JP2021093912A - 検体中に含まれる菌種を特定する方法 - Google Patents

検体中に含まれる菌種を特定する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】検体中に含まれる菌種を特定する方法であって、迅速かつ安定した方法を提供する。【解決手段】検体中に含まれる菌種を特定する方法であって、検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程と、インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程と、前記気相に含まれる前記物質を同定する工程と、同定された前記物質に基づいて、前記検体中に含まれる菌種を特定する工程と、を含む方法。検体は、例えば、生体から取得した検体である。【選択図】図２

Description

本発明は、検体中に含まれる菌種を特定する方法に関し、より詳しくは、生体から取得した検体、あるいは各種機器、容器等に付着している物から取得した検体中に含まれる菌種を特定する方法に関する。
感染症は、世界の主な疾患別死因である。感染症は、伝染のリスクがある一方、適切な治療により完治が可能な疾患である。近年、遺伝子や抗体などの解析技術の進歩により、インフルエンザなどウイルスを原因とする感染症に関して検査の迅速化が進められているが、細菌感染症の原因となる細菌や真菌など微生物検査法に関しては、迅速化は進んでおらず、検査開始から最低でも３日を要しており、微生物検査の迅速化が課題である。
例えば、血流感染、及び敗血症が疑われる場合、細菌の検出・同定のために血液培養が実施される。特に敗血症の場合、適切な抗菌薬が投与されるまでの時間が生存率に関わるため、迅速な菌種同定、及び薬剤耐性の診断技術の開発が必要とされている。しかしながら、現状において、菌種の同定のためには、血液培養後に寒天培地にサブカルチャーを行うことが多く、早くても３日ほどの時間がかかる。
医療機関においては、微生物迅速検査の実施により、患者の早期治療による予後改善に加え、医療費削減が可能になる。米国では１０００床以上の病院で、入院日数１日の短縮につき年間約１０Ｍドル以上の削減効果があるとの試算もあり、病院経営の観点からも迅速化は重要な課題である。さらに、抗菌薬に対する耐性を持つ細菌が世界的な脅威となっており、微生物検査の重要性はさらに増している。
下記特許文献１には、微生物の培養物によって生成されたヘッドスペースガスを抽出する工程と、前記抽出されたヘッドスペースガスを分析し、前記微生物培養物に伴う揮発性化合物を同定する工程と、前記同定された揮発性化合物の存在下で、検出可能な色変化を起こすことができる指示薬を選択する工程と、を含む微生物の存在を検出する方法が開示されている（請求項１）。しかしながら、微生物の培養物によって生成されたヘッドスペースガスには、３７℃程度の培養温度（インキュベート温度）において揮発する高揮発性の多くの化合物が含まれている。また、同定された揮発性化合物の存在下で検出可能な色変化を起こすことができる指示薬を選択する必要もある。これらのため、正確な微生物の検出を行うことが困難である。
下記非特許文献１には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）によるEscherichia coliの検出が開示されている。
下記非特許文献２には、病原体の揮発性代謝物に関し、大腸菌、緑膿菌、及び黄色ブドウ球菌それぞれに特徴的な揮発性代謝物についての系統的レビューが開示されている。
特表２００８−５３８１７９号公報
Camara and Heys, Discrimination between wild-type and ampicillin-resistant Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, Anal Bioanal Chem (2007) 389:1633？1638 Bos LDJ, Sterk PJ, Schultz MJ, Volatile Metabolites of Pathogens: A Systematic Review. PLoS Pathog (2013) 9:5: e1003311. doi:10.1371/journal.ppat.1003311
医学的に重要なヒト病原体を含む多くの種類の微生物は、増殖及び繁殖中に揮発性化合物（ＶＯＣ：Volatile Organic Compounds）を生成する。これらの揮発性化合物の１つ又はそれより多くが、微生物の特定の類、属、種、及び／又は亜種に特有に発生するため、これらを検出・同定することで微生物の同定が可能であることが示唆されている。これまでにソックスレー抽出、液液抽出、加速溶媒抽出、マイクロ波補助抽出、固相抽出及び超臨界流体抽出法により、微生物により生成される揮発性化合物を抽出し、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトクラフ質量分析計）や、比色定量法での検出が試みられてきたが、いずれも実用化されていない。その理由としては、揮発性化合物として非常に多くの成分が抽出されるために、安定した同定ができないことが挙げられる。
本発明の目的は、検体中に含まれる菌種を特定する方法に関し、より詳しくは、生体から取得した検体、あるいは各種機器、容器等に付着している物から取得した検体中に含まれる菌種を迅速かつ安定に特定する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、前記方法のためのプログラム、及び分析システムを提供することにある。
本発明者らは鋭意検討した結果、所定のインキュベート温度において揮発する揮発性の高い化合物ではなく、該インキュベート温度においては培地中に存在している比較的揮発性の低い化合物を培地から気化させ、該比較的揮発性の低い化合物を分析することによって、検体中に含まれる菌種同定が可能であることを見出した。これらの化合物は、アミノ酸代謝に由来する物質が多く、菌種の代謝活性の違いが反映されやすいと考えられる。具体的には、検体と培地との混合物を３７℃程度のインキュベート温度にて培養後、培地液相部を前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、その際の揮発成分を分析することにより、病原性の高い菌種を同定することに成功した。揮発成分の分析は、例えば、ＧＣ−ＭＳを用いたヘッドスペース法分析により簡便に行うことができる。
本発明は、以下の発明を含む。
（１） 検体中に含まれる菌種を特定する方法であって、
検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程と、
インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程と、
前記気相に含まれる前記物質を同定する工程と、
同定された前記物質に基づいて、前記検体中に含まれる菌種を特定する工程と、
を含む方法。
（２） 前記検体中には１つ又は複数の菌種が含まれている、上記（１）に記載の方法。
（３） 前記菌種を特定する工程において、同定された前記物質を代謝物とする菌種が、前記検体中に含まれる菌種であると特定する、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記菌種を特定する工程において、１つ又は複数の菌種と該１つ又は複数の菌種が代謝する物質とを関係づけるデータベースを用いて、
同定された前記物質について、各菌種が代謝する物質の有無と、代謝しない物質の有無との双方を照合することにより、前記検体中に含まれる菌種を特定する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 前記物質を同定する工程を、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトクラフ質量分析計）を用いて行う、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 前記検体中に含まれる菌種は、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Enterobacter cloacae、Enterobacter aerogenes、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、及びEnterococcus faecalisからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 前記菌種を特徴づける代謝物は、インドール、３−メチル−１−ブタノール、酢酸、プロピオン酸、エタノール、アセトイン、２，３−ブタンジオン、イソ吉草酸、イソ吉草酸アルデヒド、２−ブタノン、及びフェニルエチルアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、上記（６）に記載の方法。
（８） 前記インキュベート温度よりも高い温度は、４０℃以上である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９） 前記インキュベート温度よりも高い温度は、４０℃以上１２０℃以下である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０） 前記検体は、生体から取得した検体である、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
前記生体から取得した検体は、血液、尿、体分泌液及び糞便からなる群から選ばれる、上記（１０）に記載の方法。
（１１） 検体中に含まれる菌種を特定するためのプログラムであって、
検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程と、インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程と、前記気相に含まれる前記物質を同定する工程とを行うことにより同定された前記物質について、
コンピュータに、同定された前記物質と、１つ又は複数の菌種と該１つ又は複数の菌種が代謝する物質とを関係づけるデータベースとの照合を行い、前記検体中に含まれる菌種を特定することを実行させるためのプログラム。
（１２） 上記（１１）に記載のプログラムを備えた分析システム。
本発明によれば、検体中に含まれる菌種を特定する方法であって、迅速かつ安定した方法が提供される。
従来は、微生物を含む検体を所定のインキュベート温度において培養した際に生成するヘッドスペースガスそのものを分析していた。この際のヘッドスペースガスには、前記温度において揮発する高揮発性の多くの化合物が含まれている。このため、正確な微生物の検出を行うことが困難であった。これに対して、本発明においては、前記インキュベート温度において揮発する揮発性の高い化合物ではなく、前記インキュベート温度においては培地中に存在している比較的揮発性の低い化合物を培地から気化させ、該比較的揮発性の低い化合物を分析する。これら比較的揮発性の低い化合物は、アミノ酸代謝に由来する物質が多く、菌種の代謝活性の違いが反映されやすいと考えられる。そのため、比較的揮発性の低い化合物と、菌種が代謝する物質とを関係づけることによって、検体中に含まれる菌種同定を行うことができる。
本発明において、検体としては、生体から取得した検体が代表的であるが、これのみに限定されることはない。例えば、ヒトへの感染が疑われる場合、その感染源の特定のために、食品（例えば、食肉）、食品の製造及び流通過程で使用された各種機器、容器等に付着している物を検体として、それを分析することにも本発明が適用できる。
図１は、比較例１におけるＧＣ−ＭＳによる血培ボトル気相の分析結果を示す。 図２は、実施例１におけるＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図３は、実施例２におけるＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図４は、実施例３におけるＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図５は、実施例４における大腸菌Escherichia coliについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図６は、実施例５におけるKlebsiella pneumoniaeについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図７は、実施例６におけるEnterobacter cloacaeについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図８は、実施例７におけるEnterobacter aerogenesについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図９は、実施例８における緑膿菌Pseudomonas aeruginosaについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図１０は、実施例９におけるAcinetobacter baumanniiについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図１１は、実施例１０における黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図１２は、実施例１１におけるEnterococcus faecalisについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。 図１３は、実施例４〜１１のコントロール（培地のみ）又は空瓶についてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
本発明の実施形態は、検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程と、
インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程と、
前記気相に含まれる前記物質を同定する工程と、
同定された前記物質に基づいて、前記検体中に含まれる菌種を特定する工程と、
を含む、検体中に含まれる菌種を特定する方法である。
検体としては、生体から取得した検体が代表的であるが、これのみに限定されることはない。例えば、ヒトへの感染が疑われる場合、その感染源の特定のために、食品（例えば、食肉）、食品の製造及び流通過程で使用された各種機器、容器等に付着している物を検体として、それを分析することにも本発明が適用できる。
対象の生体には、種々の感染症が疑われるヒトや、ヒト以外の犬、猫などの哺乳動物などが含まれる。生体から取得した検体は、限定されることなく、血液（全血、血漿、血清）、尿、体分泌液及び糞便からなる群から選ばれるとよい。例えば、対象の生体が血流感染、及び敗血症が疑われる場合、検体には細菌が含まれ、細菌の検出・同定のために血液培養が実施される。
本発明の実施形態において、まず、生体、あるいはその他の物から取得した検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程を行い、検体中に含まれる菌種を培養する。インキュベート温度は、体内温度（例えば３５℃以上４０℃以下）であってよく、例えば３７℃であってよい。インキュベート時間は、１２時間〜４８時間程度、例えば２４時間程度であってよい。培地としても、種々の液状や固形のものを用いることができ、例えば、ＬＢ培地、ＴＳＢ培地、ＣＡＭＨＢ培地、寒天培地等が挙げられる。
このインキュベート工程において、例えば３７℃程度のインキュベート温度において、揮発性の高い化合物は揮発する。前記インキュベート時間は、この揮発性の高い化合物が十分に揮発するように設定されてよい。本発明の実施形態においては、インキュベート工程で揮発する高揮発性化合物以外の化合物を分析に用いる。例えば、インキュベート工程を血液培養ボトルなどの密閉性容器中で行った場合、ヘッドスペースガスは分析に用いないで、除去される。
次に、インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程を行う。前記インキュベート温度よりも高い温度は、例えば、４０℃以上１２０℃以下であり、好ましくは、５０℃以上１２０℃以下である。実施例にて示されるように、８０℃以上１２０℃以下とすることにより、菌種特定に必要な比較的揮発性の低い化合物（例えば、沸点：約５０〜約１２０℃）を培地から気化させやすい。また、この際の加熱の時間は、特に限定されないが、５分〜６０分間程度、好ましくは、１０分〜３０分間程度とするとよい。この加熱工程により、３７℃程度のインキュベート温度においては気化せずに培地中に存在していた、菌種特定に必要な比較的揮発性の低い化合物（例えば、沸点：約５０〜約１２０℃）を培地から気化させる。ここにおいて、ただし、比較的揮発性の低い化合物とその沸点に明確な関係がある訳ではなく、沸点：約５０〜約１２０℃は、概ねの目安である。実施例でも示されるように、沸点１２０℃を超える化合物も、この加熱工程における気相に含まれることがある。
より具体的には、インキュベート後の前記混合物（液相、又は固相、又は液相／固相混合）を、インキュベート工程でのヘッドスペースガスを除去した後そのままで密閉系として、あるいは、加熱工程用の別のボトルに移してボトル上部をキャップして密閉系として、加熱するとよい。この加熱工程用のボトルとして、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトクラフ質量分析計）のバイアルを用いると、加熱工程での気相（ヘッドスペースガス）を次の分析工程でそのまま利用できるので、便利である。
次に、前記気相に含まれる前記物質を同定する工程を行う。この同定工程は、ＧＣ（ガスクロマトクラフ）を用いて行うことができる。さらに、高い精度の分析のために、同定工程を、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトクラフ質量分析計）を用いて行うことが好ましい。ガスクロマトクラフで分離された各成分を質量分析することにより、分析の精度が高まる。
次に、同定された前記物質に基づいて、前記検体中に含まれる菌種を特定する工程を行う。同定された前記物質は、３７℃程度のインキュベート温度において揮発する揮発性の高い化合物ではなく、３７℃程度のインキュベート温度においては培地中に存在している比較的揮発性の低い化合物である。これら比較的揮発性の低い化合物は、アミノ酸代謝に由来する物質が多く、菌種の代謝活性の違いが反映されやすいと考えられる。そのため、比較的揮発性の低い化合物と、菌種が代謝する物質とを関係づけることによって、検体中に含まれる菌種同定を行うことができる。
この菌種の特定工程において、同定された前記物質を代謝物とする菌種が、前記検体中に含まれる菌種であると特定することができる。好ましくは、この菌種の特定工程において、１つ又は複数の菌種と該１つ又は複数の菌種が代謝する物質とを関係づけるデータベースを用いて、同定された前記物質について、各菌種が代謝する物質の有無と、代謝しない物質の有無との双方を照合することにより、前記検体中に含まれる菌種を特定することができる。
本発明の実施形態において、検出対象となる菌種は、特に限定されることなく、種々の菌種が含まれる。病原性の菌種としては、大腸菌Escherichia coli（ＡＴＣＣ#３５２１８）、Klebsiella pneumoniae（ＡＴＣＣ#７００６０３）、Enterobacter cloacae（ＡＴＣＣ#１３０４７Ｔ）、Enterobacter aerogenes（ＡＴＣＣ#１３０４８Ｔ）、Acinetobacter baumannii（ＡＴＣＣ#ＢＡＡ７４７）、緑膿菌Pseudomonas aeruginosa（ＡＴＣＣ#２７８５３）、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus（ＡＴＣＣ#３３８６２）、及びEnterococcus faecalis（ＡＴＣＣ#２９２１２）などの感染性微生物をカバーできれば有用である。
前記例示された菌種を特徴づける代謝物として、インドール（ｂｐ：２５３−２５４℃）、３−メチル−１−ブタノール（ｂｐ：１３１．１℃）、酢酸（ｂｐ：１１８℃）、プロピオン酸（ｂｐ：１４１℃）、エタノール（ｂｐ：７８．３７℃）、アセトイン（ｂｐ：１４８℃）、２，３−ブタンジオン（ｂｐ：８８℃）、イソ吉草酸（ｂｐ：１７５−１７７℃）、イソ吉草酸アルデヒド（ｂｐ：９１−９３℃）、２−ブタノン（ｂｐ：７９．６４℃）、及びフェニルエチルアルコール（ｂｐ：２１９−２２１℃ at 750mmHg）が挙げられる。従って、本発明の実施形態では、これら揮発性化合物（ＶＯＣ：Volatile Organic Compounds）を分離・同定することにより、菌種の特定を行う。なお、ｂｐは沸点を示す。
もちろん、上記例示の菌種以外の菌種についても、その菌種を特徴づける代謝物との関連において、本発明の実施形態は同様に適用できる。
本発明の実施形態は、検体中に含まれる菌種を特定するためのプログラムにも関する。当該プログラムは、生体、あるいはその他の物から取得した検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程と、インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程と、前記気相に含まれる前記物質を同定する工程とを行うことにより同定された前記物質について、コンピュータに、同定された前記物質と、１つ又は複数の菌種と該１つ又は複数の菌種が代謝する物質とを関係づけるデータベースとの照合を行い、前記検体中に含まれる菌種を特定することを実行させるものであってよい。
本発明の実施形態は、上記のプログラムを備えた分析システムにも関する。分析システムには、公知のインキュベート装置、ヘッドスペース採取装置（ヘッドスペースサンプラー）、ＧＣ（ガスクロマトクラフ）、及びＭＳ（質量分析計）を含んでいてよい。
ヘッドスペースを用いて液体や固体中の揮発性成分の分析を行うことができる。ヘッドスペースとは，「物の上部の空間」の意味で、液体や固体の上部には、それらに含まれている成分で特に沸点の低いものが存在している。ヘッドスペースサンプラーはバイアルに封入された試料を一定時間保温することで気相と試料を平衡状態にして，その気相部分（ヘッドスペース）をＧＣ（ガスクロマトクラフ）に導入し分析するための装置である。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。
［比較例１：ダイレクトインジェクション法］
この比較例では、３７℃での血液培養中の血液培養ボトル（血培ボトル）の気相部分のヘッドスペースガスに含まれる揮発性代謝物（ＶＯＣ）をＧＣ−ＭＳを用いて分析し、３菌種（大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌）に特徴的な物質の検出を試みた。
た。
使用した菌株は、大腸菌（K12：n=3）、黄色ブドウ球菌（JCM2874：n=4）、緑膿菌（Pao1：n=4）であった。血培ボトルは、BACTEC Plus（登録商標） Aerobic / F Culture Vials 30 mL（BD社製）を用いた。
各菌株は、培養前日にグリセロールストックから１ｍＬのＬＢ培地を用いて前培養し、その後に、１０2 cell/100μＬに調整し、緬羊脱繊維血液（コージンバイオ製）１０ｍＬと混和したのちに血培ボトルに注入した。
菌液を注入した血培ボトルを３７℃／１５０ｒｐｍにて２４時間振とう培養したのちに、気相から０．４５μｍφの滅菌フィルターを介して１ｍＬガスタイトシリンジを用いてヘッドスペースガスを採取した。採取したガスをマニュアルインジェクションにてＧＣ−ＭＳ分析した。ＧＣＭＳ−ＱＰ（登録商標）２０２０（島津製作所製）を用いた。
ＧＣ−ＭＳの設定は、以下のとおりとした。
カラム：DB-5(P/N：122-5033) 微極性、長さ３０ｍ、膜厚０．１μｍ、内径０．２５ｍｍ
インジェクション量：１ｍＬ（スプリット比４．７）
カラム温度：４０→（１０℃／分）→２３０℃
DB：NISTデータベース
血培ボトルの気相部分をＧＣ−ＭＳ分析した結果、菌種特徴的なシグナルは検出できなかった。図１にＧＣ−ＭＳによる血培ボトル気相の分析結果を示す。図１において、横軸は、ＧＣの保持時間(Retension time)（分）であり、縦軸は強度である。図１において、コントロール（菌なし）、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌の順で上からベースラインをずらして表記している。
図１より、一部検体ごとに異なるシグナルは見られるが、同一菌株内での再現性が得られず、菌種特徴的なシグナルとは認められない。このように、血培ボトルの気相部分をＧＣ−ＭＳ分析した結果、菌種特徴的なシグナルは検出できず、血培ボトルのヘッドスペースガス分析にて、増殖する菌の菌種同定は、今回の条件では困難であることが分かった。
［実施例１：加熱ヘッドスペース法］
この実施例では、３７℃での血液培養後の血液培養ボトル（血培ボトル）中の培養液の一部をガラスバイアルに移し、加熱処理した後の気相部分のヘッドスペースガスに含まれる揮発性代謝物（ＶＯＣ）をＧＣ−ＭＳを用いて分析し、３菌種（大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌）に特徴的な物質の検出を試みた。
た。
使用した菌株は、大腸菌（K12：n=3）、黄色ブドウ球菌（JCM2874：n=4）、緑膿菌（Pao1：n=4）であった。血培ボトルは、BACTEC Plus（登録商標） Aerobic / F Culture Vials 30 mL（BD社製）を用いた。
各菌株は、培養前日にグリセロールストックから１ｍＬのＬＢ培地を用いて前培養し、その後に、１０2 cell/100μＬに調整し、緬羊脱繊維血液（コージンバイオ製）１０ｍＬと混和したのちに血培ボトルに注入した。
菌液を注入した血培ボトルを３７℃／１５０ｒｐｍにて２４時間振とう培養した。その後、培養液の一部を採取し０．４５μｍフィルターで濾過した。濾液５０μＬをガラスバイアルに移し、ヘッドスペース採取装置ＨＳ−２０（島津製作所製）内で８０℃に２０分間加熱し、その際のヘッドスペースガスをＧＣＭＳ−ＱＰ（登録商標）２０２０（島津製作所製）によりＧＣ−ＭＳ分析した。
ＧＣ−ＭＳの設定は、以下のとおりとした。
カラム：DB-5(P/N：122-5033) 微極性、長さ３０ｍ、膜厚０．１μｍ、内径０．２５ｍｍ
インジェクション量：１ｍＬ（スプリット比４．７）
カラム温度：８０℃→（１０℃／分）→２７０℃
DB：NISTデータベース
図２にＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。図２において、横軸は、ＧＣの保持時間(Retension time)（分）であり、縦軸は強度である。図２において、コントロール（菌なし）、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌の順で上からベースラインをずらして表記している。以下の図３、及び図４においても、同様である。
上記３菌種特徴的なシグナルについて、Bosら（非特許文献２）にてSystematic Reviewがされている。図２によると、Bosらの報告と同様のシグナルが得られた。図２中の矢印を付したシグナルが菌種特徴的なシグナル（物質）と考えられる。
このように、３７℃での血液培養後の血液培養ボトル（血培ボトル）中の培養液の一部をガラスバイアルに移し、８０℃に加熱処理した後の気相部分のヘッドスペースガスに含まれる揮発性代謝物（ＶＯＣ）をＧＣ−ＭＳを用いて分析し、３菌種（大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌）に特徴的な物質の検出ができることが示された。
［実施例２：加熱ヘッドスペース法］
ヘッドスペース採取装置ＨＳ−２０（島津製作所製）内での加熱処理温度を６０℃として、カラム温度条件を６０℃から１０℃／分の昇温速度で２５０℃まで昇温［６０℃→（１０℃／分）→２５０℃］とした以外は、実施例１と同様にして、ヘッドスペースガスに含まれる揮発性代謝物（ＶＯＣ）をＧＣ−ＭＳ分析した。図３にＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
［実施例３：加熱ヘッドスペース法］
ヘッドスペース採取装置ＨＳ−２０（島津製作所製）内での加熱処理温度を４０℃として、カラム温度条件を４０℃から１０℃／分の昇温速度で２３０℃まで昇温［４０℃→（１０℃／分）→２３０℃］とした以外は、実施例１と同様にして、ヘッドスペースガスに含まれる揮発性代謝物（ＶＯＣ）をＧＣ−ＭＳ分析した。図４にＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
実施例１〜３について、ＧＣ検出成分の相対面積値を表１〜３にそれぞれ示す。表１〜３において、「ＥＣ」は大腸菌Escherichia coliを表し、「ＳＡ」は黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusを表し、「ＰＡ」は緑膿菌Pseudomonas aeruginosaを表す。また、「ＮＣ」は、Negative Controlの略であり、培地のみのコントロール測定結果を表す。
表１〜３より、加熱処理温度に応じて、検出される成分が異なってはいるが、加熱処理温度８０℃にて、Bosら（非特許文献２）の報告と同じ成分が検出され、本発明の方法が有用であることが示された。
Figure 2021093912
Figure 2021093912
Figure 2021093912
［実施例４〜１１：加熱ヘッドスペース法］
これらの実施例では、３７℃での血液培養後の血液培養ボトル（血培ボトル）中の培養液の一部をガラスバイアルに移し、加熱処理（８０℃、１０５℃、又は１２０℃）した後の気相部分のヘッドスペースガスに含まれる揮発性代謝物（ＶＯＣ）をＧＣ−ＭＳを用いて分析し、以下の各菌種に特徴的な物質の検出を試みた。
各実施例において、使用した菌株は、以下のとおりであった。
実施例４：大腸菌Escherichia coli（K12）
実施例５：Klebsiella pneumoniae
実施例６：Enterobacter cloacae
実施例７：Enterobacter aerogenes
実施例８：緑膿菌Pseudomonas aeruginosa（Pao1）
実施例９：Acinetobacter baumannii
実施例１０：黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus（JCM2874）
実施例１１：Enterococcus faecalis
各菌株は、培養前日にグリセロールストックから１ｍＬのＬＢ培地を用いて前培養し、その後に、１０2 cell/100μＬに調整し、緬羊脱繊維血液（コージンバイオ製）１０ｍＬと混和したのちにＴＢＳ培地ボトルに注入した。
菌液を注入したＴＢＳ培地ボトルを３７℃／１５０ｒｐｍにて２４時間振とう培養した。その後、培養液の一部を採取し０．４５μｍフィルターで濾過した。濾液５０μＬをガラスバイアルに移し、ヘッドスペース採取装置ＨＳ−２０（島津製作所製）内で８０℃、１０５℃、又は１２０℃に２０分間加熱し、その際のヘッドスペースガスをＧＣＭＳ−ＱＰ（登録商標）２０２０（島津製作所製）によりＧＣ−ＭＳ分析した。
ＧＣ−ＭＳの設定は、以下のとおりとした。
・カラム：SH-Stabilwax-DA 強極性、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、内径０．２５ｍｍ
・インジェクション量：１ｍＬ（スプリット比１０）
・カラム温度：４０℃（５分保持）→（１０℃／分）→２４０℃（５分保持）
・DB：NISTデータベース
・ＨＳ−モード：トラップ（３回注入）
図５は、実施例４における大腸菌Escherichia coliについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図６は、実施例５におけるKlebsiella pneumoniaeについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図７は、実施例６におけるEnterobacter cloacaeについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図８は、実施例７におけるEnterobacter aerogenesについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図９は、実施例８における緑膿菌Pseudomonas aeruginosaについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図１０は、実施例９におけるAcinetobacter baumanniiについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図１１は、実施例１０における黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureusについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図１２は、実施例１１におけるEnterococcus faecalisについてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。
図５〜１２のいずれにおいても、横軸は、ＧＣの保持時間(Retension time)（分）であり、縦軸は強度である。図５〜１２のいずれにおいても、ヘッドスペース採取装置ＨＳ−２０内での加熱温度（ＨＳ温度）８０℃、１０５℃、１２０℃の順で上からベースラインをずらして表記している。
図１３は、実施例４〜１１のコントロール（ＴＢＳ培地のみ）又は空瓶についてのＧＣ−ＭＳによる加熱処理後のガラスバイアルの気相（すなわち、血培ボトル液相由来の気相）の分析結果を示す。図１３において、空瓶／ＨＳ温度１１０℃、空瓶／ＨＳ温度１２０℃、ＴＢＳ培地のみ／１１０℃、ＴＢＳ培地のみ／１２０℃の順で上からベースラインをずらして表記している。
各図５〜１３より、各菌種に特徴的な揮発性代謝物（ＶＯＣ）の検出ができることが示された。表４に、各菌種と該菌種に特徴的な物質との相関関係を示す。表４において、「＋」は、物質が検出されたことを表し、「−」は、物質が検出されなかったことを表している。
Figure 2021093912
このように、３７℃での血液培養後の血液培養ボトル（血培ボトル）中の培養液の一部をガラスバイアルに移し、８０℃に加熱処理した後の気相部分のヘッドスペースガスに含まれる揮発性代謝物（ＶＯＣ）をＧＣ−ＭＳを用いて分析し、各菌種に特徴的な物質の検出ができることが示された。
上記例示の菌種以外の菌種についても、その菌種を特徴づける代謝物との関連をデータベース化しておけば、検体中の菌種を特定できることが分かる。また、コンピュータに、同定された前記物質と、１つ又は複数の菌種と該１つ又は複数の菌種が代謝する物質とを関係づけるデータベースとの照合を行い、前記検体中に含まれる菌種を特定することを実行させるためのプログラムが得られる。
さらに、本発明は、検体が生体から取得した検体のみに限定されることもない。例えば、ヒトへの感染が疑われる場合、その感染源の特定のために、食品（例えば、食肉）、食品の製造及び流通過程で使用された各種機器、容器等に付着している物を検体として、それを分析することにも本発明が適用できることは明らかである。

Claims (13)

  1. 検体中に含まれる菌種を特定する方法であって、
    検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程と、
    インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程と、
    前記気相に含まれる前記物質を同定する工程と、
    同定された前記物質に基づいて、前記検体中に含まれる菌種を特定する工程と、
    を含む方法。
  2. 前記検体中には１つ又は複数の菌種が含まれている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記菌種を特定する工程において、同定された前記物質を代謝物とする菌種が、前記検体中に含まれる菌種であると特定する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記菌種を特定する工程において、１つ又は複数の菌種と該１つ又は複数の菌種が代謝する物質とを関係づけるデータベースを用いて、
    同定された前記物質について、各菌種が代謝する物質の有無と、代謝しない物質の有無との双方を照合することにより、前記検体中に含まれる菌種を特定する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記物質を同定する工程を、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトクラフ質量分析計）を用いて行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記検体中に含まれる菌種は、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Enterobacter cloacae、Enterobacter aerogenes、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、及びEnterococcus faecalisからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記菌種を特徴づける代謝物は、インドール、３−メチル−１−ブタノール、酢酸、プロピオン酸、エタノール、アセトイン、２，３−ブタンジオン、イソ吉草酸、イソ吉草酸アルデヒド、２−ブタノン、及びフェニルエチルアルコールからなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記インキュベート温度よりも高い温度は、４０℃以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記インキュベート温度よりも高い温度は、４０℃以上１２０℃以下である、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
  10. 前記検体は、生体から取得した検体である、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
  11. 前記生体から取得した検体は、血液、尿、体分泌液及び糞便からなる群から選ばれる、請求項１０に記載の方法。
  12. 検体中に含まれる菌種を特定するためのプログラムであって、
    検体と培地との混合物をインキュベート温度にてインキュベートする工程と、インキュベート後の前記混合物を、前記インキュベート温度よりも高い温度に加熱して、前記混合物から気化した物質を含む気相を得る工程と、前記気相に含まれる前記物質を同定する工程とを行うことにより同定された前記物質について、
    コンピュータに、同定された前記物質と、１つ又は複数の菌種と該１つ又は複数の菌種が代謝する物質とを関係づけるデータベースとの照合を行い、前記検体中に含まれる菌種を特定することを実行させるためのプログラム。
  13. 請求項１２に記載のプログラムを備えた分析システム。
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