JP2021136934A - Method for collecting data for predicting administration effectiveness of immune checkpoint inhibitor to cancer patient - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのデータを収集する方法に関する。より詳細には、本発明は、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのデータを収集する方法、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのキット、抗癌剤のスクリーニング方法及び抗癌剤に関する。 The present invention relates to a method of collecting data for predicting the efficacy of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient. More specifically, the present invention predicts the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient, a method of collecting data for predicting the efficacy of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient. Kits, anti-cancer drug screening methods and anti-cancer drugs.
近年、ニボルマブ（抗ＰＤ−１抗体）に代表される免疫チェックポイント阻害薬を用いた治療法により、進行期の固形癌でも治癒が可能であることが示されている。しかしながら、免疫チェックポイント阻害薬を用いた治療の奏効率は約５〜３０％にとどまっている。このため、免疫チェックポイント阻害薬の投与前にその有効性を正確に予測する技術が求められている。 In recent years, it has been shown that even advanced stage solid cancer can be cured by a treatment method using an immune checkpoint inhibitor typified by nivolumab (anti-PD-1 antibody). However, the response rate of treatment with immune checkpoint inhibitors remains at about 5-30%. Therefore, there is a need for a technique for accurately predicting the efficacy of an immune checkpoint inhibitor before administration.
例えば特許文献１には、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１経路を標的とする治療剤の有効性を予測するために使用することが記載されている。 For example, Patent Document 1 describes that an anti-PD-L1 antibody is used to predict the efficacy of a therapeutic agent that targets the PD-L1: PD-1 pathway.
本発明は、免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測する新たな技術を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a new technique for predicting the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor.
本発明は以下の態様を含む。
［１］癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのデータを収集する方法であって、前記癌患者由来の生体試料における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定する工程を含み、前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはタンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはタンパク質を含み、前記発現量が前記有効性を予測するためのデータであり、前記発現量が基準値よりも高いことが、前記癌患者への前記免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効であることを示す、方法。
［２］前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、（ｉ）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＬＡＭＦ６遺伝子若しくはタンパク質、ＣＤ４４遺伝子若しくはタンパク質又はＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせ、又は、（ｉｉ）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＥＬＬ遺伝子若しくはタンパク質、ＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質又はＣＣＲ７遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせ、を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記生体試料が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、癌組織切片、血漿又は血清である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記免疫チェックポイント阻害薬が、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ＮＥＬＬ２タンパク質、ＡＭＩＣＡ１タンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質、ＣＬＥＣＬ１タンパク質若しくはＣＭＴＭ７タンパク質に対する特異的結合物質、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＭＴＭ７遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマー、又は、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＭＴＭ７遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを含む、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのキット。
［６］ＣＤ８タンパク質に対する特的結合物質、ＣＤ８遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマー、又は、ＣＤ８遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを更に含む、［５］に記載のキット。
［７］抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＣＤ８陽性Ｔ細胞をインキュベートする工程と、前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはタンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはタンパク質を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇したことが、前記被験物質が抗癌剤であることを示す、方法。
［８］ＮＥＬＬ２タンパク質若しくはその発現ベクター、ＡＭＩＣＡ１タンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣＬ１タンパク質若しくはその発現ベクター又はＣＭＴＭ７タンパク質若しくはその発現ベクターを有効成分として含有する、抗癌剤。
The present invention includes the following aspects.
[1] A method for collecting data for predicting the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient, and measuring the expression level of a marker gene or a marker protein in a biological sample derived from the cancer patient. The marker gene or protein comprises NELL2 gene or protein, AMICA1 gene or protein, CLEC11A gene or protein, CLECL1 gene or protein or CMTM7 gene or protein, and the expression level predicts the efficacy. A method for indicating that administration of the immune checkpoint inhibitor to the cancer patient is effective when the expression level is higher than the reference value.
[2] The marker gene or marker protein is (i) a combination of NELL2 gene or protein and SLAMF6 gene or protein, CD44 gene or protein or IL7R gene or protein, or (ii) AMICA1 gene or protein and SELL. The method according to [1], which comprises a gene or protein, an IL7R gene or protein, or a combination with a CCR7 gene or protein.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the biological sample is a CD8-positive T cell, a cancer tissue section, plasma or serum.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
[5] A primer that amplifies the cDNA of NELL2 protein, AMICA1 protein, CLEC11A protein, CLECL1 protein or CMTM7 protein, NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene, or NELL2 gene, AMICA1 A kit for predicting the efficacy of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient, which comprises a probe that hybridizes to the mRNA of the gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene.
[6] The kit according to [5], further comprising a specific binding agent for a CD8 protein, a primer that amplifies the cDNA of the CD8 gene, or a probe that hybridizes to the mRNA of the CD8 gene.
[7] A method for screening an anticancer agent, which comprises a step of incubating CD8-positive T cells in the presence of a test substance and a step of measuring the expression level of a marker gene or a marker protein in the CD8-positive T cells. The marker gene or marker protein contains NELL2 gene or protein, AMICA1 gene or protein, CLEC11A gene or protein, CLECL1 gene or protein or CMTM7 gene or protein, and the expression level is the expression level in the absence of the test substance. A method in which the elevation compared to the above indicates that the test substance is an anticancer agent.
[8] An anticancer agent containing NELL2 protein or its expression vector, AMICA1 protein or its expression vector, CLEC11A protein or its expression vector, CLECL1 protein or its expression vector or CMTM7 protein or its expression vector as an active ingredient.
本発明によれば、免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測する新たな技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a new technique for predicting the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor.
［データを収集する方法］
１実施形態において、本発明は、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのデータを収集する方法であって、前記癌患者由来の生体試料における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定する工程を含み、前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはタンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはタンパク質を含み、前記発現量が前記有効性を予測するためのデータであり、前記発現量が基準値よりも高いことが、前記癌患者への前記免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効であることを示す、方法を提供する。
[How to collect data]
In one embodiment, the invention is a method of collecting data for predicting the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient, the marker gene or marker in a biological sample derived from the cancer patient. The marker gene or the marker protein comprises a step of measuring the expression level of a protein, and the marker gene or the marker protein contains a NELL2 gene or protein, an AMICA1 gene or protein, a CLEC11A gene or protein, a CLECL1 gene or protein or a CMTM7 gene or protein, and the expression level is It is data for predicting the efficacy, and provides a method showing that administration of the immune checkpoint inhibitor to the cancer patient is effective when the expression level is higher than the reference value.
実施例において後述するように、発明者らは、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはＮＥＬＬ２タンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはＡＭＩＣＡ１タンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはＣＬＥＣ１１Ａタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＬＥＣＬ１タンパク質、又は、ＣＭＴＭ７遺伝子若しくはＣＭＴＭ７タンパク質を、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのマーカー遺伝子又はマーカータンパク質として利用することができることを明らかにした。 As will be described later in the examples, the inventors have applied the NELL2 gene or NELL2 protein, the AMICA1 gene or the AMICA1 protein, the CLEC11A gene or the CLEC11A protein, the CLECL1 gene or the CLECL1 protein, or the CMTM7 gene or the CMTM7 protein to cancer patients. It was clarified that it can be used as a marker gene or a marker protein for predicting the efficacy of administration of an immune checkpoint inhibitor.
癌患者由来の生体試料におけるこれらの遺伝子又はタンパク質の発現量が、基準値よりも高い場合、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効であると判断することができる。 When the expression level of these genes or proteins in a biological sample derived from a cancer patient is higher than the reference value, it can be judged that administration of an immune checkpoint inhibitor to the cancer patient is effective.
したがって、本実施形態の方法は、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測する方法であるということができる。あるいは、本実施形態の方法は、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効か否かを診断する方法であるということもできる。 Therefore, it can be said that the method of the present embodiment is a method of predicting the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient. Alternatively, the method of the present embodiment can be said to be a method of diagnosing whether or not administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient is effective.
ここで、基準値は、例えば、免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効でないことがすでに明らかとなっている癌患者由来の生体試料における、上記の遺伝子又はタンパク質の発現量であってよい。また、基準値は予め設定された値であってもよい。 Here, the reference value may be, for example, the expression level of the above gene or protein in a biological sample derived from a cancer patient for which administration of an immune checkpoint inhibitor has already been found to be ineffective. Further, the reference value may be a preset value.
生体試料としては、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、癌組織切片、血漿、血清等が挙げられる。中でも、生体試料はＣＤ８陽性Ｔ細胞であることが好ましい。 Examples of biological samples include CD8-positive T cells, cancer tissue sections, plasma, serum and the like. Above all, the biological sample is preferably CD8-positive T cells.
マーカー遺伝子の発現量の測定方法は特に限定されず、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ法等が挙げられる。また、マーカータンパク質の発現量の測定方法は特に限定されず、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、プロテインアレイ法等が挙げられる。 The method for measuring the expression level of the marker gene is not particularly limited, and examples thereof include RNA-Seq, quantitative RT-PCR, and DNA microarray method. The method for measuring the expression level of the marker protein is not particularly limited, and examples thereof include flow cytometry, ELISA method, and protein array method.
本実施形態の方法において、免疫チェックポイント阻害薬としては、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体等が挙げられる。より具体的な抗ＰＤ−１抗体としては、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等が挙げられる。より具体的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ等が挙げられる。 In the method of the present embodiment, examples of the immune checkpoint inhibitor include anti-PD-1 antibody and anti-PD-L1 antibody. More specific anti-PD-1 antibodies include, for example, nivolumab, pembrolizumab and the like. More specific anti-PD-L1 antibodies include, for example, avelumab, atezolizumab and the like.
ヒトＮＥＬＬ２遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１４５１０７．１、ＮＭ＿００１１４５１０８．１、ＮＭ＿００１１４５１０９．１等である。また、ヒトＮＥＬＬ２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１１３８５８０．１、ＮＰ＿００１１３８５７９．１、ＮＰ＿００６１５０．１等である。 The NCBI accession numbers of the human NELL2 gene mRNA are NM_001145107.1, NM_001145108.1, NM_001145109.1 and the like. The NCBI accession numbers of the human NELL2 protein are NP_0011385800.1, NP_0011385791, NP_0061500.1 and the like.
ヒトＡＭＩＣＡ１遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１０９８５２６．１、ＮＭ＿００１２８６５７０．１、ＮＭ＿００１２８６５７１．１、ＮＭ＿１５３２０６．２等である。また、ヒトＡＭＩＣＡ１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１２７３５００．１、ＮＰ＿００１２７３４９９．１、ＮＰ＿００１０９１９９６．１、ＮＰ＿６９４９３８．２等である。 The NCBI accession numbers of the human AMICA1 gene mRNA are NM_001098526.1, NM_001286570.1., NM_001286571.1, NM_153206.2 and the like. The NCBI accession numbers of the human AMICA1 protein are NP_00127350.1, NP_0012737991, NP_0010991996.1, NP_6949383, and the like.
ヒトＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００２９７５．３等である。また、ヒトＣＬＥＣ１１Ａタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００２９６６．１等である。 The NCBI accession number of the human CLEC11A gene mRNA is NM_002975.3. The NCBI accession number of the human CLEC11A protein is NP_002966.1 or the like.
ヒトＣＬＥＣＬ１遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２５３７５０．１、ＮＭ＿００１２６７７０１．１、ＮＭ＿１７２００４．３等である。また、ヒトＣＬＥＣ１１Ａタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１２４０６７９．１、ＮＰ＿７４２００１．１、ＮＰ＿００１２５４６３０．１等である。 The NCBI accession numbers of the mRNA of the human CLECL1 gene are NM_0012537750.1, NM_001267701.1, NM_172004.3. The NCBI accession numbers of the human CLEC11A protein are NP_001240679.1, NP_742001.1, NP_0012546301 and the like.
ヒトＣＭＴＭ７遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿１３８４１０．４、ＮＭ＿１８１４７２．３等である。また、ヒトＣＭＴＭ７タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿８５２１３７．１、ＮＰ＿６１２４１９．１等である。 The NCBI accession numbers of the mRNA of the human CMTM7 gene are NM_1384100.4, NM_181472.3 and the like. The NCBI accession numbers of the human CMTM7 protein are NP_852137.1, NP_612419.1 and the like.
上記のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質は、（ｉ−１）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＬＡＭＦ６遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉ−２）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＣＤ４４遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉ−３）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよい。 The above marker gene or marker protein may be a combination of (i-1) NELL2 gene or protein and SLAMF6 gene or protein, and (i-2) NELL2 gene or protein and CD44 gene or protein. It may be a combination, or may be a combination of (i-3) NELL2 gene or protein and IL7R gene or protein.
実施例において後述するように、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質単独の発現量を測定する場合と比較して、これらの組み合わせを測定することにより、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効か否かをより正確に予測することができる。 As will be described later in Examples, whether or not administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient is effective by measuring a combination of these as compared with the case of measuring the expression level of the NELL2 gene or protein alone. Can be predicted more accurately.
ヒトＳＬＡＭＦ６遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１１８４７１４．１、ＮＭ＿００１１８４７１５．１、ＮＭ＿００１１８４７１６．１、ＮＭ＿０５２９３１．４等である。また、ヒトＳＬＡＭＦ６タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１１７１６４４．１、ＮＰ＿４４３１６３．１、ＮＰ＿００１１７１６４５．１等である。 The NCBI accession numbers of the mRNA of the human SLAMF6 gene are NM_00118844.1.1, NM_001184715.1, NM_001184716.1, NM_052931.4 and the like. The NCBI accession numbers of the human SLAMF6 protein are NP_001171644.1, NP_443163.1, NP_001171645.1, and the like.
ヒトＣＤ４４遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿０００６１０．４、ＮＭ＿００１００１３８９．２、ＮＭ＿００１００１３９０．２等である。また、ヒトＣＤ４４タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１００１３９１．１、ＮＰ＿００１００１３９０．１、ＮＰ＿００１１８９４８５．１等である。 The NCBI accession numbers of the mRNA of the human CD44 gene are NM_000610.4, NM_001001389.2, NM_001001390.2 and the like. The NCBI accession numbers of the human CD44 protein are NP_001001391.1, NP_001001390.1, NP_001189485.1, and the like.
ヒトＩＬ７Ｒ遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００２１８５．３等である。また、ヒトＩＬ７Ｒタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００２１７６．２等である。 The NCBI accession number of the human IL7R gene mRNA is NM_002185.3. The NCBI accession number of the human IL7R protein is NP_002176.2 or the like.
あるいは、上記のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質は、（ｉｉ−１）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＥＬＬ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉｉ−２）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉｉ−３）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＣＣＲ７遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよい。 Alternatively, the above marker gene or marker protein may be a combination of (ii-1) AMICA1 gene or protein and SELL gene or protein, and (ii-2) AMICA1 gene or protein and IL7R gene or protein. It may be a combination of (ii-3) AMICA1 gene or protein and CCR7 gene or protein.
実施例において後述するように、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質単独の発現量を測定する場合と比較して、これらの組み合わせを測定することにより、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効か否かをより正確に予測することができる。 As will be described later in Examples, whether or not administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient is effective by measuring a combination of these as compared with the case of measuring the expression level of the AMICA1 gene or protein alone. Can be predicted more accurately.
ヒトＳＥＬＬ遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿０００６５５．４等である。また、ヒトＳＥＬＬタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿０００６４６．２等である。 The NCBI accession number of the human SELL gene mRNA is NM_000655.4 or the like. The NCBI accession number of the human SELL protein is NP_000646.2 or the like.
ヒトＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は上述した通りである。 The NCBI accession numbers for the human IL7R gene or protein are as described above.
ヒトＣＣＲ７遺伝子のｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＭ＿００１３０１７１４．１、ＮＭ＿００１３０１７１６．１、ＮＭ＿００１３０１７１７．１、ＮＭ＿００１３０１７１８．１、ＮＭ＿００１８３８．３等である。また、ヒトＣＣＲ７タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１２８８６４５．１、ＮＰ＿００１２８８６４７．１、ＮＰ＿００１２８８６４６．１、ＮＰ＿００１２８８６４３．１、ＮＰ＿００１８２９．１等である。 The NCBI accession numbers of the mRNA of the human CCR7 gene are NM_001301714.1, NM_001301716.1, NM_001301717.1, NM_001301718.1, NM_0018383.3. The NCBI accession numbers of the human CCR7 protein are NP_001288645.1, NP_001288647.1, NP_001288646.1, NP_0012886643.1, NP_001829.1 and the like.
［キット］
１実施形態において、本発明は、ＮＥＬＬ２タンパク質、ＡＭＩＣＡ１タンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質、ＣＬＥＣＬ１タンパク質若しくはＣＭＴＭ７タンパク質に対する特異的結合物質、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＭＴＭ７遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマー、又は、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＭＴＭ７遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを含む、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのキットを提供する。
[kit]
In one embodiment, the invention comprises a primer that amplifies the cDNA of a NELL2 protein, AMICA1 protein, CLEC11A protein, CLECL1 protein or CMTM7 protein specific binding agent, NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene. Alternatively, a kit is provided for predicting the efficacy of administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient, which comprises a probe that hybridizes to the mRNA of the NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene.
本実施形態のキットは、ＮＥＬＬ２タンパク質、ＡＭＩＣＡ１タンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質、ＣＬＥＣＬ１タンパク質又はＣＭＴＭ７タンパク質に対する特異的結合物質を含んでいてもよい。特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。特異的結合物質は、ＮＥＬＬ２タンパク質、ＡＭＩＣＡ１タンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質、ＣＬＥＣＬ１タンパク質又はＣＭＴＭ７タンパク質を検出することができれば特に限定されない。特異的結合物質は、固相に結合されて、例えば、プロテインアレイ等を構成していてもよい。 The kit of this embodiment may contain a specific binding agent to NELL2 protein, AMICA1 protein, CLEC11A protein, CLECL1 protein or CMTM7 protein. Specific binding substances include antibodies, antibody fragments, aptamers and the like. Examples of the antibody fragment include F (ab') 2 , Fab', Fab, Fv, scFv and the like. The specific binding substance is not particularly limited as long as it can detect NELL2 protein, AMICA1 protein, CLEC11A protein, CLECL1 protein or CMTM7 protein. The specific binding substance may be bound to the solid phase to form, for example, a protein array or the like.
本実施形態のキットは、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子又はＣＭＴＭ７遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマーを含んでいてもよい。通常、プライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーのセットである。プライマーは、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子又はＣＭＴＭ７遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができれば、その塩基配列や長さは特に限定されない。 The kit of this embodiment may include a primer that amplifies the cDNA of the NELL2 gene, the AMICA1 gene, the CLEC11A gene, the CLECL1 gene or the CMTM7 gene. Usually, the primer is a set of sense primer and antisense primer. The base sequence and length of the primer are not particularly limited as long as it can amplify the cDNA of the NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene.
本実施形態のキットは、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子又はＣＭＴＭ７遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを含んでいてもよい。通常、プローブは、核酸断片である。プローブの塩基配列は、ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子又はＣＭＴＭ７遺伝子のｍＲＮＡを検出することができれば特に限定されない。プローブは核酸アレイを構成していてもよい。 The kit of this embodiment may include a probe that hybridizes to the mRNA of the NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene. Usually, the probe is a nucleic acid fragment. The base sequence of the probe is not particularly limited as long as it can detect the mRNA of NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene. The probe may constitute a nucleic acid array.
本実施形態のキットは、ＣＤ８タンパク質に対する特的結合物質、ＣＤ８遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマー、又は、ＣＤ８遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを更に含んでいてもよい。これにより、癌患者由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞における上記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定することができる。 The kit of this embodiment may further include a specific binding agent for the CD8 protein, a primer that amplifies the cDNA of the CD8 gene, or a probe that hybridizes to the mRNA of the CD8 gene. This makes it possible to measure the expression level of the marker gene or marker protein in CD8-positive T cells derived from cancer patients.
本実施形態のキットは、ＳＬＡＭＦ６タンパク質、ＣＤ４４タンパク質、ＩＬ７Ｒタンパク質、ＳＥＬＬタンパク質若しくはＣＣＲ７タンパク質に対する特異的結合物質、ＳＬＡＭＦ６遺伝子、ＣＤ４４遺伝子、ＩＬ７Ｒ遺伝子、ＳＥＬＬ遺伝子若しくはＣＣＲ７遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマー、又は、ＳＬＡＭＦ６遺伝子、ＣＤ４４遺伝子、ＩＬ７Ｒ遺伝子、ＳＥＬＬ遺伝子若しくはＣＣＲ７遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを更に含んでいてもよい。 The kit of this embodiment is a primer that amplifies the cDNA of SLAMF6 protein, CD44 protein, IL7R protein, SELL protein or CCR7 protein, SLAMF6 gene, CD44 gene, IL7R gene, SELL gene or CCR7 gene, or It may further include a probe that hybridizes to the mRNA of the SLAMF6 gene, CD44 gene, IL7R gene, SELL gene or CCR7 gene.
上述したように、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質の発現量と、ＳＬＡＭＦ６遺伝子若しくはタンパク質、ＣＤ４４遺伝子若しくはタンパク質又はＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質の発現量を組み合わせて測定することにより、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効か否かをより正確に予測することができる。また、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質の発現量と、ＳＥＬＬ遺伝子若しくはタンパク質、ＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質又はＣＣＲ７遺伝子若しくはタンパク質の発現量を組み合わせて測定することにより、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効か否かをより正確に予測することができる。 As described above, administration of an immune checkpoint inhibitor to a cancer patient by measuring the expression level of the NELL2 gene or protein in combination with the expression level of the SLAMF6 gene or protein, CD44 gene or protein or IL7R gene or protein. Can be more accurately predicted whether or not is valid. Also, is it effective to administer an immune checkpoint inhibitor to cancer patients by measuring the expression level of the AMICA1 gene or protein in combination with the expression level of the SELL gene or protein, IL7R gene or protein, or CCR7 gene or protein? Whether or not it can be predicted more accurately.
［抗癌剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、抗癌剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でＣＤ８陽性Ｔ細胞をインキュベートする工程と、前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはタンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはタンパク質を含み、前記発現量が、前記被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇したことが、前記被験物質が抗癌剤であることを示す、方法を提供する。
[Anti-cancer drug screening method]
In one embodiment, the present invention is a method for screening an anticancer agent, in which a step of incubating a CD8-positive T cell in the presence of a test substance and an expression level of a marker gene or a marker protein in the CD8-positive T cell are measured. The marker gene or marker protein comprises NELL2 gene or protein, AMICA1 gene or protein, CLEC11A gene or protein, CLECL1 gene or protein or CMTM7 gene or protein, and the expression level of the test substance is the same as that of the test substance. An increase relative to the expression level in the absence provides a method indicating that the test substance is an anticancer agent.
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、特に限定されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ等を用いることができる。また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、健常人由来の細胞であってもよいし、癌患者由来の細胞であってもよいし、株化された細胞であってもよい。 In the screening method of the present embodiment, the test substance is not particularly limited, and for example, a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, or the like can be used. Further, the CD8-positive T cell may be a cell derived from a healthy person, a cell derived from a cancer patient, or a cell that has been established.
本実施形態のスクリーニング方法において、マーカー遺伝子の発現量の測定方法は上述したものと同様であり、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ法等が挙げられる。また、マーカータンパク質の発現量の測定方法についても上述したものと同様であり、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、プロテインアレイ法等が挙げられる。 In the screening method of the present embodiment, the method for measuring the expression level of the marker gene is the same as that described above, and examples thereof include RNA-Seq, quantitative RT-PCR, and DNA microarray method. Further, the method for measuring the expression level of the marker protein is the same as that described above, and examples thereof include flow cytometry, ELISA method, and protein array method.
ＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはＮＥＬＬ２タンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはＡＭＩＣＡ１タンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはＣＬＥＣ１１Ａタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＬＥＣＬ１タンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはＣＭＴＭ７タンパク質の発現量を上昇させる被験物質は、従来の免疫チェックポイント阻害薬の代わりに使用することができる抗癌剤であるということができる。あるいは、このような被験物質は、癌患者への従来の免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を向上させる薬物であるということもできる。 Test substances that increase the expression level of NELL2 gene or NELL2 protein, AMICA1 gene or AMICA1 protein, CLEC11A gene or CLEC11A protein, CLECL1 gene or CLECL1 protein or CMTM7 gene or CMTM7 protein in CD8-positive T cells are conventional immune checkpoints. It can be said that it is an anticancer agent that can be used in place of an inhibitor. Alternatively, such test substances can be said to be drugs that improve the effectiveness of administration of conventional immune checkpoint inhibitors to cancer patients.
本実施形態のスクリーニング方法において、上記のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質は、（ｉ−１）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＬＡＭＦ６遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉ−２）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＣＤ４４遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉ−３）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよい。 In the screening method of the present embodiment, the above-mentioned marker gene or marker protein may be a combination of (i-1) NELL2 gene or protein and SLAMF6 gene or protein, and (i-2) NELL2 gene or protein. And the CD44 gene or protein, or (i-3) a combination of the NELL2 gene or protein and the IL7R gene or protein.
ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質単独の発現量を測定する場合と比較して、これらの組み合わせを測定することにより、被験物質の抗癌作用をより正確に予測することができる。 By measuring the combination of these, as compared with the case of measuring the expression level of the NELL2 gene or the protein alone, the anticancer effect of the test substance can be predicted more accurately.
あるいは、上記のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質は、（ｉｉ−１）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＥＬＬ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉｉ−２）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよく、（ｉｉ−３）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＣＣＲ７遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせであってもよい。 Alternatively, the above marker gene or marker protein may be a combination of (ii-1) AMICA1 gene or protein and SELL gene or protein, and (ii-2) AMICA1 gene or protein and IL7R gene or protein. It may be a combination of (ii-3) AMICA1 gene or protein and CCR7 gene or protein.
ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質単独の発現量を測定する場合と比較して、これらの組み合わせを測定することにより、被験物質の抗癌作用をより正確に予測することができる。 By measuring the combination of these, as compared with the case of measuring the expression level of the AMICA1 gene or the protein alone, the anticancer effect of the test substance can be predicted more accurately.
［抗癌剤］
１実施形態において、本発明は、ＮＥＬＬ２タンパク質若しくはその発現ベクター、ＡＭＩＣＡ１タンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣＬ１タンパク質若しくはその発現ベクター又はＣＭＴＭ７タンパク質若しくはその発現ベクターを有効成分として含有する、抗癌剤を提供する。ＡＭＩＣＡ１タンパク質は、可溶化されていることが好ましく、例えば、抗体定常領域との融合タンパク質の形態（ＡＭＩＣＡ１−Ｆｃ）であってもよいし、ＡＭＩＣＡ１タンパク質の一部（例えば、細胞外ドメイン等）であってもよい。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を利用することができる。本実施形態の抗癌剤は、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞製剤、ＴＣＲ−Ｔ細胞製剤、腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）療法等と組み合わせて用いることができる。
[Anti-cancer drug]
In one embodiment, the present invention comprises, as an active ingredient, NELL2 protein or an expression vector thereof, AMICA1 protein or an expression vector thereof, CLEC11A protein or an expression vector thereof, CLECL1 protein or an expression vector thereof, or CMTM7 protein or an expression vector thereof. Provide anti-cancer agents. The AMICA1 protein is preferably solubilized and may be in the form of a fusion protein with an antibody constant region (AMICA1-Fc) or in part of the AMICA1 protein (eg, extracellular domain). There may be. As the expression vector, a plasmid vector, an adenovirus vector, a retrovirus vector and the like can be used. The anticancer agent of the present embodiment can be used in combination with, for example, a chimeric antigen receptor (CAR) -T cell preparation, a TCR-T cell preparation, a tumor infiltrating T cell (TIL) therapy, or the like.
実施例において後述するように、発明者らは、ＮＥＬＬ２が、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ−γの産生量を増加させる機能を有することを明らかにした。したがって、ＮＥＬＬ２タンパク質又はＮＥＬＬ２タンパク質の発現ベクターを抗癌剤として使用することができる。発現ベクターについては上述したものと同様である。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞製剤、ＴＣＲ−Ｔ細胞製剤、腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）等に、ＮＥＬＬ２タンパク質を発現させて用いることができる。 As will be described later in the Examples, the inventors have shown that NELL2 has a function of increasing the production of IFN-γ in cancer antigen-specific cytotoxic T cells. Therefore, the NELL2 protein or the expression vector of the NELL2 protein can be used as an anticancer agent. The expression vector is the same as that described above. For example, the NELL2 protein can be expressed and used in a chimeric antigen receptor (CAR) -T cell preparation, a TCR-T cell preparation, a tumor infiltrating T cell (TIL), or the like.
また、実施例において後述するように、発明者らは、ＡＭＩＣＡ１タンパク質（ＡＭＩＣＡ１−Ｆｃ）が、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ−γの産生量を増加させる機能を有することを明らかにした。したがって、ＡＭＩＣＡ１タンパク質又はＡＭＩＣＡ１タンパク質の発現ベクターを抗癌剤として使用することができる。ＡＭＩＣＡ１タンパク質を抗癌剤として用いる場合、ＡＭＩＣＡ１タンパク質は可溶化されていることが好ましく、例えばＡＭＩＣＡ１−Ｆｃの形態であってもよいし、ＡＭＩＣＡ１タンパク質の一部であってもよい。発現ベクターについては上述したものと同様である。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞製剤、ＴＣＲ−Ｔ細胞製剤、腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）等に、ＡＭＩＣＡ１−Ｆｃを発現させるか、これらの細胞にＡＭＩＣＡ１−Ｆｃタンパク質を接触させて用いることができる。 In addition, as will be described later in Examples, the inventors have clarified that the AMICA1 protein (AMICA1-Fc) has a function of increasing the production amount of IFN-γ in cancer antigen-specific cytotoxic T cells. bottom. Therefore, the AMICA1 protein or the expression vector of the AMICA1 protein can be used as an anticancer agent. When the AMICA1 protein is used as an anticancer agent, the AMICA1 protein is preferably solubilized, and may be in the form of, for example, AMICA1-Fc, or may be a part of the AMICA1 protein. The expression vector is the same as that described above. For example, chimeric antigen receptor (CAR) -T cell preparation, TCR-T cell preparation, tumor infiltrating T cell (TIL), etc. are expressed with AMICA1-Fc, or these cells are contacted with AMICA1-Fc protein. Can be used.
また、実施例において後述するように、発明者らは、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質が、Ｔ細胞の未分化性を維持する機能分子であることを明らかにした。未分化なＴ細胞は免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を向上させる可能性が考えられる（例えば、Kurtulus S., et al., Checkpoint Blockade Immunotherapy Induces Dynamic Changes in PD-1-CD8+ Tumor-Infiltrating T Cells, Immunity, 50 (1):181-194, 2019 を参照。）。したがって、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質又はＣＬＥＣ１１Ａタンパク質の発現ベクターを抗癌剤として使用することができる。発現ベクターについては上述したものと同様である。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞製剤、ＴＣＲ−Ｔ細胞製剤、腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）等に、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質を発現させて用いることができる。 In addition, as will be described later in Examples, the inventors have revealed that the CLEC11A protein is a functional molecule that maintains the undifferentiated state of T cells. Undifferentiated T cells may improve the efficacy of administration of immune checkpoint inhibitors (eg, Kurtulus S., et al., Checkpoint Blockade Immunotherapy Induces Dynamic Changes in PD-1-CD8 + Tumor-Infiltrating). See T Cells, Immunity, 50 (1): 181-194, 2019.). Therefore, the CLEC11A protein or the expression vector of the CLEC11A protein can be used as an anticancer agent. The expression vector is the same as that described above. For example, the CLEC11A protein can be expressed and used in a chimeric antigen receptor (CAR) -T cell preparation, a TCR-T cell preparation, a tumor infiltrating T cell (TIL), or the like.
本実施形態の抗癌剤は、薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。本実施形態の抗癌剤は、例えば、点滴剤、注射剤、皮膚外用剤等の形態に製剤化して非経口的に投与してもよい。皮膚外用剤としては、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。 The anticancer agent of the present embodiment is preferably formulated as a pharmaceutical composition mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. The anticancer agent of the present embodiment may be formulated into a form such as an intravenous drip, an injection, or an external preparation for skin and administered parenterally. Examples of external preparations for skin include dosage forms such as ointments and patches.
薬学的に許容される担体としては、点滴用溶剤、注射用溶剤、粘着剤等が挙げられる。点滴用溶剤、注射用溶剤としては、点滴剤、注射剤に一般的に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられるがこれらに限定されない。点滴用溶剤、注射用溶剤は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。 Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include a solvent for infusion, a solvent for injection, an adhesive and the like. As the drip solvent and the injection solvent, those generally used for drip and injection can be used without particular limitation, and for example, physiological saline, glucose, D-sorbitol, D-mannose, D. -Isotonic solutions containing auxiliaries such as mannitol and sodium chloride can be mentioned, but are not limited thereto. The solvent for drip and the solvent for injection may contain alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; nonionic surfactants such as Polysorbate 80 ™ and HCO-50.
粘着剤としては、一般的な貼付剤等に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等が挙げられるがこれらに限定されない。 As the pressure-sensitive adhesive, those used for general patches and the like can be used without particular limitation, and examples thereof include, but are not limited to, rubber-based pressure-sensitive adhesives and silicone-based pressure-sensitive adhesives.
抗癌剤の患者への投与は、例えば、点滴静脈注射、静脈注射、皮内投与、皮下投与、貼付剤の貼付等により行うことができる。また、投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法等により適宜調整することができ、通常成人（体重６０ｋｇ）においては、１回あたり、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇの有効成分（タンパク質又は発現ベクター）を投与する量が挙げられる。抗癌剤の患者への投与回数は、１回であってもよく、複数回であってもよい。複数回投与する場合の投与間隔は、例えば数日から数か月であってもよい。 The anticancer drug can be administered to a patient by, for example, intravenous drip injection, intravenous injection, intradermal administration, subcutaneous administration, application of a patch, or the like. The dose can be appropriately adjusted according to the patient's age, body weight, symptoms, administration method, etc. Usually, in an adult (body weight 60 kg), for example, 0.001 mg to 1000 mg, for example 0.001 mg to each dose. Examples include the dose of 1000 mg, eg 0.1 mg to 10 mg of the active ingredient (protein or expression vector) administered. The number of administrations of the anticancer drug to the patient may be once or may be multiple times. In the case of multiple administrations, the administration interval may be, for example, several days to several months.
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、癌患者から生体試料を採取する工程と、前記生体試料における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定する工程と、前記発現量が基準値よりも高い場合に、前記癌患者に免疫チェックポイント阻害薬を投与する工程と、を含み、前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはＮＥＬＬ２タンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはＡＭＩＣＡ１タンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはＣＬＥＣ１１Ａタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＬＥＣＬ１タンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはＣＭＴＭ７タンパク質を含む、癌の治療方法を提供する。
[Other Embodiments]
In one embodiment, the present invention comprises a step of collecting a biological sample from a cancer patient, a step of measuring the expression level of a marker gene or a marker protein in the biological sample, and a case where the expression level is higher than a reference value. , The step of administering an immune checkpoint inhibitor to the cancer patient, wherein the marker gene or marker protein is NELL2 gene or NELL2 protein, AMICA1 gene or AMICA1 protein, CLEC11A gene or CLEC11A protein, CLELL1 gene or CLELL1 protein. Alternatively, a method for treating cancer, which comprises a CMTM7 gene or a CMTM7 protein, is provided.
１実施形態において、本発明は、ＮＥＬＬ２タンパク質若しくはその発現ベクター、ＡＭＩＣＡ１タンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣＬ１タンパク質若しくはその発現ベクター又はＣＭＴＭ７タンパク質若しくはその発現ベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。 In one embodiment, the present invention treats an effective amount of NELL2 protein or its expression vector, AMICA1 protein or its expression vector, CLEC11A protein or its expression vector, CLECL1 protein or its expression vector or CMTM7 protein or its expression vector. Provided are methods of treating cancer, including administration to patients in need.
１実施形態において、本発明は、癌の治療のための、ＮＥＬＬ２タンパク質若しくはその発現ベクター、ＡＭＩＣＡ１タンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣＬ１タンパク質若しくはその発現ベクター又はＣＭＴＭ７タンパク質若しくはその発現ベクターを提供する。 In one embodiment, the present invention relates to the NELL2 protein or its expression vector, the AMICA1 protein or its expression vector, the CLEC11A protein or its expression vector, the CLECL1 protein or its expression vector or the CMTM7 protein or its expression vector for the treatment of cancer. I will provide a.
１実施形態において、本発明は、抗癌剤を製造するための、ＮＥＬＬ２タンパク質若しくはその発現ベクター、ＡＭＩＣＡ１タンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質若しくはその発現ベクター、ＣＬＥＣＬ１タンパク質若しくはその発現ベクター又はＣＭＴＭ７タンパク質若しくはその発現ベクターの使用を提供する。 In one embodiment, the present invention relates to NELL2 protein or its expression vector, AMICA1 protein or its expression vector, CLEC11A protein or its expression vector, CLECL1 protein or its expression vector or CMTM7 protein or its expression vector for producing an anticancer agent. Provide use of.
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
［実験例１］
（シングルセルＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ））
９名のメラノーマ患者について、ニボルマブの投与前の血液試料及びニボルマブの投与開始から７週間後の血液試料を採取した。図１は実験スケジュールを示す図である。図１中、「ＰＤ１ Ａｂ」はニボルマブを示し、「Ｐｒｅ ＰＢＭＣ」はニボルマブの投与前の末梢血単核球細胞を示し、「Ａｆｔｅｒ ＰＢＭＣ」はニボルマブの投与後の末梢血単核球細胞を示し、「０Ｗ」、「３Ｗ」、「６Ｗ」、「７Ｗ」は、それぞれ、０週後（ニボルマブの投与開始時）、３週間後、６週間後、７週間後を示す。
[Experimental Example 1]
(Single cell RNA sequence (scRNA-Seq))
For 9 melanoma patients, blood samples before administration of nivolumab and blood samples 7 weeks after the start of administration of nivolumab were collected. FIG. 1 is a diagram showing an experiment schedule. In FIG. 1, "PD1 Ab" indicates nivolumab, "Pre PBMC" indicates peripheral blood mononuclear cells before administration of nivolumab, and "After PBMC" indicates peripheral blood mononuclear cells after administration of nivolumab. , "0W", "3W", "6W", and "7W" indicate 0 weeks (at the start of administration of nivolumab), 3 weeks, 6 weeks, and 7 weeks, respectively.
また、下記表１に、メラノーマ患者の内訳を示す。表１中、「ＰＲ」は腫瘍の大きさの和が３０％以上減少した状態（Ｐａｒｔｉａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を意味し、「ＬＳＤ」は腫瘍の大きさが６ヵ月を超えて変化しない状態（Ｌｏｎｇ Ｓｔａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ）を意味し、「ＰＤ」は腫瘍の大きさの和が２０％以上増加し且つ絶対値でも５ｍｍ以上増加した状態、あるいは新病変が出現した状態「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ」を意味する。 Table 1 below shows the breakdown of melanoma patients. In Table 1, "PR" means a state in which the sum of tumor sizes is reduced by 30% or more (Partial Lesion), and "LSD" is a state in which the tumor size does not change for more than 6 months (Long Table Disease). ), And "PD" means a state in which the sum of tumor sizes is increased by 20% or more and the absolute value is also increased by 5 mm or more, or a state in which a new lesion appears, "Progressive Disease".
続いて、各血液試料から末梢血単核球細胞を調製し、セルソーター（型番「ＳＨ８００Ｓ」、ソニー）で９６ウェルプレートに１個／ウェルずつＣＤ８陽性Ｔ細胞を回収した。 Subsequently, peripheral blood mononuclear cells were prepared from each blood sample, and one CD8-positive T cell was collected on a 96-well plate using a cell sorter (model number "SH800S", Sony).
続いて、回収した各ＣＤ８陽性Ｔ細胞から、市販のキット（製品名「ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ（Ｒ）ｖ４ ３’ＤＥ Ｋｉｔ」、クロンテック社）を用いて次世代シーケンス用のｃＤＮＡライブラリを作製した。続いて、次世代シーケンサー（製品名「ＮｏｖａＳｅｑ６０００」、イルミナ社）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリのシーケンス（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を行った。 Subsequently, a cDNA library for next-generation sequencing was prepared from each collected CD8-positive T cell using a commercially available kit (product name "SMART-Seq (R) v4 3'DE Kit", Clontech). Subsequently, a sequence (RNA-seq) of a cDNA library prepared using a next-generation sequencer (product name “NovaSeq6000”, Illumina) was performed.
インシリコ解析の結果、ＲＮＡ−Ｓｅｑ解析を行った３，４５６細胞のうち、３，２０６細胞の結果が、ミトコンドリア含有量１０％以下であり、ＱＣ（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）をパスした。その結果、１細胞あたり、２７０万リード、平均６，０００遺伝子（種類）／細胞の検出に成功した。 As a result of in silico analysis, out of 3,456 cells subjected to RNA-Seq analysis, the result of 3,206 cells had a mitochondrial content of 10% or less and passed QC (quantity control). As a result, we succeeded in detecting 2.7 million reads per cell and an average of 6,000 genes (types) / cell.
この解析結果に基づき、ニボルマブの投与の有効性を予測しうるマーカー遺伝子として、ＮＥＬＬ２、ＡＭＩＣＡ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＣＬＥＣＬ１に着目し、以下の検討を行った。 Based on the results of this analysis, we focused on NELL2, AMICA1, CLEC11A, and CLECL1 as marker genes that can predict the efficacy of administration of nivolumab, and conducted the following studies.
［実験例２］
（ＮＥＬＬ２の検討）
《ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ》
図２（ａ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＥＬＬ２遺伝子の発現量を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は１００万リードあたりのＮＥＬＬ２のリード数である。
[Experimental Example 2]
(Examination of NELL2)
<< scRNA-Seq >>
FIG. 2A shows the expression level of the NELL2 gene in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1, and the administration of nivolumab shows the expression level of the NELL2 gene. It is a graph which shows the result of having analyzed each of the patient (PR or LSD) which was effective, and the patient (PD) who was not effective in administration of nivolumab. The vertical axis of the graph is the number of NELL2 leads per million reads.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりもＮＥＬＬ２遺伝子の発現量が高い傾向が認められた。したがって、ＮＥＬＬ２遺伝子又はＮＥＬＬ２タンパク質は、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 As a result, before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post), patients who were effective with nivolumab tended to have higher expression levels of the NELL2 gene than patients who were not effective with nivolumab. Was done. Therefore, the NELL2 gene or NELL2 protein can be used as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
図２（ｂ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現、ＳＬＡＭＦ６遺伝子高発現細胞の割合を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は割合（％）である。 FIG. 2B shows NELL2 gene high expression and SLAMF6 gene high expression cells in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of having analyzed the ratio of nivolumab for each of the patient (PR or LSD) who was effective with nivolumab, and the patient (PD) who was not effective with nivolumab. The vertical axis of the graph is the percentage (%).
本実験例では、ＮＥＬＬ２遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＮＥＬＬ２遺伝子高発現細胞と定義した。同様に、ＳＬＡＭＦ６遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＳＬＡＭＦ６遺伝子高発現細胞と定義した。 In this experimental example, the expression level of the NELL2 gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as NELL2 gene high expression cells. Similarly, the expression level of the SLAMF6 gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as cells with a high expression level of the SLAMF6 gene.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりも、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現、ＳＬＡＭＦ６遺伝子高発現細胞の割合が高い傾向が認められた。また、ＮＥＬＬ２遺伝子とＳＬＡＭＦ６遺伝子の発現を組み合わせて解析することにより、ＮＥＬＬ２遺伝子単独の発現を解析するよりもニボルマブの投与の有効性を精度よく予測できる傾向が認められた。 As a result, before nivolumab administration (Pre), patients who were effective with nivolumab tended to have a higher proportion of NELL2 gene high expression and SLAMF6 gene high expression cells than patients who were not effective with nivolumab administration. Admitted. In addition, by analyzing the expression of the NELL2 gene and the SLAMF6 gene in combination, it was found that the effectiveness of administration of nivolumab can be predicted more accurately than the analysis of the expression of the NELL2 gene alone.
したがって、ＳＬＡＭＦ６遺伝子又はＳＬＡＭＦ６タンパク質は、ＮＥＬＬ２遺伝子又はＮＥＬＬ２タンパク質と組み合わせて、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 Therefore, the SLAMF6 gene or SLAMF6 protein can be used in combination with the NELL2 gene or NELL2 protein as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
図２（ｃ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現、ＣＤ４４遺伝子高発現細胞の割合を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は割合（％）である。 FIG. 2C shows NELL2 gene high expression and CD44 gene high expression cells in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of having analyzed the ratio of nivolumab for each of the patient (PR or LSD) who was effective with nivolumab, and the patient (PD) who was not effective with nivolumab. The vertical axis of the graph is the percentage (%).
上述したように、ＮＥＬＬ２遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＮＥＬＬ２遺伝子高発現細胞と定義した。同様に、ＣＤ４４遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＣＤ４４遺伝子高発現細胞と定義した。 As described above, the expression level of the NELL2 gene was normalized, and the cells showing the expression level of the first quartile or higher were defined as the cells highly expressing the NELL2 gene. Similarly, the expression level of the CD44 gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as CD44 gene high expression cells.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりも、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現、ＣＤ４４遺伝子高発現細胞の割合が高い傾向が認められた。また、ＮＥＬＬ２遺伝子とＣＤ４４遺伝子の発現を組み合わせて解析することにより、ＮＥＬＬ２遺伝子単独の発現を解析するよりもニボルマブの投与の有効性を精度よく予測できる傾向が認められた。 As a result, before nivolumab administration (Pre), patients who were effective with nivolumab tended to have a higher proportion of cells expressing NELL2 gene and CD44 gene than those who were not effective with nivolumab. Admitted. In addition, by analyzing the expression of the NELL2 gene and the CD44 gene in combination, it was found that the effectiveness of administration of nivolumab can be predicted more accurately than the analysis of the expression of the NELL2 gene alone.
したがって、ＣＤ４４遺伝子又はＣＤ４４タンパク質は、ＮＥＬＬ２遺伝子又はＮＥＬＬ２タンパク質と組み合わせて、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 Therefore, the CD44 gene or CD44 protein can be used in combination with the NELL2 gene or NELL2 protein as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
図２（ｄ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現、ＩＬ７Ｒ遺伝子高発現細胞の割合を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は割合（％）である。 FIG. 2D shows NELL2 gene high expression and IL7R gene high expression cells in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of having analyzed the ratio of nivolumab for each of the patient (PR or LSD) who was effective with nivolumab, and the patient (PD) who was not effective with nivolumab. The vertical axis of the graph is the percentage (%).
上述したように、ＮＥＬＬ２遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＮＥＬＬ２遺伝子高発現細胞と定義した。同様に、ＩＬ７Ｒ遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＩＬ７Ｒ遺伝子高発現細胞と定義した。 As described above, the expression level of the NELL2 gene was normalized, and the cells showing the expression level of the first quartile or higher were defined as the cells highly expressing the NELL2 gene. Similarly, the expression level of the IL7R gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as cells highly expressing the IL7R gene.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりも、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現、ＩＬ７Ｒ遺伝子高発現細胞の割合が高い傾向が認められた。また、ＮＥＬＬ２遺伝子とＩＬ７Ｒ遺伝子の発現を組み合わせて解析することにより、ＮＥＬＬ２遺伝子単独の発現を解析するよりもニボルマブの投与の有効性を精度よく予測できる傾向が認められた。 As a result, before nivolumab administration (Pre), patients who were effective with nivolumab tended to have a higher proportion of cells expressing NELL2 gene and IL7R gene than those who were not effective with nivolumab. Admitted. In addition, by analyzing the expression of the NELL2 gene and the IL7R gene in combination, it was found that the effectiveness of administration of nivolumab can be predicted more accurately than the analysis of the expression of the NELL2 gene alone.
したがって、ＩＬ７Ｒ遺伝子又はＩＬ７Ｒタンパク質は、ＮＥＬＬ２遺伝子又はＮＥＬＬ２タンパク質と組み合わせて、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 Therefore, the IL7R gene or IL7R protein can be used in combination with the NELL2 gene or NELL2 protein as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
《公開データベースを用いた予後解析》
公開データベースであるＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を用いて、ＮＥＬＬ２遺伝子の発現とメラノーマ（Ｓｋｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｌａｎｏｍａ）患者の予後との関連性を検討した。具体的には、ＣＤ８遺伝子及びＮＥＬＬ２遺伝子の発現量に基づいて、各メラノーマ患者を（ｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現群、（ｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＮＥＬＬ２遺伝子低発現群、（ｉｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現群、（ｉｖ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＮＥＬＬ２遺伝子低発現群、の４群に分け、予後解析を行った。
<< Prognosis analysis using public database >>
The public database, The Cancer Genome Atlas (TCGA), was used to examine the association between NELL2 gene expression and the prognosis of patients with Skin Cutaneous Melanoma. Specifically, based on the expression levels of the CD8 gene and the NELL2 gene, each melanoma patient was classified into (i) CD8A gene high expression group, NELL2 gene high expression group, (ii) CD8A gene high expression group, NELL2 gene low expression group, ( The prognosis was analyzed by dividing into four groups: iii) CD8A gene low expression, NELL2 gene high expression group, and (iv) CD8A gene low expression, NELL2 gene low expression group.
図３は、メラノーマ患者の予後解析の結果を示すグラフである。図３中、「ＣＤ８Ａ＋／ＮＥＬＬ２＋」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ＋／ＮＥＬＬ２−」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＮＥＬＬ２遺伝子低発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ−／ＮＥＬＬ２＋」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ−／ＮＥＬＬ２−」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＮＥＬＬ２遺伝子低発現群の結果であることを示す。 FIG. 3 is a graph showing the results of prognosis analysis of melanoma patients. In FIG. 3, "CD8A + / NELL2 +" indicates the result of the CD8A gene high expression and NELL2 gene high expression group, and "CD8A + / NELL2-" is the result of the CD8A gene high expression and NELL2 gene low expression group. "CD8A- / NELL2 +" indicates that it is the result of the CD8A gene low expression and NELL2 gene high expression group, and "CD8A- / NELL2-" indicates that the CD8A gene low expression and NELL2 gene low expression group. It is shown that it is the result of.
その結果、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＮＥＬＬ２遺伝子高発現群の予後が最も良好であることが明らかとなった。 As a result, it was clarified that the prognosis of the CD8A gene high expression group and the NELL2 gene high expression group was the best.
《癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の応答》
ＭＡＲＴ−１抗原は、メラノーマ細胞の表面に存在することが知られているタンパク質である。まず、ＨＬＡ−Ａ２０１拘束性にＭＡＲＴ−１抗原を認識するＴ細胞受容体（ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ）を発現するＴ細胞（以下、「ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞」という場合がある。）６×１０６個に、ヒトＮＥＬＬ２を発現するレトロウイルスを感染させた。
<< Response of cancer antigen-specific cytotoxic T cells >>
The MART-1 antigen is a protein known to be present on the surface of melanoma cells. First, T cells expressing a T cell receptor (MART-1 TCR) that recognizes the MART-1 antigen in a HLA-A201 restraint (hereinafter, may be referred to as "MART-1 TCR-T cell") 6 × 10 6, were infected with retrovirus expressing human NELL2.
続いて、感染後、培養４日目に、メラノーマ細胞株であるＭＥＬ８８８にＨＬＡ−Ａ２０１を発現させた細胞（以下、「ＭＥＬ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１細胞」という場合がある。）と１：１の細胞数（それぞれ１０４個）で共培養を行い、共培養の開始から２４時間後の培養上清中のインターフェロン（ＩＦＮ）−γ量を測定した。また、対照として、ＭＥＬ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１細胞の代わりにＭＥＬ８８８細胞を用いた群も用意した。 Subsequently, on the 4th day after infection, the number of cells expressing HLA-A201 in MEL888, which is a melanoma cell line (hereinafter, may be referred to as "MEL888 HLA A201 cells"), is 1: 1 (the number of cells is 1: 1 (hereinafter, may be referred to as "MEL888 HLA A201 cells"). performed co-culture with each 10 4) were measured interferon (IFN)-gamma in the culture supernatant 24 hours after the start of the co-culture. In addition, as a control, a group using MEL888 cells instead of MEL888 HLA A201 cells was also prepared.
図４は、ＩＦＮ−γの産生量を定量した結果を示すグラフである。図４中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞に、空のレトロウイルスを感染させた結果であることを示し、「ＮＥＬＬ２」は、ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞に、ヒトＮＥＬＬ２を発現するレトロウイルスを感染させた結果であることを示し、「Ｍｅｌ８８８」はＭＥＬ８８８細胞を用いた結果であることを示し、「Ｍｅｌ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１」は、ＭＥＬ８８８にＨＬＡ−Ａ２０１を発現させた細胞（ＭＥＬ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１細胞）を用いた結果であることを示す。 FIG. 4 is a graph showing the results of quantifying the amount of IFN-γ produced. In FIG. 4, "Control" indicates that the MART-1 TCR-T cells were infected with an empty retrovirus, and "NELL2" indicates that the MART-1 TCR-T cells were infected with human NELL2. It was shown that it was the result of infection with the expressed retrovirus, "Mel888" was the result of using MEL888 cells, and "Mel888 HLA A201" was a cell (MEL888) in which HLA-A201 was expressed on MEL888. It is shown that it is the result of using HLA A201 cells).
その結果、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞）にＮＥＬＬ２をレトロウイルスで過剰発現させると、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＩＦＮ−γの産生量が増加することが明らかとなった。この結果は、ＮＥＬＬ２タンパク質が抗癌活性を有することを示す。したがって、ＮＥＬＬ２タンパク質は抗癌剤として使用することができる。 As a result, when NELL2 is overexpressed in cancer antigen-specific cytotoxic T cells (MART-1 TCR-T cells) with a retrovirus, the amount of IFN-γ produced by cancer antigen-specific cytotoxic T cells increases. It became clear to do. This result indicates that the NELL2 protein has anti-cancer activity. Therefore, the NELL2 protein can be used as an anticancer agent.
［実験例３］
（ＡＭＩＣＡ１の検討）
《ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ》
図５（ａ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現細胞の割合を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は割合（％）である。本実験例では、ＡＭＩＣＡ１遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現細胞と定義した。
[Experimental Example 3]
(Examination of AMICA1)
<< scRNA-Seq >>
FIG. 5A shows the proportion of AMICA1 gene-expressing cells in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of analysis for each of the patient (PR or LSD) for which administration of nivolumab was effective, and the patient (PD) for which administration of nivolumab was not effective. The vertical axis of the graph is the percentage (%). In this experimental example, the expression level of the AMICA1 gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as cells highly expressing the AMICA1 gene.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりもＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現細胞の割合が高い傾向が認められた。したがって、ＡＭＩＣＡ１遺伝子又はＡＭＩＣＡ１タンパク質は、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 As a result, before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post), patients who were effective with nivolumab tended to have a higher proportion of cells expressing the AMICA1 gene than patients who were not effective with nivolumab. Was recognized. Therefore, the AMICA1 gene or AMICA1 protein can be used as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
図５（ｂ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現、ＳＥＬＬ遺伝子高発現細胞の割合を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は割合（％）である。 FIG. 5 (b) shows AMICA1 gene high expression and SELL gene high expression cells in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of having analyzed the ratio of nivolumab for each of the patient (PR or LSD) who was effective with nivolumab, and the patient (PD) who was not effective with nivolumab. The vertical axis of the graph is the percentage (%).
上述したように、ＡＭＩＣＡ１遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現細胞と定義した。同様に、ＳＥＬＬ遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＳＥＬＬ遺伝子高発現細胞と定義した。 As described above, the expression level of the AMICA1 gene was normalized, and the cells showing the expression level of the first quartile or higher were defined as the cells highly expressing the AMICA1 gene. Similarly, the expression level of the SELL gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as cells highly expressing the SELL gene.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりも、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現、ＳＥＬＬ遺伝子高発現細胞の割合が有意に高いことが明らかとなった。また、ＡＭＩＣＡ１遺伝子とＳＥＬＬ遺伝子の発現を組み合わせて解析することにより、ＡＭＩＣＡ１遺伝子単独の発現を解析するよりもニボルマブの投与の有効性を精度よく予測できることが明らかとなった。 As a result, before nivolumab administration (Pre), the proportion of cells with high AMICA1 gene expression and high SELL gene expression was significantly higher in patients who were effective with nivolumab than those who were not effective with nivolumab. It became clear. In addition, it was clarified that the effectiveness of administration of nivolumab can be predicted more accurately than the analysis of the expression of the AMICA1 gene alone by analyzing the expression of the AMICA1 gene and the SELL gene in combination.
したがって、ＳＥＬＬ遺伝子又はＳＥＬＬタンパク質は、ＡＭＩＣＡ１遺伝子又はＡＭＩＣＡ１タンパク質と組み合わせて、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 Therefore, the SELL gene or SELL protein can be used in combination with the AMICA1 gene or AMICA1 protein as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
図５（ｃ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現、ＩＬ７Ｒ遺伝子高発現細胞の割合を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は割合（％）である。 FIG. 5 (c) shows AMICA1 gene high expression and IL7R gene high expression cells in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of having analyzed the ratio of nivolumab for each of the patient (PR or LSD) who was effective with nivolumab, and the patient (PD) who was not effective with nivolumab. The vertical axis of the graph is the percentage (%).
上述したように、ＡＭＩＣＡ１遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現細胞と定義した。同様に、ＩＬ７Ｒ遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＩＬ７Ｒ遺伝子高発現細胞と定義した。 As described above, the expression level of the AMICA1 gene was normalized, and the cells showing the expression level of the first quartile or higher were defined as the cells highly expressing the AMICA1 gene. Similarly, the expression level of the IL7R gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as cells highly expressing the IL7R gene.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりも、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現、ＩＬ７Ｒ遺伝子高発現細胞の割合が高い傾向が認められた。また、ＡＭＩＣＡ１遺伝子とＩＬ７Ｒ遺伝子の発現を組み合わせて解析することにより、ＡＭＩＣＡ１遺伝子単独の発現を解析するよりもニボルマブの投与の有効性を精度よく予測できる傾向が認められた。 As a result, before nivolumab administration (Pre), patients who were effective with nivolumab tended to have a higher proportion of cells with high AMICA1 gene expression and high IL7R gene expression than patients who were not effective with nivolumab administration. Admitted. In addition, by analyzing the expression of the AMICA1 gene and the IL7R gene in combination, it was found that the effectiveness of administration of nivolumab can be predicted more accurately than the analysis of the expression of the AMICA1 gene alone.
したがって、ＩＬ７Ｒ遺伝子又はＩＬ７Ｒタンパク質は、ＡＭＩＣＡ１遺伝子又はＡＭＩＣＡ１タンパク質と組み合わせて、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 Therefore, the IL7R gene or IL7R protein can be used in combination with the AMICA1 gene or AMICA1 protein as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
図５（ｄ）は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞における、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現、ＣＣＲ７遺伝子高発現細胞の割合を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は割合（％）である。 FIG. 5 (d) shows AMICA1 gene high expression cells and CCR7 gene high expression cells in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post) based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1. It is a graph which shows the result of having analyzed the ratio of nivolumab for each of the patient (PR or LSD) who was effective with nivolumab, and the patient (PD) who was not effective with nivolumab. The vertical axis of the graph is the percentage (%).
上述したように、ＡＭＩＣＡ１遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現細胞と定義した。同様に、ＣＣＲ７遺伝子の発現量を正規化し、第１四分位数以上の発現量を示した細胞をＣＣＲ７遺伝子高発現細胞と定義した。 As described above, the expression level of the AMICA1 gene was normalized, and the cells showing the expression level of the first quartile or higher were defined as the cells highly expressing the AMICA1 gene. Similarly, the expression level of the CCR7 gene was normalized, and cells showing an expression level of the first quartile or higher were defined as cells highly expressing the CCR7 gene.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりも、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現、ＣＣＲ７遺伝子高発現細胞の割合が有意に高いことが明らかとなった。また、ＡＭＩＣＡ１遺伝子とＣＣＲ７遺伝子の発現を組み合わせて解析することにより、ＡＭＩＣＡ１遺伝子単独の発現を解析するよりもニボルマブの投与の有効性を精度よく予測できることが明らかとなった。 As a result, before nivolumab administration (Pre), the proportion of cells with high AMICA1 gene expression and high CCR7 gene expression was significantly higher in patients who were effective with nivolumab than those who were not effective with nivolumab. It became clear. In addition, it was clarified that the effectiveness of administration of nivolumab can be predicted more accurately than the analysis of the expression of the AMICA1 gene alone by analyzing the expression of the AMICA1 gene and the CCR7 gene in combination.
したがって、ＣＣＲ７遺伝子又はＣＣＲ７タンパク質は、ＡＭＩＣＡ１遺伝子又はＡＭＩＣＡ１タンパク質と組み合わせて、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 Therefore, the CCR7 gene or CCR7 protein can be used in combination with the AMICA1 gene or AMICA1 protein as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
《公開データベースを用いた予後解析１》
公開データベースであるＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を用いて、ＡＭＩＣＡ１遺伝子の発現とメラノーマ（Ｓｋｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｌａｎｏｍａ）患者の予後との関連性を検討した。具体的には、ＣＤ８遺伝子及びＡＭＩＣＡ１遺伝子の発現量に基づいて、各メラノーマ患者を（ｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群、（ｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子低発現群、（ｉｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群、（ｉｖ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子低発現群、の４群に分け、予後解析を行った。
<< Prognosis analysis using public database 1 >>
The public database, The Cancer Genome Atlas (TCGA), was used to examine the association between AMICA1 gene expression and the prognosis of melanoma patients. Specifically, based on the expression levels of the CD8 gene and the AMICA1 gene, each melanoma patient was classified into (i) CD8A gene high expression group, AMICA1 gene high expression group, (ii) CD8A gene high expression group, AMICA1 gene low expression group, ( The prognosis was analyzed by dividing into four groups: iii) CD8A gene low expression, AMICA1 gene high expression group, and (iv) CD8A gene low expression, AMICA1 gene low expression group.
図６（ａ）は、メラノーマ患者の予後解析の結果を示すグラフである。図６（ａ）中、「ＣＤ８Ａ＋／ＡＭＩＣＡ１＋」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ＋／ＡＭＩＣＡ１−」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子低発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ−／ＡＭＩＣＡ１＋」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ−／ＡＭＩＣＡ１−」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子低発現群の結果であることを示す。 FIG. 6A is a graph showing the results of prognosis analysis of melanoma patients. In FIG. 6A, "CD8A + / AMICA1 +" indicates the result of the CD8A gene high expression and AMICA1 gene high expression group, and "CD8A + / AMICA1-" indicates the result of the CD8A gene high expression and AMICA1 gene low expression group. "CD8A- / AMICA1 +" indicates that it is the result of the CD8A gene low expression and AMICA1 gene high expression group, and "CD8A- / AMICA1-" indicates that it is the result of CD8A gene low expression and AMICA1 gene. It is shown that it is the result of the low expression group.
その結果、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群の予後が最も良好であることが明らかとなった。 As a result, it was clarified that the prognosis of the CD8A gene high expression group and the AMICA1 gene high expression group was the best.
《公開データベースを用いた予後解析２》
公開データベースであるＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を用いて、ＡＭＩＣＡ１遺伝子の発現とメラノーマ（Ｓｋｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｌａｎｏｍａ）患者の予後との関連性を検討した。具体的には、各メラノーマ患者を、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群とＡＭＩＣＡ１遺伝子低発現群の２群に分け、予後解析を行った。
<<
The public database, The Cancer Genome Atlas (TCGA), was used to examine the association between AMICA1 gene expression and the prognosis of melanoma patients. Specifically, each melanoma patient was divided into two groups, an AMICA1 gene high expression group and an AMICA1 gene low expression group, and prognosis analysis was performed.
図６（ｂ）は、メラノーマ患者の予後解析の結果を示すグラフである。図６（ｂ）中、「ＡＭＩＣＡ１＋」は、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＡＭＩＣＡ１−」は、ＡＭＩＣＡ１遺伝子低発現群の結果であることを示す。 FIG. 6B is a graph showing the results of prognosis analysis of melanoma patients. In FIG. 6 (b), "AMICA1 +" indicates that it is the result of the AMICA1 gene high expression group, and "AMICA1-" indicates that it is the result of the AMICA1 gene low expression group.
その結果、ＡＭＩＣＡ１遺伝子高発現群の予後が有意に良好であることが明らかとなった。 As a result, it was clarified that the prognosis of the AMICA1 gene high expression group was significantly good.
《癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の応答》
上述したＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞６×１０６個の培地に、ヒトＡＭＩＣＡ１タンパク質と抗体定常領域との融合タンパク質（ＡＭＩＣＡ１−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ社）を終濃度が４００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。また、対照として、抗体定常領域（ＩｇＧ１−Ｆｃ）を終濃度が４００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した群も用意した。
<< Response of cancer antigen-specific cytotoxic T cells >>
The MART-1 TCR-
続いて、培養４日目に、ＭＥＬ８８８にＨＬＡ−Ａ２０１を発現させた細胞（ＭＥＬ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１細胞）と１：１の細胞数（それぞれ１０４個）で共培養を行い、共培養の開始から２４時間後の培養上清中のＩＦＮ−γ量を測定した。また、対照として、ＭＥＬ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１細胞の代わりにＭＥＬ８８８細胞を用いた群も用意した。 Then, on the fourth day of culture, the cells expressing the HLA-A 201 to MEL888 (MEL888 HLA A201 cells) 1: 1 in the number of cells subjected to coculture with (respectively 10 4), from the start of the co-culture 24 The amount of IFN-γ in the culture supernatant after hours was measured. In addition, as a control, a group using MEL888 cells instead of MEL888 HLA A201 cells was also prepared.
図７は、ＩＦＮ−γの産生量を定量した結果を示すグラフである。図７中、「ＩｇＧ１−Ｆｃ」は、ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞の培地に、ＩｇＧ１−Ｆｃを添加した結果であることを示し、「ＡＭＩＣＡ１−Ｆｃ」は、ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞の培地に、ＡＭＩＣＡ１−Ｆｃを添加した結果であることを示し、「Ｍｅｌ８８８」はＭＥＬ８８８細胞を用いた結果であることを示し、「Ｍｅｌ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１」は、ＭＥＬ８８８にＨＬＡ−Ａ２０１を発現させた細胞（ＭＥＬ８８８ ＨＬＡ Ａ２０１細胞）を用いた結果であることを示す。 FIG. 7 is a graph showing the results of quantifying the amount of IFN-γ produced. In FIG. 7, "IgG1-Fc" indicates that it is the result of adding IgG1-Fc to the medium of MART-1 TCR-T cells, and "AMICA1-Fc" is the result of adding MART-1 TCR-T cells. It was shown that it was the result of adding AMICA1-Fc to the medium, "Mel888" was the result of using MEL888 cells, and "Mel888 HLA A201" was a cell expressing HLA-A201 in MEL888 ( It is shown that it is a result using MEL888 HLA A201 cells).
その結果、培地にＡＭＩＣＡ１タンパク質を添加すると、癌抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲ−Ｔ細胞）のＩＦＮ−γの産生量が増加することが明らかとなった。この結果は、ＡＭＩＣＡ１タンパク質が抗癌活性を有することを示す。したがって、ＡＭＩＣＡ１タンパク質は抗癌剤として使用することができる。 As a result, it was clarified that the addition of AMICA1 protein to the medium increased the production of IFN-γ of cancer antigen-specific cytotoxic T cells (MART-1 TCR-T cells). This result indicates that the AMICA1 protein has anti-cancer activity. Therefore, the AMICA1 protein can be used as an anticancer agent.
［実験例４］
（ＣＬＥＣ１１Ａの検討）
《ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ》
図８は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子の発現量を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は１００万リードあたりのＮＥＬＬ２のリード数である。
[Experimental Example 4]
(Examination of CLEC11A)
<< scRNA-Seq >>
In FIG. 8, based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1, administration of nivolumab was effective in determining the expression level of the CLEC11A gene in CD8-positive T cells before and after administration of nivolumab (Pre) and after administration of nivolumab (Post). It is a graph which shows the result of analysis for each of the patient (PR or LSD) and the patient (PD) who was not effective in administration of nivolumab. The vertical axis of the graph is the number of NELL2 leads per million reads.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりもＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子の発現量が有意に高いことが明らかとなった。したがって、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子又はＣＬＥＣ１１Ａタンパク質は、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 As a result, before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post), the expression level of the CLIC11A gene was significantly higher in the patients who were effective with nivolumab than in the patients who were not effective with nivolumab. Became clear. Therefore, the CLEC11A gene or CLEC11A protein can be used as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
《公開データベースを用いた予後解析》
公開データベースであるＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を用いて、ＮＥＬＬ２遺伝子の発現とメラノーマ（Ｓｋｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｌａｎｏｍａ）患者の予後との関連性を検討した。具体的には、ＣＤ８遺伝子及びＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子の発現量に基づいて、各メラノーマ患者を（ｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子高発現群、（ｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子低発現群、（ｉｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子高発現群、（ｉｖ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子低発現群、の４群に分け、予後解析を行った。
<< Prognosis analysis using public database >>
The public database, The Cancer Genome Atlas (TCGA), was used to examine the association between NELL2 gene expression and the prognosis of patients with Skin Cutaneous Melanoma. Specifically, based on the expression levels of the CD8 gene and the CLEC11A gene, each melanoma patient was subjected to (i) CD8A gene high expression group, CLEC11A gene high expression group, (ii) CD8A gene high expression group, CLEC11A gene low expression group, ( The prognosis was analyzed by dividing into four groups: iii) low expression of CD8A gene, high expression of CLEC11A gene, and (iv) low expression of CD8A gene and low expression of CLEC11A gene.
図９は、メラノーマ患者の予後解析の結果を示すグラフである。図９中、「ＣＬＥＣ１１Ａｈｉｇｈ＿ＣＤ８Ａｈｉｇｈ」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＬＥＣ１１Ａｌｏｗ＿ＣＤ８Ａｈｉｇｈ」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子低発現群の結果であることを示し、「ＣＬＥＣ１１Ａｈｉｇｈ＿ＣＤ８Ａｌｏｗ」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＬＥＣ１１Ａｌｏｗ＿ＣＤ８Ａｌｏｗ」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子低発現群の結果であることを示す。 FIG. 9 is a graph showing the results of prognosis analysis of melanoma patients. In FIG. 9, "CLEC11Ahigh_CD8Ahigh" indicates that it is the result of the CD8A gene high expression and CLEC11A gene high expression group, and "CLEC11Alow_CD8Ahigh" indicates that it is the result of the CD8A gene high expression and CLEC11A gene low expression group. "CLEC11Ahigh_CD8Alow" indicates that it is the result of the CD8A gene low expression and CLEC11A gene high expression group, and "CLEC11Alow_CD8Alow" indicates that it is the result of the CD8A gene low expression and CLEC11A gene low expression group.
その結果、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子高発現群の予後が最も良好であることが明らかとなった。 As a result, it was clarified that the prognosis of the CD8A gene high expression group and the CLEC11A gene high expression group was the best.
《ＣＬＥＣ１１ＡはＴ細胞の分化に与える影響の検討》
末梢血単核球細胞に、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子を過剰発現又はノックダウンし、Ｔ細胞の分化に与える影響を検討した。具体的には、まず、ヒト末梢血より単離した単核球を培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激した。続いて、培養開始から３日目に各レトロウイルス（ヒトＣＬＥＣ１１Ａを過剰発現させるレトロウイルス、ヒトＣＬＥＣ１１Ａに対するｓｈＲＮＡを発現させるレトロウイルス、対照のレトロウイルス）を感染させた。
<< Examination of the effect of CLEC11A on T cell differentiation >>
The effect of overexpressing or knocking down the CLEC11A gene in peripheral blood mononuclear cells and affecting the differentiation of T cells was investigated. Specifically, first, mononuclear cells isolated from human peripheral blood were cultured and stimulated with a CD3 / CD28 antibody. Subsequently, on the third day from the start of culture, each retrovirus (a retrovirus that overexpresses human CLEC11A, a retrovirus that expresses shRNA against human CLEC11A, and a control retrovirus) was infected.
続いて、培養開始から７日目、１４日目、２１日目にＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激を行い、培養開始から２４日目に、ウイルス感染ＣＤ８Ｔ細胞（ＧＦＰ陽性）の、細胞分画のポピュレーション解析をＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡの発現を指標に行った。 Subsequently, CD3 / CD28 antibody stimulation was performed on the 7th, 14th, and 21st days from the start of the culture, and on the 24th day from the start of the culture, population of the cell fraction of the virus-infected CD8T cells (GFP positive) was performed. The analysis was performed using the expression of CD62L and CD45RA as an index.
図１０（ａ）〜（ｄ）は、フローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。図１０（ａ）〜（ｄ）において、ＣＤ８陽性ＧＦＰ陽性細胞にゲートをかけた。図１０（ａ）〜（ｄ）中、横軸はＣＤ６２Ｌの発現強度を示し、縦軸はＣＤ４５ＲＡの発現強度を示す。 10 (a) to 10 (d) are graphs showing the results of flow cytometry analysis. In FIGS. 10 (a) to 10 (d), CD8-positive GFP-positive cells were gated. In FIGS. 10A to 10D, the horizontal axis shows the expression intensity of CD62L, and the vertical axis shows the expression intensity of CD45RA.
図１０（ａ）は、対照ベクターを導入したＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化状態を解析した結果を示すグラフである。また、図１０（ｂ）は、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子を過剰発現させたＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化状態を解析した結果を示すグラフである。 FIG. 10A is a graph showing the results of analyzing the differentiation state of CD8-positive T cells into which a control vector has been introduced. Further, FIG. 10B is a graph showing the results of analyzing the differentiation state of CD8-positive T cells overexpressing the CLEC11A gene.
その結果、ＣＬＥＣ１１Ａを過剰発現させると、ＣＤ６２Ｌ陰性ＣＤ４５ＲＡ細胞の割合が減少したことが明らかとなった。この結果は、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子を過剰発現させると、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化が抑制することを示す。 As a result, it was revealed that overexpression of CLEC11A reduced the proportion of CD62L-negative CD45RA cells. This result indicates that overexpression of the CLEC11A gene suppresses the differentiation of CD8-positive T cells.
また、図１０（ｃ）は、対照ベクターを導入したＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化状態を解析した結果を示すグラフである。また、図１０（ｄ）は、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子をノックダウンしたＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化状態を解析した結果を示すグラフである。 In addition, FIG. 10 (c) is a graph showing the results of analyzing the differentiation state of CD8-positive T cells into which a control vector has been introduced. Further, FIG. 10 (d) is a graph showing the results of analyzing the differentiation state of CD8-positive T cells in which the CLEC11A gene was knocked down.
その結果、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子をノックダウンすると、ＣＤ６２Ｌ陰性ＣＤ４５ＲＡ細胞の割合が増加したことが明らかとなった。この結果は、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子をノックダウンすると、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の分化が促進することを示す。 As a result, it was revealed that knocking down the CLEC11A gene increased the proportion of CD62L-negative CD45RA cells. This result indicates that knockdown of the CLIC11A gene promotes the differentiation of CD8-positive T cells.
以上の結果は、ＣＬＥＣ１１Ａタンパク質が、Ｔ細胞の未分化性を維持する機能分子であることを示す。未分化なＴ細胞の存在は、免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を向上させると考えられている。したがって、Ｔ細胞におけるＣＬＥＣ１１Ａタンパク質又はＣＬＥＣ１１Ａタンパク質の発現を上昇させる物質は、免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を向上させる薬物として使用することができる。 The above results indicate that the CLEC11A protein is a functional molecule that maintains the undifferentiated state of T cells. The presence of undifferentiated T cells is believed to improve the effectiveness of administration of immune checkpoint inhibitors. Therefore, a substance that increases the expression of CLEC11A protein or CLEC11A protein in T cells can be used as a drug that improves the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor.
［実験例５］
（ＣＬＥＣＬ１の検討）
《ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ》
図１１は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＣＬＥＣＬ１遺伝子の発現量を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は１００万リードあたりのＣＬＥＣＬ１のリード数である。
[Experimental Example 5]
(Examination of CLICL1)
<< scRNA-Seq >>
In FIG. 11, based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1, administration of nivolumab was effective in determining the expression level of the CLECL1 gene in CD8-positive T cells before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post). It is a graph which shows the result of analysis for each of the patient (PR or LSD) and the patient (PD) who was not effective in administration of nivolumab. The vertical axis of the graph is the number of CLECL1 reads per million reads.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりもＣＬＥＣ１Ｌ１遺伝子の発現量が有意に高いことが明らかとなった。したがって、ＣＬＥＣ１Ｌ１遺伝子又はＣＬＥＣ１Ｌ１タンパク質は、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 As a result, before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post), the expression level of the CLIC1L1 gene was significantly higher in patients who were effective with nivolumab than in patients who were not effective with nivolumab. Became clear. Therefore, the CLEC1L1 gene or CLEC1L1 protein can be used as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
［実験例６］
（ＣＭＴＭ７の検討）
《ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ》
図１２は、実験例１のＲＮＡ−Ｓｅｑの結果に基づいて、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）のＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＣＭＴＭ７遺伝子の発現量を、ニボルマブの投与が有効であった患者（ＰＲ又はＬＳＤ）と、ニボルマブの投与が有効でなかった患者（ＰＤ）のそれぞれについて解析した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は１００万リードあたりのＣＭＴＭ７のリード数である。図１２中の数値はｐ値を示す。
[Experimental Example 6]
(Examination of CMTM7)
<< scRNA-Seq >>
In FIG. 12, based on the results of RNA-Seq of Experimental Example 1, administration of nivolumab was effective in determining the expression level of the CMTM7 gene in CD8-positive T cells before and after administration of nivolumab (Pre) and after administration of nivolumab (Post). It is a graph which shows the result of analysis for each of the patient (PR or LSD) and the patient (PD) who was not effective in administration of nivolumab. The vertical axis of the graph is the number of CMTM7 reads per million reads. The numerical value in FIG. 12 indicates the p value.
その結果、ニボルマブ投与前（Ｐｒｅ）及びニボルマブ投与後（Ｐｏｓｔ）において、ニボルマブの投与が有効であった患者は、ニボルマブの投与が有効でなかった患者よりもＣＭＴＭ７遺伝子の発現量が有意に高いことが明らかとなった。したがって、ＣＭＴＭ７遺伝子又はＣＭＴＭ７タンパク質は、ニボルマブの投与の有効性を予測するマーカーとして使用することができる。 As a result, before and after nivolumab administration (Pre) and after nivolumab administration (Post), patients who were effective with nivolumab had significantly higher expression levels of the CMTM7 gene than those who were not effective with nivolumab. Became clear. Therefore, the CMTM7 gene or CMTM7 protein can be used as a marker to predict the efficacy of administration of nivolumab.
《公開データベースを用いた予後解析》
公開データベースであるＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を用いて、ＣＭＴＭ７遺伝子の発現とメラノーマ（Ｓｋｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｍｅｌａｎｏｍａ）患者の予後との関連性を検討した。具体的には、ＣＤ８遺伝子及びＣＭＴＭ７遺伝子の発現量に基づいて、各メラノーマ患者を（ｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＭＴＭ７遺伝子高発現群、（ｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＭＴＭ７遺伝子低発現群、（ｉｉｉ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＭＴＭ７遺伝子高発現群、（ｉｖ）ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＭＴＭ７遺伝子低発現群、の４群に分け、予後解析を行った。
<< Prognosis analysis using public database >>
The public database, The Cancer Genome Atlas (TCGA), was used to examine the association between CMTM7 gene expression and the prognosis of Kin Cutaneous melanoma patients. Specifically, based on the expression levels of the CD8 gene and the CMTM7 gene, (i) CD8A gene high expression group, CMTM7 gene high expression group, (ii) CD8A gene high expression group, CMTM7 gene low expression group, (i) The prognosis was analyzed by dividing into four groups: iii) CD8A gene low expression and CMTM7 gene high expression group, and (iv) CD8A gene low expression and CMTM7 gene low expression group.
図１３は、メラノーマ患者の予後解析の結果を示すグラフである。図１３中、「ＣＤ８Ａ＋／ＣＭＴＭ７＋」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＭＴＭ７遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ＋／ＣＭＴＭ７−」は、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＭＴＭ７遺伝子低発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ−／ＣＭＴＭ７＋」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＭＴＭ７遺伝子高発現群の結果であることを示し、「ＣＤ８Ａ−／ＣＭＴＭ７−」は、ＣＤ８Ａ遺伝子低発現、ＣＭＴＭ７遺伝子低発現群の結果であることを示す。 FIG. 13 is a graph showing the results of prognosis analysis of melanoma patients. In FIG. 13, "CD8A + / CMTM7 +" indicates the result of the CD8A gene high expression and CMTM7 gene high expression group, and "CD8A + / CMTM7-" is the result of the CD8A gene high expression and CMTM7 gene low expression group. "CD8A- / CMTM7 +" indicates that it is the result of the CD8A gene low expression and CMTM7 gene high expression group, and "CD8A- / CMTM7-" indicates that the CD8A gene low expression and CMTM7 gene low expression group. It is shown that it is the result of.
その結果、ＣＤ８Ａ遺伝子高発現、ＣＭＴＭ７遺伝子高発現群の予後が最も良好であることが明らかとなった。 As a result, it was clarified that the prognosis of the CD8A gene high expression group and the CMTM7 gene high expression group was the best.
本発明によれば、免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測する新たな技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a new technique for predicting the effectiveness of administration of an immune checkpoint inhibitor.
Claims (8)
前記癌患者由来の生体試料における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定する工程を含み、
前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはタンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはタンパク質を含み、
前記発現量が前記有効性を予測するためのデータであり、前記発現量が基準値よりも高いことが、前記癌患者への前記免疫チェックポイント阻害薬の投与が有効であることを示す、方法。 A method of collecting data to predict the effectiveness of administration of immune checkpoint inhibitors to cancer patients.
The step of measuring the expression level of a marker gene or a marker protein in a biological sample derived from the cancer patient is included.
The marker gene or marker protein comprises a NELL2 gene or protein, an AMICA1 gene or protein, a CLEC11A gene or protein, a CLECL1 gene or protein, or a CMTM7 gene or protein.
The method for predicting the efficacy of the expression level, and indicating that the administration of the immune checkpoint inhibitor to the cancer patient is effective when the expression level is higher than the reference value. ..
（ｉ）ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＬＡＭＦ６遺伝子若しくはタンパク質、ＣＤ４４遺伝子若しくはタンパク質又はＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせ、又は、
（ｉｉ）ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質と、ＳＥＬＬ遺伝子若しくはタンパク質、ＩＬ７Ｒ遺伝子若しくはタンパク質又はＣＣＲ７遺伝子若しくはタンパク質との組み合わせ、を含む、請求項１に記載の方法。 The marker gene or marker protein
(I) Combination of NELL2 gene or protein with SLAMF6 gene or protein, CD44 gene or protein, IL7R gene or protein, or
(Ii) The method according to claim 1, wherein the AMICA1 gene or protein is combined with a SELL gene or protein, an IL7R gene or protein, or a CCR7 gene or protein.
ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＭＴＭ７遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマー、又は、
ＮＥＬＬ２遺伝子、ＡＭＩＣＡ１遺伝子、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはＣＭＴＭ７遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを含む、癌患者への免疫チェックポイント阻害薬の投与の有効性を予測するためのキット。 Specific binding substances for NELL2 protein, AMICA1 protein, CLEC11A protein, CLECL1 protein or CMTM7 protein,
Primer that amplifies the cDNA of NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene, or
A kit for predicting the efficacy of administration of immune checkpoint inhibitors to cancer patients, which comprises a probe that hybridizes to the mRNA of the NELL2 gene, AMICA1 gene, CLEC11A gene, CLECL1 gene or CMTM7 gene.
ＣＤ８遺伝子のｃＤＮＡを増幅するプライマー、又は、
ＣＤ８遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするプローブを更に含む、請求項５に記載のキット。 A specific binding agent for the CD8 protein,
A primer that amplifies the cDNA of the CD8 gene, or
The kit of claim 5, further comprising a probe that hybridizes to the mRNA of the CD8 gene.
被験物質の存在下でＣＤ８陽性Ｔ細胞をインキュベートする工程と、
前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定する工程と、を含み、
前記マーカー遺伝子又はマーカータンパク質が、ＮＥＬＬ２遺伝子若しくはタンパク質、ＡＭＩＣＡ１遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣ１１Ａ遺伝子若しくはタンパク質、ＣＬＥＣＬ１遺伝子若しくはタンパク質又はＣＭＴＭ７遺伝子若しくはタンパク質を含み、
前記発現量が、前記被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇したことが、前記被験物質が抗癌剤であることを示す、方法。 It is a screening method for anticancer drugs.
Incubating CD8-positive T cells in the presence of the test substance,
Including a step of measuring the expression level of a marker gene or a marker protein in the CD8-positive T cells.
The marker gene or marker protein comprises a NELL2 gene or protein, an AMICA1 gene or protein, a CLEC11A gene or protein, a CLECL1 gene or protein, or a CMTM7 gene or protein.
A method in which an increase in the expression level as compared with the expression level in the absence of the test substance indicates that the test substance is an anticancer agent.
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|---|---|---|---|
| JP2020037980A JP2021136934A (en) | 2020-03-05 | 2020-03-05 | Method for collecting data for predicting administration effectiveness of immune checkpoint inhibitor to cancer patient |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2020037980A JP2021136934A (en) | 2020-03-05 | 2020-03-05 | Method for collecting data for predicting administration effectiveness of immune checkpoint inhibitor to cancer patient |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023076701A3 (en) * | 2021-10-29 | 2023-06-08 | La Jolla Institute For Immunology | Methods for modulating an immune response to cancer or tumor celts |
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2020
- 2020-03-05 JP JP2020037980A patent/JP2021136934A/en active Pending
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