JP2021153595A - 抗インスリン抵抗性物質スクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】インスリン抵抗性を治療できる化合物を探索する手法を提供すること。【解決手段】被検物質が適用された脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質をスクリーニングする方法。【選択図】なし
Description
本発明は、抗インスリン抵抗性物質をスクリーニングする方法等に関する。
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、肝硬変や肝癌へと進行する可能性のある肝炎であって、近年患者数が増えてきており、その対策は急務となっている。ＮＡＳＨの発症メカニズムについては、まだ不明点も多いが、次のような二段階を経る発症経路が提唱され、広く受け入れられている。すなわち、まず、肥満，糖尿病，高脂血症等のインスリン抵抗性によって肝臓に脂肪が蓄積して脂肪肝になり、次に脂質過酸化、サイトカイン、鉄などの酸化ストレスによりＮＡＳＨへ進行するという発症経路である。
インスリン抵抗性とは、肝臓や脂肪細胞等でインスリンが正常に働かなくなった状態のことをいい、インスリン作用障害ともいう。インスリン抵抗性があると、食事で高くなった血糖値を感知して、すい臓からインスリンが分泌されても、筋肉や肝臓が血液中のブドウ糖を取り込まないため、血糖値が下がらず、糖尿病をはじめ様々な生活習慣病を発症する危険性が高まる。
よって、インスリン抵抗性を治療することができれば、糖尿病をはじめとする生活習慣病の予防及び治療のみならず、ＮＡＳＨの予防及び治療にも役立つといえる。
これまでに、脂肪細胞においてインスリン抵抗性があると、脂肪細胞でロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）が産生され分泌されることが報告されている（非特許文献１）。
Ｍｏｔｈｅ−Ｓａｔｎｅｙ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ２０１２ Ｓｅｐ；６１（９）：２３１１−９．
Ｍａｔｔｈｅｗ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１１， １８７：１９４２−１９４９
Ｐｉｎｇｐｉｎｇ ｅｔ． ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１５ ２１：２３９−２４７
本発明は、インスリン抵抗性を治療できる化合物を探索する手法を提供すること等を課題とする。
本発明者らは、インスリン抵抗性の細胞において、５−リポキシゲナーゼ（５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ；５−ＬＯ）の発現増加が、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）過剰産生に関係していることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
被検物質（化合物も組成物も包含する）が適用された脂肪細胞（脂肪前駆細胞も含む）における５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）遺伝子の発現量（好ましくはｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量）を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質（ＮＡＳＨ予防及び／
又は治療薬を含む）をスクリーニングする方法。（当該方法においては、被験物質の添加により５−ＬＯ遺伝子の発現量が減少した場合に、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として好ましく選択することができる。）
項２．
脂肪細胞が、単離された脂肪細胞である、項１に記載の方法。
項３．
被検物質が適用された単離脂肪細胞（脂肪前駆細胞も含む）の培養液中のロイコトリエンＢ４量を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質（ＮＡＳＨ予防及び／又は治療薬候補物質を含む）をスクリーニングする方法。（当該方法においては、被験物質の添加により培養液中のロイコトリエンＢ４量が減少した場合に、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として好ましく選択することができる。）
項４．
脂肪細胞が、初代培養細胞である、項２又は３に記載の方法。
項５．
脂肪細胞が、５−ＬＯ遺伝子が過剰発現した脂肪細胞（インスリン抵抗性患者やＮＡＳＨ患者から単離した脂肪細胞でもよいし、モデル非ヒト哺乳動物〔遺伝子組み換え動物も含む〕由来脂肪細胞でもよいし、単離後に５−ＬＯ過剰発現遺伝子操作された細胞でもよい）である、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．
５−ＬＯ遺伝子が脂肪細胞において（好ましくは脂肪細胞特異的に）過剰発現した（好ましくはインスリン抵抗性又はＮＡＳＨのモデルである）非ヒト哺乳動物。
項７．
非ヒト哺乳動物の脂肪細胞において５−ＬＯ遺伝子を過剰発現させる工程を含む、インスリン抵抗性非ヒト哺乳動物を製造する方法。
項８．
被験単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、当該被験単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたかを判定する方法。
項９．
被験単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量が、正常対象から得た単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量より高い場合に、当該被験単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたと判定する、項８に記載の方法。
項１０．
５−ＬＯのｍＲＮＡを増幅するプライマーセット、及び／又は、５−ＬＯタンパク質を認識する抗体若しくはアプタマー、を備える、
抗インスリン抵抗性物質スクリーニング用キット。
項１．
被検物質（化合物も組成物も包含する）が適用された脂肪細胞（脂肪前駆細胞も含む）における５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）遺伝子の発現量（好ましくはｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量）を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質（ＮＡＳＨ予防及び／
又は治療薬を含む）をスクリーニングする方法。（当該方法においては、被験物質の添加により５−ＬＯ遺伝子の発現量が減少した場合に、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として好ましく選択することができる。）
項２．
脂肪細胞が、単離された脂肪細胞である、項１に記載の方法。
項３．
被検物質が適用された単離脂肪細胞（脂肪前駆細胞も含む）の培養液中のロイコトリエンＢ４量を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質（ＮＡＳＨ予防及び／又は治療薬候補物質を含む）をスクリーニングする方法。（当該方法においては、被験物質の添加により培養液中のロイコトリエンＢ４量が減少した場合に、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として好ましく選択することができる。）
項４．
脂肪細胞が、初代培養細胞である、項２又は３に記載の方法。
項５．
脂肪細胞が、５−ＬＯ遺伝子が過剰発現した脂肪細胞（インスリン抵抗性患者やＮＡＳＨ患者から単離した脂肪細胞でもよいし、モデル非ヒト哺乳動物〔遺伝子組み換え動物も含む〕由来脂肪細胞でもよいし、単離後に５−ＬＯ過剰発現遺伝子操作された細胞でもよい）である、項１〜４のいずれかに記載の方法。
項６．
５−ＬＯ遺伝子が脂肪細胞において（好ましくは脂肪細胞特異的に）過剰発現した（好ましくはインスリン抵抗性又はＮＡＳＨのモデルである）非ヒト哺乳動物。
項７．
非ヒト哺乳動物の脂肪細胞において５−ＬＯ遺伝子を過剰発現させる工程を含む、インスリン抵抗性非ヒト哺乳動物を製造する方法。
項８．
被験単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、当該被験単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたかを判定する方法。
項９．
被験単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量が、正常対象から得た単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量より高い場合に、当該被験単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたと判定する、項８に記載の方法。
項１０．
５−ＬＯのｍＲＮＡを増幅するプライマーセット、及び／又は、５−ＬＯタンパク質を認識する抗体若しくはアプタマー、を備える、
抗インスリン抵抗性物質スクリーニング用キット。
本発明に係るスクリーニング方法により、抗インスリン抵抗性物質（ＮＡＳＨ予防及び／又は治療薬を含む）を簡便にスクリーニングすることができる。また、本発明に係る非ヒト哺乳動物は、特にインスリン抵抗性又はＮＡＳＨのモデルとして有用である。さらに、本発明に係る判定方法により、単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたかを簡便に判定することができる。
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
本発明は、抗インスリン抵抗性物質のスクリーニング方法を含む。抗インスリン抵抗性物質とは、その物質をインスリン抵抗性の対象（好ましくは哺乳類、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ウマ等、特に好ましくはヒト）に適用することでインスリン抵抗性を治療できる可能性を有する物質である。よって、当該方法は、特にインスリン抵抗性の治療薬候補物質を選択するのに有用である。なお、上述の通り、インスリン抵抗性はＮＡＳＨ発症の引き金の一つとされていることから、インスリン抵抗性の治療薬候補物質は、ＮＡＳＨの予防及び／又は治療薬候補物質でもあり得る。
当該スクリーニング方法は、被検物質が適用された脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する工程を含む。
ここでの被験物質は、特に制限はされない。例えば、化合物及び組成物であり得る。化合物としては、例えば低分子化合物や、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物であってよい。組成物としても、生物（例えば動物、植物、微生物等）から得た抽出物等であってもよく、化合物を２種以上組み合わせたものであってもよい。
また、ここでの脂肪細胞には、特に断らない限り脂肪前駆細胞、肥大化脂肪細胞も包含される。また、当該脂肪細胞は、被験物質を適用する際には、生体（好ましくは哺乳類）から単離された脂肪細胞であってもよいし、生体に存在する脂肪細胞であってもよい。ここでの単離された脂肪細胞とは、生体から単離されたという意味合いであり、例えば、細胞一つ一つが分離されている状態のものや、複数の脂肪細胞が結合した状態の塊となっている状態のものも包含する。単離された脂肪細胞に被験物質を用いる場合には、被験物質の適用は、例えば、培養脂肪細胞に対して直接ふりかける又は培養液中に添加する方法が挙げられる。また、生体に存在する脂肪細胞を用いる場合には、被験物質の適用は、例えば生体に被験物質を摂取（例えば経口摂取、皮下摂取、経静脈若しくは動脈摂取など）させる方法が挙げられる。なお、被験物質を摂取させる場合においても、５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する際には、バイオプシー等によって生体から脂肪細胞を単離してから行うことが好ましい。なお、用いる脂肪細胞としては、特に初代培養細胞が好ましい。これは
、初代培養細胞以外の細胞（例えば株化された脂肪細胞）を用いた場合には、５−ＬＯ遺伝子の発現量変化が検出しづらいおそれがあるためである。
、初代培養細胞以外の細胞（例えば株化された脂肪細胞）を用いた場合には、５−ＬＯ遺伝子の発現量変化が検出しづらいおそれがあるためである。
また、用いる脂肪細胞は、正常生体（好ましくは哺乳類）由来の脂肪細胞であってもよく、インスリン抵抗性の脂肪細胞であってもよい。また、５−ＬＯ遺伝子過剰発現した脂肪細胞であってもよい。インスリン抵抗性の脂肪細胞は、インスリン抵抗性の生体由来の脂肪細胞であってもよく、正常生体由来の脂肪細胞を人為的操作（例えば薬物投与又は遺伝子操作）によりインスリン抵抗性を示す脂肪細胞としたものでもよい。ここでのインスリン抵抗性の生体は、インスリン抵抗性（ＮＡＳＨを含む）を患った対象はもちろんのこと、薬物投与や遺伝子操作などの人為的操作により作製されたインスリン抵抗性（ＮＡＳＨを含む）のモデル非ヒト哺乳動物をも包含する。当該モデル非ヒト哺乳動物としては、例えば、下述する５−ＬＯ遺伝子が脂肪細胞において過剰発現した非ヒト哺乳動物を挙げることができる。また、遺伝子操作により正常生体由来の脂肪細胞をインスリン抵抗性を示す脂肪細胞とする場合、５−ＬＯ遺伝子を過剰発現させる操作を用いることができる。なお、５−ＬＯ遺伝子の過剰発現は、公知の方法により行うことできる。例えば、発現ベクターのプロモーター下流に５−ＬＯ遺伝子を接続して作製したコンストラクトを脂肪細胞に導入することで行うことができる。
５−ＬＯ遺伝子の発現量の測定は、より具体的には、５−ＬＯのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定することで行うことができる。言い換えれば、「５−ＬＯ遺伝子」は５−ＬＯのｍＲＮＡ及びタンパク質を包含する。ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量測定は、公知の方法を用いて行うことができ、特に制限はされない。例えば、５−ＬＯ ｍＲＮＡの発現量測定は、ノザンブロッティング、リアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡチップ等の手法を用いて行うことができる。また例えば、５−ＬＯタンパク質発現量測定は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の手法を用いて行うことができる。当該手法には、例えば５−ＬＯタンパク質を認識する抗体やアプタマーを用いることができる。抗体は５−ＬＯタンパク質を特異的に認識するものが好ましい。また、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体が好ましい。好ましい抗体の一例として、Ａｎｔｉ−５ Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ 抗体（ａｂｃａｍ社）が挙げられる。なお、本発明において「抗体」は５−ＬＯタンパク質認識能を有する抗体の一部をも包含する意味で用いられる。また、アプタマーは核酸アプタマー及びペプチドアプタマーを包含する。
なお、被験物質の添加により５−ＬＯ遺伝子の発現量が減少した場合に、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として好ましく選択することができる。
５−ＬＯ遺伝子はよく研究された公知の遺伝子であり、その塩基配列及びアミノ酸配列は広く知られている。例えば、ヒトの５−ＬＯ遺伝子のｍＲＮＡ配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ １〜３）のアクセッションＮｏ．は、それぞれＮＭ＿０００６９８、ＮＭ＿００１２５６１５３、ＮＭ＿００１２５６１５４である。また例えば、マウスの５−ＬＯ遺伝子のｍＲＮＡ配列のアクセッションＮｏ．は、ＮＭ＿００９６６２である。
また、本発明は、被検物質が適用された単離脂肪細胞（脂肪前駆細胞も含む）の培養液中のロイコトリエンＢ４量を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質（ＮＡＳＨ予防及び／又は治療薬候補物質を含む）をスクリーニングする方法も包含する。これは、特に単離された脂肪細胞を培養している場合、５−ＬＯ遺伝子の発現量が増加すれば５−ＬＯにより生産されるロイコトリエンＢ４量も増加し、よって培養液中に分泌されるロイコトリエンＢ４量も増加すると考えられることから、培養液中のロイコトリエンＢ４量を測定することで、結果として５−ＬＯ遺伝子発現量を測定することができると考えられるためである。なお、当該説明からも明らかなように、被験物質の添加により培養液中のロイ
コトリエンＢ４量が減少した場合に、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として好ましく選択することができる。
コトリエンＢ４量が減少した場合に、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として好ましく選択することができる。
ロイコトリエンＢ４量の測定は、公知の方法により行うことができる。例えば、ロイコトリエンＢ４を特異的に認識する抗体を用いて、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の手法を用いて行うことができる。特に当該方法のため、例えばＬｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ Ｂ４ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を好ましく用いることができる。また、質量分析（例えばＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を行うことで、培養液に含まれるロイコトリエンＢ４量を解析することができる。
なお、用いる単離脂肪細胞については、上述の脂肪細胞についての説明のうち単離された脂肪細胞について述べた部分がそのまま当てはまる。特に、用いる単離脂肪細胞としては、初代培養細胞が好ましい。これは、初代培養細胞以外の細胞（例えば株化された脂肪細胞）を用いた場合には、５−ＬＯ遺伝子の発現量変化が検出しづらいおそれがあり、またそのために培養液中のロイコトリエンＢ４量の変化も検出しづらいおそれがあるためである。
また、本発明は、５−ＬＯ遺伝子が脂肪細胞において過剰発現した非ヒト哺乳動物及びその製造方法も包含する。当該非ヒト哺乳動物は、好ましくは５−ＬＯ遺伝子が脂肪細胞特異的に過剰発現した非ヒト哺乳動物である。当該非ヒト哺乳動物は、インスリン抵抗性（ＮＡＳＨを含む）のモデル動物として好ましく用いることができる。当該非ヒト哺乳動物は、脂肪細胞において（好ましくは脂肪細胞特異的に）５−ＬＯ遺伝子を過剰発現させる工程を含む方法により製造することができる。脂肪細胞において５−ＬＯ遺伝子を過剰発現させる手法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、脂肪細胞特異的に産生されるアディポサイトカインであるアディポネクチンのプロモーター下流に、５−ＬＯ遺伝子を接続してゲノムへ組み込むことにより、脂肪細胞において５−ＬＯ遺伝子を過剰発現する非ヒト哺乳動物を作製することができる。
なお、５−ＬＯ遺伝子が脂肪細胞において過剰発現した非ヒト哺乳動物から単離した脂肪細胞は、上記の５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する工程又はロイコトリエンＢ４量を測定する工程を含むスクリーニング方法において、単離脂肪細胞として好ましく用いることができる。
また、本発明は、哺乳動物から単離された脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、当該単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたかを判定する方法も包含する。インスリン抵抗性の対象から単離されたかを判定する対象となる単離脂肪細胞を被験単離脂肪細胞とよぶことがある。被験単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量が、正常対象から得た（単離した）単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量より高い場合に、当該被験単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたと判定することができる。
また、本発明は、抗インスリン抵抗性物質スクリーニング用のキットも包含する。当該キットは、５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する試薬を備える。このような試薬としては、例えば５−ＬＯのｍＲＮＡを増幅するプライマーセット、５−ＬＯタンパク質を認識する抗体若しくはアプタマーなどが挙げられる。プライマーセットを用いてＰＣＲにより核酸を増幅させる場合には、増幅が容易に確認できるよう、標識を用いることが好ましい。例えば、当該プライマーセットのフォワードプライマーとリバースプライマーとの、両方又は片方に、標識が付されていてもよい。また、ＰＣＲによる核酸増幅時に増幅核酸にインターカーレートする標識（例えばサイバーグリーンなど）をＰＣＲミックスに含有させておいてもよい。標識としては蛍光標識やラジオアイソトープ標識が挙げられる。当該プラ
イマーセットはリアルタイムＰＣＲ用のプライマーセットであることが好ましい。また、上記の通り、抗体は５−ＬＯタンパク質を特異的に認識するものが好ましい。また、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体が好ましい。好ましい抗体の一例として、Ａｎｔｉ−５ Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ 抗体（ａｂｃａｍ社）が挙げられる。なお、本発明において「抗体」は５−ＬＯタンパク質認識能を有する抗体の一部をも包含する意味で用いられる。また、アプタマーは核酸アプタマー及びペプチドアプタマーを包含する。
イマーセットはリアルタイムＰＣＲ用のプライマーセットであることが好ましい。また、上記の通り、抗体は５−ＬＯタンパク質を特異的に認識するものが好ましい。また、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体が好ましい。好ましい抗体の一例として、Ａｎｔｉ−５ Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ 抗体（ａｂｃａｍ社）が挙げられる。なお、本発明において「抗体」は５−ＬＯタンパク質認識能を有する抗体の一部をも包含する意味で用いられる。また、アプタマーは核酸アプタマー及びペプチドアプタマーを包含する。
また、これらの他にも、前記試薬として、例えば、ＰＣＲに用いる試薬や、ＥＬＩＳＡに用いる試薬として公知のものを備えることもできる。
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
脂肪細胞特異的ＰＤＫ１欠損マウスの解析
細胞におけるインスリンによる信号伝達カスケードとして、次のようなことが知られている。すなわち、インスリン受容体にインスリンが結合すると、内在するチロシンキナーゼが活性化され、自己リン酸化される。そのリン酸化チロシンにインスリンレセプター基質１（ＩＲＳ１）が結合し、このＩＲＳ１がリン酸化される。リン酸化されたＩＲＳ１はホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）に結合し活性化をおこす。活性化されたＰＩ３ＫはさらにプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、Ａｋｔとも呼ばれる）を細胞膜に引き寄せを活性化し、ＰＫＢはＰＤＫ１（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １）によりリン酸化され、活性型ＰＫＢとなる。この活性型ＰＫＢが種々のタンパク質をリン酸化することにより代謝調節が行われる。そこで、このカスケードを更に詳細に調べるため、ＰＤＫ１を脂肪細胞特異的に欠損したマウスを作製し解析した。
細胞におけるインスリンによる信号伝達カスケードとして、次のようなことが知られている。すなわち、インスリン受容体にインスリンが結合すると、内在するチロシンキナーゼが活性化され、自己リン酸化される。そのリン酸化チロシンにインスリンレセプター基質１（ＩＲＳ１）が結合し、このＩＲＳ１がリン酸化される。リン酸化されたＩＲＳ１はホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）に結合し活性化をおこす。活性化されたＰＩ３ＫはさらにプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、Ａｋｔとも呼ばれる）を細胞膜に引き寄せを活性化し、ＰＫＢはＰＤＫ１（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １）によりリン酸化され、活性型ＰＫＢとなる。この活性型ＰＫＢが種々のタンパク質をリン酸化することにより代謝調節が行われる。そこで、このカスケードを更に詳細に調べるため、ＰＤＫ１を脂肪細胞特異的に欠損したマウスを作製し解析した。
ＰＤＫ１−ｆｌｏｘマウス（Ｉｎｏｕｅ Ｈ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．
２００６， ３ ： ２６７−７５．）と脂肪細胞特異的ＣｒｅマウスであるＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−Ｃｒｅマウス（Ｅｇｕｃｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１１， １３ ： ２４９−５９．）を交配することにより脂肪細胞特異的ＰＤＫ１欠損マウス（Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウス）を作製した。当該マウスに通常食を摂取させ飼育した。また、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスとともに産出する同腹仔ＰＤＫ１−ｆｌｏｘマウスを、以下の検討においてコントロールマウスとして用いた。なお、前記交配においては、目的とするマウスを得るためには何回か交配する必要がある。よって、目的マウスを得る最終の交配としては、次に示す交配となる。
[PDK1flox/flox]×[PDK1flox/flox, Adiponectin-Cre]
→[PDK1flox/flox, Adiponectin-Cre]＆[PDK1flox/flox]（コントロール）
２００６， ３ ： ２６７−７５．）と脂肪細胞特異的ＣｒｅマウスであるＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−Ｃｒｅマウス（Ｅｇｕｃｈｉ Ｊ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１１， １３ ： ２４９−５９．）を交配することにより脂肪細胞特異的ＰＤＫ１欠損マウス（Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウス）を作製した。当該マウスに通常食を摂取させ飼育した。また、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスとともに産出する同腹仔ＰＤＫ１−ｆｌｏｘマウスを、以下の検討においてコントロールマウスとして用いた。なお、前記交配においては、目的とするマウスを得るためには何回か交配する必要がある。よって、目的マウスを得る最終の交配としては、次に示す交配となる。
[PDK1flox/flox]×[PDK1flox/flox, Adiponectin-Cre]
→[PDK1flox/flox, Adiponectin-Cre]＆[PDK1flox/flox]（コントロール）
正常マウス（コントロールマウス）及びＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスの血糖値、血漿インスリン濃度、血漿中性脂肪濃度及びコレステロール濃度を測定した。血糖値は血糖測定器（三和化学）により測定した。血漿インスリン濃度はインスリン測定キット（森永生科学研究所）により、血漿中性脂肪濃度及びコレステロール濃度はそれぞれトリグリセリドキット、コレステロールキット（いずれも和光純薬工業）により測定した。結果を図１に示す。また、正常マウス及びＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスを安楽死させ、肝臓を摘出し、ホルマリ
ン固定後パラフィン包埋し、切片を作製した。当該切片をＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）又はシリウスレッドにて染色した。結果を図２に示す。
ン固定後パラフィン包埋し、切片を作製した。当該切片をＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）又はシリウスレッドにて染色した。結果を図２に示す。
図１に示されるように、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスはコントロールマウスに比べ、インスリン、血糖、中性脂肪、及びコレステロールの各濃度が、いずれも有意（Ｐ＜０．０５）に高くなっていた。また、図２に示されるように、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスはコントロールマウスに比べ、肝臓が肥大していた。さらに、肝臓組織において、風船様変性や炎症性細胞浸潤が観察され（ＨＥ染色）、また、コラーゲンの増加による間質の線維化が見られた（シリウスレッド染色）。これらの症状は、全てＮＡＳＨにおいて観察されるものである。
以上のことから、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスは、通常食飼育下で自然にＮＡＳＨを発症すると考えられた。
次に、ＰＤＫ１の下流のどのような分子がインスリン抵抗性とＮＡＳＨ発症に寄与するのかを調べるため、インスリンシグナルによって活性が抑制される転写因子であるＦｏｘｏ１に着目し、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスのＦｏｘｏ１について解析した。
具体的には、コントロールマウスマウス及びＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスにインスリン又はリン酸緩衝液を腹腔内投与し１０分後に脂肪組織を摘出した。脂肪組織よりタンパク質抽出液を調製して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、Ｆｏｘｏ１リン酸化抗体およびＴｏｔａｌ Ｆｏｘｏ１抗体（いずれもＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いたウエスタンブロットを行った。結果を図３に示す。
図３に示されるように、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスではＦｏｘｏ１タンパク質のリン酸化が抑制されていた。よって、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスでは、Ｆｏｘｏ１経路が恒常的に活性化していると考えられた。
脂肪細胞特異的ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ダブル欠損マウスの解析
Ｆｏｘｏ１経路の恒常的な活性化がインスリン抵抗性やＮＡＳＨ発症に関与していないかを検討するため、脂肪細胞特異的ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ダブル欠損マウスの解析を行った。
Ｆｏｘｏ１経路の恒常的な活性化がインスリン抵抗性やＮＡＳＨ発症に関与していないかを検討するため、脂肪細胞特異的ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ダブル欠損マウスの解析を行った。
脂肪細胞特異的ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ダブル欠損マウス（Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウス）はＰＤＫ１−ｆｌｏｘマウスとＦｏｘｏ１−ｆｌｏｘマウス（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２００７， ６ ： ２０８−１６）及びＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−Ｃｒｅマウスを交配する（Ａｄｉｐｎｅｃｔｉｎ−Ｃｒｅ×ＰＤＫ１−ｆｌｏｘ×Ｆｏｘｏ１−ｆｌｏｘ）ことにより作製した。
Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウス、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウス、及びコントロールマウスの血糖値及び血漿インスリン濃度を上記と同様にして測定した。結果を図４に示す。なお、図面中でのｗ．ｏ．又はｗｏは週齢を示す。また、上記と同様にして、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウス、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウス、及びコントロールマウスの肝臓を採取し、切片を作製し、ＨＥ又はシリウスレッドにて染色した。結果を図５に示す。
図４から、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスではコントロールマウスに比べて有意に血糖値及びインスリン濃度が高くなっているところ、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスではＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスに比べて有意に血糖値及びインスリン濃度が低くなったことがわかった。また、図５から、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスでは風船様変性や炎症性細胞浸潤が観察され（ＨＥ染色）、また、コラーゲンの増加による間質の線維化が見られたことから、Ｎ
ＡＳＨを発症したと考えられた一方、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスでは正常マウスと同様の染色像が観察され、ＮＡＳＨは発症していないと考えられた。
ＡＳＨを発症したと考えられた一方、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスでは正常マウスと同様の染色像が観察され、ＮＡＳＨは発症していないと考えられた。
以上のことから、ＰＤＫ１が欠損するとインスリン抵抗性を発症するが、ＰＤＫ１が欠損していてもＦｏｘｏ１も併せて欠損している場合にはインスリン抵抗性は発症しないことが分かった。
脂肪細胞特異的ＰＤＫ１欠損マウス及び脂肪細胞特異的ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ダブル欠損マウスのオミックス解析
ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１の下流でどのような分子がインスリン抵抗性（特にＮＡＳＨ）の発症に寄与するのかを調べるため、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウス、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウス、及びコントロールマウスの間でオミックス解析を行い、振る舞いが変動する分子を探索した。
ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１の下流でどのような分子がインスリン抵抗性（特にＮＡＳＨ）の発症に寄与するのかを調べるため、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウス、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウス、及びコントロールマウスの間でオミックス解析を行い、振る舞いが変動する分子を探索した。
具体的には、各マウスの精巣周囲脂肪組織について、マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いたトランスクリプトーム解析行った。また、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた包括的脂質メディエーター解析（Ｃｏｌａｓ ＲＡ， Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｍ， ｅｔ
ａｌ， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１４， ３０７ ： Ｃ３９−５４．）により脂肪組織および血漿中脂質メディエーター濃度を測定した。濃度に変動が見られた物質の解析結果を図６に示す。なお、図６中の＊はＰ＜０．０５を示す。
ａｌ， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１４， ３０７ ： Ｃ３９−５４．）により脂肪組織および血漿中脂質メディエーター濃度を測定した。濃度に変動が見られた物質の解析結果を図６に示す。なお、図６中の＊はＰ＜０．０５を示す。
図６に示されるように、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスではコントロールマウスに比べて有意に脂肪組織における５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ（５−ＬＯ）ｍＲＮＡ発現量が多くなっているところ、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスではＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスに比べて有意に脂肪組織における５−ＬＯ ｍＲＮＡ発現量が少なくなった。また、Ａ−Ｐ
ＤＫ１ＫＯマウスではコントロールマウスに比べて有意に脂肪組織中のロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の濃度が高くなっているところ、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスではＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスに比べて有意に脂肪組織中のＬＴＢ４濃度が低くなった。また、同様に、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスではコントロールマウスに比べて有意に血漿中のＬＴＢ４濃度が高くなっているところ、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスではＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスに比べて有意に血漿中のＬＴＢ４濃度が低くなった。
ＤＫ１ＫＯマウスではコントロールマウスに比べて有意に脂肪組織中のロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）の濃度が高くなっているところ、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスではＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスに比べて有意に脂肪組織中のＬＴＢ４濃度が低くなった。また、同様に、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスではコントロールマウスに比べて有意に血漿中のＬＴＢ４濃度が高くなっているところ、Ａ−ＰＤＫ１／Ｆｏｘｏ１ＤＫＯマウスではＡ−ＰＤＫ１ＫＯマウスに比べて有意に血漿中のＬＴＢ４濃度が低くなった。
これらの結果から、Ａ−ＰＤＫ１ＫＯマウスでは、インスリンシグナルが脂肪細胞内カスケードを伝わっていく途中で、ＰＤＫ１が欠損しているためにＰＫＢ（Ａｋｔ）をリン酸化して活性化することができず、このためにＦｏｘｏ１の活性を抑制することができず、Ｆｏｘｏ１が恒常的に５−ＬＯを発現させることとなり、従って５−ＬＯが過剰発現し、そのためＬＴＢ４が過剰産出され、このＬＴＢ４が肝臓に存在するＬＴＢ４受容体（ＢＬＴ１）にリガンドとして結合することによって、ＮＡＳＨが発症するのではないかと考えられた。当該機構の模式図を図７に示す。
５−ＬＯ遺伝子発現抑制を指標とした抗インスリン抵抗性物質スクリーニングの可能性の検討
以上の結果から、５−ＬＯ遺伝子の発現抑制を指標として、抗インスリン抵抗性物質（インスリン抵抗性治療薬候補物質）をスクリーニングすることができると考えられた。そこで、（ｉ）インスリン処理した脂肪細胞、（ｉｉ）活性型Ａｋｔを強制発現させた脂肪細胞、及び（ｉｉｉ）Ｆｏｘｏ１阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＡＳ１８４２８５６）で処理した脂肪細胞、のそれぞれについて、５−ＬＯのｍＲＮＡ発現量を測定した。なお、ＡＳ１８４２８５６の化学構造式は次のとおりである。
以上の結果から、５−ＬＯ遺伝子の発現抑制を指標として、抗インスリン抵抗性物質（インスリン抵抗性治療薬候補物質）をスクリーニングすることができると考えられた。そこで、（ｉ）インスリン処理した脂肪細胞、（ｉｉ）活性型Ａｋｔを強制発現させた脂肪細胞、及び（ｉｉｉ）Ｆｏｘｏ１阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＡＳ１８４２８５６）で処理した脂肪細胞、のそれぞれについて、５−ＬＯのｍＲＮＡ発現量を測定した。なお、ＡＳ１８４２８５６の化学構造式は次のとおりである。
当該検討には、脂肪組織間質血管分画（ｓｔｒｏｍａｌ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）から前駆脂肪細胞を含む線維芽細胞を調製して用いた。具体的には、次のようにして調製した。Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄、１０〜２０週齢）をイソフルレン麻酔下に頸椎脱臼にて安楽死させた後、精巣周囲脂肪組織を摘出した。１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含むＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ中で１０分間ミンス（解剖用ハサミで切断）して直径約１ｍｍ程度の大きさに細断した。１００ｒｐｍ×５０分間（３７℃）振盪した後、２５０μｍのナイロンメッシュに通し、メッシュを通過した組織を含む溶液を回収した。１５００ｒｐｍ×５分間（室温）遠心し、間質血管分画（ｓｔｒｏｍａｌ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を残し、脂肪細胞分画（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と培地を除去した。１０％胎児血清、２００μＭアスコルビン酸、ペニシリン・ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（以下ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地）１０ｍｌで間質血管分画を懸濁して洗浄した後、１５００ｒｐｍ×５分間（室温）遠心する。間質血管分画を残して培地を除去する。さらに２回（合計３回）、間質血管分画をＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地１０ｍｌで懸濁して洗浄した後、１５００ｒｐｍ×５分間（室温）で遠心した。ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地１０ｍｌで間質血管分画を懸濁し、１０ｃｍディッシュに撒き、３時間後に培地交換を行い、血球成分を除いた。約１２時間後、ディッシュをたたいて血球成分をはがしながら培地交換を２回行った。約２４時間培養した後、リン酸緩衝液で洗浄後、トリプシン・ＥＤＴＡで細胞をはがし、ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地１０ｍｌを添加して１０００ｒｐｍ×５分間（室温）で遠心し細胞を回収した。ＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で細胞を懸濁してディッシュに撒き２４時間以上培養し、当該細胞を検討に用いた。当該細胞は、初代培養前駆脂肪細胞を含む線維芽細胞である。
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の細胞の各処理は、具体的には次のようにして行った。
（ｉ）インスリン処理：上記で調整した細胞を、１６時間血清を含まないＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養後、１０−７Ｍのインスリンで２４時間処理した。
（ｉｉ）アデノウイルスを用いた活性型Ａｋｔの導入：活性型Ａｋｔを発現するアデノウイルス（Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９９ ： ６２８６−９６．）又はＬａｃＺを発現するアデノウイルスを上記細胞に５．５ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の量で感染させ、４８時間後に細胞を回収した。
（ｉｉｉ）Ｆｏｘｏ１阻害剤処理：１０μＭのＦｏｘｏ１阻害剤（ＡＳ１８４２８５６）で２４時間処理した後、細胞を回収した。
（ｉ）インスリン処理：上記で調整した細胞を、１６時間血清を含まないＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地で培養後、１０−７Ｍのインスリンで２４時間処理した。
（ｉｉ）アデノウイルスを用いた活性型Ａｋｔの導入：活性型Ａｋｔを発現するアデノウイルス（Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９９ ： ６２８６−９６．）又はＬａｃＺを発現するアデノウイルスを上記細胞に５．５ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の量で感染させ、４８時間後に細胞を回収した。
（ｉｉｉ）Ｆｏｘｏ１阻害剤処理：１０μＭのＦｏｘｏ１阻害剤（ＡＳ１８４２８５６）で２４時間処理した後、細胞を回収した。
なお、５−ＬＯのｍＲＮＡ発現量の測定は、次のようにして行った。すなわち、上記処理を施した間質血管分画由来線維芽細胞よりＲＮＡを抽出し、５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅのｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲで検出し、ハウスキーピング遺伝子である３６Ｂ４のｍＲＮＡ量をコントロールとした相対量として評価した。結果を図８に示す。図８中の＊はＰ＜０．０５を示す。当該測定において、ＲＮＡ抽出はＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。また、リアルタイムＰＣＲには以下の塩基配列のプライマーセット、及び蛍光色素としてＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅ
ｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
フォワードプライマー：ＧＧＧＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＴＣ
リバースプライマー：ＣＡＣＧＧＴＧＡＣＡＴＣＧＴＡＧＧＡＧＴ
ｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
フォワードプライマー：ＧＧＧＣＴＧＴＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＴＣ
リバースプライマー：ＣＡＣＧＧＴＧＡＣＡＴＣＧＴＡＧＧＡＧＴ
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の処理がなされた細胞は、いずれも５−ＬＯ遺伝子の発現量が低下すると予想される（今回の検討で得られた知見も盛り込んだ、インスリンシグナルの伝達順の概要を図９に示す。）。
実際、図８から分かるように、（ｉ）インスリン処理、（ｉｉ）活性型Ａｋｔの強制発現、（ｉｉｉ）Ｆｏｘｏ１阻害、のいずれの処理がなされた場合であっても、５−ＬＯのｍＲＮＡ発現量は有意に低下した。このことから、５−ＬＯの発現抑制を指標として、抗インスリン抵抗性物質（インスリン抵抗性治療薬候補物質）をスクリーニングすることができるといえる。つまり、被験物質を適用した脂肪細胞の５−ＬＯ遺伝子の発現量が低下した場合、その被験物質を抗インスリン抵抗性物質として選抜することができる。
Claims (10)
- 被検物質が適用された脂肪細胞における５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）遺伝子の発現量を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質をスクリーニングする方法。
- 脂肪細胞が、単離された脂肪細胞である、請求項１に記載の方法。
- 被検物質が適用された単離脂肪細胞の培養液中のロイコトリエンＢ４量を測定する工程を含む、抗インスリン抵抗性物質をスクリーニングする方法。
- 脂肪細胞が、初代培養細胞である、請求項２又は３に記載の方法。
- 脂肪細胞が、５−ＬＯ遺伝子が過剰発現した脂肪細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- ５−ＬＯ遺伝子が脂肪細胞において過剰発現した非ヒト哺乳動物。
- 非ヒト哺乳動物の脂肪細胞において５−ＬＯ遺伝子を過剰発現させる工程を含む、インスリン抵抗性非ヒト哺乳動物を製造する方法。
- 被験単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、当該被験単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたかを判定する方法。
- 被験単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量が、正常対象から得た単離脂肪細胞における５−ＬＯ遺伝子の発現量より高い場合に、当該被験単離脂肪細胞がインスリン抵抗性の対象から単離されたと判定する、請求項８に記載の方法。
- ５−ＬＯのｍＲＮＡを増幅するプライマーセット、及び／又は、５−ＬＯタンパク質を認識する抗体若しくはアプタマー、を備える、
抗インスリン抵抗性物質スクリーニング用キット。
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|---|---|---|---|---|
| JP2008506949A (ja) * | 2004-07-13 | 2008-03-06 | メタボレックス インコーポレーティッド | 肥満、糖尿病およびインスリン抵抗性の診断および治療の方法 |
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2021
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Patent Citations (1)
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| 細岡 哲也、小川 渉, 糖尿病, vol. 59, JPN6022028336, 17 May 2016 (2016-05-17), pages 76, ISSN: 0005006863 * |
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