JP2021047072A - Standard substance for ferritin measurement and ferritin measurement method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フェリチン測定用標準物質およびその製造方法、ならびに上記標準物質を用いたフェリチンの測定方法に関するものである。また、さらに本発明は、フェリチン測定結果の差を低減する方法にも関する。 The present invention relates to a standard substance for measuring ferritin, a method for producing the same, and a method for measuring ferritin using the above standard substance. The present invention also relates to a method for reducing the difference in ferritin measurement results.
フェリチンは、２４個のポリペプチドサブユニットを含み分子量が約４８０ｋＤａの球状タンパク質複合体である。ポリペプチドサブユニットとしては、分子量の異なる２種類のＨ鎖（２１ｋＤａ）、Ｌ鎖（１９ｋＤａ）が知られている。フェリチン分子の内部は中空となっており、この空間に多数の鉄イオンを貯蔵することができる。フェリチン分子１個当たり４５００個の第三鉄イオン（Ｆｅ３＋）を貯蔵可能である。 Ferritin is a globular protein complex containing 24 polypeptide subunits and having a molecular weight of approximately 480 kDa. As the polypeptide subunit, two types of H chain (21 kDa) and L chain (19 kDa) having different molecular weights are known. The inside of the ferritin molecule is hollow, and a large number of iron ions can be stored in this space. Each ferritin molecule can store 4500 ferric ions (Fe 3+).
フェリチンは、ヒトにおいては肝臓、腎臓、脾臓、胎盤等の器官に存在するほか、血清中にも存在し、鉄輸送タンパク質として機能するものと考えられている。そして、鉄欠乏性障害の治療方法として、フェリチン−鉄複合体を患者に投与する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。 In humans, ferritin is present in organs such as liver, kidney, spleen, and placenta, and is also present in serum, and is thought to function as an iron transport protein. Then, as a method for treating iron deficiency disorder, a method for administering a ferritin-iron complex to a patient has been proposed (for example, Patent Document 1).
また、血清中のフェリチン濃度は、体内の鉄貯蔵量と密接に関係していることが分かっており、鉄欠乏性症等の臨床検査において重要な測定項目となっている（例えば、非特許文献１）。フェリチンの測定においては各種免疫学的測定方法が知られているが、近年はラテックス凝集法による免疫測定法が、他法に比べて簡便かつ迅速に測定が行える方法となっているため、広く使用されている。そして、ラテックス凝集法の検出感度を改良するために、反応液中にそれぞれ所定分子量を有するポリビニルピロリドン、プルランおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される１種を含有させる方法（特許文献２）が、また、血清検体の鮮度の影響を抑えるために反応液中に第４級アンモニウム塩を含有させる方法（特許文献３）などが提案されている。 In addition, it is known that the ferritin concentration in serum is closely related to the amount of iron stored in the body, and it is an important measurement item in clinical tests such as iron deficiency (for example, non-patent literature). 1). Various immunological measurement methods are known for the measurement of ferritin, but in recent years, the immunoassay method by the latex agglutination method has become a method that can be measured more easily and quickly than other methods, and is therefore widely used. Has been done. Then, in order to improve the detection sensitivity of the latex agglutination method, a method (Patent Document 2) in which one selected from the group consisting of polyvinylpyrrolidone, purulan and polyethylene glycol having a predetermined molecular weight, respectively, is contained in the reaction solution. Further, a method of containing a quaternary ammonium salt in the reaction solution in order to suppress the influence of the freshness of the serum sample (Patent Document 3) has been proposed.
しかし、上記非特許文献１においては、測定項目としてのフェリチンが「分類３）基準測定操作法や標準物質が確立されていないうえ、施設間差も大きい項目」と分類されている。このように、フェリチンの免疫学的測定においては、測定施設が異なった場合などに、測定結果に差が生じてしまうことがあり、精度管理が重要な課題となっていた。 However, in the above-mentioned Non-Patent Document 1, ferritin as a measurement item is classified as "classification 3) an item in which a reference measurement operation method and a standard substance have not been established and a large difference between facilities is large." As described above, in the immunological measurement of ferritin, the measurement results may differ when the measurement facilities are different, and quality control has become an important issue.
上記特許文献２は、高感度かつ迅速、簡便なフェリチン定量方法として提案されており、上記特許文献３は、フェリチン検体の鮮度の影響が少ないフェリチン測定方法として提案されている。しかし、これらの方法においても、依然として精度管理の観点から充分なものとはいえなかった。 Patent Document 2 is proposed as a highly sensitive, rapid, and simple method for quantifying ferritin, and Patent Document 3 is proposed as a method for measuring ferritin, which is less affected by the freshness of a ferritin sample. However, even with these methods, it cannot be said that they are sufficient from the viewpoint of quality control.
そこで、本発明は、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させる方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for stabilizing the measured value of ferritin concentration in a sample.
本発明者らは上記問題を解決すべく研究を行った結果、フェリチンは、２４個のポリペプチドサブユニットを含み分子量約４８０ｋＤａであるフェリチンをモノマーとして称した場合、フェリチンモノマーが会合してフェリチンダイマー、フェリチンオリゴマー等を形成し、これらの間で免疫学的測定における反応性が異なること、標準物質におけるこれらの反応性の相違が、測定値の差の一因となっていることを知見した。
すなわち、検体中のフェリチンの測定において、免疫学的測定法のための標準物質（キャリブレータ）を調製するにあたり、標準物質は生体組織に由来するフェリチンを使用することが多いが、ロットの異なるフェリチンを用いるとフェリチンモノマー、ダイマー、オリゴマー等の割合が異なることがあるため、標準物質もこれらの構成割合が異なることがある。そして、フェリチンモノマー、ダイマー、オリゴマー等は、免疫学的測定における反応性が異なることから、フェリチンモノマー、ダイマー、オリゴマー等の構成割合が複数の標準物質のロット間で異なってしまうことが、検量線が変動する原因であり、ひいては検体の測定値が変わってしまう一因となっていることを知見した。
そして、標準物質において、フェリチンモノマー、ダイマー、オリゴマー等の割合が所定範囲にあるフェリチンを用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
具体的には、本発明は以下のとおりである。
As a result of conducting research to solve the above problems, the present inventors, when ferritin contains 24 polypeptide subunits and has a molecular weight of about 480 kDa as a monomer, the ferritin monomers are associated with each other to form a ferritin dimer. , Ferritin oligomers, etc. were formed, and it was found that the reactivity in immunological measurement was different between them, and that the difference in these reactivity in the standard substance contributed to the difference in the measured values.
That is, in the measurement of ferritin in a sample, when preparing a standard substance (calibrator) for immunoassay, ferritin derived from living tissue is often used as the standard substance, but ferritin in different lots is used. When used, the proportions of ferritin monomers, dimers, oligomers, etc. may differ, so the standard substances may also differ in their constituent proportions. Since ferritin monomers, dimers, oligomers, etc. have different reactivity in immunological measurement, the calibration curve shows that the composition ratios of ferritin monomers, dimers, oligomers, etc. differ between lots of a plurality of standard substances. It was found that this is the cause of the fluctuation, which in turn is one of the causes of the change in the measured value of the sample.
Then, they have found that the above problems can be solved by using ferritin in which the ratio of ferritin monomer, dimer, oligomer and the like is within a predetermined range in the standard substance, and have completed the present invention.
Specifically, the present invention is as follows.
〔１〕 少なくとも２以上のロットのフェリチン測定用標準物質間における検体中のフェリチン測定結果の差を低減する方法であって、
前記標準物質において、下記（１）または（２）を満たすフェリチンを用いる、方法：
（１）前記標準物質中のフェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上である；
（２）前記標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合の差が、前記標準物質間で８ポイント以下である。
〔２〕 前記（２）において、前記標準物質中のフェリチンにおけるフェリチンダイマーの割合の差が、前記標準物質間で１０ポイント以下である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記（１）または（２）において、標準物質として調製される前のフェリチンに対し、前記割合が調整される、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕 フェリチン測定用標準物質の製造方法であって、
前記標準物質において、下記（１）を満たすフェリチンを用いる、方法：
（１）前記フェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上である。
〔５〕 第１のロットのフェリチン測定用標準物質を参照して、第２のロットのフェリチン測定用標準物質を製造する方法であって、
前記第２の標準物質において、下記（２）を満たすフェリチンを用いる、方法：
（２）前記標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合の差が、前記第１の標準物質と前記第２の標準物質との間で８ポイント以下である。
〔６〕 前記（２）において、前記標準物質中のフェリチンにおけるフェリチンダイマーの割合の差が、前記第１の標準物質と前記第２の標準物質との間で１０ポイント以下である、〔５〕に記載のフェリチン測定用標準物質の製造方法。
〔７〕 前記（１）または（２）において、標準物質として調製される前のフェリチンに対し、前記割合が調整される、〔４〕〜〔６〕に記載のフェリチン測定用標準物質の製造方法。
〔８〕 フェリチンを含有するフェリチン測定用標準物質であって、
前記標準物質中のフェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上であることを特徴とするフェリチン測定用標準物質。
〔９〕 前記標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合が５％以下である、〔８〕に記載のフェリチン測定用標準物質。
〔１０〕 〔４〕〜〔７〕に記載の方法で製造された標準物質、または〔８〕もしくは〔９〕に記載の標準物質を用いることを特徴とするフェリチンの測定方法。
[1] A method for reducing the difference in ferritin measurement results in a sample between at least two or more lots of ferritin measurement standard substances.
A method using ferritin satisfying the following (1) or (2) in the standard substance:
(1) The ratio of ferritin monomer in ferritin in the standard substance is 90% or more;
(2) The difference in the ratio of ferritin oligomers above the trimmer to ferritin in the standard substance is 8 points or less between the standard substances.
[2] The method according to [1], wherein the difference in the ratio of ferritin dimer to ferritin in the standard substance in (2) is 10 points or less between the standard substances.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the ratio of ferritin before being prepared as a standard substance is adjusted in the above (1) or (2).
[4] A method for producing a standard substance for ferritin measurement.
A method using ferritin satisfying the following (1) in the standard substance:
(1) The ratio of the ferritin monomer in the ferritin is 90% or more.
[5] A method for producing a ferritin measurement standard substance in a second lot with reference to the ferritin measurement standard substance in the first lot.
A method using ferritin satisfying the following (2) in the second standard substance:
(2) The difference in the ratio of ferritin oligomers above the trimmer to ferritin in the standard substance is 8 points or less between the first standard substance and the second standard substance.
[6] In the above (2), the difference in the ratio of ferritin dimer to ferritin in the standard substance is 10 points or less between the first standard substance and the second standard substance [5]. A method for producing a standard substance for ferritin measurement according to.
[7] The method for producing a standard substance for ferritin measurement according to [4] to [6], wherein the ratio of ferritin before being prepared as a standard substance is adjusted in the above (1) or (2). ..
[8] A standard substance for ferritin measurement containing ferritin, which is a standard substance for measuring ferritin.
A standard substance for ferritin measurement, wherein the ratio of the ferritin monomer in ferritin in the standard substance is 90% or more.
[9] The standard substance for ferritin measurement according to [8], wherein the proportion of ferritin oligomers above the trimmer in ferritin in the standard substance is 5% or less.
[10] A method for measuring ferritin, which comprises using the standard substance produced by the method according to [4] to [7], or the standard substance according to [8] or [9].
本発明によれば、標準物質中のフェリチン反応性を安定化することができ、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。 According to the present invention, the ferritin reactivity in the standard substance can be stabilized, and the measured value of the ferritin concentration in the sample can be stabilized.
以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の一実施形態に係る方法は、少なくとも２以上のロットのフェリチン測定用標準物質間における検体中のフェリチン測定結果の差を低減する方法であって、当該標準物質において、標準物質中のフェリチンにおけるモノマー、ダイマー、オリゴマー等の割合が所定範囲にあるフェリチンを用いるものである。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
The method according to one embodiment of the present invention is a method for reducing the difference in ferritin measurement results in a sample between at least two or more lots of a ferritin measurement standard substance, and in the standard substance, ferritin in the standard substance. Ferritin is used in which the proportions of the monomer, dimer, oligomer, etc. in the above range are within a predetermined range.
１．フェリチン
フェリチンは、２４個のポリペプチドサブユニットを含み約４８０ｋＤａとなる球状タンパク質複合体である。
本実施形態において用いるフェリチンは、肝臓、胎盤、脾臓等から精製して得ることができるほか、リコンビナントタンパク質なども利用することができる。ただし、入手容易性等の観点から、本実施形態で用いるフェリチンはＬ鎖のリコンビナントではなくてもよく、肝臓または胎盤由来であることが好ましく、肝臓由来であることが特に好ましい。
1. 1. Ferritin Ferritin is a globular protein complex that contains 24 polypeptide subunits and is approximately 480 kDa.
The ferritin used in the present embodiment can be obtained by purification from the liver, placenta, spleen, etc., and recombinant protein and the like can also be used. However, from the viewpoint of availability and the like, the ferritin used in the present embodiment does not have to be an L-chain recombinant, and is preferably derived from the liver or placenta, and particularly preferably derived from the liver.
本明細書においては、２４個のポリペプチドサブユニットを含み分子量約４８０ｋＤａであるフェリチン（タンパク質複合体）を、「フェリチンモノマー」と称する（単に「モノマー」ともいうこともある）。
また、上記モノマー２分子がさらに会合し形成された約９６０ｋＤａの複合体を、「フェリチンダイマー」と称する（単に「ダイマー」ということもある）。
さらに、上記モノマー３分子以上が会合して形成された巨大な複合体を、「トリマー以上のフェリチンオリゴマー」と称する（単に「フェリチンオリゴマー」あるいは「オリゴマー」ということもある）。
In the present specification, a ferritin (protein complex) containing 24 polypeptide subunits and having a molecular weight of about 480 kDa is referred to as a "ferritin monomer" (sometimes simply referred to as a "monomer").
Further, a complex of about 960 kDa formed by further associating the two monomer molecules is referred to as a "ferritin dimer" (sometimes simply referred to as a "dimer").
Further, a huge complex formed by associating three or more molecules of the above-mentioned monomers is referred to as "ferritin oligomer of trimmer or higher" (sometimes simply referred to as "ferritin oligomer" or "oligomer").
後述する実施例にて示すように、フェリチンは、モノマー、ダイマー、オリゴマーと多量体化するにつれて、免疫学的測定における反応性が低下する。そのため、標準物質においてこれらの構成割合が大きく変動してしまうと、同一の測定装置においても標準物質から作成される検量線が変動してしまい、検体中のフェリチン濃度の測定値も差が生じてしまう。
これに対し、標準物質に含まれるフェリチンにおいて、上記構成割合が大きく変動しないように調整することで、検量線が大きく変動することなく安定し、検体中のフェリチン濃度の測定値も安定化させることができる。
As shown in Examples described later, ferritin becomes less reactive in immunological measurements as it multimerizes with monomers, dimers, and oligomers. Therefore, if these constituent ratios fluctuate significantly in the standard substance, the calibration curve created from the standard substance fluctuates even in the same measuring device, and the measured values of the ferritin concentration in the sample also differ. It ends up.
On the other hand, in ferritin contained in the standard substance, by adjusting so that the above-mentioned composition ratio does not fluctuate significantly, the calibration curve does not fluctuate significantly and is stabilized, and the measured value of ferritin concentration in the sample is also stabilized. Can be done.
なお、フェリチンにモノマー、ダイマー、オリゴマーが存在することは知られていたが、これらの間で免疫学的測定における反応性が異なることは全く知られておらず、本発明者らの新知見である。
また、後述する実施例にて示すとおり、同じフェリチン測定試薬を用いて異なる測定装置にて測定した場合に、モノマー、ダイマー、オリゴマーの間で免疫学的測定における反応性の相違が認められる。
Although it was known that ferritin contains monomers, dimers, and oligomers, it is not known that the reactivity in immunological measurement differs among them, and the new findings of the present inventors have shown that ferritin has different reactivity. is there.
In addition, as shown in Examples described later, when the same ferritin measuring reagent is used and measured by different measuring devices, a difference in reactivity in immunological measurement is observed among the monomers, dimers, and oligomers.
２．モノマー、ダイマーおよびオリゴマーの割合
本実施形態において、フェリチン中のモノマー、ダイマーおよびオリゴマーの各割合は、例えば吸光度換算により表すことができる。具体的には、フェリチンをゲルろ過クロマトグラフィー等により分画し、全フェリチンに対するモノマー、ダイマーおよびオリゴマーのタンパク量としての割合を吸光度換算により表すことができる。
モノマー、ダイマーおよびオリゴマーは、常法に従って分子量で分画することができ、ゲルろ過クロマトグラフィーの具体的な条件は、一例として後述する実施例に示す条件を例示することができる。
吸光度は、例えば波長２８０nmの吸光度により測定することができる。モノマー、ダイマーおよびオリゴマーのタンパク量としての割合は、当該波長で測定したゲルろ過クロマトグラフィーのピークの面積比などにより特定することができる。
2. Percentages of Monomers, Dimers and Oligomers In this embodiment, the proportions of monomers, dimers and oligomers in ferritin can be expressed, for example, in terms of absorbance. Specifically, ferritin can be fractionated by gel filtration chromatography or the like, and the ratio of the monomer, dimer and oligomer as the amount of protein to the total ferritin can be expressed by absorbance conversion.
Monomers, dimers and oligomers can be fractionated by molecular weight according to a conventional method, and specific conditions for gel filtration chromatography can be exemplified by the conditions shown in Examples described later.
The absorbance can be measured, for example, by the absorbance at a wavelength of 280 nm. The ratio of the monomer, dimer and oligomer as the amount of protein can be specified by the area ratio of the peak of gel filtration chromatography measured at the wavelength.
なお、フェリチンにおけるモノマー等の割合を決定すべき組成物がフェリチン以外の成分を含む等の理由により、各画分の吸光度をフェリチンの吸光度とみなせない場合には、例えば以下の（ａ）または（ｂ）の方法により、上記割合を決定することができる。 If the absorbance of each fraction cannot be regarded as the absorbance of ferritin because the composition for which the ratio of the monomer or the like in ferritin should be determined contains a component other than ferritin, for example, the following (a) or ( The above ratio can be determined by the method of b).
（ａ）アフィニティ精製や結晶化等によりフェリチンを精製する。その後、前述と同様にゲルろ過クロマトグラフィー等により分画し、吸光度を測定することでタンパク量を求め、モノマー等の割合（タンパク量比）を決定する。 (A) Ferritin is purified by affinity purification, crystallization, or the like. Then, in the same manner as described above, the protein is fractionated by gel filtration chromatography or the like, and the amount of protein is determined by measuring the absorbance, and the ratio of the monomer or the like (protein amount ratio) is determined.
（ｂ）一般的に入手可能なフェリチンをモノマー、ダイマーおよびオリゴマーに分画し、各画分について、吸光度を測定するとともに、特定のフェリチン測定試薬および測定装置の組み合わせにてシグナル強度を測定し、フェリチンモノマー等におけるシグナル強度と吸光度との関係式を特定する。その後、フェリチンにおけるモノマー等の割合を決定すべき組成物について、ゲルろ過クロマトグラフィー等により分画し、各画分について上記特定のフェリチン測定試薬および測定装置の組み合わせによりフェリチンのシグナル強度を測定する。各画分のシグナル強度と、上記関係式とから、各画分におけるシグナル強度を吸光度に換算し、モノマー、ダイマーおよびオリゴマーの割合を算出する。 (B) Commonly available ferritin is fractionated into monomers, dimers and oligomers, and the absorbance of each fraction is measured, and the signal intensity is measured with a combination of a specific ferritin measuring reagent and a measuring device. Identify the relational expression between signal intensity and absorbance in ferritin monomers and the like. Then, the composition for which the ratio of the monomer or the like in ferritin should be determined is fractionated by gel filtration chromatography or the like, and the signal intensity of ferritin is measured for each fraction by the combination of the above-mentioned specific ferritin measuring reagent and measuring device. From the signal intensity of each fraction and the above relational expression, the signal intensity of each fraction is converted into absorbance, and the proportions of monomers, dimers and oligomers are calculated.
ここで、フェリチンの「吸光度」とは、フェリチン抗原単体を分光光度計にて測定したときの波長２８０nmの光の吸収強度をいう。
また、「シグナル強度」とは、免疫学的測定により検出されるシグナルの変化量をいう。上記シグナルは、免疫学的測定の方法によって、濁度、吸光、蛍光、発光、ＲＩ等が挙げられる。シグナル強度は、フェリチンの量に相関して増減するところ、なお、免疫学的測定における反応性がフェリチンモノマー、ダイマーおよびオリゴマーの間で異なることから、上記増減の程度はフェリチンモノマー、ダイマーおよびオリゴマーの間で異なるものとなる。
Here, the "absorbance" of ferritin refers to the absorption intensity of light having a wavelength of 280 nm when the ferritin antigen alone is measured with a spectrophotometer.
Further, the "signal intensity" refers to the amount of change in the signal detected by immunological measurement. Examples of the signal include turbidity, absorption, fluorescence, luminescence, RI, etc., depending on the method of immunological measurement. The signal intensity increases or decreases in correlation with the amount of ferritin, and since the reactivity in immunological measurement differs between ferritin monomers, dimers and oligomers, the degree of the increase or decrease is that of ferritin monomers, dimers and oligomers. Will be different between.
３．検体中のフェリチン測定結果の差の低減方法
本実施形態においては、前述したとおり、標準物質に含まれるフェリチンにおいて、モノマー、ダイマーおよびオリゴマーの構成割合が大きく変動しないように調整することで、検量線が大きく変動することなく安定し、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。
ここで、フェリチンにおけるモノマー等の構成割合が大きく変動しないように調整する方法としては、具体的には、標準物質中のフェリチンとして、下記（１）を満たすフェリチンを用いる方法が挙げられる。
（１）標準物質中に含まれるフェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上である。
3. 3. Method for reducing the difference in ferritin measurement results in a sample As described above, in the present embodiment, the calibration curve is adjusted so that the composition ratios of the monomer, dimer and oligomer of ferritin contained in the standard substance do not fluctuate significantly. Is stable without a large fluctuation, and the measured value of ferritin concentration in the sample can be stabilized.
Here, as a method for adjusting the composition ratio of the monomer and the like in ferritin so as not to fluctuate significantly, a method of using ferritin satisfying the following (1) as the ferritin in the standard substance can be specifically mentioned.
(1) The ratio of ferritin monomer in ferritin contained in the standard substance is 90% or more.
上記（１）のようにすることで、反応性の低いダイマーやオリゴマー等の割合の変動を抑制することができ、標準物質中のフェリチンの反応性を安定化させ、検量線が安定化し、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。すなわち、上記（１）を満たすフェリチンを用いることで、ロットの異なる標準物質間において、検体中のフェリチン測定結果の差を低減することができる。
上記（１）において、フェリチンモノマーの割合は、９５％以上とすることがさらに好ましく、９８％以上とすることが特に好ましい。
By performing as in (1) above, fluctuations in the proportions of low-reactivity dimers, oligomers, etc. can be suppressed, the reactivity of ferritin in the standard substance is stabilized, the calibration curve is stabilized, and the sample is sampled. The measured value of ferritin concentration in the medium can be stabilized. That is, by using ferritin satisfying the above (1), it is possible to reduce the difference in ferritin measurement results in the sample between standard substances having different lots.
In the above (1), the ratio of the ferritin monomer is more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more.
また、後述する実施例にて示すとおり、同じフェリチン測定試薬を用い異なる測定装置にて測定した場合、モノマー、ダイマー、オリゴマーの間で反応性の相違が認められる。このことに起因して、標準物質中のフェリチンがオリゴマー（あるいはダイマー）の割合が多いと、同一ロットの標準物質を用い、同一の検体を測定した場合でも、測定装置間で測定結果に差が生じてしまう場合がある。
これに対し、標準物質に用いるフェリチンにおいて、フェリチンモノマーの割合を高くする、例えば９０％以上、９５％以上、または９８％以上とすることで、ロットの異なる標準物質間で測定値差を低減できるだけでなく、同一ロットの標準物質を用い、異なる免疫学的測定装置間での測定値差を低減することもできる。
Further, as shown in Examples described later, when the same ferritin measuring reagent is used and measured by different measuring devices, a difference in reactivity is observed among the monomers, dimers, and oligomers. Due to this, if ferritin in the standard substance has a large proportion of oligomers (or dimers), even if the same sample is measured using the same lot of standard substance, there will be a difference in the measurement results between the measuring devices. It may occur.
On the other hand, in ferritin used as a standard substance, by increasing the proportion of ferritin monomer, for example, 90% or more, 95% or more, or 98% or more, it is possible to reduce the difference in measured values between standard substances in different lots. Instead, the same lot of standard material can be used to reduce the difference in measured values between different immunological measuring devices.
ここで、本明細書における「ロット」とは、同一の原料を用い、同一の条件のもとに製造された製品単位をいう。例えば、フェリチン等の原料として同一のものを用い、かつ製造された条件が同一であれば、同一ロットの標準物質ということができる。
ロットについては、標準物質だけでなく、フェリチンについても定義することができ、例えば、同一の原料を用い、同一の条件のもとに製造されたフェリチンであれば、同一ロットのフェリチンとなる。フェリチンのロットが同一であれば、フェリチンにおけるモノマー、ダイマー、オリゴマーの構成割合が同一とみなすことができる。
なお、少なくとも２以上の標準物質において、原料として用いたフェリチンのロットがそれぞれ異なる場合は、用いた原料が同一ではないため、標準物質のロットも異なるものとなる。また、少なくとも２以上の標準物質（またはフェリチン）において、製造された工程、場所、時期等が異なる場合には、製造された条件が同一ではないため、標準物質（またはフェリチン）のロットも異なるものとなる。
Here, the "lot" in the present specification means a product unit manufactured under the same conditions using the same raw materials. For example, if the same raw material such as ferritin is used and the production conditions are the same, it can be said that it is a standard substance of the same lot.
Regarding lots, not only standard substances but also ferritin can be defined. For example, ferritin produced under the same conditions using the same raw material will be ferritin in the same lot. If the lots of ferritin are the same, the composition ratios of the monomers, dimers, and oligomers in ferritin can be regarded as the same.
If the lots of ferritin used as raw materials are different for at least two or more standard substances, the lots of standard substances are also different because the raw materials used are not the same. In addition, in at least two or more standard substances (or ferritin), if the manufacturing process, place, time, etc. are different, the manufacturing conditions are not the same, so the lot of the standard substance (or ferritin) is also different. It becomes.
また、少なくとも２以上のロットの標準物質では、上記（１）の他に、標準物質中のフェリチンとして下記（２）を満たすフェリチンを用いてもよい。
（２）標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合の差が、標準物質間で８ポイント以下である。
なお、本明細書における「ポイント」はパーセントポイントである。
Further, in the standard substance of at least two or more lots, in addition to the above (1), ferritin satisfying the following (2) may be used as the ferritin in the standard substance.
(2) The difference in the ratio of ferritin oligomers above the trimmer to ferritin in the standard substance is 8 points or less between the standard substances.
The "point" in the present specification is a percentage point.
上記（２）のようにすることで、最も反応性の低いオリゴマーの割合の変動を抑制することができ、異なるロットの標準物質を用いた場合であっても、標準物質中のフェリチン反応性を安定化させ、検量線が安定化し、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。すなわち、上記（２）を満たすフェリチンを用いることにより、ロットの異なる、少なくとも２以上のロットのフェリチン測定用標準物質間において、検体中のフェリチン測定結果の差を低減することができる。
上記（２）において、標準物質中のフェリチンにおけるオリゴマーの割合の差は、標準物質間で５ポイント以下であることがさらに好ましく、３ポイント以下であることが特に好ましい。
By performing as in (2) above, fluctuations in the proportion of oligomers with the lowest reactivity can be suppressed, and ferritin reactivity in the standard substance can be improved even when standard substances of different lots are used. It can be stabilized, the calibration curve can be stabilized, and the measured value of ferritin concentration in the sample can be stabilized. That is, by using ferritin satisfying the above (2), it is possible to reduce the difference in ferritin measurement results in the sample between at least two or more lots of ferritin measurement standard substances having different lots.
In the above (2), the difference in the proportion of oligomers in ferritin in the standard substance is more preferably 5 points or less, and particularly preferably 3 points or less between the standard substances.
また、標準物質を製造する場合、上記（１）または（２）のようなフェリチンを用いることで、任意のロットのフェリチンを用いて、それぞれ異なる、複数ロットの標準物質を製造したとしても、フェリチン測定結果の差が低減された標準物質を得ることができる。 Further, when producing a standard substance, by using ferritin as described in (1) or (2) above, ferritin may be produced in a plurality of different lots using ferritin in any lot. A standard substance with a reduced difference in measurement results can be obtained.
上記（１）または（２）においては、標準物質に用いるフェリチンが、さらに下記（３）を満たすことが好ましい。
（３）標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合が、５％以下である。
さらに、上記オリゴマーの割合は、４％以下であることがさらに好ましく、３％以下となることが特に好ましい。最も反応性の低いオリゴマーの割合を少なくすることで、標準物質中のフェリチン反応性をより一層安定化させることができ、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。
In the above (1) or (2), it is preferable that ferritin used as a standard substance further satisfies the following (3).
(3) The ratio of ferritin oligomers above the trimmer in ferritin in the standard substance is 5% or less.
Further, the proportion of the oligomer is more preferably 4% or less, and particularly preferably 3% or less. By reducing the proportion of the least reactive oligomer, the ferritin reactivity in the standard substance can be further stabilized, and the measured value of the ferritin concentration in the sample can be stabilized.
また、少なくとも２以上のロットの標準物質間においては、標準物質に用いるフェリチンが、上記（１）または（２）に加え、下記（４）を満たすことが好ましい。
（４）上記標準物質中のフェリチンにおけるフェリチンダイマーの割合の差が、標準物質間で１０ポイント以下である。
さらに、標準物質中のフェリチンにおけるダイマーの割合の差は、標準物質間で７ポイント以下となることがさらに好ましく、５ポイント以下となることが特に好ましい。
Further, between the standard substances of at least two or more lots, it is preferable that the ferritin used as the standard substance satisfies the following (4) in addition to the above (1) or (2).
(4) The difference in the ratio of ferritin dimer to ferritin in the standard substance is 10 points or less between the standard substances.
Further, the difference in the ratio of dimers in ferritin in the standard substance is more preferably 7 points or less, and particularly preferably 5 points or less between the standard substances.
さらに、上記（２）においては、標準物質中のフェリチンとして、当該フェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、最も好ましくは９０％以上である、フェリチンを用いることが好ましい。 Further, in the above (2), as the ferritin in the standard substance, the ratio of the ferritin monomer in the ferritin is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, most preferably 90% or more. Is preferably used.
ここで、フェリチンにおけるモノマー等の構成割合が大きく変動しないように調整する（例えば、上記（１）〜（４）等）方法としては、例えば、フェリチンにおけるモノマー等の構成割合を確認する方法が挙げられる。この場合において、ロットの異なるフェリチンを用いる場合には、ロットごとに上記構成割合を確認することとなる。フェリチンにおけるモノマー等の構成割合を確認する方法は、上述したとおりであり、フェリチンをゲルろ過クロマトグラフィー等により分画し、構成割合を吸光度換算により表すことができる。
フェリチンにおけるモノマー等の構成割合が、所望の条件（例えば、上記（１）または（２）等）を満たす場合は、既に所望の構成割合に調整されているため、当該フェリチンをそのまま標準物質に用いればよい。一方、所望の条件を満たさない場合には、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー等により分画して得られた各画分を、適宜組み合わせることにより、所望の構成割合となるよう調整することができる。
本実施形態においては、標準物質として調製される前のフェリチンに対し、当該フェリチンにおけるモノマー等の構成割合が調整されることが好ましい。
Here, as a method of adjusting so that the composition ratio of the monomer or the like in ferritin does not fluctuate significantly (for example, (1) to (4) above), for example, a method of confirming the composition ratio of the monomer or the like in ferritin can be mentioned. Be done. In this case, when ferritins with different lots are used, the above composition ratio is confirmed for each lot. The method for confirming the composition ratio of the monomer or the like in ferritin is as described above, and ferritin can be fractionated by gel filtration chromatography or the like and the composition ratio can be expressed by absorbance conversion.
When the constituent ratio of the monomer or the like in ferritin satisfies the desired conditions (for example, (1) or (2) above), the ferritin has already been adjusted to the desired constituent ratio, and the ferritin can be used as it is as a standard substance. Just do it. On the other hand, when the desired conditions are not satisfied, for example, the respective fractions obtained by fractionation by gel filtration chromatography or the like can be appropriately combined to adjust the composition ratio to a desired value.
In the present embodiment, it is preferable that the composition ratio of the monomer or the like in the ferritin is adjusted with respect to the ferritin before it is prepared as a standard substance.
４．標準物質
本発明の一実施形態に係るフェリチン測定用標準物質は、モノマー等の構成割合が上記のような範囲にあるフェリチンを含むものである。
本実施形態に係る標準物質は、上記フェリチンを含むほか、標準物質に許容されるその他の成分を含有してもよい。このような成分として、例えば、水；塩類；緩衝剤；安定化剤；血清などを適宜添加することができる。
4. Standard substance The standard substance for ferritin measurement according to the embodiment of the present invention contains ferritin having a composition ratio of a monomer or the like in the above range.
In addition to containing the above-mentioned ferritin, the standard substance according to the present embodiment may contain other components permitted by the standard substance. As such components, for example, water; salts; buffers; stabilizers; serum and the like can be appropriately added.
塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化セシウム、リン酸塩等を適宜用いることができ、１種を単独でまたは２種以上を併用して用いることができる。塩類の濃度は、例えば５〜３０００ｍＭとすることができ、１００〜２０００ｍＭとすることができる。 As the salts, sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, cesium chloride, phosphate and the like can be appropriately used, and one type can be used alone or two or more types can be used in combination. The concentration of salts can be, for example, 5 to 3000 mM and 100 to 2000 mM.
緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ等のグッド緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、グリシン緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を併用して用いることができる。緩衝剤の濃度は、例えば１〜２００ｍＭとすることができ、５〜５０ｍＭとすることができる。 Examples of the buffer include good buffers such as HEPES and PIPES, phosphate buffers, tris buffers, glycine buffers, glycylglycine buffers, etc., one type alone or in combination of two or more types. Can be used. The concentration of the buffer can be, for example, 1 to 200 mM and 5 to 50 mM.
安定化剤は、フェリチンを安定化させるために用いられるものであり、具体的には、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を併用して用いることができる。安定化剤の濃度は、例えば０．０１〜２０質量％とすることができ、０．１〜１０質量％とすることができる。 The stabilizer is used to stabilize ferritin, and specific examples thereof include bovine serum albumin, skim milk, gelatin and the like, and one type may be used alone or two or more types may be used in combination. Can be done. The concentration of the stabilizer can be, for example, 0.01 to 20% by mass, and can be 0.1 to 10% by mass.
さらに、標準物質を希釈するために、血清を用いてもよい。かかる血清は、脱脂血清であることが好ましく、フェリチンを含まない血清であることが好ましい。フェリチンを含んでいないことは、例えば、後述する免疫学的測定などにおいて確認することができる。具体的には、当該血清を複数回測定した結果がフェリチン不含有の対照試料と有意差が認められないことをもって、当該血清がフェリチンを含んでいないと判断することができる。 In addition, serum may be used to dilute the reference material. Such serum is preferably a defatted serum, and preferably a ferritin-free serum. The absence of ferritin can be confirmed, for example, by immunological measurement described later. Specifically, it can be determined that the serum does not contain ferritin because the result of measuring the serum a plurality of times does not show a significant difference from the control sample containing no ferritin.
さらに、本実施形態に係る標準物質は、本実施形態の効果を損なわない範囲において、その他の添加剤、例えば：アジ化ナトリウム等の防腐剤；安息香酸類、ソルビン酸類等の保存料；オルトフェニルフェノール類、ジフェニル、チアベンタゾール等の防かび剤などを適宜配合することができる。 Further, the standard substance according to the present embodiment contains other additives, for example: preservatives such as sodium azide; preservatives such as benzoic acids and sorbic acids; orthophenylphenol, as long as the effects of the present embodiment are not impaired. , Diphenyl, antifungal agents such as thiaventazole and the like can be appropriately blended.
なお、標準物質のｐＨは、具体的にはｐＨ５〜１０とすることができ、さらにはｐＨ６〜８とすることができる。 The pH of the standard substance can be specifically pH 5 to 10, and further can be pH 6 to 8.
５．標準物質の製造方法
本発明の一実施形態に係るフェリチン測定用標準物質の製造方法は、モノマー等の構成割合が上記のような範囲にあるフェリチンを用いるほか、常法に従って製造することができる。例えば、フェリチンと、所望によりその他の成分とを混合することで、本実施形態に係る標準物質を製造することができる。
5. Method for Producing Standard Substance As the method for producing the standard substance for ferritin measurement according to the embodiment of the present invention, ferritin having a composition ratio of a monomer or the like in the above range can be used, or ferritin can be produced according to a conventional method. For example, by mixing ferritin with other components, if desired, the standard substance according to the present embodiment can be produced.
より具体的には、標準物質を製造するにあたり、下記（１）を満たすフェリチンを用いる：
（１）前記フェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上である。
More specifically, in producing a standard substance, ferritin satisfying the following (1) is used:
(1) The ratio of the ferritin monomer in the ferritin is 90% or more.
また、ロットの異なる標準物質を製造する場合、すなわち、第１のロットの標準物質を参照して、異なるロット（第２のロット）の標準物質を製造する場合には、当該第２の標準物質において、下記（２）を満たすフェリチンを用いる：
（２）標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合の差が、第１の標準物質と第２の標準物質との間で８ポイント以下である。
ここで、第１のロットの標準物質を参照して、第２のロットの標準物質を製造する場合とは、互いに参照しつつ第１および第２のロットの標準物質を同時に製造してもよく、既に得られている標準物質（第１のロットの標準物質）を参照して、新たな標準物質（第２のロットの標準物質）を製造してもよい。
Further, when manufacturing standard substances in different lots, that is, when manufacturing standard substances in different lots (second lot) with reference to the standard substances in the first lot, the second standard substance is concerned. In, ferritin satisfying the following (2) is used:
(2) The difference in the ratio of ferritin oligomers above the trimmer to ferritin in the standard substance is 8 points or less between the first standard substance and the second standard substance.
Here, when the standard substance of the second lot is produced with reference to the standard substance of the first lot, the standard substances of the first and second lots may be produced at the same time while referring to each other. , A new standard substance (standard substance in the second lot) may be produced with reference to the standard substance already obtained (standard substance in the first lot).
フェリチンにおけるフェリチンモノマー等の構成割合のより好ましい条件や、標準物質に許容されるその他の成分は、前述したとおりであることが好ましい。 More preferable conditions for the composition ratio of ferritin monomer and the like in ferritin and other components allowed for the standard substance are preferably as described above.
６．フェリチンの測定方法
本発明の一実施形態に係るフェリチンの測定方法は、上記のようにして得られたフェリチン測定用標準物質を用いるものである。かかる標準物質を用いることにより、検量線が安定化され、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。
フェリチンの測定は、具体的には、まず、上記フェリチン測定用標準物質を用い、フェリチン測定試薬により、種々の既知濃度のフェリチン測定用標準物質のシグナル強度の測定を行い、検量線を作成する。次に、フェリチン測定試薬により検体のシグナル強度の測定を行い、先に作製した検量線に当てはめて濃度の算出を行う。
6. Ferritin measurement method The ferritin measurement method according to the embodiment of the present invention uses the ferritin measurement standard substance obtained as described above. By using such a standard substance, the calibration curve can be stabilized and the measured value of the ferritin concentration in the sample can be stabilized.
Specifically, for the measurement of ferritin, first, the signal intensity of various known concentrations of the standard substance for ferritin measurement is measured by using the standard substance for ferritin measurement, and a calibration curve is prepared. Next, the signal intensity of the sample is measured with the ferritin measuring reagent, and the concentration is calculated by applying it to the calibration curve prepared earlier.
本実施形態に係る測定方法は、フェリチンを免疫学的に測定する。すなわち、フェリチンを抗原として抗フェリチン抗体との特異的な抗原抗体反応を利用するものである。なお、抗フェリチン抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、また、組換え抗体を使用してもよく、さらにはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ等の抗体断片を使用してもよい。 The measuring method according to the present embodiment immunologically measures ferritin. That is, a specific antigen-antibody reaction with an anti-ferritin antibody using ferritin as an antigen is used. As the anti-ferritin antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, or a recombinant antibody may be used, and further , an antibody such as Fab, F (ab') 2 , Fab', Fv or the like may be used. Fragments may be used.
免疫学的測定方法としては、例えば、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法等の免疫凝集法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法等）や化学発光測定法等のサンドイッチ法、放射性免疫測定法、イムノクロマトグラフ法等によることができ、特に限定されない。
測定方法としては、例えば、免疫反応液の吸光度や散乱光、発光、蛍光等を光学的手法により測定する方法、標識した放射性同位体の放射能を測定する方法などが挙げられる。光学的手法としては、例えば、汎用の光学的測定装置を用いてもよく、例えば、７１８０形日立自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて測定することができる。
Examples of immunological measurement methods include immunoaggregation methods such as latex agglutination method and colloidal gold colloid agglutination method, sandwich methods such as enzyme immunoassay (ELISA method, etc.) and chemiluminescence measurement method, radioimmunogenesis measurement method, and immunochromatography. It can be done by law, etc., and is not particularly limited.
Examples of the measuring method include a method of measuring the absorbance, scattered light, light emission, fluorescence, etc. of the immune reaction solution by an optical method, a method of measuring the radioactivity of the labeled radioisotope, and the like. As the optical method, for example, a general-purpose optical measuring device may be used, and for example, a 7180 type Hitachi automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation) can be used for measurement.
検体としては、全血、血清、血漿等などが挙げられる。検体はそのまま用いてもよいが、希釈等して測定用の試料としてもよい。 Examples of the sample include whole blood, serum, plasma and the like. The sample may be used as it is, or may be diluted or the like to be used as a sample for measurement.
以上述べた実施形態に係るフェリチン測定用標準物質によれば、標準物質中のフェリチン反応性を安定化することができ、検量線が安定化するため、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。 According to the standard substance for ferritin measurement according to the above-described embodiment, the ferritin reactivity in the standard substance can be stabilized and the calibration curve is stabilized, so that the measured value of the ferritin concentration in the sample is stabilized. Can be made to.
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物・均等方法をも含む趣旨である。 The embodiments described above are described for facilitating the understanding of the present invention, and are not described for limiting the present invention. Therefore, each element disclosed in the above-described embodiment is intended to include all design changes, equivalents, and equalization methods belonging to the technical scope of the present invention.
以下、試験例等を示すことにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の試験例等に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by showing test examples and the like, but the present invention is not limited to the following test examples and the like.
〔試験例１〕ロットの異なるフェリチンを用いたキャリブレータ（標準物質）による測定
フェリチン（ＢＢＩ社製，ヒト肝臓由来，ロット１およびロット２，ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度：９５％以上）を用い、フェリチン免疫学的測定用のキャリブレータ（標準物質）を調製した。キャリブレータは、フェリチンの２つのロット（それぞれロット１およびロット２）をそれぞれ用いた２種類（２ロット）を調製した。フェリチン濃度はメーカー表示値に基づき、脱脂血清により希釈して１０００ng/mLに調整し、さらに濃度２５、２５０、５００、７５０ng/mLのキャリブレータも調製した。
なお、希釈に用いた脱脂血清は、市販の脱脂血清を用い、抗フェリチン抗体を用いたアフィニティゲルによりフェリチンを除去したものである。除去後の脱脂血清がフェリチン不含有であることは、ＬＺテスト‘栄研’ＦＥＲを用いて確認した。
[Test Example 1] Measurement by a calibrator (standard substance) using different lots of ferritin Ferritin immunology using ferritin (manufactured by BBI, derived from human liver, lot 1 and lot 2, purity by SDS-PAGE: 95% or more) A calibrator (standard substance) for scientific measurement was prepared. As the calibrator, two types (two lots) were prepared using two lots of ferritin (lot 1 and lot 2 respectively). The ferritin concentration was adjusted to 1000 ng / mL by diluting with defatted serum based on the value indicated by the manufacturer, and calibrators having concentrations of 25, 250, 500 and 750 ng / mL were also prepared.
The defatted serum used for dilution was a commercially available defatted serum from which ferritin was removed by an affinity gel using an anti-ferritin antibody. It was confirmed by using the LZ test'Eiken'FER that the degreased serum after removal was ferritin-free.
得られたキャリブレータを用いて検量線を作成し、ヒト検体（No.１〜６）におけるフェリチン濃度を測定した。測定試薬としては、ラテックス凝集試薬（栄研化学社製，「ＬＺテスト‘栄研’ＦＥＲ」）を用い、測定装置としては７１８０形日立自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ社製）を用いた。
また、得られた結果に基づき、ロット間の相違として、ロット１のキャリブレータで得られた測定値に対する、ロット２のキャリブレータで得られた測定値の比を算出した。
結果を表１に示す。
A calibration curve was prepared using the obtained calibrator, and the ferritin concentration in human samples (Nos. 1 to 6) was measured. A latex aggregating reagent (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd., "LZ test'Eiken'FER") was used as the measuring reagent, and a 7180 type Hitachi automatic analyzer (manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation) was used as the measuring device.
Further, based on the obtained results, as a difference between lots, the ratio of the measured values obtained by the calibrator of lot 2 to the measured values obtained by the calibrator of lot 1 was calculated.
The results are shown in Table 1.
表１に示すように、異なるロットのフェリチンを用いた異なるロットのキャリブレータでは、シグナル強度が異なることでそれぞれ検量線が相違するため、測定結果に差が生じてしまうことが明らかとなった。キャリブレータにおけるその他の成分は同様に調製していることから、測定結果の差は、キャリブレータに用いたフェリチンのロットの相違に起因していると考えられた。 As shown in Table 1, it was clarified that the calibration curves of different lots of calibrators using different lots of ferritin differed due to the difference in signal intensity, resulting in a difference in measurement results. Since the other components in the calibrator were prepared in the same manner, it was considered that the difference in the measurement results was due to the difference in the lot of ferritin used in the calibrator.
〔試験例２〕ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析
ロット１およびロット２のフェリチンについて、緩衝液（０．０５Ｍ リン酸緩衝液:ｐＨ７．０，塩化ナトリウム：０．３Ｍ）に溶解させ（フェリチン濃度：表示値換算で１０質量％）、以下の条件にてゲルろ過クロマトグラフィーによる分析を行った。なお、分子量マーカーとしてはＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いた。
[Test Example 2] Analysis by Gel Filtration Chromatography Lot 1 and lot 2 ferritin were dissolved in a buffer solution (0.05M phosphate buffer: pH 7.0, sodium chloride: 0.3M) (ferritin concentration: indicated). Analysis was performed by gel filtration chromatography under the following conditions (10% by mass in terms of value). As a molecular weight marker, Gel Filterate Standard (manufactured by BIO RAD) was used.
＝ゲルろ過クロマトグラフィー条件＝
カラム：Ｙａｒｒａ ＳＥＣ３０００（島津ＧＬＣ社製）
移動相：０．０５Ｍ リン酸緩衝液，０．３Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０
流量：０．５mL/min
検出：ＵＶ（２８０nm）
= Gel filtration chromatography conditions =
Column: Yarra SEC3000 (manufactured by Shimadzu GLC)
Mobile phase: 0.05M phosphate buffer, 0.3M NaCl, pH 7.0
Flow rate: 0.5 mL / min
Detection: UV (280 nm)
ロット１および２のいずれも、３つのピークが認められ、これらはそれぞれフェリチンのモノマー（分子量約４８０ｋＤａ）、ダイマー（同約９６０ｋＤａ）、およびオリゴマー（同約１４００ｋＤａ以上）に対応するピークであると認められた。
ピーク面積の比から求められる構成割合は表２に示すとおりであり、２つのロット間で異なっていたことから、フェリチンにおけるモノマー等の構成比が測定結果の差の原因である可能性が考えられた。
Three peaks were observed in both lots 1 and 2, and these were recognized as peaks corresponding to ferritin monomers (molecular weight of about 480 kDa), dimers (molecular weight of about 960 kDa), and oligomers (molecular weight of about 1400 kDa or more), respectively. Was done.
The composition ratio obtained from the peak area ratio is as shown in Table 2, and since it was different between the two lots, it is possible that the composition ratio of the monomer etc. in ferritin is the cause of the difference in the measurement results. It was.
〔試験例３〕モノマー等を用いたキャリブレータによる測定
試験例２で分画したロット１のフェリチンについて、以下のようにしてフェリチンの吸光係数を決定した。
まず、フェリチンＷＨＯ国際標準（リコンビナント，３ｒｄ ＩＳ，９４／５７２）を基準として上記モノマー画分の濃度を決定し、当該モノマー画分の吸光度よりフェリチンの吸光係数を決定した。
ここで、フェリチン標準は上記ＷＨＯ国際標準に準拠すべきとされているが、ＷＨＯ国際標準はリコンビナントフェリチンタンパク質を血漿で希釈したものであり、フェリチン以外のタンパク質を多く含む。そのため、モノマーの濃度決定に当たっては、ラテックス凝集試薬（ＬＺテスト‘栄研’ＦＥＲ）および７１８０形日立自動分析装置（Ｈ７１８０）を用い、ＷＨＯ国際標準の表示値を基準として上記モノマー画分の濃度を決定した。このようにして得られたモノマー画分の濃度と、当該モノマー画分の吸光度より、フェリチンモノマーの吸光係数（波長：２８０nm）は、１mg/mLにおいて１１．２７と決定された。
[Test Example 3] Measurement by a calibrator using a monomer or the like For the ferritin of lot 1 fractionated in Test Example 2, the extinction coefficient of ferritin was determined as follows.
First, the concentration of the above-mentioned monomer fraction was determined based on the ferritin WHO international standard (recombinant, 3rd IS, 94/572), and the extinction coefficient of ferritin was determined from the absorbance of the monomer fraction.
Here, the ferritin standard is supposed to comply with the above WHO international standard, but the WHO international standard is a recombinant ferritin protein diluted with plasma and contains a large amount of proteins other than ferritin. Therefore, in determining the concentration of the monomer, a latex agglutinating reagent (LZ test'Eiken'FER) and a 7180 type Hitachi automatic analyzer (H7180) were used, and the concentration of the above monomer fraction was determined based on the display value of the WHO international standard. Were determined. From the concentration of the monomer fraction thus obtained and the absorbance of the monomer fraction, the extinction coefficient (wavelength: 280 nm) of the ferritin monomer was determined to be 11.27 at 1 mg / mL.
決定されたモノマー画分の濃度（すなわちフェリチン吸光係数）に基づき、上記脱脂血清を用いてモノマー画分の濃度を１０００ng/mLに調整した。さらに、濃度２５、２５０、５００、７５０ng/mLに調整し、一連のキャリブレータを調製した。
また、上記フェリチン吸光係数に基づき、ダイマー、オリゴマーの各画分の濃度を１０００ng/mLに調整し、モノマー画分と同様にして一連のキャリブレータを調製した。
得られたキャリブレータを用い、試験例１と同様にして検量線を作成し、ヒト検体（No.１〜６）におけるフェリチン濃度を測定した。ただし、測定値が１０００ng/mLを超えた結果については、検量線（０〜１０００ng/mL）の範囲から外れたものとして対比不可とした。
結果を表３に示す。
Based on the determined monomer fraction concentration (ie, ferritin extinction coefficient), the monomer fraction concentration was adjusted to 1000 ng / mL using the above-mentioned defatted serum. Further, the concentration was adjusted to 25, 250, 500 and 750 ng / mL, and a series of calibrators were prepared.
Further, based on the ferritin extinction coefficient, the concentration of each fraction of the dimer and the oligomer was adjusted to 1000 ng / mL, and a series of calibrators were prepared in the same manner as the monomer fraction.
Using the obtained calibrator, a calibration curve was prepared in the same manner as in Test Example 1, and the ferritin concentration in human samples (No. 1 to 6) was measured. However, the results of the measured values exceeding 1000 ng / mL were considered to be out of the range of the calibration curve (0 to 1000 ng / mL) and could not be compared.
The results are shown in Table 3.
表３に示されるとおり、モノマー、ダイマー、オリゴマーと多量体化するにつれて、反応性が顕著に減少し、各キャリブレータから得られる検量線が低くなった。その結果、ダイマーやオリゴマーをキャリブレータとした場合、同じ検体であっても測定値が高く算出されてしまうことが明らかとなった。そのため、フェリチン標準は、フェリチンにおけるモノマー、ダイマー、オリゴマー等の構成比率が非常に重要であることが示された。また、モノマーの割合を高めることで、少量のフェリチンでも充分に高い反応性を得られ、生産性の向上に有用であるものと認められた。 As shown in Table 3, the reactivity decreased significantly and the calibration curve obtained from each calibrator became lower as the number of monomers, dimers, and oligomers increased. As a result, it was clarified that when a dimer or an oligomer is used as a calibrator, the measured value is calculated high even for the same sample. Therefore, the ferritin standard has shown that the composition ratio of monomers, dimers, oligomers, etc. in ferritin is very important. Further, by increasing the proportion of the monomer, a sufficiently high reactivity could be obtained even with a small amount of ferritin, and it was recognized that it is useful for improving productivity.
〔試験例４〕モノマー等の構成比率を調整したキャリブレータによる測定
モノマー、ダイマー、オリゴマーの各画分について、試験例３で決定された濃度に基づき、表４に示す種々の比率にて混合した。得られた混合フェリチンを、試験例３と同様に濃度２５、２５０、５００、７５０、１０００ng/mLに調整し、一連のキャリブレータを調製した。得られたキャリブレータを用い、試験例１と同様にして検量線を作成し、ヒト検体（No.１〜６）におけるフェリチン濃度を測定した。ただし、測定値が１０００ng/mLを超えた結果については、検量線（０〜１０００ng/mL）の範囲から外れたものとして対比不可とした。
結果を表４に示す。
[Test Example 4] Measurement by a calibrator adjusted for the composition ratio of the monomer and the like Each fraction of the monomer, dimer and oligomer was mixed at various ratios shown in Table 4 based on the concentration determined in Test Example 3. The obtained mixed ferritin was adjusted to concentrations of 25, 250, 500, 750 and 1000 ng / mL in the same manner as in Test Example 3 to prepare a series of calibrators. Using the obtained calibrator, a calibration curve was prepared in the same manner as in Test Example 1, and the ferritin concentration in human samples (No. 1 to 6) was measured. However, the results of the measured values exceeding 1000 ng / mL were considered to be out of the range of the calibration curve (0 to 1000 ng / mL) and could not be compared.
The results are shown in Table 4.
表４に示されるとおり、キャリブレータにおけるモノマー比率が低下するにつれ、同じ検体であっても測定値が高くなる傾向が確認された。
ロットの異なるフェリチンを標準物質に用いた場合に、同じ検体において測定値の差を小さくするためには、モノマーの割合を高める（例えば、９０％以上とする）ことが有用であると認められた。
また、モノマーの割合が高くないフェリチンを用いた場合であっても、次のロットにおいてフェリチン中の構成比率をなるべく一定に調整すること（例えば、反応性の低いオリゴマーの割合の差を８ポイント以下にする、さらにはダイマーの割合の差を１０ポイント以下にする、など）により、ロット間におけるフェリチン測定値の差を低減することができると認められた。
As shown in Table 4, it was confirmed that as the monomer ratio in the calibrator decreased, the measured value tended to increase even for the same sample.
When ferritins from different lots were used as standard substances, it was found to be useful to increase the proportion of monomers (for example, 90% or more) in order to reduce the difference in measured values in the same sample. ..
Further, even when ferritin having a low monomer ratio is used, the composition ratio in ferritin should be adjusted to be as constant as possible in the next lot (for example, the difference in the ratio of low-reactive oligomers should be 8 points or less. It was recognized that the difference in ferritin measurement values between lots could be reduced by reducing the difference in the ratio of dimers to 10 points or less.
〔試験例５〕異なる測定装置による測定
試験例３で調製したモノマー、ダイマー、オリゴマーの各キャリブレータを用い、測定装置をＴＢＡ−１２０ Ｐｅａｒｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（キヤノンメディカルシステムズ社製）およびＪＣＡ−ＢＭ６０７０（日本電子社製）に変更して、ヒト検体（No.１〜６）におけるフェリチン濃度を測定した。測定試薬としては、試験例３等と同様にラテックス凝集試薬（栄研化学社製，「ＬＺテスト‘栄研’ＦＥＲ」）を用いた。
得られた測定値から、測定装置間における測定値の差を評価した。ただし、測定値が１０００ng/mLを超えた結果については、検量線（０〜１０００ng/mL）の範囲から外れたものとして対比不可とした。
結果を表５に示す。
[Test Example 5] Measurement by different measuring devices Using the monomer, dimer, and oligomer calibrators prepared in Test Example 3, the measuring devices were TBA-120 Pearl Edition (manufactured by Canon Medical Systems) and JCA-BM6070 (JEOL Ltd.). The ferritin concentration in human samples (No. 1 to 6) was measured. As the measurement reagent, a latex agglutinating reagent (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd., "LZ test'Eiken'FER") was used as in Test Example 3 and the like.
From the obtained measured values, the difference in the measured values between the measuring devices was evaluated. However, the results of the measured values exceeding 1000 ng / mL were considered to be out of the range of the calibration curve (0 to 1000 ng / mL) and could not be compared.
The results are shown in Table 5.
表５に示すように、モノマー１００％のキャリブレータを用いた場合、測定装置が異なるものであっても、得られる測定値の差を小さく抑えられるとの結果が得られた。
ここで、同じ測定試薬を用い異なる測定装置で測定する場合、測定原理は同一であるものの、反応セルの材質・大きさ、試薬の添加順序や添加量、加温条件、撹拌条件、検出条件など、測定装置の間でかなりの相違が存在する。これらの相違により、測定装置間での結果の差（ひいては施設間での結果の差）が生じるものと考えられる。
表５の結果より、モノマー、ダイマー、オリゴマー等の反応性の差は、測定装置間での結果の差にも影響するものと認められた。そのため、フェリチン標準物質においてモノマーの割合を高くすることにより、測定装置間での結果の差（ひいては施設間での結果の差）が低減され、安定した測定値を得ることができると認められた。
As shown in Table 5, when a calibrator with 100% monomer was used, the result was obtained that the difference in the obtained measured values could be suppressed to a small size even if the measuring devices were different.
Here, when measuring with different measuring devices using the same measuring reagent, although the measuring principle is the same, the material and size of the reaction cell, the order and amount of reagents added, the heating conditions, the stirring conditions, the detection conditions, etc. , There are considerable differences between measuring devices. It is considered that these differences cause differences in results between measuring devices (and thus differences in results between facilities).
From the results in Table 5, it was recognized that the difference in reactivity of monomers, dimers, oligomers, etc. also affects the difference in results between measuring devices. Therefore, it was recognized that by increasing the proportion of monomers in the ferritin standard substance, the difference in results between measuring devices (and by extension, the difference in results between facilities) can be reduced, and stable measured values can be obtained. ..
本発明によれば、検体中のフェリチン濃度の測定値を安定化させることができる。フェリチン測定においては精度安定化が長年の課題となっていたところ、本発明によればかかる課題解決の一助となるものである。 According to the present invention, the measured value of ferritin concentration in the sample can be stabilized. Stabilization of accuracy has been a long-standing problem in ferritin measurement, and according to the present invention, this problem is helped to be solved.
Claims (10)
前記標準物質において、下記（１）または（２）を満たすフェリチンを用いる、方法：
（１）前記標準物質中のフェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上である；
（２）前記標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合の差が、前記標準物質間で８ポイント以下である。 A method for reducing the difference in ferritin measurement results in a sample between at least two or more lots of ferritin measurement reference substances.
A method using ferritin satisfying the following (1) or (2) in the standard substance:
(1) The ratio of ferritin monomer in ferritin in the standard substance is 90% or more;
(2) The difference in the ratio of ferritin oligomers above the trimmer to ferritin in the standard substance is 8 points or less between the standard substances.
前記標準物質において、下記（１）を満たすフェリチンを用いる、方法：
（１）前記フェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上である。 A method for producing a standard substance for ferritin measurement.
A method using ferritin satisfying the following (1) in the standard substance:
(1) The ratio of the ferritin monomer in the ferritin is 90% or more.
前記第２の標準物質において、下記（２）を満たすフェリチンを用いる、方法：
（２）前記標準物質中のフェリチンにおけるトリマー以上のフェリチンオリゴマーの割合の差が、前記第１の標準物質と前記第２の標準物質との間で８ポイント以下である。 A method for producing a ferritin measurement standard substance in a second lot with reference to a ferritin measurement standard substance in a first lot.
A method using ferritin satisfying the following (2) in the second standard substance:
(2) The difference in the ratio of ferritin oligomers above the trimmer to ferritin in the standard substance is 8 points or less between the first standard substance and the second standard substance.
前記標準物質中のフェリチンにおけるフェリチンモノマーの割合が９０％以上であることを特徴とするフェリチン測定用標準物質。 A standard substance for ferritin measurement containing ferritin.
A standard substance for ferritin measurement, wherein the ratio of the ferritin monomer in ferritin in the standard substance is 90% or more.
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| JPS5356309A (en) * | 1976-10-28 | 1978-05-22 | Daiichi Radioisotope Lab | Production of ferritin |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "免疫血清項目におけるハーモナイゼーションの可能性についての検討 第１報", 医学検査, vol. 67, no. 2, JPN6023012738, 2018, JP, pages 189 - 195, ISSN: 0005026972 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP7438910B2 (en) | 2020-09-25 | 2024-02-27 | デンカ株式会社 | Ferritin measurement reagent |
| JP7483109B2 (en) | 2020-09-25 | 2024-05-14 | デンカ株式会社 | Ferritin measurement reagent |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2024029250A (en) | 2024-03-05 |
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