JP2021069432A - Graft material and stent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、移植材料及びステントに関する。 The present invention relates to implantable materials and stents.
高齢化や適応疾患の拡大等により、人工透析患者は急速に増加している。透析医療によりこれらの患者を救命することは可能であるが、人工透析では全ての腎機能を代償できないため、患者の心血管疾患が増加し、致死率が上昇してしまう傾向にある。また、透析患者の時間的負担や精神的負担は非常に大きく、社会復帰が困難な場合も多い。 The number of dialysis patients is increasing rapidly due to the aging of the population and the expansion of indications. Although it is possible to save the lives of these patients by dialysis treatment, since dialysis cannot compensate for all renal functions, the cardiovascular disease of the patients tends to increase and the case fatality rate tends to increase. In addition, the time and mental burden on dialysis patients is extremely large, and it is often difficult to reintegrate into society.
また、腎臓移植を必要とする末期腎不全の患者は世界に約２百万人存在しており、ドナー臓器の不足から、その数は更に増加する傾向にある。したがって、末期腎不全は医療上の重大な問題である。 In addition, there are about 2 million patients with end-stage renal disease requiring kidney transplantation worldwide, and the number tends to increase further due to the shortage of donor organs. Therefore, end-stage renal disease is a serious medical problem.
このような背景のもと、発明者らは、腎機能を長期間持続することができる移植材料を開発してきた（特許文献１参照。）。 Against this background, the inventors have developed a transplant material capable of sustaining renal function for a long period of time (see Patent Document 1).
新しく再生した腎臓を移植の際、患者が元来有する腎臓を温存し、尿路を結合させると、生成された尿が、再生した腎臓に逆流し、水腎症を誘発する。そのため、患者から腎臓を摘出する必要があり、開発した移植材料の実用化にあたり、更なる改良が必要であった。 When a newly regenerated kidney is transplanted, the patient's original kidney is preserved and the urinary tract is bound, and the generated urine flows back into the regenerated kidney, inducing hydronephrosis. Therefore, it was necessary to remove the kidney from the patient, and further improvement was required for the practical application of the developed transplant material.
そこで、本発明は、患者が元来有する腎臓を温存していても腎機能を長期間持続することができる移植材料、及びこれに用いられるステントを提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a transplant material capable of sustaining renal function for a long period of time even if the patient's original kidney is preserved, and a stent used therefor.
本発明は、以下の態様を含む。
［１］腎臓原基と、前記腎臓原基に結合した膀胱と、末広がり形状に変形可能なステントと、を備える移植材料であって、前記膀胱は、その内部に挿入された後、末広がり形状に膨張した前記ステントに保持され、ホストの尿管と接する面が拡張された状態で接続されるように移植するために用いられる移植材料。
［２］前記腎臓原基及び前記膀胱は、それぞれ独立して、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞からなるか、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞に置換され得る遺伝子改変非ヒト動物由来である、［１］に記載の移植材料。
［３］前記膀胱と前記尿管の接合は、端側吻合である、［１］又は［２］に記載の移植材料。
［４］前記前記遺伝子改変非ヒト動物は、コンディショナルに、少なくとも前記腎臓原基及び／又は前記膀胱の少なくとも一部を除去するシステムを備えた、［２］又は［３］に記載の移植材料。
［５］前記ホストがヒトである、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の移植材料。
［６］前記ホストがネコである、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の移植材料。
［７］前記非ヒト動物がブタである、［２］〜［６］のいずれか一つに記載の移植材料。
［８］前記非ヒト動物がマウスである、［２］〜［６］のいずれか一つに記載の移植材料。
［９］［１］〜［８］のいずれか一つに記載の移植材料をホストへ移植するために用いられる、末広がり形状に変形可能なステント。
The present invention includes the following aspects.
[1] A transplant material comprising a kidney primordium, a bladder bound to the kidney primordium, and a stent that can be deformed into a divergent shape. A transplant material held by the inflated stent and used for transplanting so that the surface in contact with the host's ureter is connected in an expanded state.
[2] The kidney primordium and the bladder are independently composed of substantially autologous or allogeneic cells with respect to host cells, or substantially autologous or allogeneic with respect to host cells. The transplant material according to [1], which is derived from a genetically modified non-human animal that can be replaced with home cells.
[3] The transplant material according to [1] or [2], wherein the joint between the bladder and the ureter is an end-side anastomosis.
[4] The transplant material according to [2] or [3], wherein the genetically modified non-human animal is conditionally provided with a system for removing at least the renal primordium and / or at least a part of the bladder. ..
[5] The transplant material according to any one of [1] to [4], wherein the host is a human.
[6] The transplant material according to any one of [1] to [4], wherein the host is a cat.
[7] The transplant material according to any one of [2] to [6], wherein the non-human animal is a pig.
[8] The transplant material according to any one of [2] to [6], wherein the non-human animal is a mouse.
[9] A stent that can be deformed into a divergent shape and is used for transplanting the transplant material according to any one of [1] to [8] to a host.
本発明によれば、患者が元来有する腎臓を温存していても腎機能を長期間持続することができる移植材料、及びこれに用いられるステントを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a transplant material capable of sustaining renal function for a long period of time even while preserving the kidney originally possessed by the patient, and a stent used therefor.
本発明は、１実施形態において、腎臓原基と、前記腎臓原基に結合した膀胱と、末広がり形状に変形可能なステントと、を備える移植材料であって、前記膀胱は、その内部に挿入された後、末広がり形状に膨張した前記ステントに保持され、ホストの尿管と接する面が拡張された状態で接続されるように移植するために用いられる移植材料を提供する。 The present invention is, in one embodiment, a transplant material comprising a kidney primordium, a bladder bound to the kidney primordium, and a stent that can be deformed into a divergent shape, wherein the bladder is inserted therein. After that, a transplant material is provided which is held by the stent which is expanded in a divergent shape and is used for transplanting so that the surface in contact with the ureter of the host is connected in an expanded state.
≪腎臓原基≫
図１に示すように、腎臓原基１１０とは、胎仔期の腎臓をいい、哺乳類では、後腎にあたる。解剖学用語で、鳥類等、直腸、生殖器、尿路系が１つの排泄口を兼ねているものを総排泄口という。発明者らは、この胎仔期の膀胱−尿管−後腎組織をクロアカグラフトと名付けた。腎臓原基を動物の腹腔内に移植すると、ホストからクロアカに血管が侵入し、発育が継続し、尿を生産する。
≪Kidney primordium≫
As shown in FIG. 1, the
本実施形態の移植材料において、腎臓原基及び膀胱は、それぞれ独立して、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞からなるか、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞に置換され得る遺伝子改変非ヒト動物由来であることが好ましい。 In the transplant material of the present embodiment, the kidney primordium and the bladder are independently composed of substantially autologous or allogeneic cells to the host cells or substantially autologous to the host cells. Alternatively, it is preferably derived from a genetically modified non-human animal that can be replaced by allogeneic cells.
本実施形態の移植材料が移植されるホストとしては、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ（特に競馬ウマ）、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。 Hosts to which the transplant material of the present embodiment is transplanted include humans, monkeys, cows, sheep, pigs, goats, horses (particularly horse racing horses), dogs, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice and the like. ..
≪ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞からなる腎臓原基≫
ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞からなる腎臓原基の製造方法としては、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を、ドナーの腎臓発生部位に注入することにより、胎仔内で腎臓系譜に分化誘導する方法が挙げられる。
≪Kidney primordium consisting of substantially autologous or allogeneic cells relative to host cells≫
As a method for producing a renal primordia consisting of substantially autologous or allogeneic cells with respect to host cells, mesenchymal stem cells or renal stem cells are injected into the donor's renal development site in the fetus. A method of inducing differentiation into the renal lineage can be mentioned.
注入細胞としては、哺乳動物由来の間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞由来の腎臓幹細胞等が挙げられる。 Examples of the injected cells include mammalian-derived mesenchymal stem cells, pluripotent stem cell-derived kidney stem cells such as iPS cells, and the like.
間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞は、移植対象のホスト由来の間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞であることが好ましい。
腎臓幹細胞としては、例えば、ホスト由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）や、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導した腎臓幹細胞等が挙げられる。腎臓幹細胞は、患者又は患畜由来の細胞であってもよく、患者又は患畜における拒絶反応が抑制された他家の細胞であってもよい。
The mesenchymal stem cells or kidney stem cells are preferably mesenchymal stem cells or kidney stem cells derived from the host to be transplanted.
Examples of the kidney stem cells include host-derived mesenchymal stem cells (MSCs), kidney stem cells induced to differentiate from pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells, and the like. Kidney stem cells may be cells derived from the patient or the patient, or may be allogeneic cells in which rejection in the patient or the patient is suppressed.
腎臓幹細胞は、製造後の腎臓を移植する対象である患者又は患畜由来の細胞であることが好ましい。例えば、骨髄、脂肪組織、流血中又は臍帯血から分取された間葉系幹細胞等から分化誘導した腎臓幹細胞が挙げられる。分取法は、一般的な外科的医学手法によればよい。分取された細胞は、最適条件を選択し、好適には培養を２〜５細胞継代行う。また、間葉系幹細胞の形質転換を抑制しながら培養を継続する目的でＣａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製のヒト間葉系幹細胞専用培地キット等を用いて培養してもよい。 The kidney stem cells are preferably cells derived from the patient or patient to which the kidney after production is transplanted. Examples thereof include kidney stem cells that have been induced to differentiate from mesenchymal stem cells that have been separated from bone marrow, adipose tissue, blood or umbilical cord blood. The preparative method may be a general surgical medical method. Optimal conditions are selected for the separated cells, and the cells are preferably cultured by subculturing 2 to 5 cells. Further, for the purpose of continuing the culture while suppressing the transformation of the mesenchymal stem cells, the culture may be carried out using a medium kit for human mesenchymal stem cells manufactured by Cambrex BioScience.
間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞には、所望により、アデノウイルス又はレトロウイルス等を用いて所望の遺伝子を導入してもよい。例えば、腎臓形成を補助する目的でグリア細胞由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ−ＧＤＮＦ）を発現するように遺伝子導入させてもよい。これは、腎臓が形成される直前の間葉組織はＧＤＮＦを発現するようになり、その受容体であるｃ−ｒｅｔを発現する尿管芽を引き込むことで腎臓発生の最初の重要なステップを完了させるからである。発明者らは、この形質転換により、注入幹細胞由来腎臓の形成率を５．０±４．２％から２９．８±９．２％に上昇させることを確認している。 If desired, a desired gene may be introduced into mesenchymal stem cells or kidney stem cells using adenovirus, retrovirus, or the like. For example, a gene may be introduced to express a glial cellline-developed neurotrophic factor-GDNF for the purpose of assisting kidney formation. This is because the mesenchymal tissue just before kidney formation becomes GDNF-expressing and completes the first important step of kidney development by attracting ureteral buds expressing its receptor, c-ret. Because it makes you. The inventors have confirmed that this transformation increases the formation rate of injected stem cell-derived kidneys from 5.0 ± 4.2% to 29.8 ± 9.2%.
間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を移植する対象としては、妊娠哺乳動物宿主中の胚若しくは胎仔、又は、妊娠哺乳動物の宿主から分離した胚若しくは胎仔が挙げられる。間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞をこれらの対象に注入することにより、子宮内で腎臓を形成させることができる。
宿主（ドナー）としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等の有蹄動物；ハムスター、モルモット、ラット、マウス等のげっ歯類が挙げられる。
Targets for transplanting mesenchymal stem cells or kidney stem cells include embryos or fetuses in a pregnant mammalian host, or embryos or fetuses isolated from a pregnant mammalian host. By injecting mesenchymal stem cells or kidney stem cells into these subjects, kidneys can be formed in utero.
Examples of the host (donor) include ungulates such as cows, sheep, pigs, goats, and horses; rodents such as hamsters, guinea pigs, rats, and mice.
移植の方法としては、例えば、注射針等を用いて、腎臓幹細胞を注入すればよい。ホストがヒトの場合、移植するヒト腎臓幹細胞の数は例えば１×１０３〜１×１０６個程度が好ましい。
また、ブタなどの大型の妊娠哺乳動物の生体内の胚に、経子宮アプローチによって、直接間葉幹細胞を移植し、そのまま生体内で成長を続けさせ、移植用腎臓へと成長させることもできる。また、以下に示す「全胚培養」又は「器官培養」の工程を追加してもよい。
As a method of transplantation, for example, kidney stem cells may be injected using an injection needle or the like. When the host is a human, the number of human kidney stem cells to be transplanted is preferably, for example, about 1 × 10 3 to 1 × 10 6.
It is also possible to directly transplant mesenchymal stem cells into an embryo in a large pregnant mammal such as a pig by a transuterine approach, and continue the growth in the living body as it is to grow into a kidney for transplantation. In addition, the following steps of "whole embryo culture" or "organ culture" may be added.
調製された間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞は、妊娠哺乳動物宿主（子宮）から分離した胎仔に移植し、その後、全胚培養を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで移植用腎臓形成の初期段階を完了するまで胎仔の体内で成熟させ、その後器官培養で更に培養してもよい。また、移植用腎臓を、ヒトを含む哺乳類の大網等に移植してもよい。 The prepared mesenchymal stem cells or kidney stem cells are transplanted into a fetus isolated from a pregnant mammalian host (uterine), and then embryos are used in vitro until the initial stage of kidney formation for transplantation is completed. It may be matured in the body and then further cultured in organ culture. In addition, the kidney for transplantation may be transplanted into the omentum of mammals including humans.
調製された間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞の胎仔への移植の時期は、適宜調整することができる。ラットを使った実験では、胎生９〜１２日、例えば１０〜１２日、例えば１０〜１１．５日が好適であった。大型の哺乳動物のブタ等でも、同様のステージ胚が好適に利用できる。また、条件を選定することによって、上記の前後のステージの胚も使用可能である。重要なことは、少なくとも移植時期には、宿主の免疫系が未だ免疫寛容の段階であることである。 The timing of transplantation of the prepared mesenchymal stem cells or renal stem cells into the fetus can be appropriately adjusted. In experiments with rats, 9-12 days of fetal life, eg 10-12 days, eg 10-11.5 days were preferred. Similar stage embryos can be preferably used for large mammalian pigs and the like. In addition, by selecting the conditions, embryos in the stages before and after the above can also be used. Importantly, the host's immune system is still in the stage of immune tolerance, at least at the time of transplantation.
宿主免疫系は全胚培養のこの段階では十分には成長していない。したがって、異種細胞に対して寛容性を有する。免疫無防備の異種宿主の内在的な成長系を用いて自己間葉系幹細胞から自己器官を生成する。 The host immune system is not fully developed at this stage of whole embryo culture. Therefore, it is tolerant of heterologous cells. The endogenous growth system of an immune-protected heterologous host is used to generate autologous organs from autologous mesenchymal stem cells.
間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞の胎仔への移植の部位を腎臓発生相当部位とすることにより、移植用臓器を好適に作製することができる。そのため、移植は、腎臓発生相当部位であることが確定できる時期に行うことが必要となるが、腎臓の芽細胞が発達開始する前の萌芽状態であることが好ましい。例えば、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を後腎形成間葉に移植することにより、メサンジウム細胞、尿細管上皮細胞、糸球体上皮細胞に分化させることができ、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を中間中胚葉に移植することにより、尿管芽由来の集合管及び尿管に分化させることができる。 By setting the site for transplantation of mesenchymal stem cells or kidney stem cells into the fetus as a site corresponding to kidney development, an organ for transplantation can be suitably prepared. Therefore, it is necessary to perform the transplantation at a time when it can be confirmed that the site corresponds to the development of the kidney, but it is preferable that the transplantation is in a germinated state before the bud cells of the kidney start to develop. For example, by transplanting mesenchymal stem cells or kidney stem cells into posterior nephrogenic mesenchymal cells, it is possible to differentiate into mesandium cells, ureteral epithelial cells, and glomerular epithelial cells, and mesenchymal stem cells or kidney stem cells are intermediate. By transplanting into embryos, it can be differentiated into ureteral bud-derived collecting tubes and ureters.
本発明において、全胚培養は、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を妊娠哺乳動物宿主（子宮）から分離した胎仔に移植する場合に行う。子宮を母体から分離し、そこから胎仔を子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離したものを取り出して得た胎児に間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を移植し、これを培養瓶内等で培養することにより、全胚培養を行うことができる。 In the present invention, whole embryo culture is performed when mesenchymal stem cells or renal stem cells are transplanted into a fetus isolated from a pregnant mammalian host (uterus). The uterus is separated from the mother's body, and the fetus is separated from the outer membrane layer including the uterine wall, decidua, and Reichert's membrane. Whole embryo culture can be performed by culturing in-house or the like.
より具体的には、例えば、実体顕微鏡等を用いて、子宮を麻酔下母体より摘出する。胎生９〜１２日、例えば１０〜１２日、例えば１０〜１１．５日、例えば１１．５日のラット胚を、子宮壁、脱落膜、ライヘルト膜を含む外膜層から切り離す。更に、間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を注入できるように卵黄嚢及び羊膜を開くが、絨毛膜尿膜胎盤はそのままの形で残す。間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞の注入の成功が確認できた胚を、遠心分離したラット血清に培養培地（ブドウ糖、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、及びアンフォテリシンＢ）３ｍＬを添加した培養瓶内等で培養する。 More specifically, the uterus is removed from the mother's body under anesthesia using, for example, a stereomicroscope. Rat embryos 9-12 days, eg 10-12 days, eg 10-11.5 days, eg 11.5 days of embryo are separated from the adventitial layer, including the uterine wall, decidua, and Reichert's membrane. In addition, the yolk sac and amniotic membrane are opened for injection of mesenchymal or renal stem cells, leaving the chorionic allantois placenta intact. Embryos for which successful injection of mesenchymal stem cells or kidney stem cells has been confirmed are cultured in a culture bottle or the like in which 3 mL of a culture medium (dextrose, penicillin G, streptomycin, and amphotericin B) is added to the centrifuged rat serum.
培養瓶は、例えば、インキュベーター（型番「ＲＫＩ１０−０３１０」、Ｉｋｅｍｏｔｏ社）等を用いて回転させる。培養時間は、例えば、１２時間〜６０時間、例えば２４時間〜４８時間、例えば４８時間であってもよい。一定培養時間後に、形態的・機能的に評価し、移植用腎臓の器官原器を確認する。器官原器を胎仔より分離し、以下の器官培養を行ってもよい。 The culture bottle is rotated using, for example, an incubator (model number "RKI10-0310", Ikemoto) or the like. The culturing time may be, for example, 12 hours to 60 hours, for example 24 hours to 48 hours, for example 48 hours. After a certain culture time, evaluate morphologically and functionally to confirm the organ prototype of the kidney for transplantation. The organ prototype may be separated from the fetus and the following organ culture may be performed.
本発明において、器官培養は、以下の通りである。先ず、上記器官原器をフィルター上に置き、その下の培養皿にＤＭＥＭ等の培地を加える。そして、該培養皿を５％ＣＯ２インキュベーター中で培養する。培養時間は、例えば１２時間〜１６８時間、例えば１８時間〜７２時間、例えば２４時間〜４８時間、例えば２４時間であってもよい。例えば、約２４時間の時点で大網に移植してもよい。培養温度は、例えば２０〜４５℃、例えば２５〜４０℃、例えば３７℃であってもよい。 In the present invention, the organ culture is as follows. First, the organ prototype is placed on a filter, and a medium such as DMEM is added to the culture dish under the filter. Then, the culture dish is cultured in a 5% CO 2 incubator. The culturing time may be, for example, 12 hours to 168 hours, for example, 18 hours to 72 hours, for example, 24 hours to 48 hours, for example, 24 hours. For example, it may be transplanted to the omentum at about 24 hours. The culture temperature may be, for example, 20 to 45 ° C, for example 25 to 40 ° C, for example 37 ° C.
本発明において、リレー培養とは、上記全胚培養を２時間〜６０時間行い、その後上記器官培養を１２時間〜１６８時間行うことをいう。更に、器官培養後にホストの大網等に移植してもよい。 In the present invention, the relay culture means that the whole embryo culture is carried out for 2 hours to 60 hours, and then the organ culture is carried out for 12 hours to 168 hours. Further, after organ culture, it may be transplanted to a host omentum or the like.
器官の大きさは、宿主動物が本来有する器官に相同することが好ましい。したがって、例えばヒトにおいて十分な機能を発揮させうる腎臓を形成するためには、宿主がヒトの臓器と近似の大きさを有する哺乳動物であることが好ましい。ただし、全く相同の大きさを持つ必要はなく、腎臓であれば全体の１０分の１の機能があれば十分透析を行うことができ、十分生命を維持できる。この理由から、最適な宿主はブタであり、ミニチュアブタの臓器の大きさで十分と判断される。なお、ブタの場合は上記の全胚培養が困難であるため、子宮内操作により胎仔の腎臓発生部位に間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を注入して移植用臓器を作製する。 The size of the organ is preferably homologous to the organ inherent in the host animal. Therefore, for example, in order to form a kidney capable of exerting a sufficient function in humans, it is preferable that the host is a mammal having a size close to that of a human organ. However, it is not necessary to have the same size at all, and if the kidney has one tenth of the function of the whole, sufficient dialysis can be performed and the life can be sufficiently maintained. For this reason, the optimal host is the pig, and the size of the organ of the miniature pig is judged to be sufficient. In the case of pigs, the above-mentioned whole embryo culture is difficult, so mesenchymal stem cells or kidney stem cells are injected into the renal development site of the fetus by an endometrial operation to prepare an organ for transplantation.
以上のようにして作製した腎臓原基は、機能確認がされた後、宿主から切り離され、ホストに供与される。移植後の移植用臓器は、生体内成長を継続し、腎臓機能を発揮するクローン腎臓の形成が完成する。
この腎臓原基をドナーから摘出する時期としては血管迷入期直前が好ましい。
The renal primordium produced as described above is separated from the host and donated to the host after the function is confirmed. After transplantation, the organ for transplantation continues to grow in vivo, and the formation of a cloned kidney that exerts renal function is completed.
The time to remove this renal primordium from the donor is preferably immediately before the vascular invasion period.
次いで、摘出した腎臓原基をホストの腹腔内に移植する。移植箇所としては、腹腔内であれば限定されず、大網、傍大動脈等が挙げられる。大網とは、胃の下側から下方へエプロンの様に垂れ下がった腹膜である。 The excised renal primordium is then transplanted into the abdominal cavity of the host. The transplantation site is not limited to the abdominal cavity, and examples thereof include a omentum and a para-aorta. The greater omentum is the peritoneum that hangs down like an apron from the underside of the stomach.
例えば、ヒトを含む哺乳類の大網や傍大動脈等への腎臓原基の移植は、通常の外科的処方等により行うことができる。例えば、鋭利な鑷子で移植する腎臓原基をつまみ、鑷子の先で大網の脂肪組織の表面にわずかに切り口を作りその中に組織を埋め込む方法等が挙げられる。また、内視鏡を利用して大網や傍大動脈等に移植することもできる。 For example, transplantation of renal primordium into the omentum, para-aorta, etc. of mammals including humans can be performed by a usual surgical prescription or the like. For example, a method of pinching the kidney primordium to be transplanted with a sharp tweezers, making a slight cut on the surface of the adipose tissue of the omentum with the tip of the tweezers, and embedding the tissue in the cut can be mentioned. It can also be transplanted into the omentum, para-aorta, etc. using an endoscope.
形成された腎臓内には間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞由来の細胞と宿主動物由来の細胞が混在する。混在した宿主由来細胞は腎臓をホストに移植した際に、免疫拒絶反応を引き起こす可能性がある。そこで、腎臓形成後、宿主由来細胞を徹底的に取り除く必要がある。 Mesenchymal stem cells or cells derived from kidney stem cells and cells derived from the host animal coexist in the formed kidney. Mixed host-derived cells can cause immune rejection when the kidney is transplanted into the host. Therefore, it is necessary to thoroughly remove host-derived cells after kidney formation.
形成された腎臓に、宿主由来の抗原性物質が混入しないようにするためには、例えば、調節的にプログラム細胞死を誘導可能な宿主動物を作製し、この動物を宿主として腎臓を作製する方法等が挙げられる。この宿主動物胚の当該部位に間葉系幹細胞又は腎臓幹細胞を移植し、腎臓を作製した後、宿主細胞特異的に細胞死を誘導することにより、ホストに移植する前段階で宿主由来細胞を完全に取り除くことができる。 In order to prevent host-derived antigenic substances from being mixed into the formed kidney, for example, a method of preparing a host animal capable of inducing programmed cell death in a regulated manner and preparing a kidney using this animal as a host. And so on. Mesenchymal stem cells or kidney stem cells are transplanted to the site of the host animal embryo to prepare a kidney, and then cell death is induced in a host cell-specific manner to complete the host-derived cells before transplantation to the host. Can be removed.
例えば、患者本人の細胞から作製したｉＰＳ細胞等を分化させて間葉系幹細胞や腎臓幹細胞を調製し、上記の方法に適用することにより、患者本人の細胞に由来する再生腎臓を作製することができる。 For example, iPS cells prepared from the patient's own cells can be differentiated to prepare mesenchymal stem cells and kidney stem cells, and the above method can be applied to prepare regenerated kidneys derived from the patient's own cells. it can.
≪ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞に置換され得る遺伝子改変非ヒト動物由来の腎臓原基≫
腎臓原基の製造工程において、胎仔の腎臓発生部位での移植細胞の定着率を改善するために、宿主（ドナー）として、遺伝子改変非ヒト動物を用いることが好ましい。係る遺伝子改変非ヒト動物は、上述した調節的にプログラム細胞死を誘導可能な宿主動物等、コンディショナルに、少なくとも腎原基及び／又は膀胱の少なくとも一部を除去するシステムを備えていることが好ましい。
≪Genetically modified non-human animal-derived kidney primordium that can be substantially replaced by autologous or allogeneic cells with respect to host cells≫
In the process of producing a kidney primordium, it is preferable to use a genetically modified non-human animal as a host (donor) in order to improve the colonization rate of transplanted cells at the fetal kidney development site. Such genetically modified non-human animals may conditionally be equipped with a system that removes at least a part of the renal primordium and / or bladder, such as the above-mentioned host animal capable of inducing programmed cell death in a regulated manner. preferable.
係るシステムとしては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素受容体（ｄｉｐｈｔｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＤＴＲ）を発現するｉＤＴＲ非ヒト動物と、Ｓｉｘ２のプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を導入したＳｉｘ２−Ｃｒｅ非ヒト動物とを交配し、得られた子孫の後腎組織にジフテリア毒素を接触させるシステムが挙げられる。 Such a system includes, for example, an iDTR non-human animal expressing a diphtheria toxin receptor (DTR) in a Cre recombinase activity-dependent manner, and a Six2-Cre non-human having a Cre recombinase gene introduced downstream of the Six2 promoter. Examples include a system in which diphtheria toxin is brought into contact with the posterior renal tissue of the resulting offspring by mating with an animal.
ｉＤＴＲ非ヒト動物は、ジフテリア毒素受容体をコードする遺伝子の上流に２つのｌｏｘＰ配列で挟まれた転写停止配列を有している。このため、そのままではジフテリア毒素受容体を発現しない。しかしながら、Ｃｒｅリコンビナーゼにより、２つのｌｏｘＰ配列で挟まれた転写停止配列が除去されると、ジフテリア毒素受容体を発現するようになる。 iDTR non-human animals have a transcription arrest sequence sandwiched between two loxP sequences upstream of the gene encoding the diphtheria toxin receptor. Therefore, it does not express the diphtheria toxin receptor as it is. However, when the transcription arrest sequence sandwiched between the two loxP sequences is removed by Cre recombinase, the diphtheria toxin receptor is expressed.
例えばマウス等の非ヒト動物はジフテリア毒素受容体を有しないため、本来、ジフテリア毒素をマウス等の細胞に接触させても細胞が死滅することはない。しかしながら、ジフテリア毒素受容体を発現させたマウス等の細胞にジフテリア毒素を接触させると死滅することが知られている。上記の例ではこの現象を利用している。 For example, since a non-human animal such as a mouse does not have a diphtheria toxin receptor, the cell does not die even if the diphtheria toxin is brought into contact with a cell such as a mouse. However, it is known that when cells such as mice expressing the diphtheria toxin receptor are brought into contact with diphtheria toxin, they die. This phenomenon is used in the above example.
まず、ｉＤＴＲ非ヒト動物と後腎間葉特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＳｉｘ２−Ｃｒｅ非ヒト動物とを交配すると、得られた子孫の中に後腎組織で組織特異的にジフテリア毒素受容体を発現する非ヒト動物が出現する。なお、Ｓｉｘ２は、後腎間葉で特異的に発現する転写因子である。 First, when an iDTR non-human animal and a Six2-Cre non-human animal expressing Cre recombinase specifically in the posterior mesenchyme are crossed, a diphtheria toxin receptor is tissue-specifically produced in the posterior renal tissue in the obtained progeny. A non-human animal that expresses appears. Six2 is a transcription factor specifically expressed in the posterior renal mesenchyme.
続いて、上記の非ヒト動物の後腎にジフテリア毒素を接触させると、後腎間葉特異的に細胞を死滅させ、後腎間葉の腎臓幹細胞を特異的に除去することができる。すなわち、腎発生ニッチを空けることができる。ここで、腎発生ニッチとは、尿管芽及び後腎間葉を含む腎発生領域をいう。 Subsequently, when the posterior kidney of the non-human animal is brought into contact with the diphtheria toxin, the cells can be specifically killed in the posterior mesenchyme and the renal stem cells in the posterior mesenchyme can be specifically removed. That is, the renal development niche can be opened. Here, the renal development niche refers to a renal development region including a ureteral bud and a posterior renal mesenchyme.
ジフテリア毒素の接触は、非ヒト動物の胎仔にジフテリア毒素を注射すること等により行ってもよい。あるいは、非ヒト動物の胎仔から後腎を摘出し、摘出した後腎を器官培養し、その培地中にジフテリア毒素を添加すること等により行ってもよい。あるいは、摘出した後腎を患者又は患畜の傍大動脈領域や体網に移植し、患者又は患畜の体内において、ジフテリア毒素を局所投与すること等により行ってもよい。 Contact with diphtheria toxin may be performed by injecting diphtheria toxin into the fetus of a non-human animal. Alternatively, the posterior kidney may be removed from the fetus of a non-human animal, the removed kidney may be organ-cultured, and diphtheria toxin may be added to the medium. Alternatively, the excised kidney may be transplanted into the para-aortic region or body network of the patient or the patient, and diphtheria toxin may be locally administered in the body of the patient or the patient.
上述した例において、尿管芽特異的プロモーターの下流にＣｒｅ−ＥＲタンパク質をコードする遺伝子を更に導入した非ヒト動物を用いる場合には、尿管芽を特異的に除去することができる。
ここで、尿管芽特異的プロモーターとしては、サイトケラチン８のプロモーター、ＨｏｘＢ７のプロモーター等が挙げられる。
In the above-mentioned example, when a non-human animal in which a gene encoding the Cre-ER protein is further introduced downstream of the ureteral bud-specific promoter is used, the ureteral bud can be specifically removed.
Here, examples of the ureteral bud-specific promoter include a promoter of
このようなマウスとしては、例えば、Ｓｉｘ２−Ｃｒｅｔｇ／ｗｔサイトケラチン８−Ｃｒｅ−ＥＲｔｇ／ｗｔの遺伝子型を有するｉＤＴＲ非ヒト動物、Ｓｉｘ２−Ｃｒｅｔｇ／ｗｔＨｏｘＢ７−Ｃｒｅ−ＥＲｔｇ／ｗｔの遺伝子型を有するｉＤＴＲ非ヒト動物が挙げられる。ここで、「ｔｇ」はトランスジェニックであることを表し、「ｗｔ」は野生型であることを表す。 Such mice include, for example, iDTR non-human animals having the genotype of Six2-Cretg / wt cytokeratin 8-Cre-ER tg / wt , Six2-Cretg / wt HoxB7-Cre-ER tg / wt . Included are iDTR non-human animals with genotype. Here, "tg" indicates that it is transgenic, and "wt" indicates that it is a wild type.
Ｃｒｅ−ＥＲタンパク質とは、Ｃｒｅリコンビナーゼと変異エストロゲン受容体の融合タンパク質である。上記非ヒト動物は尿管芽のマーカーであるサイトケラチン８又はＨｏｘＢ７のプロモーター依存的にＣｒｅ−ＥＲを発現する。
The Cre-ER protein is a fusion protein of Cre recombinase and mutant estrogen receptor. The non-human animals express Cre-ER in a promoter-dependent manner of
Ｃｒｅ−ＥＲタンパク質は通常細胞質に存在するが、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンと結合することにより核内に移行し、ｌｏｘＰ配列に対して組換えを起こす。これを利用してＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムの働く時期をタモキシフェン依存的に調節することが可能である。したがって、Ｃｒｅ−ＥＲ及びＣｒｅが同時に発現していても、タモキシフェンを投与するか否かにより、Ｃｒｅ−ＥＲの活性発現を制御することができる。ここで、Ｃｒｅ−ＥＲの代わりに、Ｃｒｅ−ＥＲの改変体である、Ｃｒｅ−ＥＲＴ、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２等を用いてもよい。 The Cre-ER protein is normally present in the cytoplasm, but when it binds to the estrogen derivative tamoxifen, it translocates into the nucleus and undergoes recombination with respect to the loxP sequence. Utilizing this, it is possible to adjust the working time of the Cre-loxP system in a tamoxifen-dependent manner. Therefore, even if Cre-ER and Cre are expressed at the same time, the expression of Cre-ER activity can be controlled by whether or not tamoxifen is administered. Here, instead of Cre-ER, Cre-ERT, Cre-ERT2, etc., which are variants of Cre-ER, may be used.
また、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性依存的にジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現するコンストラクト、及び後腎間葉特異的なプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を接続したコンストラクトに加えて、更に、尿管芽特異的なプロモーターの下流にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を接続したコンストラクトを有する遺伝子改変非ヒト動物を用いることにより、遺伝子改変非ヒト動物由来の腎臓原基をホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞に置換することができる。 In addition to, for example, a construct that expresses a diphtheria toxin receptor (DTR) in a Cre recombinase activity-dependent manner, and a construct in which the Cre recombinase gene is linked downstream of a posterior mesenchymal promoter, urinary tract buds are further added. By using a genetically modified non-human animal having a construct in which the Cre recombinase gene is linked downstream of a specific promoter, the kidney primordia derived from the genetically modified non-human animal can be substantially autologous or allogeneic to the host cell. Can be replaced with home cells.
係る遺伝子改変非ヒト動物由来の腎臓原基を、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞に置換する方法としては、以下の方法が挙げられる。先ず、ジフテリア毒素を、後腎に接触させることで、後腎間葉の腎臓幹細胞を特異的に除去する。後腎間葉の腎臓幹細胞除去の後、又は同時に、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の腎臓幹細胞を移植し、移植した細胞を分化成熟させ、腎臓原基の一部を形成させる。次いで、タモキシフェンを後腎に接触させることで、尿管芽を特異的に除去する。尿管芽除去の後、又は同時に、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の腎臓幹細胞を移植し、移植した細胞を分化成熟させ、腎臓原基の一部を形成させる。係る方法により、遺伝子改変非ヒト動物由来の腎臓原基が、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞に置換される。 Examples of the method for substituting the renal primordium derived from the genetically modified non-human animal with substantially autologous or allogeneic cells for the host cells include the following methods. First, the diphtheria toxin is brought into contact with the posterior kidney to specifically remove the renal stem cells of the posterior mesenchyme. After or at the same time as the removal of renal stem cells in the posterior mesenchyme, substantially autologous or allogeneic renal stem cells are transplanted into the host cells, and the transplanted cells are differentiated and matured to release a part of the renal primordia. To form. The ureteral buds are then specifically removed by contacting tamoxifen with the posterior kidney. After or at the same time as ureteral bud removal, substantially autologous or allogeneic allogeneic kidney stem cells are transplanted into host cells, and the transplanted cells are differentiated and matured to form part of the renal primordium. By such a method, the kidney primordium derived from a genetically modified non-human animal is replaced with substantially autologous or allogeneic cells relative to the host cells.
ここで、「実質的に」とは、非ヒト動物の腎発生ニッチを利用して腎臓を製造した場合に、移植したホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の腎臓幹細胞以外の細胞が混入することを排除しないという意味である。いいかえると、再生される糸球体及び尿細管は、７０質量％以上が移植した細胞からなることが好ましく、８０質量％以上が移植した細胞からなることがより好ましく、９０質量％以上が移植した細胞からなることが更に好ましく、９５質量％以上が移植した細胞からなることが更により好ましく、９９質量％以上が移植した細胞からなることが特に好ましい。 Here, "substantially" means that when a kidney is produced using the renal development niche of a non-human animal, the cells of the transplanted host are substantially other than autologous or allogeneic kidney stem cells. It means that it does not exclude the contamination of cells. In other words, the regenerated glomerules and tubules preferably consist of 70% by mass or more of the transplanted cells, more preferably 80% by mass or more of the transplanted cells, and 90% by mass or more of the transplanted cells. It is even more preferably composed of 95% by mass or more of the transplanted cells, and 99% by mass or more of the transplanted cells is particularly preferable.
また、コンディショナルに、腎原基の少なくとも一部を除去するシステムとしては、ジフテリア毒素又はジフテリア毒素受容体以外のシステムにより細胞を死滅させる構成であってもよい。例えば、組織特異的なプロモーターの下流で、ガンシクロビルの投与によってアポトーシスを誘導するヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）を発現させるシステムが挙げられる。ＨＳＶ−ＴＫを発現させた細胞はガンシクロビル投与下で細胞死が誘導される。 In addition, the system for removing at least a part of the renal primordium may be a configuration in which cells are killed by a system other than diphtheria toxin or diphtheria toxin receptor. For example, a system that expresses a herpesvirus-derived thymidine kinase gene (HSV-TK) that induces apoptosis by administration of ganciclovir downstream of a tissue-specific promoter can be mentioned. Cells expressing HSV-TK are induced to die under ganciclovir administration.
あるいは、ＡＰ２０１８７の投与により、Ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃａｓｐａｓｅ８、Ｃａｓｐａｓｅ９等を二量体化させてアポトーシスを誘導するシステムを用いてもよい。 Alternatively, a system that induces apoptosis by dimerizing Caspase3, Caspase8, Caspase9, etc. by administration of AP20187 may be used.
また、膀胱においても同様の方法を用いることができる。 A similar method can also be used for the bladder.
上述した遺伝子改変非ヒト動物における非ヒト動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等の有蹄動物；ハムスター、モルモット、ラット、マウス等のげっ歯類が挙げられる。 Examples of non-human animals in the above-mentioned genetically modified non-human animals include ungulates such as cows, sheep, pigs, goats and horses; rodents such as hamsters, guinea pigs, rats and mice.
≪移植材料≫
図１は、本実施形態の移植材料の一例を示す図である。図１に示すように、腎臓原基１１０と、腎臓原基１１０に結合した膀胱１２０とが、膀胱１２０の内部に挿入して末広がり形状に膨張させたステント１３０を介してホストの尿管１４０に接続される。ステント１３０が末広がり形状に膨張することにより、膀胱１２０も末広がり形状に膨張し、ホストの尿管１４０と接する面が拡張された状態で、ホストの尿管１４０に接続される。
≪Transplant material≫
FIG. 1 is a diagram showing an example of a transplant material of the present embodiment. As shown in FIG. 1, the
この移植材料は、ホストの体内で、インビボで成長し、尿を生産するようになる。生産された尿は、ホストの尿管１４０を介して、ホストの膀胱へ移動して排泄される。
This implant material grows in vivo in the host's body and becomes urine-producing. The produced urine is transferred to the host's bladder via the host's
ホストにおける移植材料の移植先は、膀胱１２０とホストの尿管１４０が接続可能な位置であれば特に限定されないが、ホストの大網、傍大動脈、脾動脈の周辺が好ましい。図２は、移植材料を移植されたホストの生体内の一例を示した図である。移植材料１００は、腎臓原基１１０側がホストの傍大動脈１５０に移植され、ステント１３０を介してホストの尿管１４０と接続されている。
The transplant destination of the transplant material in the host is not particularly limited as long as the
移植材料１００において、腎臓原基１１０及び膀胱１２０が由来する動物は、ホストと同じ種であっても異なる種であってもよい。例えば、ブタ由来の移植材料をヒトやネコ等に移植して臓器構造体を形成することもできる。これは、移植可能な腎臓が不足している現状における選択肢の１つである。
In the
移植材料１００において、腎臓原基１１０及び膀胱１２０は、移植対象とは異なる種の遺伝子改変非ヒト動物由来であってもよい。例えば、移植材料１００において、腎臓原基１１０、及び膀胱１２０は、ヒトやネコに移植した場合の拒絶反応が低減された遺伝子改変ブタ由来であってもよい。
In the
移植材料１００をヒトに移植する場合、腎臓原基１１０及び膀胱１２０は、実質的にヒト細胞からなるものであることが好ましく、患者本人の細胞からなるものであることが最も好ましい。ここで、「実質的に」とは、動物の体内を利用して移植材料が製造された場合等に、ヒト以外の細胞が混入することを排除しないという意味である。いいかえると、移植材料を構成する細胞は、９０％以上がヒト細胞であることが好ましく、９５％以上がヒト細胞であることがより好ましく、９９％以上がヒト細胞であることが特に好ましい。
膀胱１２０は、ドナー由来であってもよい。例えば、ブタ由来であってもよく、上述したコンディショナルに膀胱構成細胞を除去するシステムを用いて膀胱を除去するとともに、ホストの尿管上皮細胞に置換され得る。
When the
The
≪ステント≫
本発明は、１実施形態において、上記移植材料をホストへ移植するために用いられる、末広がり形状に変形可能なステントを提供する。
≪Stent≫
The present invention provides, in one embodiment, a stent that is deformable into a divergent shape and is used to implant the implant material into a host.
本実施形態におけるステントとしては、手術に用いられ、図３に示されるように、末広がり形状に変形可能なものであれば特に限定されない。例えば、冠動脈の狭窄している部分に用いられるステントが挙げられる。
例えば、本実施形態のステントの使用方法としては、以下の方法が挙げられる。ホストに移植した移植材料の膀胱を切り、先端にステントを載せたバルーンを有するカテーテルを、その膀胱に挿入し、ステントを末広がり形状に広げる。広がったステントを残してバルーンカテーテルを抜き取る。これにより、膀胱の内腔は開いたままで狭窄症を起すことは無い。
The stent in the present embodiment is not particularly limited as long as it is used for surgery and can be deformed into a divergent shape as shown in FIG. For example, a stent used for a narrowed portion of a coronary artery.
For example, as a method of using the stent of this embodiment, the following method can be mentioned. The bladder of the transplant material transplanted to the host is cut, a catheter having a balloon with a stent at the tip is inserted into the bladder, and the stent is spread in a divergent shape. Remove the balloon catheter, leaving the widened stent. As a result, the lumen of the bladder remains open and does not cause stenosis.
≪治療方法≫
１実施形態において、本発明は、それぞれ独立して、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞からなるか、ホストの細胞に対して実質的に自家又は同種他家の細胞に置換され得る遺伝子改変非ヒト動物由来である、腎臓原基及び前記腎臓原基に結合した膀胱を、患者又は患畜の体内に移植する工程（ａ）と、移植から所定期間後に、前記膀胱の内部に末広がり形状に変形可能なステントを挿入して、前記ステントを末広がり形状に膨張させ、前記膀胱においてホストの尿管と接する面が拡張された状態で、前記膀胱とホストの尿管とを接続する工程（ｂ）と、を備える、腎臓の移植方法を提供する。
ホストとは、患者又は患畜であり、患者又は患畜としては、例えば、ヒト、ネコが挙げられる。
≪Treatment method≫
In one embodiment, the invention independently comprises substantially autologous or allogeneic cells relative to the host cell, or substantially autologous or allogeneic cells relative to the host cell. The step (a) of transplanting a renal primordia and a bladder bound to the renal primordia, which is derived from a genetically modified non-human animal that can be replaced with, into the body of a patient or a patient, and a predetermined period after the transplantation, A stent that can be deformed into a divergent shape is inserted inside, the stent is inflated into a divergent shape, and the bladder is connected to the host ureter with the surface of the bladder in contact with the host ureter expanded. Provided is a method for transplanting a kidney, comprising the step (b).
The host is a patient or a patient, and examples of the patient or a patient include humans and cats.
本実施形態の方法は、腎疾患の治療方法であるともいえる。移植材料としては上述したものを用いることができる。 It can be said that the method of the present embodiment is a method for treating renal disease. As the transplant material, the above-mentioned materials can be used.
上記工程（ａ）で移植した移植材料を所定期間放置することにより、移植材料が成長し、尿産生を開始する。所定期間は、移植材料が十分に成長し、かつ、水腎症を起こす前までの期間であればよい。所定期間は、患者又は患畜の症状等によって適宜調整すればよいが、例えば１〜１０週間であってよい。 By leaving the transplanted material transplanted in the above step (a) for a predetermined period of time, the transplanted material grows and starts urine production. The predetermined period may be a period before the transplant material grows sufficiently and hydronephrosis occurs. The predetermined period may be appropriately adjusted according to the symptoms of the patient or the patient, and may be, for example, 1 to 10 weeks.
続いて、移植から所定期間後に工程（ｂ）を実施する。工程（ｂ）において、移植材料の膀胱を切り、スタントを入れ末広がり形状になるように膨らませた後、この膀胱と、患者又は患畜の尿管とを接続する。接続方法としては、端端吻合、端側吻合、側側吻合、側端吻合が挙げられ、端側吻合が好ましい。 Subsequently, step (b) is carried out after a predetermined period from the transplantation. In step (b), the bladder of the implant material is cut, stunted and inflated to form a divergent shape, and then the bladder is connected to the ureter of the patient or patient. Examples of the connection method include end-to-end anastomosis, end-side anastomosis, side-to-side anastomosis, and side-end anastomosis, and end-to-end anastomosis is preferable.
移植材料の膀胱と、患者又は患畜の膀胱とを患者又は患畜の尿管を介して接続することにより、移植材料が産生した尿を、患者又は患畜の膀胱へと排泄させることができる。より詳細には、移植材料の腎臓が産生した尿が、移植材料の膀胱まで排泄され、次いで、移植材料の膀胱から、患者又は患畜の尿管を通じて患者又は患畜の膀胱まで排泄される。 By connecting the bladder of the transplant material and the bladder of the patient or the patient via the ureter of the patient or the patient, the urine produced by the transplant material can be excreted into the bladder of the patient or the patient. More specifically, the urine produced by the kidney of the transplant material is excreted to the bladder of the transplant material, and then from the bladder of the transplant material to the bladder of the patient or patient through the ureter of the patient or patient.
工程（ｂ）において、移植材料の膀胱が、遺伝子改変非ヒト動物由来である場合には、上述したコンディショナルに膀胱構成細胞を除去するシステムを用いて、非ヒト動物由来の膀胱を除去する。係る除去に従い、膀胱の粘膜が無くなり線維化が促進されるが、本発明においては、ステントを備えているため、膀胱の内腔は開いたままで狭窄症を起すことは無い。移植材料の膀胱が除去されるにつれ、ホストの尿管上皮が膀胱の欠失を補うように生えてくるため、最終的には、移植材料の膀胱は、ホスト由来のものに置き換わる。 In step (b), when the bladder of the transplant material is derived from a genetically modified non-human animal, the bladder derived from the non-human animal is removed by using the above-mentioned system for removing bladder constituent cells conditionally. According to such removal, the mucous membrane of the bladder disappears and fibrosis is promoted, but in the present invention, since the stent is provided, the lumen of the bladder remains open and stenosis does not occur. Eventually, the bladder of the implant material will be replaced by that of the host, as the host's ureteral epithelium will grow to compensate for the bladder deletion as the bladder of the implant material is removed.
本実施形態の方法により、患者又は患畜の腎臓を温存したまま、移植材料の腎臓が産生した尿を、患者又は患畜の膀胱へと排泄させることができる。 According to the method of the present embodiment, the urine produced by the kidney of the transplant material can be excreted into the bladder of the patient or the patient while preserving the kidney of the patient or the patient.
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
［実験例１］
妊娠マイクロミニブタ１頭より胎仔５匹を取り出し、クロアカグラフト（膀胱付腎臓原基移植片）を顕微鏡下で調製した。生後直後に胸腺摘除して成熟させたマイクロミニブタ（Enhancing Survival of Human Hepatocytes by Neonatal Thymectomy and Partial Hepatectomy in Micro-miniature Pigs. Hsu HC, Enosawa S, Yamazaki T, Tohyama S, Fujita J, Fukuda K, Kobayashi E. Transplant Proc. 2017 Jan - Feb;49(1):153-158.参照。）の雄２頭に、クロアカグラフトを移植した（図４参照。）。ホストの右腎臓については、５０％腎梗塞を作り、脾臓摘出の上、胃瘻チューブを挿入した。術後は、発明者らが開発した免疫抑制プロトコールに従い（Development of an immunodeficient pig model allowing long-term accommodation of artificial human vascular tubes. Itoh M, Mukae Y, Kitsuka T, Arai K, Nakamura A, Uchihashi K, Toda S, Matsubayashi K, Oyama JI, Node K, Kami D, Gojo S, Morita S, Nishida T, Nakayama K, Kobayashi E. Nat Commun. 2019 May 21;10(1):2244. 参照。）、ホストを管理した。
[Experimental Example 1]
Five fetuses were taken out from one pregnant micromini pig, and a cloakagraft (kidney primordium graft with bladder) was prepared under a microscope. Enhancing Survival of Human Hepatocytes by Neonatal Thymectomy and Partial Hepatectomy in Micro-miniature Pigs. Hsu HC, Enosawa S, Yamazaki T, Tohyama S, Fujita J, Fukuda K, Kobayashi E Two males of Transplant Proc. 2017 Jan --Feb; 49 (1): 153-158.) Were transplanted with cloakagrafts (see Figure 4). For the host's right kidney, a 50% renal infarction was made, the splenectomy was performed, and a gastrostomy tube was inserted. Postoperatively, according to the immunosuppressive protocol developed by the inventors (Development of an immunodeficient pig model allowing long-term accommodation of artificial human vascular tubes. Itoh M, Mukae Y, Kitsuka T, Arai K, Nakamura A, Uchihashi K, Toda S, Matsubayashi K, Oyama JI, Node K, Kami D, Gojo S, Morita S, Nishida T, Nakayama K, Kobayashi E. Nat Commun. 2019 May 21; 10 (1): 2244.), Host Managed.
一か月の免疫抑制後、クロアカグラフトを移植したホストを再開腹して、クロアカグラフトの発育を確認した（図５参照。）。直径２ｍｍ以下であった胎仔腎臓は、約１ｃｍまで発育し、膀胱が確認された。係るクロアカグラフトの移植は、以前発明者らが開発したものであり（Urine excretion strategy for stem cell-generated embryonic kidneys. Yokote S, Matsunari H, Iwai S, Yamanaka S, Uchikura A, Fujimoto E, Matsumoto K, Nagashima H, Kobayashi E, Yokoo T. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Oct 20;112(42):12980-5.参照。）、発育したクロアカの膀胱とホストの尿管を端端吻合するものであったが、今回更に端側吻合で、ホストの腎臓摘出せずに尿路再建ができるか検討した（図６参照。）。
図６に示すように、発育したクロアカ膀胱に端側吻合と端端吻合をそれぞれ施した。
After one month of immunosuppression, the host transplanted with cloaca graft was restarted and the growth of cloaca graft was confirmed (see FIG. 5). The fetal kidney, which had a diameter of 2 mm or less, grew to about 1 cm, and a bladder was confirmed. The transplantation of the cloaca graft was previously developed by the inventors (Urine excretion strategy for stem cell-generated embryonic kidneys. Yokote S, Matsunari H, Iwai S, Yamanaka S, Uchikura A, Fujimoto E, Matsumoto K, Nagashima H, Kobayashi E, Yokoo T. Proc Natl Acad Sci US A. 2015 Oct 20; 112 (42): 12980-5.) However, this time, we examined whether urinary tract reconstruction could be performed by end-side anastomosis without removing the kidney of the host (see FIG. 6).
As shown in FIG. 6, the developed cloaca bladder was subjected to end-to-end anastomosis and end-to-end anastomosis, respectively.
吻合を施した後、免疫抑制を更に１か月施し、クロアカグラフトの発育を確認した（図７参照。）。膀胱・尿管端側吻合のクロアカグラフトはホスト大動脈から直接血管が入り込み、さらに発育していた。 After the anastomosis, immunosuppression was performed for another month, and the growth of the cloaca graft was confirmed (see FIG. 7). The cloaca graft of the bladder / ureteral end-side anastomosis was further developed with blood vessels entering directly from the host aorta.
［実験例２］
妊娠マイクロミニブタより子宮全摘し、妊娠後期胎仔を取り出した。クロアカグラフト（膀胱付腎臓原基移植片）は、この時点で膀胱の発生が確認できるものを使用した。先ず、胎仔を取り出した母ブタの胸腺摘除及び脾臓摘出した。次いでクロアカグラフトの膀胱切開縁とステントを６−０マイクロ糸で固定して、ホストの尿管と端側吻合した（図８参照。）。ホストの腎臓を摘出することなく尿路を再建することができた。
[Experimental Example 2]
A total hysterectomy was performed from a pregnant micromini pig, and a fetus in late pregnancy was taken out. The cloaca graft (kidney primordium graft with bladder) used was one in which the development of the bladder could be confirmed at this point. First, the thymus and splenectomy of the mother pig from which the fetus was taken out were performed. The bladder incision edge of the cloaca graft and the stent were then fixed with 6-0 microthreads and end-to-end anastomosis with the host ureter (see FIG. 8). The urinary tract could be reconstructed without removing the host's kidneys.
本発明によれば、患者が元来有する腎臓を温存していても腎機能を長期間持続することができる移植材料、及びこれに用いられるステントを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a transplant material capable of sustaining renal function for a long period of time even while preserving the kidney originally possessed by the patient, and a stent used therefor.
１００…移植材料、１１０…腎臓原基、１２０…膀胱、１３０…ステント、１４０…ホストの尿管、１５０…ホストの傍大動脈、１６０…ホストの腎臓。 100 ... Transplant material, 110 ... Kidney primordia, 120 ... Bladder, 130 ... Stent, 140 ... Host ureter, 150 ... Host para-aorta, 160 ... Host kidney.
Claims (9)
前記膀胱は、その内部に挿入された後、末広がり形状に膨張した前記ステントに保持され、ホストの尿管と接する面が拡張された状態で接続されるように移植するために用いられる移植材料。 A transplant material comprising a kidney primordium, a bladder bound to the kidney primordium, and a stent that can be deformed into a divergent shape.
A transplant material used for implanting the bladder, which is inserted into the bladder, is held by the stent which is expanded in a divergent shape, and is connected so that the surface in contact with the ureter of the host is connected in an expanded state.
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