JP2021134165A - Liberibacter bacteria growth control agent and method for controlling the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カンキツグリーニング病などの植物病害を引き起こすリベリバクター属細菌（Liberibacter）の増殖を阻害または促進するための増殖制御剤およびその制御方法に関する。 The present invention relates to a growth control agent for inhibiting or promoting the growth of Liberibacter, which causes plant diseases such as citrus greening disease, and a method for controlling the growth.
カンキツグリーニング病（citrus greening；huanglongbing）は、カンキツに壊滅的な被害を及ぼす病害である。カンキツグリーニング病は、篩部局在性の細菌であるカンジダタス・リベリバクター属（Candidatus Liberibacter spp.）細菌（以下「リベリバクター属細菌」ともいう。）によって引き起こされる（非特許文献1）。なかでも、カンジタダス・リベリバクター・アシアティクス（Candidatus Liberibacter asiaticus；以下、「Las」ともいう。）は、アジアを中心に、カンキツグリーニング病の主要な病原細菌となっている。 Citrus greening (huanglongbing) is a disease that causes catastrophic damage to citrus. Citrus greening disease is caused by Candidatus Liberibacter spp. Bacteria (hereinafter, also referred to as "Liberibacter spp."), Which are sieving-localized bacteria (Non-Patent Document 1). Among them, Candidatus Liberibacter asiaticus (hereinafter, also referred to as "Las") is a major pathogenic bacterium of citrus greening disease, mainly in Asia.
カンキツグリーニング病は、世界におけるカンキツ生産に多大な被害をもたらしている（非特許文献2）。日本では現在、鹿児島県の徳之島、沖永良部島および与論島と沖縄県全域で発生が確認されており、カンキツ主要産地への侵入を警戒している。しかしながら、この病原細菌の生物学的な特徴や病原性に関する知見はごくわずかであり、さらにこの病害に対する宿主植物の生化学的な応答や抵抗性についての情報も限られている。そのため、抵抗性品種の育種や治療薬等の防除技術の開発は、ほとんど進展していない。 Citrus greening disease causes great damage to citrus production in the world (Non-Patent Document 2). In Japan, outbreaks have been confirmed in Tokunoshima, Okinoerabujima and Yoronjima in Kagoshima Prefecture, and throughout Okinawa Prefecture, and we are wary of invasion into major citrus producing areas. However, little is known about the biological characteristics and pathogenicity of this pathogenic bacterium, and there is limited information on the biochemical response and resistance of the host plant to this disease. Therefore, breeding of resistant varieties and development of control techniques such as therapeutic agents have hardly progressed.
また、同じリベリバクター属細菌として、近年、カンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Candidatus Liberibacter solanacearum；以下「Lso」ともいう。）が新たに発見されている。本細菌は、アメリカ合衆国、メキシコ、グアテマラ、ホンジュラス、ニカラグアおよびニュージーランドにおいて、ジャガイモの塊茎部（芋）に縞状の病徴を示すゼブラチップ病を引き起こすことが報告されている（非特許文献3）。加えて、2010年以降は、欧州のフィンランド、ノルウェー、スウェーデン、フランスおよびスペインにおいて、セリ科に属するニンジンおよびセロリに対し、葉の脱色化ならびに茎および根の矮化といった病徴を引き起こすことが報告されている（非特許文献4）。 In recent years, Candidatus Liberibacter solanacearum (hereinafter also referred to as "Lso") has been newly discovered as the same bacterium of the genus Liberibacter. This bacterium has been reported to cause zebrachip disease showing striped symptoms on potato tubers (potatoes) in the United States, Mexico, Guatemala, Honduras, Nicaragua and New Zealand (Non-Patent Document 3). In addition, since 2010, it has been reported that carrots and celery belonging to the Umbelliferae family cause symptoms such as decolorization of leaves and dwarfing of stems and roots in Finland, Norway, Sweden, France and Spain in Europe. (Non-Patent Document 4).
上述した病徴は、いずれも生理障害および虫害と区別することが難しい。また、ファイトプラズマによる病害とも似ており、さらなる発生拡大が懸念されている。そのため、栽培現場において、本病原菌による病害を早期に診断し、農薬等により適切な防除を行うことが必要である。しかし、本病原菌に対するオキシテトラサイクリン等を利用した抗生物質処理の薬剤処理の効果は低い。本病原菌に対する実用的かつ有効な防除技術は未だ無く、新規の防除技術の開発が急務である。 All of the above-mentioned symptoms are difficult to distinguish from physiological disorders and insect damage. In addition, it is similar to the disease caused by phytoplasma, and there is concern that the outbreak will spread further. Therefore, it is necessary to diagnose the disease caused by this pathogen at an early stage at the cultivation site and to appropriately control it with pesticides or the like. However, the effect of drug treatment of antibiotic treatment using oxytetracycline or the like on this pathogen is low. There is no practical and effective control technology for this pathogen, and there is an urgent need to develop a new control technology.
従来のカンキツグリーニング病を治療する技術として、非特許文献5には、ペニシリン系およびテトラサイクリン系の抗生物質をカンキツグリーニング病感染樹に処理することにより、病原菌の菌密度を低減させる方法が開示されている。しかし、この方法で処理した感染樹では、病原菌の菌密度は一時的にのみ低減し、その後は再び罹病化が進むため、根本的な治療には至っていない。 As a conventional technique for treating citrus greening disease, Non-Patent Document 5 discloses a method for reducing the bacterial density of pathogenic bacteria by treating a penicillin-based and tetracycline-based antibiotic in a citrus greening disease-infected tree. Has been done. However, in infected trees treated by this method, the density of pathogens decreases only temporarily, and then the disease progresses again, so that no radical treatment has been achieved.
また、特許文献1には、カンキツグリーニング病に特徴的な病徴を改善する作用のある鉄資材を処理する方法が開示されている。しかし、鉄資材を処理したカンキツグリーニング病感染樹では、病徴の改善は認められるものの、病原細菌に対する殺菌効果および静菌効果は認められず、根本的な治療には至っていない。
Further,
上述したように、従来の方法では、カンキツグリーニング病を根本的に治療することができない。また、カンキツグリーニング病原細菌であるリベリバクター属細菌は、難培養性細菌であり、カンキツグリーニング病の防除のための研究を進めるためには、リベリバクター属細菌を培養して増殖させる技術も求められている。 As mentioned above, conventional methods cannot radically treat citrus greening disease. In addition, the citrus greening pathogenic bacterium, Riberibacter bacterium, is a refractory bacterium, and in order to advance research for the control of citrus greening disease, a technique for culturing and growing the citrus greening bacterium is also required. ing.
そこで、本発明は、リベリバクター属細菌の増殖を阻害または促進させることができる増殖制御剤およびその増殖制御方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a growth control agent capable of inhibiting or promoting the growth of a bacterium belonging to the genus Rebellivator and a method for controlling the growth thereof.
本発明者らは、リベリバクター属細菌のゲノムに保存されている遺伝子から、メバロン酸経路がリベリバクター属細菌に特異的に保存されていると予測した。そこで、メバロン酸経路の代謝産物の産生に関与する酵素の阻害物質（たとえば、中間代謝産物であるメバロン酸産生に関与するHMG-CoA還元酵素の阻害物質であるスタチン類およびゲラニル二リン酸（Geranyl-PP）あるいはファルネシル二リン酸（Farnesyl-PP）産生の両生合成に関与するFarnesyl-PP合成酵素の阻害物質であるビスフォスフォネート類）をリベリバクター属細菌に処理したところ、リベリバクター属細菌の増殖が顕著に抑制されることを新たに見出した。また、メバロン酸代謝経路の中間物質または産生物質（たとえば、メバロン酸およびアブシジン酸）をリベリバクター属細菌に処理したところ、リベリバクター属細菌の増殖が促進されることを新たに見出した。 The present inventors predicted that the mevalonate pathway is specifically conserved in the bacterium of the genus Rebellivator from the genes conserved in the genome of the bacterium of the genus Rebellivator. Therefore, inhibitors of enzymes involved in the production of metabolites of the mevalonate pathway (for example, statins and geranyl diphosphate (Geranyl) which are inhibitors of HMG-CoA reductase involved in the production of mevalonate, which is an intermediate metabolite). -PP) or bisphosphonates, which are inhibitors of Farnesyl-PP synthase involved in the amphibious synthesis of farnesyl diphosphate (Farnesyl-PP) production) were treated with Rebellibacter bacteria, and the growth of Reberibacter bacteria Was newly found to be significantly suppressed. We also newly found that treatment of mevalonic acid metabolic pathway intermediates or producing substances (eg, mevalonic acid and absidic acid) with rebellivator bacteria promotes the growth of reberibacter bacteria.
すなわち、本発明者らは、リベリバクター属細菌にメバロン酸経路が存在することを新たに見出し、さらにリベリバクター属細菌のメバロン酸経路に作用する化合物を新たに見出した。また、本発明者らは、メバロン酸経路に作用する化合物が、リベリバクター属細菌の増殖を制御する作用を有することを新たに見出した。これまでリベリバクター属細菌の増殖能に作用する有効な薬剤は皆無であったが、本発明者らは、メバロン酸経路に作用する化合物を利用することで、リベリバクター属細菌の増殖を制御することができる方法を新たに見出した。 That is, the present inventors have newly found that a mevalonate pathway exists in a bacterium belonging to the genus Rebellivator, and further found a compound that acts on the mevalonate pathway of a bacterium belonging to the genus Riberibacter. In addition, the present inventors have newly found that a compound acting on the mevalonate pathway has an action of controlling the growth of bacteria of the genus Rebellivator. Until now, there has been no effective drug that acts on the growth ability of the bacterium of the genus Rebellivator, but the present inventors can control the growth of the bacterium of the genus Rebellivator by using a compound that acts on the mevalonate pathway. I found a new way to do it.
本発明は、メバロン酸経路の代謝を阻害する作用を有するメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸経路の代謝を促進する作用を有するメバロン酸経路促進剤のいずれかを有効成分として含有する、リベリバクター属細菌の増殖制御剤を提供する。 The present invention contains a mevalonate pathway inhibitor having an action of inhibiting the metabolism of the mevalonate pathway or a mevalonate pathway promoter having an action of promoting the metabolism of the mevalonate pathway as an active ingredient. Proliferation control agent for.
また本発明は、上記メバロン酸経路阻害剤が、スタチン系化合物およびビスフォスフォネート系化合物からなる群より選択される少なくとも1つである、上記増殖制御剤を提供する。 The present invention also provides the growth control agent, wherein the mevalonate pathway inhibitor is at least one selected from the group consisting of statin compounds and bisphosphonate compounds.
また本発明は、上記メバロン酸経路阻害剤が、ロバスタチン、プラバスタチン、アレンドロネート、イバンドロネートおよびリセドロネートからなる群より選択される少なくとも1つである、上記増殖制御剤を提供する。 The present invention also provides the growth control agent, wherein the mevalonate pathway inhibitor is at least one selected from the group consisting of lovastatin, pravastatin, alendronate, ibandronate and lysedronate.
また本発明は、上記メバロン酸経路促進剤がメバロン酸およびアブシジン酸からなる群より選択される少なくとも1つである、上記増殖制御剤を提供する。 The present invention also provides the growth control agent, wherein the mevalonate pathway promoter is at least one selected from the group consisting of mevalonic acid and abscisic acid.
さらに、本発明は、リベリバクター属細菌をメバロン酸経路の代謝を阻害する作用を有するメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸経路の代謝を促進する作用を有するメバロン酸経路促進剤で処理することを含む、リベリバクター属細菌の増殖を制御する方法を提供する。 Furthermore, the present invention comprises treating a bacterium belonging to the genus Rebellibacta with a mevalonate pathway inhibitor having an action of inhibiting the metabolism of the mevalonate pathway or a mevalonate pathway promoter having an action of promoting the metabolism of the mevalonate pathway. Provided is a method for controlling the growth of bacteria of the genus Rebellivator.
また本発明は、上記メバロン酸経路阻害剤が、スタチン系化合物およびビスフォスフォネート系化合物からなる群より選択される少なくとも1つである、上記のリベリバクター属細菌の増殖を制御する方法を提供する。 The present invention also provides a method for controlling the growth of the above-mentioned Rebellibacter bacterium, wherein the above-mentioned mevalonate pathway inhibitor is at least one selected from the group consisting of a statin-based compound and a bisphosphonate-based compound. ..
また本発明は、上記メバロン酸経路阻害剤が、ロバスタチン、プラバスタチン、アレンドロネート、イバンドロネートおよびリセドロネートからなる群より選択される少なくとも1つである、上記のリベリバクター属細菌の増殖を制御する方法を提供する。 The present invention also relates to a method for controlling the growth of the above-mentioned bacterium belonging to the genus Rebellivator, wherein the mevalonate pathway inhibitor is at least one selected from the group consisting of lovastatin, pravastatin, alendronate, ibandronate and resedronate. I will provide a.
また本発明は、上記メバロン酸経路促進剤が、メバロン酸およびアブシジン酸からなる群より選択される少なくとも1つである、上記のリベリバクター属細菌の増殖を制御する方法。 Further, the present invention is a method for controlling the growth of the above-mentioned bacterium belonging to the genus Rebellivator, wherein the above-mentioned mevalonate pathway promoter is at least one selected from the group consisting of mevalonic acid and abscisic acid.
本発明に係る増殖制御剤および方法を用いることにより、リベリバクター属細菌による感染樹中の病原細菌の増殖を阻害または抑制することができ、リベリバクター属細菌による植物病害の治療および防除が可能となる。また、本発明に係る増殖制御剤および方法を用いることにより、難培養性細菌であるリベリバクター属細菌を増殖させることができ、リベリバクター属細菌の検出および病害診断に寄与することができる。また、本発明に係る増殖制御剤および方法は、リベリバクター属細菌に関する研究にも貢献することができる。 By using the growth control agent and the method according to the present invention, it is possible to inhibit or suppress the growth of pathogenic bacteria in an infected tree by the bacterium of the genus Rebellivator, and it is possible to treat and control plant diseases caused by the bacterium of the genus Rebellivator. Further, by using the growth control agent and the method according to the present invention, it is possible to grow the bacterium belonging to the genus Rebellivator, which is a refractory bacterium, and it is possible to contribute to the detection of the bacterium belonging to the genus Rebellivator and the diagnosis of disease. In addition, the growth control agent and method according to the present invention can also contribute to research on bacteria of the genus Rebellivator.
本発明は、リベリバクター属細菌の増殖制御剤を提供する。 The present invention provides a growth control agent for a bacterium belonging to the genus Rebellivator.
本明細書において、リベリバクター属細菌とは、カンジダタス・リベリバクター属（Candidatus Liberibacter spp.）細菌のことをいう。リベリバクター属細菌は、多くがカンキツグリーニング病などの植物病害を引き起こす病原細菌として知られている。リベリバクター属細菌には、たとえばカンジタダス・リベリバクター・アシアティクス（Candidatus Liberibacter asiaticus；Las）、カンジダタス・リベリバクター・ソラナケアルム（Candidatus Liberibacter solanacearum；Lso）、カンジダタス・リベリバクター・アメリカヌス（Candidatus Liberibacter americanus）、カンジダタス・リベリバクター・アフリカヌス（Candidatus Liberibacter africanus）、カンジダタス・リベリバクター・エウロパエウス（Candidatus Liberibacter europaeus）およびカンジダタス・リベリバクター・クレセンス（Candidatus Liberibacter crescens）などが含まれる。 As used herein, the bacterium belonging to the genus Liberibacter refers to a bacterium belonging to the genus Candidatus Liberibacter spp. Bacteria of the genus Riberibacter are often known as pathogenic bacteria that cause plant diseases such as citrus greening disease. Bacteria of the genus Liberibacter include, for example, Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), Candidatus Liberibacter solanacearum (Lso), Candidatus Liberibacter solanacearum (Lso), Candidatus Liberibacter Americanus (Candidatus) Includes Africanus (Candidatus Liberibacter africanus), Candidatus Liberibacter europaeus and Candidatus Liberibacter crescens.
本明細書において、「リベリバクター属細菌の増殖を制御する」とは、リベリバクター属細菌の増殖を阻害または抑制すること、ならびにリベリバクター属細菌の増殖を促進することの両方が含まれる。本明細書において、「リベリバクター属細菌の増殖を阻害または抑制する」とは、本発明の増殖制御剤で処理していない無処置のリベリバクター属細菌と比較して、リベリバクター属細菌の増殖速度が低下すること、およびリベリバクター属細菌の倍加時間が長くなることを含む。本明細書において、「リベリバクター属細菌の増殖を促進する」とは、本発明の増殖制御剤で処理していない無処置のリベリバクター属細菌と比較して、リベリバクター属細菌の増殖速度が上昇すること、およびリベリバクター属細菌の倍加時間が短くなることを含む。 As used herein, "controlling the growth of a bacterium belonging to the genus Rebellivator" includes both inhibiting or suppressing the growth of a bacterium belonging to the genus Rebellivator and promoting the growth of a bacterium belonging to the genus Rebellivator. As used herein, "inhibiting or suppressing the growth of a bacterium belonging to the genus Rebellivator" means that the growth rate of the bacterium belonging to the genus Rebellivator is reduced as compared with an untreated bacterium belonging to the genus Rebellivator which has not been treated with the growth control agent of the present invention. This includes increasing the doubling time of the bacterium of the genus Rebellivator. As used herein, "promoting the growth of a bacterium belonging to the genus Rebellivator" means that the growth rate of the bacterium belonging to the genus Rebellivator is increased as compared with an untreated bacterium belonging to the genus Rebellivator which has not been treated with the growth control agent of the present invention. , And shortening the doubling time of the bacterium of the genus Rebellivator.
本発明の増殖制御剤は、メバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸経路促進剤のいずれかを有効成分として含有する。本明細書において、メバロン酸経路（Mevalonic pathway）は、図1に示すように、アセチルCoA（Acetyl-CoA）からファルネシル二リン酸（Farnesyl-PP）を合成する生合成経路である。ファルネシル二リン酸は、テルペノイドおよびステロイド合成に用いられる。 The growth control agent of the present invention contains either a mevalonate pathway inhibitor or a mevalonate pathway promoter as an active ingredient. In the present specification, the mevalonic pathway is a biosynthetic pathway for synthesizing farnesyl diphosphate (Farnesyl-PP) from acetyl-CoA (Acetyl-CoA), as shown in FIG. Farnesyl diphosphate is used for terpenoid and steroid synthesis.
メバロン酸経路阻害剤は、メバロン酸経路の代謝を阻害する作用を有する薬剤であり、任意の薬剤であってもよい。メバロン酸経路阻害剤は、たとえばメバロン酸経路の代謝を促進することに関与する各種分子および酵素の阻害剤であることができる。メバロン酸経路の代謝を促進する分子および酵素は、たとえばアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、HMG-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、5-ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼおよびファルネシル二リン酸シンターゼなどが知られている。 The mevalonate pathway inhibitor is a drug having an action of inhibiting metabolism of the mevalonate pathway, and may be any drug. Mevalonate pathway inhibitors can be, for example, inhibitors of various molecules and enzymes involved in promoting metabolism of the mevalonate pathway. Molecules and enzymes that promote the metabolism of the mevalonate pathway include, for example, acetyl CoA acetyl transferase, HMG-CoA synthase, HMG-CoA reductase, mevalonate kinase, 5-phosphomevalonate kinase, diphosphomevalonate decarboxylase and farnesyl diphosphate synthase. It has been known.
メバロン酸経路阻害剤には、たとえばスタチン系化合物、ビスフォスフォネート系化合物およびこれらの誘導体ならびにこれらの薬理学的に許容される塩などを用いることができる。スタチン系化合物には、たとえばロバスタチン、プラバスタチン、メバスタチンおよびこれらの誘導体ならびにこれらの薬理学的に許容される塩などが含まれる。ビスフォスフォネート系化合物には、たとえばアレンドロン酸（アレンドロネート）、イバンドロン酸（イバンドロネート）、リセドロン酸（リセドロネート）、エチドロン酸（エチドロネート）、ミノドロン酸（ミノドロネート）、ゾレドロン酸（ゾレドロネート）、パミドロン酸（パミドロネート）およびこれらの誘導体ならびにこれらの薬理学的に許容される塩などが含まれる。 As the mevalonate pathway inhibitor, for example, statin compounds, bisphosphonate compounds and derivatives thereof, and pharmacologically acceptable salts thereof can be used. Statin compounds include, for example, lovastatin, pravastatin, mevastatin and derivatives thereof and pharmacologically acceptable salts thereof. Bisphosphonate compounds include, for example, alendronate (alendronate), ibandronic acid (ibandronate), risedronic acid (risedronate), etidronic acid (etidronate), minodronic acid (minodronate), zoledronic acid (zoledronate). , Pamidronate and derivatives thereof as well as pharmacologically acceptable salts thereof and the like.
メバロン酸経路促進剤は、メバロン酸経路の代謝を促進する作用を有する薬剤であり、任意の薬剤であってもよい。メバロン酸経路促進剤は、メバロン酸経路促進剤は、メバロン酸経路により産生される化合物およびその誘導体ならびにその薬理学的に許容される塩であることができる。また、メバロン酸経路促進剤は、メバロン酸経路の代謝を阻害することに関与する各種分子および酵素の阻害剤であることができる。メバロン酸経路促進剤には、たとえばメバロン酸、アブシジン酸（アブシシン酸ともいう。）およびこれらの誘導体ならびにこれらの薬理学的に許容される塩などを用いることができる。 The mevalonate pathway promoter is a drug having an action of promoting metabolism of the mevalonate pathway, and may be any drug. The mevalonate pathway promoter can be a compound produced by the mevalonate pathway, a derivative thereof, and a pharmacologically acceptable salt thereof. In addition, the mevalonate pathway promoter can be an inhibitor of various molecules and enzymes involved in inhibiting the metabolism of the mevalonate pathway. As the mevalonate pathway promoter, for example, mevalonic acid, abscisic acid (also referred to as abscisic acid) and derivatives thereof, and pharmacologically acceptable salts thereof can be used.
本発明の増殖制御剤は、メバロン酸経路阻害剤を1種類または複数種類含有してもよい。本発明の増殖制御剤は、メバロン酸経路阻害剤を含有することにより、リベリバクター属細菌の増殖を阻害または抑制することができる。 The growth control agent of the present invention may contain one or more types of mevalonate pathway inhibitors. By containing a mevalonate pathway inhibitor, the growth control agent of the present invention can inhibit or suppress the growth of Rebellibacter bacteria.
本発明の増殖制御剤は、メバロン酸経路促進剤を1種類または複数種類含有してもよい。本発明の増殖制御剤は、メバロン酸経路促進剤を含有することにより、リベリバクター属細菌の増殖を促進することができる。 The growth control agent of the present invention may contain one or more types of mevalonate pathway promoters. By containing the mevalonate pathway promoter, the growth control agent of the present invention can promote the growth of Bacteria of the genus Rebellivator.
本発明の増殖制御剤は、上述したメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸経路促進剤以外の成分をさらに含有してもよい。本発明の増殖制御剤は、たとえば溶媒、担体、界面活性剤、乳化剤、pH調整剤、分散剤、増量剤、着色剤、安定剤およびその他の添加剤などの任意の成分をさらに含有することができる。 The growth control agent of the present invention may further contain components other than the above-mentioned mevalonate pathway inhibitor or mevalonate pathway promoter. The growth control agent of the present invention may further contain any component such as a solvent, a carrier, a surfactant, an emulsifier, a pH adjuster, a dispersant, a bulking agent, a colorant, a stabilizer and other additives. can.
本発明の増殖制御剤は、粉末、顆粒、懸濁液、溶液、エマルジョン、エアロゾル、含浸顆粒、ペーストおよびカプセルなどの任意の形態であることができる。 The growth control agent of the present invention can be in any form such as powders, granules, suspensions, solutions, emulsions, aerosols, impregnated granules, pastes and capsules.
本発明はまた、リベリバクター属細菌をメバロン酸経路の代謝を阻害する作用を有するメバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸経路の代謝を促進する作用を有するメバロン酸経路促進剤で処理することを含む、リベリバクター属細菌の増殖を制御する方法を提供する。すなわち、本発明の方法は、上述した増殖制御剤を処理することを含む、リベリバクター属細菌の増殖を制御する方法を提供する。 The present invention also comprises treating a bacterium belonging to the genus Rebellivator with a mevalonate pathway inhibitor having an action of inhibiting the metabolism of the mevalonate pathway or a mevalonate pathway promoter having an action of promoting the metabolism of the mevalonate pathway. Provided is a method for controlling the growth of a genus bacterium. That is, the method of the present invention provides a method for controlling the growth of a bacterium belonging to the genus Rebellivator, which comprises treating the above-mentioned growth control agent.
本明細書において、リベリバクター属細菌を「メバロン酸経路阻害剤またはメバロン酸経路促進剤で処理する」および「増殖制御剤を処理する」には、メバロン酸経路阻害剤、メバロン酸経路促進剤または増殖制御剤をリベリバクター属細菌と接触させることを含む。たとえば、メバロン酸経路阻害剤、メバロン酸経路促進剤または増殖制御剤を、植物に投与すること、および培地に添加することなどを含む。たとえば、増殖制御剤を処理することには、リベリバクター属細菌に感染している植物あるいは感染している可能性のある植物に増殖制御剤を投与すること、およびリベリバクター属細菌を培養するための培地に増殖制御剤を添加することなどが含まれる。植物に増殖制御剤を投与する方法としては、たとえば増殖制御剤の水溶液などを植物に噴霧する方法、植物体内で増殖抑制剤を分泌（合成）させる方法、増殖制御剤を植物に浸透させる方法および増殖制御剤を植物の根部または土壌に処理する方法などを用いることができる。植物体内で増殖抑制剤を分泌（合成）させる方法としては、たとえば増殖制御剤を合成することが可能な遺伝子（たとえば有効成分がスタチン系化合物であった場合に、スタチン合成遺伝子など）を保持する組換ウイルス等を用いて、植物体内で増殖制御剤（たとえばスタチン系化合物など）を合成させる方法を用いることができる。 In the present specification, "treating a Mevalonate pathway inhibitor or a mevalonate pathway promoter" and "treating a growth control agent" include a mevalonate pathway inhibitor, a mevalonate pathway promoter or a growth. Includes contacting the control agent with bacteria of the genus Rebellivator. For example, administration of a mevalonate pathway inhibitor, a mevalonate pathway promoter or a growth control agent to a plant, and addition to a medium are included. For example, to treat a growth control agent, administer the growth control agent to a plant infected with or may be infected with a bacterium of the genus Rebellivator, and a medium for culturing the bacterium of the genus Rebellivator. Includes the addition of a growth control agent to the culture medium. Examples of the method of administering the growth control agent to the plant include a method of spraying an aqueous solution of the growth control agent on the plant, a method of secreting (synthesizing) the growth inhibitor in the plant, a method of infiltrating the growth control agent into the plant, and a method of infiltrating the plant. A method of treating the root of a plant or the soil with a growth control agent can be used. As a method for secreting (synthesizing) a growth inhibitor in a plant, for example, a gene capable of synthesizing a growth control agent (for example, when the active ingredient is a statin compound, a statin synthesis gene, etc.) is retained. A method of synthesizing a growth control agent (for example, a statin compound) in a plant using a recombinant virus or the like can be used.
本発明の方法では、メバロン酸経路阻害剤を含有する増殖制御剤を植物に処理することにより、植物におけるリベリバクター属細菌の増殖を阻害または抑制することができる。したがって、本発明の増殖制御剤および方法は、リベリバクター属細菌を原因とする植物病害の治療および／または予防に用いることができる。 In the method of the present invention, by treating a plant with a growth control agent containing a mevalonate pathway inhibitor, it is possible to inhibit or suppress the growth of Rebellibacter bacteria in the plant. Therefore, the growth control agents and methods of the present invention can be used for the treatment and / or prevention of plant diseases caused by bacteria of the genus Rebellivator.
本発明において、植物病害の治療および／または予防とは、植物に関連する分野において植物病害の治療および／または予防として観念されている一般的概念をさす。たとえば、「治療」には、感染によって生じた植物体の成長速度の低下を改善すること、感染した部位における病徴を改善すること、病徴の発症を遅延させること、および病徴の進行を防止することなどが含まれる。「予防」には、病原細菌を防除すること、病原細菌が植物内に侵入して病気を発症させることを阻止すること、病原細菌において病気を発症させる能力を失わせること、および感染した部位における病徴の再発を防ぐことなどが含まれる。 In the present invention, the treatment and / or prevention of plant diseases refers to a general concept considered as the treatment and / or prevention of plant diseases in the field related to plants. For example, "treatment" includes improving the slowdown of plant growth caused by infection, improving the symptoms at the infected site, delaying the onset of the symptoms, and the progression of the symptoms. Includes prevention and so on. "Prevention" includes controlling pathogenic bacteria, preventing pathogenic bacteria from invading plants and causing disease, losing the ability of pathogenic bacteria to develop disease, and at infected sites. This includes preventing the recurrence of symptoms.
本発明の増殖制御剤および方法を適用する対象の植物には、リベリバクター属細菌が感染し得る植物であれば特に限定されないが、たとえば果樹、農作物、野菜、観葉植物およびこれら以外の樹などが挙げられる。 The target plant to which the growth control agent and the method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a plant that can be infected with the bacterium of the genus Rebellivator, and examples thereof include fruit trees, agricultural products, vegetables, foliage plants and other trees. Be done.
本発明の方法では、メバロン酸経路阻害剤を含有する増殖制御剤を培地に添加することにより、培地上でのリベリバクター属細菌の増殖を阻害または抑制することができる。また、メバロン酸経路促進剤を含有する増殖制御剤を培地に添加することにより、培地上でのリベリバクター属細菌の増殖を促進することができる。培地は、たとえばリベリバクター属細菌を生育させるための選択培地であってもよい。したがって、本発明の増殖制御剤および方法は、培養によるリベリバクター属細菌の検出および病害診断に寄与することができる。 In the method of the present invention, by adding a growth control agent containing a mevalonate pathway inhibitor to the medium, the growth of Rebellibacter bacteria on the medium can be inhibited or suppressed. In addition, by adding a growth control agent containing a mevalonate pathway promoter to the medium, the growth of Rebellibacter bacteria on the medium can be promoted. The medium may be, for example, a selective medium for growing a bacterium belonging to the genus Riberibacter. Therefore, the growth control agent and method of the present invention can contribute to the detection of Bacteria of the genus Rebellivator and the diagnosis of diseases by culturing.
培地または植物におけるリベリバクター属細菌の有無または増減は、培地片あるいは葉片からDNAを抽出し、リベリバクター属細菌に特異的なプライマーを用いてPCR等によりDNA増幅させることにより確認することができる。 The presence or absence or increase / decrease of the bacterium belonging to the genus Rebellivator in the medium or the plant can be confirmed by extracting the DNA from the medium piece or the leaf piece and amplifying the DNA by PCR or the like using a primer specific to the bacterium belonging to the genus Rebellivator.
培地上のリベリバクター属細菌は、in situハイブリダイゼーション法などを用いて菌を色素染色し、顕微鏡観察することによって可視化することができる。また、ELIZA法および電子顕微鏡観察などによって細菌の有無を確認することも可能である。 Bacteria belonging to the genus Rebellivator on the medium can be visualized by dye-staining the bacteria using an in situ hybridization method or the like and observing them under a microscope. It is also possible to confirm the presence or absence of bacteria by the ELIZA method or electron microscope observation.
本発明の方法に用いる培地には、特に限定されず、任意の培地を用いることができる。たとえば、リベリバクター属細菌を培養するための培地および選択培地などであってもよい。リベリバクター属細菌を培養するための培地として、MIG培地（非特許文献8）、BBM3培地（非特許文献9）、LiberA培地（非特許文献10）およびジュースを添加したKB培地（非特許文献11）などが報告されている。 The medium used in the method of the present invention is not particularly limited, and any medium can be used. For example, it may be a medium for culturing a bacterium belonging to the genus Rebellivator and a selective medium. MIG medium (Non-Patent Document 8), BBM3 medium (Non-Patent Document 9), LiberA medium (Non-Patent Document 10), and KB medium to which juice is added (Non-Patent Document 11) Etc. have been reported.
また、本発明の方法に用いる培地は、特許文献2に記載の培地であってもよい。この培地は、リベリバクター属細菌を培養および検出するための培地であり、グルコースおよび／またはグルコースを含むオリゴ糖と、ケトグルタル酸とを含有する。培地は、グルコースおよびグルコースを含むオリゴ糖以外の糖質をさらに含有してもよい。また、培地は、CoA、CoA誘導体、グリセロリン酸塩およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも1つをさらに含有してもよい。また、培地は、バリン、イソロイシン、プロリン、オルニチン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンおよびシステインからなる群より選択される少なくとも1つをさらに含有してもよい。培地は、抗生物質をさらに含有してもよい。 Further, the medium used in the method of the present invention may be the medium described in Patent Document 2. This medium is a medium for culturing and detecting Rebellibacter bacteria, and contains glucose and / or oligosaccharides containing glucose and ketoglutaric acid. The medium may further contain glucose and sugars other than glucose-containing oligosaccharides. In addition, the medium may further contain at least one selected from the group consisting of CoA, CoA derivatives, glycerophosphate and glycerol. The medium may further contain at least one selected from the group consisting of valine, isoleucine, proline, ornithine, tyrosine, tryptophan, histidine and cysteine. The medium may further contain antibiotics.
本発明の増殖制御剤および方法は、リベリバクター属細菌が引き起こす様々な植物病害、たとえばカンキツグリーニング病、ジャガイモゼブラチップ病およびニンジンLso病などの治療および防除に有用である。たとえば、これらの病害の発生地において、本発明の増殖制御剤を感染樹に処理することにより、病徴の改善を行うことができる。また、これらの病害の発生地において、本発明の増殖制御剤を健全樹に処理することにより、感染樹の新たな発生を防ぐことができる。さらに、上述した病害が発生していない地域（未発生地）において、本発明の増殖制御剤を健全樹に処理することにより、病原細菌による病害を予防することができる。このように、本発明を用いることにより、リベリバクター属細菌による感染の拡大のリスクを最小限に抑えることができる。 The growth control agents and methods of the present invention are useful for the treatment and control of various plant diseases caused by bacteria of the genus Riberibacter, such as citrus greening disease, potato zebrachip disease and carrot Lso disease. For example, in the place where these diseases occur, the symptoms can be improved by treating the infected tree with the growth control agent of the present invention. In addition, by treating healthy trees with the growth control agent of the present invention in the places where these diseases occur, it is possible to prevent new outbreaks of infected trees. Furthermore, in areas where the above-mentioned diseases have not occurred (unoccurred areas), the diseases caused by pathogenic bacteria can be prevented by treating healthy trees with the growth control agent of the present invention. Thus, by using the present invention, the risk of spreading infection by bacteria of the genus Rebellivator can be minimized.
（リベリバクター属細菌におけるメバロン酸経路の同定）
本発明者らは、カンキツグリーニング病原細菌であるリベリバクター属細菌のゲノムに保存されている遺伝子について鋭意検討した。その結果、リベリバクター属細菌が図1に示すメバロン酸経路を有していることを見出した。本経路は、植物や糸状菌に存在することが知られており、またこれまでにいくつかの細菌で発見されているものの、植物病原細菌において本経路を有するものは知られていない。本発明者らは、リベリバクター属細菌が上記メバロン酸経路を有しているならば、本経路の代謝を制御することにより当該の病原細菌の増殖を制御することができると推測した。そして、リベリバクター属細菌の増殖を制御することができれば、リベリバクター属細菌が引き起こす植物病害であるカンキツグリーニング病、ジャガイモゼブラチップ病およびニンジンLso病等を抑制することが可能となると考えた。
(Identification of the mevalonate pathway in Bacteria of the genus Riberibacter)
The present inventors have diligently investigated genes conserved in the genome of the citrus greening pathogenic bacterium, the genus Rebellivacter. As a result, it was found that the bacterium belonging to the genus Riberibacter has the mevalonate pathway shown in FIG. This pathway is known to exist in plants and filamentous fungi, and although it has been found in several bacteria so far, none of the phytopathogenic bacteria having this pathway is known. The present inventors speculated that if a bacterium belonging to the genus Rebellibacta has the above-mentioned mevalonate pathway, the growth of the pathogenic bacterium can be controlled by controlling the metabolism of this pathway. Then, it was considered that if the growth of the bacterium belonging to the genus Rebellivator could be controlled, it would be possible to suppress the plant diseases caused by the bacterium belonging to the genus Rebellivator, such as citrus greening disease, potato zebrachip disease, and carrot Lso disease.
（実施例１）
メバロン酸経路の代謝を阻害する物質（メバロン酸経路阻害剤）について、カンキツグリーニング病原細菌（リベリバクター属細菌）の増殖に対する効果を調べた。メバロン酸経路阻害剤には、スタチン系化合物（ロバスタチンおよびプラバスタチン）およびビスフォスフォネート系化合物（アレンドロネート、イバンドロネートおよびリセドロネート）を用いた。スタチン系化合物は、メバロン酸経路の中間代謝産物であるメバロン酸産生に関与するHMG-CoA還元酵素の阻害物質である。ビスフォスフォネート系化合物は、ゲラニル二リン酸（Geranyl-PP）産生およびファルネシル二リン酸（Farnesyl-PP）産生の両生合成に関与するファルネシル二リン酸シンターゼ（Farnesyl-PP合成酵素）の阻害物質である。以下の方法により、スタチン系化合物またはビスフォスフォネート系化合物をカンキツグリーニング病原細菌の選択培地に添加し、カンキツグリーニング病原細菌の培養を行った。
(Example 1)
The effect of a substance that inhibits the metabolism of the mevalonate pathway (mevalonate pathway inhibitor) on the growth of citrus greening pathogenic bacteria (Bacteria of the genus Riberibacter) was investigated. As the mevalonate pathway inhibitor, statin compounds (lovastatin and pravastatin) and bisphosphonate compounds (alendronate, ibandronate and resedronate) were used. Statins are inhibitors of HMG-CoA reductase involved in the production of mevalonic acid, an intermediate metabolite of the mevalonate pathway. Bisphosphonate compounds are inhibitors of farnesyl diphosphate synthase (Farnesyl-PP synthase) involved in the amphibious synthesis of geranyl diphosphate (Geranyl-PP) production and farnesyl diphosphate (Farnesyl-PP) production. Is. By the following method, a statin compound or a bisphosphonate compound was added to a selective medium for citrus greening pathogenic bacteria, and the citrus greening pathogenic bacteria were cultured.
非特許文献6に記載の方法を用いて、カンジタダス・リベリバクター・アシアティクスに感染しているラフレモン（Citrus jambhiri Lush）の罹病葉の中肋部を回収し、細断した後、バイオマッシャーIII（株式会社ニッピ）中で滅菌水400μLと共に摩砕および遠心（6,000g、2分）した。沈殿物のみを新たに滅菌水400μLで再懸濁し、培養に用いる菌液とした。 Using the method described in Non-Patent Document 6, the midribs of the diseased leaves of Citrus jambhiri Lush infected with Canditadas reberibacter asiatics are collected, shredded, and then Biomasher III (stock). Grinded and centrifuged (6,000 g, 2 minutes) with 400 μL of sterile water in Nippi). Only the precipitate was newly resuspended in 400 μL of sterilized water to prepare a bacterial solution used for culturing.
培地には、非特許文献7に記載の選択培地を用いた。具体的にはグルコース0.1g、フルクトース0.1g、スクロース 0.1g、デンプン0.1g、ケトグルタル酸0.1ｇ、MEM必須アミノ酸溶液500ml、MEM非必須アミノ酸溶液1ml,グルタミン0.1g、メチオニン0.1g、システイン0.1g、シスチン0.1g、グリセロリン酸ナトリウム0.5g、CoA 0.1g、グリセロール1mlおよびアガロース2gを蒸留水100mLに溶解した選択培地に、ロバスタチン、プラバスタチン、アレンドロネート、イバンドロネートまたはリセドロネートをそれぞれ終濃度10μMおよび１ｍMとなるように混合し、プラスチックシャーレを用いて培地を作製した。これらの培地中に、菌液を100μLずつ分注し、スプレッダーで広げた。培養を14日間行ったところ、グリーニング病原細菌由来のコロニーは見られなかった。培養14日後に培地の断片を切り出し、DNeasy Plant Mini Kit(株式会社キアゲン)を用いてDNAを抽出した。
As the medium, the selective medium described in Non-Patent Document 7 was used. Specifically, glucose 0.1 g, fructose 0.1 g, sculose 0.1 g, starch 0.1 g, ketoglutaric acid 0.1 g, MEM essential
抽出したDNAを用いて、非特許文献6に記載の方法により、グリーニング病原細菌特異的なプライマーセットを用いてリアルタイムPCR検定を行った。グリーニング病原細菌の増殖量はPCRによるDNA増幅量に基づき算出した。リアルタイムPCRはSYBR Premix ExTaqII (Tli RNaseH Plus)（タカラバイオ株式会社）を用いて定法で行った。その結果を図2および図3に示す。なお、図2および図3では、ダネット法（Dunnett's test）により統計解析を行った。図2では、P値が0.05未満であれば統計学的に有意であるとした。図3では、P値が0.01未満であれば統計学的に有意であるとした。図2に示すように、ロバスタチンまたはプラバスタチンを処理した場合には、処理しなかった場合（無処理）と比較して、検出された菌DNAの有意な低減が認められた。図3に示すように、アレンドロネート、イバンドロネートまたはリセドロネートを処理した場合には、処理しなかった場合（無処理）と比較して、検出された菌DNAの有意な低減が認められた。 Using the extracted DNA, real-time PCR assay was performed using a primer set specific to greening pathogens by the method described in Non-Patent Document 6. The amount of growth of greening pathogenic bacteria was calculated based on the amount of DNA amplification by PCR. Real-time PCR was performed by a conventional method using SYBR Premix ExTaqII (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio Inc.). The results are shown in FIGS. 2 and 3. In FIGS. 2 and 3, statistical analysis was performed by Dunnett's test. In FIG. 2, if the P value is less than 0.05, it is considered to be statistically significant. In FIG. 3, if the P value is less than 0.01, it is considered to be statistically significant. As shown in FIG. 2, when lovastatin or pravastatin was treated, a significant reduction in the detected bacterial DNA was observed as compared with the case where it was not treated (untreated). As shown in FIG. 3, when alendronate, ibandronate or resedronate was treated, a significant reduction in the detected bacterial DNA was observed as compared with the case where it was not treated (untreated). ..
（実施例２）
メバロン酸経路の代謝を促進する物質（メバロン酸経路促進剤）について、カンキツグリーニング病原細菌（リベリバクター属細菌）の増殖に対する効果を調べた。メバロン酸経路促進剤には、中間代謝産物であるメバロン酸および最終産物の一種であるアブシジン酸を用いた。以下の方法により、メバロン酸およびアブシジン酸をカンキツグリーニング病原細菌の選択培地に添加し、カンキツグリーニング病原細菌の培養を行った。
(Example 2)
The effect of a substance that promotes the metabolism of the mevalonate pathway (mevalonate pathway promoter) on the growth of citrus greening pathogenic bacteria (Bacteria of the genus Riberibacter) was investigated. As the mevalonate pathway promoter, mevalonic acid, which is an intermediate metabolite, and abscisic acid, which is a kind of final product, were used. Mevalonic acid and absidic acid were added to a selective medium for citrus greening pathogenic bacteria by the following method, and citrus greening pathogenic bacteria were cultivated.
非特許文献6に記載の技術を用いて、カンジタダス・リベリバクター・アシアティクスに感染しているラフレモンの罹病葉の中肋部を回収し、細断した後、バイオマッシャーIII（株式会社ニッピ）中で滅菌水400μLと共に摩砕および遠心（6,000g、2分）した。沈殿物のみを新たに滅菌水400μLで再懸濁し、培養に用いる菌液とした。 Using the technique described in Non-Patent Document 6, the midribs of the diseased leaves of rough lemon infected with Candidadus reveribacter asiatics were collected, shredded, and then in Biomasher III (Nippi Co., Ltd.). Grinded and centrifuged (6,000 g, 2 minutes) with 400 μL of sterile water. Only the precipitate was newly resuspended in 400 μL of sterilized water to prepare a bacterial solution used for culturing.
実施例1と同様の選択培地に、メバロン酸またはアブシジン酸をそれぞれ終濃度10μMとなるように混合し、プラスチックシャーレを用いて培地を作製した。これらの培地中に、菌液を100μLずつ分注し、スプレッダーで広げた。培養を14日間行ったところ、グリーニング病原細菌由来のコロニーは見られなかった。培養14日後に培地の断片を切り出し、DNeasy Plant Mini Kit(株式会社キアゲン)を用いてDNAを抽出した。 Mevalonic acid or abscisic acid were mixed with the same selective medium as in Example 1 so as to have a final concentration of 10 μM, respectively, and a medium was prepared using a plastic petri dish. In these media, 100 μL of the bacterial solution was dispensed and spread with a spreader. After 14 days of culturing, no colonies derived from greening pathogens were found. After 14 days of culturing, a fragment of the medium was cut out, and DNA was extracted using the DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen Co., Ltd.).
抽出したDNAを用いて、非特許文献6に記載の方法により、グリーニング病原細菌特異的なプライマーセットを用いてリアルタイムPCR検定を行った。グリーニング病原細菌の増殖量はPCRによるDNA増幅量に基づき算出した。リアルタイムPCRはSYBR Premix ExTaqII (Tli RNaseH Plus)（タカラバイオ株式会社）を用いて定法で行った。その結果を図4に示す。なお、図4では、ダネット法（Dunnett's test）により統計解析を行い、P値が0.05未満であれば統計学的に有意であるとした。図4に示すように、メバロン酸またはアブシジン酸を処理した場合には、処理しなかった場合（無処理）と比較して、検出された菌DNAの有意な増加が認められた。 Using the extracted DNA, real-time PCR assay was performed using a primer set specific to greening pathogens by the method described in Non-Patent Document 6. The amount of growth of greening pathogenic bacteria was calculated based on the amount of DNA amplification by PCR. Real-time PCR was performed by a conventional method using SYBR Premix ExTaqII (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio Inc.). The results are shown in Fig. 4. In Fig. 4, statistical analysis was performed by Dunnett's test, and if the P value was less than 0.05, it was considered to be statistically significant. As shown in FIG. 4, when mevalonic acid or abscisic acid was treated, a significant increase in the detected bacterial DNA was observed as compared with the case where it was not treated (untreated).
本発明は、リベリバクター属細菌が引き起こす病原細菌の治療および防除に利用可能である。また、本発明は、リベリバクター属細菌の検出および病害診断に利用可能である。 The present invention can be used for the treatment and control of pathogenic bacteria caused by Bacteria of the genus Rebellivator. The present invention can also be used for the detection and disease diagnosis of Bacteria of the genus Rebellivator.
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