JP2021080250A - Ultrafiltration unit for continuous purification and method for producing protein using ultrafiltration unit for continuous purification - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養技術により生産された抗体等タンパク質を連続精製するための、制御ユニットを設けた精製用限外ろ過ユニットおよび精製用限外ろ過ユニットを用いたタンパク質の連続製造方法に関する。 The present invention relates to a method for continuously producing a protein using an ultrafiltration unit for purification provided with a control unit and an ultrafiltration unit for purification for continuously purifying a protein such as an antibody produced by a cell culture technique.
限外ろ過膜を用いたクロスフローユニットはタンパク質の精製において、タンパク質の濃縮、バッファー交換等の効果が必要な場合に用いられている（非特許文献１）。さらに、抗体を工業的に製造する場合、典型的には、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを最終処理工程で用い、濃縮された抗体を用いることも知られている（非特許文献１、特許文献１）。
A cross-flow unit using an ultrafiltration membrane is used when effects such as protein concentration and buffer exchange are required in protein purification (Non-Patent Document 1). Further, when an antibody is industrially produced, it is also known that ultrafiltration / diafiltration is typically used in the final treatment step and a concentrated antibody is used (Non-Patent
タンパク質の精製工程に用いる限外ろ過システムとして、以下の（ａ）〜（ｃ）で構成されるシステムが知られている。（ａ）２つ以上の限外濾過膜を含むとともに、供給側および反対側の透過側に各々流体流入部と流出ポートを有するクロスフロー処理流体処理モジュールを備え、（ｂ）それぞれ対応する流体供給流入部と連通している２つ以上の別個独立の限外ろ過流体導管、および（ｃ）前記流体供給流入部と流体連通している別個独立の限外ろ過流体導管のための別個独立のチャンネルを有するマルチチャンネルポンプヘッドを備え、流速を制御する機能を持つ流体ポンプとを備える、限外ろ過システム(特許文献２)。 As an ultrafiltration system used in the protein purification step, a system composed of the following (a) to (c) is known. (A) A cross-flow processing fluid treatment module containing two or more ultrafiltration membranes and having fluid inflow and outflow ports on the supply side and the opposite permeation side, respectively, and (b) corresponding fluid supply. Two or more separate and independent ultrafiltration fluid conduits communicating with the inflow section, and (c) separate and independent channels for the separate and independent ultrafiltration fluid conduits communicating with the fluid supply inflow section. An ultrafiltration system (Patent Document 2), comprising a multi-channel pump head having the above, and a fluid pump having a function of controlling a flow velocity.
プロテインＡ溶出液から抗体等の標的分子を精製するためのフロースルー方法であって、（ａ）プロテインＡカラムクロマトグラフィーからの溶出液を活性炭と接触させた後、（ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する工程、前記（ｂ）工程における溶出液を（ｃ）陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする方法において、ｐＨ調整のために（ｂ）工程と（ｃ）工程を結ぶ配管の間にサージタンクを配置することを特徴とする方法が知られている（特許文献３）。 This is a flow-through method for purifying a target molecule such as an antibody from a protein A eluate. After contacting the eluate from protein A column chromatography with activated charcoal, (b) anion exchange chromatography. In a method characterized by purifying the eluate in the step (b) by (c) cation exchange chromatography, a pipe connecting the steps (b) and (c) for pH adjustment. A method characterized by arranging a surge tank between the two is known (Patent Document 3).
限外ろ過膜を用いたクロスフローユニットはタンパク質の精製において、タンパク質の濃縮、バッファー交換等の効果が必要な場合に用いられている。しかしながら、バイオ医薬品の連続精製法においては、連続した精製操作に適したタンパク質溶液の調整と排出流量の調整が困難であるが、配管上にホールディングタンク等を設けて溶液調整を行うと、１バッチ処理毎にホールディングタンク等の洗浄が必要となり連続精製を中断しなければならないことが問題であった。 A cross-flow unit using an ultrafiltration membrane is used when effects such as protein concentration and buffer exchange are required in protein purification. However, in the continuous purification method for biopharmacy, it is difficult to adjust the protein solution and the discharge flow rate suitable for the continuous purification operation. However, if a holding tank or the like is provided on the pipe to adjust the solution, one batch is used. The problem was that the holding tank and the like had to be cleaned for each treatment, and continuous purification had to be interrupted.
また、仮に特許文献３のように陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する装置とその溶出液を次の工程である陽イオン交換クロマトグラフィー装置に移送する配管上にホールディングタンク等を設け、精製中の流量を調節しようとすると、ホールディングタンク等の洗浄毎に、各装置を連結している配管をプラントから取り外して洗浄を行う必要があるため、連続精製を中断する必要があるが、連続精製によるバイオ医薬品製造のコストダウンを目指すためには障害となっている。
Further, as in
複数の単位操作を連結したタンパク質の連続精製方法において、各単位操作に供されるタンパク質の粗精製液を各単位操作に適したタンパク質濃度、ｐH、電気伝導度などに連続的に調製すると共に流速を一定にしつつ、かつ、医薬品生産の高度衛生管理の必要からシングルユース化に対応できる、コンパクトかつ安定に濃縮、希釈、溶液交換を連続的におこなうことを可能にした以下の発明が創作された。 In a method for continuously purifying a protein in which a plurality of unit operations are linked, a crude solution of the protein to be subjected to each unit operation is continuously prepared at a protein concentration, pH, electrical conductivity, etc. suitable for each unit operation, and a flow velocity. The following inventions have been created that enable continuous concentration, dilution, and solution exchange in a compact and stable manner, which can be used for single use due to the need for advanced hygiene management of pharmaceutical production. ..
本発明は、
〔１〕細胞培養液からのタンパク質の精製方法において、タンパク質の粗精製液に対して、サージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを用いて、少なくとも濃縮またはバッファー交換のいずれか一方を行う工程を有することを特徴とする方法、
〔２〕前記〔１〕記載の精製方法において、流量制御用サージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを用いて、少なくとも濃縮またはバッファー交換のいずれか一方を行う工程を培養液またはタンパク質の粗精製液に対するタンパク質の分離精製工程の後に行うことを特徴とする方法、
〔３〕前記〔１〕記載の精製方法において、サージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを用いて、少なくとも濃縮またはバッファー交換のいずれか一方を行う工程をタンパク質の粗精製液に対するタンパク質の分離精製工程の前に行うことを特徴とする方法、
〔４〕前記〔１〕記載の精製方法において、サージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを用いて、少なくとも濃縮またはバッファー交換のいずれか一方を行う工程をタンパク質の精製工程の間に行うことを特徴とする方法、
〔５〕前記〔１〕から〔４〕のいずれか一つに記載の精製方法において、細胞培養液からのタンパク質の精製を連続的に行うことを特徴とする方法、
〔６〕前記〔１〕から〔５〕のいずれか一つに記載の精製方法において、サージタンクが、流量制御機能を有することを特徴とする方法、および
〔７〕前記〔１〕から〔６〕のいずれか一つに記載の精製方法において、タンパク質が抗体であることを特徴とする方法に関する。
本発明はまた、
〔８〕サージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニット、
〔９〕限外ろ過膜を内包するモジュールがタンパク質を含む液体の流入口、タンパク質を含む液体の流出口、および廃液排出口を備えることを特徴とする〔８〕記載のクロスフロー限外ろ過ユニット、
〔１０〕複数の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットにおいて、各モジュールの連結方法は、前位のモジュールの流出口と次位のモジュールの流入口を接合させることからなり、最前位のモジュールの流入口はタンパク質を含む液体の供給手段と接合され、最後位のモジュールの流出口はサージタンクに接続されることを特徴とする〔９〕記載のクロスフロー限外ろ過ユニット、
〔１１〕タンパク質の連続生産工程において、シングルユース使用が可能な〔８〕から〔１０〕のいずれか一つに記載のクロスフロー限外ろ過ユニット、
および
〔１２〕前位のモジュールからの流出液とバッファーもしくは洗浄液を混合するために次位のモジュールの流入口の手前に設置する三方コックがエジェクターであることを特徴とする〔８〕から〔１１〕のいずれか一つに記載のクロスフロー限外ろ過ユニットに関する。
The present invention
[1] In a method for purifying a protein from a cell culture solution, a cross-flow ultrafiltration unit having a surge tank and a module including a plurality of ultrafiltration membranes connected to the crude protein solution is provided. A method, characterized in that it comprises the step of performing at least either concentration or buffer exchange.
[2] In the purification method according to the above [1], at least concentration or buffer is used by using a cross-flow ultrafiltration unit having a surge tank for flow control and to which a module including a plurality of ultrafiltration membranes is connected. A method characterized in that the step of performing either of the exchanges is performed after the step of separating and purifying the protein with respect to the culture solution or the crude solution of the protein.
[3] In the purification method according to the above [1], at least either concentration or buffer exchange is performed using a cross-flow ultrafiltration unit having a surge tank and to which a module containing a plurality of ultrafiltration membranes is connected. A method characterized in that the step of performing one of them is performed before the step of separating and purifying the protein with respect to the crude protein solution.
[4] In the purification method according to the above [1], at least either concentration or buffer exchange is performed using a cross-flow ultrafiltration unit having a surge tank and to which a module containing a plurality of ultrafiltration membranes is connected. A method characterized in that the step of performing one of them is performed during the step of purifying the protein,
[5] The method according to any one of [1] to [4] above, wherein the protein is continuously purified from the cell culture medium.
[6] In the purification method according to any one of the above [1] to [5], a method characterized in that the surge tank has a flow rate control function, and [7] the above [1] to [6]. ] The purification method according to any one of the above, wherein the protein is an antibody.
The present invention also
[8] A cross-flow ultrafiltration unit having a surge tank and to which modules containing a plurality of ultrafiltration membranes are connected.
[9] The cross-flow ultrafiltration unit according to [8], wherein the module containing the ultrafiltration membrane includes an inlet for a liquid containing a protein, an outlet for a liquid containing a protein, and a waste liquid outlet. ,
[10] In a cross-flow ultrafiltration unit in which modules containing a plurality of ultrafiltration membranes are connected, the method of connecting each module is to join the outlet of the previous module and the inlet of the next module. The crossflow according to [9], wherein the inlet of the frontmost module is joined to a supply means of a liquid containing a protein, and the outlet of the lastmost module is connected to a surge tank. Ultrafiltration unit,
[11] The cross-flow ultrafiltration unit according to any one of [8] to [10], which can be used for single use in a continuous protein production step.
And [12] the three-way cock installed in front of the inlet of the next module to mix the outflow liquid from the previous module with the buffer or cleaning liquid is an ejector [8] to [11]. ] The cross-flow ultrafiltration unit described in any one of the above.
本発明により、細胞培養液からのタンパク質の連続精製方法において、容易にタンパク質の濃縮およびバッファー交換が可能で、かつ流速の調節やシングルユースへの対応が容易なクロスフロー限外ろ過ユニットおよびクロスフロー限外ろ過方法が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, in a method for continuously purifying a protein from a cell culture medium, a crossflow ultrafiltration unit and a crossflow that allow easy protein concentration and buffer exchange, as well as easy flow rate adjustment and single-use support. An ultrafiltration method is provided.
本発明において、細胞培養液からのタンパク質の精製方法とは、培養タンクまたはバイオリアクターの中でタンパク質生産細胞を培養液中で培養した結果、タンパク質生産細胞により生産されたタンパク質を含む溶出液を、各種精製手段を用いて精製することにより不純物を取り除く方法を示す。 In the present invention, the method for purifying a protein from a cell culture medium is an eluate containing a protein produced by the protein-producing cells as a result of culturing the protein-producing cells in the culture medium in a culture tank or a bioreactor. A method of removing impurities by purification using various purification means is shown.
本発明において、タンパク質生産細胞とは組換え又は非組換えタンパク質等の有用物質生産に使用可能な細胞であれば特に限定されず、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、齧歯類のミエローマ細胞（例えば、ＳＰ２/Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞等のマウス骨髄腫細胞等）、大腸菌、枯草菌、ハイブリドーマ、昆虫細胞およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が例として挙げられる。有用物質として抗体を産生させる場合は、ＣＨＯ細胞を用いることが好ましい。 In the present invention, the protein-producing cells are not particularly limited as long as they can be used for producing useful substances such as recombinant or non-recombinant proteins, and are CHO cells, BHK cells, HepG2 cells, rodent myeloma cells ( For example, SP2 / O cells, mouse myeloma cells such as NSO cells), Escherichia coli, Bacillus subtilis, hybridoma, insect cells and transformed cells in which a foreign gene is introduced into these cells can be mentioned as an example. When producing an antibody as a useful substance, it is preferable to use CHO cells.
前記タンパク質生産細胞の培養液に用いられる培地としては、生産細胞の培養に適したものであればどのようなものでも良いが、例えば市販の培養培地の例としては、ハムＦ１０（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）、基礎培地〔「ＭＥＭ」（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）〕、ＲＰＭＩ-１６４０（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）、およびダルベッコ変法イーグル培地〔「ＤＭＥＭ」（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社製）〕を含む。何れのこのような培地は、必要に応じて、インスリン、トランスフェリン又は上皮細胞成長因子等のホルモンまたはその他増殖因子、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩等の塩類、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ、リン酸等のバッファー、チミジン、アデニン等のヌクレオシド、ゲンタマイシン等の抗生物質、鉄、銅、亜鉛、マグネシウム、等の微量元素、エネルギー源としてのグルコース等が添加されていてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、生産細胞の培養のために適した条件であればよい。 The medium used in the culture medium of the protein-producing cells may be any medium as long as it is suitable for culturing the producing cells. For example, as an example of a commercially available culture medium, Ham F10 (Sigma Aldrich Japan Joint) (Manufactured by the company), basal medium ["MEM" (manufactured by Sigma Aldrich Japan GK)], RPMI-1640 (manufactured by Sigma Aldrich Japan GK), and Dalbeco modified Eagle's medium ["DMEM" (manufactured by Sigma Aldrich Japan GK)) 〕including. Any such medium may optionally include hormones such as insulin, transferrin or epithelial cell growth factors or other growth factors, salts such as sodium chloride, calcium, magnesium and phosphates, HEPES, TRIS, phosphates and the like. Buffer, nucleosides such as thymidine and adenin, antibiotics such as gentamycin, trace elements such as iron, copper, zinc and magnesium, glucose as an energy source and the like may be added. The culture conditions, such as temperature and pH, may be any conditions suitable for culturing the producing cells.
本発明におけるタンパク質とは、組織プラスミンアクティベーター等の酵素、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン類、インターロイキン類のサイトカイン、ヒト抗体、マウス抗体、ヒト化抗体等の抗体等、どのようなものでも良いが、とりわけ抗体に用いることが好ましい。 The protein in the present invention may be any enzyme such as tissue plasmin activator, granulocyte colony stimulating factor, erythropoetin, interferons, cytokines of interleukins, human antibody, mouse antibody, antibody such as humanized antibody, etc. Good, but especially preferred for antibodies.
本発明における溶出液とは、生産細胞により生産されたタンパク質を含む培養液であって、培養タンクまたはバイオリアクターから、溶出される液体を示す。 The eluate in the present invention is a culture solution containing a protein produced by a production cell, and indicates a liquid eluted from a culture tank or a bioreactor.
本発明における分離精製手段としては、ウイルスろ過、プロテインＡクロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー手段、ウイルスろ過等の衛生管理に必須の精製手段、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、又は限外ろ過とダイアフィルトレーションとの組合せによる濃縮手段が挙げられる。 Separation and purification means in the present invention include virus filtration, affinity chromatography such as protein A chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, mixed mode chromatography, and / or hydrophobic interaction chromatography and the like. Examples thereof include various chromatographic means, purification means essential for hygiene control such as virus filtration, ultrafiltration, diafiltration, or concentration means by combining ultrafiltration and diafiltration.
本精製方法に付すタンパク質の粗精製液とは、タンパク質が工程の最終産物として純化されていない状態の溶出液であればどのような状態のものでも良く、用いられる粗精製液が前記精製工程のいずれかの手段により精製されたものであっても、または培養タンクからの溶出液であっても良いが、前記分離クロマトグラフィーにより精製された後の粗精製液であることが好ましい。 The crude protein solution attached to the present purification method may be any state as long as the eluate is in a state in which the protein is not purified as the final product of the step, and the crude solution used is the crude solution of the purification step. It may be purified by any means, or it may be an eluate from a culture tank, but it is preferably a crude purified solution after being purified by the separation chromatography.
サージタンクとは流体の過剰な流入量を一時的に蓄えることで流量を緩和して増減を平準化することを目的に備えられる比較的小型の貯留槽を示し、単に１バッチ相当の流体を貯蔵するためのホールディングタンクとは異なる。本発明の特徴はサージタンクが複数の限外ろ過膜を内包するモジュールがエジェクターで連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットに設置され、クロスフロー限外ろ過工程が終了したタンパク質の粗精製液（溶出液）の流量を調節しえるようにしたことである。サージタンクにより流量を調整された粗精製液は次の工程である精製手段に移送される。精製手段はウイルスろ過、プロテインＡクロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、および／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー等の各種分離クロマトグラフィー手段、ウイルスろ過等の衛生管理に必須の精製手段、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、又は限外ろ過とダイアフィルトレーションとの組合せによる濃縮手段が挙げられるが、とりわけ分離クロマトグラフィーによる精製工程に、タンパク質の粗精製液（溶出液）を移送することが好ましい。 A surge tank is a relatively small storage tank that is provided for the purpose of relaxing the flow rate and leveling the increase / decrease by temporarily storing the excess inflow of fluid, and simply stores one batch of fluid. It is different from the holding tank for The feature of the present invention is that the surge tank is installed in a cross-flow ultrafiltration unit in which a module containing a plurality of ultrafiltration membranes is connected by an ejector, and the cross-flow ultrafiltration step is completed. The flow rate of the eluate) can be adjusted. The crude refined liquid whose flow rate is adjusted by the surge tank is transferred to the purification means, which is the next step. Purification means include virus filtration, affinity chromatography such as protein A chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, mixed mode chromatography, and / or various separation chromatography means such as hydrophobic interaction chromatography. Purification means essential for hygiene management such as virus filtration, ultrafiltration, diafiltration, or concentration means by combining ultrafiltration and diafiltration can be mentioned, but especially in the purification step by separation chromatography. It is preferable to transfer the crude protein solution (eluent).
本発明の複数の限外ろ過膜を内包するモジュールがエジェクターで連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットにおける、限外ろ過膜を内包するモジュールとは、筐体中に限外ろ過膜を内蔵し溶液の流れがクロスフローになるように設計されたモジュールを示す。限外ろ過膜の形状としては平膜や中空糸膜またはスパイラル膜等が挙げられるが、中空糸膜を用いることが好ましい。膜の素材としては、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル等が挙げられるがこれらに限定されたものではない。 In the cross-flow ultrafiltration unit in which the modules containing a plurality of ultrafiltration membranes of the present invention are connected by an ejector, the module containing the ultrafiltration membrane has an ultrafiltration membrane built in the housing. Shown is a module designed so that the flow of solution is cross-flow. Examples of the shape of the ultrafiltration membrane include a flat membrane, a hollow fiber membrane, a spiral membrane, and the like, but it is preferable to use a hollow fiber membrane. Examples of the material of the membrane include, but are not limited to, cellulose acetate, aromatic polyamide, polyvinyl alcohol, polysulfone, polyvinylidene fluoride, polyethylene, polyacrylonitrile and the like.
複数の限外ろ過膜を内包するモジュールがエジェクターで連結されているとは、前記限外ろ過膜を内包するモジュールの各モジュールが、前位のモジュールの流出口と次位のモジュールの流入口をエジェクターで接合されていると共に、最前位のモジュールの流入口は粗タンパク質を含む液体の供給手段と接合され、最後位のモジュールの流出口はサージタンクに接続されている状態を示す。各モジュールはタンパク質を含む粗精製液が流出する流出口と共に廃液が排出される排出口を持つ。使用されるモジュールの数は２つ以上好ましくは９つ以内が良い。各モジュール間の接合方法は逆流が生じなければどのようなものでも良いが、三方コックを介して接合すると、モジュールの用途により例えばバッファー交換の場合はバッファーを三方コックの一方の口から、洗浄の場合は洗浄液を三方コックの一方の口から注入することが可能になる。三方コックはどのようなものでも良いが、エジェクターを用いることが好ましい。 When the modules containing a plurality of ultrafiltration membranes are connected by an ejector, each module of the module containing the ultrafiltration membranes has an outlet of the previous module and an inlet of the next module. In addition to being joined by an ejector, the inlet of the frontmost module is joined with a liquid supply means containing crude protein, and the outlet of the lastmost module is connected to the surge tank. Each module has an outlet through which the crude purified liquid containing protein flows out and an outlet through which the waste liquid is discharged. The number of modules used is preferably 2 or more, preferably 9 or less. The joining method between the modules may be any method as long as no backflow occurs, but when joining via a three-way cock, depending on the application of the module, for example, in the case of buffer replacement, the buffer can be cleaned from one mouth of the three-way cock. In that case, the cleaning solution can be injected from one mouth of the three-way cock. Any three-way cock can be used, but it is preferable to use an ejector.
本発明は、このようなサージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールがエジェクターで連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを用いることにより、タンパク質の粗精製液中のタンパク質の少なくとも濃縮またはバッファー交換を容易に行うことができる。 The present invention uses a cross-flow ultrafiltration unit provided with such a surge tank and in which modules containing a plurality of ultrafiltration membranes are connected by an ejector, whereby at least the protein in the crude protein solution is used. Concentration or buffer exchange can be easily performed.
本発明における少なくとも濃縮またはバッファー交換を行う工程とは、濃縮を行う工程、バッファー交換を行う工程、希釈を行った後に濃縮を行う工程、およびバッファー交換を行う工程を示し、これらの工程は反復繰り返しても良い。 In the present invention, at least the step of concentrating or exchanging the buffer means a step of concentrating, a step of exchanging the buffer, a step of concentrating after diluting, and a step of exchanging the buffer, and these steps are repeated repeatedly. You may.
本発明でいう濃縮とは、タンパク質の粗精製液から溶媒を除きタンパク質の濃度を増加させる操作を示し、バッファー交換とは粗精製液から低分子除去及び塩分除去を行う脱塩手法であり、タンパク質が溶解しているバッファーの交換を示す。 Concentration as used in the present invention refers to an operation of removing a solvent from a crude protein solution to increase the concentration of the protein, and buffer exchange is a desalting method for removing low molecules and salt from the crude protein solution. Indicates replacement of the buffer in which is dissolved.
バッファーとは塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸バッファー、トリスバッファー、ＨＥＰＥＳバッファーおよび酢酸バッファー等が挙げられるが、通常利用されるバッファーであれば特に限定されるものではない。 The buffer is an aqueous solution containing salts, and specific examples thereof include a phosphate buffer, a Tris buffer, a HEPES buffer, and an acetic acid buffer, but the buffer is not particularly limited as long as it is a commonly used buffer.
また、連続精製の工程においてユニット内の一つのモジュールがタンパク質の濃縮の機能を持ち、別のモジュールがバッファー交換の機能を持つことができる。更にモジュールのフィルター等が目詰まりを起こした場合は、フィルターモジュールユニットを取り外し、新たなユニットと容易に交換することができる。また、各段階のフィルターモジュールをそれぞれ2本以上並列に接続することで目詰まりを生じたフィルターのみを交換することにより連続精製を中断することなく行うことができる。このように簡単に交換できる装置であるため、本発明のユニットはバイオ医薬品製造のシングルユース化にも対応可能である。 Further, in the step of continuous purification, one module in the unit can have a function of protein concentration and another module can have a function of buffer exchange. Further, when the filter or the like of the module is clogged, the filter module unit can be removed and easily replaced with a new unit. Further, by connecting two or more filter modules at each stage in parallel, only the clogged filter can be replaced, so that continuous purification can be performed without interruption. Since the device can be easily replaced in this way, the unit of the present invention can be used for single use in biopharmacy production.
本発明におけるサージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールがエジェクターで連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットとは、タンパク質の連続製造工程等において、生産の目的とするタンパク質の粗精製液を濃縮またはバッファー交換に用いる装置ユニットを示し、ユニット内に複数のクロスフローによる限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されていること、当該連結された複数の限外ろ過膜を内包するモジュールの排出口がサージタンクと接続されることにより、タンパク質の粗精製溶液がユニットから一定流量で排出される機能を有するユニットを示す。 The cross-flow ultrafiltration unit comprising the surge tank in the present invention and in which a module containing a plurality of ultrafiltration membranes is connected by an ejector is a crude protein to be produced in a continuous protein production process or the like. Indicates an equipment unit that uses the purified solution for concentration or buffer exchange, and that a module containing a plurality of cross-flow ultrafiltration membranes is connected in the unit, and that the connected multiple ultrafiltration membranes are included. A unit having a function of discharging a crude protein solution from the unit at a constant flow rate by connecting the discharge port of the module to a surge tank is shown.
また、限外ろ過膜を内包するモジュールがタンパク質を含む液体の流入口、タンパク質を含む液体の流出口、および廃液排出口を備えるとは、複数のユニットの流入口および排出口が並列又は直列に連結されることにより、より多機能なろ過機能を示せる状態を示すが、各モジュールの連結方法は、前位のモジュールの流出口と次位のモジュールの流入口をエジェクターで接合させることからなり、最前位のモジュールの流入口はタンパク質を含む液体の供給手段と接合され、最後位のモジュールの流出口はサージタンクに接続されていることが好ましい。 Further, when the module containing the ultrafiltration membrane is provided with an inlet for a liquid containing protein, an outlet for liquid containing protein, and an outlet for waste liquid, the inlet and outlet of a plurality of units are arranged in parallel or in series. By connecting, it shows a state where a more multifunctional filtration function can be shown, but the connection method of each module consists of joining the outlet of the previous module and the inlet of the next module with an ejector. It is preferable that the inlet of the frontmost module is joined to the supply means of the liquid containing protein, and the outlet of the rearmost module is connected to the surge tank.
本発明において、前位のモジュールの流出口と次位のモジュールの流入口を接合する方法は、流入口に三方コックを用いる等の一般的な方法でも良いが、モジュールの流入口がエジェクターであることがとりわけ好ましい。 In the present invention, the method of joining the outlet of the previous module and the inlet of the next module may be a general method such as using a three-way cock for the inlet, but the inlet of the module is an ejector. Is particularly preferred.
［実施例１］
図１に示したサージタンクを備え、３個の限外ろ過膜を内包するフィルターモジュールがエジェクターで連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを作製した。
[Example 1]
A cross-flow ultrafiltration unit having the surge tank shown in FIG. 1 and having a filter module containing three ultrafiltration membranes connected by an ejector was produced.
以下に、作製されたサージタンクを備え、３個の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを説明する。 Hereinafter, a cross-flow ultrafiltration unit including a manufactured surge tank and to which a module containing three ultrafiltration membranes is connected will be described.
前記ユニットには、Ａ、Ｂ、Ｃで示された３つの限外ろ過膜を内包するモジュール〔ＭｉｄｉＫｒｏｓ（商品名：ミディクロス）タンジェンシャルフローろ過実験用小型中空糸膜モジュール：ＳＰＥＣＴＲＵＭＬＡＢＳ．ＣＯＭ（スペクトラムラボ社）製〕が並列に配置され、カラム内には限外ろ過膜としてポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を素材とする中空糸膜〔ＳＰＥＣＴＲＵＭＬＡＢＳ．ＣＯＭ（スペクトラムラボ社）製、製品番号：Ｄ０２−Ｅ０３０−０５−Ｎ、細孔：３０ｋＤ、内径：０．５ｍｍ、膜面積：１１５ｃｍ２〕が充填されている。第一の限外ろ過膜を内包するモジュール（Ａ）の一次側（未透過側）入口（６ａ）は、バルブ（４ａ）を介してタンパク質の粗精製液の入ったタンク（１ａ）と接続され、該ユニットへのタンパク質の粗精製液の入り口としての役割をはたしている。なお、タンパク質の粗精製液の入ったタンク（１ａ）とバルブ（４ａ）を結ぶ配管には、ポンプ（２ａ）と流量計（３ａ）が設置され、一次側（未透過側）入口（６ａ）とバルブ（４ａ）を結ぶ配管には、圧力計（５ａ）が設置されている。第一のモジュール内で濃縮されたタンパク質の粗精製液は、第一のモジュール（Ａ）の一次側（未透過側）出口（７ａ）からエジェクター（４ｂ）を介して第二の限外ろ過膜を内包するモジュール（Ｂ）の一次側（未透過側）入口（６ｂ）と接続されているため、第二のモジュール内へ移送される。第一のモジュール（Ａ）の一次側（未透過側）出口（７ａ）とエジェクター（４ｂ）を結ぶ配管には圧力計（９ａ）と流量計（１１ａ）が設置されている。一方、第一のモジュールにおける廃液は第一のモジュール（Ａ）の二次側（透過側）出口（８ａ）から排出される。 The unit contains a module [MidiKros (trade name: Midicross) small hollow fiber membrane module for tangential flow filtration experiment: SPECTRUMLABS. COM (manufactured by Spectrum Lab)] is arranged in parallel, and a hollow fiber membrane made of polyether sulfone (PES) as an ultrafiltration membrane [SPECTRUMLABS. Made by COM (Spectrum Lab), product number: D02-E030-05-N, pores: 30 kD, inner diameter: 0.5 mm, film area: 115 cm 2 ] is filled. The primary side (impermeable side) inlet (6a) of the module (A) containing the first ultrafiltration membrane is connected to the tank (1a) containing the crude protein solution via a valve (4a). , It serves as an entrance for the crude protein solution to the unit. A pump (2a) and a flow meter (3a) are installed in the pipe connecting the tank (1a) containing the crude protein solution and the valve (4a), and the primary side (non-permeated side) inlet (6a). A pressure gauge (5a) is installed in the pipe connecting the valve (4a) and the valve (4a). The crude protein solution concentrated in the first module is subjected to the second ultrafiltration membrane from the primary side (non-permeated side) outlet (7a) of the first module (A) via the ejector (4b). Since it is connected to the primary side (non-transparent side) inlet (6b) of the module (B) containing the above, it is transferred into the second module. A pressure gauge (9a) and a flow meter (11a) are installed in the pipe connecting the primary side (non-transparent side) outlet (7a) and the ejector (4b) of the first module (A). On the other hand, the waste liquid in the first module is discharged from the secondary side (permeation side) outlet (8a) of the first module (A).
エジェクター（４ｂ）は、精製水又は注射用生理食塩水の入ったタンク（１ｂ）とも接続されているため、第二の限外ろ過膜を内包するモジュール（Ｂ）には、第一のモジュール内で濃縮されたタンパク質の粗精製液が洗浄用の精製水又注射用生理食塩水に希釈された形で注入される。なお、精製水または注射用生理食塩水の入ったタンク（１ｂ）とエジェクター（４ｂ）の間の配管には、ポンプ（２ｂ）と流量計（３ｂ）が設置され、モジュール（Ｂ）の一次側（未透過側）入口（６ｂ）とエジェクター（４ｂ）を結ぶ配管の間には圧力計５（ｂ）が設置されている。 Since the ejector (4b) is also connected to the tank (1b) containing purified water or physiological saline for injection, the module (B) containing the second ultrafiltration membrane is contained in the first module. The crude purified solution of the protein concentrated in (1) is injected in a diluted form in purified water for washing or physiological saline for injection. A pump (2b) and a flow meter (3b) are installed in the pipe between the tank (1b) containing purified water or saline for injection and the ejector (4b), and the primary side of the module (B). A pressure gauge 5 (b) is installed between the pipe connecting the (non-permeating side) inlet (6b) and the ejector (4b).
第二のモジュール内で洗浄されたタンパク質の粗精製液は、第二のモジュール（Ｂ）の一次側（未透過側）出口（７ｂ）からエジェクター（４ｃ）を介して第三の限外ろ過膜を内包するモジュール（Ｃ）の一次側（未透過側）入口（６ｃ）と接続されているため、第二のモジュール内へ移送される。第二のモジュール（Ｂ）の一次側（未透過側）出口（７ｂ）とエジェクター（４ｃ）を結ぶ配管には圧力計（９ｂ）と流量計（１１ｂ）が設置されている。一方、第二のモジュールにおける廃液は第ニのモジュール（Ｂ）の二次側（透過側）出口（８ｂ）から排出される。 The crude protein solution washed in the second module is subjected to a third ultrafiltration membrane from the primary side (non-permeated side) outlet (7b) of the second module (B) via an ejector (4c). Since it is connected to the primary side (non-transparent side) inlet (6c) of the module (C) containing the above, it is transferred into the second module. A pressure gauge (9b) and a flow meter (11b) are installed in the pipe connecting the primary side (non-transparent side) outlet (7b) and the ejector (4c) of the second module (B). On the other hand, the waste liquid in the second module is discharged from the secondary side (permeation side) outlet (8b) of the second module (B).
エジェクター（４ｃ）は、バッファーの入ったタンク（１ｃ）とも接続されているため、第三の限外ろ過膜を内包するモジュール（Ｃ）には、第二のモジュール内で濃縮されたタンパク質がバッファーで希釈された形で注入される。なお、バッファーの入ったタンク（１ｃ）とエジェクター（４ｃ）の間の配管には、ポンプ（２ｃ）と流量計（３ｃ）が設置され、モジュール（Ｃ）の一次側（未透過側）入口（６ｃ）とエジェクター（４ｃ）を結ぶ配管の間には圧力計（５ｃ）が設置されている。 Since the ejector (4c) is also connected to the tank (1c) containing the buffer, the module (C) containing the third ultrafiltration membrane is buffered with the protein concentrated in the second module. It is injected in a diluted form with. A pump (2c) and a flow meter (3c) are installed in the piping between the tank (1c) containing the buffer and the ejector (4c), and the primary side (non-transparent side) inlet of the module (C) (non-transparent side). A pressure gauge (5c) is installed between the pipes connecting the ejector (4c) and the ejector (6c).
第三のモジュール内でバッファー交換されたタンパク質の粗精製液は、第三のモジュール（Ｃ）の一次側（未透過側）出口（７ｃ）から、圧力計（９Ｃ）が設置された配管により、サージタンク（Ｄ）と接続しているＴ字型（三方）継手に接続される。一方、第三のモジュールにおける廃液は第三のモジュール（Ｃ）の二次側（透過側）出口（８ｃ）から排出される。 The crude protein solution whose buffer has been exchanged in the third module is sent from the primary side (non-permeated side) outlet (7c) of the third module (C) through a pipe equipped with a pressure gauge (9C). It is connected to a T-shaped (three-way) joint that is connected to the surge tank (D). On the other hand, the waste liquid in the third module is discharged from the secondary side (permeation side) outlet (8c) of the third module (C).
サージタンク（Ｄ）は、サージタンク下方出入口（１７）によりＴ字型（三方）継手（１２）と接続され、その上方はサージタンク上方出入口（空気出入口）（１８）によりベントフィルター付き圧力調整用バルブ（１９）と接続している。 The surge tank (D) is connected to a T-shaped (three-way) joint (12) by a surge tank lower inlet / outlet (17), and above it is for pressure adjustment with a vent filter by a surge tank upper inlet / outlet (air inlet / outlet) (18). It is connected to the valve (19).
本発明のサージタンクを備え、３個の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットにより精製されたタンパク質の粗精製液は、Ｔ字型（三方）継手（１２）から、バルブ（１３）を経て、次の精製手段と接続可能な構成され、更に連続製紙のために必要な、ｐＨメーター（１４）、導電率計（１５）、流量計（１６）が設置される。 The crude protein purified by the cross-flow ultrafiltration unit equipped with the surge tank of the present invention and to which a module containing three ultrafiltration membranes is connected is a T-shaped (three-way) joint (12). ), Via a valve (13), a pH meter (14), a conductivity meter (15), and a flow meter (16), which are configured to be connectable to the next refining means and are necessary for continuous papermaking, are installed. Will be done.
［実施例２］
図２に示すサージタンクを備え、３個の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを製作し、実施例３以降の試験でその機能を評価した。
[Example 2]
A cross-flow ultrafiltration unit having the surge tank shown in FIG. 2 and to which a module containing three ultrafiltration membranes is connected was manufactured, and its function was evaluated in the tests of Example 3 and thereafter.
図２の装置は、濃縮用（２１）、脱塩用（２２）、バッファー交換用（２３）の機能に用いる３つの限外ろ過膜を内包するモジュール〔ＭｉｄｉＫｒｏｓ（商品名：ミディクロス）タンジェンシャルフローろ過実験用小型中空糸膜モジュール：ＳＰＥＣＴＲＵＭＬＡＢＳ．ＣＯＭ（スペクトラムラボ社）製〕が並列に配置され、カラム内には限外ろ過膜としてポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を素材とする中空糸膜〔ＳＰＥＣＴＲＵＭＬＡＢＳ．ＣＯＭ（スペクトラムラボ社）製、製品番号：Ｄ０２−Ｅ０３０−０５−Ｎ、細孔：３０ｋＤ，内径：０．５ｍｍ、膜面積：１１５ｃｍ２〕を充填した。 The device of FIG. 2 is a module [MidiKros (trade name: Midicross) tangential) containing three ultrafiltration membranes used for the functions of concentration (21), desalination (22), and buffer exchange (23). Small hollow fiber membrane module for flow filtration experiments: SPECTRUMLABS. COM (manufactured by Spectrum Lab)] is arranged in parallel, and a hollow fiber membrane made of polyether sulfone (PES) as an ultrafiltration membrane [SPECTRUMLABS. COM (Spectrum Lab), product number: D02-E030-05-N, pores: 30 kD, inner diameter: 0.5 mm, film area: 115 cm 2 ] was filled.
各モジュールは、ろ過の対象となる溶液が濃縮用モジュール（２１）を介して脱塩用モジュール（２２）、次いでバッファー交換用モジュール（２３）と順次移動するように構成されているが、多連ポンプヘッド（商品名：カートリッジポンプヘッドシステムＬ／Ｓ、マスターフラックス社製）を持ったポンプ（２４）（商品名：タンジェンシャルフローろ過システム、スペクトラム社製）により濃縮用モジュール（２１）のみならず、エジェクター（２５）（２６）（形式名ＤＡＥＪＨ−１８０１１）を介して、脱塩用モジュール（２２）、バッファー交換用モジュール（２３）にも水や緩衝液が直接注入できるように構成されている。 Each module is configured such that the solution to be filtered moves sequentially through the concentration module (21) to the desalting module (22) and then to the buffer replacement module (23). Not only the concentration module (21) but also the concentration module (21) by the pump (24) (trade name: tangential flow filtration system, manufactured by Spectrum) having a pump head (trade name: cartridge pump head system L / S, manufactured by Masterflux). , Water or buffer can be directly injected into the desalting module (22) and the buffer replacement module (23) via the ejectors (25) (26) (model name DAEJH-18011). ..
多連ポンプヘッドを持ったポンプは、サンプル貯留槽（２７）、水貯留槽（２８）、バッファー貯留槽（２９）とも接続できる構造を持ち、これらの貯留槽中の液体を目的に応じて各モジュールに供給する機能を持つ。また、バッファー交換モジュールから排出された流体は、通気のできるサージタンク（３０）（内径５０ｍｍ，高さ４００ｍｍ）と接続した排出管で排出される構成を持ち、流体は次の精製手段である陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）または陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）へと移送される。
The pump having a multiple pump head has a structure that can be connected to a sample storage tank (27), a water storage tank (28), and a buffer storage tank (29), and each of the liquids in these storage tanks can be used according to the purpose. It has a function to supply to the module. Further, the fluid discharged from the buffer exchange module has a configuration in which it is discharged through a discharge pipe connected to a surge tank (30) (
［実施例３］
実施例２で製作したクロスフロー限外ろ過ユニットにおいて、（１）各流速での圧力損出と処理液量の確認、（２）各流速での圧損、処理液量、モジュール単位の水透過性の確認，を行うため以下の試験を行った。サンプル貯留槽、水貯留槽、バッファー貯留槽にいずれも精製水を充填し、添加流速を１０〜１５０ｍＬ／ｍｉｎ、膜間差圧を大気開放（加圧なし）の条件で実験を行った。実験方法は、各流速において６０秒経過後安定した時点で圧力損出（膜間差圧参考値）及び１次側保持流量（Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ流量）、２次側透過流量（Ｐｅｒｍｅａｔｅ流量）を測定した。
[Example 3]
In the cross-flow ultrafiltration unit manufactured in Example 2, (1) pressure loss at each flow velocity and confirmation of the amount of treatment liquid, (2) pressure loss at each flow velocity, amount of treatment liquid, and water permeability of each module. The following tests were conducted to confirm the above. The sample storage tank, the water storage tank, and the buffer storage tank were all filled with purified water, and the experiment was conducted under the conditions that the addition flow rate was 10 to 150 mL / min and the intermembrane pressure was open to the atmosphere (no pressurization). In the experimental method, the pressure loss (intermembrane differential pressure reference value), the primary side holding flow rate (Retentate flow rate), and the secondary side permeation flow rate (Permeate flow rate) were measured at the time when each flow velocity became stable after 60 seconds.
（１）各種流速での圧損と処理液量の確認
結果を図３に示した。図３によれば、一次側流速の変化に応じて圧損(膜間差圧参考値)、1次側保持流量（Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ流量）、２次側透過流量（Ｐｅｒｍｅａｔｅ流量）が一次関数的に変化しており処理量は流速と比例することがわかった。このことにより、３連の膜モジュールをエジェクターで接続したシステムにおいて各膜モジュールに通液される際にエジェクターを介して引き込まれることにより３段階の膜モジュールにおいて最初に投入された溶液が順次濃縮、希釈・濃縮、希釈濃縮されて溶液交換が可能であることが実証された。
(1) Fig. 3 shows the results of checking the pressure loss and the amount of treatment liquid at various flow velocities. According to FIG. 3, the pressure loss (intermembrane differential pressure reference value), the primary side holding flow rate (Retentate flow rate), and the secondary side permeation flow rate (Permeate flow rate) change linearly according to the change in the primary side flow velocity. It was found that the processing amount was proportional to the flow velocity. As a result, in a system in which three membrane modules are connected by an ejector, the solution initially charged in the three-stage membrane module is sequentially concentrated by being drawn through the ejector when the liquid is passed through each membrane module. It was demonstrated that the solution can be exchanged by diluting / concentrating and diluting / concentrating.
（２）各流速での圧損、処理液量、モジュール単位の水透過性（Ｗａｔｅｒ Ｆｌｕｘ）の確認結果を第１表に示した。第１表中のＴＭＰは膜間差圧、Ｗａｔｅｒ Ｆｌｕｘ＠２０℃は２０℃における水透過性、Ｗａｔｅｒ Ｆｌｕｘ ｍｌ／ｍｉｎ／モジュールは、モジュールの1分当たりの水透過性を示す。 (2) Table 1 shows the results of confirming the pressure loss at each flow velocity, the amount of the treated liquid, and the water permeability (Water Lux) of each module. In Table 1, TMP indicates the differential pressure between membranes, Water Lux @ 20 ° C. indicates water permeability at 20 ° C., and Water Flux ml / min / module indicates water permeability per minute of the module.
第１表によれば、各流速で、処理液量、透過液（Ｐｅｒｍｅａｔｅ）、膜間差圧（ＴＭＰ）、水透過性はＵＦ膜モジュールの本数に関わらず一次関数的に変化しており、水透過性は膜モジュール本数に比例することがわかった。このことは、本実施例の（１）で示したことを裏付けるものであり、１番目のＵＦ膜モジュールで濾過されて透過側に出てくる溶液の量が１番目のＵＦ膜モジュールにおいて流速に応じて直線的に多くなっていること、および２つのＵＦ膜モジュールをエジェクターで接続した場合に透過流量がほぼ直線的に増加していることから１番目のＵＦ膜モジュールで濃縮された溶液がエジェクターを経由して２番目のモジュールに引き込まれ透過流量、処理液量が共に多くなっている。このことは３つのＵＦ膜モジュールをエジェクターで繋いで１番目の膜モジュールで濃縮を行い、２番目の膜モジュールで希釈・濃縮、また３番目の膜モジュールで希釈・濃縮されることで処理流量、透過流量共に直線的に増加していることからこのシステムによるバッファー交換が可能であることが示された。 According to Table 1, the treatment liquid volume, permeate, intermembrane differential pressure (TMP), and water permeability change linearly at each flow velocity regardless of the number of UF membrane modules. It was found that the water permeability is proportional to the number of membrane modules. This confirms what was shown in (1) of this example, and the amount of the liquid filtered by the first UF membrane module and coming out to the permeation side becomes the flow velocity in the first UF membrane module. The solution concentrated by the first UF membrane module is the ejector because it increases linearly accordingly and the permeation flow rate increases almost linearly when the two UF membrane modules are connected by an ejector. It is drawn into the second module via the above, and both the permeation flow rate and the amount of processing liquid are large. This means that the three UF membrane modules are connected by an ejector, concentrated by the first membrane module, diluted and concentrated by the second membrane module, and diluted and concentrated by the third membrane module, so that the processing flow rate is increased. Both the permeation flow rate increased linearly, indicating that buffer exchange by this system is possible.
［実施例４］
実施例２で製作したクロスフロー限外ろ過ユニットにおいて、バッファーの交換効率の変化の確認を行うために、（１）酢酸バッファーからリン酸バッファーへの交換効率、（２）ＮａＣｌ溶液からリン酸バッファーへの交換効率、および（３）ＮａＣｌ溶液から酢酸バッファーへの交換率を測定した。
[Example 4]
In the cross-flow ultrafiltration unit manufactured in Example 2, in order to confirm the change in the buffer exchange efficiency, (1) the exchange efficiency from the acetate buffer to the phosphate buffer, and (2) the NaCl solution to the phosphate buffer. The exchange efficiency to (3) NaCl solution to acetate buffer was measured.
（１）酢酸バッファーからリン酸バッファーへの交換
サンプル貯留槽に０．１Ｍ酢酸Ｎａ バッファー ｐＨ３．５、水貯留槽へ精製水、バッファー貯留槽に２０ｍＭリン酸Ｎａバッファー ｐＨ７．０を充填し、添加流速 を１０〜１５０ｍＬ／ｍｉｎ、膜間差圧を大気開放（加圧なし）の条件で実験を行った。実験方法は、各流速において６０秒経過後安定した時点で圧力損出（膜間差圧参考値）及び１次側保持流量、２次側透過流量に加えて、導電率（Ｃｏｎｄ）およびｐＨを測定した。
(1) Replacement of acetate buffer with phosphate buffer 0.1 M Na acetate buffer pH 3.5 is filled in the sample storage tank, purified water is filled in the water storage tank, and 20 mM Na phosphate buffer pH 7.0 is filled in the buffer storage tank, and the mixture is added. The experiment was conducted under the conditions that the flow velocity was 10 to 150 mL / min and the intermembrane differential pressure was open to the atmosphere (no pressurization). The experimental method is to determine the conductivity (Cond) and pH in addition to the pressure loss (intermembrane differential pressure reference value), the primary side holding flow rate, and the secondary side permeation flow rate when the pressure is stabilized after 60 seconds have passed at each flow rate. It was measured.
その結果を図４に示した。図４によれば各流速で、圧損、処理液量が比例関係であって、導電率、ｐＨは各流速でほぼ一定の値であることがわかった。従って、３段階のＵＦ膜モジュールをエジェクターで繋ぐことで、それぞれ濃縮、希釈・濃縮、希釈・バッファー交換が行われていることが明白である。但し、バッファー交換は３番目のＵＦ膜モジュールでのみ行われている為完全なバッファー交換にはなっておらず一定割合の置換にとどまっていることが判る。しかしながら処理される流速が２０ｍｌ／ｍｉｎの段階から１２０ｍｉ／ｍｉｎと言う比較的高流速での処理においても電気伝導度及びｐＨの値が安定していることから広範囲の流速で安定したバッファー交換が行われていることが理解された。 The result is shown in FIG. According to FIG. 4, it was found that the pressure loss and the amount of the treatment liquid were in a proportional relationship at each flow velocity, and the conductivity and pH were substantially constant values at each flow velocity. Therefore, it is clear that by connecting the three-stage UF membrane modules with an ejector, concentration, dilution / concentration, and dilution / buffer exchange are performed, respectively. However, since the buffer exchange is performed only in the third UF membrane module, it can be seen that the buffer exchange is not complete and the replacement is limited to a certain ratio. However, since the electrical conductivity and pH values are stable even in the treatment at a relatively high flow velocity of 120 mi / min from the stage where the treatment flow velocity is 20 ml / min, stable buffer exchange is performed at a wide range of flow velocities. It was understood that it was being done.
（２）ＮａＣｌ溶液からリン酸バッファーへの交換
サンプル貯留槽に５０ｍＭＮａＣｌ、水貯留槽へ精製水、バッファー貯留槽に２０ｍＭリン酸Ｎａバッファー ｐＨ７．０を充填し、添加流速を１０〜１５０ｍＬ／ｍｉｎ、膜間差圧を大気開放（加圧なし）の条件で実験を行った。実験方法は、各流速において６０秒経過後安定した時点で圧力損出（膜間差圧参考値）及び１次側保持流量、２次側透過流量に加えて、導電率（Ｃｏｎｄ）およびｐＨを測定した。
結果を第２に表に示した。第２表中、Ｃｏｎｄは導電率、Ｐｆは供給液圧力、Ｐｐは透過液圧力、Ｐｒは保持液圧力、ＴＭＰは膜間差圧を示す。
(2) Replacement of NaCl solution with phosphate buffer
The sample storage tank is filled with 50 mM NaCl, the water storage tank is filled with purified water, and the buffer storage tank is filled with 20 mM Na phosphate buffer pH 7.0, the addition flow rate is 10 to 150 mL / min, and the intermembrane differential pressure is open to the atmosphere (no pressurization). The experiment was conducted under the conditions of. The experimental method is to determine the conductivity (Cond) and pH in addition to the pressure loss (intermembrane differential pressure reference value), the primary side holding flow rate, and the secondary side permeation flow rate when the pressure is stabilized after 60 seconds have passed at each flow rate. It was measured.
The results are shown in the second table. In Table 2, Cond indicates the conductivity, Pf indicates the supply liquid pressure, Pp indicates the permeate liquid pressure, Pr indicates the holding liquid pressure, and TMP indicates the intermembrane differential pressure.
第２表より、各流速で、圧損、処理液量が比例関係であって、導電率、ｐＨは各流速でほぼ一定の値であることがわかった。このことはサンプル（５０ｍＭ ＮａＣ１）や希釈液、バッファーを変えても同様に一定した効率でバッファー交換が可能であることを示した。 From Table 2, it was found that the pressure loss and the amount of the treatment liquid were in a proportional relationship at each flow velocity, and the conductivity and pH were almost constant values at each flow velocity. This indicates that the buffer can be exchanged with a constant efficiency even if the sample (50 mM NaC1), the diluent, and the buffer are changed.
（３）ＮａＣｌ溶液から酢酸バッファーへの交換
サンプル貯留槽に２５０ｍＭ ＮａＣｌ、水貯留槽へ精製水、バッファー貯留槽に１００ｍＭ酢酸バッファーｐＨ３．５を充填し、２０ｍｌ／ｍｉｎから１００ｍｌ／ｍｉｎまで流速を変化させた時の各センサー圧力計および膜間差圧(表示)が安定していることを６０秒経過時点において確認した後、データを取得した。液量は、圧力安定確認後６０秒間の液量を測定した。
結果を第３表に示した。第３表中、Ｃｏｎｄは導電率、Ｐｆは供給液圧力、Ｐｐは透過液圧力、Ｐｒは保持液圧力、ＴＭＰは膜間差圧を示す。
(3) Replacement of NaCl solution with acetic acid buffer
Fill the sample storage tank with 250 mM NaCl, the water storage tank with purified water, and the buffer storage tank with 100 mM acetate buffer pH 3.5, and change the flow velocity from 20 ml / min to 100 ml / min. After confirming that the differential pressure (display) was stable after 60 seconds, data was acquired. The liquid volume was measured for 60 seconds after the pressure stability was confirmed.
The results are shown in Table 3. In Table 3, Cond indicates the conductivity, Pf indicates the supply liquid pressure, Pp indicates the permeate liquid pressure, Pr indicates the holding liquid pressure, and TMP indicates the intermembrane differential pressure.
第３表より、各流速で、圧損(膜間差圧参考値)、処理液量が比例関係であって、導電率、ｐＨは各流速でほぼ一定の値であることがわかった。このことはサンプル濃度が高い０．０２５Ｍ ＮａＣｌであっても安定したバッファー交換が行われていることを示している。 From Table 3, it was found that the pressure loss (reference value of the differential pressure between the membranes) and the amount of the treatment liquid were in a proportional relationship at each flow velocity, and the conductivity and pH were almost constant values at each flow velocity. This indicates that stable buffer exchange is performed even at a high sample concentration of 0.025 M NaCl.
［実施例５］
実施例２で製作したクロスフロー限外ろ過ユニットにおいて、抗体精製において使用される条件下でのバッファーの交換効率の変化の確認を行うために、（１）抗体精製において一般的に使用されるサンプル条件バッファーを用いた交換効率の確認および（２）抗体タンパク質を含む溶液のバッファー交換効率の確認を行った。
[Example 5]
In the cross-flow ultrafiltration unit produced in Example 2, in order to confirm the change in buffer exchange efficiency under the conditions used in antibody purification, (1) a sample generally used in antibody purification. The exchange efficiency using the conditioned buffer was confirmed, and (2) the buffer exchange efficiency of the solution containing the antibody protein was confirmed.
（１）抗体精製において一般的に使用されるサンプル条件バッファーを用いた交換効率の確認
サンプル貯留槽に０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）、水貯留槽に精製水、バッファー貯留槽に０．１Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ３．０を充填し、添加流速を１０〜１５０ｍＬ／ｍｉｎ、膜間差圧を大気開放（加圧なし）の条件で実験を行った。
実験方法は、１０ｍｌ／ｍｉｎから１２０ｍｌ／ｍｉｎまで流速を変化させた時の各センサー圧力計、膜間差圧(表示)が安定していることを６０秒経過時点において確認した後データを取得した。液量は、圧力安定確認後６０秒間の液量を測定した。結果を第４表に示した。第４表中、Ｃｏｎｄは導電率、Ｐｆは供給液圧力、Ｐｐは透過液圧力、Ｐｒは保持液圧力、ＴＭＰは膜間差圧、Ｐｅｒｍｅａｔｅは処理液を示す。
(1) Confirmation of exchange efficiency using a sample condition buffer generally used in antibody purification. 0.15 M NaCl-containing 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7) in a sample storage tank, purified water in a water storage tank, and a buffer storage tank. Was filled with 0.1 M Gly-HCl buffer and pH 3.0, and the experiment was conducted under the conditions that the addition flow rate was 10 to 150 mL / min and the intermembrane differential pressure was open to the atmosphere (no pressurization).
In the experimental method, data was acquired after confirming that each sensor pressure gauge and intermembrane differential pressure (display) were stable when the flow velocity was changed from 10 ml / min to 120 ml / min after 60 seconds had passed. .. The liquid volume was measured for 60 seconds after the pressure stability was confirmed. The results are shown in Table 4. In Table 4, Cond indicates conductivity, Pf indicates supply liquid pressure, Pp indicates permeate pressure, Pr indicates holding liquid pressure, TMP indicates intermembrane pressure, and Permeate indicates treatment liquid.
第４表によれば、各流速で、圧損、処理液量が比例関係であって電気伝導度（導電率）は流速を上げることで低下傾向にある。ｐＨは各流速でほぼ一定の値であることがわかった。このことは実際の抗体精製においてタンパク質を含まない状態で通常用いられているバッファーを用いた場合においても一定の安定したバッファー交換が可能であることが示された。 According to Table 4, the pressure loss and the amount of the treatment liquid are in a proportional relationship at each flow velocity, and the electric conductivity (conductivity) tends to decrease as the flow velocity is increased. It was found that the pH was almost constant at each flow velocity. This indicates that a certain stable buffer exchange is possible even when a buffer usually used in a protein-free state is used in actual antibody purification.
（２）抗体タンパク質を含む溶液のバッファー交換効率の確認
サンプル貯留槽に遺伝子組み換え精製モノクローナル抗体（ＩｇＧ）溶液、水貯留槽へ精製水、バッファー貯留槽に２０ｍＭリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．０）を充填し、添加流速 を１０〜１５０ｍＬ／ｍｉｎ、膜間差圧を大気開放（加圧なし）の条件で実験を行った。
実験方法は、サンプルの抗体溶液及び希釈液、交換用バッファーの流速を順次、２０、４０、７０、１００、１２０ ｍｌ／ｍｉｎと変化させ時の各センサー圧力計、膜間差圧 (表示)が安定していることを６０秒経過時点において確認した後データを取得した。液量は、圧力安定確認後６０秒間の液量を測定した。
結果を第５表に示した。第５表中、Ｃｏｎｄは導電率、Ｐｆは供給液圧力、Ｐｐは透過液圧力、Ｐｒは保持液圧力、ＴＭＰは膜間差圧、Ｐｅｒｍｅａｔｅは処理液を示す。
(2) Confirmation of buffer exchange efficiency of solution containing antibody protein Add recombinant purified monoclonal antibody (IgG) solution to sample storage tank, purified water to water storage tank, and 20 mM Na phosphate buffer (pH 7.0) to buffer storage tank. The experiment was carried out under the conditions of filling, the addition flow rate being 10 to 150 mL / min, and the intermembrane differential pressure being open to the atmosphere (no pressurization).
In the experimental method, the flow velocities of the sample antibody solution, diluent, and replacement buffer were sequentially changed to 20, 40, 70, 100, and 120 ml / min, and each sensor pressure gauge and intermembrane differential pressure (display) were displayed. After confirming that it was stable after 60 seconds, the data was acquired. The liquid volume was measured for 60 seconds after the pressure stability was confirmed.
The results are shown in Table 5. In Table 5, Cond indicates conductivity, Pf indicates supply liquid pressure, Pp indicates permeate pressure, Pr indicates holding liquid pressure, TMP indicates intermembrane pressure, and Permeate indicates treatment liquid.
第５表によれば、各流速で、圧損(膜間差圧参考値)、処理液量が比例関係であって、導電率、ｐＨは各流速でほぼ一定の値であることがわかった。このことから実際の抗体（タンパク質）を含む溶液を用いた場合においても安定して一定のバッファー交換が出来ていることが判明した。 According to Table 5, it was found that the pressure loss (intermembrane differential pressure reference value) and the amount of the treatment liquid were in a proportional relationship at each flow velocity, and the conductivity and pH were almost constant values at each flow velocity. From this, it was found that stable and constant buffer exchange was possible even when a solution containing an actual antibody (protein) was used.
［実施例６］
実施例２で製作したクロスフロー限外ろ過ユニットにおいて、高濃度（約６ｍｇ/ｍｌ）の抗体タンパク質を含む溶液のバッファー交換の確認を行った。
サンプル貯留槽にサンプル抗体溶液（遺伝子組換えモノクローナル抗体を０．１Ｍ酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．０）で濃度６．１ｍｇ／ｍｌになるように調整し、また導電率が７．４ｍＳ／ｃｍになるようにＮａＣｌを添加した溶液）を充填し、バッファー貯留槽には交換用バッファー（２０ｍＭ酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．０））を充填した。バッファーの交換は、膜間差圧（ＴＭＰ）０〜２．５ｐｓｉ、サンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速５〜１０ｍｌ／ｍｉｎの条件で実験を行った。
[Example 6]
In the cross-flow ultrafiltration unit produced in Example 2, buffer exchange of the solution containing a high concentration (about 6 mg / ml) of antibody protein was confirmed.
In the sample storage tank, adjust the sample antibody solution (genetical recombinant monoclonal antibody to a concentration of 6.1 mg / ml with 0.1 M Na acetate buffer (pH 4.0), and the conductivity becomes 7.4 mS / cm. (Sodium chloride-added solution) was filled, and the buffer storage tank was filled with a replacement buffer (20 mM Na acetate buffer (pH 4.0)). The buffer exchange was carried out under the conditions of an intermembrane differential pressure (TMP) of 0 to 2.5 psi and a flow rate of addition of the sample antibody solution and the exchange buffer of 5 to 10 ml / min.
実験では、膜間差圧（ＴＭＰ）を自動調節バルブで０〜２．５ｐｓｉの様々な値に設定した。また、サンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速を、ポンプの目盛設定により５、８、１０ｍｌ／ｍｉｎと変化させた。各々の条件で、圧力センサー、膜間差圧（ＴＭＰ）が安定していることを６０秒経過時点において確認した後、保持液の流量、透過液の流量を測定した。その後、保持液をサンプリングして、ｐＨ、導電率（Ｃｏｎｄ（ｍＳ／ｃｍ））、抗体濃度（ｍｇ／ｍｌ）を測定した。また、膜透過流束（ＬＭＨ：１時間あたり１ｍ２の膜を透過する溶液量（Ｌ））を算出した。結果を、図５と表６に示した。 In the experiment, the intermembrane differential pressure (TMP) was set to various values from 0 to 2.5 psi with an automatic adjustment valve. The addition flow rate of the sample antibody solution and the replacement buffer was changed to 5, 8, and 10 ml / min by setting the scale of the pump. After confirming that the pressure sensor and the intermembrane differential pressure (TMP) were stable under each condition after 60 seconds, the flow rate of the holding liquid and the flow rate of the permeated liquid were measured. Then, the holding liquid was sampled, and the pH, conductivity (Cond (mS / cm)), and antibody concentration (mg / ml) were measured. In addition, the membrane permeation flux (LMH: amount of solution (L) permeating 1 m 2 of membrane per hour) was calculated. The results are shown in FIGS. 5 and 6.
図５によれば、バッファー交換時の膜透過流束は、膜間差圧（ＴＭＰ）にほぼ比例して速くなっていたが（図５Ａ）、サンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速にはほとんど依存していなかった。また、保持液の流速は添加流速にほぼ比例して速くなっており、膜間差圧（ＴＭＰ）をあげると流速は低下していた（図５Ｂ）。 According to FIG. 5, the membrane permeation flux during buffer exchange increased in proportion to the intermembrane pressure (TMP) (FIG. 5A), but the addition flow rate of the sample antibody solution and the exchange buffer was increased. It was almost independent. In addition, the flow rate of the holding liquid increased in proportion to the addition flow rate, and the flow rate decreased when the intermembrane differential pressure (TMP) was increased (FIG. 5B).
サンプル抗体溶液をバッファー交換した後の保持液のｐＨ（図５Ｃ）、導電率（図５Ｄ）、の値を見ると、その組成が交換用バッファーの組成に近づいており、実際にバッファー交換ができていることが判明した。また、その交換の効率は、膜間差圧（ＴＭＰ）やサンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速にはほとんど依存していなかった。バッファー交換後の保持液の抗体濃度を見ると、膜間差圧（ＴＭＰ）やサンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速に依存して、保持液の抗体濃度は変わることが分かった（図５Ｅ）。また、条件によっては、交換前のサンプル抗体溶液とほとんど同じ抗体濃度の保持液が得られており、抗体濃度を変えずにバッファー交換することが可能であることが判明した。 Looking at the values of the pH (Fig. 5C) and conductivity (Fig. 5D) of the holding solution after exchanging the sample antibody solution with a buffer, the composition is close to the composition of the exchange buffer, and the buffer can be actually exchanged. It turned out that. Moreover, the efficiency of the exchange was hardly dependent on the intermembrane pressure (TMP) and the addition flow rate of the sample antibody solution and the exchange buffer. Looking at the antibody concentration of the holding solution after buffer exchange, it was found that the antibody concentration of the holding solution changed depending on the intermembrane differential pressure (TMP) and the addition flow rate of the sample antibody solution and the replacement buffer (Fig. 5E). ). Further, depending on the conditions, a holding solution having an antibody concentration almost the same as that of the sample antibody solution before the exchange was obtained, and it was found that the buffer can be exchanged without changing the antibody concentration.
［実施例７］
実施例２で製作した図２の装置のエジェクターの代わりにチェッツクバルブ（逆止弁）とＴ字コネクターの組み合わせを用いた他は、図２の装置と同一のクロスフロー限外ろ過ユニットにおいて、高濃度（約６ｍｇ/ｍｌ）の抗体タンパク質を含む溶液のバッファー交換の確認を行った。
[Example 7]
In the same cross-flow ultrafiltration unit as the device of FIG. 2, except that a combination of a check valve (check valve) and a T-shaped connector was used instead of the ejector of the device of FIG. 2 manufactured in the second embodiment. The buffer exchange of the solution containing the high concentration (about 6 mg / ml) of the antibody protein was confirmed.
サンプル貯留槽にサンプル抗体溶液（遺伝子組換えモノクローナル抗体を０．１Ｍ 酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．０）で濃度６ｍｇ/ｍｌになるように調整し、また導電率が８．２８ｍＳ/ｃｍになるようにＮａＣｌを添加した溶液）を充填し、バッファー貯留槽には交換用バッファー（２０ｍＭリン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．０））を充填した。バッファーの交換は、膜間差圧（ＴＭＰ）０〜２．５ｐｓｉ、サンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速５〜１０ｍｌ/ｍｉｎの条件で実験を行った。 Adjust the sample antibody solution (genetical recombinant monoclonal antibody to a concentration of 6 mg / ml with 0.1 M Na acetate buffer (pH 4.0)) in the sample storage tank, and adjust the conductivity to 8.28 mS / cm. A solution containing NaCl) was filled, and a replacement buffer (20 mM Na phosphate buffer (pH 7.0)) was filled in the buffer storage tank. The buffer exchange was carried out under the conditions of an intermembrane differential pressure (TMP) of 0 to 2.5 psi and a flow rate of addition of the sample antibody solution and the exchange buffer of 5 to 10 ml / min.
実験では、膜間差圧（ＴＭＰ）を自動調節バルブで０〜２．５ｐｓｉの様々な値に設定した。また、サンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速を、ポンプの目盛設定により５、８、１０ｍｌ/ｍｉｎと変化させた。各々の条件で、圧力センサー、膜間差圧（ＴＭＰ）が安定していることを６０秒経過時点において確認した後、保持液の流量、透過液の流量を測定した。その後、保持液をサンプリングして、ｐＨ、導電率（Ｃｏｎｄ (ｍＳ/ｃｍ）)、抗体濃度（ｍｇ/ｍｌ）を測定した。また、膜透過流束（ＬＭＨ：1時間あたり1ｍ2の膜を透過する溶液量（Ｌ））を算出した。結果を、図６と表７に示した。 In the experiment, the intermembrane differential pressure (TMP) was set to various values from 0 to 2.5 psi with an automatic adjustment valve. The addition flow rate of the sample antibody solution and the replacement buffer was changed to 5, 8, and 10 ml / min by setting the scale of the pump. After confirming that the pressure sensor and the intermembrane differential pressure (TMP) were stable under each condition after 60 seconds, the flow rate of the holding liquid and the flow rate of the permeated liquid were measured. Then, the holding liquid was sampled, and the pH, conductivity (Cond (mS / cm)), and antibody concentration (mg / ml) were measured. In addition, the membrane permeation flux (LMH: amount of solution (L) permeating 1 m 2 of membrane per hour) was calculated. The results are shown in FIGS. 6 and 7.
図６によれば、実施例６と同様、バッファー交換時の膜透過流束は、膜間差圧（ＴＭＰ）にほぼ比例して速くなっていたが（図６Ａ）、サンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速にはほとんど依存していなかった。また、保持液の流速は添加流速にほぼ比例して速くなっており、膜間差圧（ＴＭＰ）をあげると流速は低下していた（図６Ｂ）。
サンプル抗体溶液をバッファー交換した後の保持液のｐＨ（図６Ｃ）、導電率（図６Ｄ）の値を見ると、その組成が交換用バッファーの組成に近づいており、実際にバッファー交換ができていることが判明した。また、その交換の効率は、膜間差圧（ＴＭＰ）やサンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速にはほとんど依存していなかった。バッファー交換後の保持液の抗体濃度を見ると（図６Ｅ）、膜間差圧（ＴＭＰ）やサンプル抗体溶液および交換用バッファーの添加流速に依存して、保持液の抗体濃度は変わることが分かった。また、条件によっては、交換前のサンプル抗体溶液とほとんど同じ抗体濃度の保持液が得られており、抗体濃度を変えずにバッファー交換することが可能であることが判明した。
According to FIG. 6, as in Example 6, the membrane permeation flux during buffer replacement increased substantially in proportion to the intermembrane differential pressure (TMP) (FIG. 6A), but the sample antibody solution and replacement It was almost independent of the buffer addition flow rate. In addition, the flow rate of the holding liquid increased in proportion to the addition flow rate, and the flow rate decreased when the intermembrane differential pressure (TMP) was increased (FIG. 6B).
Looking at the pH (Fig. 6C) and conductivity (Fig. 6D) values of the holding solution after exchanging the sample antibody solution with a buffer, the composition is close to the composition of the exchange buffer, and the buffer can be actually exchanged. It turned out to be. Moreover, the efficiency of the exchange was hardly dependent on the intermembrane pressure (TMP) and the addition flow rate of the sample antibody solution and the exchange buffer. Looking at the antibody concentration of the holding solution after buffer exchange (Fig. 6E), it was found that the antibody concentration of the holding solution changes depending on the intermembrane differential pressure (TMP) and the addition flow rate of the sample antibody solution and the replacement buffer. It was. Further, depending on the conditions, a holding solution having an antibody concentration almost the same as that of the sample antibody solution before the exchange was obtained, and it was found that the buffer can be exchanged without changing the antibody concentration.
本発明によりタンパク質の連続製造に適し、メインテナンスフリーで、タンパク質を含む粗精製溶液の、濃縮およびバッファー交換に適したろ過ユニットが提供される。 The present invention provides a filtration unit suitable for continuous production of proteins, maintenance-free, and suitable for concentration and buffer exchange of crudely purified solutions containing proteins.
符号の説明
Ａ、Ｂ、Ｃ：限外ろ過膜を内包するモジュール
Ｄ：サージタンク
１ａ: タンパク質の粗精製液の入ったタンク
１ｂ：精製水又は注射用生理食塩水の入ったタンク
１ｃ：バッファーの入ったタンク
２ａ、２ｂ、２ｃ：ポンプ
３ａ、３ｂ、３ｃ：流量計
４ａ：バルブ
４ｂ、４ｃ：エジェクター
５ａ、５ｂ、５ｃ：圧力計
６ａ、６ｂ、６ｃ：一次側（未透過側）入口
７ａ、７ｂ、７ｃ：一次側（未透過側）出口
８ａ、８ｂ、８ｃ：二次側（透過側）出口
９ａ、９ｂ、９ｃ：圧力計
１０ａ、１０ｂ、１０ｃ：圧力計
１１ａ、１１ｂ：流量計
１２：Ｔ字型（三方）継手
１３：バルブ
１４：ｐＨメーター
１５：導電率計
１６：流量計
１７：サージタンク下方出入口
１８：サージタンク上方出入口（空気出入口）
１９：圧力調整用バルブ（ベントフィルター付き）
２１：濃縮用中空糸膜モジュール
２２：脱塩用中空糸膜モジュール
２３；バッファー交換用中空糸膜モジュール
２４：多連ヘッドポンプ
２５、２６：エジェクター
２７：サンプル貯留槽
２８：水貯留槽
２９：バッファー貯留槽
３０：サージタンク
Description of Code A, B, C: Module containing an ultrafiltration membrane D:
19: Pressure adjustment valve (with vent filter)
21: Hollow fiber membrane module for concentration 22: Hollow fiber membrane module for desalting 23; Hollow fiber membrane module for buffer replacement 24: Multiple head pumps 25, 26: Ejector 27: Sample storage tank 28: Water storage tank 29: Buffer Storage tank 30: Surge tank
Claims (12)
サージタンクを備え、複数の限外ろ過膜を内包するモジュールが連結されているクロスフロー限外ろ過ユニットを用いて、少なくとも濃縮またはバッファー交換のいずれか一方を行う工程を有することを特徴とする方法。 In the method for purifying a protein from a cell culture medium, a crude protein purification solution is used.
A method comprising a surge tank and having a step of performing at least either concentration or buffer exchange using a cross-flow ultrafiltration unit in which a module containing a plurality of ultrafiltration membranes is connected. ..
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