JP2021122233A - 細胞外マトリックス、成熟心筋細胞製造方法、創薬支援方法、治療方法、成熟心筋細胞、及び心筋細胞成熟キット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の細胞外マトリックスは、前記ラミニン断片は、ラミニン511 E8断片及び/又はラミニン521 E8断片であることを特徴とする。
本発明の成熟心筋細胞製造方法は、未成熟の心筋細胞を、前記細胞外マトリックスを含む培地で培養し、成熟した心筋細胞を取得することを特徴とする。
本発明の創薬支援方法は、前記成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞を培養し、培養された前記心筋細胞に対して、創薬のための毒性及び/又は疾患に関する薬物を投与し、前記心筋細胞の状態を評価することを特徴とする。
本発明の治療方法は、前記成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞を培養し、培養された前記成熟心筋細胞を移植することを特徴とする。
本発明の成熟心筋細胞は、前記成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞であって、心筋細胞の成熟に伴い発現が増加する成熟心筋細胞マーカーを指標として、前記未成熟の心筋細胞から、前記成熟した心筋細胞を取得することを特徴とする。
本発明の心筋細胞成熟キットは、未成熟の心筋細胞を成熟させるための細胞外マトリックスを含み、前記細胞外マトリックスは、ラミニン断片を含むことを特徴とする。
図1に、多能性幹細胞から分化誘導して得られる心筋細胞(以下、「PSC−CMs」という。)の例を示す。PSC−CMsは、胎児(胎仔)型〜新生児型となり、完全に成熟した心臓の心筋細胞と同様にはならないことが分かっている。たとえば、図1(a)は、マウスのES細胞のような多能性幹細胞から分化誘導したPSC−CMsの例を示す。図2(b)は、実際のマウスの胎仔の心筋細胞の例を示す。図2(a)は、マウスのES細胞から分化誘導したPSC−CMsについて、それぞれ分化10日目、図2(b)は分化20日目、図2(c)は、分化30日目の様子を示す。このように、PSC−CMsは培養することで、多少、成熟するものの、マウス新生仔から単離した細胞と同程度にしかならない。このような状態では、マウス成体の細胞とは形態的にも大きな差がある。さらに、細胞内のカルシウム量の変化を見るカルシウムトランジェントでも、その未成熟パターンであることは明らかであった。
このため、PSC−CMsをより成熟させる成熟方法が求められていた。
このため、鋭意実験を繰り返し、この時期特異的に発現している細胞外マトリックスのうち、どの細胞外マトリックスが、心筋細胞の成熟に特異的な効果を持つかどうかを、網羅的に調べた。この際に、心筋細胞が成熟するのに合わせて発現が増加する遺伝子座に対し、蛍光タンパク質を挿入した多能性幹細胞株(レポーター細胞)を用いた。
そして、ラミニンE8フラグメント(E8断片)に効果があり、更に、ラミニン511 cE8断片及び/又はラミニン521 E8断片により、レポーター細胞の蛍光強度が増加し、形態や生理的な活性等が成熟することを確認して、本発明を完成させるに至った。
細胞外マトリックス(Extracellular Matrix、細胞外基質、細胞間マトリックス)は、生物において、細胞の外に存在する不溶性物質である。細胞外マトリックスは、細胞にとって、物理的な足場となり、更に、組織の形態の形成、分化、ホメオスタシス等についての、生化学的、生物力学的なシグナルカスケードに関連する。動物において、細胞外マトリックスは、繊維状のタンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン等から構成される。このうち、繊維状のタンパク質は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン(Laminin)を含む。このうち、ラミニンは、細胞外マトリックスである基底膜を構成する巨大なタンパク質である。
ここで、ラミニンは、3つの鎖(α鎖、β鎖、γ鎖)から構成される非常に大きなタンパク質である。本発明者らは、ラミニン全体を用いると、心筋細胞の成熟を逆に抑制して、前駆細胞の段階で安定的に止めてしまうことを見いだした。実際に、従来の組み換えラミニン521は、ヒト初期胚細胞で発現するラミニンとして、ヒト多能性幹細胞のような未分化の細胞を分化させずに維持させるのに用いられている(例えば、<URL=”https://www.veritastk.co.jp/sciencelibrary/pickup/laminin−521.html”>等参照)。
ここで、本実施形態のラミニン断片としては、E8断片を用いることが好適である。ラミニンのE8断片は、細胞表面のインテグリンと結合する最小構成部位のタンパク片(ペプチド鎖)である。このうち、ラミニン511及び/又はラミニン522のE8断片を用いることが、特に、ヒトやマウスを含む脊椎動物の心筋細胞の成熟化に好適である。このラミニン511及び/又はラミニン522 E8断片は、それぞれの種の配列のものを用いることが好適である。また、化学的に修飾されていても、ペプチドの配列が一部異なっていても、他のペプチドと合成されたものであっても、その他の化学的な修飾を受けたものであってもよい。
さらに、本実施形態の心筋細胞は、心筋細胞に分化誘導された細胞を、各種マーカーや目視等によりコロニー等の形式で選択したものであってもよい。また、本実施形態の心筋細胞は、各種細胞の混合細胞集団、組織、臓器等(以下、「組織等」という。)であってもよい。これらの心筋細胞は、後述する成熟度スコアで示されるような様々な状態のものを混合して含んでいてもよい。すなわち、各細胞は、十分分化していなかったり、未成熟であったり、成体の細胞程、成熟していなかったりしてもよい。さらに加えて、本実施形態の心筋細胞は、後述するレポーター細胞を分化誘導したものを含んでいてもよい。
また、以下、これらの心筋細胞のうち、成熟した心筋細胞を、単に「成熟心筋細胞」という。
なお、本実施形態の多能性幹細胞としては、必ずしも全能性に近い多分化能を備えている細胞である必要はないものの、通常より多分化能が高いナイーブ(Naive)な細胞を用いることも可能である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、疾患の患者から得られた細胞から作成された細胞、その他の疾患のモデルとなる細胞、レポーター遺伝子が組み込まれた細胞(レポーター細胞)、コンディショナルノックアウトが可能な細胞、その他の遺伝子組み換えされた細胞等であってもよい。この遺伝子組み換えは、染色体内の遺伝子の追加や修飾や削除、各種ベクターや人工染色体による遺伝子等の付加、エピジェネティック制御の変更、PNA等の人工遺伝物質の付加、その他の遺伝子組み換えを含む。
本実施形態の成熟心筋細胞製造方法は、未成熟の心筋細胞を、本実施形態の細胞外マトリックスを含む培地で培養し、成熟した心筋細胞(成熟心筋細胞)を取得することを特徴とする。
本実施形態の成熟心筋細胞は、本実施形態の成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞であって、心筋細胞の成熟に伴い発現が増加する成熟心筋細胞マーカーを指標として、未成熟の心筋細胞から、成熟した心筋細胞(成熟心筋細胞)を取得することを特徴とする。
このうち、Myom2は、成人の心筋で発現し、Mバンド構造を含むタンパク質の3次元配列を安定化するタンパクの遺伝子である。
すなわち、まず、レポーター遺伝子をノックインした多能性幹細胞としてレポーター細胞を用意することが可能である。この上で、このレポーター細胞を分化誘導してPSC−CMsを作成し、レポーター遺伝子が活性化(発現)したものを指標としてフローサイトメトリーを用いた蛍光活性化セルソーティング(Fluorescence Activated Cell Sorting、以下、「FACS」という。)等で選択して取得することで、成熟心筋細胞を純化して取得することが可能である。
以下の実施例では、Myom2に、レポーター遺伝子としてRFP遺伝子をノックインしたレポーター細胞を用いる例を示している。
なお、蛍光タンパク以外にも、薬剤耐性遺伝子を導入した細胞を用意し、これを分化誘導してPSC−CMsを作成し、成熟することで薬剤耐性を獲得した心筋細胞を純化することも可能である。すなわち、薬剤耐性遺伝子を、広義の「レポーター」細胞として用いることが可能である。
なお、生物基礎医学分野において、特定の時点において、数万の遺伝子の発現と、生体細胞内において実際に進行している物質的、化学的変化、動作の関係とを完全に知ることは不可能である。よって、本実施形態のように遺伝子の発現レベル(トランスクリプトーム)を用いた成熟度スコア以上に、定量的に心筋細胞の成熟度を測定することは、当業者にとって非常に難しいため、本実施形態の成熟心筋細胞をその構造又は特性により直接特定することは困難であるという特段の事情が存在する。
本実施形態の心筋細胞成熟キットは、未成熟の心筋細胞を成熟させるための細胞外マトリックスを含み、細胞外マトリックスは、ラミニン断片を含むことを特徴とする。
本実施形態の心筋細胞成熟キットは、本実施形態の成熟心臓細胞の製造方法に必要な各種試薬を含む。これらの試薬には、例えば、培養用の培地、細胞外マトリックス、培地、FACS用の試薬、抗体、容器等を含む。この細胞外マトリックスは、例えば、ラミニン511 E8断片及び/又はラミニン521 E8断片のペプチドを含んでいてもよい。さらに、細胞外マトリックスは、発現ベクター等として、心筋細胞自体やフィーダー細胞等で発現されるように提供されてもよい。加えて、上述のレポーター細胞自体、更に、各種ホルモンやアゴニスト、転写因子を含む心筋細胞成熟剤、その他が含まれる特別の培地や薬剤についても、本実施形態の心筋細胞成熟キットに加えられていてもよい。さらに、レポーター細胞を保存したり維持したりするための特別の培地、分化誘導や成熟に必要な薬剤等も含んでいてもよい。
本実施形態の創薬支援方法は、上述の成熟心筋細胞製造方法により成熟させた成熟心筋細胞を培養し、培養された成熟心筋細胞に対して、創薬のための毒性及び/又は疾患に関する薬物を投与し、成熟心筋細胞の状態を評価することを特徴とする。
これらの解析において、候補薬物を投与した成熟心筋細胞において、正常な機能が維持された場合に、当該候補薬物が心毒性の少ないものと推定可能である。
本実施形態の心疾患の治療方法は、本実施形態の成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞を培養し、培養された前記成熟心筋細胞を移植することを特徴とする。
たとえば、本実施形態の成熟心筋細胞は、当該患者から取得して作成又は生成された多能性幹細胞、又は、HLA等の型が近い多能性幹細胞のライブラリーから取得され、分化誘導され、その後、心筋細胞成熟剤を加えて特定期間培養されて成熟させる。そして、成熟させた成熟心筋細胞は、分離された細胞又は細胞塊の状態で心疾患等の患者の疾病の心臓に注入、心筋シートや心筋組織や心臓臓器(以下、「心筋シート等」という。)を形成しての移植等の治療に用いることができる。この心筋シート等は、当業者に用いられる培養器材を用いて単層又は多層のシートを作成し、心疾患患者の心臓に移植してもよい。さらに、本実施形態の成熟心筋細胞を、サルコメア構造をもつ心臓の筋繊維や組織の状態にして、心疾患患者の心臓に移植してもよい。さらに、適切な担体を用いて培養したり、3Dプリンター等を用いて積層したりして、より組織化された培養物を心疾患患者の心臓に移植することも可能である。これらの担体や培養基材、及び/又は培地に、本実施形態の細胞外マトリックスを含ませることが可能である。
なお、本実施形態の成熟心筋細胞は、再生医療以外の治療用途、例えば、バイオリアクター、人工臓器の製造、クローン個体の作成等、各種用途に使用可能である。
また、本発明を日本で実施する場合、培養物の提供より後の治療は医師により行われるため、本発明の治療方法の「動物」は、ヒト(Homo sapiens)を含まないものとする。一方、それ以外の国においては、「動物」「治療法」の定義は、限定されない。
本発明の実施の形態に係る成熟心筋細胞の1回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
投与回数及び期間は、1回のみでもよいし、1日1回〜数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
本発明の実施の形態に係る心筋細胞成熟用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
従来、患者から得られた初代培養の心筋細胞は、ディッシュで維持することが困難であった。このため、多能性幹細胞に成長因子又は小分子を順次添加することにより、心臓分化誘導させるプロトコルが開発された。これにより生成された多能性幹細胞由来の心筋細胞(PSC−CMs)は、疾患モデリング及び薬物スクリーニングのために用いられることが期待されている。
この本実施形態の成熟心筋細胞を疾患のモデルとなるiPS細胞等に応用することで、これまで病態が再現できなかったものであっても、再現できるようになる可能性がある。具体的には、心筋梗塞等、虚血性心疾患を原因とする特発性心疾患等についても候補薬物を選択可能になる。また、QT延長について、子供では症状がないものの大人では症状が出るといった状態に対応して、候補薬物をふるい分けることが可能となる。このため、心筋症治療に向けた再生医療への応用に資することができる。
すなわち、従来、ラミニン511及びラミニン521が多能性幹細胞から心筋細胞への成熟に有効であるという知見は存在しなかった。
これに対して、本実施形態のラミニン511 E8断片及び/又はラミニン521 E8断片は、従来の常識と異なり、それだけで未成熟の心筋細胞を成熟させ、成熟心筋細胞を作製させることが可能な細胞外マトリックスとなる。
本実施形態のレポーター細胞から作成した成熟心筋細胞は、病態モデルの作成が可能となり、心筋症の治療に向けた再生医療への応用に近づく可能性がある。たとえば、大人になって発症する心筋症の治療法開発に役立つ可能性がある。
(ノックインES細胞株(レポーター細胞)の樹立)
心筋細胞の成熟度レポーター細胞は、マウスES細胞であるsyNP4細胞に対し、ゲノム編集を行うことで樹立した。Myom2は骨格筋細胞でも発現しているため、sodium−calcium exchanger 1 promoterによって駆動されるピューロマイシン耐性カセットを含んでいるsyNP4株の細胞を用いることで、in vitroで心筋細胞を、確実に純化することが可能となる。また、ゲノム編集はCRISPR/Cas9によりゲノムを切断し、ノックインベクターを目的部位に挿入することで行った。Cas9タンパク及びsingle guide RNAを一つのベクターから発現するpx330のguide RNA cloning位置に、Myom2のストップコドン直上となるguide RNAを設計し、挿入したpx330−Myom2を作成した。ノックインベクターはgRNA標的部位より約1000bpのホモロジーアームを持ち、Myom2遺伝子と同一フレームでTagRFPが挿入されている。また、TagRFPより下流にFRT−Blastcidin耐性遺伝子−FRTというカセットを持つ(Myom2−TagRFP−Blast)。Px330−Myom2、及びMyom2−TagRFP−BlastをSynp4にリポフェクションで導入し、blastcitidin処置を行うことで、ノックイン細胞を得た。ノックイン細胞はクロナール密度から培養することで、単一細胞由来のコロニーを得た。それぞれのコロニーについて、ノックインが正しく行われていることをPCR及びシーケンスで確認し、心筋細胞分化能が維持されていることを合わせて確認した。このようにして得られたMyom2−RFPノックインマウスES細胞を、SMM18と名付けた。さらに、pCAG−Flpe−IRES−puroプラスミドをリポフェクションにより導入し、短期間のpuromycynセレクションを行うことで、FRT−Blast−FRTカセットを喪失した、別のMyom2−RFP株を樹立し、SMM−B2と名付けた。カセットの喪失は薬剤の感受性試験及びPCRにより確認した。本研究では、SMM18又はSMM−B2(以下、これらを単に「Myom2−RFP株」という。)を用いて実験を行った。
Ncxプロモーター下にPuromycin耐性遺伝子を発現するトランスジェニックマウスES細胞(syNP4)を、LIF、CHIR00021、PD0325901、及び血清存在下で未分化維持培養を行い、週3回継代を行った。
分化誘導は、血清の代わりにB27サプリメント(Vitamin A不含),N2サプリメント存在下で浮遊培養にて胚様体を形成させた。分化2日目からはActivin A,BMP4,VEGFを加え、分化を継続した。分化4日目に胚様体をTrypleにより単離し、高密度平面培養(250k cells/cm2程度)をbFGF,FGF10,VEGF存在下で行った。分化7日目頃より拍動する心筋細胞が観察される。Puromycinを加えることにより、心筋細胞へと分化しなかった細胞を死滅させ、純度の高い心筋細胞を得た。また、この手法は以下で記載するノックイン細胞でも同様であった。
分化10日目にはTrypleを用いて細胞を単離し、50k/cm2で播種し直した。播種する際には培養プレートを0.1%ゼラチンでコートしたものを用い、上記分化培地に10%の血清を加えた(分化11日目まで)。ウイルス感染は分化11日目〜12日目にかけて行った。分化12日目〜14日目はPuromycinによる心筋細胞の純化を継続した。アゴニスト等を加えるアゴニスト処理については、分化11日目〜14日目までPuromycin処理を行った後、分化14日目から最大4週間アゴニスト等を添加する処理を行った。
ECMを加えて培養するECMでの成熟処理は、濃度0.125、0.5、1μg/cm2、培養期間は1、2、4週で、それぞれ行った。
マウスの心臓を胎生11日〜生後10ヶ月から摘出し、心房及び心室に分離、TRIzolを用いて溶解した。また、PSC−CMsは、分化10日目のものを0.1% Gelatin上に播種し、分化14日目からアゴニスト処理を行い、2週後にTRIzolにて溶解した。RNAの抽出は、マウス心臓についてはフェノールクロロホルム抽出、又はDirect−zol RNA kit(ザイモリサーチ社製)、PSC−CMsについてはDirect−zol RNA kitにより抽出した。RNAは、Nanodrop(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)又はQubit Fluorometer(Invitrogen社製)を用いて定量した。また、Bioanalyzerを用いて、RNAが分解されていないことを確認した。それぞれ500ngのRNAを100ng/uLに調製し、QUANT−seq 3’mRNA−Seq Library Prep Kit(Lexogen社製)を用いて、RNA−seq用のライブラリーを作成した。得られたライブラリーサイズはBioanalyzer(アジレント・テクノロジー株式会社製)を用いて確認し、その濃度はBioanalyzerの結果ないしQubit Fluorometerを用いて定量した。それぞれのサンプルについて同量ずつになるよう混合し、Next−seq high output 75SE(イルミナ株式会社製)を用いて、超並列シーケンスを行った。なお、心臓サンプルは48サンプルずつ、PSC−CMsは96サンプルずつ混合した。追加で行った心臓サンプルは、生後10日目、30週、10ヶ月のものを、96サンプルずつシーケンスした。
マウスの胎仔(E)11〜生後(P)56まで、さらに10ヶ月までの各段階(Stages)の心臓サンプルについてRNA−seqを行った結果のデータについて、主成分分析を行い、成熟度スコア(Maturation Score)を算出する基準(以下、「参照」という。)となる各遺伝子の固有ベクトル(係数)を算出した。この際、TPMに1を加えた数字に、10を底とする対数に変換した上で、主成分分析を行った。成熟度スコアは、各遺伝子発現に第一主成分に対応する係数を掛けたものの総和を用い、一定のオフセット値(32)を加え、係数(1.5)を掛けることで得た。この計算により、成熟度スコアは、概ね0〜100の幅となった。
biomaRt(RからBioMartを利用するパッケージ)を用いて、ヒトとマウスで対応する遺伝子リストを得た。この際、hsapiens_gene_ensemblと、mmusculus_gene_ensemblの2つのデータセットを用いた。同一遺伝子名を持つものに加えて、orthologueとして単一の遺伝子が登録されている遺伝子を、対応リストとして設定した。
ヒト心筋細胞の定量的成熟度評価は、これらの遺伝子のRNA−seqのデータをマウスのデータへと投写することで行った。ヒト胎児心臓RNAサンプル、ヒト成人心臓RNAサンプル、及び、in houseで分化誘導を行ったヒトPSC−CMsを用いて分化誘導後18日目、32日目、46日目のサンプルについてRNA−seqを行い、マウスのデータへ投写した。また、ヒトPSC−CMsについては、成熟を促進するホルモン処理として、Hydrocortisone(HC)と甲状腺ホルモンT3の処理を行ったものも作成した。
具体的には、対応リストに含まれる遺伝子のみを用いて、上述の各サンプルについてのRNA−seqのデータの主成分分析を行い、成熟度スコアを算出する基準となる各遺伝子の固有ベクトル(係数)を算出した。同様に、概ね0〜100の幅となるように、第一主成分得点に対し、オフセット値(30)、係数(1.5)を算出した。
心臓の場合、組織を埋め込み、最適切断温度(OCT)コンパウンドで(Tissue−Tek、Sakura製)直接凍結し、Leica Cryostat(4μm)で切断した。切片は、PBSで洗浄してから4%パラホルムアルデヒド(PFA、Wako製)を用いて4°Cで30分間処理し、固定した。その後、PBSで0.1%トリトンX−100(アマーシャム バイオサイエンス社製)を用いて、室温で15分間、切片を洗浄し、透明化した。透明化後、細胞を3%ウシ血清アルブミンでブロックし、続いて抗Myom2ポリクローナル抗体(LS−B9842、1:100、LifeSpan バイオサイエンス社製)、及び抗α−アクチニンモノクローナル抗体(EA−53、1:100、シグマアルドリッチ社製)を4°Cで一晩、反応させた。次いで、0.2%Tween−20(ナカライテスク社製)を含むPBSで洗浄し、二次抗体、抗ウサギIgG(1:500、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)、及び抗マウスIgG(1:500、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)で染色し、Alexa Fluor Plus 555及び488でそれぞれ重合させた。DAPI(Dojindo Laboratories製)は、核染色に用いた。スライドは、VECTASHIELDアンチフェード取り付け媒体(Vector Laboratories製)に取り付けられまた。
細胞内カルシウムトランジェントを測定するために、PSC−CMsを、ガラス底の24ウェルプレート(MatTek Corporation社製)で28日間培養した。次に、細胞をPBSで洗浄し、カルシウム指示薬Calbryte 520−AM(AAT Bioquest社製)を含むタイロード液(140mM NaCl、5.4mM KCl、0.5mM MgCl2、0.33mM NaH2PO4、2 mMCaCl2、5mM HEPES、及び11mM D−グルコース、NaOHでpHを7.4に調整)で30分間、処理された。細胞は、1Hzの電界刺激された(C−Pace、IonOptics社製)。倒立蛍光顕微鏡(オリンパス社製IX83、ORCA−Flash 4.0 V3搭載)により、40倍の対物レンズ、露出10ミリ秒、20ミリ秒の間隔で細胞内カルシウムのトランジェント現象を記録した。ImageJを使用して、細胞内カルシウムトランジェントを定量化した。サルコメア短縮については、生細胞イメージング用のタイムラプス記録で細胞収縮を継続的に記録した。タイムラプス記録は、ImageJに対してSarcOptiMによって分析された。
ミトコンドリア機能をSeahorse XF96 extracellular flux analyzerで解析した。Seahorse XF96マイクロプレートを、0.1%ゼラチン(コントロール)又は各ECMでコーティングした。分化誘導後、10日目に、PSC−CMsを50000細胞/ウェルの密度で、プレート上に播種した。アッセイを開始する前に、38日目まで細胞を培養した。アッセイを実行する1時間前及び測定中に、培養培地をベース培地(1mM ピルビン酸、2mM グルタミン、25mM グルコースを添加したSeahorse XF RPMI培地)に交換した。選択的阻害剤は、最終濃度3μMのオリゴマイシン(ミトコンドリア電子輸送チェーン[METC]の複合体V[ATPアーゼ]のための阻害剤)、0.5μMのCarbonyl cyanide−p−trifluoromethoxyphenylhydrazone(FCCP、ミトコンドリア酸化リン酸化アンカプラー)、3μMロテノン(METCの複合体Iの阻害剤)、及びアンチマイシンA(METCの複合体IIIの阻害剤)が、測定中に、逐次的に注入された。ミトコンドリア呼吸における主要な指標である基礎呼吸(Basal respiration)は、オリゴマイシンを適用する前に、酸素消費量率(Oxygen Consumption Rate、OCR)で表された。ATP産生関連呼吸(ATP−linked respiration)は、オリゴマイシン感受性呼吸数で表された。プロトンリークは、オリゴマイシンとロテノン/アンチマイシンAの割合との差分によって算出された。最大呼吸(Maximal respiration、最大ミトコンドリア呼吸)はFCCPに対応して算出した。
Myom2−RFP株から生成されたPSC−CMsを、TrypLE(Thermo Fisher Scientific社製)にて10分、37℃で処理して、単一細胞に解離した。PBSで洗浄した後、細胞を、DAPI(1:2000)を含むPBS中の2%FBSで懸濁した。RFP陽性(以下「RFP+」と称する。)、及びRFP強度の割合の測定と細胞選別は、SH800(SONY社製)を使用して実行された。
データは、少なくとも3つの繰り返しサンプルの平均±標準偏差(SD)として表示された。トランスクリプトームデータ等、それ以下のサンプル数の実験については、すべてのデータ点を示した。スチューデントのt検定、デネット(Dunnett)検定、カイ2乗検定、又は一元配置分散分析は、適切な場所で使用された。統計分析はすべて、統計プログラム「R」を使用して行った。0.05未満のp値(p<0.05)は有意と見なされた。
Myom2−RFP株を心筋細胞の成熟のスクリーニングに使用できるかどうかをテストするために、PSC−CMsの成熟に対する細胞外マトリックス(ECM)の影響を調べた。心筋細胞の成熟を促進するECMの候補を特定するために、E11からP56までの各ステージの野生型マウス心室のRNA−seqを実行した。
この階層的クラスタリングでは、初期胚、新生児、及び成熟したものの心室の遺伝子発現パターンがグループ化を示した。これらから、代表的なものを選択した。
結果として、RFP+のPSC−CMsの割合及びRFP強度の両方が17〜38日まで増加したことが分かった。一部のECMのPSC−CMsでは、RFP強度の増加が用量依存的に観察された。
これらのECMの中で、RFP+のPSC−CMsの割合は同じままであった。すなわち、成熟を惹起する効果はないと考えられた。これに対して、RFP強度は、複数のECMで増加した。特に、ラミニン511 E8断片、及びラミニン522 E8断片(以下、「ラミニン511/521」と省略する。)は、他と比較して、最も高いRFP強度を示した。この結果は、ECM、特にラミニン511/521が、成熟を惹起するのではなく、in vitroで心筋細胞の成熟を促進したことを示唆している。
各ECMで処理すると、特に、細胞サイズ及びサルコメア長が増加していた。
また、Dunnett検定を使用して、各ECM治療をコントロール(ゼラチン)と比較した。「*」はP<0.05、「§」はP<0.01、「#」はP<0.001、「†」はP<0.0001であることを示す。すると、ラミニン511/521で培養されたPSC−CMsは、細胞サイズ、細胞長、及び細胞幅の有意な増加を示した。さらに、PSC−CMsのサルコメア長は、コントロールと比較してラミニン−511/521で長かった。
これらの結果は、ラミニン511/521が、心筋細胞の構造的成熟を強く促進することを示した。
結果として、ラミニン511/521処理したPSC−CMsは、コントロールのゼラチン(7.77%)よりも、2核細胞の集団が多くなった。具体的には、ラミニン511 E8断片では38.68%、ラミニン521 E8短辺では54.72%であった。
ここで、胚性心筋細胞では、Cx43は細胞質中で拡散発現される。その後、新生児から若年期には、心筋細胞の側面に局在する。心筋細胞が完全に成熟すると、Cx43は主に心筋細胞のインターカレーションディスクに局在化する。このような形態変化が見られるかどうか観察した。
コントロールのゼラチン上のPSC−CMsは、Cx43を弱く発現した。これに対して、ラミニン511/521処理したPSC−CMsは、細胞の側面にCx43を強く発現した。すなわち、ラミニン511/521処理での培養により、ギャップジャンクション(Cx43)が形成されていた。
これらの結果は、ラミニン511/521処理により、PSC−CMsがより成熟し、少なくとも、新生児又は若年期の段階に達したことを示唆した。
図13(a)は基礎呼吸、図13(b)はATP産生関連呼吸、図13(c)はプロトンリーク、図14(d)は最大呼吸についてのOCRの統計分析結果を示す。データは平均値±SD(n=3)として示される。ラミニン上のPSC−CMsとゼラチン上のPSC−CMsを対照として比較するために、Dunnett検定を行った。「*」はP<0.05、「§」はP<0.01、「#」はP<0.001、「†」はP<0.0001であることを示す。
結果として、ラミニン511/521処理したPSC−CMsは、基礎呼吸及び最大呼吸レベルがより高く、コントロールのゼラチン上のPSC−CMsよりも高いミトコンドリア活性を示唆した。
図15(a)は、カルシウムトランジェントのピークまでの時間の平均値、図15(b)はピーク振幅、図15(c)は減衰時間(n>80)を示す。Dunnett検定にて、「*」はP<0.05、「†」はP<0.0001であることを示す。
結果として、ラミニン521処理したPSC−CMsは、ピークまでの時間が大幅に短縮され、減衰までの時間も有意に減少し、ピーク振幅も高かった。
結果として、ラミニン511/521処理を行うと、サルコメア短縮の割合を有意に増加させることが分かった。
これらの結果は、ラミニン511/521処理にて、PSC−CMの生理特性を改善することを示した。
図18は、トランスクトリームの詳細な分析を行った結果を示す。上述の合計発現と異なり、ゼラチンと比較すると、心筋細胞の発達に関連する既知の遺伝子は、ラミニン511/521処理されたPSC−CMsでアップレギュレートされた。たとえば、心臓マーカー遺伝子(Tnnt2及びActc1)、心臓遺伝子発現に関する転写因子の遺伝子(Ankrd23)、カルシウム関連遺伝子(Casq2)、及びサルコメア遺伝子(Mybpc2、Mybpc3、Myh7、及びMyl2)等である。
これらの結果によれば、サルコメア遺伝子と成熟関連遺伝子とは、ラミニン511/521処理されたPSC−CMsでアップレギュレートされる傾向があり、ECMの効果は、転写量の変化ではなく、翻訳量の変化であることが示唆された。
結果として、ラミニン511/521処理したPSC−CMsは、2wであっても、ゼラチンで4w培養したものよりも成熟していた。
Claims (7)
- 未成熟の心筋細胞を成熟させるための細胞外マトリックスであって、
ラミニン断片を含む
ことを特徴とする細胞外マトリックス。 - 前記ラミニン断片は、ラミニン511 E8断片及び/又はラミニン521 E8断片である
ことを特徴とする請求項1に記載の細胞外マトリックス。 - 未成熟の心筋細胞を、請求項1又は2に記載の細胞外マトリックスを含む培地で培養し、
成熟した心筋細胞を取得する
ことを特徴とする成熟心筋細胞製造方法。 - 請求項3に記載の成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞を培養し、
培養された前記心筋細胞に対して、創薬のための毒性及び/又は疾患に関する薬物を投与し、
前記心筋細胞の状態を評価する
ことを特徴とする創薬支援方法。 - 請求項3に記載の成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞を培養し、
培養された前記成熟心筋細胞を移植する
ことを特徴とする心疾患の治療方法。 - 請求項3に記載の成熟心筋細胞製造方法により製造された成熟心筋細胞であって、
心筋細胞の成熟に伴い発現が増加する成熟心筋細胞マーカーを指標として、前記未成熟の心筋細胞から、前記成熟した心筋細胞を取得する
ことを特徴とする成熟心筋細胞。 - 未成熟の心筋細胞を成熟させるための細胞外マトリックスを含み、
前記細胞外マトリックスは、ラミニン断片を含む
ことを特徴とする心筋細胞成熟キット。
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