JP2021052662A - Method for increasing activity of graft - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、移植片の活性を高める方法、当該方法を含む移植片の製造方法、当該製造方法により製造された移植片、当該移植片を用いた疾患の処置方法などに関する。 The present disclosure relates to a method for enhancing the activity of a graft, a method for producing a graft including the method, a graft produced by the manufacturing method, a method for treating a disease using the graft, and the like.
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。 In recent years, attempts have been made to transplant various cells for repairing damaged tissues and the like. For example, use of fetal myocardial cells, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, iPS cells, etc. for repair of myocardial tissue damaged by ischemic heart disease such as angina and myocardial infarction. Has been attempted (Non-Patent Document 1).
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１、非特許文献２）。このようなシート状細胞培養物などの移植片を用いた治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。 As a part of such an attempt, a cell structure formed by using a scaffold and a sheet-shaped cell culture in which cells are formed in a sheet shape have been developed (Patent Document 1 and Non-Patent Document 2). Regarding the application to the treatment using implants such as sheet-shaped cell cultures, the use of cultured epidermis sheets for skin damage caused by burns, the use of corneal epithelial sheet-shaped cell cultures for corneal damage, and the use of intraesophageal cancer. The use of oral mucosal sheet-like cell cultures for endoscopic resection is under study, and some of them are in the stage of clinical application.
シート状細胞培養物などの移植片の臨床応用が進むにつれて、より高品質で取り扱いが容易であり、簡便に製造可能な移植片を提供することが求められるようになってきた。移植片は、移植片中の細胞が産生する種々のサイトカインが移植先の組織に作用することにより当該組織の再生を促進させることが知られているところ、本発明者らは、移植片の改良について研究する中で、移植片を保存すると、サイトカイン産生能や移植片中の細胞の増殖能などの活性が低下するという課題に直面した。 As the clinical application of grafts such as sheet-shaped cell cultures has progressed, it has become necessary to provide grafts of higher quality, easier to handle, and easier to manufacture. It is known that the graft promotes the regeneration of the tissue by the action of various cytokines produced by the cells in the graft on the tissue to be transplanted. In my research on the graft, I faced the problem that when the graft is preserved, the activity such as the ability to produce cytokines and the ability to proliferate the cells in the graft is reduced.
かかる課題を解決すべく研究を続けたところ、シート状細胞培養物を２５℃以上でインキュベートすることによりサイトカイン産生能や移植片中の細胞の活性を向上させ得ることを見出した。さらに研究を進め、スキャフォールドを有する移植片を用いた場合、移植片の形状を維持したままサイトカイン産生能を向上させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of continuing research to solve this problem, it was found that the cytokine-producing ability and the activity of cells in the graft can be improved by incubating the sheet-shaped cell culture at 25 ° C. or higher. Further research was carried out, and it was found that when a graft having a scaffold was used, the cytokine-producing ability could be improved while maintaining the shape of the graft, and the present invention was completed.
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
＜１＞ 多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含有する移植片のサイトカイン産生能、増殖能、生着能、血管誘導能および組織再生能からなる群から選択される活性を高める方法であって、移植片を２５℃以上でインキュベートするステップを含む前記方法。
＜２＞ 移植片がスキャフォールドを有する、請求項１に記載の方法。
＜３＞ スキャフォールドが、フィブリン、ゼラチンまたはコラーゲンを含むゲルである、請求項２に記載の方法。
＜４＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の方法を含む移植片の製造方法。
＜５＞ 移植片が、シート状細胞培養物である、＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の方法よって得られた移植片または＜４＞もしくは＜５＞に記載の方法によって製造された移植片。
＜７＞ 心疾患を治療するための＜６＞に記載の移植片。
＜８＞ 移植片の適用により改善される疾患を処置する方法であって、＜６＞または＜７＞に記載の移植片を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。
That is, the present invention relates to the following:
<1> A method for enhancing the activity selected from the group consisting of cytokine-producing ability, proliferation ability, engraftment ability, blood vessel-inducing ability, and tissue regeneration ability of a graft containing differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells. The method comprising the step of incubating the implant at 25 ° C. or higher.
<2> The method according to claim 1, wherein the implant has a scaffold.
<3> The method according to claim 2, wherein the scaffold is a gel containing fibrin, gelatin or collagen.
<4> A method for producing a graft, which comprises the method according to any one of <1> to <3>.
<5> The method according to any one of <1> to <4>, wherein the implant is a sheet-like cell culture.
<6> The implant obtained by the method according to any one of <1> to <3> or the implant produced by the method according to <4> or <5>.
<7> The implant according to <6> for treating heart disease.
<8> The method for treating a disease that is ameliorated by the application of the implant, comprising the step of applying the implant according to <6> or <7> to a subject in need thereof.
本発明による移植片は、サイトカイン産生能および増殖能などの活性が高く、組織への生着およびその後の生存性や機能性、機能の持続性などに優れるため、種々の疾患の効率的な処置だけでなく長時間の保存や移送が可能となる。したがって、高い品質を保った移植片を提供することが可能となる。 The graft according to the present invention has high activity such as cytokine producing ability and proliferative ability, and is excellent in tissue engraftment and subsequent survival, functionality, sustainability of function, etc., and therefore, therefore, efficient treatment of various diseases. Not only that, it can be stored and transported for a long time. Therefore, it is possible to provide a graft piece maintaining high quality.
以下、本開示を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
Hereinafter, the present disclosure will be described in detail.
Unless defined otherwise herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as those commonly understood by one of ordinary skill in the art. All patents, applications, published applications and other publications referenced herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict between the publications referred to herein and the description herein, the description herein shall prevail.
＜移植片の活性を高める方法＞
本開示は、移植片のサイトカイン産生能、増殖能、生着能、血管誘導能および組織再生能からなる群から選択される活性を高める方法であって、シート状細胞培養物を２５℃以上でインキュベーするステップを含む。
<How to increase the activity of the graft>
The present disclosure is a method for enhancing the activity selected from the group consisting of cytokine-producing ability, proliferation ability, engraftment ability, blood vessel-inducing ability, and tissue regeneration ability of a graft, in which a sheet-shaped cell culture is prepared at 25 ° C. or higher. Includes steps to incubate.
本開示において、「移植片」とは、生体内へ移植するための構造物を意味し、特に細胞を構成成分として含む移植用構造物を意味する。移植片を構成する細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質（本明細書において「スキャフォールド」ともいう）を介して、互いに連結していてもよい。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。本開示における移植片としては、これに限定するものではないが、例えばシート状細胞培養物、細胞凝集塊、スフェロイド、オルガノイドなどが挙げられ（本明細書において「細胞凝集塊」、「スフェロイド」、「オルガノイド」を総称して「細胞塊」とも言う）、好ましくはシート状細胞培養物またはスフェロイド、より好ましくはシート状細胞培養物である。 In the present disclosure, the "graft" means a structure for transplantation into a living body, and particularly means a structure for transplantation containing cells as a constituent component. The cells that make up the implant may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances (also referred to herein as "scaffolds"). Good. The cells are at least physically (mechanically) connected, but may be more functionally, for example, chemically or electrically connected. The implant pieces in the present disclosure include, but are not limited to, sheet-like cell cultures, cell aggregates, spheroids, organoids, and the like (in the present specification, "cell aggregates", "spheroids", etc.). "Organoids" are also collectively referred to as "cell clumps"), preferably sheet-like cell cultures or spheroids, more preferably sheet-like cell cultures.
本発明の一態様において移植片は、スキャフォールドを含む。スキャフォールドは、その表面および／またはその内部に細胞を付着または包埋し、これにより移植片の物理的一体性の維持や、強度の付与のために当該技術分野において用いられる。スキャフォールドとしては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特限定されず、細胞由来の物質であっても、細胞由来以外の物質であってもよい。スキャフォールドとしては、例えば、生体適合性を有するフィルムまたはゲルなどが知られている。例えば、羊膜、ＰＶＤＦ、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、シリコーン、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）などのフィルム、フィブリン、ゼラチン、コラーゲンアルギン酸ナトリウム、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で架橋した温度応答性ゲル（市販名：メビオールゲル）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、キトサン、ゼラチン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、デキストリン、トレハロースなどを含むゲルが挙げられるがこれに限定されない。スキャフォールドとしては好ましくは、フィブリンゲル、ゼラチンまたはコラーゲンを含むゲルであり、より好ましくはフィブリンゲルを含むゲルである。
スキャフォールドを有する移植片としては、例えばフィルムを表面または内部に有する移植片、ゲル層が表面または内部に形成された移植片、または、細胞、細胞塊、シート状細胞培養物の間隙を埋めるゲルにより一体性が付与された移植片などが挙げられるが、これらに限定されない。
In one aspect of the invention, the implant comprises a scaffold. Scaffolds are used in the art to attach or embed cells on and / or within them, thereby maintaining the physical integrity of the implant and imparting strength. The scaffold is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells to each other, and may be a cell-derived substance or a non-cell-derived substance. Known scaffolds include, for example, biocompatible films or gels. For example, sheep membrane, PVDF, polytetrafluoroethylene (PTFE), polyurethane, polypropylene, polyester, vinyl chloride, polycarbonate, acrylic, silicone, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine), polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid / glycolic acid. A temperature-responsive gel (trade name: mebiol gel) in which a film such as a copolymer (PLGA), fibrin, gelatin, sodium collagen alginate, poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) is crosslinked with polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid, glyco Gel containing saminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethyl cellulose, chitin, chitosan, gelatin, atelocollagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenesin, fibroin, entactin, thrombospondin, retronectin, dextrin, trehalose, etc. However, it is not limited to this. The scaffold is preferably a gel containing fibrin gel, gelatin or collagen, and more preferably a gel containing fibrin gel.
Examples of the graft having a scaffold include a graft having a film on the surface or inside, a graft having a gel layer formed on the surface or inside, or a gel that fills the gaps between cells, cell clusters, and sheet-like cell cultures. Examples include, but are not limited to, implants that have been imparted with integrity.
本開示において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／またはスキャフォールドを介して、互いに連結していてもよい。
したがって、本開示において「シート状細胞培養物」は、細胞をシート状に培養したものだけでなく、細胞をシート状に成形したものが含まれる。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（（例えば２層、３層、４層、５層、６層などの多層）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していても、細胞間にフィルムやゲルなどのスキャフォールドが含まれていてもよい。
In the present disclosure, "sheet-shaped cell culture" refers to cells connected to each other to form a sheet. Cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via scaffolds.
Therefore, in the present disclosure, the "sheet-shaped cell culture" includes not only those obtained by culturing cells in a sheet shape but also those obtained by molding cells into a sheet shape. The sheet-like cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or two or more cell layers (for example, two layers, three layers, four layers, five layers, etc.). The sheet-like cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without showing a clear layer structure of the cells. For example, in a vertical cross section of a sheet-like cell culture, cells may be present in a non-uniformly (for example, mosaic-like) arrangement without being uniformly aligned in the horizontal direction, and may be intercellular. May contain scaffolds such as film or gel.
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、移植片が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞（自家ｉＰＳ細胞を含む）である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞（他家ｉＰＳ細胞を含む）である。 The cell may be a heterologous cell or an allogeneic cell. Here, "heterologous cell" means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the graft is used for transplantation. For example, when the recipient is a human, cells derived from monkeys and pigs correspond to heterologous cells. In addition, "homogeneous cell" means a cell derived from an organism of the same species as the recipient. For example, when the recipient is a human, the human cell corresponds to an allogeneic cell. Allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), ie, recipient-derived cells and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present disclosure because they do not cause rejection when transplanted. However, it is also possible to utilize heterologous cells and allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection. In the present specification, cells other than autologous cells, that is, allogeneic non-self-derived cells and allogeneic non-self-derived cells may be collectively referred to as non-autologous cells. In one aspect of the disclosure, the cell is an autologous cell or an allogeneic cell. In one aspect of the disclosure, the cell is an autologous cell (including an autologous iPS cell). In another aspect of the disclosure, the cell is an allogeneic cell (including an allogeneic iPS cell).
本開示の移植片を構成する細胞は、遺伝子導入により多能性幹細胞から分化誘導された細胞であって、移植片、特にシート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞）などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。ｉＰＳ細胞は遺伝子を導入して誘導された細胞である。移植片を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。 The cells constituting the transplants of the present disclosure are not particularly limited as long as they are cells induced to differentiate from pluripotent stem cells by gene transfer and can form transplants, particularly sheet-like cell cultures. For example, it includes adherent cells (adherent cells). Adhesive cells include, for example, somatic cells (eg, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocellular cells, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin cells, glides. Membrane cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, heart stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS), pluripotent stem cells, mesophyll Includes lineage stem cells, etc.). iPS cells are cells induced by introducing a gene. Non-limiting examples of cells constituting the transplant include, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots, muscle tissue, etc.) Endometrial, placenta, umbilical cord blood, etc.), myocardial cells, fibroblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelial cells, retinal pigments) Epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells, etc.), hepatocytes (eg, hepatic parenchymal cells, etc.), pancreatic cells (eg, pancreatic islet cells, etc.), kidney cells, adrenal cells, root membrane Examples include cells, gingival cells, bone membrane cells, skin cells and the like. Non-limiting examples of iPS cell-derived adherent cells include iPS cell-derived myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, and bone membrane cells. , Skin cells, synovial cells, cartilage cells and the like.
本開示において、「多能性幹細胞」は、当該技術分野で周知の用語であり、三胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉に属する全ての系列の細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。通常、多能性幹細胞を特定の細胞に分化誘導する際には、まず多能性幹細胞を浮遊培養して、上記三胚葉のいずれかの細胞の凝集体を形成し、その後凝集体を形成する細胞を目的とする特定の細胞に分化誘導させることができる。 In the present disclosure, "pluripotent stem cell" is a well-known term in the art and has the ability to differentiate into three germ layers, i.e. cells of all lineages belonging to endoderm, mesoderm and ectoderm. Means cell. Non-limiting examples of pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), nuclear-transplanted embryonic stem cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like. Normally, when inducing differentiation of pluripotent stem cells into specific cells, pluripotent stem cells are first suspended and cultured to form aggregates of any of the above three germ layers, and then aggregates are formed. It is possible to induce differentiation of cells into specific cells of interest.
本開示において、「多能性幹細胞由来の分化誘導細胞」は、多能性幹細胞から特定の種類の細胞に分化するように分化誘導処理された任意の細胞を意味する。分化誘導細胞の非限定例は、心筋細胞、骨格筋芽細胞などの筋肉系の細胞、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、ドーパミン産生細胞などの神経系の細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血球細胞、骨髄細胞などの造血系の細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などの免疫関連の細胞、肝細胞、膵β細胞、腎細胞などの臓器を構成する細胞、軟骨細胞、生殖細胞などの他、これらの細胞に分化する前駆細胞や体性幹細胞などを含む。かかる前駆細胞や体性幹細胞の典型例としては、例えば心筋細胞における間葉系幹細胞、多分化性心臓前駆細胞、単能性心臓前駆細胞、神経系の細胞における神経幹細胞、造血系の細胞や免疫関連の細胞における造血幹細胞およびリンパ系幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞の分化誘導は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導は、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８に記載の手法に基づいて行うことができる。所望の細胞として、ｉＰＳ由来心筋細胞等の多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を用いる場合、分化誘導後に未分化細胞の除去処理を行ってもよい。未分化細胞の除去処理は、当該技術分野において知られており、例えばＷＯ２０１７／０３８５６２、ＷＯ２０１６／０７２５１９およびＷＯ２００７／０８８８７４等に記載された方法を用いることができる。 In the present disclosure, "pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cell" means any cell that has been subjected to differentiation-inducing treatment so as to differentiate from a pluripotent stem cell into a specific type of cell. Non-limiting examples of differentiation-inducing cells include muscular cells such as myocardial cells and skeletal myoblasts, neural cells such as neuron cells, oligodendrocytes and dopamine-producing cells, retinal cells such as retinal pigment epithelial cells, and blood cells. Hematopoietic cells such as cells and bone marrow cells, immune-related cells such as T cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells and B cells, cells constituting organs such as hepatocytes, pancreatic β cells and renal cells, In addition to cartilage cells and germ cells, it also includes precursor cells and somatic stem cells that differentiate into these cells. Typical examples of such progenitor cells and somatic stem cells include mesenchymal stem cells in myocardial cells, pluripotent cardiac progenitor cells, monopoly cardiac progenitor cells, neural stem cells in neural cells, hematopoietic cells and immunity. Examples include hematopoietic stem cells and lymphoid stem cells in related cells. Induction of differentiation of pluripotent stem cells can be performed using any known method. For example, the induction of differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes can be performed based on the method described in Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015 and WO 2014/185358. When a differentiation-inducing cell derived from a pluripotent stem cell such as an iPS-derived cardiomyocyte is used as the desired cell, the undifferentiated cell may be removed after the differentiation induction. The treatment for removing undifferentiated cells is known in the art, and the methods described in, for example, WO2017 / 038562, WO2016 / 072519, WO2007 / 088744, etc. can be used.
また分化誘導細胞は、リプログラミングのための遺伝子以外の任意の有用な遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導された細胞であってもよい。かかる細胞の非限定例としては、例えば、Themeli M. et al. Nature Biotechnology, vol. 31, no. 10, pp. 928-933, 2013に記載のキメラ抗原受容体の遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導されるＴ細胞などが挙げられる。また、多能性幹細胞から分化誘導された後、任意の有用な遺伝子が導入された細胞もまた、本発明の分化誘導細胞に包含される。 In addition, the differentiation-inducing cell may be a cell derived from an iPS cell into which any useful gene other than the gene for reprogramming has been introduced. Non-limiting examples of such cells include, for example, iPS cells into which the chimeric antigen receptor gene described in Themeli M. et al. Nature Biotechnology, vol. 31, no. 10, pp. 928-933, 2013 has been introduced. Examples include T cells derived from. In addition, cells into which any useful gene has been introduced after induction of differentiation from pluripotent stem cells are also included in the differentiation-inducing cells of the present invention.
本開示において「心筋細胞」は、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味し、心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ−ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。心筋細胞としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞が好ましく例示される。
本発明において、移植片を構成する細胞は、好ましくは、心筋細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、膵細胞、腎細胞、血管内皮細胞、または角膜上皮細胞であり、より好ましくは心筋細胞であり、最も好ましくはｉＰＳ細胞由来の心筋細胞である。
In the present disclosure, "cardiomyocyte" means a cell having characteristics of cardiomyocytes, and the characteristics of cardiomyocytes include, without limitation, for example, expression of cardiomyocyte markers, presence of autonomous pulsation, and the like. .. Non-limiting examples of cardiomyocyte markers include, for example, c-TNT (cardiac troponin T), CD172a (also known as SIRPA or SHPS-1), KDR (also known as CD309, FLK1 or VEGFR2), PDGFRA, EMILIN2, VCAM and the like. .. As the cardiomyocytes, iPS cell-derived cardiomyocytes are preferably exemplified.
In the present invention, the cells constituting the implant are preferably myocardial cells, hepatocytes, fibroblasts, myoblasts, pancreatic cells, renal cells, vascular endothelial cells, or corneal epithelial cells, and more preferably myocardium. It is a cell, most preferably an iPS cell-derived myocardial cell.
移植片を構成する細胞は、移植片による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、シート状細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみ細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。シート状物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、シート状細胞培養物の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。 The cells that make up the implant can be derived from any organism that can be treated with the implant. Such organisms include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, etc. Is included. Further, the number of types of cells constituting the sheet-shaped cell culture is not particularly limited, and only one type of cells may be used, but two or more types of cells may be used. When there are two or more types of cells forming a sheet-like substance, the content ratio (purity) of the most abundant cells is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70 at the end of the formation of the sheet-like cell culture. % Or more, more preferably 75% or more.
移植片は、既知の任意の方法で製造されたものを使用することができる。本発明の一態様において、移植片が、シート状細胞培養物である場合、シート状細胞培養物は、典型的には、細胞を基材上に播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップを含む方法で製造されたものを使用することができるが、これに限定されない。
本発明の一態様においてスキャフォールドを有する移植片は、既知の任意の方法で製造されたものを使用することができる。
本発明の一態様において、移植片がスキャフォールドを有する場合、例えば、前記播種した細胞をシート化するステップの後に、さらにゲル層を形成するステップを含む方法で製造された、ゲル層が形成されたシート状細胞培養物を使用することができる。シート状細胞培養物へゲル層を形成するステップは、公知の方法を使用することができ、例えば、トロンビン液を噴霧後、シート状細胞培養物を一定期間静置することにより行うことができ、これに限定されない（特許第６４９５６０３号公報参照）。
As the implant, those manufactured by any known method can be used. In one aspect of the invention, when the implant is a sheet-like cell culture, the sheet-like cell culture typically includes a step of seeding the cells on a substrate, a step of sheeting the seeded cells. It is possible to use, but is not limited to, those manufactured by a method including.
As the implant having a scaffold in one aspect of the present invention, one produced by any known method can be used.
In one aspect of the invention, when the implant has a scaffold, for example, a gel layer produced by a method comprising the step of sheeting the seeded cells followed by the step of further forming a gel layer is formed. Sheet-shaped cell culture can be used. The step of forming the gel layer on the sheet-shaped cell culture can be performed by using a known method, for example, by spraying the thrombin solution and then allowing the sheet-shaped cell culture to stand for a certain period of time. The present invention is not limited to this (see Japanese Patent No. 6495603).
本発明の一態様において、移植片がスキャフォールドを有する場合、細胞、細胞塊および/またはシート状細胞培養物を基材上に間隙を介して配置するステップ、該細胞間の間隙をゲルで埋めてシート状にするステップ、を含む方法で製造された、ゲルにより一体性が付与された移植片が使用できる。
本発明の更なる別の態様において、移植片がスキャフォールドを有する場合、細胞、細胞塊および/またはシート状細胞培養物を基材上に沈降させるステップ、細胞、細胞塊および/またはシート状細胞培養物をゲルによりシート状に成形するステップを含む方法で製造された、ゲルにより一体性が付与された移植片を使用できる。
間隙をゲルで埋めてシート状にするステップまたはゲルによりシート状に成形するステップは、例えば、細胞がその表面に配置されている基材上に、ゲルを静かに添加することにより行われる。添加される量は、任意の量であってよいが、好ましくはシート状物が例えば１０μｍ〜２０００μｍ、好ましくは１０μｍ〜５００μｍ、より好ましくは５０μｍ〜２００μｍの厚さになる量である。
一態様において、ゲルは２液を混合することによりゲル化が生じるものであり、このようなゲルを用いてゲル化する方法は、任意の既知の方法を用いることができる。かかる方法としても、例えば、フィブリノゲン液とトロンビン液を同時に添加する方法や、フィブリノゲン液を細胞上に滴下し、その後トロンビン液を噴霧することによりフィブリンゲルを形成する方法（特許第６４９５６０３号公報）を用いることができるが、これに限定されない。
In one aspect of the invention, when the implant has a scaffold, a step of placing cells, cell clusters and / or sheet-like cell cultures on a substrate through gaps, filling the gaps between the cells with gel. A gel-integrated implant produced by a method comprising the step of forming into a sheet can be used.
In yet another aspect of the invention, when the implant has a scaffold, a step of sedimenting cells, cell clumps and / or sheet cell cultures onto a substrate, cells, cell clumps and / or sheet cells. Implants that are made by a method that includes the step of forming the culture into a sheet by gel can be used.
The step of filling the gap with a gel to form a sheet or the step of forming a sheet with a gel is performed, for example, by gently adding the gel onto a substrate on which cells are arranged on the surface thereof. The amount added may be any amount, but is preferably an amount such that the sheet-like material has a thickness of, for example, 10 μm to 2000 μm, preferably 10 μm to 500 μm, and more preferably 50 μm to 200 μm.
In one aspect, the gel is gelled by mixing the two liquids, and any known method can be used as the method for gelling using such a gel. As such a method, for example, a method of adding a fibrinogen solution and a thrombin solution at the same time, or a method of dropping the fibrinogen solution onto cells and then spraying the thrombin solution to form a fibrin gel (Patent No. 6495603). It can be used, but is not limited to this.
本発明の一態様において、スキャフォールドとしてゲルを使用する場合、ゲルは生体内分解性ゲルであり、生体内において分解し、体内へ吸収され、代謝、排泄される。例えば、フィブリノゲン液とトロンビン液を混合させてなるフィブリンゲル、ＮＨＳ化ＣＭデキストリンおよびトレハロース水溶液と炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム水溶液を混合させてなる癒着防止剤などが挙げられる。これらは、例えばボルヒール（登録商標）組織接着用（帝人ファーマ社製）、ベリプラスト（登録商標）組織接着用（CSLベーリング社製）、アドスプレー（登録商標）（テルモ社製）として商業的に入手可能であり、本発明において使用することができる。 In one aspect of the present invention, when a gel is used as a scaffold, the gel is an in vivo degradable gel, which is degraded in vivo, absorbed into the body, metabolized and excreted. For example, a fibrin gel obtained by mixing a fibrinogen solution and a thrombin solution, an adhesion inhibitor formed by mixing an aqueous solution of NHS-modified CM dextrin and trehalose with an aqueous solution of sodium carbonate and an aqueous solution of sodium hydrogen carbonate can be mentioned. These are commercially available, for example, for Bolheel (registered trademark) tissue bonding (Teijin Pharma Limited), Veriplast (registered trademark) tissue bonding (CSL Bering), and Adspray (registered trademark) (Termo). It is possible and can be used in the present invention.
本開示は、移植片を２５℃以上でインキュベートするステップを含む。インキュベート時間は、シート状細胞培養物の活性が低下しなければ、特に限定されず、約１時間〜約９６時間、好ましくは約４時間〜約７２時間、より好ましくは約５時間〜約７２時間、さらに好ましくは約８時間〜約４８時間である。 The disclosure includes the step of incubating the implant at 25 ° C. or higher. The incubation time is not particularly limited as long as the activity of the sheet-like cell culture does not decrease, and is not particularly limited, and is about 1 hour to about 96 hours, preferably about 4 hours to about 72 hours, and more preferably about 5 hours to about 72 hours. , More preferably from about 8 hours to about 48 hours.
インキュベート温度も移植片の活性が低下しなければ特に限定されず、例えば、約２０℃〜約４５℃である。インキュベート温度の下限値は、例えば約２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、約２６℃以上、約２７℃以上、約２８℃以上、約２９℃以上、約３０℃以上、約３１℃以上、約３２℃以上、約３３℃以上、約３４℃以上、約３５℃以上、約３６℃以上、約３７℃以上、約３８℃以上、約３９℃以上、約４０℃以上、約４１℃以上、約４２℃以上、約４３℃以上、約４４℃以上、約４５℃以上である。 The incubation temperature is also not particularly limited as long as the activity of the implant does not decrease, and is, for example, about 20 ° C to about 45 ° C. The lower limit of the incubation temperature is, for example, about 20 ° C or higher, 21 ° C or higher, 22 ° C or higher, 23 ° C or higher, 24 ° C or higher, 25 ° C or higher, about 26 ° C or higher, about 27 ° C or higher, about 28 ° C or higher, about 29. ℃ or more, about 30 ℃ or more, about 31 ℃ or more, about 32 ℃ or more, about 33 ℃ or more, about 34 ℃ or more, about 35 ℃ or more, about 36 ℃ or more, about 37 ℃ or more, about 38 ℃ or more, about 39 ° C. or higher, about 40 ° C. or higher, about 41 ° C. or higher, about 42 ° C. or higher, about 43 ° C. or higher, about 44 ° C. or higher, about 45 ° C. or higher.
インキュベート温度の上限値は、例えば約２６℃以下、約２７℃以下、約２８℃以下、約２９℃以下、約３０℃以下、約３１℃以下、約３２℃以下、約３３℃以下、約３４℃以下、約３５℃以下、約３６℃以下、約３７℃以下、約３８℃以下、約３９℃以下、約４０℃以下、約４１℃以下、約４２℃以下、約４３℃以下、約４４℃以下、約４５℃以下であり、好ましくは３９℃以下であり、上記例示した上限値および下限値の任意の組み合わせなどが挙げられる。
すなわち例えば、約２０℃〜約４５℃、約２５℃〜〜約４５℃、約２６℃〜約４４℃、２７℃〜約４３℃、２８〜４２℃、約２９℃〜約４１℃、約３０℃〜約４０℃、約３１℃〜約３９℃、約３２℃〜約３８℃、約３３℃〜約３７℃、約３４℃〜約３６℃、好ましくは２７℃〜約４３℃、より好ましくは約３０℃〜約４０℃、さらに好ましくは約３２℃〜約３９℃、一層好ましくは約３３℃〜約３９℃、特に好ましくは約３４℃〜約３９℃である。
The upper limit of the incubation temperature is, for example, about 26 ° C. or lower, about 27 ° C. or lower, about 28 ° C. or lower, about 29 ° C. or lower, about 30 ° C. or lower, about 31 ° C. or lower, about 32 ° C. or lower, about 33 ° C. or lower, about 34. ℃ or less, about 35 ℃ or less, about 36 ℃ or less, about 37 ℃ or less, about 38 ℃ or less, about 39 ℃ or less, about 40 ℃ or less, about 41 ℃ or less, about 42 ℃ or less, about 43 ℃ or less, about 44 ° C. or lower, about 45 ° C. or lower, preferably 39 ° C. or lower, and any combination of the above-exemplified upper limit value and lower limit value can be mentioned.
That is, for example, about 20 ° C. to about 45 ° C., about 25 ° C. to about 45 ° C., about 26 ° C. to about 44 ° C., 27 ° C. to about 43 ° C., 28 to 42 ° C., about 29 ° C. to about 41 ° C., about 30. ° C to about 40 ° C, about 31 ° C to about 39 ° C, about 32 ° C to about 38 ° C, about 33 ° C to about 37 ° C, about 34 ° C to about 36 ° C, preferably 27 ° C to about 43 ° C, more preferably. It is about 30 ° C. to about 40 ° C., more preferably about 32 ° C. to about 39 ° C., more preferably about 33 ° C. to about 39 ° C., and particularly preferably about 34 ° C. to about 39 ° C.
本発明の２５℃以上でインキュベートするステップは、移植片の製造後であれば、どのようなタイミングで行なってもよく、例えば移植片の製造直後から行なってもよいし、移植片を例えば４℃で保存後、例えば当該移植片を異なる施設へ移送する際に行なっても、移送後の施設内で行なってもよいが、製造直後から持続的に行なうことが好ましい。
本発明の一態様において、インキュベートするステップの前にゲル層を形成するステップを加える場合、ゲル層を形成するステップは、移植片を例えば４℃で保存する前に行なうことが好ましい。
The step of incubating at 25 ° C. or higher in the present invention may be performed at any timing after the production of the implant, for example, immediately after the production of the implant, or the implant may be performed at, for example, 4 ° C. After storage in, for example, it may be carried out when the graft is transferred to a different facility, or it may be carried out in the facility after the transfer, but it is preferably carried out continuously immediately after production.
In one aspect of the invention, if the step of forming the gel layer is added before the step of incubating, the step of forming the gel layer is preferably performed before storing the implant, for example, at 4 ° C.
本発明に用いる移植片は、基材（例えば培養基材）に接着したままであっても移植片が、基材から剥離されていてもよい。移植片が基材に接着したままであれば、当該基材へ（当該基材が容器表面である場合は容器へ）任意の媒体を添加した後にインキュベートするステップを行なうことができ、移植片が、基材から剥離されていれば、移植片を収容した容器へ媒体を添加した後に、行なうことができる。
媒体は、移植片を構成する細胞の生存を維持できる媒体であれば特に限定されず、例えば、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地をベースにしたものなどを使用してもよい。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。媒体は、通常血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等）、種々の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等）などの添加物を含んでもよい。好ましい媒体は、ＤＭＥＭであり、１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭが特に好ましい。
The implant used in the present invention may remain adhered to a substrate (for example, a culture substrate) or the implant may be detached from the substrate. If the implant remains adhered to the substrate, the step of adding any medium to the substrate (to the container if the substrate is the surface of the container) and then incubating can be performed and the implant can be used. If it is peeled off from the substrate, it can be carried out after adding the medium to the container containing the implant.
The medium is not particularly limited as long as it can maintain the survival of the cells constituting the implant, and includes, for example, physiological saline, various physiological buffer solutions (for example, PBS, WBSS, etc.), and basics for various cell cultures. A medium-based one may be used. Such basal medium is not limited to, for example, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM. / F12 and the like are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known. The basal medium may be used as it has a standard composition (for example, as it is on the market), or the composition may be appropriately changed depending on the cell type and cell conditions. The vehicle may also include additives such as normal serum (eg, fetal bovine serum (FBS) and other bovine serum, horse serum, human serum, etc.) and various growth factors (eg, FGF, EGF, VEGF, HGF, etc.). Good. A preferred medium is DMEM, with DMEM containing 10% FBS being particularly preferred.
本発明の方法は、移植片のサイトカイン能や増殖能などの活性を維持または増強するために行なってもよいし、保存や移送などにより活性が低下したシート状細胞培養物等の活性を回復、維持または増強するために行なってもよい。さらに移植片の製造において一部が破損した移植片を修復、例えばゲル層を形成するステップを加えた後に、活性を回復、維持または増強するために行なってもよい。 The method of the present invention may be carried out to maintain or enhance the activity of the graft such as cytokine ability and proliferation ability, and restore the activity of the sheet-shaped cell culture or the like whose activity has decreased due to storage or transfer. It may be done to maintain or enhance. Further, in the production of the implant, it may be carried out to restore, maintain or enhance the activity after repairing the partially damaged implant, for example, adding a step of forming a gel layer.
本発明の方法に供した移植片は、本発明のインキュベートするステップを加えていない移植片（以下、対照移植片と呼ぶ場合がある）より活性が高い。かかる活性としては、限定されずに、例えば、サイトカイン産生能、増殖能、生着能、血管誘導能および組織再生能などが挙げられる。ここで、活性が高いとは、対照移植片の活性を基準として、限定されずに、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上活性が高いことを意味する。 The implant used in the method of the present invention is more active than the implant without the incubation step of the present invention (hereinafter, may be referred to as a control implant). Such activities include, but are not limited to, cytokine-producing ability, proliferation ability, engraftment ability, blood vessel-inducing ability, tissue regeneration ability, and the like. Here, high activity is not limited to, based on the activity of the control graft, and is, for example, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60. % Or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, 200% or more, 300% or more, 400% or more.
本発明の一態様において、サイトカインは、移植片の移植先の組織への生着に有益なものである。本発明の一態様において、サイトカインは、血管新生に有益なものである。本発明の一態様において、サイトカインは、骨髄間葉系幹細胞の誘導に有益なものである。本発明の一態様において、サイトカインは、組織の再生に有益なものである。このようなサイトカインは当該技術分野において知られており、当業者は既知の情報をもとに、適切なサイトカインを決定することができる。本発明の一態様において、サイトカインは成長因子を含む。本発明の一態様において、サイトカインはＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ、ＳＣＦからなる群から選択される。したがって、本発明の一態様において、サイトカイン産生能は、成長因子の産生能である。また、本発明の一態様において、サイトカイン産生能は、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ、ＳＣＦからなる群から選択される成長因子の産生能である。 In one aspect of the invention, cytokines are beneficial for engraftment of the implant in the tissue to which it is transplanted. In one aspect of the invention, cytokines are beneficial for angiogenesis. In one aspect of the invention, cytokines are beneficial for the induction of bone marrow mesenchymal stem cells. In one aspect of the invention, cytokines are beneficial for tissue regeneration. Such cytokines are known in the art and those skilled in the art can determine appropriate cytokines based on known information. In one aspect of the invention, cytokines include growth factors. In one aspect of the invention, the cytokine is selected from the group consisting of VEGF, HGF, SDF-1, FGF, SCF. Therefore, in one aspect of the present invention, the cytokine-producing ability is the growth factor-producing ability. Further, in one aspect of the present invention, the cytokine-producing ability is the ability to produce a growth factor selected from the group consisting of VEGF, HGF, SDF-1, FGF, and SCF.
移植片の活性は種々の手法を用いて定量化することができる。活性がサイトカイン産生能であれば、例えば、本発明の方法により得られた移植片を所定の培養液中で所定時間培養し、培養液に分泌されたサイトカインの量を測定したり、移植片に発現されたサイトカイン遺伝子の量を測定することなどにより、サイトカイン産生能を定量化できる。特定のタンパク質の量や遺伝子発現のレベルを測定する手法は、当該技術分野において公知の方法を使用することができる。 Graft activity can be quantified using a variety of techniques. If the activity is cytokine-producing ability, for example, the graft obtained by the method of the present invention is cultured in a predetermined culture solution for a predetermined time, and the amount of cytokine secreted in the culture solution is measured, or the implant piece is used. Cytokine-producing ability can be quantified by measuring the amount of expressed cytokine gene. As a method for measuring the amount of a specific protein or the level of gene expression, a method known in the art can be used.
活性が、増殖能である場合、例えば、本発明の方法により得られた移植片を構成する移植片中の生細胞数を測定したり、培養液中で所定時間保存した際の移植片、例えば移植片に占める生残細胞数を測定することなどにより、増殖能を定量化できる。移植片の生細胞数を測定する手法は、当該技術分野において公知の方法を使用することができる。 When the activity is proliferative, for example, the number of viable cells in the graft constituting the graft obtained by the method of the present invention is measured, or the graft when stored in a culture medium for a predetermined time, for example. Proliferative ability can be quantified by measuring the number of surviving cells in the graft. As a method for measuring the number of viable cells of the graft, a method known in the art can be used.
活性が生着能である場合は、移植片、シート状細胞培養物を組織に適用し、所定時間経過後に適用された移植片の状態、例えば、組織への接着、残存する移植片のサイズ、色、形態などを観察し、これらをスコア化することなどにより、生着能を定量化できる。活性が血管誘導能である場合は、移植片を組織に適用し、所定時間経過後に適用された移植片および適用部位の組織の状態、例えば、血管新生の有無などを観察し、これらをスコア化することなどにより、血管誘導能を定量化できる。また、活性が組織再生能である場合は、移植片を組織に適用し、所定時間経過後に、適用部位（移植先）の組織の状態、例えば、組織のサイズ、組織の微細構造、損傷組織と正常組織との割合、骨髄間葉系幹細胞の心筋細胞の誘導の程度、組織の機能などを観察し、これらをスコア化することなどにより、組織再生能を定量化できる。 If the activity is engraftment, the graft, sheet-like cell culture, is applied to the tissue and the condition of the graft applied after a predetermined period of time, eg, adhesion to the tissue, size of the remaining graft, Engraftment ability can be quantified by observing color, morphology, etc. and scoring these. If the activity is vascular inducibility, the graft is applied to the tissue, and after a lapse of a predetermined time, the condition of the applied graft and the tissue at the application site, for example, the presence or absence of angiogenesis, is observed and scored. By doing so, the blood vessel inducing ability can be quantified. When the activity is tissue regeneration ability, the graft is applied to the tissue, and after a lapse of a predetermined time, the state of the tissue at the application site (transplant destination), for example, the size of the tissue, the microstructure of the tissue, and the damaged tissue. Tissue regeneration ability can be quantified by observing the ratio of bone marrow mesenchymal stem cells to normal tissue, the degree of induction of myocardial cells of bone marrow mesenchymal stem cells, tissue function, and the like, and scoring these.
本発明の一態様において、スキャフォールドを有する移植片は、本発明の方法によるインキュベートするステップと同じ条件で、インキュベートするステップを加えたスキャフォールドを有しない移植片に比べて、撚れおよび／または縮みが生じにくい。
本開示において、移植片の「撚れ」および「縮み」は、それぞれ移植片（例えばシート状細胞培養物）の外縁部が撚れたり、移植片が丸まったりすることを意味する。かかる「撚れ」および「縮み」は、細胞間接着力の作用によるもののほか、移送作業により物理的に生ずる皺や折れ重なりを含む。「撚れ」および「縮み」の程度は、例えば、移植片の形、サイズ、形態などを公知の方法で観察し、これらをスコア化することなどにより定量化してよい。
In one aspect of the invention, the scaffolded graft is twisted and / or compared to the scaffold-free graft with the addition of the incubating step under the same conditions as the incubating step according to the method of the invention. Less likely to shrink.
In the present disclosure, "twisting" and "shrinking" of the implant mean that the outer edge of the implant (eg, sheet-like cell culture) is twisted or the implant is curled, respectively. Such "twisting" and "shrinking" include wrinkles and folds that are physically caused by the transfer operation, as well as due to the action of cell-cell adhesive force. The degree of "twist" and "shrinkage" may be quantified by, for example, observing the shape, size, morphology, etc. of the implant by a known method and scoring these.
一態様において、本発明の方法はその全ステップがin vitroで行われる。別の態様において、本発明の製造方法は、in vivoで行われるステップ、限定されずに、例えば、対象から細胞または細胞の供給源となる組織を採取するステップを含む。一態様において、本発明の方法はその全ステップが無菌条件下で行われる。 In one aspect, the method of the invention is performed in vitro in all steps thereof. In another aspect, the production method of the present invention comprises a step performed in vivo, including, but not limited to, the step of collecting, for example, cells or tissue from which the cells are sourced from a subject. In one aspect, the method of the invention is performed under sterile conditions in all steps.
＜活性の高い移植片の製造方法＞
本発明の別の側面は、本発明の方法を含む移植片の製造方法により得られた移植片に関する。
本発明の一態様において、移植片の製造は、例えば細胞を基材上に播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、２５℃以上でインキュベーするステップを含むが、これに限定されない。
さらにシート化するステップの後に、シート化した移植片を剥離するステップを行った後、インキュベートするステップを行なってもよいし、移植片が培養基材上に接着したままインキュベートするステップを行なってもよい。さらに播種した細胞をシート化するステップの後に移植片へゲル層を形成するステップを行なってもよい。この場合、剥離後または基材上に接着したままゲル層を形成するステップを行なってもよい。
<Manufacturing method of highly active graft>
Another aspect of the invention relates to the implants obtained by methods of making the implants, including the methods of the invention.
In one aspect of the invention, the production of the implant includes, but is not limited to, for example, a step of seeding the cells on a substrate, a step of sheeting the seeded cells, and a step of incubating at 25 ° C. or higher.
Further, after the step of sheeting, the step of peeling the sheeted implant may be performed, and then the step of incubating may be performed, or the step of incubating while the implant is adhered to the culture substrate may be performed. Good. Further, a step of forming a gel layer on the implant may be performed after the step of sheeting the seeded cells. In this case, the step of forming the gel layer after peeling or while adhering to the substrate may be performed.
本発明の一態様において、移植片の製造は、例えば細胞、細胞塊および/またはシート状細胞培養物を基材上に間隙を介して配置するステップ、該細胞間の間隙をゲルで埋めてシート状にするステップ、２５℃以上でインキュベーするステップを含むが、これに限定されない。
本発明の更なる別の態様において、移植片の製造は、例えば細胞、細胞塊および/またはシート状細胞培養物を基材上に沈降させるステップ、細胞、細胞塊および/またはシート状細胞培養物をゲルによりシート状に成形するステップ、２５℃以上でインキュベーするステップを含むが、これに限定されない。
かかる態様において、前記ゲルで埋めてシート状にするステップまたはシート状細胞培養物をゲルによりシート状に成形するステップの後に、シート化した移植片を剥離するステップを行った後、インキュベートするステップを行なってもよいし、移植片が培養基材上に接着したままインキュベートするステップを行なってもよい。
これら各ステップは、種々の移植片の製造の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。本発明の方法は、移植片を製造するステップをさらに含んでもよく、その場合、移植片を製造するステップは、任意の１または２以上のステップを含んでもよい。
In one aspect of the invention, the preparation of the implant is, for example, the step of placing cells, cell clusters and / or sheet cell cultures on a substrate through gaps, filling the gaps between the cells with gel and sheeting. It includes, but is not limited to, a step of shaping and a step of incubating at 25 ° C. or higher.
In yet another aspect of the invention, the production of the implant is, for example, a step of sedimenting a cell, cell mass and / or sheet cell culture onto a substrate, a cell, cell mass and / or sheet cell culture. Is included, but is not limited to, a step of forming a sheet by gel and a step of incubating at 25 ° C. or higher.
In such an embodiment, a step of filling with the gel to form a sheet or a step of forming a sheet-like cell culture into a sheet by a gel is performed, followed by a step of peeling the sheeted implant and then incubating. This may be done, or the step of incubating with the implant adhered to the culture substrate may be performed.
Each of these steps can be performed by any known technique suitable for the manufacture of various implants. The method of the present invention may further include the step of producing the implant, in which case the step of producing the implant may include any one or more steps.
移植片の製造に使用し得る基材、例えば培養基材は、細胞がその上で移植片を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質および／または形状の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。 The substrate that can be used in the production of the implant, such as the culture substrate, is not particularly limited as long as the cells can form the implant on it, for example, containers and containers of various materials and / or shapes. Includes solid or semi-solid surfaces inside. The container preferably has a structure / material that does not allow a liquid such as a culture solution to permeate. Such materials include, without limitation, for example, polyethylene, polypropylene, Teflon®, polyethylene terephthalate, polymethylmethacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, polyacrylamide, polydimethyl. Acrylamide, metals (eg, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass) and the like can be mentioned. Also, the container preferably has at least one flat surface. Examples of such a container include, without limitation, a culture container having a bottom surface made of a base material capable of forming a cell culture and a liquid-impermeable side surface. Specific examples of such a culture vessel include, but are not limited to, a cell culture dish, a cell culture bottle, and the like. The bottom surface of the container may be transparent or opaque. If the bottom surface of the container is transparent, cells can be observed and counted from the back side of the container. Further, the container may have a solid or semi-solid surface inside the container. Examples of the solid surface include plates and containers of various materials as described above, and examples of the semi-solid surface include gels and soft polymer matrices. The base material may be produced using the above materials, or a commercially available material may be used.
好ましい基材としては、限定することなく、例えば、移植片の形成に適した、
接着性の表面を有する基材、低接着性の表面を有する基材および／または均一なウェル状構造を有する基材などが挙げられる。具体的には、シート状細胞培養物の形成の場合であれば、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。またスフェロイドの形成の場合であれば、例えば軟寒天、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で架橋した温度応答性ゲル（市販名：メビオールゲル）、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（ポリＨＥＭＡ）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーなどのハイドロゲルなどの非細胞接着性化合物を表面にコーティングした基材および／または均一な凹凸構造を表面に有する基材などが挙げられる。かかる基材もまた市販されている（例えば、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（Ｒ）など）。基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。
Preferred substrates are, for example, suitable for the formation of implants, without limitation.
Examples include a substrate having an adhesive surface, a substrate having a low adhesive surface and / or a substrate having a uniform well-like structure. Specifically, in the case of forming a sheet-like cell culture, for example, a substrate coated with a hydrophilic compound such as corona discharge-treated polystyrene, collagen gel or hydrophilic polymer on the surface thereof, and further, collagen. , Fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan and other extracellular matrix, and base materials coated with cell adhesion factors such as cadoherin family, selectin family and integrin family on the surface. In addition, such substrates are commercially available (eg, Corning (R) TC-Treated Culture Dish, Corning, etc.). In the case of spheroid formation, for example, soft agar, temperature-responsive gel obtained by cross-linking poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) with polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethyl methacrylate (commercially available name: mebiol gel), polyhydroxyethyl methacrylate ( Examples include a base material coated with a non-cell adhesive compound such as a hydrogel such as poly-HEMA) and 2-methacryloyloxyethyl phosphorischoline (MPC) polymer and / or a base material having a uniform uneven structure on the surface. Be done. Such substrates are also commercially available (eg, EZSPHERE (R), etc.). The substrate may be transparent or opaque in whole or in part.
基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２−２１１８６５、特開２００３−３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、株式会社セルシードのUpCell（登録商標）やＤＩＣ株式会社のCepallet（登録商標））、これらを本発明において使用することができる。 The surface of the base material may be coated with a material whose physical properties change in response to a stimulus, for example, temperature or light. Such materials include, but are not limited to, for example, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, etc. N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacryl (Amid, etc.), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethylmethylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, etc.), and having cyclic groups (eg, Meta) Acrylamide derivatives (eg 1- (1-oxo-2-propenyl) -pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-propenyl) -piperidin, 4- (1-oxo-2-propenyl) -morpholin, 1 -(1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -piperidin, 4- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -A temperature-responsive material consisting of a homopolymer or copolymer of a vinyl ether derivative (eg, methylvinyl ether) or a homopolymer or copolymer of a vinyl ether derivative (eg, methylvinyl ether), a photoabsorbable polymer having an azobenzene group, a vinyl derivative of triphenylmethane leucohydrooxide and an acrylamide-based single amount. Known materials such as a copolymer with a body and a photoresponsive material such as N-isopropylacrylamide gel containing spirobenzopyran can be used (see, for example, JP-A-2-21186 and JP-A-2003-33177). ). By giving a predetermined stimulus to these materials, their physical characteristics, for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and the exfoliation of the cell culture adhering on the material can be promoted. Culture dishes coated with a temperature-responsive material are commercially available (for example, UpCell® from CellSeed Corporation and Cepallet® from DIC Corporation), and these can be used in the present invention.
基材は、種々の形状であってもよい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２〜約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。培養表面は平坦であってもよいし、凹凸構造を有していてもよい。凹凸構造を有する場合、均一な凹凸構造であることが好ましい。 The base material may have various shapes. The area thereof is not particularly limited, but may be, for example, about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , about 3 cm 2 to about 50 cm 2 . For example, a circular culture dish having a diameter of 10 cm can be mentioned as a base material. In this case, the area is 56.7 cm 2 . The culture surface may be flat or may have an uneven structure. When it has a concavo-convex structure, it is preferable that it has a uniform concavo-convex structure.
基材は血清でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。血清でコートされた基材を用いることにより、より高密度の移植片、特にシート状細胞培養物を形成することができる。「血清でコートされている」とは、基材の表面に血清成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、基材を血清で処理することにより得ることができる。血清による処理は、血清を基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。 The substrate may be coated (coated or coated) with serum. By using a serum-coated substrate, higher density implants, especially sheet cell cultures, can be formed. "Coated with serum" means a state in which serum components are attached to the surface of the base material. Such a state can be obtained without limitation, for example, by treating the substrate with serum. Treatment with serum involves contacting the serum with the substrate and, if necessary, incubating for a predetermined period of time.
血清としては、異種血清および／または同種血清を用いることができる。異種血清は、移植片、特にシート状細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。 As the serum, heterologous serum and / or allogeneic serum can be used. Heterologous serum means serum derived from an organism of a species different from its recipient when a graft, especially a sheet cell culture, is used for transplantation. For example, when the recipient is human, serum derived from bovine or horse, for example, fetal bovine serum (FBS, FCS), calf serum (CS), horse serum (HS), etc. corresponds to heterologous serum. In addition, "homogeneous serum" means serum derived from an organism of the same species as the recipient. For example, if the recipient is human, human serum corresponds to allogeneic serum. Allogeneic sera include autologous sera (also referred to as autologous sera), that is, sera derived from the recipient and allogeneic sera derived from allogeneic individuals other than the recipient. In the present specification, sera other than autologous serum, that is, allogeneic serum and allogeneic serum may be collectively referred to as non-autologous serum.
基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で約２０分〜約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ〜約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。 Serum for coating the substrate can be commercially available or prepared by routine from blood collected from the desired organism. Specifically, for example, a method in which the collected blood is left at room temperature for about 20 minutes to about 60 minutes to coagulate, and this is centrifuged at about 1000 × g to about 1200 × g, and the supernatant is collected. And so on.
基材上でインキュベートする場合、血清は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７など）等で行うことができる。希釈濃度は、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％〜約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％〜約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）である。 When incubating on a substrate, serum may be used as a stock solution or diluted. Dilution can be made in any medium, such as, but not limited to, water, saline, various buffers (eg, PBS, HBSS, etc.), various liquid media (eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, etc.). It can be performed in DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, etc.). The dilution concentration is not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, and is, for example, about 0.5% to about 100% (v / v), preferably about 1% to about 60% (v / v). v), more preferably about 5% to about 40% (v / v).
インキュベート時間も、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約１時間〜約７２時間、好ましくは約２時間〜約４８時間、より好ましくは約２時間〜約２４時間、さらに好ましくは約２時間〜約１２時間である。インキュベート温度も、血清成分が基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０℃〜約６０℃、好ましくは約４℃〜約４５℃、より好ましくは室温〜約４０℃である。 The incubation time is also not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, for example, about 1 hour to about 72 hours, preferably about 2 hours to about 48 hours, more preferably about 2 hours to about 24 hours. The time, more preferably about 2 hours to about 12 hours. The incubation temperature is also not particularly limited as long as the serum component can adhere to the substrate, for example, at about 0 ° C. to about 60 ° C., preferably about 4 ° C. to about 45 ° C., more preferably room temperature to about 40 ° C. is there.
インキュベート後に血清を廃棄してもよい。血清の廃棄手法としては、ピペットなどによる吸引や、デカンテーションなどの慣用の液体廃棄手法を用いることができる。本開示の好ましい態様においては、血清廃棄後に、基材を無血清洗浄液で洗浄してもよい。無血清洗浄液としては、血清を含まず、基材に付着した血清成分に悪影響を与えない液体媒体であれば特に限定されず、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７など）等で行うことができる。洗浄手法としては、慣用の基材洗浄手法、例えば、限定することなく、基材上に無血清洗浄液を加えて所定時間（例えば、約５秒〜約６０秒間）撹拌後、廃棄する手法などを用いることができる。 Serum may be discarded after incubation. As a serum disposal method, suction with a pipette or the like or a conventional liquid disposal method such as decantation can be used. In a preferred embodiment of the present disclosure, the substrate may be washed with a serum-free wash after serum disposal. The serum-free cleaning solution is not particularly limited as long as it is a liquid medium that does not contain serum and does not adversely affect the serum components adhering to the substrate. (Eg, PBS, HBSS, etc.), various liquid media (eg, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, etc.) can be used. Examples of the cleaning method include a conventional substrate cleaning method, for example, a method in which a serum-free cleaning solution is added onto the substrate, stirred for a predetermined time (for example, about 5 seconds to about 60 seconds), and then discarded without limitation. Can be used.
本開示において、基材を、成長因子でコートしてもよい。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。成長因子による基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、例えば、約０．０００１μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０００５μｇ／ｍＬ〜約０．０５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ〜約０．０１μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。 In the present disclosure, the substrate may be coated with a growth factor. Here, "growth factor" means any substance that promotes cell growth as compared to its absence, eg, epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblasts. Includes cell growth factor (FGF) and the like. In the growth factor coating method, disposal method and washing method, the dilution concentration during incubation is, for example, about 0.0001 μg / mL to about 1 μg / mL, preferably about 0.0005 μg / mL to about 0.05 μg. It is basically the same as serum except that it is / mL, more preferably about 0.001 μg / mL to about 0.01 μg / mL.
本開示において、基材を、ステロイド剤でコートしてもよい。ここで「ステロイド剤」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。ステロイド剤による基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、デキサメタゾンとして、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．４μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。 In the present disclosure, the substrate may be coated with a steroid. Here, the "steroid agent" refers to a compound having a steroid nucleus that can adversely affect the living body such as adrenocortical insufficiency and Cushing's syndrome. Such compounds include, but are not limited to, for example, cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone and the like. In the substrate coating method, disposal method and washing method using a steroid agent, the dilution concentration at the time of incubation is, for example, about 0.1 μg / mL to about 100 μg / mL, preferably about 0.4 μg / mL to about as dexamethasone. It is basically the same as serum except that it is 40 μg / mL, more preferably about 1 μg / mL to about 10 μg / mL.
基材は、血清、成長因子およびステロイド剤のいずれか１つでコートしても、これらの任意の組合わせ、すなわち、血清と成長因子、血清とステロイド剤、血清と成長因子とステロイド剤、または、成長因子とステロイド剤の組合わせでコートしてもよい。複数の成分でコートする場合、これらの成分を混合して同時にコートしてもよいし、別々のステップでコートしてもよい。 The substrate may be coated with any one of serum, growth factors and steroids and any combination of these, ie serum and growth factors, serum and steroids, serum and growth factors and steroids, or , May be coated with a combination of growth factors and steroids. When coating with a plurality of components, these components may be mixed and coated at the same time, or may be coated in separate steps.
本発明の製造方法に用いる培養液は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。しかしながら、本発明の製造方法に用いる場合は、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。 The culture medium used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it can maintain the survival of cells, but typically, those containing amino acids, vitamins, and electrolytes as main components can be used. In one aspect of the invention, the culture medium is based on a basal medium for cell culture. Such basal medium is not limited to, for example, DMEM, MEM, F12, DMEM / F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80. -7 and so on are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known. However, when used in the production method of the present invention, the composition may be appropriately changed according to the cell type and cell conditions.
基材上に移植片形成細胞を含む細胞を播種する。移植片形成細胞は、移植片（例えばシート状細胞培養物）を構成し得る細胞として上述した細胞であれば特に限定されない。細胞には、少なくとも１種の移植片形成細胞（例えばシート形成細胞）が含まれるが、２種以上の移植片形成細胞を含んでもよいし、移植片形成細胞以外の細胞を含んでもよい。本開示の別の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種の移植片形成細胞は心筋細胞である。かかる態様において、細胞にはさらに血管内皮細胞が含まれ得る。すなわち、心筋細胞と血管内皮細胞を移植片形成細胞として含む移植片が挙げられる。本開示の別の態様において線維芽細胞や血管内皮細胞および／または壁細胞などを移植片形成細胞として含み、例えば、移植片中に心筋細胞約３０〜７０％、血管内皮細胞０．１％〜約２０％、および壁細胞約１％〜約４０％であってもよい。本開示のさらに別の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種の移植片形成細胞は、間葉系幹細胞である。かかる態様において、細胞にはさらに血管内皮細胞が含まれ得る。 Cells containing graft-forming cells are seeded on the substrate. The graft-forming cell is not particularly limited as long as it is a cell described above as a cell that can constitute a graft (for example, a sheet-like cell culture). The cell includes at least one type of graft-forming cell (for example, sheet-forming cell), but may include two or more types of graft-forming cells, or may contain cells other than the graft-forming cells. In another aspect of the disclosure, the at least one graft-forming cell included in the cell population is a cardiomyocyte. In such an embodiment, the cells may further include vascular endothelial cells. That is, a graft containing cardiomyocytes and vascular endothelial cells as a graft-forming cell can be mentioned. In another aspect of the present disclosure, fibroblasts, vascular endothelial cells and / or parietal cells and the like are included as implant-forming cells, for example, about 30-70% of myocardial cells and 0.1% of vascular endothelial cells in the implant. It may be about 20% and about 1% to about 40% parietal cells. In yet another aspect of the disclosure, the at least one graft-forming cell included in the cell population is a mesenchymal stem cell. In such an embodiment, the cells may further include vascular endothelial cells.
播種される細胞密度は、移植片を形成し得る密度であれば特に限定されないが、好ましい態様において、細胞集団はコンフルエントに達する密度またはそれ以上の密度で播種される。本開示において、「コンフルエントに達する密度」とは、細胞を播種した際に、播種された細胞により、培養容器の接着表面一面が隙間なく覆われることが想定される程度の密度を指す。例えば、播種した際に、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度である。 The cell density to be seeded is not particularly limited as long as it can form a graft, but in a preferred embodiment, the cell population is seeded at a density reaching confluence or higher. In the present disclosure, the “density reaching confluence” refers to a density at which it is assumed that when cells are seeded, the seeded cells cover the entire adhesive surface of the culture vessel without gaps. For example, the density at which cells are expected to come into contact with each other when seeded, the density at which contact inhibition occurs, or the density at which cell proliferation is substantially stopped by contact inhibition.
細胞集団の播種密度の非限定例は、約７．１×１０５個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２〜約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２〜約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２〜約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２〜約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２〜約１．８×１０６個／ｃｍ２、約９．０×１０５個／ｃｍ２〜約１．６×１０６個／ｃｍ２などの密度を含む。なお、これらの密度は、特段の記載がない限り、細胞集団に含有される全ての細胞の密度であることとする。 Non-limiting examples of seeding density of the cell population are about 7.1 × 10 5 cells / cm 2 to about 3.0 × 10 6 cells / cm 2 , about 7.3 × 10 5 cells / cm 2 to about 2. 8 x 10 6 pieces / cm 2 , about 7.5 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.5 x 10 6 pieces / cm 2 , about 7.5 x 10 5 pieces / cm 2 to about 3.0 x 10 6 pieces / cm 2 , about 7.8 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.3 x 10 6 pieces / cm 2 , about 8.0 x 10 5 pieces / cm 2 to about 2.0 x 10 6 Pieces / cm 2 , about 8.5 x 10 5 pieces / cm 2 to about 1.8 x 10 6 pieces / cm 2 , about 9.0 x 10 5 pieces / cm 2 to about 1.6 x 10 6 pieces / cm Includes densities such as cm 2. Unless otherwise specified, these densities are the densities of all cells contained in a cell population.
さらに別の態様において、播種は、成長因子を実質的に含まない細胞培養液において、細胞集団に含まれ得る少なくとも１種の移植片形成細胞が実質的に増殖しない密度で行うことができる。かかる態様において、細胞集団に含まれ得る他の細胞は、増殖抑制を受けながらも、増殖可能な密度であり得る。本開示の方法に用いられる基材は、上述のとおりである。好ましい一態様において、基材は血清で被覆されていてよい。別の好ましい一態様において、基材は温度応答性材料で被覆されていてよい。さらに好ましい一態様において、基材は温度応答性材料及び血清で被覆されていてよい。 In yet another embodiment, seeding can be performed in a cell culture medium that is substantially free of growth factors at a density at which at least one graft-forming cell that can be contained in the cell population does not substantially proliferate. In such an embodiment, the other cells that may be included in the cell population may have a proliferative density while undergoing growth inhibition. The base material used in the method of the present disclosure is as described above. In a preferred embodiment, the substrate may be coated with serum. In another preferred embodiment, the substrate may be coated with a temperature responsive material. In a more preferred embodiment, the substrate may be coated with a temperature responsive material and serum.
＜キット＞
本発明の別の側面において、移植片の製造、とくに増殖培養を経ない移植片の製造に用いる一部またはすべての要素を含む、移植片の製造するためのキットに関する。
本発明のキットは、限定されずに、例えば、ゲル層を形成するステップに用いられるゲルを形成するための材料、例えばフィブリンを含む溶液およびトロンビンを含む溶液のほか移植片を構成する細胞（例えば、凍結保存細胞、本発明の回収方法により回収された細胞等）、培養液、培養皿、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、移植片の製造方法に関する指示（例えば、使用説明書、製造方法や本発明の凍結保存細胞の回収方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。
<Kit>
In another aspect of the invention, the present invention relates to a kit for producing a implant, which comprises some or all of the elements used in the production of the implant, in particular the production of the implant without growth culture.
The kit of the present invention is not limited to, for example, a material for forming a gel used in the step of forming a gel layer, for example, a solution containing fibrin and a solution containing thrombin, as well as cells constituting the implant (for example, , Cryopreserved cells, cells recovered by the recovery method of the present invention, etc.), culture solution, culture dish, instruments (for example, pipette, dropper, tweezers, etc.), instructions for manufacturing method of implant (for example, instruction manual). , A medium on which information on a production method and a method for recovering cryopreserved cells of the present invention is recorded, for example, a flexible disc, a CD, a DVD, a Blu-ray disc, a memory card, a USB memory, etc.) may be included.
＜活性の高い移植片＞
本発明の別の側面は、本発明の方法により得られた移植片、または、本発明の方法を含む移植片の製造方法により得られた移植片に関する。本発明の一態様において、本開示の製造方法により製造された移植片は、心筋細胞からなる。本発明の別の態様において、本開示の製造方法により製造された移植片は、心筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞および／または壁細胞を含む。
本発明の製造方法により得られた移植片は、対照移植片よりも活性が高いことを特徴とする。活性の高さに関する詳細については上述のとおりである。一態様において、本発明の移植片は、サイトカイン産生能、増殖能、生着能、血管誘導能および組織再生能からなる群から選択される活性が対照移植片のものより高い。また、一態様において、移植片は、ＨＧＦ、ＳＤＦ−１、ＦＧＦ、ＳＣＦ、ＶＥＧＦからなる群から選択されるサイトカインの産生能が対照移植片のものより高い。移植片は、高い活性を有するため、種々の治療用途において、対照移植片よりも優れた効果を示す。特に、ＨＧＦまたはＶＥＧＦの産生能が高いと、組織への生着や血管誘導、組織再生促進され、また増殖能が高いと移植片が長期間、持続的に機能し、治療効果を高めることが可能となる。本発明の一態様において、本発明の製造方法により得られた移植片は、スキャフォールドを有する移植片であり、スキャフォールドを有しない移植片に比べて、撚れおよび／または縮みが生じにくい。したがって、スキャフォールドを有する移植片は、スキャフォールドを有しない対照移植片に対して、組織への生着や血管誘導、組織再生促進作用を長期間、持続的な治療効果を向上するだけでなく、強度が高く、操作性に優れ、患部への適用が容易であり、施術者の熟練度による操作上の差も小さいため、疾患の確実な処置が可能となるため利便性が格段に高い。
<Highly active graft>
Another aspect of the present invention relates to the implant obtained by the method of the present invention or the implant obtained by the method of producing the implant including the method of the present invention. In one aspect of the invention, the implant produced by the production method of the present disclosure comprises cardiomyocytes. In another aspect of the invention, the implant produced by the production method of the present disclosure comprises cardiomyocytes, fibroblasts, endothelial cells and / or parietal cells.
The implant obtained by the production method of the present invention is characterized by having higher activity than the control implant. Details regarding the high activity are as described above. In one aspect, the implant of the present invention has a higher activity selected from the group consisting of cytokine producing ability, proliferation ability, engraftment ability, blood vessel inducing ability and tissue regeneration ability than that of the control implant. Also, in one embodiment, the implant has a higher ability to produce cytokines selected from the group consisting of HGF, SDF-1, FGF, SCF, VEGF than that of the control implant. Due to the high activity of the implant, it is more effective than the control implant in various therapeutic applications. In particular, when the production ability of HGF or VEGF is high, engraftment to tissues, blood vessel induction, and tissue regeneration are promoted, and when the proliferative ability is high, the graft functions continuously for a long period of time and enhances the therapeutic effect. It will be possible. In one aspect of the present invention, the implant obtained by the production method of the present invention is a scaffold-bearing implant, which is less prone to twisting and / or shrinkage than a scaffold-free implant. Therefore, the scaffold-bearing graft not only improves tissue engraftment, vascular induction, and tissue regeneration-promoting effect over a long-term and sustained therapeutic effect on the scaffold-free control graft. The strength is high, the operability is excellent, the application to the affected area is easy, and the difference in operation depending on the skill level of the practitioner is small, so that the disease can be reliably treated, which is extremely convenient.
＜疾患を処置する方法＞
本開示の別の側面は、本開示の方法により得られた移植片または当該方法を含む移植片の製造方法により得られた移植片の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法に関する。処置の対象となる疾患は、上記したとおりである。
<How to treat the disease>
Another aspect of the present disclosure is the application of an effective amount of a graft obtained by the method of the present disclosure or a graft obtained by a method of manufacturing a graft comprising the method to a subject in need thereof. The present invention relates to a method for treating a disease in the subject, including. The diseases to be treated are as described above.
本開示において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 In the present disclosure, the term "treatment" shall include all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at the cure, temporary remission or prevention of a disease. For example, the term "treatment" is medically acceptable for a variety of purposes, including delaying or stopping the progression of a disease associated with a tissue abnormality, regressing or eliminating a lesion, preventing the onset or recurrence of the disease, and the like. Including interventions to be performed.
本開示の処置方法においては、移植片の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示の移植片等と併用することができる。 In the treatment method of the present disclosure, an ingredient that enhances the viability, engraftment and / or function of the implant, other active ingredients useful for treating the target disease, etc. are used in combination with the implant of the present disclosure. be able to.
本開示の処置方法は、本開示の方法に従って、本開示の活性が高められた移植片をさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、移植片を製造するステップの前に、対象から移植片を製造するための細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の供給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、移植片等の投与を受ける対象とは異種の個体である。 The treatment methods of the present disclosure may further comprise a graft with enhanced activity of the present disclosure in accordance with the methods of the present disclosure. The treatment method of the present disclosure serves as a cell (for example, skin cells, blood cells, etc. when using iPS cells) or a source of cells for producing a graft from a subject before the step of producing the graft. It may further include the step of collecting tissue (for example, skin tissue, blood, etc. when using iPS cells). In one embodiment, the subject from which the cell or tissue from which the cell is source is collected is the same individual as the subject to whom the cell culture, composition, implant, or the like is administered. In another embodiment, the subject from which the cell or tissue from which the cell is sourced is harvested is a separate entity of the same species as the subject receiving the administration, such as a cell culture, composition, or implant. In another embodiment, the subject from which the cell or tissue that is the source of the cell is collected is an individual different from the subject to which the implant or the like is administered.
本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズ、重量、枚数等）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。 In the present disclosure, the effective amount is, for example, an amount capable of suppressing the onset or recurrence of a disease, reducing symptoms, or delaying or stopping the progression (for example, size, weight, number of sheet-like cell cultures, etc.). The amount is preferably an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease. In addition, an amount that does not cause an adverse effect exceeding the benefit of administration is preferable. Such an amount can be appropriately determined by, for example, a test in an experimental animal such as a mouse, a rat, a dog or a pig, or a disease model animal, and such a test method is well known to those skilled in the art. In addition, the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining the effective amount.
投与方法としては、例えば、静脈投与、筋肉内投与、骨内投与、髄腔内投与、組織への直接的な適用などが挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、本発明の細胞培養物、組成物、または移植片等を対象の組織に縫合糸やステープルなどの係止手段により固定してもよい。 Examples of the administration method include intravenous administration, intramuscular administration, intraosseous administration, intrathecal administration, and direct application to tissues. The frequency of administration is typically once per treatment, but multiple doses can be administered if the desired effect is not obtained. When applied to a tissue, the cell culture, composition, implant or the like of the present invention may be fixed to the target tissue by a locking means such as a suture or a staple.
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these show specific specific examples of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
以下の実施例において、多能性幹細胞として、京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）で樹立された臨床用ヒトｉＰＳ細胞を用いた。M. Nakagawa et al., Scientific Reports, 4:3594 (2014）を参考に、ヒトｉＰＳ細胞をフィーダーフリー法で維持した。ついで、Miki et al., Ce
ll Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８およびＷＯ２０１７／０３８５６２の記載を参考にして、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導して胚様体を得た。具体的には、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養したヒトｉＰＳ細胞を、EZ Sphere（旭硝子）上で１０μＭのＹ２７６３２（和光純薬）を含有するＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３培地（味の素）中で１日培養し、得られた胚様体をアクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）４および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で培養し、さらにＷｎｔ阻害剤（ＩＷＰ３）およびＢＭＰ４阻害剤（Dorsomorphin）およびＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）を含む培養液中で培養し、その後ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中で培養を行うことで、ｉＰＳ細胞由来のヒト心筋細胞を得た。得られた細胞における心筋細胞の割合は５０％〜９０％であった。
In the following examples, clinical human iPS cells established at the Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University were used as pluripotent stem cells. Human iPS cells were maintained by the feeder-free method with reference to M. Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3594 (2014). Then Miki et al., Ce
With reference to ll Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015 and the description of WO2014 / 185358 and WO2017 / 038562, human iPS cells were induced to differentiate into cardiomyocytes to obtain embryoid bodies. Specifically, human iPS cells maintained and cultured in a culture medium containing no feeder cells are cultured on EZ Sphere (Asahi Glass) for one day in StemFit AK03 medium (Ajinomoto) containing 10 μM Y27632 (Wako Pure Chemical Industries). Then, the obtained embryo-like body was cultured in a culture medium containing Actibin A, bone-forming protein (BMP) 4, and basic fibroblast growth factor (bFGF), and further, Wnt inhibitor (IWP3) and BMP4 inhibition were performed. Human myocardial cells derived from iPS cells were obtained by culturing in a culture medium containing a drug (Dorsomorphin) and a TGFβ inhibitor (SB431542) and then in a culture medium containing VEGF and bFGF. The proportion of cardiomyocytes in the obtained cells was 50% to 90%.
比較例１ シート状細胞培養物の製造
細胞凍結用保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＭＣＤＢ培地）中で凍結保存した心筋細胞を３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む生理緩衝液を用いて２回洗浄した。洗浄した細胞６．０×１０７個を、ヒト血清２０％含有ＤＭＥＭ培地（１０ｍＬ）に懸濁させ、直径１０ｃｍの細胞培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）１０ｃｍディッシュ、ＣＳ３００５、セルシード社製）に播種した。播種後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２に設定されたインキュベーター（ＢＮＡ−１２１Ｄ、エスペック社製）内で２０時間培養した。培養後、培養皿をインキュベーターから取り出し、シート状細胞培養物が、培養皿底面全体を覆うように接着していることを確認し、培地を廃棄した。その後、温度処理（室温（２０〜２５℃）に５〜３０分間静置）およびピペッティングにより、シート状細胞培養物を培養皿から単離した。得られたシート状細胞培養物は４７ｍｍ×４７ｍｍの大きさであった。
Comparative Example 1 Production of sheet-shaped cell culture Cardiomyocytes cryopreserved in a cell freezing storage solution (MCDB medium containing 10% DMSO) were thawed at 37 ° C., and a physiological buffer solution containing 0.5% serum albumin was used. Was washed twice. The washed cells 6.0 × 10 7 were suspended in DMEM medium (10 mL) containing 20% human serum and seeded in a cell culture dish (UpCell (R) 10 cm dish, CS3005, manufactured by Cellseed) having a diameter of 10 cm. .. After seeding, the cells were cultured for 20 hours in an incubator (BNA-121D, manufactured by ESPEC) set at 37 ° C. and 5% CO 2. After culturing, the culture dish was taken out from the incubator, it was confirmed that the sheet-shaped cell culture was adhered so as to cover the entire bottom surface of the culture dish, and the medium was discarded. Then, the sheet-shaped cell culture was isolated from the culture dish by temperature treatment (standing at room temperature (20 to 25 ° C.) for 5 to 30 minutes) and pipetting. The obtained sheet-shaped cell culture had a size of 47 mm × 47 mm.
比較例２ シート状細胞培養物の細胞数およびサイトカイン産生量の測定
比較例１で作成されたシート状細胞培養物を、ハンクス平衡塩溶液およびヒト血清１０％含有ＤＭＥＭ培地に４℃および２５℃で７２時間保存し、その際のシート状細胞培養物を構成する心筋細胞数の変化をCell counting kit8（同仁化学）を使用して確認し、生残細胞率（％）を｛保存後／保存前（４５０ｎｍの吸光度）｝×１００として算出した。図１に生残細胞率の経時変化を示す。
図１に示す結果から、シート状細胞培養物の生残細胞率が経時的に減少することが明らかとなった。生残細胞率は、ハンクス平衡塩溶液で４℃で保存した場合が最も高かった。また３７℃で７２時間保存した場合、縮みが生じた。
Comparative Example 2 Measurement of cell number and cytokine production of sheet-shaped cell culture The sheet-shaped cell culture prepared in Comparative Example 1 was placed in a Hanks equilibrium salt solution and DMEM medium containing 10% human serum at 4 ° C and 25 ° C. After storing for 72 hours, the change in the number of myocardial cells constituting the sheet-shaped cell culture at that time was confirmed using Cell counting kit8 (Dojin Kagaku), and the surviving cell rate (%) was {after storage / before storage. (Absorptivity at 450 nm)} × 100 was calculated. FIG. 1 shows the change over time in the survival cell rate.
From the results shown in FIG. 1, it was clarified that the survival cell rate of the sheet-shaped cell culture decreased with time. The survival cell rate was highest when stored in Hanks balanced salt solution at 4 ° C. Further, when stored at 37 ° C. for 72 hours, shrinkage occurred.
比較例１で作成されたシート状細胞培養物をハンクス平衡塩溶液およびヒト血清１０％含有ＤＭＥＭ培地に４℃および２５℃で９６時間保存し、その際に培養上清中に培養上清中に産生されたサイトカイン（ＶＥＧＦ）の濃度をELISA法により測定した(ｎ＝３)。測定は、Human VEGF Quantikine ELISA Kit(R&D systems、カタログ番号ＤＶＥ００）を用い、製造者のマニュアルに従って行った。図２に示す結果から、経時的にＶＥＧＦの産生量が減少することが分かる。４℃に比べて２５℃での保存することによりＶＥＧＦ産生量の減少が抑制された。 The sheet-shaped cell culture prepared in Comparative Example 1 was stored in a Hanks balanced salt solution and a DMEM medium containing 10% human serum at 4 ° C. and 25 ° C. for 96 hours, and at that time, in the culture supernatant, in the culture supernatant. The concentration of the produced cytokine (VEGF) was measured by the ELISA method (n = 3). The measurement was performed using the Human VEGF Quantikine ELISA Kit (R & D systems, catalog number DVE00) according to the manufacturer's manual. From the results shown in FIG. 2, it can be seen that the amount of VEGF produced decreases over time. The decrease in VEGF production was suppressed by storage at 25 ° C as compared to 4 ° C.
比較例３ シート状細胞培養物の製造
細胞凍結用保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＭＣＤＢ培地）中で凍結保存した心筋細胞を３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む生理緩衝液を用いて２回洗浄した。洗浄した細胞４．０×１０6個を、ヒト血清２０％含有ＤＭＥＭ培地（２ｍＬ）に懸濁させ、１２ウェルの温度応答性基材（ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）１２Ｗｅｌｌ、ＣＳ３００３、セルシード社製）に播種した。播種後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２に設定されたインキュベーター（ＢＮＡ−１２１Ｄ、エスペック社製）内で２０時間培養した。培養後、培養皿をインキュベーターから取り出し、シート状細胞培養物が、培養皿底面全体を覆うように接着していることを確認し、培地を廃棄した。その後、温度処理（室温（２０〜２５℃）に５〜３０分間静置）およびピペッティングにより、シート状細胞培養物を培養皿から単離した。
Comparative Example 3 Production of sheet-shaped cell culture Cardiomyocytes cryopreserved in a cell freezing storage solution (MCDB medium containing 10% DMSO) were thawed at 37 ° C., and a physiological buffer solution containing 0.5% serum albumin was used. Was washed twice. 4.0 x 10 6 washed cells were suspended in DMEM medium (2 mL) containing 20% human serum and seeded on a 12-well temperature-responsive substrate (UpCell (R) 12Well, CS3003, CellSeed). did. After seeding, the cells were cultured for 20 hours in an incubator (BNA-121D, manufactured by ESPEC) set at 37 ° C. and 5% CO 2. After culturing, the culture dish was taken out from the incubator, it was confirmed that the sheet-shaped cell culture was adhered so as to cover the entire bottom surface of the culture dish, and the medium was discarded. Then, the sheet-shaped cell culture was isolated from the culture dish by temperature treatment (standing at room temperature (20 to 25 ° C.) for 5 to 30 minutes) and pipetting.
実施例１ ゲル層が形成されシート状細胞培養物の製造
比較例１と同じ手順でシート状細胞培養物を得た。培養皿中の培養液を除去し、シート状細胞培養物上にフィブリノゲン液（ボルヒール（Ｒ）組織接着用（帝人ファーマ社製）のバイアル１の内容物（フィブリノゲン凍結乾燥粉末）をバイアル２の内容物（フィブリノゲン溶解液）で溶解したもの、フィブリノゲン濃度８０ｍｇ／ｍＬ、以下同じ）を５００μＬ、ボルヒール（Ｒ）組織接着用に付属する調製器セットの２液混合セット（長さ約６ｃｍ、内径約１ｍｍのアプライノズル付、ニプロ社製）を用いて滴下した。次いで、トロンビン液（ボルヒール（Ｒ）組織接着用（帝人ファーマ社製）のバイアル３の内容物（トロンビン凍結乾燥粉末）をバイアル４の内容物（トロンビン溶解液）で溶解したもの、トロンビン濃度２５０単位／ｍＬ、以下同じ）を８００μＬ、ボルヒール（Ｒ）スプレーセット（秋田住友ベーク社製）を用い、噴霧ノズルを細胞シートから約７ｃｍ離して０．０３ＭＰａの圧力で噴霧した。
Example 1 Production of sheet-shaped cell culture in which a gel layer was formed A sheet-shaped cell culture was obtained by the same procedure as in Comparative Example 1. Remove the culture solution in the culture dish, and place the contents of the fibrinogen solution (fibrinogen lyophilized powder) of the fibrinogen solution (for boulder (R) tissue adhesion (manufactured by Teijin Pharma Limited)) on the sheet-shaped cell culture, and the contents of the vial 2. objects obtained by dissolving in (fibrinogen solution), fibrinogen concentration 80 mg / mL, or less the same) 500 [mu] L, Boruhiru (R) 2-liquid mixed set of prepared device sets included for tissue adhesion (length of about 6 cm, an inner diameter of about 1mm Dropped using the above (with an apply nozzle, manufactured by Nipro). Next, the contents (thrombin freeze-dried powder) of the vial 3 of the thrombin solution (for bolhel (R) tissue adhesion (manufactured by Teijin Pharma Limited)) dissolved in the contents of the vial 4 (thrombin solution), the thrombin concentration was 250 units. 800 μL of / mL (the same applies hereinafter), using a Volheel (R) spray set (manufactured by Sumitomo Akita Bake Co., Ltd.), the spray nozzle was sprayed at a pressure of 0.03 MPa at a distance of about 7 cm from the cell sheet.
フィブリノゲン液とトロンビン液との反応により、フィブリンゲルが形成される。約５分間静置後、培養皿に２４ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ（＋）、Cat No.14025、Life Technologies社製、以下同じ）を加え、直ちに除去することにより、シート状細胞培養物を含む培養皿を洗浄した。これにより、未反応のフィブリノゲン液やトロンビン液を除去することができる。次いで、培養皿に２４ｍＬのハンクス平衡塩溶液を再度加えて約１５分間静置後、培養皿中の溶液を除去し、シート状細胞培養物上以外で凝固したフィブリンゲルをスカルペルでトリミングし、フィブリンゲル層を有するシート状細胞培養物を単離した。
単離後のシート状細胞培養物の写真を図３（Ａ）に示す。
The reaction between the fibrinogen solution and the thrombin solution forms a fibrin gel. After allowing to stand for about 5 minutes, add 24 mL of Hanks balanced salt solution (HBSS (+), Cat No. 14025, manufactured by Life Technologies, the same applies hereinafter) to the culture dish and immediately remove the sheet-like cell culture. The containing culture dish was washed. Thereby, the unreacted fibrinogen solution and the thrombin solution can be removed. Next, 24 mL of Hanks balanced salt solution was added to the culture dish again and allowed to stand for about 15 minutes, the solution in the culture dish was removed, and the fibrin gel coagulated except on the sheet-like cell culture was trimmed with a scalpel to form fibrin. Sheet cell cultures with a gel layer were isolated.
A photograph of the sheet-shaped cell culture after isolation is shown in FIG. 3 (A).
実施例２ 細胞間の間隙がゲルで埋められたシート状細胞培養物の製造
細胞保存用保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＭＣＤＢ培地）中で凍結保存したｉＰＳ細胞由来のヒト心筋細胞を３７℃で解凍し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで希釈後、遠心分離し、上清を除去したのち、細胞を２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で、１５ｍＬのヒト血清２０％含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、直径６ｃｍの温度応答性基材（UpCell（登録商標）、６ｃｍディッシュ、ＣＳ３００６、セルシード社製）に播種した。播種後、細胞集団を３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベーター（ＢＮＡ−１２１Ｄ、エスペック社製）内で７２時間培養した。培養後、基材をインキュベーターから取り出し、細胞が基材に接着していることを確認し、培地を廃棄した。
培地の廃棄後、基材上に、５００μｌのフィブリノゲン液（ベリプラスト（登録商標）組織接着用（CSLベーリング社製）のバイアル１の内容物（フィブリノゲン凍結乾燥粉末）をバイアル２の内容物（フィブリノゲン溶解液）で溶解したもの、フィブリノゲン濃度８０ｍｇ／ｍＬ）と、５００μｌのトロンビン液（ベリプラスト（登録商標）組織接着用（CSLベーリング社製）のバイアル３の内容物（トロンビン凍結乾燥粉末）をバイアル４の内容物（トロンビン溶解液）で溶解したもの、トロンビン濃度３００単位／ｍＬ）とを滴下し、約５分静置して、フィブリンゲルを形成した。
フィブリンゲル形成後に、１０ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ（＋）、Cat No.14025、Life Technologies社製）を加えて、３回洗浄し、未反応のフィブリノゲンおよびトロンビンを除去した。その後、温度応答性材料の温度処理のため室温（２０〜２５℃）で５〜３０分間静置し、ピペッティングにより、シート状物を基材から剥離させ、細胞間の間隙がゲルで埋められたシート状細胞培養物を単離した。単離前のシート状細胞培養物の写真を図３（Ｂ）に示す。
Example 2 Production of sheet-shaped cell culture in which the gaps between cells are filled with gel Thaw human myocardial cells derived from iPS cells cryopreserved in a cell preservation solution (MCDB medium containing 10% DMSO) at 37 ° C. and, after dilution with 10% FBS / DMEM, and centrifuged, after removing the supernatant, at a density of cells 2 × 10 6 cells / cm 2, were suspended in human serum containing 20% DMEM medium 15 mL, diameter The seeds were seeded on a 6 cm temperature-responsive substrate (UpCell®, 6 cm dish, CS3006, manufactured by Cellseed). After seeding, the cells were cultured for 72 hours in an incubator (BNA-121D, manufactured by ESPEC) set at 37 ° C. and 5% CO 2. After culturing, the substrate was removed from the incubator, it was confirmed that the cells were adhered to the substrate, and the medium was discarded.
After discarding the medium, 500 μl of fibrinogen solution (fibrinogen (registered trademark) for tissue adhesion (manufactured by CSL Bering Co., Ltd.), vial 1 contents (fibrinogen lyophilized powder), was placed on the substrate, and the contents of vial 2 (fibrinogen dissolved). (Liquid), fibrinogen concentration 80 mg / mL) and 500 μl of thrombin solution (Beliplast (registered trademark) for tissue adhesion (manufactured by CSL Bering)) contents of vial 3 (thrombin lyophilized powder) in
After fibrin gel formation, 10 mL of Hanks balanced salt solution (HBSS (+), Cat No. 14025, manufactured by Life Technologies) was added and washed 3 times to remove unreacted fibrinogen and thrombin. Then, the temperature-responsive material was allowed to stand at room temperature (20 to 25 ° C.) for 5 to 30 minutes for temperature treatment, and the sheet-like material was peeled off from the substrate by pipetting, and the gaps between cells were filled with gel. Sheet-shaped cell cultures were isolated. A photograph of the sheet-shaped cell culture before isolation is shown in FIG. 3 (B).
実施例３ シート状細胞培養物中の細胞数およびサイトカイン産生量の測定
実施例１および２で作成したシート状細胞培養物を構成する細胞数を、単離直後（ｄａｙ０）ならびにヒト血清１０％含有ＤＭＥＭ培地に４℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃および３９℃で７２時間インキュベート（保存）し、４５０ｎｍの吸光度で測定した。実施例１で作成したシート状細胞培養物シート状細胞培養の結果を図４に示す。フィブリンゲル層が形成されたシート状細胞培養物は、４℃でインキュベートした場合、細胞数の減少が確認されたが、２５℃では殆ど減少せず、３０℃以上で大幅な細胞数の増加が確認された。また、実施例２で作成したシート状細胞培養物も同様の結果であった。
Example 3 Measurement of the number of cells and cytokine production in the sheet-shaped cell culture The number of cells constituting the sheet-shaped cell culture prepared in Examples 1 and 2 is contained immediately after isolation (day 0) and 10% of human serum. The cells were incubated (stored) in DMEM medium at 4 ° C., 25 ° C., 30 ° C., 35 ° C., 37 ° C. and 39 ° C. for 72 hours, and measured at an absorbance of 450 nm. Sheet-shaped cell culture prepared in Example 1 The results of sheet-shaped cell culture are shown in FIG. In the sheet-like cell culture in which the fibrin gel layer was formed, a decrease in the number of cells was confirmed when incubated at 4 ° C, but there was almost no decrease at 25 ° C, and a significant increase in the number of cells was observed at 30 ° C or higher. confirmed. In addition, the sheet-shaped cell culture prepared in Example 2 had similar results.
実施例１および２で作成したシート状細胞培養物を単離直後ならびにヒト血清１０％含有ＤＭＥＭ培地に２５℃、３０℃、３５℃、３７℃および３９℃で７２時間保存し、比較例２と同じ手順でサイトカイン産生量を測定した。実施例１で作成したシート状細胞培養物の結果を図５に示す。
実施例１で作成したシート状細胞培養物を２５℃でインキュベートするステップを加えることにより、比較例２と同様にシート状細胞培養物のサイトカイン産生量の減少が抑制されることが明らかとなった。また３０℃以上で保存することによりサイトカイン産生量が大幅に増強されることが明らかとなった。また実施例２で作成したシート状細胞培養物も同様の結果であった。
Immediately after isolation and in DMEM medium containing 10% human serum, the sheet-shaped cell cultures prepared in Examples 1 and 2 were stored at 25 ° C., 30 ° C., 35 ° C., 37 ° C. and 39 ° C. for 72 hours, and compared with Comparative Example 2. Cytokine production was measured in the same procedure. The results of the sheet-shaped cell culture prepared in Example 1 are shown in FIG.
It was clarified that by adding the step of incubating the sheet-shaped cell culture prepared in Example 1 at 25 ° C., the decrease in the cytokine production amount of the sheet-shaped cell culture was suppressed as in Comparative Example 2. .. It was also clarified that the amount of cytokine production was significantly enhanced by storing at 30 ° C. or higher. The same result was obtained with the sheet-shaped cell culture prepared in Example 2.
実施例４ 細胞間の間隙がゲルで埋められたシート状細胞培養物の製造
細胞保存用保存液（１０％ＤＭＳＯ含有ＭＣＤＢ培地）中で凍結保存したｉＰＳ細胞由来のヒト心筋細胞を３７℃で解凍し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで希釈後、遠心分離し、上清を除去したのち、細胞を２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で、３ｍＬのヒト血清２０％含有ＤＭＥＭ培地に懸濁し、１２ウェルの温度応答性基材（ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）１２Ｗｅｌｌ、ＣＳ３００３、セルシード社製）に播種した。播種後、細胞集団を３７℃、５％ＣＯ２に設定したインキュベーター（ＢＮＡ−１２１Ｄ、エスペック社製）内で７２時間培養した。培養後、基材をインキュベーターから取り出し、細胞が基材に接着していることを確認し、培地を廃棄した。
培地の廃棄後、基材上に、１００μｌのフィブリノゲン液（ベリプラスト（登録商標）組織接着用（CSLベーリング社製）のバイアル１の内容物（フィブリノゲン凍結乾燥粉末）をバイアル２の内容物（フィブリノゲン溶解液）で溶解したもの、フィブリノゲン濃度８０ｍｇ／ｍＬ）と、１００μｌのトロンビン液（ベリプラスト（登録商標）組織接着用（CSLベーリング社製）のバイアル３の内容物（トロンビン凍結乾燥粉末）をバイアル４の内容物（トロンビン溶解液）で溶解したもの、トロンビン濃度３００単位／ｍＬ）とを滴下し、約５分静置して、フィブリンゲルを形成した。
フィブリンゲル形成後に、２ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ（＋）、Cat No.14025、Life Technologies社製）を加えて、３回洗浄し、未反応のフィブリノゲンおよびトロンビンを除去した。その後、温度応答性材料の温度処理のため室温（２０〜２５℃）で５〜３０分間静置し、ピペッティングにより、シート状物を基材から剥離させ、細胞間の間隙がゲルで埋められたシート状細胞培養物を単離した。
Example 4 Production of sheet-shaped cell culture in which the gaps between cells are filled with gel Thaw human myocardial cells derived from iPS cells cryopreserved in a cell preservation preservation solution (MCDB medium containing 10% DMSO) at 37 ° C. The cells were diluted with 10% FBS / DMEM, centrifuged, and the supernatant was removed. Then, the cells were suspended in 3 mL of DMEM medium containing 20% human serum at a density of 2 × 10 6 cells / cm 2, and 12 The wells were seeded on a temperature-responsive substrate (UpCell (R) 12Well, CS3003, manufactured by Cellseed). After seeding, the cells were cultured for 72 hours in an incubator (BNA-121D, manufactured by ESPEC) set at 37 ° C. and 5% CO 2. After culturing, the substrate was removed from the incubator, it was confirmed that the cells were adhered to the substrate, and the medium was discarded.
After discarding the medium, 100 μl of fibrinogen solution (Beriplast (registered trademark) for tissue adhesion (manufactured by CSL Bering Co., Ltd.), vial 1 contents (fibrinogen lyophilized powder), was placed on the substrate, and the contents of vial 2 (fibrinogen dissolved) (Liquid), fibrinogen concentration 80 mg / mL) and 100 μl of thrombin solution (Thrombin lyophilized powder) of vial 3 for tissue adhesion (CSL Bering Co., Ltd.) of 100 μl of thrombin solution in
After fibrin gel formation, 2 mL of Hanks balanced salt solution (HBSS (+), Cat No. 14025, manufactured by Life Technologies) was added and washed 3 times to remove unreacted fibrinogen and thrombin. Then, the temperature-responsive material was allowed to stand at room temperature (20 to 25 ° C.) for 5 to 30 minutes for temperature treatment, and the sheet-like material was peeled off from the substrate by pipetting, and the gaps between cells were filled with gel. Sheet-shaped cell cultures were isolated.
実施例５ シート状細胞培養物中の形態変化
比較例３で作成したシート状細胞培養物および実施例４で作成した間隙がゲルで埋められたシート状細胞培養物を４℃および２５℃で保存した際の写真を図６に示す。比較例３で作成したシート状細胞培養物を４℃（Ａ）および２５℃（Ｂ）、実施例４で作成した間隙がゲルで埋められたシート状細胞培養物を４℃（Ｃ）および２５℃（Ｄ）で保存した際の写真を図６に示す。実施例４で作成したシート状細胞培養物を２５℃で保存してもシート状細胞培養物の撚れや縮みは生じないことが分かる（Ｄ）。したがって、スキャフォールドを有する移植片は形態を維持したままサイトカイン産生量を増強できることが明らかとなった。
Example 5 Morphological change in sheet-shaped cell culture The sheet-shaped cell culture prepared in Comparative Example 3 and the sheet-shaped cell culture in which the gaps prepared in Example 4 were filled with gel were stored at 4 ° C. and 25 ° C. A photograph of this is shown in FIG. The sheet-shaped cell cultures prepared in Comparative Example 3 were 4 ° C. (A) and 25 ° C. (B), and the sheet-shaped cell cultures prepared in Example 4 in which the gaps were filled with gel were 4 ° C. (C) and 25 ° C. A photograph of the cells stored at ° C. (D) is shown in FIG. It can be seen that even if the sheet-shaped cell culture prepared in Example 4 is stored at 25 ° C., the sheet-shaped cell culture does not twist or shrink (D). Therefore, it was clarified that the graft having the scaffold can enhance the cytokine production while maintaining the morphology.
本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解している。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。 The various features of the invention described herein can be combined in various ways, and all aspects obtained by such combinations, including combinations not specifically described herein, are of the present invention. It is within the range. Those skilled in the art also understand that a number of various modifications are possible that do not deviate from the spirit of the present invention. Therefore, it should be understood that the embodiments described herein are merely exemplary and are not intended to limit the scope of the invention.
Claims (8)
移植片を２５℃以上でインキュベートするステップを含む前記方法。 A method for enhancing the activity selected from the group consisting of cytokine-producing ability, proliferation ability, engraftment ability, blood vessel-inducing ability, and tissue regeneration ability of a graft containing differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells.
The method comprising incubating the implant at 25 ° C. or higher.
請求項６または７に記載の移植片を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。 A method of treating a disease that is ameliorated by the application of a graft.
The method comprising applying the implant according to claim 6 or 7 to a subject in need thereof.
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-
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Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP2015047140A (en) * | 2013-09-03 | 2015-03-16 | 国立大学法人京都大学 | Complex composed of neuron having engraftment capability following transplantation and solid three-dimensional matrix |
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Non-Patent Citations (4)
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|---|
| "Development and use of a human induced pluripotent stem cell derived cardiac construct", JOURNAL OF CARDIAC FAILURE, vol. Vol. 20, No. 8, Supp. SUPPL. 1,, JPN6023008961, 2014, pages 83, ISSN: 0005108199 * |
| AM. J. TRANSPLANT., vol. 14, no. 6, JPN6023008964, 2014, pages 1400 - 9, ISSN: 0005108202 * |
| J. SURG. RES., vol. 175, no. 1, JPN6023008962, 2012, pages 149 - 156, ISSN: 0005108200 * |
| SCI. REP., vol. 9, no. 1, JPN6023008963, February 2019 (2019-02-01), pages 2891, ISSN: 0005108201 * |
Also Published As
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