JP2021166481A

JP2021166481A - Method for extraction of intracellular constituent

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Publication number: JP2021166481A
Application number: JP2020070743A
Authority: JP
Inventors: 昌治竹内; Shoji Takeuchi; 悠杉本; Yu Sugimoto; 香苗酒井; Kanae Sakai
Original assignee: Toyota Boshoku Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Toyota Boshoku Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2021-10-21
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: JP7409944B2

Abstract

To provide an extraction method that can efficiently extract an intracellular constituent.SOLUTION: The present invention relates to a method for extraction of an intracellular constituent 1 with an instrument 9 that has a body part 5 having a plurality of wells 3, and a lid 7 having gas permeability and to seal the openings of the wells 3. A culture medium 23 containing microorganisms 21 is put into the wells 3 and the openings are covered with the lid 7. In that state, the solvent of the culture medium 23 in the wells 3 are evaporated. The lid 7 is removed and an enzyme liquid 25 is added into the wells 3. The openings are covered with the lid 7. After left to stand for a predetermined period of time, the lid 7 is removed and the intracellular constituent 1 is extracted.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本開示は、細胞内構成物質の抽出方法に関する。 The present disclosure relates to a method for extracting intracellular constituent substances.

多様な微生物から有用な微生物を探索することが行われている。この場合に、培養後に有用な微生物の遺伝子を解析するため、ＤＮＡ等の細胞内構成物質を抽出する必要がある。
従来、ＤＮＡ等の細胞内構成物質を抽出する方法としては、例えば、非特許文献１に開示されている物理破砕を用いた方法、非特許文献２に開示されている熱を用いた方法、非特許文献３に開示されている電気穿孔を用いた方法が知られている。
非特許文献１では、ナノ粒子と微生物を混合し振動させて溶菌している。非特許文献２では、微生物を９５℃で加熱して溶菌している。非特許文献３では、微生物にＤＣ８ｋＶの電圧をかけて溶菌している。 Searching for useful microorganisms from various microorganisms is being carried out. In this case, it is necessary to extract intracellular constituents such as DNA in order to analyze the genes of useful microorganisms after culturing.
Conventionally, as a method for extracting an intracellular constituent substance such as DNA, for example, a method using physical disruption disclosed in Non-Patent Document 1, a method using heat disclosed in Non-Patent Document 2, and a non-patent document 2 are used. A method using electric perforation disclosed in Patent Document 3 is known.
In Non-Patent Document 1, nanoparticles and microorganisms are mixed and vibrated to lyse. In Non-Patent Document 2, microorganisms are lysed by heating at 95 ° C. In Non-Patent Document 3, microorganisms are lysed by applying a voltage of DC 8 kV.

Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，２０１８，ｖ９９，ｐ６２Biosens. Bioelectron. , 2018, v99, p62 ＬａｂＣｈｉｐ，２００４，ｖ４，ｐ５１６Lab Chip, 2004, v4, p516 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０１１，ｖ３２，ｐ３１７２Electrophoresis, 2011, v32, p3172

しかし、従来の方法は、細胞内構成物質の抽出効率が必ずしも十分でなく、新規な抽出方法が求められていた。
本開示は、上記実情に鑑みてなされたものであり、細胞内構成物質を効率よく抽出できる抽出方法を提供することを目的とする。本開示は、以下の形態として実現することが可能である。 However, the conventional method does not always have sufficient extraction efficiency of intracellular constituent substances, and a new extraction method has been required.
The present disclosure has been made in view of the above circumstances, and an object of the present disclosure is to provide an extraction method capable of efficiently extracting intracellular constituent substances. The present disclosure can be realized in the following forms.

〔１〕複数のウェルを有する本体部と、
ガス透過性を有し、前記ウェルの開口を塞ぐ蓋部と、を備えた器具を用いた細胞内構成物質の抽出方法であって、
微生物を含む培養液を前記ウェルに入れ、
前記開口を前記蓋部で覆った状態で、前記ウェル内の前記培養液の溶媒を蒸発させ、
前記蓋部を外して、前記ウェル内に酵素液を添加し、
前記開口を前記蓋部で覆い、所定時間置いた後に、前記蓋部を外して、前記細胞内構成物質を抽出する、細胞内構成物質の抽出方法。 [1] A main body having a plurality of wells and
A method for extracting intracellular constituents using an instrument having a gas-permeable lid and a lid that closes the opening of the well.
A culture solution containing microorganisms was placed in the well,
With the opening covered with the lid, the solvent of the culture solution in the well was evaporated.
The lid is removed, the enzyme solution is added into the well, and the enzyme solution is added.
A method for extracting an intracellular constituent substance, wherein the opening is covered with the lid portion, left for a predetermined time, and then the lid portion is removed to extract the intracellular constituent substance.

本開示の抽出方法によれば、効率的に細胞内構成物質を抽出できる。 According to the extraction method of the present disclosure, intracellular constituent substances can be efficiently extracted.

器具（マイクロチャンバー）の一例を示す斜視図である。It is a perspective view which shows an example of an instrument (micro chamber). 第１工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 1st process. 第２工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 2nd process. 第２工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 2nd process. 第３工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 3rd process. 第３工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 3rd process. 第４工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 4th process. 第４工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 4th process. 第４工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 4th process. 第４工程を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the 4th process. 器具（マイクロチャンバー）の一例を示す断面図である。It is sectional drawing which shows an example of an instrument (micro chamber). 器具（マイクロチャンバー）の使用方法の一例を示す側面図である。It is a side view which shows an example of how to use the instrument (micro chamber). 実施例１の抽出方法の概念図である。It is a conceptual diagram of the extraction method of Example 1. 比較例１の抽出方法の概念図である。It is a conceptual diagram of the extraction method of Comparative Example 1. 比較例２の抽出方法の概念図である。It is a conceptual diagram of the extraction method of Comparative Example 2. 比較例３の抽出方法の概念図である。It is a conceptual diagram of the extraction method of Comparative Example 3. 各種抽出方法によるＤＮＡ回収量を示すグラフである。It is a graph which shows the DNA recovery amount by various extraction methods. 各種微生物を用いた場合のＤＮＡ回収量を示すグラフである。It is a graph which shows the amount of DNA recovery when various microorganisms are used. 実験ＢにおけるウェルＩＤと菌体（微生物）の配置を説明する説明図である。It is explanatory drawing explaining the arrangement of a well ID and a bacterial cell (microorganism) in Experiment B. 実験Ｂの実験結果を示すグラフである。It is a graph which shows the experimental result of Experiment B.

ここで、本開示の望ましい例を示す。
〔２〕前記蓋部は、シリコーン樹脂を主成分とする、〔１〕に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
蓋部の主成分がシリコーン樹脂であると、蓋部を通して溶媒の除去がしやすくなる。
〔３〕前記本体部は、シリコーン樹脂を主成分とする、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
本体部の主成分がシリコーン樹脂であると、本体部を通しても溶媒の除去が行える。 Here, a desirable example of the present disclosure is shown.
[2] The method for extracting an intracellular constituent substance according to [1], wherein the lid portion contains a silicone resin as a main component.
When the main component of the lid portion is a silicone resin, the solvent can be easily removed through the lid portion.
[3] The method for extracting an intracellular constituent substance according to [1] or [2], wherein the main body is mainly composed of a silicone resin.
If the main component of the main body is silicone resin, the solvent can be removed through the main body as well.

以下、本開示を詳しく説明する。なお、本明細書において、数値範囲について「〜」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値及び上限値を含むものとする。例えば、「１０〜２０」という記載では、下限値である「１０」、上限値である「２０」のいずれも含むものとする。すなわち、「１０〜２０」は、「１０以上２０以下」と同じ意味である。 Hereinafter, the present disclosure will be described in detail. In this specification, the description using "~" for the numerical range shall include the lower limit value and the upper limit value unless otherwise specified. For example, in the description of "10 to 20", both the lower limit value "10" and the upper limit value "20" are included. That is, "10 to 20" has the same meaning as "10 or more and 20 or less".

１．細胞内構成物質１の抽出方法
細胞内構成物質１の抽出方法は、複数のウェル３を有する本体部５と、ウェル３の開口を塞ぐ蓋部７と、を備えた器具９を用いる（図１，１１参照）。蓋部７は、ガス透過性（水蒸気透過性）を有する。器具９は、マイクロチャンバー（マイクロデバイス）とも呼ばれる。
細胞内構成物質１の抽出方法は、以下の工程を少なくとも備える。なお、細胞内構成物質１とは、細胞内に存在する物質である。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質が例示される。
〔１〕微生物２１を含む培養液２３をウェル３に入れる第１工程（図２参照）。この際にウェル３毎に異なる種類の微生物２１を入れてもよい。ウェル３毎に異なる種類の微生物２１を入れれば、一度の実験で、複数種の微生物２１の細胞内構成物質１を抽出できる。
〔２〕開口を蓋部７で覆った状態で、ウェル３内の培養液２３の溶媒を蒸発させる第２工程（図３，４参照）。図３における矢印は水蒸気を示している（以下の図７でも同様である）。第２工程で溶媒を蒸発させることで、ウェル３内に酵素液２５を受け入れるスペースを十分に確保できる。仮に溶媒を蒸発させないと、第３工程で所定量の酵素液２５を入れた際に、酵素液２５がウェル３から溢れてしまい、隣接するウェル３間で内容物が混ざるおそれがある。すなわち、各ウェル３が異なる内容物の場合には、隣接するウェル３間でのコンタミネーションの原因となる可能性がある。
なお、第２工程の際に器具９は、例えば常温（１５℃〜３０℃）の環境下に静置される。
〔３〕蓋部７を外して、ウェル３内に酵素液２５を添加する第３工程（図５，６参照）。
〔４〕開口を蓋部７で覆い、所定時間（例えば２０分〜２時間）置いた後に、蓋部７を外して、細胞内構成物質１を抽出する第４工程（図７〜１０参照）。この工程では、酵素（例えば消化酵素）によって微生物の溶菌反応が起きて、細胞内構成物質１が細胞外へ出てくる。なお、第４工程の際に器具９は、例えば常温（１５℃〜３０℃）の環境下に静置される。
この第４工程では、図７に示すように、酵素液２５の溶媒を蒸発させてもよい。
第４工程では、図９に示すように細胞内構成物質１を乾燥した状態で取り出してもよいが、図１０に示すようにウェル３内に溶媒３１（例えば水）を更に入れて、細胞内構成物質１を含有する液体とし、この液体を取り出してもよい。ウェル３内に溶媒３１を加えて液体とすることで、細胞内構成物質１を抽出しやすくなる。 1. 1. Extraction Method of Intracellular Constituent Material 1 The extraction method of the intracellular constituent substance 1 uses an instrument 9 provided with a main body portion 5 having a plurality of wells 3 and a lid portion 7 for closing the opening of the well 3 (FIG. 1). , 11). The lid portion 7 has gas permeability (water vapor permeability). The instrument 9 is also called a microchamber (microdevice).
The method for extracting the intracellular constituent substance 1 includes at least the following steps. The intracellular constituent substance 1 is a substance existing in the cell. For example, DNA, RNA, and protein are exemplified.
[1] The first step (see FIG. 2) in which the culture solution 23 containing the microorganism 21 is put into the well 3. At this time, different types of microorganisms 21 may be added to each well 3. If different types of microorganisms 21 are added to each well 3, the intracellular constituent substance 1 of a plurality of types of microorganisms 21 can be extracted in one experiment.
[2] A second step of evaporating the solvent of the culture solution 23 in the well 3 with the opening covered with the lid 7 (see FIGS. 3 and 4). The arrow in FIG. 3 indicates water vapor (the same applies to FIG. 7 below). By evaporating the solvent in the second step, a sufficient space for receiving the enzyme solution 25 can be secured in the well 3. If the solvent is not evaporated, when a predetermined amount of the enzyme solution 25 is added in the third step, the enzyme solution 25 overflows from the wells 3, and the contents may be mixed between the adjacent wells 3. That is, if each well 3 has different contents, it may cause contamination between adjacent wells 3.
In the second step, the instrument 9 is allowed to stand in an environment of, for example, room temperature (15 ° C. to 30 ° C.).
[3] A third step of removing the lid portion 7 and adding the enzyme solution 25 into the well 3 (see FIGS. 5 and 6).
[4] A fourth step (see FIGS. 7 to 10) in which the opening is covered with the lid 7 and left for a predetermined time (for example, 20 minutes to 2 hours), then the lid 7 is removed and the intracellular constituent substance 1 is extracted (see FIGS. 7 to 10). .. In this step, an enzyme (for example, a digestive enzyme) causes a lytic reaction of the microorganism, and the intracellular constituent substance 1 comes out of the cell. In the fourth step, the instrument 9 is allowed to stand in an environment of, for example, room temperature (15 ° C. to 30 ° C.).
In this fourth step, as shown in FIG. 7, the solvent of the enzyme solution 25 may be evaporated.
In the fourth step, the intracellular constituent substance 1 may be taken out in a dry state as shown in FIG. 9, but as shown in FIG. 10, a solvent 31 (for example, water) is further added into the well 3 to enter the cell. A liquid containing the constituent substance 1 may be used, and this liquid may be taken out. By adding the solvent 31 into the well 3 to make it a liquid, it becomes easy to extract the intracellular constituent substance 1.

なお、第２，４工程では、図１２に示すように、蓋部７を被せた本体部５を、一対の板状体４１（例えばアクリル板）で挟み込んでもよい。このようにすることで、蓋部７が本体部５から外れることを防止できる。なお、板状体４１を用いる場合には、図１２に示すように、蓋部７と板状体４１との間に不織布４３を挟むことが望ましい。不織布４３を挟むことで、蓋部７と板状体４１との間に隙間ができるため、溶媒の除去が効率的に行える。 In the second and fourth steps, as shown in FIG. 12, the main body portion 5 covered with the lid portion 7 may be sandwiched between a pair of plate-shaped bodies 41 (for example, an acrylic plate). By doing so, it is possible to prevent the lid portion 7 from coming off from the main body portion 5. When the plate-shaped body 41 is used, it is desirable to sandwich the non-woven fabric 43 between the lid portion 7 and the plate-shaped body 41 as shown in FIG. By sandwiching the non-woven fabric 43, a gap is formed between the lid portion 7 and the plate-shaped body 41, so that the solvent can be efficiently removed.

ここで、各用語について詳細に説明する。
（１）器具９
器具９は、複数のウェル３を有する本体部５と蓋部７とを備える。本体部５は、例えば、複数の窪みたるウェル３を有する平板状部材である。
（１．１）本体部５
本体部５の材質は、特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が主成分として好適に用いられる。ここで、主成分とは、含有率（質量％）が５０質量％以上の物質をいう。シリコーン樹脂は、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。ポリジメチルシロキサンは、ガス透過性を有しており、水蒸気が透過するから、前記第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させるために好都合だからである。 Here, each term will be described in detail.
(1) Instrument 9
The instrument 9 includes a main body portion 5 having a plurality of wells 3 and a lid portion 7. The main body 5 is, for example, a flat plate-like member having a plurality of recessed wells 3.
(1.1) Main body 5
The material of the main body 5 is not particularly limited. As the material, for example, silicone resin is preferably used as the main component. Here, the main component means a substance having a content (mass%) of 50% by mass or more. The silicone resin is not particularly limited, but polydimethylsiloxane (PDMS), polymethylphenylsiloxane, polymethylhydrogensiloxane, polymethylmethoxysiloxane, polymethylvinylsiloxane and the like are preferable. These silicone resins may be used alone or in combination of two or more. Polydimethylsiloxane (PDMS) is preferred. This is because polydimethylsiloxane has gas permeability and is permeable to water vapor, which is convenient for evaporating the solvent (water) in the well 3 in the second step.

本体部５の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
本体部５の厚みｔ（図１１参照）は、特に限定されない。
本体部５の厚みｔは、ウェル３の深さを十分に確保する観点から、３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、本体部５の厚みｔは、取扱い性及び生産性の観点から、５ｍｍ以下が好ましく、３ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、本体部５の厚みｔは、３５０μｍ〜５ｍｍが好ましく、４００μｍ〜３ｍｍより好ましく、４５０μｍ〜２ｍｍが更に好ましい。 The planar shape and size of the main body 5 are not particularly limited.
The thickness t (see FIG. 11) of the main body 5 is not particularly limited.
The thickness t of the main body 5 is preferably 350 μm or more, more preferably 400 μm or more, still more preferably 450 μm or more, from the viewpoint of ensuring a sufficient depth of the well 3. On the other hand, the thickness t of the main body 5 is preferably 5 mm or less, more preferably 3 mm or less, still more preferably 2 mm or less, from the viewpoint of handleability and productivity. From these viewpoints, the thickness t of the main body 5 is preferably 350 μm to 5 mm, more preferably 400 μm to 3 mm, and even more preferably 450 μm to 2 mm.

ウェル３の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
ウェル３の平面形状は、例えば円形、矩形等を採用することができる。 The planar shape and size of the well 3 are not particularly limited.
As the planar shape of the well 3, for example, a circular shape, a rectangular shape, or the like can be adopted.

ウェル３の大きさは、その平面形状が円形の場合には、ウェル３に入る微生物の量を十分に確保する観点から、径３Ａ（図１１参照）は３５０μｍ以上が好ましく、５００μｍ以上がより好ましい。他方、ウェル３の大きさは、ウェル３を高密度に配置するの観点から、径３Ａは１２００μｍ以下が好ましく、１０００μｍ以下がより好ましい。これらの観点から、ウェル３の大きさは、その平面形状が円形の場合には、径３Ａは３５０μｍ〜１２００μｍが好ましく、５００μｍ〜１０００μｍがより好ましい。 When the planar shape of the well 3 is circular, the diameter 3A (see FIG. 11) is preferably 350 μm or more, more preferably 500 μm or more, from the viewpoint of sufficiently securing the amount of microorganisms entering the well 3. .. On the other hand, the size of the well 3 is preferably 1200 μm or less, more preferably 1000 μm or less, from the viewpoint of arranging the well 3 at a high density. From these viewpoints, when the planar shape of the well 3 is circular, the diameter 3A is preferably 350 μm to 1200 μm, and more preferably 500 μm to 1000 μm.

ウェル間距離３Ｂ（図１１参照）は、特に限定されない。ウェル間距離３Ｂとは、隣合うウェル３同士の最短の直線距離を意味する。
ウェル間距離３Ｂは、隣接するウェル３間でコンタミネーション抑制の観点から、２００μｍ〜１０００μｍが好ましい。 The distance between wells 3B (see FIG. 11) is not particularly limited. The distance between wells 3B means the shortest straight line distance between adjacent wells 3.
The distance between wells 3B is preferably 200 μm to 1000 μm from the viewpoint of suppressing contamination between adjacent wells 3.

ウェル３の深さ３Ｃ（図１１参照）は、特に限定されない。
ウェル３の深さ３Ｃは、ウェル３内に十分な培養液２３を内包する観点から、４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましく、８０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル３の深さ３Ｃは、深すぎて培養液２３、酵素液２５等を入れにくくなることを抑制する観点から、１６０μｍ以下が好ましく、１４０μｍ以下がより好ましく、１２０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル３の深さ３Ｃは、４０μｍ〜１６０μｍが好ましく、６０μｍ〜１４０μｍがより好ましく、８０μｍ〜１２０μｍが更に好ましい。 The depth 3C of the well 3 (see FIG. 11) is not particularly limited.
The depth 3C of the well 3 is preferably 40 μm or more, more preferably 60 μm or more, still more preferably 80 μm or more, from the viewpoint of including a sufficient culture solution 23 in the well 3. On the other hand, the depth 3C of the well 3 is preferably 160 μm or less, more preferably 140 μm or less, still more preferably 120 μm or less, from the viewpoint of suppressing the difficulty of inserting the culture solution 23, the enzyme solution 25, etc. because it is too deep. From these viewpoints, the depth 3C of the well 3 is preferably 40 μm to 160 μm, more preferably 60 μm to 140 μm, and even more preferably 80 μm to 120 μm.

ウェル３の容量は、特に限定されない。１つのウェル３の容量は、各ウェル３から十分な量の細胞内構成物質１を回収する観点から、３０ｎＬ〜１００ｎＬが好ましく、４０ｎＬ〜７０ｎＬがより好ましい。 The capacity of the well 3 is not particularly limited. The volume of one well 3 is preferably 30 nL to 100 nL, more preferably 40 nL to 70 nL, from the viewpoint of recovering a sufficient amount of the intracellular constituent substance 1 from each well 3.

１つの本体部５におけるウェル３の個数は、特に限定されず、本体部５の大きさ等に応じて適宜選択される。 The number of wells 3 in one main body 5 is not particularly limited, and is appropriately selected according to the size of the main body 5 and the like.

（１．２）蓋部７
蓋部７は、ウェル３の開口を塞ぐものであり、例えば、平板状部材とされている。
蓋部７の材質は、ガス透過性（水蒸気透過性）を有するものであれば特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が主成分として好適に用いられる。ここで、主成分とは、含有率（質量％）が５０質量％以上の物質をいう。シリコーン樹脂は、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。ポリジメチルシロキサンは、ガス透過性を有しており、水蒸気が透過するから、前記第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させるために好都合だからである。 (1.2) Cover 7
The lid portion 7 closes the opening of the well 3, and is, for example, a flat plate-shaped member.
The material of the lid portion 7 is not particularly limited as long as it has gas permeability (water vapor permeability). As the material, for example, silicone resin is preferably used as the main component. Here, the main component means a substance having a content (mass%) of 50% by mass or more. The silicone resin is not particularly limited, but polydimethylsiloxane (PDMS), polymethylphenylsiloxane, polymethylhydrogensiloxane, polymethylmethoxysiloxane, polymethylvinylsiloxane and the like are preferable. These silicone resins may be used alone or in combination of two or more. Polydimethylsiloxane (PDMS) is preferred. This is because polydimethylsiloxane has gas permeability and is permeable to water vapor, which is convenient for evaporating the solvent (water) in the well 3 in the second step.

蓋部７の厚み７Ａ（図１１参照）は、特に限定されない。
蓋部７の厚み７Ａは、第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させやすくする観点から、１００μｍ〜７００μｍが好ましく、２００μｍ〜６００μｍがより好ましい。 The thickness 7A of the lid portion 7 (see FIG. 11) is not particularly limited.
The thickness 7A of the lid portion 7 is preferably 100 μm to 700 μm, more preferably 200 μm to 600 μm, from the viewpoint of facilitating evaporation of the solvent (water) in the well 3 in the second step.

２．本実施形態の効果
本実施形態の抽出方法によれば、効率的に細胞内構成物質１を抽出できる。 2. Effect of the present embodiment According to the extraction method of the present embodiment, the intracellular constituent substance 1 can be efficiently extracted.

以下、実施例により更に具体的に説明する。 Hereinafter, a more specific description will be given with reference to Examples.

＜実験Ａ＞
以下の実験では、本開示の抽出方法（実施例１）、熱による抽出方法（比較例１）、電気穿孔による抽出方法（比較例２）、ビーズによる抽出方法（比較例３）をそれぞれ行い、抽出されたＤＮＡ量を比較した。なお、各方法の概念を図１３〜１６で示す。図１３は、本開示の抽出方法（実施例１）を示している。図１４は、熱による抽出方法（比較例１）を示している。図１５は、電気穿孔による抽出方法（比較例２）を示している。図１６は、ビーズによる抽出方法（比較例３）を示している。なお、図１３の符号４３は酵素を示し、図１６の符号４５はビーズを示している。 <Experiment A>
In the following experiments, the extraction method of the present disclosure (Example 1), the extraction method by heat (Comparative Example 1), the extraction method by electric perforation (Comparative Example 2), and the extraction method by beads (Comparative Example 3) were performed, respectively. The amount of extracted DNA was compared. The concept of each method is shown in FIGS. 13 to 16. FIG. 13 shows the extraction method (Example 1) of the present disclosure. FIG. 14 shows an extraction method by heat (Comparative Example 1). FIG. 15 shows an extraction method by electroporation (Comparative Example 2). FIG. 16 shows an extraction method using beads (Comparative Example 3). Reference numeral 43 in FIG. 13 indicates an enzyme, and reference numeral 45 in FIG. 16 indicates beads.

１．実験方法
（１）試薬
リン酸緩衝食塩水タブレットはＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈから購入した。これを純水に溶解させることで、２．７ｍＭ塩化カリウムと１３７ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４、これ以降ＰＢＳ（−）と略記）を調製した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二水素二ナトリウム水和物はナカライテスクから購入した。１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０、これ以降ＴＥＢｕｆｆｅｒと略記）はニッポン・ジーンから購入した。クエン酸、クエン酸３ナトリウム、リゾチーム、アクロモペプチダーゼは富士フィルムから購入した。ラビアーゼはコスモバイオから購入した。リゾチーム、アクロモペプチダーゼの１０ｍｇｍＬ^−１ストック溶液はＴＥｂｕｆｆｅｒを用いて調製した。ラビアーゼの１０ｍｇｍＬ^−１ストック溶液は１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて作成した。酵素による溶菌を用いた本開示の抽出方法では、実験直前にこれらのストック溶液をＴＥｂｕｆｆｅｒで希釈し、リゾチーム溶液（２００μｇｍＬ^−１）、もしくはリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼの混合溶液（それぞれ２００μｇｍＬ^−１）を作製した。 1. 1. Experimental Method (1) Reagent Phosphate Buffered Saline Tablet was purchased from Sigma Aldrich. By dissolving this in pure water, a 10 mM phosphate buffered saline (pH 7.4, hereinafter abbreviated as PBS (−)) containing 2.7 mM potassium chloride and 137 mM sodium chloride was prepared. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium dihydrogen hydrate was purchased from Nacalai Tesque. A 10 mM Tris buffer (pH 8.0, hereinafter abbreviated as TE Buffer) containing 1 mM EDTA was purchased from Nippon Gene. Citric acid, trisodium citrate, lysozyme, and achromopeptidase were purchased from Fujifilm. Labiase was purchased from Cosmo Bio. A 10 mg mL- ¹ stock solution of lysozyme, achromopeptidase was prepared using TE buffer. A 10 mg mL- ¹ stock solution of labiase was prepared using 10 mM citrate buffer (pH 4.0) containing 1 mM EDTA. In the extraction method of the present disclosure using enzymatic lysis, these stock solutions are diluted with TE buffer immediately prior to the experiment and lysozyme solution (200 μg mL ^-1 ) or a mixed solution of lysozyme, achromopeptidase, and labiase (200 μg each). mL ^-1 ) was prepared.

（２）微生物の培養
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）はＬＢ培地にて３７℃で振とう培養した。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（ＮＢＲＣ１０２４１３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ１３７１９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ（ＮＢＲＣ１４１６４）はＭｅｄｉｕｍＮｏ．７０２（ハイポリペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．０）にて３０℃で振とう培養した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ＮＢＲＣ１００９１１）はＭｅｄｉｕｍＮｏ．７０２で３７℃にて振とう培養した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（ＮＢＲＣＮｏ．１３４１４）はＩｓｐＭｅｄｉｕｍＮｏ．２（酵母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．３）にて２８℃で振とう培養した。培養後、各菌体液を１，０００×ｇ、５ｍｉｎで遠心した。遠心後、上清を捨てＰＢＳ（−）を１ｍＬ加えて懸濁した。懸濁後、１，０００×ｇ、１０ｍｉｎで遠心した。遠心後、上清を捨て、菌体の湿重量１ｍｇに対してＰＢＳ（−）を１μＬ加えて懸濁し、各菌体の溶菌サンプルとした。 (2) Culture of microorganisms Escherichia coli (ATCC 25922) was cultured in LB medium by shaking at 37 ° C. Acinetobacter radioretestens (NBRC 102413), Bacillus subtilis subsp. Subtilis (NBRC 13719) and Pseudomonas putida (NBRC 14164) are described in Medium No. 702 (high poly peptone 10 g, yeast extract _{_{2g, MgSO 4 · 7H 2 O}} 1g, distilled water 1L, pH 7.0) and cultured with shaking at 30 ° C. at. Staphylococcus (NBRC 100911) is described in Medium No. The cells were cultured with shaking at 37 ° C. at 702. Streptomyces kanamyces (NBRC No. 13414) is described in Isp Medium No. 2 (4 g of yeast extract, 10 g of malt extract, 4 g of glucose, 1 L of distilled water, pH 7.3) was cultured with shaking at 28 ° C. After culturing, each bacterial cell fluid was centrifuged at 1,000 × g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded and 1 mL of PBS (-) was added and suspended. After suspension, it was centrifuged at 1,000 × g for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, and 1 μL of PBS (−) was added to 1 mg of wet weight of the cells to suspend the cells to prepare a lysed sample of each cells.

（３）標準ＤＮＡ試料の作製
各微生物を上述の手順で培養、遠心し、湿重量５０〜１００ｍｇを得た。この菌体を微生物破砕・精製キット（ＺＹＭＯＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｑｕｉｃｋ−ＤＮＡＦｕｎｇａｌ／ＢａｃｔｅｒｉａｌＫｉｔ（Ｄ６００５））にアプライし、ＤＮＡを抽出・精製した。精製したＤＮＡの濃度（ｃＤＮＡ）は２６０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ２６０）を測定し、以下の式を用いて算出した。
ｃＤＮＡ（ｎｇμＬ^−１）＝Ａｂｓ２６０×５０
このＤＮＡを標準ＤＮＡ試料とした。これをＴＥｂｕｆｆｅｒで希釈し、ｑＰＣＲの検量線作成のための希釈系列（１０ｎｇμＬ^−１、１ｎｇμＬ^−１、０．１ｎｇμＬ^−１、０．０１ｎｇμＬ^−１、０．００１ｎｇμＬ^−１）とした。 (3) Preparation of standard DNA sample Each microorganism was cultured and centrifuged according to the above procedure to obtain a wet weight of 50 to 100 mg. This bacterial cell was applied to a microbial crushing / purification kit (ZYMO RESEARCH, Quick-DNA Fungal / Bacterial Kit (D6005)), and DNA was extracted and purified. The concentration (cDNA) of the purified DNA was calculated by measuring the absorbance (Abs260) at 260 nm using the following formula.
cDNA (ngμL ^-1 ) = Abs 260 × 50
This DNA was used as a standard DNA sample. This was diluted with TE buffer to prepare a dilution series (10 ng μL ^-1 , ¹ ng μL ^-1 , 0.1 ng μL ^-1 , 0.01 ng μL -1, 0.001 ng μL ^-1 ) for preparing a calibration curve for qPCR.

（４）ｑＰＣＲ測定
各微生物の遺伝子に特異的なプライマーを作製した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの場合、作成したプライマー、測定サンプル、ＴＡＫＡＲＡ，ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＧＣ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）を用い、溶液量２０μＬとしてｑＰＣＲ測定を行った。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ以外の微生物の場合、作成したプライマー、測定サンプル、ＴＡＫＡＲＡ，ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（ＴｌｉＲＮａｓｅＨＰｌｕｓ）を用い、溶液量２０μＬとしてｑＰＣＲ測定を行った。検量線は標準ＤＮＡの希釈系列をサンプルとすることで作成した。 (4) qPCR measurement Primers specific to the genes of each microorganism were prepared. In the case of Streptomyces, qPCR measurement was performed with a solution volume of 20 μL using the prepared primers, measurement sample, TAKARA, TB Green Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time). In the case of microorganisms other than Streptomyces, qPCR measurement was performed with a solution volume of 20 μL using the prepared primers, measurement sample, TAKARA, TB Green Premix Ex Taq II (TliRNaseH Plus). The calibration curve was prepared by using a dilution series of standard DNA as a sample.

（５）各実験に用いた器具
実施例１、比較例１、比較例３では、本体部５と蓋部７とを備えた器具９（マイクロチャンバー）を用いた。ウェル３のサイズ等を以下に示す。ウェル３の平面形状は、全て円形とした。これらの器具９（マイクロチャンバー）は、全てポリジメチルシロキサンにより作製した。 (5) Instruments used in each experiment In Example 1, Comparative Example 1, and Comparative Example 3, an instrument 9 (microchamber) having a main body 5 and a lid 7 was used. The size of well 3 and the like are shown below. The planar shape of the wells 3 is all circular. All of these instruments 9 (microchambers) were made of polydimethylsiloxane.

比較例２では、厚さ３００μｍのポリジメチルシロキサン製のシートを用いた。このシートには、直径５００μｍの円形の貫通孔が５００μｍの間隔で形成されている。このシートを２枚の白金電極で挟むことでチャンバとした。 In Comparative Example 2, a sheet made of polydimethylsiloxane having a thickness of 300 μm was used. Circular through holes having a diameter of 500 μm are formed in this sheet at intervals of 500 μm. This sheet was sandwiched between two platinum electrodes to form a chamber.

（６）実施例１の実験方法（酵素による溶菌）
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した（第１工程）。この本体部５に蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態にて常温で３０ｍｉｎ静置し、菌体液に含まれる水分を蒸発させた（第２工程）。水分を蒸発後、蓋部７を外して、ウェル３内に酵素溶液（リゾチーム溶液（２００μｇｍＬ^−１）、もしくはリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ混合溶液（それぞれ２００μｇｍＬ^−１））を２００μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた（第３工程）。蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態で、常温で２０ｍｉｎの酵素反応を進めた後、蓋部７を取り外した。その後、本体部５に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した（第４工程）。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。 (6) Experimental method of Example 1 (enzymatic lysis)
Apply 50 μL of the bacterial cell fluid to the well 3 of the main body 5 (manufactured by PDMS), spread it so as to cover all the wells 3, and then wipe the surface of the main body 5 using a PDMS piece (25 mm × 25 mm, thickness about 2 mm). Excess cell fluid was removed (first step). The main body 5 was covered with a lid 7 (manufactured by PDMS) and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to evaporate the water contained in the bacterial cell fluid (second step). After evaporating the water, remove the lid 7 and apply 200 μL ^{of enzyme solution (lysozyme solution (200 μg mL -1} ) or mixed solution of lysozyme, achromopeptidase, and labiase (each 200 μg mL ^{-1)) into the well 3.} , Spread to cover all wells 3 (third step). With the lid 7 (manufactured by PDMS) covered, the enzyme reaction was carried out for 20 minutes at room temperature, and then the lid 7 was removed. Then, 200 μL of pure water was applied to the main body 5, and DNA was recovered by pipetting on the main body 5 (fourth step). The collected liquid was centrifuged at 10,000 × g for 1 min, the supernatant was collected, and the amount of DNA contained therein was determined by qPCR measurement.

（７）比較例１の実験方法（熱による溶菌）
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した。この本体部５をホットプレートにて９８℃、１０ｍｉｎ間加熱した。加熱後、本体部５に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。 (7) Experimental method of Comparative Example 1 (lysis by heat)
Apply 50 μL of the bacterial cell fluid to the well 3 of the main body 5 (manufactured by PDMS), spread it so as to cover all the wells 3, and then wipe the surface of the main body 5 with a PDMS piece (25 mm × 25 mm, thickness about 2 mm). Excess bacterial fluid was removed. The main body 5 was heated on a hot plate at 98 ° C. for 10 minutes. After heating, 200 μL of pure water was applied to the main body 5, and DNA was recovered by pipetting on the main body 5. The collected liquid was centrifuged at 10,000 × g for 1 min, the supernatant was collected, and the amount of DNA contained therein was determined by qPCR measurement.

（８）比較例２の実験方法（電気穿孔による抽出方法）
貫通孔が形成された上述のポリジメチルシロキサン製のシートを用いた。ガラスに白金をスパッタしたものを電極とした。シートを白金電極にのせ、そこに菌体液を５０μＬアプライし、すべての穴を覆うように広げた後、もう一枚の白金電極で蓋をした。あふれた菌体液は除去した。これをクランプで固定し、電極間に１００Ｖ、１ｓ印加した。電圧印加後、クランプ、白金電極を取り外し、シートに純水２００μＬをアプライし、シート上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。 (8) Experimental method of Comparative Example 2 (extraction method by electroporation)
The above-mentioned sheet made of polydimethylsiloxane having through holes formed was used. A glass sputtered with platinum was used as an electrode. The sheet was placed on a platinum electrode, 50 μL of the bacterial cell fluid was applied thereto, and the sheet was spread so as to cover all the holes, and then covered with another platinum electrode. The overflowing bacterial cell fluid was removed. This was fixed with a clamp, and 100 V, 1 s was applied between the electrodes. After applying the voltage, the clamp and the platinum electrode were removed, 200 μL of pure water was applied to the sheet, and DNA was recovered by pipetting on the sheet. The collected liquid was centrifuged at 10,000 × g for 1 min, the supernatant was collected, and the amount of DNA contained therein was determined by qPCR measurement.

（９）比較例３の実験方法（ビーズによる抽出方法）
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に直径５０μｍのジルコニア製のビーズ４５をアプライした。すべてのウェル３にビーズ４５を入れた後、本体部５を裏返し、余分なビーズ４５を振り落とした。ウェル３とウェル３の間の表面に付着したジルコニアのビーズ４５はテープで除去した。ビーズ４５を入れたウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３（穴）を覆うように広げた。その後、ＰＤＭＳ片（２０ｍｍ×２０ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を蓋部７として押しつけるように本体部５に被せた。ＰＤＭＳ片を押しつけた際にあふれた菌体液は除去した。本体部５と蓋部７とを厚さ１ｍｍのガラス板２枚で挟みクランプで固定した。これをボルテックスミキサーで２０ｍｉｎ間振とうした。その後、クランプ、ガラス板、蓋部７を取り外した。その後、ウェル３に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。 (9) Experimental method of Comparative Example 3 (extraction method using beads)
A zirconia bead 45 having a diameter of 50 μm was applied to the well 3 of the main body 5 (made of PDMS). After putting the beads 45 in all the wells 3, the main body 5 was turned over and the excess beads 45 were shaken off. The zirconia beads 45 adhering to the surface between wells 3 were removed with tape. 50 μL of the bacterial cell fluid was applied to the well 3 containing the beads 45, and the cells were spread so as to cover all the wells 3 (holes). Then, a PDMS piece (20 mm × 20 mm, thickness about 2 mm) was put on the main body 5 so as to be pressed as the lid 7. The bacterial fluid that overflowed when the PDMS piece was pressed was removed. The main body 5 and the lid 7 were sandwiched between two glass plates having a thickness of 1 mm and fixed with a clamp. This was shaken for 20 minutes with a vortex mixer. After that, the clamp, the glass plate, and the lid 7 were removed. Then, 200 μL of pure water was applied to the well 3 and pipetting was performed on the main body 5 to recover the DNA. The collected liquid was centrifuged at 10,000 × g for 1 min, the supernatant was collected, and the amount of DNA contained therein was determined by qPCR measurement.

２．実験結果
（１）各種抽出方法によるＤＮＡ回収量
微生物として、Ｅ．ｃｏｌｉを用いた結果を図１７に示す。実施例１では酵素としてリゾチームを用いた場合の結果が示されている。
図１７より、実施例１は、比較例１〜３よりもＤＮＡの回収量（抽出量）が多いことが確認された。 2. Experimental results (1) Amount of DNA recovered by various extraction methods As a microorganism, E.I. The result of using colli is shown in FIG. Example 1 shows the results when lysozyme was used as the enzyme.
From FIG. 17, it was confirmed that Example 1 had a larger amount of DNA recovered (extracted amount) than Comparative Examples 1 to 3.

（２）各種微生物を用いた場合のＤＮＡ回収量
実施例１において、６種類の異なる微生物を用いた場合のＤＮＡ回収量を検討した。図１８に結果を示す。いずれの微生物の場合においても、図１７の比較例１〜３よりもＤＮＡの回収量（抽出量）が多いことが確認された。 (2) Amount of DNA recovered when various microorganisms were used In Example 1, the amount of DNA recovered when six different types of microorganisms were used was examined. The results are shown in FIG. In the case of any of the microorganisms, it was confirmed that the amount of DNA recovered (extracted amount) was larger than that of Comparative Examples 1 to 3 in FIG.

３．実施例の効果
本実施例の抽出方法によれば、従来法よりもＤＮＡ等の細胞内構成物質を効率よく抽出できる。この抽出方法は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の種類を問わず、幅広い微生物に適用可能である。 3. 3. Effect of Example According to the extraction method of this example, intracellular constituent substances such as DNA can be extracted more efficiently than the conventional method. This extraction method is applicable to a wide range of microorganisms regardless of the types of Gram-positive and Gram-negative bacteria.

＜実験Ｂ＞
この実験では、本開示の器具９を用いた細胞内構成物質１の抽出方法において、各ウェル３毎にそれぞれ異なる微生物を含む培養液を入れた場合に、クロスコンタミネーションが抑制されることを確認した。
この実験では、図１９に示すように、隣接する複数の（５つの）ウェル３に対して、別々の微生物を含む培養液（菌体液（ＯＤ６６０＝１．０））をアプライした。各ウェル３のウェル間距離３Ｂは、４５０μｍとした。ウェル３は平面形状が円形であり、径が７５０μｍとした。
各ウェル３には、ウェルＩＤを付している。各ウェル３には、次の微生物を含む培養液をアプライした。
ウェルＩＤ１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ウェルＩＤ２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ウェルＩＤ３：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ウェルＩＤ４：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ウェルＩＤ５：Ｅ．ｃｏｌｉ <Experiment B>
In this experiment, it was confirmed that in the method for extracting the intracellular constituent substance 1 using the instrument 9 of the present disclosure, cross-contamination was suppressed when a culture solution containing a different microorganism was added to each well 3. bottom.
In this experiment, as shown in FIG. 19, a culture solution (cell fluid (OD660 = 1.0)) containing different microorganisms was applied to a plurality of (five) wells 3 adjacent to each other. The distance between wells 3B of each well 3 was set to 450 μm. The well 3 has a circular planar shape and a diameter of 750 μm.
A well ID is attached to each well 3. A culture solution containing the following microorganisms was applied to each well 3.
Well ID 1: Pseudomonas
Well ID 2: Bacillus
Well ID 3: Staphylococcus
Well ID 4: Acinetobacter
Well ID 5: E.I. coli

実験方法を次に示す。本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３にそれぞれの菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した（第１工程）。この本体部５に蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態にて常温で３０ｍｉｎ静置し、菌体液に含まれる水分を蒸発させた（第２工程）。水分を蒸発後、蓋部７を外して、ウェル３内にリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ混合溶液（それぞれ２００μｇｍＬ^−１）を２００μＬアプライした（第３工程）。蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態で、常温で２０ｍｉｎの酵素反応を進めた後、蓋部７を取り外した。その後、マイクロピペットのチップで各ウェル３をこすってＤＮＡを回収した（第４工程）。０．１ＮＮａＯＨ５μＬでチップ先端を洗い、０．１ＮＨＣｌ５μＬで中和し、実験Ａと同様にＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。 The experimental method is shown below. Apply 50 μL of each bacterial solution to the well 3 of the main body 5 (manufactured by PDMS), spread it so as to cover all the wells 3, and then use a PDMS piece (25 mm × 25 mm, thickness about 2 mm) to cover the surface of the main body 5. Was wiped to remove excess bacterial cell fluid (first step). The main body 5 was covered with a lid 7 (manufactured by PDMS) and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to evaporate the water contained in the bacterial cell fluid (second step). After evaporating the water content, the lid 7 was removed, and 200 μL of a mixed solution of lysozyme, achromopeptidase, and labiase (each 200 μg mL ^-1 ) was applied into the well 3 (third step). With the lid 7 (manufactured by PDMS) covered, the enzyme reaction was carried out for 20 minutes at room temperature, and then the lid 7 was removed. Then, the DNA was collected by rubbing each well 3 with the tip of a micropipette (4th step). The tip of the chip was washed with 5 μL of 0.1N NaOH, neutralized with 5 μL of 0.1N HCl, and the amount of DNA was determined by qPCR measurement in the same manner as in Experiment A.

実験結果を図２０に示す。各ウェル３で、そこにアプライした微生物のＤＮＡが主に回収されたことから、クロスコンタミネーションが抑制されていることが確認された。これは、第２工程で溶媒を蒸発させることによって、ウェル３内に酵素液を受け入れるスペースを十分に確保することができ、その結果、第３工程で所定量の酵素液を入れた際に、酵素液２５がウェル３から溢れて、隣接するウェル３間で内容物が混ざりにくかったためと推測される。 The experimental results are shown in FIG. In each well 3, the DNA of the microorganism applied thereto was mainly recovered, confirming that cross-contamination was suppressed. This is because by evaporating the solvent in the second step, a sufficient space for receiving the enzyme solution can be secured in the well 3, and as a result, when a predetermined amount of the enzyme solution is added in the third step, It is presumed that the enzyme solution 25 overflowed from the well 3 and the contents were difficult to mix between the adjacent wells 3.

前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述及び図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的及び例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲又は本質から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料及び実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。 The above examples are for illustration purposes only and are not to be construed as limiting the invention. Although the present invention has been described with reference to typical embodiments, the language used in the description and illustration of the invention is understood to be descriptive and exemplary rather than restrictive. As described in detail here, modifications can be made within the scope of the appended claims without departing from the scope or nature of the invention in that form. Although specific structures, materials and examples have been referred to herein in detail of the invention, it is not intended to limit the invention to the disclosures herein, but rather the invention is claimed in the accompanying claims. It shall cover all functionally equivalent structures, methods and uses within the scope.

本発明は上記で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。 The present invention is not limited to the embodiments detailed above, and various modifications or modifications can be made within the scope of the claims of the present invention.

本開示の細胞内構成物質の抽出方法を用いれば、細胞内構成物質を効率よく抽出できる By using the method for extracting intracellular constituents of the present disclosure, intracellular constituents can be efficiently extracted.

１ …細胞内構成物質
３ …ウェル
３Ａ…径
３Ｂ…ウェル間距離
３Ｃ…深さ
５ …本体部
７ …蓋部
７Ａ…厚み
９ …器具
２１…微生物
２３…培養液
２５…酵素液
３１…溶媒
４１…板状体
４３…不織布 1 ... Intracellular constituents 3 ... Wells 3A ... Diameter 3B ... Well-to-well distance 3C ... Depth 5 ... Main body 7 ... Lid 7A ... Thickness 9 ... Instruments 21 ... Microorganisms 23 ... Culture solution 25 ... Enzyme solution 31 ... Solvent 41 ... Plate-shaped body 43 ... Non-woven fabric

Claims

The main body with multiple wells and
A method for extracting intracellular constituents using an instrument having a gas-permeable lid and a lid that closes the opening of the well.
A culture solution containing microorganisms was placed in the well,
With the opening covered with the lid, the solvent of the culture solution in the well was evaporated.
The lid is removed, the enzyme solution is added into the well, and the enzyme solution is added.
A method for extracting an intracellular constituent substance, wherein the opening is covered with the lid portion, left for a predetermined time, and then the lid portion is removed to extract the intracellular constituent substance.

The method for extracting an intracellular constituent substance according to claim 1, wherein the lid portion contains a silicone resin as a main component.

The method for extracting an intracellular constituent substance according to claim 1 or 2, wherein the main body is mainly composed of a silicone resin.