材料によって形成されればよい。 The second substrate 15 may be formed of an insulating material so that a short circuit does not occur in the conductive electrode or the like.

図4Bは、実施の形態に係る細胞培養チップを示す斜視図である。また、図4Cは、図4Bに示すC−C線で切断した細胞培養チップの断面図である。図4B及び図4Cに示すように、本体部10を構成する第1基板11、第1隔壁層12、第2隔壁層14、及び、第2基板15と、細胞分離膜13との積層によって、内部に第1流路33及び第2流路41を有する細胞培養チップ100が形成される。細胞分離膜13は、特に、第1主流路33a及び第2主流路41aに対応する位置において、培地成分及びイオン等を交換可能に第1流路33と第2流路41とを隔てている。このように、第1主流路33aと第2主流路41aとにおいて電解質が交換可能であることから、第1主流路33aと第2主流路41aとはそれぞれの流路を通流する培地成分及びイオン等の電解質を含む第1流体91及び第2流体92によって電気的に接続される。 FIG. 4B is a perspective view showing a cell culture chip according to an embodiment. Further, FIG. 4C is a cross-sectional view of the cell culture chip cut along the line CC shown in FIG. 4B. As shown in FIGS. 4B and 4C, by laminating the first substrate 11, the first partition wall layer 12, the second partition wall layer 14, and the second substrate 15 constituting the main body 10, and the cell separation membrane 13. A cell culture chip 100 having a first flow path 33 and a second flow path 41 is formed inside. The cell separation membrane 13 particularly separates the first main flow path 33 and the second main flow path 41 so that medium components, ions, and the like can be exchanged at positions corresponding to the first main flow path 33a and the second main flow path 41a. .. As described above, since the electrolytes can be exchanged between the first main flow path 33a and the second main flow path 41a, the first main flow path 33a and the second main flow path 41a have the medium components and the medium components flowing through the respective flow paths. It is electrically connected by a first fluid 91 and a second fluid 92 containing an electrolyte such as ions.

図4Cの紙面下方には、第1流路33及び第2流路41が重なる箇所の拡大断面図を示している。本図に示すように、細胞培養チップ100において細胞99が培養されることで、細胞分離膜13の、例えば、第1主面13y上で細胞99が互いに細胞間結合を形成して細胞シートが形成される。細胞分離膜13を介した培地成分及びイオン等の交換は、形成された細胞シートによって制限される。このように、細胞シートの形成によって、電気的に接続された第1流路33と第2流路41との間に電気抵抗が発生する。このとき、第1電極21、第2電極22、第3電極23、及び、第4電極24を用いて、細胞シートを挟む配置で、当該細胞シートの電気抵抗を計測することが可能となる。 Below the paper surface of FIG. 4C, an enlarged cross-sectional view of a portion where the first flow path 33 and the second flow path 41 overlap is shown. As shown in this figure, when the cells 99 are cultured in the cell culture chip 100, the cells 99 form intercellular bonds with each other on the cell separation membrane 13, for example, the first main surface 13y, and the cell sheet is formed. It is formed. The exchange of medium components, ions, etc. through the cell separation membrane 13 is restricted by the formed cell sheet. As described above, the formation of the cell sheet generates electrical resistance between the electrically connected first flow path 33 and the second flow path 41. At this time, the electric resistance of the cell sheet can be measured by using the first electrode 21, the second electrode 22, the third electrode 23, and the fourth electrode 24 in an arrangement that sandwiches the cell sheet.

以下では、引き続き図4Cを参照しつつ、さらに図5及び図6を参照することによって、本実施の形態における細胞99の電気抵抗の計測方法について説明する。図4Cの拡大断面図ではさらに、本実施の形態における各電極と細胞99とを接続する回路モデルを示している。本実施の形態の計測方法では、図中の回路モデルを用いて細胞99の電気抵抗を含む電気的特性の計測を行う。ここで、上記したように、細胞99は、電気抵抗性(図中の抵抗R)とともに容量性(図中の容量C)を示す。電気的特性は、上記した抵抗R及び容量Cを含む概念である。 In the following, a method for measuring the electrical resistance of the cell 99 in the present embodiment will be described with reference to FIGS. 4C and 5 and 6. The enlarged cross-sectional view of FIG. 4C further shows a circuit model for connecting each electrode and the cell 99 in the present embodiment. In the measurement method of the present embodiment, the electrical characteristics including the electrical resistance of the cells 99 are measured using the circuit model in the figure. Here, as described above, the cells 99 show capacitance (capacitance C p in the figure) as well as electrical resistance (resistance R p in the figure). The electrical property is a concept including the above-mentioned resistance R p and capacitance C p.

なお、詳細は後述するが、抵抗R及び容量Cは、互いに相関する数値であるため、少なくとも一方を計測することで、他方を計算によって算出できる。また、電気的特性として、これら抵抗R及び容量Cの周波数依存性を計測してもよいし、抵抗R及び容量Cに誤差を生じさせる要因に応じて、当該誤差を補正するための補正係数を計測してもよい。 Although the details will be described later, since the resistance R p and the capacitance C p are numerical values that correlate with each other, the other can be calculated by measuring at least one of them. Further, as the electrical characteristics may be measured the frequency dependence of these resistors R p and the capacitance C p, depending on the factors that cause an error in the resistance R p and the capacitance C p, for correcting the error The correction coefficient of may be measured.

本実施の形態において用いる回路モデルでは、抵抗R及び容量Cが並列に接続された回路要素を含むとみなせる。また、計測に用いられる各電極は、内部抵抗を有する。具体的に、第1電極21は第1抵抗rを有し、第2電極22は第2抵抗rを有し、第3電極23は第3抵抗rを有し、第4電極24は第4抵抗rを有する。また、実施の形態において、用いられるITO膜は、培地成分との間で電気二重層を形成するため、容量性を示す。すなわち、第1電極21と第1流体91との間に第1容量Cが存在し、第2電極22と第1流体91との間に第2容量Cが存在し、第3電極23と第2流体92との間に第3容量Cが存在し、第4電極24と第2流体92との間に第4容量Cが存在するとみなせる。 In the circuit model used in this embodiment, it can be considered that the resistor R p and the capacitance C p include circuit elements connected in parallel. In addition, each electrode used for measurement has an internal resistance. Specifically, the first electrode 21 has a first resistance r 1 , the second electrode 22 has a second resistance r 2 , the third electrode 23 has a third resistance r 3 , and the fourth electrode 24 has. has a fourth resistor r 4. Further, in the embodiment, the ITO film used exhibits a capacitance because it forms an electric double layer with the medium component. That is, the first capacitance C 1 exists between the first electrode 21 and the first fluid 91 , the second capacitance C 2 exists between the second electrode 22 and the first fluid 91, and the third electrode 23 exists. It can be considered that the third capacitance C 3 exists between the second fluid 92 and the second fluid 92, and the fourth capacitance C 4 exists between the fourth electrode 24 and the second fluid 92.

図示するように、第1電極21と第2電極22とは、いずれも第1流路33内に配置され、第1流体91を介して電気的に接続されている。このとき第1電極21と第2電極22との間には、細胞シートが介在しないので、抵抗R及び容量Cを含む回路要素は接続されていない。なお、第1流体91にも抵抗成分が存在するため、第1電極21及び第2電極22を結ぶ経路上に水平方向の抵抗が存在するとみなせる。水平方向の抵抗は、第1電極21と第2電極22との間の距離に比例し、第1隔壁層12の厚み方向における第1流路33の長さに反比例する。このように、水平方向の抵抗は、流路及び電極の設計と関係する。また、第1電極21及び抵抗R及び容量Cを含む回路要素の間、ならびに、第2電極22及び回路要素の間には、垂直方向の抵抗が存在するとみなせる。垂直方向の抵抗は、第1流体91の性質(例えば、電気伝導度等)に依存する値である。 As shown in the figure, both the first electrode 21 and the second electrode 22 are arranged in the first flow path 33 and are electrically connected via the first fluid 91. At this time, since the cell sheet does not intervene between the first electrode 21 and the second electrode 22, the circuit element including the resistance R p and the capacitance C p is not connected. Since the resistance component also exists in the first fluid 91, it can be considered that the resistance in the horizontal direction exists on the path connecting the first electrode 21 and the second electrode 22. The resistance in the horizontal direction is proportional to the distance between the first electrode 21 and the second electrode 22, and is inversely proportional to the length of the first flow path 33 in the thickness direction of the first partition wall layer 12. Thus, the horizontal resistance is related to the design of the flow path and electrodes. Further, it can be considered that there is a vertical resistance between the first electrode 21 and the circuit element including the resistor R p and the capacitance C p , and between the second electrode 22 and the circuit element. The resistance in the vertical direction is a value that depends on the properties of the first fluid 91 (for example, electrical conductivity and the like).

ここで、第1電極21及び第2電極22は、Y軸方向に直交する平面(XZ平面)を対称面とした対称な形状である。したがって、細胞シートに対して、第1電極21及び第2電極22は、略等価の配置及び形状を有する。このことから、第1電極21及び第2電極22間の水平方向の抵抗は、2つの第1水平抵抗α・rが直列に接続された抵抗であるとみなすことができる。ここで、αは第1電極21と第2電極22との間の距離に比例し、第1隔壁層12の厚み方向における第1流路33の長さに反比例する、細胞培養チップ100の設計によって決まる定数である。また、2つの第1水平抵抗α・rの間の接続ノードと、抵抗R及び容量Cを含む回路要素との間に1つの第1垂直抵抗rが接続されているとみなすことができる。 Here, the first electrode 21 and the second electrode 22 have a symmetrical shape with a plane (XZ plane) orthogonal to the Y-axis direction as a symmetric plane. Therefore, the first electrode 21 and the second electrode 22 have substantially equivalent arrangements and shapes with respect to the cell sheet. Therefore, the horizontal resistance between the first electrode 21 and the second electrode 22 can be regarded as two first horizontal resistor alpha · r U is connected resistors in series. Here, α is proportional to the distance between the first electrode 21 and the second electrode 22, and is inversely proportional to the length of the first flow path 33 in the thickness direction of the first partition wall layer 12. The design of the cell culture chip 100. It is a constant determined by. Further, it is considered that one first vertical resistor r U is connected between the connection node between the two first horizontal resistors α and r U and the circuit element including the resistor R p and the capacitance C p. Can be done.

第2流路41においても同様に、第3電極23と第4電極24とは、いずれも第2流路41内に配置され、第2流体92を介して電気的に接続されている。第3電極23と第4電極24との間には、細胞シートが介在しないので、抵抗R及び容量Cが並列に接続された回路要素は接続されていない。ただし、第2流体92にも抵抗成分が存在するため、第3電極23及び第4電極24を結ぶ経路上に水平方向の抵抗が存在するとみなせる。水平方向の抵抗は、第3電極23と第4電極24との間の距離に比例し、第2隔壁層14の厚み方向における第2流路41の長さに反比例する。このように、水平方向の抵抗は、流路及び電極の設計と関係する。また、第3電極23及び抵抗R及び容量Cを含む回路要素の間、及び第4電極24及び回路要素の間には、垂直方向の抵抗が存在するとみなせる。垂直方向の抵抗は、第2流体92の性質(例えば、電気伝導度等)に依存する値である。 Similarly, in the second flow path 41, both the third electrode 23 and the fourth electrode 24 are arranged in the second flow path 41 and are electrically connected via the second fluid 92. Since the cell sheet does not intervene between the third electrode 23 and the fourth electrode 24, the circuit element to which the resistance R p and the capacitance C p are connected in parallel is not connected. However, since the resistance component also exists in the second fluid 92, it can be considered that the resistance in the horizontal direction exists on the path connecting the third electrode 23 and the fourth electrode 24. The resistance in the horizontal direction is proportional to the distance between the third electrode 23 and the fourth electrode 24, and is inversely proportional to the length of the second flow path 41 in the thickness direction of the second partition wall layer 14. Thus, the horizontal resistance is related to the design of the flow path and electrodes. Further, it can be considered that there is a vertical resistance between the circuit element including the third electrode 23 and the resistor R p and the capacitance C p, and between the fourth electrode 24 and the circuit element. The resistance in the vertical direction is a value that depends on the properties of the second fluid 92 (for example, electrical conductivity and the like).

第3電極23及び第4電極24は、Y軸方向に直交する平面(XZ平面)を対称面とした対称な形状であるため、細胞シートに対して、略等価の配置及び形状を有する。このことから、第3電極23及び第4電極24間の水平方向の抵抗は、2つの第2水平抵抗β・rが直列に接続された抵抗であるとみなすことができる。ここで、βは第3電極23と第4電極24との間の距離に比例し、第2隔壁層14の厚み方向における第2流路41の長さに反比例する、細胞培養チップ100の設計によって決まる定数である。また、2つの第2水平抵抗β・rの間の接続ノードと、抵抗R及び容量Cを含む回路要素との間に1つの第2垂直抵抗rが接続されているとみなすことができる。 Since the third electrode 23 and the fourth electrode 24 have a symmetrical shape with a plane orthogonal to the Y-axis direction (XZ plane) as a symmetric plane, they have substantially equivalent arrangements and shapes with respect to the cell sheet. From this, the horizontal resistance between the third electrode 23 and the fourth electrode 24 can be regarded as a resistance in which two second horizontal resistances β · r L are connected in series. Here, β is proportional to the distance between the third electrode 23 and the fourth electrode 24, and is inversely proportional to the length of the second flow path 41 in the thickness direction of the second partition wall layer 14, the design of the cell culture chip 100. It is a constant determined by. Further, it is considered that one second vertical resistor r L is connected between the connection node between the two second horizontal resistors β · r L and the circuit element including the resistor R p and the capacitance C p. Can be done.

第1電極21と第4電極24とは、第1流体91、抵抗R及び容量Cを含む回路要素、及び、第2流体92を介して電気的に接続されている。つまり、第1電極21は、1つの第1水平抵抗α・r、1つの第1垂直抵抗r、抵抗R及び容量Cを含む回路要素、1つの第2垂直抵抗r、及び、1つの第2水平抵抗β・rを介して第4電極24に接続されている。 The first electrode 21 and the fourth electrode 24 are electrically connected via a first fluid 91, a circuit element including a resistance R p and a capacitance C p , and a second fluid 92. That is, the first electrode 21 is a circuit element including one first horizontal resistor α · r U , one first vertical resistor r U , resistance R p and capacitance C p , one second vertical resistor r L , and It is connected to the fourth electrode 24 via one second horizontal resistor β · r L.

また、第2電極22と第3電極23とは、第1流体91、抵抗R及び容量Cを含む回路要素、及び、第2流体92を介して電気的に接続されている。つまり、第2電極22は、1つの第1水平抵抗α・r、1つの第1垂直抵抗r、抵抗R及び容量Cを含む回路要素、1つの第2垂直抵抗r、及び、1つの第2水平抵抗β・rを介して第3電極23に接続されている。 Further, the second electrode 22 and the third electrode 23 are electrically connected via a first fluid 91, a circuit element including a resistance R p and a capacitance C p , and a second fluid 92. That is, the second electrode 22 is a circuit element including one first horizontal resistor α · r U , one first vertical resistor r U , resistance R p and capacitance C p , one second vertical resistor r L , and It is connected to the third electrode 23 via one second horizontal resistor β · r L.

ここで、本実施の形態では、第1電極21と第4電極24との電極セット間で所定の周波数を有する交流電圧が印加された際のインピーダンスの大きさ及び位相差の測定を行う。同様に、第2電極22と第3電極23との電極セット間、第1電極21と第2電極22との電極セット間、及び第3電極23と第4電極24との電極セット間で交流電圧が印加された際のインピーダンスの大きさ及び位相差の測定を行う。なお、4つの電極セット間でインピーダンスの大きさ及び位相差を測定する場合の交流電圧の周波数及び振幅は揃えておくことが望ましい。一方で、これらの4つの電極セット間におけるインピーダンスの測定順序は任意の順序でよい。本実施の形態の計測方法では、このようにして得られた4つの電極セット間のそれぞれのインピーダンスの大きさ及び位相差に基づいて、細胞99の(つまり細胞シートの)抵抗R及び容量Cの少なくとも一方を算出によって計測する。 Here, in the present embodiment, the magnitude of impedance and the phase difference when an AC voltage having a predetermined frequency is applied between the electrode sets of the first electrode 21 and the fourth electrode 24 are measured. Similarly, alternating between the electrode sets of the second electrode 22 and the third electrode 23, between the electrode sets of the first electrode 21 and the second electrode 22, and between the electrode sets of the third electrode 23 and the fourth electrode 24. The magnitude of the impedance and the phase difference when a voltage is applied are measured. It is desirable that the frequency and amplitude of the AC voltage when measuring the impedance magnitude and phase difference between the four electrode sets are the same. On the other hand, the impedance measurement order between these four electrode sets may be any order. In the measurement method of the present embodiment, the resistance R p and the capacitance C of the cell 99 (that is, the cell sheet) are based on the magnitude and the phase difference of the respective impedances between the four electrode sets thus obtained. At least one of p is measured by calculation.

[電気的特性の算出方法]
以下、抵抗R及び容量Cの算出方法を具体的に説明する。
[Calculation method of electrical characteristics]
Hereinafter, a method for calculating the resistance R p and the capacitance C p will be specifically described.

まず、第1電極21と第4電極24との電極セット間におけるインピーダンスZ14は、次式(1)によって表される。 First, the impedance Z 14 between the electrode sets of the first electrode 21 and the fourth electrode 24 is expressed by the following equation (1).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

なお、ここでのωは角周波数を示し、jは虚数単位を示す。また、同様に、第2電極22と第3電極23との電極セット間におけるインピーダンスZ23は、次式(2)によって表される。 Here, ω indicates an angular frequency, and j indicates an imaginary unit. Similarly, the impedance Z 23 between the electrode sets of the second electrode 22 and the third electrode 23 is expressed by the following equation (2).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

一方で、第1電極21と第2電極22との電極セット間におけるインピーダンスZ12は、次式(3)によって表される。 On the other hand, the impedance Z 12 between the electrode sets of the first electrode 21 and the second electrode 22 is expressed by the following equation (3).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

また、同様に、第3電極23と第4電極24との電極セット間におけるインピーダンスZ34は、次式(4)によって表される。 Similarly, the impedance Z 34 between the electrode sets of the third electrode 23 and the fourth electrode 24 is expressed by the following equation (4).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

以上のようにして得られた、4つの電極セットそれぞれのインピーダンスは、第1電極21と第4電極24との間におけるインピーダンス及び、第2電極22と第3電極23との間におけるインピーダンスを加算し、加算により得られた値から、第1電極21と第2電極22との間におけるインピーダンス及び、第3電極23と第4電極24との間におけるインピーダンス減算して、減算により得られた計算値を2で除することによって整理できる。すなわち、インピーダンスは、次式(5)のように整理できる。 For the impedance of each of the four electrode sets obtained as described above, the impedance between the first electrode 21 and the fourth electrode 24 and the impedance between the second electrode 22 and the third electrode 23 are added. Then, the impedance between the first electrode 21 and the second electrode 22 and the impedance between the third electrode 23 and the fourth electrode 24 are subtracted from the value obtained by the addition, and the calculation obtained by the subtraction. It can be organized by dividing the value by 2. That is, the impedance can be arranged as shown in the following equation (5).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

ここで、電極セット間のインピーダンスは、電極セット間のインピーダンスの大きさと位相差θを用いて実数成分(実数部分、又は、実数部ともいう)及び虚数成分(虚数部分、又は、虚数部ともいう)に展開できる。すなわち、以下式(6)〜式(9)が成り立つ。 Here, the impedance between the electrode sets is also referred to as a real number component (also referred to as a real number part or a real number part) and an imaginary number component (also referred to as an imaginary number part or an imaginary number part) using the magnitude of the impedance between the electrode sets and the phase difference θ. ) Can be expanded. That is, the following equations (6) to (9) hold.

Figure 2021180631
Figure 2021180631

Figure 2021180631
Figure 2021180631

Figure 2021180631
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Figure 2021180631
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なお、ここでの|Z14|およびθ14は第1電極21と第4電極24との電極セット間でインピーダンス測定したときのインピーダンスの大きさおよび位相差を示し、同様に|Z23|およびθ23は第2電極22と第3電極23との電極セット間で、|Z12|およびθ12は第1電極21と第2電極23との電極セット間で、|Z34|およびθ34は第3電極23と第4電極24との電極セット間でインピーダンス測定したときのインピーダンスの大きさと位相差を示す。これらの式(6)〜式(9)を用いて、式(5)の左辺を変形して実数成分と虚数成分に展開することで、次式(10)が得られる。 Note that | Z 14 | and θ 14 here indicate the magnitude and phase difference of the impedance when the impedance is measured between the electrode sets of the first electrode 21 and the fourth electrode 24, and similarly | Z 23 | and θ 23 is between the electrode sets of the second electrode 22 and the third electrode 23, | Z 12 | and θ 12 are between the electrode sets of the first electrode 21 and the second electrode 23, | Z 34 | and θ 34. Indicates the magnitude and phase difference of the impedance when the impedance is measured between the electrode sets of the third electrode 23 and the fourth electrode 24. The following equation (10) is obtained by transforming the left side of the equation (5) into a real number component and an imaginary number component using these equations (6) to (9).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

このように、式(5)の左辺を実数成分と虚数成分とに分解することができる。また、式(5)の右辺を整理すると、次式(11)のように表される。 In this way, the left side of the equation (5) can be decomposed into a real number component and an imaginary number component. Further, if the right side of the equation (5) is rearranged, it is expressed as the following equation (11).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

式(10)の実数成分(つまり、前半部)をscZrとし、虚数成分(つまり、後半部)をscZiとした場合、式(11)の実数成分及び虚数成分は、それぞれ、式(12)及び式(13)のように表される。 When the real number component (that is, the first half) of the formula (10) is scZr and the imaginary number component (that is, the second half) is scZi, the real number component and the imaginary number component of the formula (11) are the formula (12) and the imaginary number components, respectively. It is expressed as the equation (13).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

Figure 2021180631
Figure 2021180631

上記したように、細胞の培養のために第1流体91及び第2流体92として多量の電解質を含む培地が使用されるため、培地の電気抵抗はかなり小さく、一方で、細胞シートの電気抵抗は、絶縁膜に準ずる電気抵抗性を示す。したがって、式(12)の第1垂直抵抗r及び第2垂直抵抗rは、抵抗Rに対して無視できるほどに小さい値である。このため、式(12)は、以下式(14)のように変形できる。 As described above, since the medium containing a large amount of electrolyte is used as the first fluid 91 and the second fluid 92 for culturing the cells, the electric resistance of the medium is considerably small, while the electric resistance of the cell sheet is high. , Shows electrical resistance equivalent to that of an insulating film. Therefore, the first vertical resistance r U and the second vertical resistance r L in the equation (12) are negligibly small values with respect to the resistance R p. Therefore, the equation (12) can be modified as the following equation (14).

Figure 2021180631
Figure 2021180631

このように導出された式(13)及び式(14)を用いて、抵抗R及び容量Cについて連立方程式を解くと、以下式(15)及び式(16)の関係が得られる。 Using the equations (13) and (14) derived in this way, the simultaneous equations for the resistance R p and the capacitance C p are solved, and the following equations (15) and (16) are obtained.

Figure 2021180631
Figure 2021180631

Figure 2021180631
Figure 2021180631

scZi及びscZrは、上記式(13)及び式(14)に示したように、測定によって得られる各電極セット間のインピーダンスの大きさ|Z|と位相差θとから算出される、それぞれの実数成分と虚数成分を用いて計算によって算出可能である。すなわち、第1電極21と第4電極24との電極セット間のインピーダンスの実数成分、及び、第2電極22と第3電極23との電極セット間のインピーダンスの実数成分を加算し、第1電極21と第2電極22との電極セット間のインピーダンスの実数成分、及び、第2電極22と第4電極24との電極セット間のインピーダンスの実数成分を減算する。得られた値を2で除することにより一意的にscZrが算出される。 As shown in the above equations (13) and (14), scZi and scZr are real numbers calculated from the magnitude | Z | of the impedance between each electrode set obtained by the measurement and the phase difference θ. It can be calculated by calculation using components and imaginary components. That is, the real component of the impedance between the electrode set of the first electrode 21 and the fourth electrode 24 and the real component of the impedance between the electrode set of the second electrode 22 and the third electrode 23 are added, and the first electrode is added. The real component of the impedance between the electrode set of 21 and the second electrode 22 and the real component of the impedance between the electrode set of the second electrode 22 and the fourth electrode 24 are subtracted. ScZr is uniquely calculated by dividing the obtained value by 2.

また、第1電極21と第4電極24との電極セット間のインピーダンスの虚数成分、及び、第2電極22と第3電極23との電極セット間のインピーダンスの虚数成分を加算し、第1電極21と第2電極22との電極セット間のインピーダンスの虚数成分、及び、第2電極22と第4電極24との電極セット間のインピーダンスの虚数成分を減算する。得られた値を2で除することにより一意的にscZiが算出される。このようにして、算出されたscZr、及びscZiを式(15)及び式(16)に代入して抵抗R及び容量Cの値が算出される。 Further, the imaginary component of the impedance between the electrode sets of the first electrode 21 and the fourth electrode 24 and the imaginary component of the impedance between the electrode sets of the second electrode 22 and the third electrode 23 are added, and the first electrode is added. The imaginary component of the impedance between the electrode set of 21 and the second electrode 22 and the imaginary component of the impedance between the electrode set of the second electrode 22 and the fourth electrode 24 are subtracted. ScZi is uniquely calculated by dividing the obtained value by 2. In this way, the calculated scZr and scZi are substituted into the equations (15) and (16) to calculate the values of the resistance R p and the capacitance C p.

上記の回路モデル及び算出方法の有効性を評価するため、電子部品を組み合わせて回路モデルを疑似的に再現した疑似モデル上で計測を行った。なお、第1抵抗r、第2抵抗r、第3抵抗r、及び、第4抵抗rにあたる電子部品には、それぞれ510Ωの抵抗値を有する抵抗素子を組み込んだ。また、第1容量C、第2容量C、第3容量C、及び、第4容量Cにあたる電子部品には、それぞれ0.10μFの容量を有するコンデンサを組み込んだ。また、抵抗Rにあたる電子部品には、2.2kΩの抵抗値を有する抵抗素子を組み込んだ。また、容量Cにあたる電子部品には、0.20μFの容量を有するコンデンサを組み込んだ。なお、疑似モデルに用いたこれらの電子部品は、実際の使用が想定される細胞培養チップ100及び細胞99の値に近いものが選択された。 In order to evaluate the effectiveness of the above circuit model and calculation method, measurements were performed on a pseudo model that simulated the circuit model by combining electronic components. The electronic components corresponding to the first resistance r 1 , the second resistance r 2 , the third resistance r 3 , and the fourth resistance r 4 each incorporate a resistance element having a resistance value of 510 Ω. Further, a capacitor having a capacity of 0.10 μF was incorporated in each of the electronic components corresponding to the first capacity C 1 , the second capacity C 2 , the third capacity C 3 , and the fourth capacity C 4. Further, a resistance element having a resistance value of 2.2 kΩ was incorporated in the electronic component corresponding to the resistance R p. In addition, the electronic component corresponding to the capacitance C p, incorporating a capacitor having a capacitance of 0.20μF. As these electronic components used in the pseudo model, those close to the values of the cell culture chips 100 and the cells 99, which are expected to be actually used, were selected.

また、ここでは、200mVの交流電圧を印加し、周波数を1Hz〜100kHzの間で変化させ、各周波数において、電極セット間で測定されたインピーダンスの大きさ及び位相から抵抗R及び容量Cを算出によって計測した。結果を図5に示す。図5は、疑似モデルを計測した結果を示すグラフである。図5では、横軸に印加電圧の周波数を対数軸で示し、紙面左側の縦軸に測定値から算出された抵抗Rを対数軸で示し、紙面右側の縦軸に測定値から算出された容量Cを線形軸で示している。 Further, here, an AC voltage of 200 mV is applied, the frequency is changed between 1 Hz and 100 kHz, and at each frequency, the resistance R p and the capacitance C p are calculated from the magnitude and phase of the impedance measured between the electrode sets. It was measured by calculation. The results are shown in FIG. FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the pseudo model. In Figure 5, the frequency of the applied voltage on the horizontal axis shows a logarithmic axis, the resistance R p calculated from the measured values on the vertical axis of the left side shows a logarithmic axis, was calculated from the measured values on the vertical axis of the right side The capacitance C p is shown on the linear axis.

本計測では、抵抗Rの値として、周波数によらず2.2kΩの値が得られ、容量Cの値として、周波数によらず0.2μFの値が得られることが理想的である。図5に示すように、計測の結果、抵抗R及び容量Cに周波数によらず一定の値が得られる周波数範囲が確認された。具体的には、抵抗Rにおいて、5kHz以下の周波数範囲で一様に2.2kΩの値が得られ、良好に計測されていることが示された。また、容量Cにおいて、100Hz以上の周波数範囲で、一様に0.18μFの値が得られた。この値は、設計値である0.20μFに十分近い値といえ、容量Cも良好に計測されていることが示された。 In this measurement, it is ideal that a value of 2.2 kΩ is obtained as the value of the resistance R p regardless of the frequency, and a value of 0.2 μF is obtained as the value of the capacitance C p regardless of the frequency. As shown in FIG. 5, as a result of the measurement, it was confirmed that the frequency range in which a constant value can be obtained for the resistance R p and the capacitance C p regardless of the frequency is confirmed. Specifically, in the resistance R p , a uniform value of 2.2 kΩ was obtained in the frequency range of 5 kHz or less, indicating that the measurement was good. Further, in the capacitance C p , a value of 0.18 μF was uniformly obtained in the frequency range of 100 Hz or higher. This value is said to value sufficiently close to a design value 0.20MyuF, capacitance C p were also shown to be satisfactorily measured.

このように、上記に説明した回路モデル及び算出方法は、少なくとも、100Hz以上かつ5kHz以下の周波数範囲において十分に実用に耐えることが判明した。特に、実際の細胞培養系を想定した場合、第1流体91及び第2流体92として用いられる培地中のイオン等の物理的移動によって印加電圧の周波数範囲が制限され、例えば、50Hz〜500Hzの周波数範囲での電圧の印加が想定される。 As described above, it has been found that the circuit model and the calculation method described above can sufficiently withstand practical use in a frequency range of at least 100 Hz or more and 5 kHz or less. In particular, assuming an actual cell culture system, the frequency range of the applied voltage is limited by the physical movement of ions and the like in the medium used as the first fluid 91 and the second fluid 92, and the frequency range is, for example, 50 Hz to 500 Hz. It is assumed that a voltage will be applied in the range.

したがって、想定される印加電圧の周波数範囲の大半が、上記の計測に適した周波数範囲に重なるため、本実施の形態の回路モデル及び算出方法は有効であるといえる。以上に説明したように、本実施の形態によって、例えば、100Hzの周波数を有する電圧を印加して、細胞シートの抵抗R及び容量Cを正確かつ簡易な装置によって計測できる。また、フィッティング解析等の複雑な計算を行う必要がなく、計算リソースのコストを削減できる他、抵抗R及び容量Cの算出を即時的に行うことができるため、培養状態のリアルタイムモニタリングによって、最適な時点で、細胞シートを用いた評価試験等に移行することができる。 Therefore, it can be said that the circuit model and the calculation method of the present embodiment are effective because most of the frequency range of the assumed applied voltage overlaps with the frequency range suitable for the above measurement. As described above, according to the present embodiment, for example, a voltage having a frequency of 100 Hz can be applied to measure the resistance R p and the capacitance C p of the cell sheet with an accurate and simple device. In addition, since it is not necessary to perform complicated calculations such as fitting analysis, the cost of calculation resources can be reduced, and the resistance R p and the capacity C p can be calculated immediately, real-time monitoring of the culture state enables the real-time monitoring of the culture state. At the optimum time point, it is possible to shift to an evaluation test using a cell sheet or the like.

(実施例)
以下、上記実施の形態に基づく実施例について、図6〜図8を参照して説明する。以下で説明する実施例では、上記実施の形態において説明した細胞培養チップ100に加工を加えた細胞培養チップ100a(図6参照)を用いる。このため、はじめに、細胞培養チップ100aの作製について説明する。なお、以下の説明において、上記の実施の形態での説明と実質的に同等の箇所については、図4A〜図4Cを参照することによって説明を省略する場合がある。
(Example)
Hereinafter, examples based on the above-described embodiment will be described with reference to FIGS. 6 to 8. In the examples described below, the cell culture chip 100a (see FIG. 6) obtained by processing the cell culture chip 100 described in the above embodiment is used. Therefore, first, the production of the cell culture chip 100a will be described. In the following description, the description may be omitted by referring to FIGS. 4A to 4C for points substantially equivalent to the description in the above embodiment.

図6は、実施例に係る細胞培養チップ構成について説明する斜視図である。本実施例においては、まず、第2基板15として、0.7ミリメートルの厚み(Z軸方向の長さ)、30ミリメートルの幅(Y軸方向の長さ)、及び、40ミリメートルの奥行(X軸方向の長さ)を有するガラス基板を用いた。スパッタリングにより、膜厚が150ナノメートルとなるよう、ガラス基板上にITO膜を成膜した。成膜されたITO膜をフォトリソグラフィによってパターン化して第3電極23及び第4電極24等に対応する電極パターンを形成した。なお、電極パターンには、引き出し線及び接点等が含まれる。なお、第3電極23及び第4電極24に対応する電極パターンの一部分はそれぞれ、0.1ミリメートルの幅と10ミリメートルの奥行とを有するように加工を行った。 FIG. 6 is a perspective view illustrating a cell culture chip configuration according to an example. In this embodiment, first, the second substrate 15 has a thickness of 0.7 mm (length in the Z-axis direction), a width of 30 mm (length in the Y-axis direction), and a depth of 40 mm (X). A glass substrate having an axial length) was used. An ITO film was formed on a glass substrate by sputtering so that the film thickness was 150 nanometers. The formed ITO film was patterned by photolithography to form an electrode pattern corresponding to the third electrode 23, the fourth electrode 24, and the like. The electrode pattern includes leader wires, contacts, and the like. A part of the electrode pattern corresponding to the third electrode 23 and the fourth electrode 24 was processed so as to have a width of 0.1 mm and a depth of 10 mm, respectively.

次に、ガラス基板上に、第2隔壁層14に対応するシリコーン樹脂板を積層した。シリコーン樹脂板は、1.0ミリメートルの厚み、20ミリメートルの幅、及び、40ミリメートルの奥行を有するように成形し、硬化させたものを用いた。シリコーン樹脂板は、あらかじめ第2流路41に対応する第2貫通孔が形成されたものを用い、第2貫通孔の第2主流路41aの位置と、第3電極23及び第4電極24に対応する電極パターンの一部分とが対応するように位置合わせしてガラス基板に接着した。 Next, a silicone resin plate corresponding to the second partition wall layer 14 was laminated on the glass substrate. The silicone resin plate used was molded and cured so as to have a thickness of 1.0 mm, a width of 20 mm, and a depth of 40 mm. As the silicone resin plate, a silicon resin plate having a second through hole corresponding to the second through hole 41 formed in advance is used, and the position of the second main flow path 41a of the second through hole and the third electrode 23 and the fourth electrode 24 are set. It was aligned and adhered to the glass substrate so that it corresponded to a part of the corresponding electrode pattern.

ガラス基板とシリコーン樹脂板との接着は、未硬化のシリコーン樹脂をガラス基板とシリコーン樹脂板との接着面に塗布し、接合させて位置合わせした後に、65℃の環境において2時間静置して接着面のシリコーン樹脂を硬化させることにより行った。なお、ここでの第2主流路41aの長さは13ミリメートルに設定しており、対応する電極パターンの一部分よりも3ミリメートル長くなっている。また、シリコーン樹脂板の幅をガラス基板の幅よりも10ミリメートル短く設計することで、電極パターンの一部をシリコーン樹脂板の幅方向の端部から露出させた。 For adhesion between the glass substrate and the silicone resin plate, uncured silicone resin is applied to the adhesive surface between the glass substrate and the silicone resin plate, bonded and aligned, and then allowed to stand for 2 hours in an environment of 65 ° C. This was done by curing the silicone resin on the adhesive surface. The length of the second main flow path 41a here is set to 13 mm, which is 3 mm longer than a part of the corresponding electrode pattern. Further, by designing the width of the silicone resin plate to be 10 mm shorter than the width of the glass substrate, a part of the electrode pattern was exposed from the end portion in the width direction of the silicone resin plate.

次に、シリコーン樹脂板に細胞分離膜13として、PET樹脂製の多孔質膜を積層した。多孔質膜には、10マイクロメートルの厚み、5.0ミリメートルの幅、及び、14ミリメートルの奥行を有し、平均孔径3マイクロメートルの多数の孔が形成されたものを用いた。また、多孔質膜を積層する際の接着は、上記のガラス基板とシリコーン樹脂板との接着と同様の手法によって行った。 Next, a porous membrane made of PET resin was laminated on the silicone resin plate as the cell separation membrane 13. The porous membrane used had a thickness of 10 micrometers, a width of 5.0 millimeters, and a depth of 14 millimeters, and had a large number of pores having an average pore diameter of 3 micrometers. Further, the adhesion when laminating the porous film was performed by the same method as the above-mentioned adhesion between the glass substrate and the silicone resin plate.

次に、シリコーン樹脂板及び多孔質膜の上に、第1隔壁層12に対応するシリコーン樹脂板を積層した。シリコーン樹脂板の寸法は、第2隔壁層14に対応するシリコーン樹脂板の寸法と同等である。ただし、第1流路33に対応する第1貫通孔、ならびに、第3開口32b及び32cに対応する貫通孔が形成されている点で、第2隔壁層14に対応するシリコーン樹脂板と異なっている。ここでのシリコーン樹脂板の積層際の接着は、上記のガラス基板とシリコーン樹脂板との接着と同様の手法によって行った。 Next, the silicone resin plate corresponding to the first partition wall layer 12 was laminated on the silicone resin plate and the porous membrane. The dimensions of the silicone resin plate are equivalent to the dimensions of the silicone resin plate corresponding to the second partition wall layer 14. However, unlike the silicone resin plate corresponding to the second partition wall layer 14, the first through hole corresponding to the first flow path 33 and the through hole corresponding to the third openings 32b and 32c are formed. There is. The bonding of the silicone resin plates at the time of laminating here was performed by the same method as the bonding between the glass substrate and the silicone resin plate described above.

次に、シリコーン樹脂板の上に第1基板11に対応するガラス基板を積層した。ここでのガラス基板の寸法は、第2基板15に対応するガラス基板の寸法と同等である。また、ここでのガラス基板には、第2基板15に対応するガラス基板と同様の手法により、第1電極21及び第2電極22に対応する電極パターンをあらかじめ形成したものを用いた。また、ここでのガラス基板には、第1開口31及び31a、ならびに、第2開口32及び32aに対応する貫通孔を形成したものを用いた。 Next, a glass substrate corresponding to the first substrate 11 was laminated on the silicone resin plate. The dimensions of the glass substrate here are equivalent to the dimensions of the glass substrate corresponding to the second substrate 15. Further, as the glass substrate here, a glass substrate having an electrode pattern corresponding to the first electrode 21 and the second electrode 22 formed in advance by the same method as the glass substrate corresponding to the second substrate 15 was used. Further, as the glass substrate here, those having through holes corresponding to the first openings 31 and 31a and the second openings 32 and 32a were used.

このように上記の実施の形態と同様の積層構造を有する本体部10及び細胞分離膜13を備える細胞培養チップを作製した。さらに本実施例においては、細胞培養チップ100aに対してマイクロポンプ等を用いての連続的な培地の供給を不要にするため、貯留槽を形成した。具体的には、第1開口31及び31a、ならびに第2開口32及び32aのそれぞれを囲むように最上層のガラス基板のZ軸プラス側の面に7.0ミリメートルの厚み、及び、6.0ミリメートルの直径を有する環状のシリコーン樹脂製の壁部を接着した。これにより、壁部とガラス基板のZ軸プラス側の面とで容器状の200マイクロリットルの容積を有する貯留槽を形成した。 As described above, a cell culture chip having a main body portion 10 and a cell separation membrane 13 having a laminated structure similar to that of the above embodiment was produced. Further, in this example, a storage tank was formed in order to eliminate the need for continuous supply of the medium to the cell culture chip 100a by using a micropump or the like. Specifically, a thickness of 7.0 mm and 6.0 on the Z-axis plus side surface of the uppermost glass substrate so as to surround the first openings 31 and 31a and the second openings 32 and 32a, respectively. An annular silicone resin wall with a millimeter diameter was glued. As a result, a container-shaped storage tank having a volume of 200 microliters was formed between the wall portion and the Z-axis plus side surface of the glass substrate.

例えば、第1開口31を囲んで形成された貯留槽34に貯留された培地は、第1流路33内の培地量に応じて重力に従って自動的に第1流路33内に供給される。また、第1開口31aを囲んで形成された貯留槽35には、第1流路33の容積を超えた量の培地が供給された場合に、第1流路33から排出された培地の一部が貯留される。また、例えば、第2開口32を囲んで形成された貯留槽36に貯留された培地は、第2流路41内の培地量に応じて重力に従って自動的に第2流路41内に供給される。また、第2開口32aを囲んで形成された貯留槽37には、第2流路41の容積を超えた量の培地が供給された場合に、第2流路41から排出された培地の一部が貯留される。貯留槽34〜貯留槽37を形成するためのガラス基板への壁部の接着は、上記のガラス基板とシリコーン樹脂板との接着と同様の手法によって行った。 For example, the medium stored in the storage tank 34 formed around the first opening 31 is automatically supplied into the first flow path 33 according to the amount of medium in the first flow path 33 according to gravity. Further, when a medium in an amount exceeding the volume of the first flow path 33 is supplied to the storage tank 35 formed surrounding the first opening 31a, one of the media discharged from the first flow path 33. The part is stored. Further, for example, the medium stored in the storage tank 36 formed around the second opening 32 is automatically supplied into the second flow path 41 according to the amount of the medium in the second flow path 41 according to gravity. NS. Further, when a medium in an amount exceeding the volume of the second flow path 41 is supplied to the storage tank 37 formed surrounding the second opening 32a, one of the media discharged from the second flow path 41. The part is stored. Adhesion of the wall portion to the glass substrate for forming the storage tanks 34 to 37 was performed by the same method as the above-mentioned adhesion between the glass substrate and the silicone resin plate.

本実施例においては、上記のようにして作製した細胞培養チップ100aを用いて、ヒト結腸癌由来の細胞株であるCaco−2細胞の培養を行った。 In this example, Caco-2 cells, which are cell lines derived from human colon cancer, were cultured using the cell culture chip 100a prepared as described above.

はじめに、細胞培養チップ100aに30分間紫外線を照射して滅菌処理を行った。滅菌処理後の細胞培養チップ100aには、細胞の接着及び増殖の促進剤として0.01%コラーゲン溶液を5マイクロリットル供給した。室温の環境において30分間静置した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS:Phosphate Buffered Saline)を供給して排出する操作を3回行うことで、不要なコラーゲン溶液を洗浄した。 First, the cell culture chip 100a was sterilized by irradiating it with ultraviolet rays for 30 minutes. The cell culture chip 100a after the sterilization treatment was supplied with 5 microliters of a 0.01% collagen solution as an agent for promoting cell adhesion and proliferation. After allowing to stand for 30 minutes in an environment at room temperature, the unnecessary collagen solution was washed by performing the operation of supplying and discharging phosphate buffered saline (PBS) three times.

第2流路41に10マイクロリットルの培地を供給し、第1流路33に10マイクロリットルのCaco−2細胞懸濁液を供給した。Caco−2細胞懸濁液には、2.0×10個/ミリリットルの個数濃度となるようあらかじめ調整したものを用いた。5%CO雰囲気の条件で、37℃の環境において30分間静置した後、貯留槽34〜貯留槽37の各々に150マイクロリットルの培地を供給し、5%CO雰囲気の条件で、37℃の環境において静置培養を行った。なお、培養日数が2日経過するごとに貯留槽34〜貯留槽37の各々の内の培地を廃棄して新たな培地を添加する操作を行った。細胞の培養は、細胞培養チップ100aを17個用意し、それぞれについて同様の条件で行った。 A 10 microliter medium was supplied to the second channel 41, and a 10 microliter Caco-2 cell suspension was supplied to the first channel 33. The Caco-2 cell suspension used was prepared in advance so as to have a number concentration of 2.0 × 10 6 cells / ml. After standing for 30 minutes in an environment of 37 ° C. under the condition of 5% CO 2 atmosphere, 150 microliters of medium was supplied to each of the storage tanks 34 to 37, and 37 under the condition of 5% CO 2 atmosphere. The static culture was carried out in an environment of ℃. In addition, every two days after the culturing days, the medium in each of the storage tanks 34 to 37 was discarded and a new medium was added. For cell culture, 17 cell culture chips 100a were prepared, and the cells were cultured under the same conditions for each.

また、培養開始時を起点として培養日数が1日経過するごとに、培養細胞の電気的特性の計測を行った。なお、ここで計測される電気的特性は、抵抗R及び容量Cである。抵抗R及び容量Cの計測は、細胞培養チップ100aに設けられた電極パターンのうち、第1接点21b、第2接点22b、第3接点23b、及び、第4接点24bのそれぞれをガラス基板とともにワニ口クリップ等の電気接続クリップで挟持し、当該電気接続クリップから伸びる接続配線をスイッチボックス202の各接続端子に接続して行った。 In addition, the electrical characteristics of the cultured cells were measured every 1 day after the start of the culture. The electrical characteristics measured here are the resistance R p and the capacitance C p . The resistance R p and the capacitance C p are measured by using each of the first contact 21b, the second contact 22b, the third contact 23b, and the fourth contact 24b of the electrode patterns provided on the cell culture chip 100a as a glass substrate. At the same time, it was sandwiched by an electrical connection clip such as an alligator clip, and the connection wiring extending from the electrical connection clip was connected to each connection terminal of the switch box 202.

また、抵抗R及び容量Cの計測においては、第1電極21及び第2電極22、第3電極23及び第4電極24、第1電極21及び第4電極24、ならびに、第2電極22及び第3電極23の順に、100Hzの周波数を有する20mVの交流電圧を印加してインピーダンスの大きさ及び位相を測定した。なお、電気的特性は、17個の細胞培養チップ100aのそれぞれにおいて計測された値の平均値として算出した。 Further, in the measurement of the resistance R p and the capacitance C p , the first electrode 21, the second electrode 22, the third electrode 23 and the fourth electrode 24, the first electrode 21 and the fourth electrode 24, and the second electrode 22 are measured. The magnitude and phase of the impedance were measured by applying an AC voltage of 20 mV having a frequency of 100 Hz in the order of the third electrode 23 and the third electrode 23. The electrical characteristics were calculated as the average value of the values measured in each of the 17 cell culture chips 100a.

結果を図7及び図8に示す。図7は、実施例に係る培養細胞を計測した結果を示す第1グラフである。図7では、計測された電気的特性の一つである抵抗Rと培養日数との関係を示している。より詳しくは、図7の横軸は、培養開始日を0日とした培養日数を示している。また、図7の縦軸は、計測された抵抗値に、細胞シートのXY平面における面積(シート面積)を乗算して正規化した抵抗Rを示している。また図中の各計測点には、17個の細胞培養チップ100aのそれぞれにおいて計測された値の分散(つまり、培養ロット間のバラツキ)を示している。 The results are shown in FIGS. 7 and 8. FIG. 7 is a first graph showing the results of measuring the cultured cells according to the examples. FIG. 7 shows the relationship between the resistance R p , which is one of the measured electrical characteristics, and the number of culture days. More specifically, the horizontal axis of FIG. 7 shows the number of culture days with the culture start date as 0 day. Further, the vertical axis of FIG. 7 shows the resistance R p normalized by multiplying the measured resistance value by the area (sheet area) of the cell sheet in the XY plane. Further, each measurement point in the figure shows the dispersion of the values measured in each of the 17 cell culture chips 100a (that is, the variation between culture lots).

図7に示すように、本実施例における培養細胞では、培養日数が4日に至るまでの期間では、抵抗Rの上昇がみられた。また、培養日数が5日〜13日の期間では、抵抗Rが安定した値を示した。さらに細胞の培養を続けると、培養日数が14日以降の期間では、抵抗Rの平均値は上昇するものの、分散も大きく、17個の細胞培養チップ100aのそれぞれにおいて培養された細胞ごとに、形態が異なることが示唆された。 As shown in FIG. 7, the cell culture in the present embodiment, in a period from cultivation period reaches 4 days, rise of the resistance R p was observed. Furthermore, cultivation period to be a period of 5 days to 13 days, the resistance R p showed stable values. Continuing the culture of cells, in a period of 14 days after the culture days, while the average value of the resistance R p increases, the dispersion is large, each cells cultured in each of 17 cells cultured chips 100a, It was suggested that the morphology was different.

また、図8は、実施例に係る培養細胞を計測した結果を示す第2グラフである。図8では、計測された電気的特性の一つである容量Cと培養日数との関係を示している。より詳しくは、図8の横軸は、培養開始日を0日とした培養日数を示している。また、図8の縦軸は、計測された容量に、細胞シートのXY平面における面積(シート面積)を除算して正規化した容量Cを示している。また図中の各計測点には、17個の細胞培養チップ100aのそれぞれにおいて計測された値の分散(つまり、培養ロット間のバラツキ)を示している。 Further, FIG. 8 is a second graph showing the results of measuring the cultured cells according to the examples. 8 shows the relationship between the capacitance C p between culture days is one of the measured electrical properties. More specifically, the horizontal axis of FIG. 8 shows the number of culture days with the culture start date as 0 day. The vertical axis of FIG. 8, the measured capacitance indicates the normalized capacity C p by dividing the area in the XY plane of the cell sheet (sheet area). Further, each measurement point in the figure shows the dispersion of the values measured in each of the 17 cell culture chips 100a (that is, the variation between culture lots).

図8に示すように、本実施例における培養細胞では、培養日数が4日に至るまでの期間では、容量Cの上昇がみられた。さらに細胞の培養を続けると、培養日数が12日以降の期間では、容量Cの減少がみられた。 As shown in FIG. 8, the cell culture in the present embodiment, in a period from cultivation period reaches 4 days, the increase in capacitance C p was observed. When the cells were further cultured, the volume Cp decreased in the period after 12 days of culture.

なお、図示しないが、同時に行った顕微鏡による細胞の観察では、培養日数が13日に至るまでの期間では、細胞剥離及び細胞死等の異常もみられず、略均一な細胞シートが形成されていた。また、培養日数が14日以降の期間では、細胞表面に形成された凸凹形状の大きさが大きくなり、細胞シートの厚みも増加する傾向がみられた。培養日数が14日以降の期間における抵抗Rの上昇及び、培養日数が12日以降の期間における容量Cの減少は、顕微鏡観察において培養日数が14日以降の期間でみられた細胞の形態の変化によるものであると考えられる。 Although not shown, in the observation of cells with a microscope performed at the same time, no abnormalities such as cell detachment and cell death were observed during the period up to 13 days of culture, and a substantially uniform cell sheet was formed. .. In addition, when the number of culture days was 14 days or later, the size of the uneven shape formed on the cell surface increased, and the thickness of the cell sheet also tended to increase. The increase in resistance R p during the period after 14 days of culture and the decrease in volume C p during the period after 12 days of culture showed the morphology of cells observed during the period after 14 days of culture under microscopic observation. It is considered that this is due to the change in.

本実施例において、モデルの細胞として用いられたCaco−2細胞では、上記のように培養日数が13日に至るまでの期間において安定した細胞シートが形成され、一方で、培養日数が14日以降の期間では、凸凹形状の拡大、培養ロット間のバラツキも大きいことがわかる。これにより、培養細胞を用いた薬剤評価等の試験を行う場合、培養日数が5日〜13日の期間で行われることが適切であると評価できる。特に、この適切な培養日数が、抵抗Rの値に基づいて評価される培養日数が5日以降の期間であることは、顕微鏡観察では得られない知見である。 In the Caco-2 cells used as the model cells in this example, stable cell sheets were formed in the period up to 13 days of culture as described above, while the number of culture days was 14 days or later. It can be seen that during this period, the uneven shape is enlarged and the variation between culture lots is large. From this, when conducting a test such as drug evaluation using cultured cells, it can be evaluated that it is appropriate that the culture period is 5 to 13 days. In particular, it is a finding that this appropriate number of culture days cannot be obtained by microscopic observation that the number of culture days evaluated based on the value of resistance R p is a period of 5 days or later.

また、培養日数が12日以降の期間における容量Cの減少は、培養日数が11日に至るまでの期間と、培養日数が12日以降の期間との間における細胞の形態の変化を示している可能性がある。つまり、容量Cの値に基づいて、さらに、薬剤評価等の試験を行うに適した期間が、培養日数が5日〜11日の期間であるか、又は、培養日数が12日〜13日の期間であるかの評価を実施できる可能性がある。 Further, reduction of the capacitance C p in the period of after 12 days cultivation period is, shows a period up to 11 days cultivation period, the change in the morphology of the cells between the period of after 12 days culture days May be there. That is, based on the value of the capacitance C p, furthermore, the period which is suitable for testing the drug evaluation etc., or cultivation period is a period of 5 days to 11 days, or, cultivation period is 12 days to 13 days It may be possible to carry out an evaluation of whether or not the period is.

以上のように、本開示の抵抗Rの値及び容量Cの値等の電気的特性を用いることで、従来の顕微鏡観察による細胞の評価と併せて、又は、顕微鏡観察による評価とは独立に細胞の評価を行うことができる。この評価を行うために必要な装置は、上記に説明したように簡易な構成で実現でき、かつ、即時性を有する評価が可能であるため、より適切に細胞の評価を行うことができる。また、薬剤評価等に移行するタイミングを、より適切な細胞の評価に基づいて、より正確に判定することが可能となる。 As described above, by using the electrical characteristics such as the value of resistance R p and the value of volume C p of the present disclosure, it is used in combination with the evaluation of cells by conventional microscopic observation or independently of the evaluation by microscopic observation. Can be evaluated for cells. The device required for this evaluation can be realized with a simple configuration as described above, and the evaluation can be performed with immediacy, so that the cells can be evaluated more appropriately. In addition, it is possible to more accurately determine the timing of transition to drug evaluation or the like based on more appropriate cell evaluation.

(その他の実施の形態)
以上、実施の形態等について説明したが、本開示は、上記実施の形態等に限定されるものではない。
(Other embodiments)
Although the embodiments and the like have been described above, the present disclosure is not limited to the above embodiments and the like.

また、上記実施の形態等において計測装置を構成する構成要素について例示したが、計測装置が備える構成要素の各機能は、計測装置を構成する複数の部分にどのように振り分けられてもよい。例えば、上記実施の形態における測定部と制御部とスイッチボックスとが一つの装置で実現されてもよいし、測定部と制御部とスイッチボックスとのそれぞれが複数の装置から構成されてもよい。 Further, although the components constituting the measuring device have been illustrated in the above-described embodiment and the like, each function of the components included in the measuring device may be distributed to a plurality of parts constituting the measuring device in any way. For example, the measurement unit, the control unit, and the switch box in the above embodiment may be realized by one device, or each of the measurement unit, the control unit, and the switch box may be composed of a plurality of devices.

その他、実施の形態等に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態、又は、本開示の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態等における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本開示に含まれる。 In addition, it is realized by a form obtained by applying various modifications that a person skilled in the art can think of to the embodiment, or by arbitrarily combining the components and functions in the embodiment, etc. within the range not deviating from the purpose of the present disclosure. Also included in this disclosure.

例えば、上記の実施の形態において、積層構造を有するとして説明した細胞培養チップは、3Dプリンタ等の手法を用いて一体的に形成されたものであってもよい。 For example, in the above embodiment, the cell culture chip described as having a laminated structure may be integrally formed by using a technique such as a 3D printer.

また、例えば、第1基板、ならびに第1電極及び第2電極は、透明でなくてもよい。細胞シートにおける電気抵抗の計測のみが目的の場合においては、細胞の細胞状態が目視で確認できなくてもよい。 Further, for example, the first substrate and the first electrode and the second electrode do not have to be transparent. When the purpose is only to measure the electrical resistance of the cell sheet, the cell state of the cell may not be visually confirmed.

また、1つの細胞培養チップ内に上記の実施の形態と同様の構成(すなわち、第1流路、第2流路、第1電極、及び第2電極を備える)を複数備え、一挙に複数の条件での細胞培養、又は、上記実施例で説明した同条件での複数セットの細胞培養が行われてもよい。当然、これらの複数の培養細胞を用いた薬剤評価等の試験が同時並行に行える構成としてもよい。 Further, one cell culture chip is provided with a plurality of configurations (that is, a first flow path, a second flow path, a first electrode, and a second electrode) similar to those of the above embodiment, and a plurality of cells are provided at once. Cell culture under the conditions, or a plurality of sets of cell cultures under the same conditions described in the above Examples may be performed. Naturally, a configuration may be configured in which tests such as drug evaluation using these plurality of cultured cells can be performed in parallel.

また、上記実施の形態において説明した第1流路及び第2流路は、単に空間が重なる形状であればよい。つまり、第1空間(例えば第1主流路)及び第2空間(例えば第2主流路)が重なるように構成された、当該第1空間を有する空間と、当該第2空間を有する空間とが形成されていれば、本開示の内容を適用することが可能である。 Further, the first flow path and the second flow path described in the above embodiment may simply have a shape in which the spaces overlap. That is, a space having the first space and a space having the second space formed so as to overlap the first space (for example, the first main flow path) and the second space (for example, the second main flow path) are formed. If so, the content of this disclosure can be applied.

また、例えば、スイッチボックス及び制御装置を備えることなく、ユーザが手動で電極セット間のインピーダンスを測定して電気的特性を計測することも可能である。 It is also possible for the user to manually measure the impedance between the electrode sets to measure the electrical characteristics without, for example, providing a switch box and a control device.

本開示は、細胞の評価等に用いられる計測装置、及び、当該計測装置を用いて評価された培養細胞による試験系の構築等、医薬品開発等における新たな展開に寄与するものとして有用である。 The present disclosure is useful as contributing to new developments in drug development, such as construction of a measuring device used for cell evaluation and the like, and a test system using cultured cells evaluated using the measuring device.

10 本体部
11 第1基板
12 第1隔壁層
13 細胞分離膜
13y 第1主面
13z 第2主面
14 第2隔壁層
15 第2基板
21 第1電極
21a 第1引き出し線
21b 第1接点
22 第2電極
22a 第2引き出し線
22b 第2接点
23 第3電極
23a 第3引き出し線
23b 第3接点
24 第4電極
24a 第4引き出し線
24b 第4接点
31、31a 第1開口
32、32a 第2開口
32b、32c 第3開口
33 第1流路
33a 第1主流路
33b 第1流入路
33c 第1流入口
33d 第1流出路
33e 第1流出口
34、35、36、37 貯留槽
41 第2流路
41a 第2主流路
41b 第2流入路
41c 第2流入口
41d 第2流出路
41e 第2流出口
91 第1流体
92 第2流体
99 細胞
100、100a 細胞培養チップ
200 測定部
201 測定部
202 スイッチボックス
300 計測装置
第1容量
第2容量
第3容量
第4容量
容量
第1抵抗
第2抵抗
第3抵抗
第4抵抗
第2垂直抵抗
抵抗
第1垂直抵抗
S1 第1接続端子
S2 第2接続端子
S3 第3接続端子
S4 第4接続端子
SW1 第1スイッチ
SW2 第2スイッチ
T1 第1端子
T2 第2端子
α・r 第1水平抵抗
β・r 第2水平抵抗
10 Main body 11 1st substrate 12 1st partition layer 13 Cell separation membrane 13y 1st main surface 13z 2nd main surface 14 2nd partition layer 15 2nd substrate 21 1st electrode 21a 1st lead wire 21b 1st contact 22nd 2 Electrode 22a 2nd Leader 22b 2nd Contact 23 3rd Electrode 23a 3rd Leader 23b 3rd Contact 24 4th Electrode 24a 4th Leader 24b 4th Contact 31, 31a 1st Opening 32, 32a 2nd Opening 32b , 32c 3rd opening 33 1st flow path 33a 1st main flow path 33b 1st inflow path 33c 1st inflow port 33d 1st outflow path 33e 1st outflow port 34, 35, 36, 37 Storage tank 41 2nd flow path 41a 2nd main flow path 41b 2nd inflow path 41c 2nd inflow port 41d 2nd outflow channel 41e 2nd outflow port 91 1st fluid 92 2nd fluid 99 Cell 100, 100a Cell culture chip 200 Measuring unit 201 Measuring unit 202 Switch box 300 Measuring device C 1 1st capacity C 2 2nd capacity C 3 3rd capacity C 4 4th capacity C p capacity r 1 1st resistance r 2 2nd resistance r 3 3rd resistance r 4 4th resistance r L 2nd vertical Resistance R p resistance r U 1st vertical resistance S1 1st connection terminal S2 2nd connection terminal S3 3rd connection terminal S4 4th connection terminal SW1 1st switch SW2 2nd switch T1 1st terminal T2 2nd terminal α ・ r U 1st horizontal resistance β · r L 2nd horizontal resistance

Claims (12)

細胞培養チップを用いて培養された細胞を電気的に計測する計測方法であって、
前記細胞培養チップは、
第1流路と、所定方向から見て少なくとも一部が前記第1流路に重なる第2流路とを有する本体部と、
前記第1流路が形成された第1主面、及び、前記第2流路が形成され、前記第1主面に背向する第2主面を有し、前記第1流路及び前記第2流路の間に配置された細胞分離膜と、
前記第1流路内を前記第1流路に沿って延びる第1電極及び第2電極と、
前記第2流路内を前記第2流路に沿って延びる第3電極及び第4電極と、を備え、
前記計測方法は、
前記第1電極と前記第2電極との間、前記第3電極と前記第4電極との間、前記第1電極と前記第4電極との間、及び、前記第2電極と前記第3電極との間が含まれる4つの電極セット間のそれぞれに、所定の周波数を有する交流電圧を印加する第1ステップと、
前記交流電圧が印加された際の、それぞれの前記電極セット間において、大きさ及び位相差を有するインピーダンスを測定する第2ステップと、
測定された前記インピーダンスの大きさ及び位相差に基づいて、前記細胞の電気的特性を算出する第3ステップと、を含む
計測方法。
It is a measurement method that electrically measures cells cultured using a cell culture chip.
The cell culture chip is
A main body having a first flow path and a second flow path that at least partially overlaps the first flow path when viewed from a predetermined direction.
It has a first main surface on which the first flow path is formed and a second main surface on which the second flow path is formed and faces the first main surface, and the first flow path and the first flow path are formed. The cell separation membrane placed between the two channels and
A first electrode and a second electrode extending along the first flow path in the first flow path,
A third electrode and a fourth electrode extending in the second flow path along the second flow path are provided.
The measurement method is
Between the first electrode and the second electrode, between the third electrode and the fourth electrode, between the first electrode and the fourth electrode, and between the second electrode and the third electrode. In the first step, an AC voltage having a predetermined frequency is applied to each of the four electrode sets including the space between the two electrodes.
The second step of measuring the impedance having a magnitude and a phase difference between the respective electrode sets when the AC voltage is applied, and
A measurement method comprising a third step of calculating the electrical characteristics of the cell based on the measured magnitude and phase difference of the impedance.
前記交流電圧は、所定の振幅を有し、
前記第2ステップでは、それぞれの前記電極セット間において、印加された前記交流電圧の前記所定の振幅に応じて得られる電流値に基づいて前記インピーダンスを測定する
請求項1に記載の計測方法。
The AC voltage has a predetermined amplitude and has a predetermined amplitude.
The measurement method according to claim 1, wherein in the second step, the impedance is measured based on the current value obtained according to the predetermined amplitude of the applied AC voltage between the respective electrode sets.
前記第3ステップでは、
測定された前記インピーダンスの大きさ及び位相差を用いて、測定された前記インピーダンスの大きさから前記インピーダンスの実数部及び虚数部を算出し、
抽出された前記実数部に基づいて前記細胞のインピーダンスにおける実数成分を算出し、
抽出された前記虚数部に基づいて前記細胞のインピーダンスにおける虚数成分を算出する
請求項1又は2に記載の計測方法。
In the third step,
Using the measured impedance magnitude and phase difference, the real and imaginary parts of the impedance are calculated from the measured impedance magnitude.
Based on the extracted real part, the real component in the impedance of the cell is calculated.
The measurement method according to claim 1 or 2, wherein the imaginary component in the impedance of the cell is calculated based on the extracted imaginary part.
前記電気的特性は、前記細胞の抵抗R及び容量Cの少なくとも一方である
請求項1〜3のいずれか一項に記載の計測方法。
The measuring method according to any one of claims 1 to 3, wherein the electrical property is at least one of the resistance R p and the volume C p of the cell.
前記第3ステップでは、
前記細胞を前記細胞の抵抗R及び容量Cが並列に接続された回路要素とみなし、
前記第1電極、前記第2電極、前記第3電極、前記第4電極、及び前記回路要素を含む回路モデルを用いて前記電気的特性を算出する
請求項3に記載の計測方法。
In the third step,
The cell is regarded as a circuit element in which the resistance R p and the capacitance C p of the cell are connected in parallel.
The measurement method according to claim 3, wherein the electrical characteristics are calculated using a circuit model including the first electrode, the second electrode, the third electrode, the fourth electrode, and the circuit element.
前記回路モデルでは、
4つの前記電極セット間のうち、前記第1電極と前記第4電極との間及び前記第2電極と前記第3電極との間には、前記回路要素が接続され、
4つの前記電極セット間のうち、前記第1電極と前記第2電極との間及び前記第3電極と前記第4電極との間には、前記回路要素が接続されない
請求項5に記載の計測方法。
In the circuit model,
Of the four electrode sets, the circuit element is connected between the first electrode and the fourth electrode and between the second electrode and the third electrode.
The measurement according to claim 5, wherein the circuit element is not connected between the first electrode and the second electrode and between the third electrode and the fourth electrode among the four electrode sets. Method.
前記第3ステップでは、
前記第1電極と前記第4電極との間における前記インピーダンス、及び、前記第2電極と前記第3電極との間における前記インピーダンスを加算し、
加算で得られた計算値から、前記第1電極と前記第2電極との間における前記インピーダンス、及び、前記第3電極と前記第4電極との間における前記インピーダンスを減算し、
減算で得られた計算値を2で除する
請求項5に記載の計測方法。
In the third step,
The impedance between the first electrode and the fourth electrode and the impedance between the second electrode and the third electrode are added together.
The impedance between the first electrode and the second electrode and the impedance between the third electrode and the fourth electrode are subtracted from the calculated value obtained by the addition.
The measurement method according to claim 5, wherein the calculated value obtained by subtraction is divided by 2.
前記第3ステップでは、
前記第1電極が第1抵抗を有し、前記第2電極が第2抵抗を有し、前記第3電極が第3抵抗を有し、前記第4電極が第4抵抗を有するとみなし、
前記第1電極、前記第2電極、前記第3電極、前記第4電極、及び前記回路要素を含む回路モデルを用いて前記電気的特性を算出する
請求項5〜7のいずれか一項に記載の計測方法。
In the third step,
It is considered that the first electrode has the first resistance, the second electrode has the second resistance, the third electrode has the third resistance, and the fourth electrode has the fourth resistance.
The item according to any one of claims 5 to 7, wherein the electrical characteristics are calculated using a circuit model including the first electrode, the second electrode, the third electrode, the fourth electrode, and the circuit element. Measurement method.
前記第3ステップでは、
前記第1電極と、前記第1流路を満たす第1流体との間に、第1容量が形成され、前記第2電極と、前記第1流体との間に、第2容量が形成され、前記第3電極と、前記第2流路を満たす第2流体との間に、第3容量が形成され、前記第4電極と、前記第2流体との間に、第4容量が形成されるとみなし、
前記第1電極、前記第2電極、前記第3電極、前記第4電極、及び前記回路要素、ならびに、前記第1容量、前記第2容量、前記第3容量、及び前記第4容量を含む回路モデルを用いて前記電気的特性を算出する
請求項8に記載の計測方法。
In the third step,
A first capacitance is formed between the first electrode and the first fluid that fills the first flow path, and a second capacitance is formed between the second electrode and the first fluid. A third capacitance is formed between the third electrode and the second fluid that fills the second flow path, and a fourth capacitance is formed between the fourth electrode and the second fluid. Considered,
A circuit including the first electrode, the second electrode, the third electrode, the fourth electrode, and the circuit element, and the first capacitance, the second capacitance, the third capacitance, and the fourth capacitance. The measurement method according to claim 8, wherein the electrical characteristics are calculated using a model.
前記第3ステップでは、
前記第1電極及び前記第2電極間に前記第1流体の成分に応じた2つの第1水平抵抗が直列に接続され、前記2つの第1水平抵抗の間の接続ノードと前記回路要素との間に前記第1流体の成分に応じた第1垂直抵抗が接続され、前記第3電極及び前記第4電極間に前記第2流体の成分に応じた2つの第2水平抵抗が直列に接続され、前記2つの第2水平抵抗の間の接続ノードと前記回路要素との間に前記第2流体の成分に応じた第2垂直抵抗が接続されるとみなし、
前記第1電極、前記第2電極、前記第3電極、前記第4電極、前記回路要素、前記第1容量、前記第2容量、前記第3容量、及び前記第4容量、ならびに、前記2つの第1水平抵抗、前記第1垂直抵抗、前記2つの第2水平抵抗、及び、前記第2垂直抵抗を含む回路モデルを用いて前記電気的特性を算出する
請求項9に記載の計測方法。
In the third step,
Two first horizontal resistors corresponding to the components of the first fluid are connected in series between the first electrode and the second electrode, and the connection node between the two first horizontal resistors and the circuit element are connected to each other. A first vertical resistor corresponding to the component of the first fluid is connected between them, and two second horizontal resistors corresponding to the component of the second fluid are connected in series between the third electrode and the fourth electrode. , It is considered that the second vertical resistance corresponding to the component of the second fluid is connected between the connection node between the two second horizontal resistors and the circuit element.
The first electrode, the second electrode, the third electrode, the fourth electrode, the circuit element, the first capacity, the second capacity, the third capacity, and the fourth capacity, and the two. The measurement method according to claim 9, wherein the electrical characteristics are calculated using a circuit model including the first horizontal resistance, the first vertical resistance, the two second horizontal resistances, and the second vertical resistance.
請求項1〜10のいずれか一項に記載の計測方法を実施するための計測装置であって、
前記第1電極、前記第2電極、前記第3電極、及び、前記第4電極の各々に接続され、所定の周波数を有する交流電圧を前記4つの電極セット間のそれぞれに印加させ、それぞれの前記電極セット間において、大きさ及び位相を有するインピーダンスを測定する測定部と、
測定された前記インピーダンスの大きさ及び位相に基づいて、前記細胞の電気的特性を算出し、算出された前記電気的特性を出力する制御部と、を備える
計測装置。
A measuring device for carrying out the measuring method according to any one of claims 1 to 10.
An AC voltage connected to each of the first electrode, the second electrode, the third electrode, and the fourth electrode and having a predetermined frequency is applied to each of the four electrode sets, respectively. A measuring unit that measures impedance with magnitude and phase between electrode sets, and
A measuring device including a control unit that calculates the electrical characteristics of the cell based on the measured magnitude and phase of the impedance and outputs the calculated electrical characteristics.
請求項1〜10のいずれか一項に記載の計測方法をコンピュータに実行させるための
プログラム。
A program for causing a computer to execute the measurement method according to any one of claims 1 to 10.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023119963A1 (en) * 2021-12-24 2023-06-29 株式会社Screenホールディングス Flow channel device

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