JP2021093947A

JP2021093947A - 皮膚バリア機能低下抑制剤の評価又は選択方法

Info

Publication number: JP2021093947A
Application number: JP2019227106A
Authority: JP
Inventors: 明音川本; Akane Kawamoto
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2021-06-24

Abstract

【課題】皮膚バリア機能低下抑制剤の評価又は選択のための迅速で簡便な方法の提供。【解決手段】被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルにおける、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを評価することを含む、皮膚バリア機能低下抑制剤の評価及び／又は選択方法。【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚バリア機能低下抑制剤を評価又は選択する方法に関する。

皮膚の最外層には、角層と呼ばれる数層から数十層に規則正しく重なる構造が存在する。角層は、皮膚の内側からの水分の蒸散を防ぐ機能と、外界から皮膚への物質の侵入を防ぐ機能をつかさどっており、これらの機能は皮膚のバリア機能と呼ばれている。アトピー性皮膚炎の患者では、皮膚バリア機能が恒常的に低下していることが知られている。アトピー性皮膚炎との関連が報告されている因子として、アレルゲン（例えばハウスダストダニ、花粉）、黄色ブドウ球菌などが知られている。バリア機能が低下した皮膚は、これらのアレルゲン又は菌が侵入しやすい状態にある。侵入したアレルゲン又は菌は、それらが保有するプロテアーゼによりさらに皮膚バリア機能を低下させ、又は炎症性応答を介して様々な皮膚トラブルを惹起する可能性がある。皮膚のバリア機能の維持及び低下の抑制は、健康な皮膚を維持し、又は乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎等を改善するために重要である。

従前、皮膚バリア機能の評価は、実験動物又は動物から単離した皮膚組織を用いて行われていた（例えば非特許文献１、２）。しかし、これらの方法は手間や時間がかかり、また実験動物を必要とするため好ましくない。非特許文献３では、培養ケラチノサイトを用いて小麦グルテン、ダニ、トリプシンなどのアレルゲンタンパク質に対する免疫応答を調べたことが開示されている。しかし、ケラチノサイトの単層培養物は、実際の皮膚とは構造的に異なるため、皮膚モデルとしては不十分である。特許文献１には、再生表皮モデルにハウスダスト及びシソエキスを適用して４８時間培養した後、炎症性サイトカイン関連遺伝子及び皮膚バリア機能関連遺伝子の発現を指標に、該表皮モデルの炎症や皮膚バリア機能を評価したことが開示されている。

特開２０１８−１８３１０５号公報

J Invest Dermatol, 2010, 130(2):614-617 J Invest Dermatol, 2008, 128(4):906-916 J Immunotoxicol, 2017, 14(1):178-187

本発明は、皮膚バリア機能低下抑制剤の評価又は選択のための迅速かつ簡便な方法を提供する。

本発明者らは、３次元培養皮膚モデルに黄色ブドウ球菌プロテアーゼを曝露する試験系を用い、かつ該皮膚モデルにおけるサイトカインの発現レベル、細胞接着因子の分解レベル、又は角層構造の保持レベルを指標とすることで、比較的短時間に、被験物質の皮膚バリア機能低下に及ぼす作用を評価することができることを見出した。

したがって、本発明は、被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルにおける、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを評価することを含む、皮膚バリア機能低下抑制剤の評価及び／又は選択方法を提供する。

本発明によれば、実験動物又は動物から単離した皮膚組織を用いることなく、簡便かつ迅速に、物質の皮膚バリア機能低下抑制作用を評価することができる。また本発明では、３次元培養皮膚モデルを用いることでプロテアーゼ刺激に対する皮膚の応答を再現することができるので、現実の皮膚に対して効果のある皮膚バリア機能低下抑制剤を効率よく探索することができる。

各種アレルゲンによる刺激の３時間後の３次元培養皮膚モデルにおけるサイトカイン発現。エラーバー＝Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１（Dunnet検定 vs コントロール）。プロテアーゼ刺激１〜１８時間後の３次元培養皮膚モデルにおけるサイトカイン発現。（ａ）ＴＳＬＰ遺伝子発現結果、（ｂ）ＩＬ−８遺伝子発現結果。エラーバー＝Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１（Turkey検定）。図２−１の続き。（ｃ）ＩＬ−１α遺伝子発現結果、（ｄ）ＩＬ−１β遺伝子発現結果。図２−２の続き。（ｅ）ＴＮＦα遺伝子発現結果。３次元培養皮膚モデルにおけるサイトカイン発現に及ぼすプロテアーゼ刺激濃度の検討結果。エラーバー＝Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１（Dunnet検定）。３次元培養皮膚モデルにおけるプロテアーゼ刺激誘導サイトカイン発現に対する試験物質の抑制作用。エラーバー＝Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１（Dunnet検定）。３次元培養皮膚モデルにおける細胞接着因子のウエスタンブロット像。黒矢印は、上からＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＣｌａｕｄｉｎ−１のバンドの位置を示す。３次元培養皮膚モデルの組織切片の免疫染色像。

本発明は、皮膚バリア機能低下抑制剤の評価及び／又は選択方法を提供する。本発明においては、３次元培養皮膚モデルにおける、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ刺激に対するサイトカインの発現、細胞接着因子の分解又は角層構造の保持を指標として、物質の皮膚バリア機能低下抑制作用を評価する。さらに、当該評価に基づいて、皮膚バリア機能低下抑制作用を有する物質を皮膚バリア機能低下抑制剤として選択する。

より詳細には、本発明の皮膚バリア機能低下抑制剤の評価及び／又は選択方法（以下、単に本発明の方法ともいう）は、被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルにおける、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを評価することを含む。

本発明の方法で用いられる３次元培養皮膚モデルとは、好ましくは３次元培養表皮細胞モデルであり、より好ましくは３次元培養ヒト由来表皮細胞モデルである。このような３次元培養皮膚モデルは、培養系を構築してもよいが、市販されているものを購入することもできる。一例において、３次元培養皮膚モデルは、特開２０００−２０１６９５号公報又は特開２００５−１３７１７号公報に記載の方法に従って、コラーゲンゲルに包埋した繊維芽細胞と表皮細胞とを共培養することにより構築することができる。別の一例において、３次元培養皮膚モデルは、Ｐｏｎｅｃらの方法（J Invest Dermatol, 1997, 109:348-355）に従って、表皮細胞を気液界面培養することにより構築することができる。市販の３次元培養皮膚モデルの例としては、ＥｐｉＤｅｒｍ^TM、皮膚３次元モデルＥＰＩ−２００・２１２・２００Ｘ・６０６・６０６Ｘ・２０１・２９６、皮膚３次元モデルＥＦＴ−４００・４１２、皮膚３次元モデルＭＥＬ−３００・３１２・６０６・３０１、皮膚３次元モデルＭＬＮＭ−ＦＴ−Ａ３７５（ＭａｔＴｅｋ）；ＥｐｉＳｋｉｎ、ＲＨＥ、ＲＨＰＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ）；ＴＥＳＴＳＫＩＮ^TM ＬＳＥ−ｈｉｇｈ、ＭＡＴＲＥＸ^TM ＬＤＭ（ＴＯＹＯＢＯ）；ＬａｂＣｙｔｅＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ（Ｊ−ＴＥＣ）、等が挙げられる。本発明の方法で用いられる３次元培養皮膚モデルは、角層を含むものであればよいが、基底層、有棘層、顆粒層及び角層を含むものが好ましい。市販の３次元培養皮膚モデルを使用する場合は、角層を含む表皮構造が既に形成されている培養６日目程度の３次元培養皮膚モデルを購入し、１日〜数日間順化のため前培養し、その後本発明の方法に用いるのが好ましい。

本発明の方法で用いられる黄色ブドウ球菌プロテアーゼの例としては、Ｖ８プロテアーゼが挙げられる。Ｖ８プロテアーゼは黄色ブドウ球菌Ｖ８株が培地中に分泌するセリンプロテアーゼの一種で、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテアーゼである。Ｖ８プロテアーゼは、黄色ブドウ球菌Ｖ８株の培養物から公知情報に従って精製・単離したものを用いても良いが、Ｖ８プロテアーゼとして市販されているものを用いても良い（例えば、富士フイルム和光純薬工業(株)；１６４−１３９８２）。

３次元培養皮膚モデルにプロテアーゼを適用する手法としては、皮膚がアレルゲンや菌に曝露される実環境を考慮し、プロテアーゼの溶液を、塗布、噴霧、散布、滴下、貼付等により３次元培養皮膚モデルの角層上に適用することが挙げられる。このうち、ろ紙や不織布等にプロテアーゼ溶液を含侵させたものを３次元培養皮膚モデルの角層上に貼付させることが好ましい。

３次元培養皮膚モデルに対するプロテアーゼの適用量は、３次元培養皮膚モデルの角層の表面積１ｃｍ²あたり、好ましくは５〜１５Ｕ（液量として３２〜９７μＬ）、より好ましくは１０〜１５Ｕ（液量として６４〜９７μＬ）である。なお、プロテアーゼ活性１単位（Ｕ）とは、２−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−４−ＮＡを基質としてｐＨ７．８、２５℃において１分間に１μｍｏｌの４−ニトロアニリンを生成する酵素量とする。プロテアーゼの溶液を用いる場合、該溶液中のプロテアーゼ濃度は、上述した量のプロテアーゼを角層の表面に満遍なく適用することができるように、適宜調整すればよい。例えば、該溶液中のプロテアーゼ濃度は、好ましくは０．５〜１．５質量％、より好ましくは１．０〜１．５質量％であればよい。また、プロテアーゼタンパク量当たりのプロテアーゼ活性としては、好ましくは５〜４０Ｕ／ｍｇであり、より好ましくは１０〜３０Ｕ／ｍｇである。

本発明の方法で用いられる被験物質は、皮膚バリア機能低下抑制剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。被験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。被験物質の形態は、特に制限されず、固形、半固形、ゲル、液体、気体等いずれの形態であってもよいが、ゲル又は液体が好ましい。

３次元培養皮膚モデルに被験物質を適用する手法としては、例えば、被験物質を所定の最終濃度になるように含有する培地で３次元培養皮膚モデルを培養すること；３次元培養皮膚モデルを含む培地に、被験物質を所定の最終濃度になるように添加すること；被験物質を、塗布、噴霧、散布、滴下、貼付、照射等により、３次元培養皮膚モデルに対して直接適用すること、などが挙げられる。被験物質が外用剤もしくは外用剤として用いることを企図した物質であるか、又は被験物質がゲル又は液体である場合、該被験物質は、塗布、噴霧、散布、滴下、貼付等により、３次元培養皮膚モデルの角層上に適用されることが好ましい。

被験物質の濃度及び適用量は、被験物質の形態、化学的性質、細胞毒性、予想される皮膚感作性の強度等に基づいて適宜設定すればよい。好ましくは、被験物質の濃度及び適用量は、該被験物質を角層の表面に満遍なく適用することができるように適宜調整される。

３次元培養皮膚モデルに対する被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼの適用の順序は特に制限されない。一実施形態においては、３次元培養皮膚モデルに対して被験物質を適用し、次いで黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用する。別の一実施形態においては、３次元培養皮膚モデルに対して黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用し、次いで被験物質を適用する。別の一実施形態においては、３次元培養皮膚モデルに対して被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼを同時に適用する。好ましくは、３次元培養皮膚モデルに対して被験物質を適用し、次いで黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用する。

より好ましい実施形態においては、まず、被験物質を、塗布、噴霧、散布、滴下、貼付等により、３次元培養皮膚モデルの角層上に適用し、次いで、黄色ブドウ球菌プロテアーゼの溶液を、塗布、噴霧、散布、滴下、貼付等により、該３次元培養皮膚モデルの角層上に適用する。被験物質を適用後、黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用するまでの間隔には特に限定はないが、好ましくは１〜６０分間、より好ましくは５〜３０分間、さらに好ましくは１０〜２０分間である。

本発明の方法においては、被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルを培養する。培養の時間は、１時間以上であればよく、好ましくは３時間以上、より好ましくは３〜１８時間、さらに好ましくは３〜９時間である。その他の培養条件は、３次元培養皮膚モデルの通常の培養条件に従えばよい。例えば、培地には、市販の３次元培養皮膚モデルに付属の培地又は付属のプロトコルに従って調製した培地を用いることができる。当該培地を用いて、好ましくは３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で、上述の時間で該皮膚モデルを培養すればよい。

続いて、上記の手順で培養した３次元培養皮膚モデルにおけるサイトカインの発現、細胞接着因子の量、又は角層構造を評価する。本発明の方法においては、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造のいずれか１つを評価すればよいが、これらの２つ以上、又は全てを評価してもよい。

本発明の方法で評価するサイトカインは、黄色ブドウ球菌プロテアーゼの曝露によりその発現量が変化するサイトカインであれば特に制限されるものではなく、インターロイキン、インターフェロン、胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｈｙｍｉｃｓｔｒｏｍａｌｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＳＬＰ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、エイコサノイド、ＳＣＦ、ＭＣＰ、ＣＳＦなどが挙げられる。測定方法の簡便性の観点から、好ましい例としてインターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＴＳＬＰ、ＴＮＦαが挙げられ、より好ましい例としてＩＬ−１β及びＩＬ−８が挙げられる。本発明の方法においては、上記に挙げたサイトカイン種のいずれか１種又はいずれか２種以上の発現を評価すればよい。

サイトカインの発現は、該サイトカインのポリペプチドの発現、該ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはｍＲＮＡの発現、又は該遺伝子のプロモーターの活性化等に基づいて該サイトカインの発現量を測定することにより、評価することができる。サイトカイン発現量の測定は、目的のパラメータ（例えば、ポリペプチド発現、遺伝子又はｍＲＮＡ発現、プロモーター活性化等）の測定方法として当該分野で公知の方法に従って行えばよい。例えば、遺伝子又はｍＲＮＡ発現の測定方法としては、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイが、レポーター遺伝子を用いたプロモーター活性や転写活性の蛍光・光学的測定（レポーターアッセイ）等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。ポリペプチド発現の測定方法の例としては、アガロースゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クロマトグラフィー法、免疫学的測定法（例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降等）、比色定量法、質量分析、電子顕微鏡観察等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

測定したサイトカインの発現を対照と比較することで、黄色ブドウ球菌プロテアーゼによるサイトカイン発現の上昇（すなわち、該プロテアーゼによる炎症）に対する被験物質の影響を調べることができる。より詳細には、被験物質添加群におけるサイトカイン発現レベルが対照と比較して低いか否かを調べる。例えば、被験物質添加群におけるサイトカイン発現レベルが対照と比較して統計学的に有意に低下していれば、該サイトカイン発現の上昇が該被験物質により抑制されたと判断し得る。また例えば、被験物質添加群におけるサイトカイン発現レベルが対照に対して好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下に低下していれば、該サイトカイン発現の上昇が該被験物質により抑制されたと判断し得る。

本発明の方法で評価する細胞接着因子の例としては、Ｃａｄｈｅｒｉｎなどの細胞表面タンパク質；Ｃｌａｕｄｉｎ、Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ−１（ＤＳＧ−１）、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＪＡＭ）などの膜貫通型タンパク質；ｚｏｎｕｌａｏｃｃｌｕｄｅｎｓ（ＺＯ）−１、２及び３などの細胞質内に存在するタンパク質、などが挙げられ、特に制限されない。好ましい例としては、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１、ＤＳＧ−１及びＺＯ−１が挙げられる。本発明の方法においては、上記に挙げた細胞接着因子のいずれか１種又はいずれか２種以上の量を評価すればよい。

細胞接着因子の量の測定は、当該分野で公知のタンパク質の測定方法に従って行えばよい。測定方法の例としては、アガロースゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クロマトグラフィー法、免疫学的測定法（例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降等）、比色定量法、質量分析、電子顕微鏡観察等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

測定した細胞接着因子の量を対照と比較することで、黄色ブドウ球菌プロテアーゼによる細胞接着因子の分解（すなわち、該プロテアーゼによる皮膚組織の破壊）に対する被験物質の影響を調べることができる。より詳細には、被験物質添加群における細胞接着因子の量が対照と比較して多いか否かを調べる。例えば、被験物質添加群における細胞接着因子の量が対照と比較して統計学的に有意に増加していれば、該細胞接着因子の分解が該被験物質により抑制されたと判断し得る。また例えば、被験物質添加群における細胞接着因子の量が対照に対して１２０％以上、好ましくは１５０％以上に増加していれば、該細胞接着因子の分解が該被験物質により抑制されたと判断し得る。

角層構造の評価は、３次元培養皮膚モデルの顕微鏡観察、免疫組織化学的観察等により実施することができる。角層構造を対照と比較することで、黄色ブドウ球菌プロテアーゼによる角層構造の破壊に対する被験物質の影響を調べることができる。より詳細には、角層の厚さ、角層の形状などに基づいて、被験物質添加群における角層構造が、対照と比較してより保持されているか（より破壊されていないか）否かを調べる。被験物質添加群における角層構造が対照群よりも保持されていれば、該角層構造の破壊が被験物質により抑制されたと判断し得る。

上述したサイトカイン発現レベル、細胞接着因子の量、及び角層構造の比較に用いられる対照としては、被験物質の適用条件以外は上述と同様の条件で培養した３次元培養皮膚モデルが挙げられる。例えば、被験物質非添加で黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用して培養した３次元培養皮膚モデル（例えば、黄色ブドウ球菌プロテアーゼのみを適用して培養した３次元培養皮膚モデル、黄色ブドウ球菌プロテアーゼと対照物質とを適用して培養した３次元培養皮膚モデル、等）、黄色ブドウ球菌プロテアーゼと低濃度の被験物質を適用して培養した３次元培養皮膚モデル、などが挙げられる。ただし、被験物質の影響を比較できる限りにおいて、対照の種類はこれらに限定されない。

本発明の方法においては、上述のとおり評価したサイトカインの発現レベル、細胞接着因子の分解レベル、又は角層構造の保持レベルを指標として、被験物質の皮膚バリア機能の低下抑制作用を評価する。
一例として、サイトカインの発現レベルを指標とする場合、被験物質添加群でのサイトカイン発現レベルが対照と比較して低下していれば、該被験物質は、黄色ブドウ球菌プロテアーゼによるサイトカイン発現の上昇を抑制したと判断される。該被験物質は、皮膚バリア機能低下抑制剤として選択することができる。
別の一例として、細胞接着因子の分解レベルを指標とする場合、被験物質添加群での細胞接着因子の量が対照と比較して増加していれば、該被験物質は、黄色ブドウ球菌プロテアーゼによるによる細胞接着因子の分解を抑制したと判断される。該被験物質は、皮膚バリア機能低下抑制剤として選択することができる。
別の一例として角層構造の保持レベルを指標とする場合、被験物質添加群での角層構造が対照と比較して保持されていれば、該被験物質は、黄色ブドウ球菌プロテアーゼによるによる角層構造の破壊を抑制したと判断される。該被験物質は、皮膚バリア機能低下抑制剤として選択することができる。
また、本発明の方法を、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）や蛍光物質等の皮膚への浸透量等を指標とする従来公知の皮膚バリア機能評価方法と併用して、皮膚バリア機能低下抑制剤の評価又は選択を行うことも可能である。

本発明の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルにおける、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを評価することを含む、皮膚バリア機能低下抑制剤の評価及び／又は選択方法。
〔２〕好ましくは、以下：
前記３次元培養皮膚モデルの角層上に、前記被験物質を適用し、次いで前記黄色ブドウ球菌プロテアーゼの溶液を適用すること；
該３次元培養皮膚モデルを培養すること；及び、
該３次元培養皮膚モデルにおける、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを評価すること、
を含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは前記黄色ブドウ球菌プロテアーゼがＶ８プロテアーゼである、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記サイトカインが、
好ましくはインターロイキン、インターフェロン、ＴＳＬＰ、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、エイコサノイド、ＳＣＦ、ＭＣＰ、及びＣＳＦからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＳＬＰ、及びＴＮＦαからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくはＩＬ−１β及びＩＬ−８からなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記細胞接着因子が、
好ましくは、細胞表面タンパク質、膜貫通型タンパク質、及び細胞質内タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ、ＤＳＧ−１、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ＪＡＭ、ＺＯ−１、ＺＯ−２、及びＺＯ−３からなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１、ＤＳＧ−１及びＺＯ−１からなる群より選択される少なくとも１種である、
〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記培養が、好ましくは３時間以上、より好ましくは３〜１８時間、さらに好ましくは３〜９時間行われる、〔２〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記被験物質及び前記黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルにおけるサイトカインの発現、細胞接着因子の量及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを、対照と比較することをさらに含む、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記対照と比較して、前記サイトカインの発現が低下しているか、前記細胞接着因子の量が増加しているか、又は前記角層構造が保持されている場合に、前記被験物質を皮膚バリア機能低下抑制剤として選択することをさらに含む、〔７〕記載の方法。
〔９〕前記対象が、
好ましくは、被験物質非添加で黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用して培養した３次元培養皮膚モデルであり、
より好ましくは、黄色ブドウ球菌プロテアーゼのみを適用して培養した３次元培養皮膚モデル、又は黄色ブドウ球菌プロテアーゼと対照物質とを適用して培養した３次元培養皮膚モデルである、
〔７〕又は〔８〕記載の方法。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１アレルゲン刺激による細胞応答の誘導
３次元培養皮膚モデル（ＬａｂＣｙｔｅＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ１２、６日培養品、１２ｗｅｌｌ、Ｊ−ＴＥＣ、製品コード：４０１１１２）をアッセイ培地（キット付属品）で１日培養した（３７℃、５％ＣＯ₂濃度）。細胞の角層側にアレルゲン溶液又はＰＢＳ（コントロール）を６０μＬ含浸させたろ紙（ＰＡＰＥＲＤＩＳＣＦＯＲＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣＡＳＳＡＹ，ＴＨＩＮ，８ｍｍ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ^TM）を載置し、さらに３時間培養し、細胞を回収した。アレルゲン溶液には、表１記載のものを用いた。

回収した細胞をＰＢＳで一度洗浄した。ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に付属のＲＮＡ抽出用溶液を含む１．５ｍＬチューブに洗浄した細胞を入れ、該キット付属のプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを逆転写反応に供した。逆転写反応にはＨｉｇｈ−ＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡＫｉｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、付属のプロトコルに従ってｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲによりサイトカインＴＳＬＰ、ＩＬ−８、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの発現を解析した。ＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて各サイトカインの遺伝子発現を解析した。解析に使用したプローブ（全てＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｔｅｍｓ）は以下に示す通りであった。各遺伝子の発現量は、ＲＰＬＰ０の発現量で補正した。
ＲＰＬＰ０：Ｈｓ９９９９９０２＿ｍ１
ＴＳＬＰ：Ｈｓ００２６３６３９＿ｍ１
Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆｃｈｅｍｏｋｉｎｅｌｉｇａｎｄ８（ＩＬ−８）：Ｈｓ００１７４１０３＿ｍ１
ＩＬ−１α：Ｈｓ００１７４０９２＿ｍ１
ＩＬ−１β：Ｈｓ０１５５５４１０＿ｍ１

遺伝子発現解析の結果を図１に示す。アレルゲンとして黄色ブドウ球菌プロテアーゼを用いた場合、刺激から３時間程度で調べた全てのサイトカイン種が統計学的に有意に発現増加した。黄色ブドウ球菌プロテアーゼ以外のアレルゲンを適用した場合には、３時間後ではサイトカイン発現に有意な増加がみられない場合があった。３次元培養皮膚モデルに対して黄色ブドウ球菌プロテアーゼを直接適用することで、短時間でアレルゲン刺激に対する強い炎症反応が誘導されることが示された。

実施例２プロテアーゼ刺激に対する細胞応答の経時変化
アレルゲン溶液として実施例１で用いた黄色ブドウ球菌プロテアーゼ（Ｖ８プロテアーゼ）溶液及びダニ培地抽出物溶液を用いた。実施例１と同様の手順で、ただしアレルゲン溶液又はＰＢＳを適用した後の培養時間を１、３、９又は１８時間に変えて３次元培養皮膚モデルを培養し、細胞におけるＴＳＬＰ、ＩＬ−８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＴＮＦαの発現を解析した。なお、ＴＮＦαの発現解析に使用したプローブ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｔｅｍｓ）は以下に示す通りであった。
ＴＮＦα：Ｈｓ００１７４１２８＿ｍ１

遺伝子発現解析の結果を図２−１〜２−３に示す。Ｖ８プロテアーゼ溶液を適用した場合、調べた５種のサイトカイン全てにおいて、プロテアーゼ刺激３時間後に統計学的に有意な発現増加がみられた。

実施例３プロテアーゼ刺激に対する細胞応答（プロテアーゼ濃度依存性）
実施例１で用いたＶ８プロテアーゼを用い、実施例１と同様の手順で、ただしＶ８プロテアーゼ溶液の濃度を０．５、１．０又は１．５質量％（５、１０又は１５Ｕ）に変えて３次元培養皮膚モデルに適用した。適用後３時間培養し、実施例１と同様の手順で細胞におけるＴＳＬＰ、ＩＬ−８、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの発現を解析した。

遺伝子発現解析の結果を図３に示す。調べた４種のサイトカイン中の３つ（ＴＳＬＰ、ＩＬ−８及びＩＬ−１α）でプロテアーゼ濃度依存的に有意な発現の増加がみられた。一方、ＩＬ−１βでは１．０質量％プロテアーゼ条件で有意な発現の増加がみられた。

実施例４試験物質のバリア機能低下抑制作用の評価
プロテアーゼ刺激３次元培養皮膚モデルを用いた試験物質のバリア機能低下抑制作用評価系を、バリア機能を担う角層細胞間脂質の膜構造と類似した被膜を形成することが既知である、合成セラミド（ＳＬＥ、ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄＥ；Ｎ−（ヘキサデシロキシヒドロキシプロピル）−Ｎ−ヒドロキシエチルヘキサデカナミド、花王製）を用いて検証した。ＳＬＥは、例えば日本化学会誌、1993年、No.10、p.1107-1117に記載の方法に準じて合成することができる。

１）試験物質の適用
３次元培養皮膚モデル（ＬａｂＣｙｔｅＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ１２、６日培養品、１２ｗｅｌｌ、Ｊ−ＴＥＣ、製品コード：４０１１１２）をアッセイ培地（キット付属品）で１日培養した。試験物質にはＳＬＥ含有製剤［ＳＬＥ２．５質量％、ステアリルアルコール０．８５質量％、液状油（スクワラン、シリコーン油）計４質量％、活性剤（モノステアリン酸グリセリン、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）計１．０質量％及び精製水、を含有するクリーム製剤］を用いた。対照物質にはＳＬＥ非含有製剤［ＳＬＥ０質量％、ステアリルアルコール０．８５質量％、液状油（スクワラン、シリコーン油）計４質量％、活性剤（モノステアリン酸グリセリン、Ｎ−アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）計１．０質量％及び精製水、を含有するクリーム製剤］を用いた。３次元培養皮膚モデルの角層側に、試験物質又は対照物質を１０μＬずつ塗布し、１０分間放置後実施例１で用いたＶ８プロテアーゼ溶液を含浸させたろ紙を載置した（（＋）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群、及び（−）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群）。無塗布→Ｖ８プロテアーゼ刺激群には、３次元培養皮膚モデルの角層側に、何も塗布せず実施例１で用いたＶ８プロテアーゼ溶液を含浸させたろ紙を載置した。無塗布→ＰＢＳ群には、３次元培養皮膚モデルの角層側に、何も塗布せずＰＢＳを含浸させたろ紙を載置した（表２参照）。

２）培養
各群の３次元培養皮膚モデルを３時間培養した後、細胞におけるサイトカイン発現及び細胞接着因子の量を測定し、また角層構造を観察した。

３）サイトカイン発現の測定
実施例１と同様の手順でＩＬ−１β及びＩＬ−８の遺伝子発現を解析した。

４）細胞接着因子の測定
ウエスタンブロットにより細胞接着因子ＺＯ−１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１及びＤＳＧ−１を解析した。３次元培養皮膚モデルの細胞をＰＢＳで一度洗浄してから、Ｕｒｅａ含有Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（２ＭＵｒｅａ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、２％ＳＤＳ、ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｃＯｍｐｌｅｔｅＵＬＴＲＡ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ, ＃５８９２９５３００１，Ｒｏｃｈｅ）で溶解した後、ホモジナイズと遠心を行い、その上清を蛋白質溶液とした。ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（＃２３２２５，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、検量線作成はウシ血清アルブミンを使用）を用いてタンパク質定量を行った後、約１．５μｇ相当をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し（７０Ｖ，４−２０％ミニプロティアンＴＧＸゲル（＃４５６１０９３，ＢｉｏＲａｄ））、次いで転写（Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＴｕｒｂｏＴｒａｎｓｆｅｒＰａｃｋ，ＭＩＸＥＤＭＷ（７ｍｉｎ．１．３Ａｃｏｎｓｔａｎｔ）；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を行った。メンブレン（トランスブロットＴｕｒｂｏ^TM ミニＰＶＤＦ転写パック，＃１７０４１５６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を５％スキムミルクでブロッキング（室温、１ｈ）した後、ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ１（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した一次抗体を反応させ（４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）、次いでＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌｓｏｌｕｔｉｏｎ２（ＴＯＹＯＢＯ）で希釈した二次抗体を反応させた（４℃、１ｈ）。検出は、ＥＣＬ（ＣｌａｒｉｔｙＷｅｓｔｅｒｎＥＣＬＳｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。観察はＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ−４０００（富士フイルム）で行った。表３に使用した抗体と希釈率を示す。

５）角層構造の観察
３次元培養皮膚モデルはＳＣＥＭ（ＳｕｐｅｒＣｒｙｏｅｍｂｅｄｄｉｎｇＭｅｄｉｕｍ）液（川本法）にて包埋し凍結した。その後、クライオトーム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｉｃｒｏｍクリオスタットＨＭ５５０）で６μｍ厚の切片を作製し、使用するまで−８０℃で保存した。凍結切片を融解後、冷却した４％ＰＦＡ−ＰＢＳで組織切片を固定した。その後、ＰｒｏｔｅｉｎＢｌｏｃｋＳｅｒｕｍ−ＦｒｅｅＲｅａｄｙｔｏＵｓｅ（Ｄａｋｏ）で非特異的な結合を阻害した。１次抗体をＣａｎｇｅｔｓｉｇｎａｌｓｏｌｕｔｉｏｎＡ（ＴＯＹＯＢＯ）に希釈し、１時間反応させた。その後、２次抗体とＤＡＰＩ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＣａｎｇｅｔｓｉｇｎａｌｓｏｌｕｔｉｏｎＡで希釈し、３０分間反応させた。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（０１００−０１，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）にて封入を行い、蛍光顕微鏡で観察した（蛍光フィルター：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM５５５，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^TM４８８，ＤＡＰＩ、顕微鏡：ＤＭ５５００Ｂ（Ｌｅｉｃａ））。表４に使用した抗体と希釈率を示す。

各群におけるサイトカイン発現を図４に、細胞接着因子のウエスタンブロット像を図５に、３次元培養皮膚モデルの組織切片の免疫染色像を図６に示す。図４に示すとおり、バリア機能を担う角層細胞間脂質の膜構造と類似した被膜を形成するＳＬＥを含有する製剤を塗布した細胞（（＋）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群）では、無塗布→Ｖ８プロテアーゼ刺激群と比較してＩＬ−１βの発現が有意に抑制され、ＩＬ−８発現にも抑制傾向がみられた。一方、ＳＬＥ非含有製剤を塗布した細胞（（−）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群）では、いずれのサイトカイン発現にも有意な抑制は見られなかった。また図５に示すとおり、無塗布→Ｖ８プロテアーゼ刺激群及び（−）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群では細胞接着因子のバンドが消失していたが、（＋）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群では細胞接着因子のバンドが観察され、ＳＬＥにより細胞接着因子の分解が抑制されていたことが示された。また図６の上図に示す通り、無塗布→Ｖ８プロテアーゼ刺激群及び（−）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群では角層が観察できなかったが、（＋）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群では角層が観察され（上図中の白矢印を参照）、ＳＬＥにより角層構造の破壊が抑制されていたことが示された。また、図６の下図に示す通り、無塗布→Ｖ８プロテアーゼ刺激群及び（−）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群では細胞接着因子が破壊されていたが（下図中の矢印で示す囲った領域を参照）、（＋）ＳＬＥ→Ｖ８プロテアーゼ刺激群では細胞接着因子の構造が維持されていた。これらの結果は、ＳＬＥがＶ８プロテアーゼによる炎症誘導や角層構造の破壊を抑制することで、皮膚バリア機能の低下を抑制したことを表す。

Claims

被験物質及び黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルにおける、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを評価することを含む、皮膚バリア機能低下抑制剤の評価及び／又は選択方法。
前記プロテアーゼがＶ８プロテアーゼである、請求項１記載の方法。
前記サイトカインがＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＳＬＰ、及びＴＮＦαからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
前記細胞接着因子がＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ−１、ＤＳＧ−１及びＺＯ−１からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の方法。
前記３次元培養皮膚モデルの角層上に、前記被験物質を適用し、次いで前記黄色ブドウ球菌プロテアーゼの溶液を適用すること；
該３次元培養皮膚モデルを培養すること；及び、
該３次元培養皮膚モデルにおける、サイトカインの発現、細胞接着因子の量、及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを評価すること、
を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
前記培養が３時間以上行われる、請求項５記載の方法。
前記被験物質及び前記黄色ブドウ球菌プロテアーゼを適用した３次元培養皮膚モデルにおけるサイトカインの発現、細胞接着因子の量及び角層構造からなる群より選択される少なくとも１つを、対照と比較することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
前記対照と比較して、前記サイトカインの発現が低下しているか、前記細胞接着因子の量が増加しているか、又は前記角層構造が保持されている場合に、前記被験物質を皮膚バリア機能低下抑制剤として選択することをさらに含む、請求項７記載の方法。