JP2021122180A - 疾患ｄｎａの定量方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】高感度に精度よくＭＲＤを定量することができる、染色体転座を有する疾患ＤＮＡの定量方法を提供する。【解決手段】染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、転座が生じた染色体の切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の対応する前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程と、前記増幅産物の配列解析を行い、ＤＮＡ領域（ｂ）のリード数（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）のリード数（ｎ）を取得する工程と、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、検量線を作製する工程と、前記検量線を用いて、前記ＤＮＡ試料におけるＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する工程と、を含む、疾患ＤＮＡの定量方法。【選択図】なし
Description
本発明は、疾患ＤＮＡの定量方法に関する。特に、染色体転座を伴う疾患の治療中に、微小残存病変を定量する方法に関する。また、本発明は、２２番染色体と９番染色体との転座の切断点同定用プライマーセット、並びに２２番染色体と９番染色体との転座の切断点の同定方法に関する。
チロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）により慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療は大きく前進し、慢性期ＣＭＬ患者が、ＣＭＬを原因として亡くなることはほとんどなくなっている。さらに、深い寛解を果たしたＣＭＬ患者では、ＴＫＩの休薬も検討されている状況である。一方で、白血病幹細胞等の微小残存病変（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ＭＲＤ）が残存している限り再発の危険性がなくなるわけではない。日本血液学会「造血器腫瘍診療ガイドライン」２０１８年版では、「ＤＭＲ（Ｄｅｅｐ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ；分子遺伝学的に深い寛解）を達成しＭＲＤが検出されなければＴＫＩ中止は勧められるか」という問いに対して、「ＤＭＲが得られて安全にＴＫＩ治療が終了できる基準が確立されるまでは，臨床試験以外でＴＫＩを中止すべきではない。」という見解を出している。そのため、現状では、ＭＲＤが極めて少数、あるいは根絶できていたとしても、ＴＫＩ服用を続けているケースが存在する。
しかしながら、最近、ＴＫＩ服用を中止しても、分子遺伝学的再発がみられない（無治療寛解：ＴＦＲ）場合があることが報告されている。ＴＫＩの服用は少なからず身体には副作用をもたらし、経済的負担も課すことから、患者のＱＯＬ、及び予後改善のためにもＴＫＩ治療終了の基準を提供し得る技術、例えば、より高感度なＭＲＤ検出技術が必要とされている。
ＣＭＬは、造血幹細胞（ＨＳＣ）のクローンが異常に発生しながら、骨髄内に異常な細胞が過度に増殖して生ずる疾患である。ＣＭＬは、９番染色体と２２番染色体との転座（ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１））によって生じたフィラデルフィア染色体（Ｐｈ染色体）によって発病する。前記染色体転座によって、９番染色体のＡＢＬ１遺伝子と、２２番染色体のＢＣＲ遺伝子との融合が起き、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子が生じる。この融合遺伝子にコードされて産生するＢＣＲ−ＡＢＬ１チロシンキナーゼが恒常的に活性化し、白血病細胞の増殖に関与する。
従来のＭＲＤの検出方法では、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子の転写物であるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｍＲＮＡを検出することで、ＭＲＤの判定を行っていた。しかしながら、白血病幹細胞（ＬＳＣ）は、一般的に転写活性の低下した静止期にあると考えられる。そのため、ｍＲＮＡを検出する方法では、ＬＳＣを高感度に検出できないという問題がある。
従来のＭＲＤの検出方法では、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子の転写物であるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｍＲＮＡを検出することで、ＭＲＤの判定を行っていた。しかしながら、白血病幹細胞（ＬＳＣ）は、一般的に転写活性の低下した静止期にあると考えられる。そのため、ｍＲＮＡを検出する方法では、ＬＳＣを高感度に検出できないという問題がある。
一方、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子ＤＮＡを検出することにより、ＭＲＤを高感度に検出する試みも行われている。例えば、デジタルＰＣＲと次世代シーケンサーとを組み合わせて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子を検出する方法が報告されている（非特許文献１）。
Alikian M et al., Next-Generation Sequencing-Assisted DNA-Based Digital PCR for a Personalized Approach to the Detection and Quantification of Residual Disease in Chronic Myeloid Leukemia Patients. J Mol Diagn. 2016 Mar;18(2):176-189.
非特許文献１に記載の方法では、次世代シーケンサーを用いて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子ＤＮＡの切断点を同定し、デジタルＰＣＲを用いて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子ＤＮＡを定量している。しかしながら、デジタルＰＣＲによる定量では、検出対象が微量である場合に定量性に欠ける場合があり、偽陽性が生じやすい。そのため、ＭＲＤの検出においては、偽陽性であるか真陽性であるかの判定が難しい場合がある。
そこで、本発明は、高感度に精度よくＭＲＤを定量することができる、染色体転座を有する疾患ＤＮＡの定量方法、並びに前記疾患ＤＮＡの定量方法に使用可能なプライマーセット、及び前記プライマーセットを用いた切断点の同定方法を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］染色体転座を伴う疾患を有する対象について、前記染色体転座の切断点の情報を取得する工程（Ａ）と、
前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、前記染色体転座が生じた染色体の前記切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程（Ｂ）と、
前記増幅産物の配列解析を行い、前記ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する工程（Ｃ）と、
前記ＤＮＡ領域（ｎ）に対する前記ＤＮＡ領域（ｂ）の割合（ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ））が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、前記リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））から前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する工程（Ｄ）と、
前記検量線を用いて、前記工程（Ｃ）で取得した前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する工程（Ｅ）と、
を含む、疾患ＤＮＡの定量方法。
［２］前記ＤＮＡ試料が、前記疾患の治療中の前記対象から取得したＤＮＡ試料である、［１］に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［３］前記配列解析を次世代シーケンサーで行う、［１］又は［２］に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［４］前記標準ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の定量を、デジタルＰＣＲで行う、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［５］前記標準ＤＮＡ試料における前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）の取得を、次世代シーケンサーを用いて行う、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［６］前記ＤＮＡ試料が、フローサイトメトリーで分画された細胞画分から調製されたＤＮＡ試料である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［７］前記疾患が、慢性骨髄性白血病、及び急性リンパ性白血病からなる群より選択される、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［８］２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点同定用プライマーセットであって、（ａ）２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記２２番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー；及び（ｂ）９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記９番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー、を含む、プライマーセット。
［９］前記（ａ）のプライマーがフォワードプライマーであり、前記（ｂ）のプライマーがリバースプライマーである、［８］に記載のプライマーセット。
［１０］前記（ａ）のプライマーが、配列番号６４〜６７のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであり、前記（ｂ）のプライマーが、配列番号６８〜１６９のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーである、［９］に記載のプライマーセット。
［１１］２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点の同定方法であって、［８］〜［１０］のいずれか一項に記載のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行う工程（Ａ−１）と、前記核酸増幅反応により得られた核酸増幅断片の配列解析を行い、前記核酸増幅断片の配列情報を取得する工程（Ａ−２）と、前記核酸増幅断片の前記配列情報に基づいて、前記染色体転座の切断点を同定する工程（Ａ−３）と、を含む、切断点の同定方法。
［１２］前記染色体転座を伴う疾患が、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患であり、前記工程（Ａ）における染色体転座の切断点の情報を、［１１］に記載の切断点の同定方法により取得する、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［１］染色体転座を伴う疾患を有する対象について、前記染色体転座の切断点の情報を取得する工程（Ａ）と、
前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、前記染色体転座が生じた染色体の前記切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程（Ｂ）と、
前記増幅産物の配列解析を行い、前記ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する工程（Ｃ）と、
前記ＤＮＡ領域（ｎ）に対する前記ＤＮＡ領域（ｂ）の割合（ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ））が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、前記リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））から前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する工程（Ｄ）と、
前記検量線を用いて、前記工程（Ｃ）で取得した前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する工程（Ｅ）と、
を含む、疾患ＤＮＡの定量方法。
［２］前記ＤＮＡ試料が、前記疾患の治療中の前記対象から取得したＤＮＡ試料である、［１］に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［３］前記配列解析を次世代シーケンサーで行う、［１］又は［２］に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［４］前記標準ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の定量を、デジタルＰＣＲで行う、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［５］前記標準ＤＮＡ試料における前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）の取得を、次世代シーケンサーを用いて行う、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［６］前記ＤＮＡ試料が、フローサイトメトリーで分画された細胞画分から調製されたＤＮＡ試料である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［７］前記疾患が、慢性骨髄性白血病、及び急性リンパ性白血病からなる群より選択される、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
［８］２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点同定用プライマーセットであって、（ａ）２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記２２番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー；及び（ｂ）９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記９番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー、を含む、プライマーセット。
［９］前記（ａ）のプライマーがフォワードプライマーであり、前記（ｂ）のプライマーがリバースプライマーである、［８］に記載のプライマーセット。
［１０］前記（ａ）のプライマーが、配列番号６４〜６７のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであり、前記（ｂ）のプライマーが、配列番号６８〜１６９のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーである、［９］に記載のプライマーセット。
［１１］２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点の同定方法であって、［８］〜［１０］のいずれか一項に記載のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行う工程（Ａ−１）と、前記核酸増幅反応により得られた核酸増幅断片の配列解析を行い、前記核酸増幅断片の配列情報を取得する工程（Ａ−２）と、前記核酸増幅断片の前記配列情報に基づいて、前記染色体転座の切断点を同定する工程（Ａ−３）と、を含む、切断点の同定方法。
［１２］前記染色体転座を伴う疾患が、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患であり、前記工程（Ａ）における染色体転座の切断点の情報を、［１１］に記載の切断点の同定方法により取得する、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
本発明によれば、高感度に精度よくＭＲＤを定量することができる、染色体転座を有する疾患ＤＮＡの定量方法、並びに前記疾患ＤＮＡの定量方法に使用可能なプライマーセット、及び前記プライマーセットを用いた切断点の同定方法が提供される。
［疾患ＤＮＡの定量方法］
一実施形態において、染色体転座を有する疾患ＤＮＡの定量方法を提供する。前記疾患ＤＮＡの定量方法は、染色体転座を伴う疾患を有する対象について、前記染色体転座の切断点の情報を取得する工程（Ａ）と、前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、前記染色体転座が生じた染色体の前記切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程（Ｂ）と、前記増幅産物の配列解析を行い、前記ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する工程（Ｃ）と、前記ＤＮＡ領域（ｎ）に対する前記ＤＮＡ領域（ｂ）の割合（ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ））が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、前記リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））から前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する工程（Ｄ）と、前記検量線を用いて、前記工程（Ｃ）で取得した前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する工程（Ｅ）と、を含む。
一実施形態において、染色体転座を有する疾患ＤＮＡの定量方法を提供する。前記疾患ＤＮＡの定量方法は、染色体転座を伴う疾患を有する対象について、前記染色体転座の切断点の情報を取得する工程（Ａ）と、前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、前記染色体転座が生じた染色体の前記切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程（Ｂ）と、前記増幅産物の配列解析を行い、前記ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する工程（Ｃ）と、前記ＤＮＡ領域（ｎ）に対する前記ＤＮＡ領域（ｂ）の割合（ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ））が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、前記リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））から前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する工程（Ｄ）と、前記検量線を用いて、前記工程（Ｃ）で取得した前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する工程（Ｅ）と、を含む。
図１Ａ〜１Ｅは、本実施形態の疾患ＤＮＡの定量方法の概略を説明する図である。
まず、染色体転座を伴う疾患を有する対象について、転座した染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）及び染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）の切断点（ｂ）の情報を取得する（工程（Ａ）；図１Ａ）。
次に、前記切断点（ｂ）を含むＤＮＡ領域（ｂ）を増幅可能なプライマー（Ｆｗ１（Ｓ），Ｒｖ（Ｔ））を設計する。また、正常染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）の前記切断点（ｂ）の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）を増幅可能なプライマー（Ｆｗ２（Ｓ），Ｒｖ（Ｓ））を設計する。Ｆｗ１（Ｓ）とＦｗ２（Ｓ）とは、同じプライマーであってもよく、異なるプライマーであってもよい。これらのプライマーを用いて、定量対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を取得する（工程（Ｂ）；図１Ｂ）。
次に、前記増幅産物の配列解析を行い、ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する（工程（Ｃ）；図１Ｃ）。
次に、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２，・・・）を調製し、プライマー（Ｆｗ１（Ｓ），Ｒｖ（Ｔ），Ｆｗ２（Ｓ），Ｒｖ（Ｓ））用いて、ＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）を増幅する。増幅産物の配列解析を行い、リード数（ｂ）及びリード数（ｎ）を取得する。そして、リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））からＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する（工程（Ｄ）；図１Ｄ）。
次に、検量線を用いて、工程（Ｂ）で取得した定量対象のＤＮＡ試料のリード数（ｂ）及びリード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料におけるＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する（工程（Ｅ）；図１Ｅ）。
以下、各工程について、詳細を説明する。
まず、染色体転座を伴う疾患を有する対象について、転座した染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）及び染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）の切断点（ｂ）の情報を取得する（工程（Ａ）；図１Ａ）。
次に、前記切断点（ｂ）を含むＤＮＡ領域（ｂ）を増幅可能なプライマー（Ｆｗ１（Ｓ），Ｒｖ（Ｔ））を設計する。また、正常染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）の前記切断点（ｂ）の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）を増幅可能なプライマー（Ｆｗ２（Ｓ），Ｒｖ（Ｓ））を設計する。Ｆｗ１（Ｓ）とＦｗ２（Ｓ）とは、同じプライマーであってもよく、異なるプライマーであってもよい。これらのプライマーを用いて、定量対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を取得する（工程（Ｂ）；図１Ｂ）。
次に、前記増幅産物の配列解析を行い、ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する（工程（Ｃ）；図１Ｃ）。
次に、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２，・・・）を調製し、プライマー（Ｆｗ１（Ｓ），Ｒｖ（Ｔ），Ｆｗ２（Ｓ），Ｒｖ（Ｓ））用いて、ＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）を増幅する。増幅産物の配列解析を行い、リード数（ｂ）及びリード数（ｎ）を取得する。そして、リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））からＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する（工程（Ｄ）；図１Ｄ）。
次に、検量線を用いて、工程（Ｂ）で取得した定量対象のＤＮＡ試料のリード数（ｂ）及びリード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料におけるＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する（工程（Ｅ）；図１Ｅ）。
以下、各工程について、詳細を説明する。
＜工程（Ａ）＞
工程（Ａ）では、染色体転座を伴う疾患を有する対象について、前記染色体転座の切断点の情報を取得する。
工程（Ａ）では、染色体転座を伴う疾患を有する対象について、前記染色体転座の切断点の情報を取得する。
「染色体転座」とは、染色体の一部が分断され他の染色体に付着・融合することを意味する。
「染色体転座を伴う疾患」とは、疾患を発症した対象の疾患部位に、染色体転座が生じた細胞が認められる疾患を意味する。染色体転座を伴う疾患は、例えば、染色体転座により生じた異常染色体上の異常遺伝子の転写・翻訳産物である異常タンパク質により引き起こされる疾患である。染色体転座を伴う疾患としては、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
「染色体転座を伴う疾患」とは、疾患を発症した対象の疾患部位に、染色体転座が生じた細胞が認められる疾患を意味する。染色体転座を伴う疾患は、例えば、染色体転座により生じた異常染色体上の異常遺伝子の転写・翻訳産物である異常タンパク質により引き起こされる疾患である。染色体転座を伴う疾患としては、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＭＬでは、９番染色体と２２番染色体との相互転座（ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１））により生じたＰｈ染色体が生じる。Ｐｈ染色体は、９番染色体のＡＢＬ１遺伝子と、２２番染色体のＢＣＲ遺伝子との融合により生じたＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子を有する。
ＡＭＬでは、ＡＭＬと診断される患者の１割程度に、１５番染色体と１７番染色体との相互転座（t（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２））により、１７番染色体のレチノイン酸受容体α遺伝子（ＲＡＲα）と１５番染色体のＰＭＬ遺伝子とが融合してＰＭＬ−ＲＡＲα融合遺伝子が生じる。
ＡＬＬでは、ＡＬＬと診断される患者の２〜３割に、ＣＭＬと同様のＰｈ染色体が生じる。Ｐｈ染色体が生じるＡＬＬは、特に、Ｐｈ染色体陽性ＡＬＬともいう。Ｐｈ染色体陽性ＡＬＬは、染色体転座を伴う疾患の好適な例である。
ＡＭＬでは、ＡＭＬと診断される患者の１割程度に、１５番染色体と１７番染色体との相互転座（t（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２））により、１７番染色体のレチノイン酸受容体α遺伝子（ＲＡＲα）と１５番染色体のＰＭＬ遺伝子とが融合してＰＭＬ−ＲＡＲα融合遺伝子が生じる。
ＡＬＬでは、ＡＬＬと診断される患者の２〜３割に、ＣＭＬと同様のＰｈ染色体が生じる。Ｐｈ染色体が生じるＡＬＬは、特に、Ｐｈ染色体陽性ＡＬＬともいう。Ｐｈ染色体陽性ＡＬＬは、染色体転座を伴う疾患の好適な例である。
「染色体転座を伴う疾患を有する対象」とは、染色体転座を伴う疾患に罹患している対象を意味する。染色体転座を伴う疾患を有する対象は、染色体転座が生じた細胞を体内に有し、当該細胞により疾患状態を発症している対象である。「対象」は、染色体転座を伴う疾患を発症し得る生物であれば、特に限定されず、動物であることが好ましい。前記動物としては、例えば、ヒト又はヒト以外の哺乳類が挙げられる。ヒト以外の哺乳類としては、例えば、霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（マウス、ハムスター、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な対象としては、ヒトが挙げられる。
「切断点」とは、染色体転座により染色体が切断された位置を意味する。同じ疾患を有する対象であっても、切断点は、対象毎に異なっており、一様ではない。そのため、疾患ＤＮＡの定量対象となる対象毎に、切断点の情報を取得する。
例えば、図１Ａでは、染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）と染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）とが相互転座した疾患ＤＮＡを示している。染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）及び染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）が結合している（ｂ）点が切断点となる。ここで、「疾患ＤＮＡ」とは、染色体転座により生じたＤＮＡを意味する。
切断点の情報は、例えば、染色体転座を伴う疾患を有する対象が、前記疾患を有すると診断された時点、又は当該疾患の治療開始前において取得される。前記診断時又は治療開始前では、一般的に、前記対象の体内に、染色体転移が生じた細胞が多く存在する。そのため、その時点で、前記対象から疾患部位の細胞を採取し、ＤＮＡ試料を調製して、配列解析を行うことにより、切断点を同定することができる。例えば、疾患がＣＭＬ、ＡＭＬ等の血液がんである場合、前記対象から末梢血又は骨髄血を採取して、単核細胞を分離し、ＤＮＡ試料を調製し、配列解析を行うことにより、切断点を同定することができる。
切断点同定のための配列解析は、例えば、次世代シーケンサー等を行うことができる。「次世代シーケンサー」とは、サンガー法を利用したキャピラリー電気泳動によるシーケンサーである「第１世代シーケンサー」と対比させて用いられる用語であり、大量のＤＮＡ断片（数千万〜数億個）を同時並列的に処理して塩基配列を決定する装置を意味する。次世代シーケンサーとしては、例えば、ＨｉＳｅｑ２５００ （ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＭｉＳｅｑ （ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｉｏｎ ＰＧＭ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が挙げられるが、これらに限定されない。
切断点の同定は、次世代シーケンサー等による配列解析の前に、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の製品を用いて、高頻度で切断点が発生する領域を濃縮してもよい。例えば、ＣＭＬでは、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子にハイブリダイズするプローブ等を用いて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子を含む領域を濃縮してもよい。
切断点の同定は、複数種類のプライマーペアの組合せを用いて行うこともできる。例えば、図１Ａの疾患ＤＮＡにおいて、切断点（ｂ）を同定する場合、染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）にアニーリングする複数種類の染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）用プライマーを設計する。また、染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）にアニーリングする複数種類の染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）用プライマーを設計する。切断点（ｂ）の発生領域が概ね予測される場合、これらのプライマーは、予測される切断点（ｂ）の近傍に設計することが好ましい。複数種類の染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）用プライマーは、染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）におけるアニーリング位置が、相互に重複しないことが好ましい。複数種類の染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）用プライマーは、染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）におけるアニーリング位置が、相互に重複しないことが好ましい。染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）用プライマーをフォワードプライマーとして設計する場合、染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）用プライマーをリバースプライマーとして設計する。また、この逆であってもよい。
複数種類の染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）用プライマー及び複数種類の染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）用プライマーから選択されるプライマーペアを用いて、核酸増幅反応を行い、核酸増幅断片の生成の有無を確認する。「プライマーペア」とは、１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せを意味する。核酸増幅反応の方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法が好ましい。核酸増幅断片の確認は、例えば、アガロースゲル電気泳動等により確認することができる。５００〜５０００ｂｐ程度の核酸増幅断片が得られた場合、当該核酸増幅断片の配列解析を行うことにより、切断点を同定することができる。この場合、次世代シーケンサーを利用できない環境でも、第１世代シーケンサーが利用可能であれば、切断点の同定を行うことができる。
Ｐｈ染色体を生じる疾患である場合、プライマーを用いて切断点を同定奏する方法の具体例としては、後述の［切断点の同定方法］の項に記載の方法が挙げられる。
切断点の情報は、例えば、予め、染色体転座を伴う対象について同定されていた切断点の情報を取得してもよい。切断点の情報は、例えば、前記対象毎に、データベースに蓄積されていてもよい。データベースに蓄積される切断点の情報は、例えば、当該対象が、線直退転座を伴う疾患を有すると診断された時点、又は当該疾患の治療開始前において取得される。
＜工程（Ｂ）＞
工程（Ｂ）では、前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、前記染色体転座が生じた染色体の前記切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る。
工程（Ｂ）では、前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、前記染色体転座が生じた染色体の前記切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る。
染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料は、前記対象から疾患部位の細胞を採取し、前記細胞からＤＮＡを抽出することにより、調製することができる。例えば、疾患がＣＭＬ、ＡＭＬ等の血液がんである場合、末梢血又は骨髄血に含まれる単核細胞からＤＮＡ試料を調製することができる。前記ＤＮＡ試料は、例えば、前記疾患の治療中の対象から取得することができる。前記疾患の治療中の対象から取得したＤＮＡ試料を用いて、疾患ＤＮＡの定量を行うことにより、治療を継続するか、治療を終了するかを判断する情報を得ることができる。ＤＮＡ試料は、細胞から抽出された全ＤＮＡ（全ゲノムＤＮＡ）を用いることが好ましい。
ＤＮＡ試料は、フローサイトメトリーで分画された細胞画分から調製されたものであってもよい。例えば、疾患の治療中の対象から採取した細胞を、フローサイトメトリーで分画し、各細胞画分又は特定の細胞画分からＤＮＡ試料を調製することができる。
例えば、疾患がＣＭＬ、ＡＭＬ等の血液がんである場合、末梢血又は骨髄血に含まれる単核細胞を単離し、前記単核細胞をフローサイトメトリーで分画してもよい。フローサイトメトリーによる分画は、細胞表面マーカーに対する抗体を用いて行うことができる。細胞が末梢血又は骨髄血の単核細胞である場合、前記細胞表面マーカーとしては、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＩＬ１ＲＡＰ等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞表面マーカーを用いて、単核細胞を、フローサイトメトリーにより、例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ２５−細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞、ＣＤ３４−細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１５＋細胞（Ｍ細胞）、ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）等の細胞画分に分画してもよい。ＤＮＡ試料は、このように分画された細胞画分のいずれかから調製して当該細胞画分のＤＮＡ試料としてもよく、これらすべての細胞画分から調製して各細胞画分のＤＮＡ試料としてもよい。スローサイトメトリーで分画した細胞画分を用いることにより、各細胞画分における疾患ＤＮＡを定量することができる。これにより、ＭＲＤが残存する細胞画分を特定することができる。
また、ＭＲＤが残存している可能性が高い細胞画分からＤＮＡ試料を調製してもよい。例えば、後述する実施例で示すように、ＣＭＬでは、末梢血、特にＢ細胞にＭＲＤが残存している可能性が高い。そのため、ＣＭＬでは、末梢血中の単核細胞（好ましくはＢ細胞画分）からＤＮＡ試料を調製することができる。
例えば、疾患がＣＭＬ、ＡＭＬ等の血液がんである場合、末梢血又は骨髄血に含まれる単核細胞を単離し、前記単核細胞をフローサイトメトリーで分画してもよい。フローサイトメトリーによる分画は、細胞表面マーカーに対する抗体を用いて行うことができる。細胞が末梢血又は骨髄血の単核細胞である場合、前記細胞表面マーカーとしては、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ３８、及びＩＬ１ＲＡＰ等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞表面マーカーを用いて、単核細胞を、フローサイトメトリーにより、例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ２５−細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞、ＣＤ３４−細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１５＋細胞（Ｍ細胞）、ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）等の細胞画分に分画してもよい。ＤＮＡ試料は、このように分画された細胞画分のいずれかから調製して当該細胞画分のＤＮＡ試料としてもよく、これらすべての細胞画分から調製して各細胞画分のＤＮＡ試料としてもよい。スローサイトメトリーで分画した細胞画分を用いることにより、各細胞画分における疾患ＤＮＡを定量することができる。これにより、ＭＲＤが残存する細胞画分を特定することができる。
また、ＭＲＤが残存している可能性が高い細胞画分からＤＮＡ試料を調製してもよい。例えば、後述する実施例で示すように、ＣＭＬでは、末梢血、特にＢ細胞にＭＲＤが残存している可能性が高い。そのため、ＣＭＬでは、末梢血中の単核細胞（好ましくはＢ細胞画分）からＤＮＡ試料を調製することができる。
ＤＮＡ領域（ｂ）の核酸増幅反応は、疾患ＤＮＡの切断点（ｂ）を挟む領域にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））を用いることにより行うことができる。ＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応は、正常ＤＮＡの前記切断点（ｂ）の座標を挟む領域にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））を用いることにより行うことができる（図１Ｂ参照）。ここで、「正常ＤＮＡ」とは、染色体転座が生じていない正常染色体のＤＮＡを意味する。
フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））、並びにフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））の設計は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３等のプライマー設計ツールを用いて行うことができる。フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））は、増幅されるＤＮＡ領域（ｂ）が、シーケンサーで配列決定可能なリード長以下となるように設計することが好ましい。同様に、フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｘ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））は、増幅されるＤＮＡ領域（ｎ）が、シーケンサーで配列決定可能なリード長以下となるように設計することが好ましい。ここで、「リード長」とは、シーケンサーで配列決定されるＤＮＡ断片の１単位を意味する。ＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ（ｎ）のサイズとしては、例えば、７０〜１２０塩基が挙げられる。ＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ（ｎ）は、ほぼ同じサイズであることが好ましい。
フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））、フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）のＤＮＡ配列へのアニーリング配列を、１８〜２５塩基程度とすることが好ましく、１９〜２１塩基程度とすることがより好ましい。リバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））は、染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）のＤＮＡ配列へのアニーリング配列を、１８〜２５塩基程度とすることが好ましく、１９〜２１塩基程度とすることがより好ましい。
フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））、フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）のＤＮＡ配列へのアニーリング配列を、１８〜２５塩基程度とすることが好ましく、１９〜２１塩基程度とすることがより好ましい。リバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））は、染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）のＤＮＡ配列へのアニーリング配列を、１８〜２５塩基程度とすることが好ましく、１９〜２１塩基程度とすることがより好ましい。
例えば、フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））は、疾患ＤＮＡのセンス鎖の切断点（ｂ）の５’側上流領域における塩基配列の一部を有することができる。フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））は、前記５’側上流領域における連続する１８〜２５塩基程度の塩基配列を有していてもよい。例えば、リバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））は、疾患ＤＮＡのアンチセンス鎖の切断点（ｂ）の５’側上流領域における塩基配列の一部を有することができる。リバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））は、前記５’側上流領域における連続する１８〜２５塩基程度の塩基配列を有していてもよい。
例えば、フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））は、正常ＤＮＡのセンス鎖の切断点（ｂ）に対応する座標の５’側上流領域における塩基配列の一部を有することができる。フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））は、前記５’側上流領域における連続する１８〜２５塩基程度の塩基配列を有していてもよい。例えば、リバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、正常ＤＮＡのアンチセンス鎖の切断点（ｂ）に対応する座標の５’側領域における塩基配列の一部を有することができる。リバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、前記５’側上流領域における連続する１８〜２５塩基程度の塩基配列を有していてもよい。
例えば、フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））は、正常ＤＮＡのセンス鎖の切断点（ｂ）に対応する座標の５’側上流領域における塩基配列の一部を有することができる。フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））は、前記５’側上流領域における連続する１８〜２５塩基程度の塩基配列を有していてもよい。例えば、リバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、正常ＤＮＡのアンチセンス鎖の切断点（ｂ）に対応する座標の５’側領域における塩基配列の一部を有することができる。リバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、前記５’側上流領域における連続する１８〜２５塩基程度の塩基配列を有していてもよい。
例えば、疾患がＣＭＬである場合、フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））は、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子のアンチセンス鎖のＢＣＲ配列にアニーリングするように設計することができ、リバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））は、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子のセンス鎖のＡＢＬ１配列にアニーリングするように設計することができる。フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））は、正常ＢＣＲ遺伝子のアンチセンス鎖における切断点に対応する座標の３’側下流領域の配列にアニーリングするように設計することができ、リバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、正常ＢＣＲ遺伝子のセンス鎖における切断点に対応する座標の３’側下流領域の配列にアニーリングするように設計することができる。
疾患ＤＮＡにアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））と、正常ＤＮＡにアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））とは、同じプライマーであってもよいし、異なるプライマーであってもよいが、同じプライマーであることが好ましい。フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））を同じプライマーとすることにより、ＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を３種のプライマーで行うことができる。例えば、疾患がＣＭＬである場合、フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））は、ともに、ＢＣＲ遺伝子の同一の配列にアニーリングするプライマーとすることができ、同一の配列からなるものであってもよい。
フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））、並びにフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））は、増幅散布物を後述の工程（Ｃ）の配列解析に供するために、配列解析用のアダプター配列が付加されたものであってもよい。配列解析用アダプター配列は、プライマーの５’末端に付加することができる。配列解析用アダプター配列は、工程（Ｃ）で使用するシーケンサーに応じて、プロバイダーが推奨するものを用いることができる。
複数の対象のＤＮＡ試料を同時に配列解析する場合には、各対象を識別するタグ配列をフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方に付加してもよい。あるいは、フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））、並びにフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））を用いて核酸増幅反応（第１の核酸増幅反応）を行った後、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方にタグ配列を含むプライマーペアを用いて、第２の核酸増幅反応を行ってもよい。この場合、フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））、並びにフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））には、第２の核酸増幅反応用プライマーがアニーリングするためのアダプター配列を付加してもよい。第２の核酸増幅反応用プライマーは、前記アダプター配列にアニーリングする配列、タグ配列、及び配列解析用アダプター配列を含むことができる。
上記の例では、正常ＤＮＡとして染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）を用いる場合について説明したが、正常ＤＮＡとして染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）を用いてもよい。この場合、ＤＮＡ領域（ｎ）は、染色体（Ｃｈｒ．Ｔ）の切断点（ｂ）に対応する座標を挟む領域となる。ＤＮＡ領域（ｎ）を核酸増幅反応に用いるプライマーとしては、フォワードプライマー（Ｆｗ（Ｔ））及びリバースプライマー（Ｒｖ２（Ｔ））を用いることができる。リバースプライマー（Ｒｖ２（Ｔ））は、ＤＮＡ領域（ｂ）の核酸増幅反応に用いるリバースプライマー（Ｒｖ１（Ｔ））と同じ出会ってもよいし、異なっていてもよい。フォワードプライマー（Ｆｗ（Ｔ））及びリバースプライマー（Ｒｖ２（Ｔ））は、染色体（Ｃｈｒ．Ｓ）のＤＮＡ領域（ｎ）を核酸増幅反応の対象とすること以外は、上記フォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ））と同様に設計することができる。
核酸増幅反応には、公知の核酸増幅法を特に制限なく用いることができる。核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の等温増幅法等が挙げられる。核酸増幅法は、ＰＣＲ法が好ましい。
前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、ＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行うと、前記ＤＮＡ試料中のＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）の含有量に応じて、ＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）の増幅産物が得られる。例えば、疾患の治療を行った結果、前記対象において疾患細胞が消失した場合には、前記対象のＤＮＡ試料は疾患ＤＮＡを含まない。この場合、ＤＮＡ領域（ｂ）は増幅されず、本工程で得られる増幅産物は、ＤＮＡ領域（ｂ）を含まない。一方、前記対象において疾患細胞が残存している場合には、前記対象のＤＮＡ試料は疾患ＤＮＡを含む。この場合、ＤＮＡ領域（ｂ）が増幅されて、本工程で得られる増幅産物は、ＤＮＡ領域（ｂ）を含む。
＜工程（Ｃ）＞
工程（Ｃ）では、前記増幅産物の配列解析を行い、前記ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する。
工程（Ｃ）では、前記増幅産物の配列解析を行い、前記ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する。
工程（Ｂ）で得られた増幅産物の配列解析は、例えば、次世代シーケンサーを用いて行うことができる。配列解析により、工程（Ｂ）で得られた各核酸増幅断片の配列が決定される。これにより、ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）と、ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得することができる。「リード数」とは、シーケンサーにより配列決定されたＤＮＡ断片の数を意味する。すなわち、リード数（ｂ）は、シーケンサーで配列決定された核酸増幅断片のうち、ＤＮＡ領域（ｂ）を含む核酸増幅断片の数である。リード数（ｎ）は、シーケンサーで配列決定された核酸増幅断片のうち、ＤＮＡ領域（ｎ）を含む核酸増幅断片の数である。
図１Ｃの例では、増幅産物の配列解析により、リード数（ｂ）としてＰが取得されており、リード数（ｎ）としてＱが取得されている。
図１Ｃの例では、増幅産物の配列解析により、リード数（ｂ）としてＰが取得されており、リード数（ｎ）としてＱが取得されている。
＜工程（Ｄ）＞
工程（Ｄ）では、前記ＤＮＡ領域（ｎ）に対する前記ＤＮＡ領域（ｂ）の割合（ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）；以下、単に「ＤＮＡ領域（ｂ）の割合」ともいう）が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、前記リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））から前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する。
工程（Ｄ）では、前記ＤＮＡ領域（ｎ）に対する前記ＤＮＡ領域（ｂ）の割合（ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）；以下、単に「ＤＮＡ領域（ｂ）の割合」ともいう）が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、前記リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））から前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する。
「標準ＤＮＡ試料」とは、検量線を作製するためのＤＮＡ試料を意味する。標準ＤＮＡ試料には、ＤＮＡ領域（ｂ）の割合が、予め既知であるＤＮＡ試料を用いる。標準ＤＮＡ試料は、ＤＮＡ領域（ｂ）の割合が相互に異なるものを複数種類用いる。例えば、図１Ｄの例では、試料Ｎｏ．１として、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）＝０．００１であるＤＮＡ試料を用いている。試料Ｎｏ．２として、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）＝０．０１であるＤＮＡ試料を用いている。標準ＤＮＡ試料におけるＤＮＡ領域（ｂ）の割合の段階は、２段階以上であれば特に限定されないが、３段階以上であることが好ましい。ＤＮＡ領域（ｂ）の割合が相互に異なる各段階の標準ＤＮＡ試料は、例えば、ＤＮＡ領域（ｂ）の割合が最も高い標準ＤＮＡの段階希釈により調製してもよい。
標準ＤＮＡ試料中のＤＮＡ領域（ｂ）の割合は、例えば、デジタルＰＣＲを用いて確認してもよい。「デジタルＰＣＲ」は、核酸試料を希釈して、各画分に核酸分子が１個以下となるように分画し、前記各画分で核酸増幅反応を行い、核酸増幅された陽性画分と、核酸増幅されなかった陰性画分とを計数することにより、元の核酸試料の核酸量を定量する方法である。例えば、標準試料中のＤＮＡ領域（ｂ）及びＤＮＡ領域（ｎ）の含有量をデジタルＰＣＲで定量することにより、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出することができる。この場合、標準試料中のＤＮＡ領域（ｂ）の含有量及びＤＮＡ領域（ｎ）の含有量は、それぞれ、ＤＮＡ領域（ｂ）のコピー数及びＤＮＡ領域（ｎ）のコピー数として求められる。
標準ＤＮＡ試料は、前記工程（Ｂ）及び工程（Ｃ）と同様に、核酸増幅反応及び配列解析を行い、標準ＤＮＡ試料の種類毎に、リード数（ｂ）及びリード数（ｎ）を取得する。図１Ｃの例では、試料Ｎｏ．１では、リード数（ｂ）としてｐ１、リード数（ｎ）としてｑ１が取得されている。試料Ｎｏ．２では、リード数（ｂ）としてｐ２、リード数（ｎ）としてｑ２が取得されている。
標準ＤＮＡ試料における核酸増幅反応は、対象のＤＮＡ試料に替えて、標準ＤＮＡ試料を鋳型として用いること以外は、前記工程（Ｂ）と同様に行うことができる。すなわち、前記工程（Ｂ）と同じプライマー（フォワードプライマー（Ｆｗ１（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｔ））、並びにフォワードプライマー（Ｆｗ２（Ｓ））及びリバースプライマー（Ｒｖ（Ｓ）））を用いて、各標準ＤＮＡ試料を鋳型として核酸増幅反応を行う。これにより、各標準ＤＮＡ試料の増幅産物を得ることができる。
各標準ＤＮＡ試料の増幅産物の配列解析は、対象のＤＮＡ試料の増幅産物に替えて、各標準ＤＮＡ試料の増幅産物を用いること以外は、前記工程（Ｃ）と同様に行うことができる。すなわち、次世代シーケンサー等を用いて、各標準ＤＮＡ試料の増幅産物の配列解析を行う。これにより、各標準ＤＮＡ試料の各リード数（ｂ）及び各リード数（ｎ）を得ることができる。
次いで、各標準ＤＮＡ試料のＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）をＹ軸とし、各標準ＤＮＡ試料のリード数（ｂ）／リード数（ｎ）をＸ軸とする検量線を作製する。この検量線は、リード数（ｂ）／リード数（ｎ）の値から、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求めることができるものである。
＜工程（Ｅ）＞
工程（Ｅ）では、前記検量線を用いて、前記工程（Ｃ）で取得した前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する。
工程（Ｅ）では、前記検量線を用いて、前記工程（Ｃ）で取得した前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する。
前記工程（Ｃ）で取得した前記対象のＤＮＡ試料のリード数（ｂ）及びリード数（ｎ）からリード数（ｂ）／リード数（ｎ）を算出し、前記工程（Ｄ）で取得した検量線を用いて、前記対象のＤＮＡ試料におけるＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する。
前記のように算出されたＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）の値は、前記対象のＤＮＡ試料における疾患ＤＮＡであるＤＮＡ領域（ｂ）を含むＤＮＡの割合を示している。
前記のように算出されたＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）の値は、前記対象のＤＮＡ試料における疾患ＤＮＡであるＤＮＡ領域（ｂ）を含むＤＮＡの割合を示している。
本実施形態の疾患ＤＮＡの定量方法によれば、各対象について、切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び対応する正常染色体のＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行って増幅産物を取得し、前記増幅産物の配列解析によりリード数（ｂ）及びリード数（ｎ）を取得している。そして、標準ＤＮＡ試料を用いて作製された検量線に基づき、ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出している。そのため、ＤＮＡ領域（ｂ）が微量であっても、高感度に精度よく、ＤＮＡ領域（ｂ）を含む疾患ＤＮＡを定量することができる。また、検出対象がＤＮＡであるため、転写活性が低下した状態であっても疾患ＤＮＡを定量することができる。したがって、ＣＭＬ等の染色体転座を伴う疾患のＭＲＤの定量に有用である。本実施形態の方法を用いてＭＲＤを定量することにより、疾患の治療を継続するか否かを判断するために有用な情報が提供される。
［プライマーセット］
一実施形態において、本発明は、２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点同定用プライマーセットを提供する。前記プライマーセットは、（ａ）２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記２２番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー；及び（ｂ）９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記９番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー、を含む。
一実施形態において、本発明は、２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点同定用プライマーセットを提供する。前記プライマーセットは、（ａ）２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記２２番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー；及び（ｂ）９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記９番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー、を含む。
本実施形態のプライマーセットは、前記実施形態の疾患ＤＮＡの定量方法において、工程（Ａ）を実施するために用いることができる。本実施形態のプライマーセットは、２２番染色体と９番染色体の転座を伴う疾患を有する対象において、切断点の情報を取得する場合に有効である。本実施形態のプライマーセットは、２２番染色体と９番染色体の転座により生じるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子（図８中段左図参照）又はＡＢＬ１−ＢＣＲ融合遺伝子（図８中段右図参照）の核酸断片を増幅可能である。
＜（ａ）ＢＣＲ遺伝子用プライマー＞
本実施形態のプライマーセットは、複数種類のＢＣＲ遺伝子用プライマーを含む。ＢＣＲ遺伝子用プライマーは、２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域にアニーリングするプライマーである。ＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域は、Ｐｈ染色体の切断点の存在頻度が高い。そのため、この領域内でプライマーを設計することにより、効率よく切断点を同定することができる。
本実施形態のプライマーセットは、複数種類のＢＣＲ遺伝子用プライマーを含む。ＢＣＲ遺伝子用プライマーは、２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域にアニーリングするプライマーである。ＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域は、Ｐｈ染色体の切断点の存在頻度が高い。そのため、この領域内でプライマーを設計することにより、効率よく切断点を同定することができる。
ＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域は、ヒトゲノムの参照配列であるｈｇ１９の２２番染色体において、２３，６３１，７０４〜２３，６３４，８２５の座標に位置する領域（長さ：３，１２２ｂｐ）である。複数種類のＢＣＲ遺伝子用プライマーは、前記領域内にアニーリングし、且つアニーリング位置が相互に重複しないように設計される。ＢＣＲ遺伝子用プライマーのアニーリング位置の間隔は、特に限定されないが、５００〜２，０００ｂｐ程度が挙げられる。前記アニーリング位置の間隔は、５００〜１，５００ｂｐ程度がより好ましい。ＢＣＲ遺伝子用プライマーの長さとしては、１８〜２５塩基程度が好ましく、１９〜２１塩基程度がより好ましい。この場合、２〜６種類程度のＢＣＲ遺伝子用プライマーを設計可能である。
ＢＣＲ遺伝子用プライマーは、フォワードプライマーであってもよく、リバースプライマーであってもよい。ＢＣＲ遺伝子用プライマーがフォワードプライマーである場合、後述のＡＢＬ１遺伝子用プライマーは、リバースプライマーとなる。この場合、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子由来の核酸断片を増幅することができる。ＢＣＲ遺伝子用プライマーがリバースプライマーである場合、後述のＡＢＬ１遺伝子用プライマーは、フォワードプライマーとなる。この場合、ＡＢＬ１−ＢＣＲ融合遺伝子由来の核酸断片を増幅することができる。
ＢＣＲ遺伝子用プライマーがフォワードプライマーである場合の具体例を、配列番号６４〜６７に示す。前記フォワードプライマーは、配列番号６４〜６７のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるものが好ましい。ＢＣＲ遺伝子用のフォワードプライマーとしては、例えば、配列番号６４〜６７の塩基配列；配列番号６４〜６７の塩基配列の５’末端若しくは３’末端の塩基が１個又は２個欠失した塩基配列；配列番号６４〜６７の塩基配列の５’末端又は３’末端に１個又は２個の塩基が付加された塩基配列；及び配列番号６４〜６７の塩基配列の５’末端及び３’末端のいずれか一方の塩基が１個又は２個欠失し、他方に１個又は２個の塩基が付加された塩基配列、等が挙げられる。
本実施形態のプライマーセットが含むＢＣＲ遺伝子用プライマーの種類は、２種類以上であればよく、３〜６種類が好ましく、４〜５種類がより好ましい。本実施形態のプライマーセットは、ＢＣＲ遺伝子用プライマーとして、配列番号６４〜６７のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる４種類のプライマーを含むことが特に好ましい。
＜（ｂ）ＡＢＬ１遺伝子用プライマー＞
本実施形態のプライマーセットは、複数種類のＡＢＬ１遺伝子用プライマーを含む。ＡＢＬ１遺伝子用プライマーは、９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域にアニーリングするプライマーである。ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域は、Ｐｈ染色体の切断点の存在頻度が高い。そのため、この領域内でプライマーを設計することにより、効率よく切断点を同定することができる。
本実施形態のプライマーセットは、複数種類のＡＢＬ１遺伝子用プライマーを含む。ＡＢＬ１遺伝子用プライマーは、９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域にアニーリングするプライマーである。ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域は、Ｐｈ染色体の切断点の存在頻度が高い。そのため、この領域内でプライマーを設計することにより、効率よく切断点を同定することができる。
ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域は、ヒトゲノムの参照配列であるｈｇ１９の９番染色体において、１３３，５８９，３３３〜１３３，７２９，６２４の座標に位置する領域（長さ：１４０，２９２ｂｐ）である。複数種類のＡＢＬ１遺伝子用プライマーは、前記領域内にアニーリングし、且つアニーリング位置が相互に重複しないように設計される。ＡＢＬ１遺伝子用プライマーのアニーリング位置の間隔は、特に限定されないが、５００〜６，０００ｂｐ程度が挙げられる。前記アニーリング位置の間隔は、５００〜５，０００ｂｐ程度がより好ましく、５００〜４，０００程度がさらに好ましい。ＡＢＬ１遺伝子用プライマーの長さとしては、１８〜２５塩基程度が好ましく、１９〜２１塩基程度がより好ましい。この場合、３０〜３００種類程度のＡＢＬ１遺伝子用プライマーを設計可能である。
ＡＢＬ１遺伝子用プライマーがリバースプライマーである場合の具体例を、配列番号６８〜１６９に示す。前記リバースプライマーは、配列番号６８〜１６９のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるものが好ましい。ＡＢＬ１遺伝子用のリバースプライマーとしては、例えば、配列番号６８〜１６９の塩基配列；配列番号６８〜１６９の塩基配列の５’末端若しくは３’末端の塩基が１個又は２個欠失した塩基配列；配列番号６８〜１６９の塩基配列の５’末端又は３’末端に１個又は２個の塩基が付加された塩基配列；及び配列番号６８〜１６９の塩基配列の５’末端及び３’末端のいずれか一方の塩基が１個又は２個欠失し、他方に１個又は２個の塩基が付加された塩基配列、等が挙げられる。
本実施形態のプライマーセットが含むＡＢＬ１遺伝子用プライマーの種類は、３０種類以上が好ましく、５０種類以上がより好ましく、８０種類以上がさらに好ましく、１００種類以上が特に好ましい。好ましくは１００〜３００種類であり、より好ましくは１００〜２００種類である。本実施形態のプライマーセットは、ＡＢＬ１遺伝子用プライマーとして、配列番号６８〜１６９のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる１０２種類のプライマーを含むことが特に好ましい。
［切断点の同定方法］
一実施形態において、本発明は、２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点の同定方法を提供する。前記同定方法は、前記実施形態のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行う工程（Ａ−１）と、前記核酸増幅反応により得られた核酸増幅断片の配列解析を行い、前記核酸増幅断片の配列情報を取得する工程（Ａ−２）と、前記核酸増幅断片の前記配列情報に基づいて、前記染色体転座の切断点を同定する工程（Ａ−３）と、を含む。
一実施形態において、本発明は、２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点の同定方法を提供する。前記同定方法は、前記実施形態のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行う工程（Ａ−１）と、前記核酸増幅反応により得られた核酸増幅断片の配列解析を行い、前記核酸増幅断片の配列情報を取得する工程（Ａ−２）と、前記核酸増幅断片の前記配列情報に基づいて、前記染色体転座の切断点を同定する工程（Ａ−３）と、を含む。
本実施形態の切断点の同定方法は、前記実施形態の疾患が２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患である場合に、工程（Ａ）の染色体転座の切断点の情報を取得するために用いることができる。
＜工程（Ａ−１）＞
工程（Ａ−１）では、前記実施形態のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行う。
工程（Ａ−１）では、前記実施形態のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行う。
２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患としては、ＣＭＬ及びＡＬＬが挙げられる。これらの疾患では、２２番染色体と９番染色体とが転座して、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子及びＡＢＬ１−ＢＣＲ融合遺伝子が生じる（図８参照）。前記実施形態のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて核酸増幅反応を行うことにより、これらの融合遺伝子由来の核酸増幅断片を得ることができる。
ＤＮＡ試料の調製は、上記［疾患ＤＮＡの定量方法］の＜工程（Ｂ）＞の項で説明した方法と同様に行うことができる。
プライマーペアは、前記実施形態のプライマーセットから、任意のフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せを選択する。対象のＤＮＡ試料を鋳型とする核酸増幅反応は、前記実施形態のプライマーセットから選択可能な全てのプライマーペアについて行うことが好ましい。核酸増幅反応の方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法が好ましい。
各プライマーペアによる核酸増幅反応後、核酸増幅断片の有無をアガロースゲル電気泳動法等により確認する。核酸増幅断片が確認された場合、前記核酸増幅断片中に切断点が存在することになる。
＜工程（Ａ−２）＞
工程（Ａ−２）では、前記核酸増幅反応により得られた核酸増幅断片の配列解析を行い、前記核酸増幅断片の配列情報を取得する。
工程（Ａ−２）では、前記核酸増幅反応により得られた核酸増幅断片の配列解析を行い、前記核酸増幅断片の配列情報を取得する。
工程（Ａ−１）で核酸増幅断片が得られた場合、前記核酸増幅断片中に切断点が存在する。そのため、前記核酸増幅断片の配列解析を行い、配列情報を取得することにより、切断点を同定することができる。
核酸増幅断片の配列解析は、ＤＮＡシーケンサーを用いて、公知の方法により行うことができる。工程（Ａ−１）において、複数種類のプライマーペアで核酸増幅断片が得られた場合、ＤＮＡシーケンサーの種類に応じて、配列解析に最も適したサイズの核酸増幅断片を選択すればよい。通常、最も小さいサイズの核酸増幅断片を選択することが好ましい。ＤＮＡシーケンサーは、第１世代シーケンサーを用いることができる。
配列解析用のプライマーとしては、工程（Ａ−１）において当該核酸増幅断片を得たプライマーペアを用いることができる。あるいは、前記プライマーペアを構成するプライマーの近傍に、新たにプライマーを設計して用いてもよい。
配列解析用のプライマーとしては、工程（Ａ−１）において当該核酸増幅断片を得たプライマーペアを用いることができる。あるいは、前記プライマーペアを構成するプライマーの近傍に、新たにプライマーを設計して用いてもよい。
＜工程（Ａ−３）＞
工程（Ａ−３）では、前記核酸増幅断片の配列情報に基づいて、前記染色体転座の切断点を同定する。
工程（Ａ−３）では、前記核酸増幅断片の配列情報に基づいて、前記染色体転座の切断点を同定する。
前期工程（Ａ−２）で取得した配列情報を、２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子配列と比較することにより、２２番染色体の切断点を同定することができる。すなわち、前記核酸増幅断片において、ＢＣＲ遺伝子配列と一致する領域と相違する領域との境界が、２２番染色体における切断点である。
また、前期工程（Ａ−２）で取得した配列情報を、９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子配列と比較することにより、９番染色体の切断点を同定することができる。すなわち、前記核酸増幅断片において、ＡＢＬ１遺伝子配列と一致する領域と相違する領域との境界が、９番染色体における切断点である。
また、前期工程（Ａ−２）で取得した配列情報を、９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子配列と比較することにより、９番染色体の切断点を同定することができる。すなわち、前記核酸増幅断片において、ＡＢＬ１遺伝子配列と一致する領域と相違する領域との境界が、９番染色体における切断点である。
本実施形態の同定方法によれば、次世代シーケンサーを用いることなく、切断点の情報を得ることができる。そのため、前記実施形態の疾患ＤＮＡの定量方法を実施する場合、工程（Ａ）〜（Ｃ）の全てを次世代シーケンサーにより行う場合と比較して、コストを低減することができる。
［他の態様］
一実施形態において、本発明は、前記疾患ＤＮＡの定量方法により求められた疾患ＤＮＡ量に基づいて、染色体転座を伴う疾患を有する対象の治療の継続を判断する、染色体転座を伴う疾患の治療方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、前記疾患ＤＮＡの定量方法により求められた疾患ＤＮＡ量に基づいて、染色体転座を伴う疾患を有する対象の治療の継続を判断する、染色体転座を伴う疾患の治療方法を提供する。
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］残存病変の検出
＜材料及び方法＞
＜材料及び方法＞
≪フローサイトメトリー≫
単核細胞（ＭＮＣ）を、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者から採取した末梢血（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）細胞のフィコール分離及び溶血によって分離した。単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｃ受容体に対する抗体で染色し、次いで、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１４（ＭφＰ９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１５（ＨＩ９８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ２５（２Ａ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ２６（ＢＡ５ｂ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３４（８Ｇ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３８（ＨＢ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＬ１ＲＡＰ（８９４１２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）等の表面マーカーに対する抗体で染色した。新たに単離した細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析し、ＳＯＲＰ ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分類した。培養細胞を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。ＦｌｏｗＪｏＴＭソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ）を使用してデータを分析した。
単核細胞（ＭＮＣ）を、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者から採取した末梢血（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）細胞のフィコール分離及び溶血によって分離した。単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｃ受容体に対する抗体で染色し、次いで、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１４（ＭφＰ９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１５（ＨＩ９８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ２５（２Ａ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ２６（ＢＡ５ｂ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３４（８Ｇ１２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３８（ＨＢ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＩＬ１ＲＡＰ（８９４１２、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）等の表面マーカーに対する抗体で染色した。新たに単離した細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析し、ＳＯＲＰ ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分類した。培養細胞を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分析した。ＦｌｏｗＪｏＴＭソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ）を使用してデータを分析した。
≪ＰＣＲ≫
ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）転写産物を、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びネステッドＰＣＲ（ｎＰＣＲ）により評価した。Ｏｓｕｍｉ Ｋ ｅｔ ａｌ（Leuk Lymphoma. 2002 Dec;43(12):2291-9.）に記載されているように、全ＢＭ細胞のＲＴ−ＰＣＲを行った。ＣＤ２５＋ＳＰＣ（ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）からのＲＮＡ及びｎＰＣＲを行ったＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。少量のＣＤ２５＋ ＳＰＣの回収効率を向上させるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスＢＭ細胞を添加した。使用したプライマーを表１に示す。
ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）転写産物を、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びネステッドＰＣＲ（ｎＰＣＲ）により評価した。Ｏｓｕｍｉ Ｋ ｅｔ ａｌ（Leuk Lymphoma. 2002 Dec;43(12):2291-9.）に記載されているように、全ＢＭ細胞のＲＴ−ＰＣＲを行った。ＣＤ２５＋ＳＰＣ（ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）からのＲＮＡ及びｎＰＣＲを行ったＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。少量のＣＤ２５＋ ＳＰＣの回収効率を向上させるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスＢＭ細胞を添加した。使用したプライマーを表１に示す。
≪次世代シーケンサー（ＮＧＳ）によるｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎの同定≫
（ＤＮＡ抽出）
１５人の患者から骨髄血液細胞を採取し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を用いて、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡの濃度を、Ｑｕｂｉｔ蛍光分析法（Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。
（ＤＮＡ抽出）
１５人の患者から骨髄血液細胞を採取し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を用いて、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡの濃度を、Ｑｕｂｉｔ蛍光分析法（Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。
（ｆｕｓｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ）
ＢＣＲ Ｅｘｏｎ１３−１５及びＡＢＬ１ Ｅｘｏｎ１−２をキャプチャするために設計されたＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴカスタムキャプチャライブラリキット（１Ｋｂ−４９９Ｋｂ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１転座ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎを検出するためのＤＮＡライブラリを構築した。簡単に記載すると、Ｃｏｖａｒｉｓ ＤＮＡせん断システム（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２）を用いて、１０〜２００ｎｇの患者ＤＮＡをせん断し、１５０〜２００ｂｐのサイズに断片化した。次いで、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ ＨＳ Ｌｉｂｒａｓｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ及び分子バーコードキットを用いてサンプルを調製し、インデックスプライマーを用いてＰＣＲを行った。この増幅産物を、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ ＨＳ試薬を用いてハイブリダイズし、ＰＣＲで増幅した。次いで、調製したＤＮＡライブラリの２５０ｂｐ断片の両末端を、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、ＭｉＳｅｑ ＤＮＡシーケンサーにより配列決定した。
ＢＣＲ Ｅｘｏｎ１３−１５及びＡＢＬ１ Ｅｘｏｎ１−２をキャプチャするために設計されたＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴカスタムキャプチャライブラリキット（１Ｋｂ−４９９Ｋｂ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１転座ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎを検出するためのＤＮＡライブラリを構築した。簡単に記載すると、Ｃｏｖａｒｉｓ ＤＮＡせん断システム（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２）を用いて、１０〜２００ｎｇの患者ＤＮＡをせん断し、１５０〜２００ｂｐのサイズに断片化した。次いで、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ ＨＳ Ｌｉｂｒａｓｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ及び分子バーコードキットを用いてサンプルを調製し、インデックスプライマーを用いてＰＣＲを行った。この増幅産物を、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ ＨＳ試薬を用いてハイブリダイズし、ＰＣＲで増幅した。次いで、調製したＤＮＡライブラリの２５０ｂｐ断片の両末端を、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、ＭｉＳｅｑ ＤＮＡシーケンサーにより配列決定した。
アダプター及び低品質ＤＮＡを除去するために、ｔｒｉｍ ｇａｌｏｒｅプログラム（バージョン０．４．４、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ／）及びｃｕｔａｄａｐｔプログラム（バージョン１．１４）を用いて、得られたＤＮＡ配列データをトリミングした。トリミングした配列データを、ｂｗａプログラム（バージョン０．７．１６ａ−ｒ１１８１）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡｒｅｆｅｒｅｎｃｅ配列（ｈｓ３７ｄ５）にマッピングした。一方の末端ＤＮＡ配列をＢＣＲ領域にマッピングし、他方の末端ＤＮＡ配列をＡＢＬ領域にマッピングして、ＤＮＡ配列をスクリーニングし、ＢＣＲ−ＡＢＬ１転座のｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎを決定した（表２）。次いで、サンガー法を用いた配列解析により、ＢＣＲ−ＡＢＬ１転座の全てのｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ配列を検証した。プライマー配列を表３に示す。検証のために、Ｐｒｉｍｅｒ３オンラインソフトウェアを用いて、ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎの少なくとも２００ｂｐ上流及び下流にプライマーを設計した。
≪残存病変の定量≫
（ＤＮＡ抽出）
治療後の７人の患者（ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ配列解析済）からＢＭ又はＰＢを採取し、フローサイトメトリーでソーティングした。ソーティングした細胞から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ又はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてＤＮＡを抽出した。
（ＤＮＡ抽出）
治療後の７人の患者（ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ配列解析済）からＢＭ又はＰＢを採取し、フローサイトメトリーでソーティングした。ソーティングした細胞から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ又はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ ＸＳ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてＤＮＡを抽出した。
（デジタルＰＣＲによる定量）
まず、ＶＩＣ−蛍光色素セットを有する患者特異的プライマー及びＴａｑｍａｎプローブを各患者のｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ上に設計して、各患者のＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡを検出した。プライマー及びプローブの配列を表４及ぶ表５に示す。診断時のＤＮＡを陽性対照として使用し、正常ヒトゲノムＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）を陰性対照として使用した。各サンプル中のゲノムＤＮＡの正確なコピー数を、ＴａｑＭａｎＴＭ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ，ｈｕｍａｎ，ＲＮａｓｅ Ｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてカウントした。ＢＣＲ−ＡＢＬ１転座ゲノムＤＮＡを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ＤデジタルＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたデジタルＰＣＲにより検出及び測定した。簡潔に記載すると、ＤＮＡサンプル、ＱＳ３ＤデジタルＰＣＲマスターミックスバージョン２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、３００ｎＭの各プライマー、及び２５０ｎＭのプローブを含む１６μＬの反応混合物を調製し、ＱＳ３Ｄデジタル２０Ｋチップにロードした。チップをＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、ＰＣＲを行った（９６℃、１０分；（６０℃、２分；９８℃、３０秒）×３９サイクル；６０℃、２分；暗所１０℃で維持）。次いで、ＱＳ３ＤデジタルＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＰＣＲ混合物１μＬ当たりのコピー数（コピー／反応１μＬ）としてＤＮＡを定量した。データの解析には、ＱＳ３Ｄ ＡｎａｌｙｓｉｓＳｕｉｔ Ｃｌｏｕｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。希釈アッセイによれば、５未満の陽性ドット数は信頼できず再現性がなかったため、カットオフラインを、５ドットを超える陽性クラスターとして定義した。
まず、ＶＩＣ−蛍光色素セットを有する患者特異的プライマー及びＴａｑｍａｎプローブを各患者のｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ上に設計して、各患者のＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡを検出した。プライマー及びプローブの配列を表４及ぶ表５に示す。診断時のＤＮＡを陽性対照として使用し、正常ヒトゲノムＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）を陰性対照として使用した。各サンプル中のゲノムＤＮＡの正確なコピー数を、ＴａｑＭａｎＴＭ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ，ｈｕｍａｎ，ＲＮａｓｅ Ｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてカウントした。ＢＣＲ−ＡＢＬ１転座ゲノムＤＮＡを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ＤデジタルＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたデジタルＰＣＲにより検出及び測定した。簡潔に記載すると、ＤＮＡサンプル、ＱＳ３ＤデジタルＰＣＲマスターミックスバージョン２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、３００ｎＭの各プライマー、及び２５０ｎＭのプローブを含む１６μＬの反応混合物を調製し、ＱＳ３Ｄデジタル２０Ｋチップにロードした。チップをＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、ＰＣＲを行った（９６℃、１０分；（６０℃、２分；９８℃、３０秒）×３９サイクル；６０℃、２分；暗所１０℃で維持）。次いで、ＱＳ３ＤデジタルＰＣＲ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＰＣＲ混合物１μＬ当たりのコピー数（コピー／反応１μＬ）としてＤＮＡを定量した。データの解析には、ＱＳ３Ｄ ＡｎａｌｙｓｉｓＳｕｉｔ Ｃｌｏｕｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。希釈アッセイによれば、５未満の陽性ドット数は信頼できず再現性がなかったため、カットオフラインを、５ドットを超える陽性クラスターとして定義した。
（ＮＧＳを用いた定量）
各患者のサンプルを、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）ポリメラーゼにより、患者特異的な３つのプライマーを用いて一次増幅した。アダプターの共通領域を除いたＰＣＲ産物が１５０〜３００ｂｐ以内になり、且つＰＣＲ産物がｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎを含むように、プライマーを設計した。試料中の最小残存病変の頻度を検証するために、転座したｔ（９；２２）のＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡ及び正常染色体（Ｃｈ）２２の正常ＢＣＲの両方を増幅するように、ＢＣＲ配列用フォワープライマーとセットとなるように、ＡＢＬ１配列用のリバースプライマー及びＢＣＲ配列法リバースプライマーを設計した。プライマー及びプローブの配列を表６〜８に示す。次いで、ＮＧＳ用のアダプター配列を有するプライマーを用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘポリメラーゼにより、試料を二次増幅した（２ｎｄ ＰＣＲ）。その結果、一次増幅ＰＣＲ産物が試料中で５０倍を超えて希釈された。ＰＣＲ増幅の概略を図２に示す。１ｓｔ ＰＣＲ及び２ｎｄ ＰＣＲの条件を表９に示す。
次いで、サンプルを混合し、ブリッジ増幅及びクラスター生成の後、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、２５０塩基対ペアエンドシーケンシングを行った。
各患者のサンプルを、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）ポリメラーゼにより、患者特異的な３つのプライマーを用いて一次増幅した。アダプターの共通領域を除いたＰＣＲ産物が１５０〜３００ｂｐ以内になり、且つＰＣＲ産物がｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎを含むように、プライマーを設計した。試料中の最小残存病変の頻度を検証するために、転座したｔ（９；２２）のＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡ及び正常染色体（Ｃｈ）２２の正常ＢＣＲの両方を増幅するように、ＢＣＲ配列用フォワープライマーとセットとなるように、ＡＢＬ１配列用のリバースプライマー及びＢＣＲ配列法リバースプライマーを設計した。プライマー及びプローブの配列を表６〜８に示す。次いで、ＮＧＳ用のアダプター配列を有するプライマーを用いて、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ＤｙｅＭｉｘポリメラーゼにより、試料を二次増幅した（２ｎｄ ＰＣＲ）。その結果、一次増幅ＰＣＲ産物が試料中で５０倍を超えて希釈された。ＰＣＲ増幅の概略を図２に示す。１ｓｔ ＰＣＲ及び２ｎｄ ＰＣＲの条件を表９に示す。
次いで、サンプルを混合し、ブリッジ増幅及びクラスター生成の後、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、２５０塩基対ペアエンドシーケンシングを行った。
ｄＰＣＲで定量された診断時のＤＮＡ及び正常ヒトゲノムＤＮＡを混合して、ＮＧＳ用検量線サンプルを作製した。ＮＧＳ用検量線サンプルで検出されたＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡ及び正常ＢＣＲのリード数を表１０に示す。表１０に示すデータから作製した検量線を図３に示す。前記検量線に基づいて、各患者サンプルにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡの割合を算出した。
＜結果＞
ＴＫＩ療法でほとんどのＣＤ２５＋ ＳＰＣを根絶できると考え、これらの細胞を１４人の患者から収集した。Ｐｈ染色体（ｎ＝６）及びＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｍＲＮＡ（ｎ＝６）のいずれも、これらの細胞では検出されなかった。さらに、液体培養中のＣＤ２５＋ＳＰＣは、ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの証拠を示さなかった（ｎ＝２）。さらに、ＨＳＣと同様に、ＣＭＬ−ＬＳＣは限られた量のｍＲＮＡしか産生しない可能性が高いため（Ross DM et al., Leukemia. 2010 Oct;24(10):1719-24.）、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡを評価した。７人の患者全員がＴＫＩ治療を受けており、臨床検査により６人の患者でＢＣＲ−ＡＢＬ１のｍＲＮＡが検出された（表１１）。
また、ＢＭサンプル及びＰＢサンプルについて、デジタルＰＣＲ解析を行った。デジタルＰＣＲ解析では、ＢＭサンプル及びＰＢサンプルのいずれの分画においても、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡ陰性であった（表１２）。
ＴＫＩ療法でほとんどのＣＤ２５＋ ＳＰＣを根絶できると考え、これらの細胞を１４人の患者から収集した。Ｐｈ染色体（ｎ＝６）及びＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｍＲＮＡ（ｎ＝６）のいずれも、これらの細胞では検出されなかった。さらに、液体培養中のＣＤ２５＋ＳＰＣは、ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの証拠を示さなかった（ｎ＝２）。さらに、ＨＳＣと同様に、ＣＭＬ−ＬＳＣは限られた量のｍＲＮＡしか産生しない可能性が高いため（Ross DM et al., Leukemia. 2010 Oct;24(10):1719-24.）、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡを評価した。７人の患者全員がＴＫＩ治療を受けており、臨床検査により６人の患者でＢＣＲ−ＡＢＬ１のｍＲＮＡが検出された（表１１）。
また、ＢＭサンプル及びＰＢサンプルについて、デジタルＰＣＲ解析を行った。デジタルＰＣＲ解析では、ＢＭサンプル及びＰＢサンプルのいずれの分画においても、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡ陰性であった（表１２）。
次に、ＮＧＳを用いた解析を行った。ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡ配列は、１人の患者（ＫＵ１２８）のＣＤ２５＋ ＳＰＣ画分、及び４人の患者（ＫＵ１２５、ＫＵ１２６、ＫＵ１２８、ＫＵ１３０）のＣＤ２５− ＳＰＣを含む他の画分で検出された（図４）。これらの結果は、ＴＫＩ療法後のＣＤ２５＋ ＳＰＣは、主たる残存ＣＭＬ細胞ではないことを示している。次いで、ＰＢの４画分（ＣＤ３４＋細胞、骨髄性細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞）について分析を行った。その結果、７人の患者のうち６人においてＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡが検出された（図５）。Ｂ細胞は、これらの６人の患者の間で共通のＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡ陽性画分であった。ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合ｇＤＮＡは、６人の患者のうちの３人（ＫＵ００１、ＫＵ１５７、ＫＵ１５９）のＢＭ細胞において陰性であった。これらの知見に基づき、末梢Ｂ細胞を用いた残存ＣＭＬ細胞の検出は、ＣＭＬ幹細胞マーカーＣＤ２５陽性のＢＭ細胞を用いるよりも高感度であると結論した。
［実験例２］ＰＣＲ法による切断点の同定
＜プライマーの設計＞
図６は、９番染色体と２２番染色体との転座を概念的に示す。染色体９ｑ３４に存在するＡＢＬ１遺伝子と、染色体２２ｑ１１に存在するＢＣＲ遺伝子と、の間で転座が生じることにより、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子（ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｐ１１））が形成される。転座の切断点は、患者毎に異なっている。本実験例では、ＢＣＲ遺伝子にアニーリングするフォワードプライマーと、ＡＢＬ１遺伝子にアニーリングするするリバースプライマーと、をそれぞれ複数種類設計し、ＰＣＲ法により切断点の同定を試みた。
＜プライマーの設計＞
図６は、９番染色体と２２番染色体との転座を概念的に示す。染色体９ｑ３４に存在するＡＢＬ１遺伝子と、染色体２２ｑ１１に存在するＢＣＲ遺伝子と、の間で転座が生じることにより、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子（ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｐ１１））が形成される。転座の切断点は、患者毎に異なっている。本実験例では、ＢＣＲ遺伝子にアニーリングするフォワードプライマーと、ＡＢＬ１遺伝子にアニーリングするするリバースプライマーと、をそれぞれ複数種類設計し、ＰＣＲ法により切断点の同定を試みた。
図７に、切断点の同定に用いたプライマーの設計位置を示す。ＢＣＲ遺伝子のエクソン１３〜１５の領域に、４種類のフォワードプライマー（１Ｆ〜４Ｆ）を設計した（図７上段）。ＡＢＬ１遺伝子のエクソン１〜２の領域に、１０２種類のリバースプライマー（１Ｒ〜１０２Ｒ）を設計した（図７下段）。表１３に、ＢＣＲ遺伝子用フォワードプライマーの配列を示す。表１４〜１６に、ＡＢＬ１遺伝子用リバースプライマーの配列を示す。
＜切断点の同定スキーム＞
図８は、切断点の同定スキームを示す。患者の細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、フォワードプライマー ＢＣＲ−１Ｆ〜４Ｆと、リバースプライマー ＡＢＬ１−１Ｒ〜１０２Ｒとを組み合わせて、ＰＣＲを行う（図８下段、左図）。切断点を挟んで近接するプライマーペア（約１００〜５０００ｂｐ）により、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子の断片が増幅される（図８中段、左図）。一方、ＡＢＬ１−ＢＣＲ融合遺伝子は増幅されない（図８中段、右図）。各プライマーペアによるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行い、核酸増幅断片を確認する（図８下段、中図）。図８の例では、ＢＣＲ−１Ｆと、ＡＢＬ１−１８Ｒ、ＡＢＬ１−１９Ｒ又はＡＢＬ１−２０Ｒと、の組合せで核酸増幅断片が得られている。次に、核酸増幅断片の配列解析を行い、切断点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）を同定する（図８下段、右図）。
図８は、切断点の同定スキームを示す。患者の細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、フォワードプライマー ＢＣＲ−１Ｆ〜４Ｆと、リバースプライマー ＡＢＬ１−１Ｒ〜１０２Ｒとを組み合わせて、ＰＣＲを行う（図８下段、左図）。切断点を挟んで近接するプライマーペア（約１００〜５０００ｂｐ）により、ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子の断片が増幅される（図８中段、左図）。一方、ＡＢＬ１−ＢＣＲ融合遺伝子は増幅されない（図８中段、右図）。各プライマーペアによるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行い、核酸増幅断片を確認する（図８下段、中図）。図８の例では、ＢＣＲ−１Ｆと、ＡＢＬ１−１８Ｒ、ＡＢＬ１−１９Ｒ又はＡＢＬ１−２０Ｒと、の組合せで核酸増幅断片が得られている。次に、核酸増幅断片の配列解析を行い、切断点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）を同定する（図８下段、右図）。
＜ゲノムＤＮＡのＰＣＲ＞
ＣＭＬ患者のゲノムＤＮＡ（サンプル１、サンプル２）を、Ｑｕｂｉｔ蛍光分析法（Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。ゲノムＤＮＡを、希釈液（ＴＥバッファー（ｐＨ８．０） １０００μＬ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ９０μＬ、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ８９１０μＬ）を用いて、１０ｎｇ／μＬに希釈し、ＰＣＲ鋳型用の患者ＤＮＡ試料とした。
ＣＭＬ患者のゲノムＤＮＡ（サンプル１、サンプル２）を、Ｑｕｂｉｔ蛍光分析法（Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。ゲノムＤＮＡを、希釈液（ＴＥバッファー（ｐＨ８．０） １０００μＬ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ９０μＬ、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ８９１０μＬ）を用いて、１０ｎｇ／μＬに希釈し、ＰＣＲ鋳型用の患者ＤＮＡ試料とした。
患者ＤＮＡ試料１μＬ（ＤＮＡ １０ｎｇ）を用いて、ＰＣＲ反応液量２０μＬで、ＰＣＲ反応（アニーリング温度６０℃、３５サイクル；Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ３ Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ）を行った。ＰＣＲ反応液の組成は以下の通りである。ネガティブコントロールとして、患者ＤＮＡ料に替えて、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ、又はＣｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ（Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ−Ｈｕｍａｎ Ａｄｕｌｔ；ＢｉｏＣｈａｉｎ）を用いた。
患者ＤＮＡ試料：１μＬ（ＤＮＡ １０ｎｇ）
プライマー：１μＬ（フォワード及びリバースそれぞれＤＮＡ ０．６６ｎｇ）
ＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１Ｕ／μＬ；ＫＦＸ−１０１；ＴＯＹＯＢＯ）：０．１μＬ
２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＫＦＸ−１０１；ＴＯＹＯＢＯ）：５μＬ
２．５ｎＭ ｄＮＴＰｓ（ＫＦＸ−１０１；ＴＯＹＯＢＯ）：１μＬ
５Ｍ Ｂｅｔａｉｎ（無水、一級；和光純薬）：０μＬ又は２μＬ
患者ＤＮＡ試料：１μＬ（ＤＮＡ １０ｎｇ）
プライマー：１μＬ（フォワード及びリバースそれぞれＤＮＡ ０．６６ｎｇ）
ＫＯＤ ＦＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１Ｕ／μＬ；ＫＦＸ−１０１；ＴＯＹＯＢＯ）：０．１μＬ
２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（ＫＦＸ−１０１；ＴＯＹＯＢＯ）：５μＬ
２．５ｎＭ ｄＮＴＰｓ（ＫＦＸ−１０１；ＴＯＹＯＢＯ）：１μＬ
５Ｍ Ｂｅｔａｉｎ（無水、一級；和光純薬）：０μＬ又は２μＬ
ＰＣＲ反応後、２μＬ又は１０μＬのＰＣＲ反応液を用いて、０．７％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ−Ａ、ＳＩＧＭＡ）電気泳動を行った。サイズマーカーには、ＳＭ１０１ Ｌａｍｂｄａ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（１５０ｎｇ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び３４０５Ａ φ１７４／Ｈａｅ ＩＩＩ（１５０ｎｇ）（Ｔａｋａｒａ）を用いた。
図９Ａは、サンプル１において、以前に同定されたＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子の切断点を示す。図９Ａに示すように、サンプル１では、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１８Ｒにより、１１６２ｂｐの断片が増幅されると予測される。また、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１９Ｒにより、２１６３ｂｐの断片が増幅されると予測される。
図９Ｂは、サンプル１のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応液のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１８Ｒ、及びプライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１９Ｒを用いた場合には、図９Ａで予想されるサイズとほぼ同サイズの核酸増幅断片が検出された。一方、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１７Ｒを用いた場合には、核酸増幅断片は検出されなかった。Ｂｅｔａｉｎｅは、ＰＣＲ増幅効率改善試薬として使用した。患者ＤＮＡ試料に替えて、水又はＣｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡを用いたものでは、核酸増幅断片は検出されなかった。
図９Ｂは、サンプル１のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応液のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１８Ｒ、及びプライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１９Ｒを用いた場合には、図９Ａで予想されるサイズとほぼ同サイズの核酸増幅断片が検出された。一方、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１７Ｒを用いた場合には、核酸増幅断片は検出されなかった。Ｂｅｔａｉｎｅは、ＰＣＲ増幅効率改善試薬として使用した。患者ＤＮＡ試料に替えて、水又はＣｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡを用いたものでは、核酸増幅断片は検出されなかった。
図１０Ａは、サンプル２において、以前に同定されたＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子の切断点を示す。図１０Ａに示すように、サンプル２では、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−７９Ｒにより、２２４０ｂｐの断片が増幅されると予測される。また、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−８０Ｒにより、５７４４ｂｐの断片が増幅されると予測される。
図１０Ｂは、サンプル２のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応液のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−７９Ｒ、及びプライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−８０Ｒを用いた場合には、図１０Ａで予想されるサイズとほぼ同サイズの核酸増幅断片が検出された。一方、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−７８Ｒを用いた場合には、核酸増幅断片は検出されなかった。患者ＤＮＡ試料に替えて、水又はＣｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡを用いたものでは、核酸増幅断片は検出されなかった。
図１０Ｂは、サンプル２のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応液のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−７９Ｒ、及びプライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−８０Ｒを用いた場合には、図１０Ａで予想されるサイズとほぼ同サイズの核酸増幅断片が検出された。一方、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−７８Ｒを用いた場合には、核酸増幅断片は検出されなかった。患者ＤＮＡ試料に替えて、水又はＣｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡを用いたものでは、核酸増幅断片は検出されなかった。
＜核酸増幅断片の配列解析＞
プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１８Ｒを用いて、上記と同様にＰＣＲ反応及びアガロースゲル電気泳動を行い、１１６２ｂｐの核酸増幅断片を確認した。プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−７９Ｒを用いて、上記と同様にＰＣＲ反応及びアガロースゲル電気泳動を行い、２２４０ｂｐの核酸増幅断片を確認した。
プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−１８Ｒを用いて、上記と同様にＰＣＲ反応及びアガロースゲル電気泳動を行い、１１６２ｂｐの核酸増幅断片を確認した。プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ／ＡＢＬ１−７９Ｒを用いて、上記と同様にＰＣＲ反応及びアガロースゲル電気泳動を行い、２２４０ｂｐの核酸増幅断片を確認した。
ＰＣＲ反応後のＰＣＲ反応液５μＬに、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ ５μＬを添加して混和し、ＳＡＰ処理用試料とした。ＳＡＰ処理は、ＰＣＲ産物をＥｘｏ ＳＡ−ＩＴ（登録商標）という酵素混合液で処理することにより、ｄＮＴＰの不活性化とモノマーの分解を行う処理である。ＳＡＰ処理は、３７℃で３０分間、次いで８０℃で１５分間反応させた後、室温で維持することにより行った。ＳＡＰ処理反応液の組成を以下に示す。
ＳＡＰ処理用試料：９．０μＬ
Ｅｘｏ ＳＡＰ−ＩＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）：２．０μＬ
ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）：７．０μＬ
ＳＡＰ処理用試料：９．０μＬ
Ｅｘｏ ＳＡＰ−ＩＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）：２．０μＬ
ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）：７．０μＬ
ＳＡＰ処理後のＳＡＰ処理反応液５μＬに、Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ ５μＬを添加し、配列解析用試料とした。サンプル１については、プライマーペアＢＣＲ−２Ｆ−１／ＡＢＬ１−１７Ｒ−１を用いて、配列解析用反応を行った。サンプル２については、プライマーペアＢＣＲ−３Ｆ／ＡＢＬ１−７８Ｒ−１を用いて、配列解析用反応（９６℃で２分；９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分、２５サイクル；室温）を行った。配列解析用反応液の組成を以下に示す。プライマー配列を表１７に示す。
配列解析用試料：４．０μＬ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ０．０、５ｎＭ ＭｇＣｌ２））：１．６μＬ
ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） ｖｅｒ．３．１：０．５μＬ
１０μＭ プライマー：０．５μＬ
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ：１．１μＬ
配列解析用試料：４．０μＬ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ０．０、５ｎＭ ＭｇＣｌ２））：１．６μＬ
ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） ｖｅｒ．３．１：０．５μＬ
１０μＭ プライマー：０．５μＬ
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ：１．１μＬ
配列解析用ＰＣＲ反応後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＣｌｅａｎＳＥＱ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いて精製した。次いで、Ｈｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） ４０μＬでＤＮＡを溶出し、３０μのサンプルを回収した。
上記で調製したサンプルを、シーケンサー（３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、３１００ ＰＯＰ−６ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にランし、配列解析を行った。配列解析には、ＣｏｄｏｎＣｏｄｅ Ａｌｉｇｎｅｒ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０．１を用いた。
図１１Ａは、サンプル１について、切断点を同定した結果を示す。サンプル１では、２２番染色体における切断点はｈｇ１９ Ｃｈｒ２２：２３，６３３，５３１、９番染色体における切断点はｈｇ１９ Ｃｈｒ９：１３３，６１４，００１と、同定された。
図１１Ｂは、サンプル２について、切断点を同定した結果を示す。サンプル２では、２２番染色体における切断点はｈｇ１９ Ｃｈｒ２２：２３，６３４，７０５、９番染色体における切断点はｈｇ１９ Ｃｈｒ９：１３３，７０１，２８６と、同定された。
図１１Ｂは、サンプル２について、切断点を同定した結果を示す。サンプル２では、２２番染色体における切断点はｈｇ１９ Ｃｈｒ２２：２３，６３４，７０５、９番染色体における切断点はｈｇ１９ Ｃｈｒ９：１３３，７０１，２８６と、同定された。
以上の結果から、ＰＣＲ法を用いて、切断点の同定が可能であることが確認された。
本発明によれば、高感度に精度よくＭＲＤを定量することができる、染色体転座を有する疾患ＤＮＡの定量方法が提供される。
Claims (12)
- 染色体転座を伴う疾患を有する対象について、前記染色体転座の切断点の情報を取得する工程（Ａ）と、
前記対象のＤＮＡ試料を鋳型として、前記染色体転座が生じた染色体の前記切断点を含むＤＮＡ領域（ｂ）及び正常染色体の前記切断点の座標を含むＤＮＡ領域（ｎ）の核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程（Ｂ）と、
前記増幅産物の配列解析を行い、前記ＤＮＡ領域（ｂ）の配列を含むリード数（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の配列を含むリード数（ｎ）を取得する工程（Ｃ）と、
前記ＤＮＡ領域（ｎ）に対する前記ＤＮＡ領域（ｂ）の割合（ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ））が互いに異なる複数の標準ＤＮＡ試料を用いて、前記リード数（ｎ）に対する前記リード数（ｂ）の割合（リード数（ｂ）／リード数（ｎ））から前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を求める検量線を作製する工程（Ｄ）と、
前記検量線を用いて、前記工程（Ｃ）で取得した前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）に基づいて、前記ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）／ＤＮＡ領域（ｎ）を算出する工程（Ｅ）と、
を含む、疾患ＤＮＡの定量方法。 - 前記ＤＮＡ試料が、前記疾患の治療中の前記対象から取得したＤＮＡ試料である、請求項１に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
- 前記配列解析を次世代シーケンサーで行う、請求項１又は２に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
- 前記標準ＤＮＡ試料における前記ＤＮＡ領域（ｂ）及び前記ＤＮＡ領域（ｎ）の定量を、デジタルＰＣＲで行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
- 前記標準ＤＮＡ試料における前記リード数（ｂ）及び前記リード数（ｎ）の取得を、次世代シーケンサーを用いて行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
- 前記ＤＮＡ試料が、
フローサイトメトリーで分画された細胞画分から調製されたＤＮＡ試料である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。 - 前記疾患が、慢性骨髄性白血病、及び急性リンパ性白血病からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
- ２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点同定用プライマーセットであって、
（ａ）２２番染色体におけるＢＣＲ遺伝子のエクソン１３からエクソン１５までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記２２番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー；及び
（ｂ）９番染色体におけるＡＢＬ１遺伝子のエクソン１からエクソン２までの領域にアニーリングするプライマーであって、前記９番染色体上のアニーリング位置が相互に重複しない、複数種類のプライマー、
を含む、プライマーセット。 - 前記（ａ）のプライマーがフォワードプライマーであり、前記（ｂ）のプライマーがリバースプライマーである、請求項８に記載のプライマーセット。
- 前記（ａ）のプライマーが、配列番号６４〜６７のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであり、
前記（ｂ）のプライマーが、配列番号６８〜１６９のいずれかに記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーである、
請求項９に記載のプライマーセット。 - ２２番染色体と９番染色体との染色体転座の切断点の同定方法であって、
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のプライマーセットから選択されるプライマーペアを用いて、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患を有する対象のＤＮＡ試料を鋳型として、核酸増幅反応を行う工程（Ａ−１）と、
前記核酸増幅反応により得られた核酸増幅断片の配列解析を行い、前記核酸増幅断片の配列情報を取得する工程（Ａ−２）と、
前記核酸増幅断片の前記配列情報に基づいて、前記染色体転座の切断点を同定する工程（Ａ−３）と、
を含む、切断点の同定方法。 - 前記染色体転座を伴う疾患が、２２番染色体と９番染色体との染色体転座を伴う疾患であり、
前記工程（Ａ）における染色体転座の切断点の情報を、請求項１１に記載の切断点の同定方法により取得する、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の疾患ＤＮＡの定量方法。
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| JP2020015314A JP2021122180A (ja) | 2020-01-31 | 2020-01-31 | 疾患ｄｎａの定量方法 |
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|---|---|---|---|
| JP2020015314A JP2021122180A (ja) | 2020-01-31 | 2020-01-31 | 疾患ｄｎａの定量方法 |
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|---|---|
| JP2021122180A true JP2021122180A (ja) | 2021-08-30 |
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| JP2020015314A Pending JP2021122180A (ja) | 2020-01-31 | 2020-01-31 | 疾患ｄｎａの定量方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2021122180A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023058100A1 (ja) * | 2021-10-04 | 2023-04-13 | 国立大学法人 東京大学 | 構造多型の検出方法、プライマーセット及びプライマーセットの設計方法 |
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2020
- 2020-01-31 JP JP2020015314A patent/JP2021122180A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023058100A1 (ja) * | 2021-10-04 | 2023-04-13 | 国立大学法人 東京大学 | 構造多型の検出方法、プライマーセット及びプライマーセットの設計方法 |
| WO2023058522A1 (ja) * | 2021-10-04 | 2023-04-13 | 国立大学法人 東京大学 | 構造多型の分析方法、プライマー対セット及びプライマー対セットの設計方法 |
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