JP2021132593A - Lipase derived from ricinus communis l., and dna encoding the same, vector, and transgenic plant body - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒマ由来のリパーゼ、及びそのリパーゼをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを有するベクター、前記ＤＮＡが導入された形質転換植物体に関するものである。 The present invention relates to a lipase derived from Hima, a DNA encoding the lipase, a vector having the DNA, and a transformed plant into which the DNA has been introduced.
ヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）の種子から搾油されるひまし油はヒドロキシ脂肪酸の1種であるリシノール酸を８０〜９０％程度含み、植物由来の機能性プラスチック原材料として大きな位置を占め、工業用途で有用視されている。
一方、ヒマ種子は毒性の高いリシンと呼ばれるタンパク質を含み、限られた地域でのみ栽培されている。そのため、リシノール酸の生産量を高める目的として、ヒマ以外の作物によるリシノール酸生産が研究されている。その上で、リシノール酸を合成する遺伝子を同定し、他の植物に導入することにより、リシノール酸生産を増大させることを目的とし、ヒマにおけるリシノール酸合成経路が研究されてきた。
そして、リシノール酸の生産に関して、リシノール酸の前駆体であるオレイン酸に水酸基を付加し、リシノール酸を合成する酵素をコードするヒマの遺伝子ＦＡＨ１２が同定され、ヒマを代替する形質転換植物体を作出するには、リシノール酸を合成するヒマ由来の酵素の遺伝コードとしてＦＡＨ１２遺伝子の導入が有用であることが分かった（特許文献１参照）。尚、ヒマについては、ドラフトゲノムのＤＮＡの解析結果が開示されている（非特許文献１参照）。
また、植物種子の貯蔵脂質は大部分がトリアシルグリセロールであり、ヒマ種子においても合成されたリシノール酸はグリセロールと結合し、トリアシルグリセロールとして貯蔵される。高濃度にリシノール酸を蓄積する形質転換植物を作出するために、ヒマにおける脂肪酸合成経路およびＴＡＧ合成経路の詳細な研究が進められ、脂肪酸合成経路においては、水酸基を付加するＦＡＨ１２の導入に加えて、脂肪酸の伸長酵素であるＦＡＥ１および脂肪酸不飽和化酵素ＦＡＤ２、ＦＡＤ３を欠損させることでシロイヌナズナ種子におけるリシノール酸含量を向上させることが報告されている（非特許文献２参照）。
Castor oil, which is extracted from the seeds of castor oil (also known as castor oil, scientific name: Ricinus communis L.), contains about 80 to 90% of ricinoleic acid, which is one of the hydroxy fatty acids, and occupies a large position as a raw material for functional plastics derived from plants. , Is regarded as useful in industrial applications.
On the other hand, castor seeds contain a highly toxic protein called ricin and are cultivated only in a limited area. Therefore, ricinoleic acid production by crops other than castor bean is being studied for the purpose of increasing the production of ricinoleic acid. Then, the ricinoleic acid synthesis pathway in castor has been studied with the aim of increasing ricinoleic acid production by identifying the gene that synthesizes ricinoleic acid and introducing it into other plants.
Then, regarding the production of ricinoleic acid, the castor gene FAH12, which encodes an enzyme that synthesizes ricinoleic acid by adding a hydroxyl group to oleic acid, which is a precursor of ricinoleic acid, was identified, and a transformed plant that replaces castor was created. To this end, it was found that the introduction of the FAH12 gene is useful as the genetic code of the castor-derived enzyme that synthesizes ricinoleic acid (see Patent Document 1). Regarding the free time, the analysis result of the DNA of the draft genome is disclosed (see Non-Patent Document 1).
Most of the stored lipids in plant seeds are triacylglycerols, and ricinoleic acid synthesized in castor seeds also binds to glycerol and is stored as triacylglycerols. In order to produce a transformed plant that accumulates ricinoleic acid at a high concentration, detailed studies on the fatty acid synthesis pathway and TAG synthesis pathway in Hima have been carried out, and in the fatty acid synthesis pathway, in addition to the introduction of FAH12 that adds a hydroxyl group. It has been reported that the ricinoleic acid content in white inunaduna seeds is improved by deficient in FAE1 which is a fatty acid elongating enzyme and FAD2 and FAD3 which are fatty acid desaturases (see Non-Patent Document 2).
特許文献１におけるＦＡＨ１２遺伝子が導入された形質転換植物由来の種子においてもリシノール酸含量は低く、より高濃度のリシノール酸を蓄積する形質転換体が求められている。また、非特許文献２におけるＦＡＨ１２遺伝子の導入に加えて、脂肪酸の伸長酵素であるＦＡＥ１及び脂肪酸不飽和化酵素ＦＡＤ２、ＦＡＤ３を欠損させる場合でも、十分な結果が得られない場合があった。
そこで、本願の発明者等は、リシノール酸を高濃度に蓄積させるには、脂肪酸合成だけでなく、脂質分解に関与するヒマ由来のリパーゼについても検討し、特定のリパーゼによりＴＡＧを分解させることによって、リシノール酸の含有量を向上させることを見出した。
本発明の目的は、リシノール酸含量の向上に寄与するリパーゼ、そのリパーゼをコードするＤＮＡ、ベクター、形質転換植物体を提供することである。
Seeds derived from transformed plants into which the FAH12 gene has been introduced in Patent Document 1 also have a low ricinoleic acid content, and a transformant that accumulates a higher concentration of ricinoleic acid is required. Further, in addition to the introduction of the FAH12 gene in
Therefore, in order to accumulate ricinoleic acid at a high concentration, the inventors of the present application examined not only fatty acid synthesis but also castor-derived lipase involved in lipolysis, and decomposed TAG by a specific lipase. , Found to improve the content of ricinoleic acid.
An object of the present invention is to provide a lipase that contributes to an improvement in the ricinoleic acid content, a DNA encoding the lipase, a vector, and a transformed plant.
上記従来の問題点を解決する手段として、本発明は以下に示される。
１．下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
２．上記１．に記載のＤＮＡを有するベクター。
３．上記１．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
４．下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
５．上記４．に記載のＤＮＡを有するベクター。
６．上記４．に記載のＤＮＡが導入された形質転換植物体。
７．ヒマ由来のリパーゼであって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
８．ヒマ由来のリパーゼであって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
The present invention is shown below as a means for solving the above-mentioned conventional problems.
1. 1. The DNA according to any one of (a) to (d) below, which encodes a lipase derived from castor bean.
(A) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
(B) DNA having a base sequence of 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
(C) DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(D) DNA that hybridizes with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 under stringent conditions.
2. Above 1. A vector having the DNA described in 1.
3. 3. Above 1. A transformed plant into which the DNA described in the above has been introduced.
4. The DNA according to any one of (e) to (h) below, which encodes a lipase derived from castor bean.
(E) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6
(F) DNA having a base sequence of 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(G) DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(H) A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 under stringent conditions.
5. Above 4. A vector having the DNA described in 1.
6. Above 4. A transformed plant into which the DNA described in the above has been introduced.
7. A lipase derived from castor bean, characterized in that it is the polypeptide according to any one of the following (a) to (c).
(A) Polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (b) Polypeptide having an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (c) Tableed by SEQ ID NO: 18. 8. Polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence to be used. A lipase derived from castor bean, characterized in that it is the polypeptide according to any one of the following (a) to (c).
(A) Polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (b) Polypeptide having an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (c) Tableed by SEQ ID NO: 19. A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence to be used.
本発明によれば、リシノール酸含量の向上に寄与するリパーゼ、そのリパーゼをコードするＤＮＡ（ポリヌクレオチド）、ベクター、形質転換植物体を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a lipase that contributes to an improvement in the ricinoleic acid content, a DNA (polynucleotide) encoding the lipase, a vector, and a transformed plant.
本発明のＤＮＡ（遺伝子）は、植物体のヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）から調整したゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡであり、脂質の分解に関与するリパーゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡである。
上記脂質は、１分子のグリセロールに、１〜３分子の脂肪酸がエステル結合したものであれば、特に限定されない。この脂質として、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールが挙げられる。
上述の脂質の中でも１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合したトリアシルグリセロール、特に３分子の脂肪酸のうち少なくとも１分子がリシノール酸であり、残りがリノール酸であるトリアシルグリセロールは、種子中におけるリシノール酸の含有量の向上に大きく寄与する。このため、本発明のリパーゼは、トリアシルグリセロールに関与するトリアシルグリセロールリパーゼが好ましい。
The DNA (gene) of the present invention is a DNA obtained from genomic DNA prepared from castor bean (also known as castor bean, scientific name: Ricinus communis L.), and is a nucleotide sequence encoding lipase involved in lipid degradation. It is a DNA containing.
The lipid is not particularly limited as long as it is obtained by ester-bonding 1 to 3 molecules of fatty acid to 1 molecule of glycerol. Examples of this lipid include triacylglycerol, diacylglycerol, and monoacylglycerol.
Among the above-mentioned lipids, triacylglycerol in which three fatty acids are ester-bonded to one molecule of glycerol, particularly triacylglycerol in which at least one of the three fatty acids is ricinoleic acid and the rest is linoleic acid is a seed. It greatly contributes to the improvement of the content of ricinoleic acid in the medium. Therefore, the lipase of the present invention is preferably a triacylglycerol lipase involved in triacylglycerol.
尚、本明細書においては、トリアシルグリセロールを「ＴＡＧ」ともいうものとし、トリアシルグリセロールリパーゼを「ＴＡＧリパーゼ」ともいう。
また、本明細書において、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡによる「ＴＡＧリパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＡ」、配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡによる「ＴＡＧリパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＢ」ともいう。
尚また、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢは、本発明のＤＮＡのＴＡＧリパーゼ遺伝子から転写と翻訳により合成されたタンパク質を基にして構成されるポリペプチドからなる。
In the present specification, triacylglycerol is also referred to as "TAG", and triacylglycerol lipase is also referred to as "TAG lipase".
Further, in the present specification, "TAG lipase" due to the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is referred to as "TAG lipase A", and "TAG lipase" due to the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is referred to as "TAG lipase". Also called "TAG Lipase B".
Further, TAG lipase A or B is composed of a polypeptide composed based on a protein synthesized by transcription and translation from the TAG lipase gene of the DNA of the present invention.
本発明のＤＮＡ（ＤＮＡ断片）は、以下の（ａ）〜（ｄ）の態様で示されるＤＮＡのうちの一種である。
（ａ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
The DNA (DNA fragment) of the present invention is one of the DNAs shown in the following aspects (a) to (d).
(A) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6.
(B) A DNA having a base sequence having 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6.
(C) A DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6.
(D) A DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6 under stringent conditions.
上記態様（ｂ）における、本発明におけるＤＮＡの塩基配列の同一性については、リパーゼをコードする機能、特にはＴＡＧリパーゼＡ又はＢをコードする機能を発揮すればよく、７０％以上の同一性を有する塩基配列であればよく、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡである。 Regarding the identity of the base sequence of DNA in the present invention in the above aspect (b), it suffices to exert the function of encoding lipase, particularly the function of encoding TAG lipase A or B, and the identity of 70% or more can be achieved. The DNA may have any base sequence, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more of the same base sequence.
塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Karlin S and Altschul SF (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268; (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えば、score=100、wordlength=12とする。 Nucleotide sequence identity is determined by the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Karlin S and Altschul SF (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268; (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA. , 90: 5873-5877). Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403). When analyzing the base sequence using BLASTN, the parameters are, for example, score = 100 and wordlength = 12.
上記態様（ｃ）における本発明のＤＮＡは、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢをコードする機能を有するものであれば、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡでも構わない。この場合、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列において、その３’末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを含むものや、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢのコード機能を失うことなく、その５’末端を欠失したものも含まれる。 If the DNA of the present invention in the above aspect (c) has a function of encoding TAG lipase A or B, the DNA of one or more bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6 It may be a DNA consisting of a substituted, deleted, inserted or added base sequence. In this case, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6, the base sequence containing a base sequence that increases translation efficiency at the 3'end, or the coding function of TAG lipase A or B is not lost. 'The one with the terminal deleted is also included.
上記態様（ｄ）におけるＤＮＡは、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡである。この「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
そのような条件の例としては、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５の配列と相同性の高いＤＮＡが、配列番号３又は配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし、それより低い相同性のＤＮＡが相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズしない条件が挙げられる。
本明細書でいう相同性が高いとは、相同性が７０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５%以上を意味する。
ストリンジェントな条件の具体例としては、６０℃−７０℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。
The DNA in the above aspect (d) is a DNA that hybridizes with a DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6 under stringent conditions. This "stringent condition" refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
As an example of such a condition, DNA having high homology with the sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 is complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 6. There is a condition that it hybridizes with a DNA having a different base sequence and a DNA having a lower homology does not hybridize with a DNA having a complementary base sequence.
The term "high homology" as used herein means that the homology is 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
Specific examples of stringent conditions include washing in a 0.1 × SSC, 0.1% SDS solution under a temperature condition of 60 ° C. to 70 ° C.
本発明におけるＤＮＡはＴＡＧリパーゼＡ又はＢをコードしている。本発明のＤＮＡによるＴＡＧリパーゼＡ又はＢは、脂質であるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のエステル結合の加水分解能を有し、特定のＴＡＧを分解させることによって、種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる効果を発揮する。種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる作用機構については、ＴＡＧ中のオレイン酸に係るエステル結合を選択的に加水分解し、オレイン酸を遊離させることが推定され、これにより、リシノール酸がグリセロールと結合して為るＴＡＧが貯蔵されて、リシノール酸含量が増加するものと考えられる。 The DNA in the present invention encodes TAG lipase A or B. The TAG lipase A or B according to the DNA of the present invention has the ability to hydrolyze the ester bond of the lipid triacylglycerol (TAG), and improves the content of ricinoleic acid in the seed by degrading a specific TAG. It exerts the effect of making it. Regarding the mechanism of action to improve the content of ricinoleic acid in seeds, it is presumed that the ester bond related to oleic acid in TAG is selectively hydrolyzed to release oleic acid, whereby ricinoleic acid is glycerol. It is considered that the TAG formed by binding with is stored and the ricinoleic acid content is increased.
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを有するベクターである。上記ベクターとしては、本発明のＤＮＡを安定に保持するものであり、そのＤＮＡが有するＴＡＧリパーゼ遺伝子を好適に発現させることができるものであれば、その構造や種類等に特に制限はない。このようなベクターとして、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ＹＡＣ等が挙げられるが、汎用性の観点からプラスミドが好適である。
ベクターは、周知の方法により、本発明のＤＮＡがベクターへ担持（挿入）されることで構築される。ベクターには、本発明のＤＮＡの他に、エンハンサー領域（配列）やターミネーター領域（配列）、薬剤耐性遺伝子や選択マーカー遺伝子等といった周知の要素が組み込まれていてもよい。
The vector of the present invention is a vector having the DNA of the present invention. The vector is not particularly limited in its structure, type and the like as long as it stably retains the DNA of the present invention and can suitably express the TAG lipase gene contained in the DNA. Examples of such a vector include plasmids, phages, cosmids, YACs, etc., but plasmids are preferable from the viewpoint of versatility.
The vector is constructed by supporting (inserting) the DNA of the present invention into the vector by a well-known method. In addition to the DNA of the present invention, the vector may incorporate well-known elements such as an enhancer region (sequence), a terminator region (sequence), a drug resistance gene, a selectable marker gene, and the like.
ベクターは、通常、好適に担持（挿入）された本発明のＤＮＡを、宿主細胞へ導入する場合に用いられる。
例えば、宿主に大腸菌を用いるのであれば、薬剤耐性遺伝子や選択マーカー遺伝子が組み込まれた市販のベクター（プラスミド）や、クローニング用ベクターとして市販されている種々のベクター（プラスミド）を利用することができる。
The vector is usually used when introducing a preferably supported (inserted) DNA of the present invention into a host cell.
For example, when Escherichia coli is used as the host, a commercially available vector (plasmid) in which a drug resistance gene or a selectable marker gene is incorporated, or various commercially available vectors (plasmid) as a cloning vector can be used. ..
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞が挙げられるが、作業性及び汎用性等から、大腸菌が好適である。
宿主細胞へのベクター導入は、塩化カルシウム水溶液等を使用して、カルシウム存在下で大腸菌（コンピテントセル）に取り込ませる方法や、その他、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション方法等の公知の方法で行うことができる。
The host cell is not particularly limited, and various host cells are used depending on the purpose. Examples thereof include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), insect cells, animal cells and plant cells, but Escherichia coli is preferable from the viewpoint of workability and versatility.
For vector introduction into host cells, known methods such as a method of incorporating into Escherichia coli (competent cells) in the presence of calcium using an aqueous calcium chloride solution, an electric pulse perforation method, a lipofection method, a microinjection method, and the like are known. It can be done in a way.
また、植物体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のベクターを、例えば、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である。植物体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。 Further, as a method for expressing the DNA of the present invention in a plant, the vector of the present invention is introduced into a living body by, for example, a particle gun method, an electroporation method, an Agrobacterium method, a liposome method, a cationic liposome method, or the like. The method of introduction can be mentioned. General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to a conventional method. The administration into the plant body may be an ex vivo method or an in vivo method.
本発明の形質転換植物体は、本発明のＤＮＡが導入されたものであり、本発明のＤＮＡを利用して、導入したＴＡＧリパーゼの塩基配列の発現により、植物体を形質転換したものである。
形質転換植物体の作製は、本発明のベクターやＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム等の手法を用い、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入して、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることで行われる。この形質転換に要する期間は、従来のような交雑による遺伝子移入に比較して極めて短期間である。また、他の形質の変化を伴わない点で有利である。
形質転換の手法の一つの具体例として、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、細菌のＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）システムが侵入したウィルスのＤＮＡをバラバラにしてその中で特定の塩基配列をもつ断片を細菌自身のゲノムに取り込み、記憶して、ウィルスの再侵入時には、記憶したＤＮＡから転写されたＲＮＡがウィルスのＤＮＡを照合して見つけ出し、ＲＮＡにガイドされた酵素（Ｃａｓタンパク質）が、ウィルスのＤＮＡを切断する仕組みを利用するものである。
また、形質転換植物体に用いられる植物細胞としては特に限定されない。具体的には、シロイヌナズナ等が挙げられるが、本発明のＤＮＡを発現可能なものであれば、特に制限はなく、何れが用いられてもよい。
The transformed plant of the present invention is the one into which the DNA of the present invention has been introduced, and the plant is transformed by expressing the base sequence of the introduced TAG lipase using the DNA of the present invention. ..
The transformed plant is produced by introducing the DNA of the present invention into a plant cell using a method such as the vector of the present invention or the CRISPR-Cas9 system, and regenerating the transformed plant cell obtained thereby. It is said. The period required for this transformation is extremely short as compared with the conventional introgression by crossing. It is also advantageous in that it does not involve changes in other traits.
As a specific example of the transformation method, for example, the CRISPR-Cas9 system can be mentioned. The CRISPR-Cas9 system breaks up the DNA of the virus invaded by the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) system of the bacterium, and incorporates and stores the fragment having a specific base sequence into the genome of the bacterium itself. When the virus re-enters, the RNA transcribed from the stored DNA collates and finds the virus DNA, and the RNA-guided enzyme (Cas protein) uses a mechanism to cleave the virus DNA.
Further, the plant cells used for the transformed plant are not particularly limited. Specific examples thereof include Arabidopsis thaliana, but any of them may be used as long as it can express the DNA of the present invention without particular limitation.
本発明のリパーゼは、植物体のヒマ（トウゴマの別名、学名：Ricinus communis L.）に由来するリパーゼであり、タンパク質を基にして構成されるポリペプチドからなる。このリパーゼは、脂質分解に関与することで、種子中におけるリシノール酸含量の向上に寄与するリパーゼである。
上述したように、リパーゼが分解対象とする脂質として、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールが挙げられ、これらの中でもトリアシルグリセロールは、種子中におけるリシノール酸の含有量の向上に大きく寄与する。このため、本発明のリパーゼは、ＴＡＧリパーゼが好ましい。
The lipase of the present invention is a lipase derived from plant Hima (another name for castor bean, scientific name: Ricinus communis L.), and is composed of a protein-based polypeptide. This lipase is a lipase that contributes to the improvement of ricinoleic acid content in seeds by participating in lipolysis.
As described above, examples of lipids to be decomposed by lipase include triacylglycerol, diacylglycerol, and monoacylglycerol, and among these, triacylglycerol greatly contributes to the improvement of the content of ricinoleic acid in seeds. .. Therefore, the lipase of the present invention is preferably TAG lipase.
尚、本明細書において、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによる「リパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＡ」、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドによる「リパーゼ」を「ＴＡＧリパーゼＢ」ともいう。 In the present specification, "lipase" by the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 is referred to as "TAG lipase A", and "lipase" by the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is referred to as "lipase". Also called "TAG Lipase B".
本発明のリパーゼは、以下の（ａ）〜（ｃ）の態様で示されるポリペプチドのうちの一種である。
（ａ）配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
The lipase of the present invention is one of the polypeptides shown in the following aspects (a) to (c).
(A) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19.
(B) A polypeptide having an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19.
(C) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19.
上記態様（ｂ）における、本発明におけるポリペプチドのアミノ酸配列の同一性については、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢがリシノール酸含量の向上に寄与する機能を発揮すればよく、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であればよく、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。 Regarding the identity of the amino acid sequence of the polypeptide in the present invention in the above aspect (b), it is sufficient that TAG lipase A or B exerts a function of contributing to the improvement of the ricinolic acid content, and the identity is 70% or more. It may have an amino acid sequence, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more of the same amino acid sequence.
アミノ酸配列の同一性は、既存のアルゴリズムを用いて計算することができる。このアルゴリズムとして、例えば、以下が挙げられる。
Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）
ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）
通常は、上記のようなアルゴリズムが組み込まれた解析プログラムが開発されており、こうした解析プログラムを用いてアミノ酸配列の同一性（％）を解析する。
この解析プログラムとして、例えば、以下が挙げられる。
ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch（J Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）のアルゴリズム。
遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムに組み込まれた、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）により、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として算出。
Amino acid sequence identity can be calculated using existing algorithms. Examples of this algorithm include the following.
Computational Molecular Biology, Lesk, A. et al. M. , Ed. , Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, D.M. W. , Ed. , Academic Press, New York (1993)
Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. et al. M. , And Griffin, H. et al. G. , Eds. , Humana Press, New Jersey (1994)
von Heinje, G.M. , Sequencing Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987)
Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.D. and Deverex, J. et al. , Eds. , M Stockton Press, New York (1991)
Usually, an analysis program incorporating the above algorithm has been developed, and the identity (%) of the amino acid sequence is analyzed using such an analysis program.
Examples of this analysis program include the following.
Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) algorithms embedded in the GAP program of the GCG software package.
Calculated with Unit size to homology (ktup) as 2 by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441) incorporated in the homology analysis (Search homology) program of the genetic information processing software Genetyx-Win.
上記態様（ｃ）における本発明のリパーゼは、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢの機能を有するものであれば、配列番号１８又は配列番号１９で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドでも構わない。 The lipase of the present invention in the above aspect (c) has one or more amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19, as long as it has the function of TAG lipase A or B. It may be a polypeptide consisting of a substituted, deleted, inserted or added amino acid sequence.
本発明におけるリパーゼとして、ＴＡＧリパーゼＡ又はＢは、脂質、特にはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）のエステル結合の加水分解能を有し、特定のＴＡＧを分解させることによって、種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる効果を発揮する。種子中におけるリシノール酸の含有量を向上させる作用機構については、ＴＡＧ中のオレイン酸に係るエステル結合を選択的に加水分解し、オレイン酸を遊離させることが推定され、これにより、リシノール酸がグリセロールと結合して為るＴＡＧが貯蔵されて、リシノール酸含量が増加するものと考えられる。 As the lipase in the present invention, TAG lipase A or B has the ability to hydrolyze the ester bond of lipids, especially triacylglycerol (TAG), and the content of ricinoleic acid in seeds by degrading specific TAGs. It exerts the effect of improving. Regarding the mechanism of action to improve the content of ricinoleic acid in seeds, it is presumed that the ester bond related to oleic acid in TAG is selectively hydrolyzed to release oleic acid, whereby ricinoleic acid is glycerol. It is considered that the TAG formed by binding with is stored and the ricinoleic acid content is increased.
以下、本発明をさらに具体化した実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, examples in which the present invention is further embodied will be described, but the present invention is not limited to the following examples.
［１］シロイヌナズナの播種及び生育
シロイヌナズナ種子を、滅菌液（次亜塩素酸ナトリウム２％、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（商品名、非イオン系界面活性剤）０．０２％の混合液）に５分間浸し、滅菌した。
滅菌したシロイヌナズナ種子を、滅菌した純水で５回洗浄した後、発芽培地に播種した。発芽培地には、１／２濃度のムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地用混合塩類に、スクロース（濃度１％）、２−モルホリノエタンスルホン（ＭＥＳ）緩衝剤（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）、寒天（濃度０．８％）を添加し、ｐＨ５．８としたものを使用した。
播種後は、温度２２℃で一定とした環境下において、明期を１６時間、暗期を８時間とし、明期に使用する光源を蛍光灯（光量子束密度、７０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）として、播種から１０日後に芽生えしたものを培養土に移植し、シロイヌナズナの生育を行った。そして、培養土に移植後、約２ヶ月間生育したシロイヌナズナから種子を収穫した。
[1] Seeding and growth of Arabidopsis Arabidopsis seeds are sterilized (a mixture of
Sterilized Arabidopsis seeds were washed 5 times with sterilized pure water and then sown in germination medium. For the germination medium, add 1/2 concentration of mixed salts for Murashige and Skoog (MS) medium, sucrose (concentration 1%), 2-morpholinoethan sulfonate (MES) buffer (concentration 0.5 mg / ml), and agar (concentration 0.5 mg / ml). A concentration of 0.8%) was added to adjust the pH to 5.8.
After sowing, in an environment where the temperature is constant at 22 ° C., the light period is 16 hours and the dark period is 8 hours, and the light source used in the light period is a fluorescent lamp (photon flux density, 70 μmol / m 2 / s). The seedlings that sprouted 10 days after sowing were transplanted into potting soil to grow white indigo plants. Then, after transplanting to the potting soil, seeds were harvested from Arabidopsis thaliana that had grown for about two months.
［２］ヒマの播種及び生育
ヒマ種子を、滅菌液（次亜塩素酸ナトリウム２％、「Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００」（商品名、非イオン系界面活性剤）０．０２％の混合液）に５分間浸し、滅菌した。
滅菌したヒマ種子を、滅菌した純水で５回洗浄した後、滅菌水で湿潤させたキッチンペーパーで包み、プラスチック製の容器に入れて遮光し、該容器を、室温２２℃で一定とした培養室に５日間静置して、発根したヒマ種子を培養土に播種した。
播種後は、室温２８℃で一定とした人工気象室内において、明期を１６時間、暗期を８時間とし、明期に使用する光源をメタルハライドランプ（光量子束密度、１０００μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）として、ヒマの生育を行った。そして、培養土に播種後、約４ヶ月間生育したヒマから種子を収穫した。
[2] Sowing and growth of Hima seeds Hima seeds are mixed with a sterilizing solution (
Sterilized seeds were washed 5 times with sterilized pure water, wrapped in kitchen paper moistened with sterilized water, placed in a plastic container to shield it from light, and the container was cultured at a constant temperature of 22 ° C. The seeds were allowed to stand in the room for 5 days, and the rooted Hima seeds were sown in the culture soil.
After sowing, in an artificial weather room where the room temperature was constant at 28 ° C, the light period was 16 hours and the dark period was 8 hours, and the light source used in the light period was a metal halide lamp (photon flux density, 1000 μmol / m 2 / s). As a result, the free time was grown. Then, after sowing in the potting soil, seeds were harvested from castor beans that had grown for about 4 months.
［３］分子系統樹の作成
ヒマと、ヒマの近縁種であるナンヨウアブラギリ（学名：Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ、以下「ヤトロファ」とも記載する）とについて、これらのゲノムにコードされるタンパク質の中で、ＴＡＧリパーゼに特徴的なドメインであるｃｌａｓｓ＿３ リパーゼ（ＰＦ０１７６４）を持つタンパク質を抽出した。この抽出には、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ１２〈ＵＲＬ：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html〉を利用した。
そして、抽出したタンパク質のアミノ酸配列を系統解析し、分子系統樹を作成した。この系統解析には、ＭＥＧＡ７〈ＵＲＬ：https://www.megasoftware.net/〉を利用し、ブートストラップ値は１０００回反復から決定された。
作成した分子系統樹を、図１に示す。
尚、図１では、ヒマ由来のタンパク質に○を、ヤトロファ由来のタンパク質に●を付した。
[3] Creation of molecular phylogenetic tree Among the proteins encoded by these genomes, TAG A protein having class_3 lipase (PF01764), which is a domain characteristic of lipase, was extracted. Phytosome12 <URL: https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html> was used for this extraction.
Then, the amino acid sequence of the extracted protein was phylogenetically analyzed to create a molecular phylogenetic tree. MEGA7 <URL: https://www.megasoftware.net/> was used for this phylogenetic analysis, and the bootstrap value was determined from 1000 iterations.
The created molecular phylogenetic tree is shown in FIG.
In FIG. 1, the protein derived from castor bean is marked with ◯, and the protein derived from jatropha is marked with ●.
［４］ＴＡＧリパーゼ遺伝子の探索
上記［３］で作成した分子系統樹から系統樹解析を行い、ヒマ及びヤトロファのゲノムにコードされるｃｌａｓｓ＿３ リパーゼ（ＰＦ０１７６４）ドメインを持つ遺伝子を抽出した。
ｃｌａｓｓ＿３ リパーゼドメインを持つ遺伝子がヒマゲノムには３９、ヤトロファゲノムには３１存在した。これらの中から、ヒマゲノムにのみ存在し、近縁種であるヤトロファゲノムには存在しないヒマ特異的リパーゼ遺伝子を探索して、28424.m000016、29900.m001596、29935.m000048、30183.m001305の４つの遺伝子を候補として選抜した（図１中に矢印で示す）。
[4] Search for TAG lipase gene A phylogenetic tree was analyzed from the molecular phylogenetic tree prepared in [3] above, and a gene having a class_3 lipase (PF01764) domain encoded by the genomes of Hima and Yatrofa was extracted.
There were 39 genes with the class_3 lipase domain in the Hima genome and 31 in the Jatropha genome. From these, we searched for the Hima-specific lipase gene, which exists only in the Hima genome and does not exist in the closely related species Jatropha genome, and searched for four, 28424.m000016, 29900.m001596, 29935.m000048, and 30183.m001305. Genes were selected as candidates (indicated by arrows in FIG. 1).
［５］ヒマ由来遺伝子の単離
［５−１］ＲＮＡの抽出
上記［２］に従って生育した開花後３週間又は４週間のヒマ種子を採取し、ヒマのＲＮＡを抽出した。このＲＮＡの抽出は、以下（１）〜（３）に示す手順に従って行った。
（１）ヒマ種子をチューブ（容量：１．５ｍＬ、ポリプロピレン製）に収容し、液体窒素で凍結した後、ポリビニルピロリドン（分子生物学用、濃度：１ｗ／ｖ％）を添加したＲＮＡ抽出用の細胞溶解バッファー（以下、「ＰＶＰ添加バッファー」ともいう）１００μＬを加え、温度４℃、遠心力１０００×ｇで１分間、遠心分離し、モーターグラインダー及びステンレス鋼製の乳棒を用いて６０秒間均質化した。
（２）さらにＰＶＰ添加バッファー５５０μＬを加え、逆さまにしてＰＶＰ添加バッファーを混合し、２５℃で１０分間インキュベートした後、温度２５℃、遠心力８０００×ｇで５分間、遠心分離した。
（３）（２）の遠心分離後、上清５５０μＬを新しいチューブ（容量：１．５ｍＬ、ポリプロピレン製）に移し替え、温度２５℃、遠心力１００００×ｇで５分間、遠心分離した後、上清４５０μＬを新しいチューブ（容量：１．５ｍＬ、ポリプロピレン製）に移し替え、これをヒマＲＮＡの抽出物として使用した。
[5] Isolation of castor-derived gene [5-1] Extraction of RNA The castor seeds grown according to the above [2] were collected 3 weeks or 4 weeks after flowering, and the RNA of castor was extracted. Extraction of this RNA was carried out according to the procedure shown in (1) to (3) below.
(1) For RNA extraction, the perilla seeds were placed in a tube (volume: 1.5 mL, made of polypropylene), frozen in liquid nitrogen, and then polyvinylpyrrolidone (for molecular biology, concentration: 1 w / v%) was added. Add 100 μL of cell lysis buffer (hereinafter also referred to as “PVP-added buffer”), centrifuge at a temperature of 4 ° C. and a centrifugal force of 1000 × g for 1 minute, and homogenize for 60 seconds using a motor grinder and a stainless steel milk rod. bottom.
(2) Further, 550 μL of PVP-added buffer was added, the PVP-added buffer was mixed upside down, incubated at 25 ° C. for 10 minutes, and then centrifuged at a temperature of 25 ° C. and a centrifugal force of 8000 × g for 5 minutes.
(3) After centrifugation of (2), transfer 550 μL of the supernatant to a new tube (volume: 1.5 mL, made of polypropylene), centrifuge at a temperature of 25 ° C. and a centrifugal force of 10000 × g for 5 minutes, and then perform the above. 450 μL of Qing was transferred to a new tube (volume: 1.5 mL, made of polypropylene), which was used as an extract of Hima RNA.
［５−２］ｃＤＮＡの合成
上記［５−１］で抽出したヒマＲＮＡからｃＤＮＡ合成キット（「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（商品名）、タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。
合成したヒマのｃＤＮＡについて、このｃＤＮＡを鋳型として、上記［４］で選抜した４つの遺伝子について、表１に示したプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼ（「Prime STAR GXL」（商品名）、タカラバイオ社）とを使用したＰＣＲ法により増幅した。
プライマーセットについては、５’末端側のプライマーの塩基配列を配列番号１，４，７，１０とし、３’末端側のプライマーの塩基配列を配列番号２，５，８，１１とする。
そして、配列番号３で示される29935.m000048、配列番号６で示される30183.m001305、配列番号９で示される28424.m000016、配列番号１２で示される29900.m001596の４種の遺伝子を単離し、それぞれの塩基配列を常法に従って解析した。
また、上記４つの遺伝子の他、さらに配列番号１３で示される水酸基付加酵素（ＦＡＨ１２）を単離した。
ＰＣＲ法で用いたプライマー及び得られた遺伝子の関係を表１に示す。
なお、上記ＰＣＲ法による増幅は、ＤＮＡ二本鎖解離を９５℃で１分、アニーリングを９８℃で１０秒と６０℃で１５秒と６８℃で３分とを１サイクルとして３０サイクル、ＤＮＡ合成を６８℃で５分、を条件として行った。
[5-2] Synthesis of cDNA cDNA using a cDNA synthesis kit (“PrimeScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit” (trade name), Takara Bio Inc.) from the Hima RNA extracted in [5-1] above. Synthesis was performed.
Regarding the synthesized Hima cDNA, the primer set shown in Table 1 and the DNA polymerase (“Prime STAR GXL” (trade name), Takara Bio Inc.) were used for the four genes selected in [4] above using this cDNA as a template. ) And was amplified by the PCR method.
Regarding the primer set, the base sequence of the primer on the 5'end side is SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, and the base sequence of the primer on the 3'end side is SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11.
Then, four kinds of genes, 29935.m000048 shown by SEQ ID NO: 3, 30183.m001305 shown by SEQ ID NO: 6, 28424.m000016 shown by SEQ ID NO: 9, and 29900.m001596 shown by SEQ ID NO: 12 were isolated. Each base sequence was analyzed according to a conventional method.
In addition to the above four genes, the hydroxyl group lyase (FAH12) shown in SEQ ID NO: 13 was further isolated.
Table 1 shows the relationship between the primers used in the PCR method and the obtained genes.
Amplification by the above PCR method consists of 30 cycles of DNA double-stranded dissociation at 95 ° C. for 1 minute, annealing at 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 3 minutes. Was carried out at 68 ° C. for 5 minutes.
［６］遺伝子発現量の確認
上記［２］で得られたヒマの種子のうち、開花後２５日目の登熟種子、開花後３５日目の登熟種子、発芽直後の種子、及び、発芽後の芽生えの子葉、について、上記［４］で選抜した４つの遺伝子の遺伝子発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析法で定量した。その結果を、図２のグラフに示す。
[6] Confirmation of gene expression level Among the seeds of Hima obtained in [2] above, ripened
〔６−１〕定量的ＲＴ−ＰＣＲ法
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法の手順について、以下（１）〜（３）に示す。
（１）種子については、ＲＮＡ抽出キット（「ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（商品名）、ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
子葉については、ＲＮＡ抽出キット（「「ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（商品名）、ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
（２）（１）で抽出した２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ｃＤＮＡ合成キット（「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ」（商品名）、タカラバイオ社）を使用し、ｃＤＮＡを合成した。
（３）定量ＰＣＲキット（「ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ（登録商標） ＦＡＳＴユニバーサルキット」（商品名）、ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）と、リアルタイムＰＣＲシステム（「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） ７５００Ｆａｓｔ」（商品名）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と、を使用し、参照遺伝子にＥＬＦ３ｋ（真核生物翻訳開始因子３Ｋ）及びＭＡＰ２Ｂ（メチオニンアミノペプチダーゼ２Ｂ）を用いて、遺伝子発現量を定量した。
[6-1] Quantitative RT-PCR method The procedure of the quantitative RT-PCR method is shown in (1) to (3) below.
(1) For seeds, total RNA was extracted using an RNA extraction kit (“RNeasy Plant Mini Kit” (trade name), QIAGEN).
For cotyledons, total RNA was extracted using an RNA extraction kit (“RNeasy Plant Mini Kit” (trade name), QIAGEN).
(2) cDNA was synthesized from 2 μg of total RNA extracted in (1) using a cDNA synthesis kit (“PrimeScript® RT Reagent Kit” (trade name), Takara Bio Inc.).
(3) Quantitative PCR kit ("KAPA SYBR (registered trademark) FAST universal kit" (trade name), KAPA BIOSYSTEMS) and real-time PCR system ("Applied Biosystems (registered trademark) 7500 Fast" (trade name), Life Technologies, Inc. ) And MAP2B (methionine aminopeptidase 2B) were used as reference genes for ELF3k (eukaryotic translation initiation factor 3K), and the gene expression level was quantified.
〔６−２〕遺伝子発現量の定量結果
図２のグラフに示されるように、上記［４］で選抜した選抜した４つの遺伝子のうち、8424.m000016、29900.m001596は、登熟種子（開花後２５日目、３５日目）、発芽直後の種子、及び、発芽後の芽生えの子葉の全てで、遺伝子発現量が検出限界以下であり、遺伝子の発現が見られなかった。
29935.m000048、30183.m001305は、開花後２５日目及び３５日目の登熟種子で、遺伝子発現量が５を超えており、遺伝子の発現が見られた。また、29935.m000048、30183.m001305は、発芽直後の種子、及び発芽した芽生えの子葉では、遺伝子発現量が０（ゼロ）であり、遺伝子の発現が見られなかった。
上記の結果は、29935.m000048、30183.m001305が、発芽後は機能せず、登熟種子で特異的に機能するリパーゼであることを示唆している。
よって、29935.m000048をＴＡＧリパーゼＡ、30183.m001305をＴＡＧリパーゼＢと同定し、以下ではＴＡＧリパーゼＡである29935.m000048をRcTL1、ＴＡＧリパーゼＢである30183.m001305をRcTL2と記載する。
また、RcTL1の塩基配列（配列番号３）に基づき、ＴＡＧリパーゼＡのアミノ酸配列を解析し、ＴＡＧリパーゼＡのアミノ酸配列を、配列番号１８に示す。
さらに、RcTL2の塩基配列（配列番号６）に基づき、ＴＡＧリパーゼＢのアミノ酸配列を解析し、ＴＡＧリパーゼＢのアミノ酸配列を、配列番号１９に示す。
[6-2] Quantification Results of Gene Expression Level As shown in the graph of FIG. 2, of the four genes selected in [4] above, 8424.m000016 and 29900.m001596 were ripened seeds (flowering). On the 25th and 35th days afterwards), the gene expression level was below the detection limit in all of the seeds immediately after germination and the seedlings of the seedlings after germination, and no gene expression was observed.
29935.m000048 and 30183.m001305 were ripened seeds on the 25th and 35th days after flowering, and the gene expression level exceeded 5, and gene expression was observed. In 29935.m000048 and 30183.m001305, the gene expression level was 0 (zero) in the seeds immediately after germination and the sprouted cotyledons, and no gene expression was observed.
The above results suggest that 29935.m000048 and 30183.m001305 are lipases that do not function after germination and function specifically in ripened seeds.
Therefore, 29935.m000048 is identified as TAG lipase A, 30183.m001305 is identified as TAG lipase B, and TAG lipase A 29935.m000048 is referred to as RcTL1 and TAG lipase B 30183.m001305 is referred to as RcTL2.
Further, the amino acid sequence of TAG lipase A is analyzed based on the nucleotide sequence of RcTL1 (SEQ ID NO: 3), and the amino acid sequence of TAG lipase A is shown in SEQ ID NO: 18.
Furthermore, the amino acid sequence of TAG lipase B is analyzed based on the nucleotide sequence of RcTL2 (SEQ ID NO: 6), and the amino acid sequence of TAG lipase B is shown in SEQ ID NO: 19.
［７］シロイヌナズナ由来ＤＮＡ断片の単離
上記［１］に従って４週間生育したシロイヌナズナから葉を採取し、その葉を液体窒素で凍結させた後、液体窒素を加えて冷やしながら乳鉢・乳棒ですり潰した。
すり潰した植物体粉末０．１ｇからＤＮＡ抽出キット（「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（商品名）、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてシロイヌナズナのゲノムＤＮＡを抽出した。
抽出したシロイヌナズナのゲノムＤＮＡについて、このゲノムＤＮＡを鋳型とし、シロイヌナズナ由来の特定のＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、単離した。
単離したＤＮＡ断片を表２に示す。
[7] Isolation of Arabidopsis-derived DNA fragments Leaves were collected from Arabidopsis thaliana grown for 4 weeks according to the above [1], and the leaves were frozen in liquid nitrogen and then ground in a dairy pot / stick while being cooled by adding liquid nitrogen. ..
Genomic DNA of Arabidopsis thaliana was extracted from 0.1 g of ground plant powder using a DNA extraction kit (“DNeasy Plant Mini Kit” (trade name), Qiagen).
With respect to the extracted genomic DNA of Arabidopsis thaliana, a specific DNA fragment derived from Arabidopsis thaliana was amplified and isolated by the PCR method using this genomic DNA as a template.
The isolated DNA fragments are shown in Table 2.
［８］形質転換植物体の作成
リシノール酸合成を担う水酸基付加酵素であるＦＡＨ１２を導入Ｎｏ．１として、このＮｏ．１のみをシロイヌナズナへ導入し、比較試料とした。
さらに、Ｎｏ．１のＦＡＨ１２とともに、上記［６］で同定されたリパーゼのうち、ＲｃＴＬ１（ＴＡＧリパーゼＡ）を導入Ｎｏ．２、ＲｃＴＬ２（ＴＡＧリパーゼＢ）を導入Ｎｏ．３として、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．２の組み合わせと、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．３の組み合わせとを、それぞれシロイヌナズナへ導入し、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．２を実施試料１、Ｎｏ．１＋Ｎｏ．３を実施試料２とした。
比較試料、実施試料１及び２のシロイヌナズナからそれぞれ採取した種子を、２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含む発芽培地に播種し、形質転換植物としてそれぞれ３０個ずつ合計１５０個を選抜した。
上記Ｎｏ．１〜３のシロイヌナズナへの導入は、クローニングキット（「Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ」（商品名）、タカラバイオ社）を用い、Ｔｉプラスミド（「ｐＧＷＢ５０１」（Ａｄｄｇｅｎｅ提供））に導入後、このＴｉプラスミドをアグロバクテリウム法によりシロイヌナズナへ導入して行った。
Ｎｏ．１について、種子における強力な発現を目的として、ＦＡＨ１２を、シロイヌナズナのプロモーター（１２Ｓ１）及び３’ＵＴＲ（１２Ｓ１）と融合した。
Ｎｏ．２及びＮｏ．３については、ＲｃＴＬ１及びＲｃＴＬ２をそれぞれ、シロイヌナズナのオレオシン１および２のプロモーターと融合した。
この導入における組み合わせを表３に示す。
[8] Preparation of transformed plant FAH12, which is a hydroxyl group-adding enzyme responsible for ricinoleic acid synthesis, was introduced into No. As No. 1, this No. Only 1 was introduced into Arabidopsis thaliana and used as a comparative sample.
Furthermore, No. Among the lipases identified in [6] above, RcTL1 (TAG lipase A) was introduced into No. 1 together with FAH12 of 1. 2. Introduced RcTL2 (TAG Lipase B) No. As No. 3, No. 1 + No. Combination of 2 and No. 1 + No. The combinations of 3 were introduced into Arabidopsis thaliana, respectively, and No. 1 + No. No. 2 was carried out in Sample 1, No. 1 + No. 3 was used as the
Seeds collected from Arabidopsis thaliana in Comparative Samples and
The above No. Introduction of 1-3 to Arabidopsis thaliana was introduced into Ti plasmid ("pGWB501" (provided by Addgene)) using a cloning kit ("In-Fusion (registered trademark) HD Cloning kit" (trade name), Takara Bio Co., Ltd.). Later, this Ti plasmid was introduced into Arabidopsis thaliana by the Agrobacterium method.
No. For 1, FAH12 was fused with the Arabidopsis promoter (12S1) and 3'UTR (12S1) for potent expression in seeds.
No. 2 and No. For 3, RcTL1 and RcTL2 were fused with the promoters of
The combinations in this introduction are shown in Table 3.
［９］リシノール酸含量の定量
上記［８］で得られた形質転換植物について、ガスクロマトグラフィー質量分析法（以下、「ＧＣ−ＭＳ」と略す）により、リシノール酸含量の定量を行った。その結果を、図３のグラフに示す。
なお、比較試料、実施試料１及び２の形質転換植物（種子）は、リシノール酸含量を定量化するため、各３０個ずつをホモジナイザーで粉砕して使用した。
[9] Quantification of ricinoleic acid content The transformed plant obtained in [8] above was quantified for its ricinoleic acid content by gas chromatography-mass spectrometry (hereinafter abbreviated as "GC-MS"). The result is shown in the graph of FIG.
In addition, in order to quantify the ricinoleic acid content, 30 of each of the transformed plants (seed) of the comparative sample and the
［９−１］ＧＣ−ＭＳの手順
ＧＣ−ＭＳは、以下（１）〜（６）に示す手順に従って行った。
（１）比較試料、実施試料１及び２の形質転換植物（種子）各３０個ずつを、クロロホルム：メタノールを２：１で混合した抽出溶媒４００ｍＬと、ホモジナイザーと、を使用して粉砕した後、温度２５℃、遠心力２０００×ｇで５分間、遠心分離し、上清を回収した。
（２）（１）の上清の回収後に残ったペレットに、クロロホルム：メタノールを２：１で混合した抽出溶媒４００ｍＬを加え、温度２５℃、遠心力２０００×ｇで５分間、遠心分離し、上清を回収した。
（３）（１）で回収した上清と、（２）で回収した上清とを混合し、乾燥した後、得られた乾燥脂質を２５ｍＬのヘキサンに溶解させた。
（４）（３）で得た乾燥脂質から、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用のプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、ＴＡＧを分離した。ＴＬＣにおけるＴＡＧ中の脂肪酸定量時の内標準物質には、トリヘプタデカノイン（和光社）を使用した。ＴＬＣ溶媒には、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸を８０：２０：１で混合したものを使用した。
（５）（４）のプレートから、ＴＡＧのスポットを収集し、ヘキサン１００ｍＬでＴＡＧを抽出した。
（６）前処理として、脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク社）を使用してＴＡＧ中の脂肪酸をメチル化して脂肪酸メチルエステルとした後、カラム（ＤＢ−２３、アジレント・テクノロジー社）と、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−１４、島津製作所社）と、スペクトル測定に二重収束型質量分析計（ＪＭＳＤＸ−３００、日本電子社）と、を用い、ＴＡＧ中の脂肪酸メチルエステルを定量した。
[9-1] Procedure of GC-MS GC-MS was performed according to the procedures shown in (1) to (6) below.
(1) After crushing 30 of each of the transformed plants (seed) of the comparative sample and the
(2) To the pellet remaining after collecting the supernatant of (1), 400 mL of an extraction solvent in which chloroform: methanol was mixed at a ratio of 2: 1 was added, and the mixture was centrifuged at a temperature of 25 ° C. and a centrifugal force of 2000 × g for 5 minutes. The supernatant was collected.
(3) The supernatant recovered in (1) and the supernatant recovered in (2) were mixed, dried, and then the obtained dried lipid was dissolved in 25 mL of hexane.
(4) TAG was separated from the dried lipid obtained in (3) using a plate for silica gel thin layer chromatography (TLC) (Merck Millipore). Triheptadecanoin (Wako Co., Ltd.) was used as an internal standard substance for quantifying fatty acids in TAG in TLC. As the TLC solvent, a mixture of hexane: diethyl ether: acetic acid at a ratio of 80:20: 1 was used.
(5) Spots of TAG were collected from the plate of (4), and TAG was extracted with 100 mL of hexane.
(6) As a pretreatment, a fatty acid methylation kit (Nakaraitesku Co., Ltd.) is used to methylate the fatty acids in the TAG to obtain fatty acid methyl ester, and then a column (DB-23, Azilent Technology Co., Ltd.) and a gas chromatograph are used. A fatty acid methyl ester in TAG was quantified using a mass spectrometer (GC-14, Shimadzu Corporation) and a double-focusing mass spectrometer (JMSDX-300, JEOL Ltd.) for spectrum measurement.
［９−２］リシノール酸含量の定量結果
図３のグラフに示されるように、ＦＡＨ１２のみを導入した比較試料（図３中に「Ｎｏ．１」と記載）は、リシノール酸含量が４〜６％前後であった。
ＦＡＨ１２とＲｃＴＬ１（ＴＡＧリパーゼＡ）を導入した実施試料１（図３中に「Ｎｏ．１＋Ｎｏ．２」と記載）は、リシノール酸含量が７〜１０％であった。
ＦＡＨ１２とＲｃＴＬ２（ＴＡＧリパーゼＢ）を導入した実施試料２（図３中に「Ｎｏ．１＋Ｎｏ．３」と記載）は、リシノール酸含量が９〜１２％であった。
これらの結果から、リパーゼ（ＲｃＴＬ１、ＲｃＴＬ２）の機能により、種子中におけるリシノール酸含量が向上することが示された。
[9-2] Quantification Results of Ricinoleic Acid Content As shown in the graph of FIG. 3, the comparative sample into which only FAH12 was introduced (described as “No. 1” in FIG. 3) had a ricinoleic acid content of 4 to 6. It was around%.
Example 1 (described as "No. 1 + No. 2" in FIG. 3) into which FAH12 and RcTL1 (TAG lipase A) were introduced had a ricinoleic acid content of 7 to 10%.
Example 2 into which FAH12 and RcTL2 (TAG lipase B) were introduced (described as "No. 1 + No. 3" in FIG. 3) had a ricinoleic acid content of 9 to 12%.
From these results, it was shown that the function of lipase (RcTL1, RcTL2) improves the ricinoleic acid content in seeds.
本発明のヒマ由来リパーゼは、種子中のリシノール酸含量を向上させる機能を有し、形質転換に有用であるから、産業上利用可能である。 The castor-derived lipase of the present invention has a function of improving the ricinoleic acid content in seeds and is useful for transformation, so that it can be industrially used.
Claims (8)
ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ The DNA according to any one of the following (a) to (d).
A DNA characterized by encoding a lipase derived from castor bean.
(A) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
(B) DNA having a base sequence of 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
(C) DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(D) DNA that hybridizes with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 under stringent conditions.
ヒマ由来のリパーゼをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠損、挿入又は付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ The DNA according to any one of the following (a) to (d).
A DNA characterized by encoding a lipase derived from castor bean.
(A) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6
(B) DNA having a base sequence of 70% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(C) DNA consisting of a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, inserted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(D) DNA that hybridizes with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 under stringent conditions.
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド It ’s a lipase derived from castor,
A lipase characterized by being the polypeptide according to any one of the following (a) to (c).
(A) Polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (b) Polypeptide having an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (c) Tableed by SEQ ID NO: 18. A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence to be used.
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドであることを特徴とするリパーゼ。
（ａ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１９で表されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸残基の置換、欠損、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド It ’s a lipase derived from castor,
A lipase characterized by being the polypeptide according to any one of the following (a) to (c).
(A) Polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (b) Polypeptide having an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (c) Tableed by SEQ ID NO: 19. A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence to be used.
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